-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines Proteins durch Transformation eines Mikroorganismus
mit einem Vektor, der in der Lage ist, das gewünschte
Protein als Fusionsprotein mit dem N-terminalen Anteil von APH
zu exprimieren, die Herstellung des das Fusionsprotein
erzeugenden Mikroorganismus und die Gewinnung des gewünschten
Proteins.
-
Die jüngsten bemerkenswerten Fortschritte in der
Gentechnologie erlauben die Herstellung verschiedener
nützlicher Proteine in Mikroorganismen. Wenn Peptide, unter
anderen mit relativ kurzen Ketten, wie z. B. menschliches Insulin
und menschliches Somatostatin in Mikroorganismen hergestellt
werden, werden diese leicht durch Protease abgebaut und die
Ausbeute ist gering. Es wurde deshalb versucht, ein
gewünschtes Protein in Mikroorganismen als Fusionsprotein
herzustellen (wie z. B. in der japanischen nicht geprüften
Offenlegungsschrift Nr. 54-92696 offenbart). Falls das Produkt
für den Wirt lethal ist oder dessen Vermehrung hemmt und die
Ausbeute gering ist, ist es möglich, die Ausbeute dadurch zu
erhöhen, daß das Produkt als ein gegenüber dem Wirkt
inaktives Fusionsprotein hergestellt wird.
-
Transposon Tn5 enthält ein APH (Aminoglycosid 3'-
Phosphotransferase II) codierendes Gen, das einem
Mikroorganismus Neomycin: oder Kanamycinresistenz verleiht. Die
Basensequenz dieses Gens in Transposon Tn5 ist bekannt (Gene
19, 327, 1982) und ein diese Basensequenz enthaltendes
Plasmid ist im Handel erhältlich (z. B. pNEO bei Pharmacia). Die
Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz von
APH sind in Fig. 1 dargestellt.
-
Bei aus Pankreas gewonnenen Trypsininhibitoren
unterscheidet man zwei Arten, sekretorischen
Pankreas-Trypsininhibitor
(PSTI) und basischen Pankreas-Trypsininhibitor.
Ersterer kommt in Säugetieren vor und ist außer in Pankreas
in der Niere, Lunge, Milz, Leber und im Gehirn verbreitet.
Der Letztere kommt im Pankreas und anderen Organen von
Wiederkäuern vor, ist jedoch nicht im Menschen und anderen
Säugetieren anzutreffen. Pubols et al. (J. Biol. Chem. 249,
1974, 2235) bzw. Feinstein et al. (Eur. J. Biochem 43, 1974,
569), isolierten und reinigten menschlichen PSTI aus
menschlichem Pankreassaft. Seine Struktur wurde von Greene
et al. (Methods Enzymol. 45, 1976, 813) ermittelt. Die von
Greene et al. beschriebene Aminosäuresequenz von PSTI
unterscheidet sich allerdings von der in Fig. 2 gezeigten
Aminosäuresequenz an den Positionen 21 und 29 (J. Biochem. 98,
1985, 687). Wie in Fig. 2 gezeigt, handelt es sich bei
menschlichem PSTI um ein aus 56 Aminosäuren
zusammengesetztes Polypeptid. Sein Molekulargewicht beträgt 6242. Die SH-
Gruppen von Cys bilden zwischen den Positionen 9 und 38, 16
und 35, und 24 und 56 der Aminosäuresequenz eine
Disulfidbrücke. Eine freie SH-Gruppe ist nicht vorhanden. Eddeland
et al. (Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 359, 1978, 671) und
Kitahara et al. (Biomed. J. 3, 1979, 1119) entwickelten das
Radioimmuntestsystem zur Bestimmung von PSTI in Blut, wobei
als Antigen aus Pankreassaft erhaltener menschlicher PSTI
verwendet wurde. Yamamoto et al. (Biochem., Biophys. Res.
Commun. 132, 1985, 605) ermittelten die DNA-Sequenz von
menschlichem PSTI (siehe Fig. 2).
-
Bei der akuten Pankreatitis wird durch proteolytische
Enzyme Autolyse induziert, da angeblich eine geringe Menge
von durch irgendeine Ursache aktiviertem Trypsin in einer
Kettenreaktion Trypsinogen und anderes Zymogen aktiviert.
Der in acinösen Zellen des Pankreas vorkommende PSTI wird
zusammen mit Pankreasenzymen in den Pankreassaft abgesondert
und hemmt die Aktivierung des im Ausführungsgang des
Pankreas befindlichen Trypsins. Außerdem wandert ein Teil
dieses PSTI als freigesetzter Inhibitor in das Blut und liegt
in einem freien Zustand vor (Cholecyst and Pankreas, 2,
1981, 231). Bei Pankreaserkrankungen, besonders bei akuten
Pankreaserkrankungen schwankt der Blutspiegel von PSTI
beträchtlich, und der Zeitraum mit einem hohen Spiegel ist
länger als der von Amylase. Auch bringen, unabhängig vom
Proteaseinhibitor, Schwankungen des Blutspiegels von PSTI
deutlich Belastungen des Pankreas zum Ausdruck (Cholecyst
and Pancreas, 3, 1982, 383). Die Bestimmung des Blutspiegels
von PSTI erlaubt daher die Diagnose und die Beobachtung von
Krankheitsprozessen des Pankreas.
-
Rattenactin stellt ein Protein dar, das die
Skelettmuskeln der Ratten bildet. Das dieses Actin codierende Gen
wurde bereits cloniert (Biophysics, Bd. 25, Nachtrag, 1985,
S. S78 (siehe Fig. 5).
-
Menschliches PSTI und Rattenactin wurden bisher noch
nicht gentechnologisch hergestellt, die Expression von
menschlichem Insulin oder menschlichem Somatostatin als
Fusionsprotein mit β-Galactosidase ist jedoch bereits als ein
Verfahren bekannt, das zur Expression eines Peptids mit
einer relativ kurzen Kette, wie z. B. menschlichem PSTI, in
Mikroorganismen angewandt werden kann (siehe oben). Dieses
System ist jedoch nicht für alle Peptide anwendbar. Es ist
daher sehr wichtig, andere Systeme zur Expression eines
gewünschten Peptids als Fusionsprotein in Mikroorganismen zu
finden.
-
APH codierende Gene sind im Handel erhältlich. Sie
sind z. B. im Transposon Tn5 enthalten. Es wurden bisher
jedoch keine Versuche unternommen, ein gewünschtes Peptid als
Fusionsprotein mit APH in einen Mikroorganismus zu
exprimieren.
-
Zur Diagnose und zur Beobachtung von
Krankheitsprozessen des Pankreas wird meist die Bestimmung von PSTI
mittels RIA angewandt. Für diese Bestimmung ist menschliches
PSTI als Standardreagens unerläßlich. Da es bisher aus
menschlichem Pankreassaft gewonnen und aufgereinigt wird,
ist die verfügbare Menge begrenzt. Bisher war es nicht
möglich, es in großen Mengen zu erhalten.
-
Wie bereits erwähnt, wurde Rattenactin codierende DNA
bereits cloniert. Es konnte jedoch durch die Experimente der
Erfinder gezeigt werden (siehe Beispiele), daß Rattenactin,
falls es in E. coli als Nicht-Fusionsprotein exprimiert
wird, kaum erzeugt wird.
-
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende
technische Problem besteht darin, ein Verfahren zur
Herstellung eines gewünschten Proteins bereitzustellen, wobei ein
Mikroorganismus mit einem zur Expression des Proteins als
Fusionsprotein mit dem N-terminalen Anteil von APH
befähigten Vektors transformiert wird, der Mikroorganismus zur
Herstellung des Fusionsproteins gezüchtet und das gewünschte
Protein gewonnen wird.
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung stellte sich heraus,
daß eine große Menge an APH in Mikroorganismen hergestellt
wird, falls das APH-Gen stromabwärts eines geeigneten
Promotors eingesetzt wird. Es stellte sich außerdem heraus, daß
durch die Ausnutzung der Fähigkeit von APH zu hoher
Expression ein gewünschtes Protein als Fusionsprotein in
Mikroorganismen hergestellt werden kann.
-
Diese Erfindung offenbart daher ein Verfahren zur
Herstellung eines gewünschten Proteins, wie menschliches
PSTI und Rattenactin, wobei zuerst ein dieses codierendes
Gen mit einem verkürzten APH-Gen verbunden wird. Das
erhaltene fusionierte Gen wird dann in einen Vektor stromabwärts
eines geeigneten Promotors eingesetzt. Dieser rekombinante
Vektor wird in einen Wirt eingeschleust, der das codierte
Protein herstellt. Schließlich wird das gewünschte Protein
aus dem Fusionsprotein gewonnen. Dieses Verfahren ist zur
Herstellung verschiedener Arten von Proteinen geeignet.
-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines gewünschten Proteins, das von der Fähigkeit des APH-
Gens zu hoher Expression Gebrauch macht, d. h. der
ausgezeichneten Effizienz der Transkription in mRNA und der
Translation der mRNA in ein Polypeptid. Falls es sich bei
dem gewünschten Protein um eine relativ kurze Kette handelt,
wird es erfindungsgemäß in dem Mikroorganismus als
Fusionsprotein mit dem langkettigen APH hergestellt. Dadurch kann
der Abbau des gewünschten Proteins durch Proteasen in dem
Mikroorganismus vermieden werden. Durch die Fusion ist es
außerdem möglich, dem gewünschten Protein die schädliche
Wirkung zu nehmen. Man kann davon ausgehen, daß die
ausgezeichnete erfindungsgemäße Herstellungseffizienz
hauptsächlich auf der Verbesserung der Effizienz der Translation der
mRNA in ein Peptid beruht. Dies scheint zur Expression eines
Peptids, das aufgrund einer geringen Translationseffizienz
gering exprimiert wurde, besonders wirksam zu sein.
-
Fig. 1 zeigt eine DNA-Sequenz des APH-Gens und die
von dieser DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz.
-
Fig. 2 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz von
menschlichem PSTI.
-
Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz des in einem Beispiel
verwendeten synthetischen menschlichen PSTI-Gens, die
entsprechende Aminosäuresequenz und die Strategie zur Synthese
der DNA-Sequenz.
-
Fig. 4 zeigt eine Restriktionskarte des APH-Gens und
seiner flankierenden Bereiche.
-
Fig. 5 zeigt schematisch die Herstellung von
pUCKMFPSTI.
-
Fig. 6 zeigt schematisch die Herstellung von pUCKMF.
-
Fig. 7 zeigt eine DNA-Sequenz
eines-Rattenskelettmuskelactingens und die abgeleitete Aminosäuresequenz.
-
Fig. 8 zeigt schematisch die Herstellung von pUCACT.
-
Fig. 9 zeigt schematisch die Herstellung von
pUCKMFACT.
-
Fig. 10 zeigt schematisch die Herstellung von
pUCKMF1.
-
Fig. 11 zeigt schematisch die Herstellung von
pUCKMFACT1.
-
Fig. 12 zeigt schematisch die Herstellung von
pUCKMACT.
-
Fig. 13 zeigt die DNA-Sequenz in der Nähe der zur
Herstellung von pUCKMACT eingefügten synthetischen
Oligonucleotidsequenz.
-
Fig. 14 zeigt in einer Skizze ein Fusionsprotein aus
APH und Rattenskelettmuskelactin, wie dieses in den
Beispielen exprimiert wurde.
-
Fig. 15 zeigt den Ertrag in Abhängigkeit von der
Länge eines mit Rattenskelettmuskelactin fusionierten
Peptids.
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung stellte sich heraus,
daß eine große Menge an APH in Mikroorganismen hergestellt
wird, falls das APH-Gen stromabwärts eines geeigneten
Promotors eingesetzt wird. Es stellte sich außerdem heraus, daß
durch die Ausnutzung der Fähigkeit von APH zu hoher
Expression menschliches PSTI und Rattenactin als Fusionsprotein in
Mikroorganismen hergestellt werden können.
-
Diese Erfindung offenbart daher ein Verfahren zur
Herstellung eines gewünschten Proteins, wie z. B.
menschliches PSTI und Rattenactin, wobei zuerst ein dieses
codierende Gen mit einem verkürzten APH-Gen verbunden wird. Das
erhaltene fusionierte Gen wird dann in einen Vektor
stromabwärts eines geeigneten Promotors eingesetzt. Dieser
rekombinante Vektor wird in einen Wirt eingeschleust, der das
codierte Protein herstellt. Schließlich wird das gewünschte
Protein aus dem Fusionsprotein gewonnen. Dieses Verfahren
ist nicht nur für die Herstellung von menschlichem PSTI und
Rattenactin, sondern auch zur Herstellung anderer Proteine
geeignet.
-
Übrigens kann das APH-Gen nicht nur das APH
codierende Strukturgen, sondern auch seinen Promotor und/oder
seine Ribosomenbindungssequenz enthalten. Das fusionierte
Gen, das das den APH-Promotor enthaltende APH-Gen und ein
ein gewünschtes Protein codierende Gen umfaßt, kann unter
die Kontrolle eines starken Promotors, wie des
lac-Promotors, des Trp-Promotors oder des Tac-Promotors gestellt
werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das zwar die
Ribosomenbindungssequenz und das Strukturgen für APH, nicht
jedoch den APH-Promotor umfassende fusionierte Gen zusammen
mit einem das gewünschte Protein codierenden Gen unter die
Kontrolle der Promotoren gestellt werden. Der Austausch der
Umgebung der Ribosomenbindungssequenz des APH-Gens durch
andere geeignete Ribosomenbindungssequenzen kann ebenfalls in
Erwägung gezogen werden. Außerdem ist es nicht immer
notwendig, daß das APH-Gen das vollständige Strukturgen von APH
enthält. Es reicht aus, wenn es eine DNA-Sequenz umfaßt, die
13 oder mehr Aminosäuren des N-Terminus, bevorzugt 24 oder
mehr Aminosäuren codiert. Das heißt, man kann davon
ausgehen, daß die starke erfindungsgemäße Expressionseffizienz
hauptsächlich auf der hohen Translationseffizienz von der
mRNA in das Protein beruht. Als wichtig wird erachtet, daß
die Sequenz die Ribosomenbindungssequenz das APH-Gens und
eine eine Anzahl von Aminosäuren vom N-Terminus von APH
codierende Sequenz umfaßt, die für die Initiation der
Translation verantwortlich ist. Wenn z. B. eine synthetische
menschliche PSTI-DNA mit einem
HindIII-TaqI-Restriktionsfragment von pNEO (Pharmacia) (das den APH-Promotor und das
Gen enthält, das die Aminosäuren vom N-Terminus von APH bis
zur Position 82, entsprechend der DNA-Sequenz von Position
-350 bis 246 in Fig. 1, codiert) verbunden wird, und unter
die Kontrolle des lac-Promotors von pUc13 (Takara Shuzo Co.,
Ltd.) gestellt wird, wird so ein Vektor hergestellt, der ein
Fusionsprotein aus APH und menschlichem PSTI exprimiert. Da
nicht nur die in Fig. 1 gezeigte Sequenz hohe
Translationseffizienz besitzt, sondern auch Sequenzen, bei denen einige
Basen des APH-Gens ersetzt, eliminiert oder eingefügt sind,
sollte beachtet werden, daß die Verwendung solcher
APH-Genvarianten im erfindungsgemäßen Verfahren im Schutzumfang
dieser Erfindung eingeschlossen ist. In diesem Fall kann man
selbstverständlich davon ausgehen, daß die
Aminosäuresequenzen von APH stark verändert sein können; insoweit die DNA
eine ähnliche Wirksamkeit besitzt, ist jedoch das Verfahren,
bei dem eine derartige APH-Variante verwendet wird,
ebenfalls im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen.
-
Beispiele für Vektoren, die das APH und ein
gewünschtes Protein codierende Fusionsgen tragen, sind:
-
pUc13, pβ-gall3c, pOP203-13, pUC9, pUC8, pEA300, ptrpL1,
pBN70, pWT111, pWT121, pWT131, pKK223-3, pDR540, pDR720,
pYEJ001,
pPL-lambda, pKc30, pKc31, pAS1, pLC24, pHUB4,
pIN-I, pIN-II, pIN-III, pC194, pC221, pUB112, pI127, pSAO503
und pE194. Diele Auszählung ist jedoch nicht limitierend, es
kann jeder Vektor verwendet werden, der ein fusioniertes Gen
tragen und dieses in einem Mikroorganismus exprimieren kann.
Außerdem können alle im allgemeinen zur Transformation auf
diesem Gebiet verwendeten Vektoren benutzt werden. Durch
eine geeignete, vom Wirt abhängige Auswahl dieser Vektoren,
und Einsetzen des Fusionsgens unter die Kontrolle eines
geeigneten Promotors, kann das Fusionsprotein aus APH und
einem gewünschten Protein exprimiert werden.
-
Wenn z. B. E. coli als Wirt verwendet wird, kann das
gewünschte Protein effizient hergestellt werden.
-
Falls eine geeignete Aminosäure-Bindungssequenz wie
Met oder eine Met enthaltende Sequenz in dem Fusionsprotein
zwischen APH und dem gewünschten Protein enthalten ist, kann
mittels Bromcyan das gewünschte Protein leicht von dem damit
fusionierten Protein abgespalten werden. Weitere Verfahren
sind ebenfalls anwendbar. Zum Beispiel das Verfahren der
Insertion von Cys zwischen zwei Proteine und Spaltung mit 2-
Nitro-5-thiocyanobenzoesäure, der Insertion von Asn-Gly und
Spaltung mit Hydroxylamin, der Insertion von Trp und
Spaltung mit 2-(2-Nitrophenylsulphenyl)-3-methyl-3-bromindol,
der Insertion von Lys oder Arg und Spaltung mit Trypsin und
der Insertion von -Ile-Glu-Gly-Arg- und Spaltung mit dem
Blutgerinnungsfaktor Xa. Diese allgemein angewandten
Verfahren können unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz des
gewünschten Proteins entsprechend ausgewählt werden.
-
Außerdem können nicht nur zur Erzielung dieser
Spaltungen, einige Bindungsbasensequenzen zwangsläufig infolge
der Vektorkonstruktion eingefügt werden, der Einfluß auf die
Herstellungseffizienz des gewünschten Proteins ist jedoch
vernachlässigbar.
-
Ein gewünschtes, von dem Fusionsprotein abgespaltenes
Protein kann durch die geeignete Kombination aus
Chromatographie, Affinitätschromatographie, Zentrifugation und
anderen Techniken routinemäßig gereinigt werden.
-
Das menschliches PSTI codierende Gen wurde bereits
von Yamamoto et al. (siehe oben) aus menschlichen
Pankreaszellen cloniert und seine Sequenz bereits bestimmt. Da es
sich um eine relativ kurze Kette handelt, ist es
vorteilhaft, ein synthetisches menschliches PSTI-Gen zu verwenden.
Natürlich kann es auch nach dem üblichen Verfahren aus
menschlichen Pankreaszellen, wie von Yamamoto et al. (siehe
oben) durchgeführt, hergestellt werden. Bei dieser Sequenz
kann es sich sowohl um eine der die Aminosäuresequenz des in
Fig. 2 gezeigten menschlichen PSTI codierenden Sequenzen
handeln, als auch um natürliche, wie in Fig. 2 gezeigte DNA-
Sequenzen. Bei der Verbindung des menschlichen PSTI-Gens mit
einem APH-Gen wird bevorzugt die einen Met-Rest codierende
Sequenz ATG zwischen dem APH-Gen und dem 5'-Terminus des
humanen PSTI-Gens eingefügt. In diesem Fall kann das
menschliche PSTI aus dem exprimierten Fusionsprotein durch die
Behandlung mit Bromcyan leicht gewonnen werden.
-
Wenn Rattenactin in einem Mikroorganismus als reifes
Nicht-Fusionsactin exprimiert wird, ist die Ausbeute sehr
gering. Wenn es jedoch mit mehr als 13 Aminosäureresten des
Aminoterminus von APH fusioniert ist, so wird es in dem
Mikroorganismus effizient hergestellt. Es können auch
weitere Proteine in hohen Ausbeuten hergestellt werden, falls
sie mit APH-Polypeptiden ähnlicher Länge fusioniert sind.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den
nachfolgenden Beispielen genauer erläutert. Diese Beispiele
beziehen sich zwar auf menschliches PSTI und Rattenactin, sollen
jedoch den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht
begrenzen.
Beispiel 1
Herstellung von menschlichem PSTI
-
Die Basensequenz des menschlichen PSTI-Gens wurde
unter Zugrundelegung der von Yamamoto et al. (Biochem.
Biophys. Res. Commun., 132, 1985, 605) bestimmten Sequenz
hergestellt und die Met codierende Sequenz ATG unmittelbar
vor dem Strukturgen für das reife Protein und das
Terminationscodon TGA unmittelbar danach eingefügt. Zu dieser
Sequenz wurden außerdem bestimmte Basensequenzen so
hinzugefügt, daß diene an ihrem 5'-Ende die Erkennungsstelle für
das Restriktionsenzym AccI und an ihrem 3'-Ende die
Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BamHI besaß und so ein
zwei Ketten mit Kettenlängen von 179 und 181 umfassender
Doppelstrang erhalten wurde.
-
Zwanzig Arten von kurzkettigen DNA-Fragmenten wurden
in zwei Gruppen chemisch synthetisiert, von denen eine die
DNA-Kette bildet, welche die die Aminosäuresequenz von PSTI
codierende Basensequenz enthält und die andere eine zu der
codierenden Kette komplementäre DNA-Kette bildet, wenn diese
in der richtigen Sequenzfolge verbunden wird. Wenn alle
diese Arten miteinander gemischt werden, bilden diese
Fragmente durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen den zueinander komplementären Bereichen
doppelsträngige Strukturen, die kohäsive Enden als Erkennungsstellen
für die Restriktionsenzyme besitzen (Fig. 3).
-
Insgesamt wurden unter Verwendung eines automatischen
Nucleinsäuresynthesizers GENET A-II (Nippon Zeon) 20 Arten
von Fragmenten von U-l bis U-10 und L-1 bis L-10 (Fig. 3)
hergestellt. Jedes der so erhaltenen Fragmente wurde durch
Gelchromatographie mit Sephadex G-50 und
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einer
Umkehrphasen-Kieselgelsäule (Nucleosil 10C18, 10·250 mm) gereinigt.
-
Da das synthetisierte Oligonucleotid an seinem 5'-
Ende keine Phosphatgruppe besitzt, kann es nicht direkt für
die Ligierungsreaktion mit T4 DNA-Ligase verwendet werden.
Mit Ausnahme von U-1 und L-10 wurden 18 der 20 synthetischen
Oligonucleotide für die enzymatische Additionsreaktion einer
Phosphorsäuregruppe an das 5'-Ende verwendet. Die
Phosphorsäuregruppen-Additionsreaktion wurde unter Verwendung von
T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
durchgeführt. Etwa 300 pmol jedes Oligonucleotids wurden in 25 il
Kinasereaktionslösung (50 mM Tris-Hydrochloridpuffer, 10 mM
Magnesiumchlorid, 10 mM 2-Mercaptoethanol, etwa 1000 pmol
ATP, pH 7,6) gelöst und zum Start der Reaktion 3 Einheiten
des Enzyms zu der Reaktionslösung gegeben. Die Reaktion
wurde 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt. Die
T4-Polynucleotidkinase wurde durch Hitzebehandlung (65ºC, 20 Minuten)
inaktiviert und das Gemisch direkt für die anschließende
Ligierungsreaktion verwendet. Eine Ligierungsreaktionslösung
wurde durch Mischen von jeweils 50 pmol der 18
phosphorylierten synthetischen Oligonucleotide U-2 bis U-10 und L-1
bis L-9 und der 2 nicht phosphorylierten synthetischen
Oligonucleotide U-1 und L-10 hergestellt. Die Ligierungslösung
wurde zuerst 2 Minuten auf 80ºC erhitzt und dann nach und
nach auf 20ºC abgekühlt. Danach erfolgte nach Zugabe von
Dithiothreit, ATP und T4-DNA-Ligase die Ligierungsreaktion.
Die endgültige Ligierungsreaktionslösung (200 !l) enthielt
66 mM Tris-Hydrochloridpuffer, 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10
mM Dithiothreit, 1 mM ATP und 700 Einheiten T4-DNA-Ligase
(Takara Shuzo Co., Ltd.); die Reaktion erfolgte 5 Tage lang
bei 4ºC. Dieses Vorgehen entspricht im Prinzip dem in
Nucleic Acids Res. 13, S. 2959 (1985) beschriebenen
Verfahren. Im Anschluß an die Ligierungsreaktion wurden in
üblicher Weise Phenolextraktion und Ethanolfällung durchgeführt,
zur Auftrennung erfolgte Polyacrylamidgelelektrophorese in
Tris-Boratpufferlösung. Die gewünschten DNA-Fragmente von
etwa 180 bp wurden elektrophoretisch unter Verwendung von
DEAE-Membranen gewonnen. Die auf dem Gel aufgetrennte DNA
wurde mit Ethidiumbromid angefärbt, nach der Einfügung der
DEAE-Membran (Schleicher und Schuell) in das Gel in der Nähe
der gewünschten DNA-Bande wurde die DNA-Bande
elektrophoretisch an die DEAE-Membran adsorbiert. Nach der Beendigung
des Lauf s der DNA-Bande wurde die DNA von der DEAE-Membran
mit 1,0 M Natriumchlorid-10 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH
8,0)-1 mM EDTA eluiert und durch Ethanolfällung gewonnen.
(Dieses übliche Verfahren ist ausführlich z. B. in "Molecular
Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982,
beschrieben). Diese gewonnenen DNA-Fragmente wurden zur
Bestimmung der Basensequenz in den M13 Phagenvektor eingefügt.
Der M13 mp10-Vektor (Takara Shuzo Cop., Ltd.) wurde mit den
Restriktionsenzymen AccI und BamHI gespalten. Dieser
linearisierte mp10-Vektor und die gewonnenen DNA-Fragmente
wurden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase miteinander
ligiert. Die Ligierungsreaktion wurde unter fast denselben
Bedingungen, wie sie vorstehend für die Oligonucleotide
beschrieben wurden, durchgeführt, außer, daß die
Reaktionstemperatur 12ºC und die Zeit 16 Stunden betrug. Nach der
Ligierungsreaktion wurde die DNA zur Transformation nach dem in
"Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory, New
York, 1982, S. 250-251) beschriebenen Verfahren verwendet.
Die Transformation erfolgte durch das Mischen kompetenter
Zellen, die durch die Behandlung einer Kultur des E. coli K-
12-Stamms JM103 in der logarithmischen Wachstumsphase mit
Calciumchlorid bei 0ºC erhalten wurden, mit der DNA nach der
Ligierungsreaktion, Inkubation im Eis und 2minütiger
Behandlung bei 42ºC. Da die mit M13 Phagen infizierten E. coli
eine verzögerte Wachstumsgeschwindigkeit zeigen, erscheinen
diese als Plaque. Die DNA enthaltenden JM103 wurden zu 20 il
100 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid, 50 ul 2 % 5-Brom-4-
chlor-3-indolyl-β-galactosid, 0,2 ml der JM103-Kultur in
logarithmischer Wachstumsphase und 3 ml Weichagarlösung (0,6
% Agarlösung) gegeben, und auf eine Platte mit 1,5 % festem
Agar gegeben. Der verwendete Agar enthielt TY-Medium (8 g
Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid in 1 Liter
Wasser). Nach Inkubation bei 37ºC über Nacht bildet die
Transformante einen Plaque. Eine Transformante von M13mp10
selbst bildet einen blauen Plaque, die Transformation mit
M13-Phagen mit einer Deletion oder Insertion des
DNA-Fragments führt zur Bildung eines farblosen Plaques. Nach dem
Verfahren von Messing (Methods Enzymol. 101, 1983, S. 20-28)
wurde eine einzelsträngige Phagen-DNA folgendermaßen
hergestellt. Eine Übernachtkultur (1 ml) des E. coli K-12-Stammes
JM103 wurde in 100 ml 2·TY-Medium (2 x TY-Medium: 16 g
Bactotrypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid/Liter)
überführt und 2 Stunden bei 37ºC unter Schütteln inkubiert.
Diese Kultur wurde in 5 ml Aliquots aufgeteilt. Der Agar,
auf dem sich ein Plaque gebildet hatte, wurde unter
Verwendung einer Kapillarpippette ausgeschnitten und in das
vorstehende Aliquot inoculiert. Im Anschluß daran wurde die
Infektion mit dem M13-Phagen und seine Freisetzung in das
Medium durch weiteres 5 Stunden langes Inkubieren der Lösung
bei 37ºC erreicht. Die Organismen in dieser Kultur wurden
für die Herstellung einer replikativen doppelsträngigen DNA
und der Mediumüberstand, aus dem die Organismen entfernt
waren, für die Herstellung einzelsträngiger Phagen-DNA
verwendet. Zu dem Mediumüberstand (4 ml) wurden 800 ul einer
Lösung aus 20 % Polyethylenglykol und 2,5 M Natriumchlorid
zugegeben und die Phagen durch Zentrifugation geerntet. Die
Phagen wurden in 500 ul 10 mM Tris-Hydrochloridpuffer und 1
mM EDTA (pH 8,0) gelöst und die einzelsträngige Phagen-DNA
durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gewonnen. Die
Herstellung der replikativen doppelsträngigen DNA aus mit
Phagen infizierten Organismen entsprach dem üblichem
Natriumhydroxid-Natriumdodecylsulfat (SDS) -Verfahren (Nucleic Acids
Res. Z, 1979, S. 1513-1529). Die aus 5 ml der Kultur
erhaltenen Organismen wurden in 100 ul 50 mM Glucose, 25 mM Tris-
Hydrochlorid (pH 8,0), 10 mM EDTA und 1 mg/ml Lysozym
suspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
Dazu wurden 200 ul 0,2 M Natriumhydroxid- 1 % SDS zugegeben,
vorsichtig gemischt und 5 Minuten im Eis stehengelassen.
Danach wurden 150 ul 5 M Kaliumacetat (pH 5,2) zugegeben und
gemischt, das Gemisch ließ man 5 Minuten oder länger auf Eis
stehen. Nach Zentrifugation wurden 2 Volumina Ethanol zu dem
Überstand gegeben und das Sediment gewonnen. Nach Lösen des
Sediments wurde nochmals eine Ethanolfällung durchgeführt.
Durch dieses Verfahren wurde eine replikative
doppelsträngige DNA aus dem farblosen Plaque hergestellt. Diese wurde
einer Doppelspaltung mit AccI und BamHI unterworfen und es
bestätigte sich, daß DNA-Fragmente von etwa 180 bp erzeugt
wurden. Danach wurde die aus demselben Plaque hergestellte
einzelsträngige Phagen-DNA für die Bestimmung der
DNA-Basensequenz nach dem Dideoxy-Verfahren (Science 214, 1981, S.
1205-1210) verwendet. Die Basensequenz wurde unter
Verwendung des M13-Sequenzierungskits (Takara Shuzo Co., Ltd.)
bestimmt. Dabei bestätigte sich, daß der erhaltene Clon den
gesamten Bereich des PSTI-Strukturgens enthielt. Die
replikative
doppelsträngige DNA, bei der die Basensequenz
ermittelt worden war, wurde darauf zur Herstellung eines
Expressionsplasmids verwendet.
-
Das Expressionsplasmid für PSTI wurde durch die
Ligierung der drei nachstehend gezeigten Fragmente
hergestellt:
-
a) des durch die vorstehende Ligierung der
synthetischen Oligonucleotide erhaltenen AccI-BamHI-Fragments mit
etwa 180 bp, dessen Basensequenz bestätigt worden war;
-
b) des durch Spaltung von pUC13 (Takara Shuzo Co.,
Ltd.) mit HindIII-BamHI erhaltenen DNA-Fragments von etwa
2,8 Kbp;
-
c) des durch Spaltung von pNEO (das APH-Gen von Tn5
enthaltend, Pharmacia) mit HindIII und weiterer Spaltung mit
TaqI erhaltenen DNA-Fragments von etwa 600 bp (entsprechend
der DNA-Sequenz von Position -350 bis 246 in Fig. 2, siehe
Fig. 4).
-
Von diesen Fragmenten wurden die Fragmente a und c
durch Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert, unter
Verwendung von DEAE-Membranen gewonnen und für die Ligierung
verwendet. Fragment b wurde nach Bestätigung der Doppelspaltung
mit Phenol extrahiert, Ethanol-gefällt und für die Ligierung
verwendet. Das durch die Ligierung dieser drei Fragmente
erhaltene Expressionsplasmid exprimiert ein Fusionsprotein,
wobei PSTI stromabwärts der 82 aminoterminalen
Aminosäurereste des in Transposon Tn5 codierten APH angeknüpft ist.
Die Ligierung dieser drei Fragmente wurde auf dieselbe Weise
wie vorstehend erwähnt, ebenfalls unter Verwendung von T4
DNA-Ligase, durchgeführt. Die ligierte DNA wurde für die
Transformation nach dem in Molecular Cloning (op. cit.)
erwähnten Verfahren verwendet. Als DNA-Empfänger wurden die E.
coli K-12 Stämme C600 oder AG-1 verwendet. Da die
Transformante Resistenz gegenüber Ampicillin erwirbt, bildet sie
eine Kolonie auf einer Ampicillin enthaltenden Agarplatte
(LB-Medium: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g
Natriumchlorid in 1 Liter). 12 der entstandenen Kolonien wurden mit
Hilfe einer Platinöse in 5 ml 40 ug/ml Ampicillin
enthaltendes
LB-Medium überführt und 16 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Die Organismen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und
das Plasmid mittels des vorstehend erwähnten
Natriumhydroxid-SDS-Verfahrens untersucht. Das gewünschte Plasmid
enthält jeweils eine einzige Spaltstelle für HindIII, BamHI und
PstI. Daher bildet das gewünschte Plasmid pUCKMFPSTI bei
Spaltung mit einem dieser Restriktionsenzyme eine DNA-Bande
in linearer Form von etwa 3,6 Kb (siehe Fig. 5). Der
pUCKMFPSTI enthaltende Clon wurde für die nachstehende
Expression verwendet.
-
Der Clon wurde in LB-Medium (das 40 ug/ml Ampicillin
enthielt) inkubiert, nachdem das Tragen des gewünschten
Plasmids bestätigt worden war, und in Gegenwart von 50 %
Glycerin bei -70ºC aufbewahrt. Diese Konservierungslösung
für Bakterien (10 ul) wurde zu 5 ml Ampicillin enthaltendem
LB-Medium gegeben und 8 Stunden bei 37ºC inkubiert. Diese
Kultur (100 il) wurde zu 5 ml Ampicillin enthaltendem
M9-Medium gegeben (M9-Medium: 6 g Dinatriumhydrogenphosphat, 3 g
Natriumdihydrogenphosphat, 0,5 g Natriumchlorid und 1 g
Ammoniumchlorid wurden in 1 Liter Wasser gelöst und
sterilisiert, danach Magnesiumsulfat und Calciumchlorid bis zu
einer Endkonzentration von 2 mM bzw. 0,1 mM und außerdem 40
ug/ml Ampicillin, 0,5 % Glukose und 0,5 % Casaminosäuren
zugegeben) und 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach Inkubation
wurden die Organismen durch Zentrifugation geerntet und für
die nachstehende Untersuchung verwendet.
-
Ein kleines Aliquot der Organismen wurde als Probe
für die Analyse mit Polyacrylamidgelelektrophorese in
Gegenwart von SDS (SDS-PAGE) verwendet. Das bakterielle Protein
wurde in 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 6,8), 1 % SDS, 1
% 2-Mercaptoethanol und 20 % Glycerin solubilisiert,
extrahiert und durch Gelelektrophorese analysiert. In diesem
Stadium erscheint das PSTI enthaltende Fusionsprotein als eine
der Hauptbanden an einer Position, die einem erwarteten
Molekulargewicht von 15000 entspricht, und es zeigte sich, daß
es in E. coli exprimiert wird. Nachdem die E. coli
ultraschallbehandelt, durch Zentrifugation in die lösliche
Proteinfraktion
und die unlösliche Proteinfraktion aufgetrennt
und durch SDS-PAGE untersucht worden waren, stellte sich
heraus, daß das Fusionsprotein hauptsächlich in der
unlöslichen Proteinfraktion vorhanden war.
-
Die vorstehenden Mikroorganismen (6 g) wurden in 20
ml 5 mM EDTA enthaltendem 0,1 M Tris-Hydrochlorid (pH 7,0)
suspendiert und 10 Minuten bei 12 000·g zentrifugiert.
Nach Wiederholung desselben Vorgangs wurde das Sediment in
15 ml 5 mM EDTA, 50 mM Benzamidin und 1 mM
Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltendem 0,1 M Tris-Hydrochlorid (pH 7,0)
suspendiert und unter Verwendung einer French-Presse bei
einem Druck von 400 kg/cm² zerdrückt. Das durch 20minütige
Zentrifugation bei 23 000·g erhaltene Pellet (1,05 g)
wurde in 10 ml 20 mM Dithiothreit (DTT) und ein
Protein-denaturierendes Reagens enthaltendem 0,1 M Natriumphosphat (pH
7,0) gelöst und einer Gelfiltration auf einer Sephacryl S-
200-Säule (2,6·79 cm) unterworfen, die mit 1 mM DTT und 7
M Harnstoff enthaltendem 0,1 M Tris-Hydrochlorid (pH 7,2)
äquilibriert worden war. Fraktionen mit einem
Molekulargewicht von etwa 17 000 wurden gesammelt, gegen destilliertes
Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das
gefriergetrocknete Material wurde in 2 ml 70 % Ameisensäure gelöst
und danach 6 Stunden bei Raumtemperatur mit 160 mg Bromcyan
umgesetzt. Durch Zugabe von 18 ml destilliertem Wasser und
die darauf folgende Gefriertrocknung wurde die Reaktion
beendet. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in 2 ml 2 mM
EDTA und 6 M Guanidinhydrochlorid enthaltendem 0,5
Tris-Hydrochlorid (pH 8,1) gelöst und 100 ul 2-Mercaptoethanol
wurden zugegeben. Man ließ das Gemisch sich unter einer
Stickstoffatmosphäre 4 Stunden bei 37ºC umsetzen, und das Produkt
wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das dialysierte
Material wurde 1 Minute bei 10 000·g zentrifugiert, zu 6
ml des Überstands 172 mg NaCl und 320 ul 1 M
Tris-Hydrochlorid (pH 8,0) gegeben und das Gemisch auf eine Rindertrypsin-
CH-Sepharose 4B-Säule gegeben, die vorher mit 0,5 M NaCl
enthaltendem 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) äquilibriert worden
war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer und danach mit
destilliertem Wasser gewaschen. Die mit 10 mM Salzsäure
eluierten PSTI-Fraktionen wurden vereinigt und danach
gefriergetrocknet, wobei 1,55 mg des gereinigten Produkts erhalten
wurden.
-
Rekombinanter menschlicher PSTI (rHn-PSTI) (12 ug)
wurde in verschlossenen, evakuierten Teströhrchen (10·90
mm) mit 50 ul 4 M Methansulfonsäure (0,2 %
3-(2-Aminoethyl)indol enthaltend) 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert.
die Aminosäureanalyse wurde mit einem
Hitachi-Aminosäureanalysegerät (Modell 835) durchgeführt. Die
Aminosäurezusammensetzung von rHn-PSTI, die mit der von natürlichem
menschlichem PSTI vollkommen übereinstimmt, ist in Tabelle 1
gezeigt.
Tabelle 1
-
Aminosäure experimenteller Wert theoretischer Wert
-
Asparaginsäure 7,8 8
-
Threonin 3,8 4
-
Serin 2,8 3
-
Glutaminsäure 6,2 6
-
Prolin 2,9 3
-
Glycin 5,2 5
-
Alanin 1,4 1
-
Cystin 2,5 3
-
Valin 2,0 2
-
Methionin 0,0 0
-
Isoleucin 2,8 3
-
Leucin 4,0 4
-
Tyrosin 2,9 3
-
Phenylalamin 1,2 1
-
Lysin 3,8 4
-
Histidin 0,0 0
-
Tryptophan 0,0 0
-
Arginin 3,0 3
-
Die partielle amino-terminale Aminosäuresequenz von
rHn-PSTI wurde mit dem Edman-Verfahren (modifiziertes
Verfahren nach Iwanaga et al., Eur. J. Biochem. 8, 1969, S.
189-199) als Asp-Ser-Leu bestimmt, was mit der von
natürlichem menschlichem PSTI übereinstimmt. Außerdem hemmte rHu-
PSTI die Aktivität von Rindertrypsin stöchiometrisch, und
bezüglich der Immunreaktivität gegenüber polyclonalem gegen
natürliches menschliches PSTI gerichtetem Kaninchenantiserum
stimmte seine Verdünnungskurve mit der von natürlichem
menschlichem PSTI überein.
Beispiel 2
Herstellung von Rattenactin
-
Zur Herstellung des Expressionsplasmids für ein
Fusionsprotein wurden einleitend verschiedene Vektoren
hergestellt. Zuerst wurde ein HindIII-SalI-Fragment des
Transposons Tn5 (abgeleitet von pNEO, Pharmacia) in die HindIII-
SalI-Stelle on pUC13 (Takara Shuzo Co., Ltd.) inseriert
(siehe Fig. 6). Da diese DNA das APH-Gen des Transposons Tn5
vollständig enthält, erwerben die E. coli, in die die
gewünschte DNA eingeschleust wurde, Resistenz gegenüber
Kanamycin, was die Selektion transformierter E. coli-Zellen
erlaubt. pUC13 wurde einer Doppelspaltung mit den
Restriktionsenzymen HindIII und SalI unterworfen. Die Bedingungen
für die Spaltung mit dem jeweiligen Enzym entsprach den
Angaben der Hersteller. pNEO wurde in gleicher Weise einer
Doppelspaltung mit HindIII und SalI unterworfen, das
erhaltene DNA-Fragment von etwa 1,5 kb durch
Agaroseelektrophorose abgetrennt und unter Verwendung einer DEAE-Membran
(Schleicher & Schuell) gewonnen. Die DNA in dem Gel wurde
mit Ethidiumbromid fluoreszengefärbte und danach die DEAE-
Membran in der Nähe der DNA-Bande eingefügt, die durch
Elektrophorese zu der DEAE-Membran wanderte. Die an die DEAE-
Membran adsorbierte DNA wurde mit 1 M Natriumchlorid - 10 mM
Tris-Hydrochloridpuffer (pH 8,0) - 1 mM
Ethylendiamtetraessigsäure (EDTA) bei 65º eluiert, entsalzt, und durch
Ethanolfällung konzentriert. Dabei handelt es sich um ein
übliches, in der Literatur beschriebenes Verfahren
(Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. "Molecular
Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)). Zur
Ligierung der beiden Fragmente wurde T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo
Co., Ltd.) verwendet und die Reaktion 15 Stunden bei 12ºC in
einer 66 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,6) - 6,6 mM
Magnesiumchlorid - 10 mM Dithiothreit - 1 mM Adenosintriphosphat
enthaltenden Lösung durchgeführt. Als DNA-Empfänger wurde
der E. coli K-12-Stamm JM103 verwendet. Bei JM103 handelt es
sich um einen weit verbreiteten Stamm, der z. B. zusammen mit
pDR540 von Pharmacia erhältlich ist. Die für die
Transformation verwendeten Organismen wurden durch eine Behandlung der
Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase mit
Calciumchlorid bei 0ºC erhalten. Die so erhaltenen, für DNA
empfänglichen Organismen wurden mit der ligierten DNA-Probe
gemischt, und das Gemisch 20 Minuten auf Eis stehengelassen.
Mach 2minütigem Erhitzen auf 42ºC und 10minütigem Halten auf
25ºC wurden die Transformanten auf einer Agarplatte
selektioniert. Der Agar auf dieser Platte setzte sich zusammen
aus die Antibiotika Kanamycin (50 ug/ml) und Ampicillin (100
ug/ml) enthaltendem 1,5 % Agar [der LB-Medium [10 g Trypton,
5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid in 1 Liter]
enthielt]. Bei dieser Clonierung müssen die meisten der
gebildeten Kolonien das gewünschte Plasmid enthalten, es
wurden jedoch aus jeder Kolonie Plasmide präpariert und
untersucht. 5 Kolonien wurden von der Agarplatte in 5 ml
LB-Medium überführt und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Aus diesen
Bakterien wurde das Plasmid nach dem alkalischen
Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Verfahren (Birnboim, H.C. & Doly, J.,
Nucl. Acids Res. 7 (1979), S. 1513-1523) präpariert und
einer Doppelspaltung an der bei der Clonierung verwendeten
HindIII-Stelle und der EcoRI-Stelle von pUC13 unterworfen;
es bestätigte sich, daß ein Fragment von etwa 1,5 Kb erzeugt
wurde. Das so erhaltene Plasmid (pUCKM) wurde mit PstI
gespalten, von den durch Agarosegelelektrophorese
aufgetrennten DNAs wurde nur das große Fragment durch das vorstehende
Verfahren aus dem Gel gewonnen und unter Verwendung von T4
DNA-Ligase zirkularisiert. Die damit erhaltene Transformante
wurde auf einer Ampicillin (100 ug/ml) enthaltenden
Agarplatte (1,5 % Agar, LB-Medium) selektioniert und das Plasmid
aus den aufgetretenen Kolonien auf dieselbe Art, wie
vorstehend beschrieben, präpariert. Durch Agarosegelelektrophorese
wurde bestätigt, daß bei Doppelspaltung mit HindIII und PstI
zwei DNA-Banden auftraten, deren Größen 2,7 Kb und 0,6 Kb
entsprachen. Das durch diese Clonierung erhaltene gewünschte
Plasmid (pUCKMF) stellt ein allgemeines Expressionsplasmid
für Fusionsproteine dar. Eine multiple Clonierungsstelle von
pUC13 stromabwärts der SalI-Stelle des Plasmids bleibt
unverändert, was für die Einfügung eines Gens eines
gewünschten Proteins zur Expression eines Fusionsproteins günstig
ist. Da außerdem die SalI-Stelle auch die Spaltstelle für
AccI und HincII darstellt, wird die Anpassung der Leserahmen
des von dem APH-Gen codierten Proteins und des gewünschten
Gens bei der Verknüpfung dadurch erleichtert, daß die
Unterschiede in der Art der Spaltung mit den drei
Restriktionsenzymen und die darauffolgende Reparatur durch Polymerase
ausgenutzt wird.
-
Bei der Herstellung eines Expressionsvektors für ein
Fusionsprotein mit Actin wurde pUCACT als Donorplasmid für
die reifes Actin codierende DNA-Sequenz (siehe Fig. 7)
verwendet (Ohara, O. et al., Proceedings of the 23rd Meeting of
Japan Society of Biophysics) (siehe Fig. 8). Einleitend
wurde mRNA aus dem Hinterbeinmuskel der Ratte nach dem SDS-
Phenol-Verfahren (Brawerman, G., Methods in Enzymology 30
(1974), S. 605-612) präpariert und eine cDNA-Bank nach dem
Okayama-Berg-Verfahren (Okayama, H. & Berg, P., Mol. Cell
Biol. 2, S. 161-170, 1982) hergestellt. Auf dieser Genbank
wurde der die Rattenskelettmuskelactin-cDNA aufweisende Clon
durch Koloniehybridisierung selektiert (Grunstein, M. &
Hogness, D.5., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (1975), S.
3961-3965). Die für das Screening verwendeten Probe stammt
vom β-Actingen (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Aus
den durch dieses Screening erhaltenen Clonen wurde das
Plasmid nach dem alkalischen SDS-Verfahren präpariert. Die
Sequenz der cDNA wurde unter Zugrundelegung der bekannten
Basensequenz des chromosomalen Gens für
Rattenskelettmuskelactin (Nature 298 (1982), S. 857-859) abgeleitet und mit der
cDNA-Basensequenz des erhaltenen Clons verglichen. Die
Basensequenz wurde unter Verwendung des M13-Sequenzierungskits
von Takara Shuzo Co., Ltd., bestimmt. Dabei bestätigte sich,
daß es sich bei der so erhaltenen cDNA um eine
Rattenskelettmuskelactin-cDNA mit vollständiger Länge handelte, mit
der dann pUCACT hergestellt wurde. Zum Erhalt einer, das
reife Act in codierenden Basensequenz wurde das
Primer-Verlängerungs ("primer elongation"-) Verfahren angewandt. Die
Rattenactin- cDNA wurde als PstI-Fragment (etwa 1,4 Kb)
hergestellt und nach dem vorstehend beschriebenen Agarosegel-
Elektrophoreseverfahren gewonnen. Dieses Fragment und der
mit PstI gespaltene M13 mp10 Phagen-Vektor wurden einer
Ligierungsreaktion mit T4-DNA-Ligase, wie vorstehend erwähnt,
unterworfen. Mit dem Produkt dieser Ligierungsreaktion wurde
der Stamm JM103 transformiert und die Transformante mit 40
ul 100 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, 40 ul 2 % 5-
Brom-4-chlor-3-indoryl-β-galactosid (Dimethylformamidlösung)
und 250 ul JM103-Kultur (LB-Medium) gemischt. Das Gemisch
wurde zu 0,6 % geschmolzenem Agar gegeben, auf 42ºC
gehalten, der dann auf eine Platte mit 1,5 % festem Agar
(TY-Medium) gegossen wurde. (TY-Medium: 8 g Trypton, 5 g
Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid/Liter) Nach der Verfestigung
der oberen Agarschicht wurde die Platte über Nacht bei 37ºC
gehalten. Die mit dem M13-Phagen infizierten Organismen sind
in ihrer Wachstumsrate verzögert und bilden Plaques. Der
rekombinante Phage, in den das DNA-Fragment eingefügt ist,
erscheint als ein farbloser Plaque und der von M13 mp10
abstammende Phage als ein blauer Plaque, so daß der farblose
Plaque selektiert werden kann. Eine E. coli JM103
Übernachtkultur (1 ml) wurde in 100 ml 2·TY-Medium (16 g Trypton,
10 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid/Liter) überführt und
nach einer 2stündigen Inkubation wurden jeweils 5 ml in
Teströhrchen verteilt. Nach Ausschneiden mit einer
Kapillarpipette wurde in jedes Teströhrchen ein Agar enthaltender,
farbloser Plaque inoculiert. Nachdem für weitere 5 Stunden
bei 37ºC inkubiert worden war, wurden der Überstand und die
Organismen durch Zentrifugation getrennt. Aus den Organismen
wurde die replikative doppelsträngige DNA nach dem
vorstehend erwähnten alkalischen SDS-Verfahren hergestellt und aus
dem Überstand eine einzelsträngige Phagen-DNA hergestellt.
Zu dem Überstand wurden etwa 800 ul 20 % Polyethylenglykol
6000 und 2,5 N Natriumchlorid gegeben, und die Phagen durch
Zentrifugation sedimentiert. Die Phagen wurden in 10 mM
Tris-Hydrochlorid (pH 8,0) - 1 mM EDTA suspendiert und durch
Phenolextraktion und Ethanolfällung einzelsträngige DNA
hergestellt. Da sich auf der Actin-cDNA eine BamHI-Stelle
befindet, erhält man bei der Spaltung der aus dem farblosen
Plaque hergestellten doppelsträngigen DNA mit BamHI bei der
Agarosegelelektrophorese ein Fragment von etwa 1000 bp oder
400 bp. Dies beruht darauf, daß bei dieser Clonierung die
Actin-cDNA in zwei Orientierungen eingefügt werden kann,
wobei eine Phagen-DNA gewünscht ist, bei der das Fragment mit
etwa 1000 bp erzeugt wird. Die aus dem Clon, der die für
diese Untersuchung als gewünscht erachtete Phagen-DNA
besitzt, hergestellte einzelsträngige Phagen-DNA, wurde für
die Herstellung von pUCACT verwendet. Ein Oligonucleotid mit
der Basensequenz, die die 5 aminoterminalen Reste des reifen
Actins codiert, wurde nach dem Phosphotriester-Verfahren
synthetisiert (Nucl. Acids Res. 8 (1980), S.5507-5517). Das
15-mer-Oligonucleotid umfaßt die Sequenz
5'GACGAGGACGAGACC3'. Dieses Oligonucleotid und die durch die
obige Clonierung erhaltene einzelsträngige Phagen-DNA wurden
gemischt und danach unter Verwendung der einzelsträngigen
Phagen-DNA als Matrize 2 Stunden bei 37ºC in 10 mM
Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,5), 7 mM Magnesiumchlorid, 20 mM
Natriumchlorid und jeweils 0,2 mM der 4 dNTPs mit dem E.
coli-Polyinerase I Klenow-Fragment verlängert. Nach der
Reaktion wurde die DNA durch Phenolextraktion und Ethanolfällung
gewonnen und der verbleibende einzelsträngige Bereich mit
Nuclease SI gespalten. Nach Gewinnung der DNA durch
Phenolextraktion und Ethanolfällung wurden durch Reparatur mit dem
E. coli-Polymerase I Klenow-Fragment glatte Enden erzeugt.
-
Die Reparaturreaktion wurde unter denselben Bedingungen wie
die Elongationsreaktion durchgeführt. Nach der Reaktion
wurde die Probe 20 Minuten bei 65ºC zur Inaktivierung des
Klenow-Fragments behandelt. Zu dem Gemisch wurde
Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben
und mit PstI gespalten.
-
Die Spaltprodukte wurden durch
Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung einer DEAE-Membran
eine DNA-Bande von etwa 1,2 Kb gewonnen. Das mit HincII und
PstI gespaltene Produkt aus pUC13 und das vorstehende DNA-
Fragment wurden gemischt und unter Verwendung von
T4-DNA-Ligase ligiert. Die Transformanten wurden, wie vorstehend
erwähnt, auf einer Agarplatte (1,5 % Agar, LB-Medium,
Ampicillin 100 ug/ml) selektioniert und Plasmide aus 9 willkürlich
ausgewählten Kolonien nach dem alkalischen SDS-Verfahren
präpariert. Bei dem gewünschten Plasmid wird bei einer
Doppelspaltung mit HincII und EcoRI eine DNA-Bande von etwa 1,2
Kb erzeugt. Bei dem in dieser Untersuchung als gewünscht
erachteten Plasmid ist sowohl die bei der Clonierung
verwendete HincII-Stelle als auch die PstI-Stelle repariert. Ein
bei der ersten Base der reifes Act in codierenden
Basensequenz beginnendes DNA-Fragment kann ebenfalls durch Spaltung
mit HincII hergestellt werden. Durch die Spaltung dieses
Plasmids mit HindIII, der Reparatur mit E. coli-Polymerase I
Klenow-Fragment zur Erzeugung stumpfer Enden und der
anschließenden Spaltung mit SalI, wurde ein DNA-Fragment von
etwa 1,2 Kb erhalten, das aus dem Agarosegel gewonnen wurde.
Das SalI-SmaI-Spaltprodukt aus pUC13 und das vorstehende
DNA-Fragment wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase
verknüpft. Aus der Transformante wurde das Plasmid wie
vorstehend erwähnt präpariert, wobei aus dem gewünschten Plasmid
pUCACT durch Doppelspaltung mit EcoRI-HincII ein
DNA-Fragment von etwa 1,2 Kb erhalten wird.
-
Ein durch Doppelspaltung von pUCKMF mit HindIII-
HincII erhaltenes Fragment von etwa 600 bp und ein durch
Spaltung von pUCACT mit HindIII-HincII erhaltenes Fragment
von etwa 3,9 Kb wurden aus dem Agarosegel gewonnen und unter
Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die Transformante
(JM103) wurde auf die gleiche Weise, wie bereits erwähnt,
auf einer Ampicillin enthaltenden Agarplatte selektioniert
und aus etwa 10 Kolonien das Plasmid präpariert. Bei dem
gewünschten Plasmid wird bei Doppelspaltung mit HindIII-EcoRI
ein Fragment von etwa 1,5 Kb erzeugt. Das erhaltene
gewünschte Plasmid (pUCKMFACT) besitzt eine Sequenz, die eine
Polypeptidkette mit insgesamt 446 Resten codiert, die an
ihm Aminoende 61 von APH abstammende Aminosäurereste und 10
von dem Transposon Tn5 abstammende Aminosäurereste umfaßt
und darauf folgend- 375 Reste von Actin (siehe Fig. 9).
-
Zur Expression des fusionierten Actins wurde zuerst
das vorstehende pUCKMACT tragender E. coli in 40 ug/ml
Ampicillin enthaltendem LB-Medium 14 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Diese Kultur (100 ul) wurde zu 5 ml M9-Medium (6 g Na&sub2;HPO&sub4;,
3 g H&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl, 1 g NH&sub4;Cl/Liter, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM
CaCl&sub2;, 0,5 % Glycerin, 0,5 % Casaminosäuren und Ampicillin
40 ug/ml) gegeben und 10 Stunden bei 37ºC weiter inkubiert.
Zur Induktion wurde 2 Stunden nach der Inkubation
Isopropylβ-D-thiogalactopyranosid bis zu 1 mM zugegeben. Nach der
Inkubation wurden die Organismen durch Zentrifugation
sedimentiert und in 10 % Glycerin - 0,1 M Tris-Hydrochloridpuffer -
1 % SDS - 1 % 2-Mercaptoethanol suspendiert. Nach
Ultraschallbehandlung und 2minütigem Erhitzen auf 100ºC erfolgte
mit dem erhaltenen Produkt eine Analyse durch
Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von SDS nach dem Verfahren
von Laemmli et al. (Nature 227 (1970), 680-683).
-
Im Muster der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
konnte an einer Position, die fast dem Molekulargewicht des
gewünschten fusionierten Actins entsprach, eine deutliche
Bande entdeckt werden (etwa 15 % des bakteriellen
Gesamtproteins). Es konnte bestätigt werden, daß es sich bei dieser
Bande um das gewünschte Produkt handelte, da das Protein in
dieser Bande monoclonalen Antikörper gegen Act in (Amersham
International) binden konnte.
-
Das durch Doppelspaltung von pUCKMF mit HindIII-
HaeIII erhaltene DNA-Fragment von etwa 400 bp wurde mit der
DNA verknüpft, die durch Spaltung von pUCACT mit SalI,
Behandlung mit dem E. coli-Polymerase I-Klenow-Fragment und im
Anschluß daran- Spaltung mit HindIII erhalten wurde, wobei
ein Expressionsplasmid pUCKMFACT4 für fusioniertes Actin
erhalten wurde, das 12 Reste des Aminoterminus von APH und 1
Rest als verbindenden Bereich (insgesamt 13 Reste), gefolgt
von Actin, umfaßt. Bei der bereits vorstehend erwähnten Art
der Herstellung des Fusionsproteins unter Verwendung von E.
coli, die dieses Plasmid enthielten, konnte keine deutliche
Bande auf dem Gel beobachtet werden (weniger als 1 % des
bakteriellen Gesamtproteins).
-
Unter Verwendung des pUC-Vektors wurde ein
Expressionsplasmid für reifes Actin nach dem von Schoner et al.
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), S. 5403-5407)
beschriebenen Prinzip der Zwei-Cistron-Konstruktion aufgebaut
(siehe Fig. 9, 10 und 11). Bei der diesem Prinzip
folgenden Herstellung wurde das Terminationscodon TAA, die
Ribosomen-Bindungssequenz und das Initiationscodon ATG für den
Start der Translation des darauf folgenden Actingens
zwischen den die 60 Reste des Aminoterminus von APH codierenden
Bereich und das Actingen eingefügt. Damit wurde
beabsichtigt, reifes Actin zu exprimieren, ohne die hohe
Translationseffizienz der von dem stromaufwärts gelegenen APH-Gen
abgeleiteten Struktur zu opfern; die erfolgreiche Expression
von verschiedenen Genen durch ähnliche Verfahren wurde
beschrieben (EP-154539).
-
pUCKMF wurde mit PstI gespalten und unter Verwendung
des E. coli-Polymerase I-Klenow-Fragments werden glatte
Enden erzeugt. An diese glatten Enden wurde mit T4-DNA-Ligase
nach dem üblichen Verfahren (Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York, 1982) ein XbaI-Linker
(5'-Phosphatlinker, 5'-CTCTAGAG-3'; Pharmacia) angeknüpft. Die mit
den XbaI-Linkern verknüpfte DNA wurde mit XbaI gespalten.
Nach der Spaltung mit XbaI wurde die DNA durch
Phenolextraktion und Ethanolfällung gewonnen. Die beiden Enden der
erhaltenen linearen DNA wurden mit T4-DNA-Ligase verbunden, so
daß diese eine geschlossene zirkuläre DNA bildete. Nach der
Ligierung wurde die DNA in E. coli JM103, genau wie
vorstehend beschrieben, eingeschleust und das Plasmid aus der
erhaltenen Transformante präpariert. Im Anschluß daran wurde
bestätigt, daß durch Spaltung mit HindIII und XbaI das
inserierte Fragment von etwa 600 bp erzeugt wird und daß keine
PstI-Spaltstelle vorhanden ist. Dieses Plasmid pUCKMF1 kann
nicht nur als Expressionsplasmid mittels der Zwei-Cistron-
Konstruktion, sondern auch zur Konstruktion eines
Expressionsplasmids für fusioniertes Actin verwendet werden (siehe
Fig. 10).
-
Dieses pUCKMF1 wurde mit XbaI und im Anschluß daran
mit Klenow-Fragment behandelt und dann weiter mit EcoRI
gespalten. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit Hilfe von
T4-DNA-Ligase mit dem DNA-Fragment verbunden, das den Actin
codierenden Bereich von etwa 1,2 Kb enthält, welcher durch
Spaltung von pUCACT mit EcoRI nach Behandlung mit SalI und
dem Klenow-Fragment erzeugt wurde, wobei ein
Expressionsplasmid für fusioniertes Actin erhalten wurde. Dieses
Expressionsplasmid für fusioniertes Actin (pUCEMFACT1)
exprimiert Actin, das mit 60 Aminosäureresten des Aminoterminus
von APH und 3 Aminosäureresten als verbindendem Bereich
verknüpft ist (siehe Fig. 11).
-
Zur Konstruktion des Expressionsplasmids für reifes
Actin mittels der Zwei-Cistron-Konstruktion wurde ein
synthetisches Oligonucleotid in die XbaI-SstI-Stelle des pUC-
Vektors inseriert, der das APH-Gen enthielt, an das die
XbaI-Linker, wie vorstehend erwähnt, angefügt waren, so daß
die in Fig. 13 gezeigte Basensequenz stromabwärts der vom
APH-Gen stammenden Basensequenz gelegen ist. Der so
erhaltene Vektor kann als ATG-Vektor, wie von Nishi et al. (DNA 2
(1983), S. 265-273) berichtet, verwendet werden. Das heißt,
daß dieser bei geeigneter Enzymbehandlung als Spendervektor
für einen Promotor und eine für die Initiation der
Translation benötigte Basensequenz, einschließlich des
Initiationscodons, verwendet werden kann. Dieser Vektor wurde mit SstI
gespalten, mit dem Klenow-Fragment wurden glatte Enden
erzeugt und danach weiter mit EcoRI gespalten. Diese DNA wurde
unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem DNA-Fragment von
etwa 1,2 Kb verbunden, das den Actin codierenden Bereich
einschließt und durch Spaltung von pUCACT mit HincII-EcoRI
erhalten wurde, wobei ein Expressionsplasmid pUCKMACT für
reifes Act in entsprechend der Zwei-Cistron-Konstruktion
entstand (siehe fig. 12). Durch die Bestätigung, daß ein
Fragment von etwa 1,8 Kb bei der Spaltung des aus der
Transformante erhaltenden Plasmids mit HindIII-EcoRI erzeugt wurde,
und durch die Überprüfung der Basensequenz in der Nähe des
Initiationscodons ATG von Actin mit Hilfe des von Takara
Shuzo Co., Ltd. hergestellten Sequenzierungskits konnte
dieses als das gewünschte Plasmid identifiziert werden.
Änderung in der Ausbeute in Abhängigkeit von der Länge des
APH-Gens
-
Um zu überprüfen, wieviele Reste des Aminoterminus
des bei der Fusion verwendeten APH für eine hohe Expression
notwendig sind, wurde die mit der Kürzung des Fusionsteils
von APH durch Exonuclease BAL 31 von der pUCKMACT-HincII-
Stelle aus einhergehende Änderung der Ausbeute an
fusioniertem Actin untersucht, und es stellte sich heraus, daß das so
erzeugte fusionierte Act in mehr als 10 % des bakteriellen
Gesamtproteins ausmachte, wenn mindestens 25 Reste des
Aminoterminus von APH fusioniert waren.
-
Das mit SalI gespaltene pUCKMF wurde mit
Exonuclease BAL31 verdaut. Der Verdau mit BAL31 wurde in 20 mM
Tris-Hydrochloridpuffer (pH 8,0), 12 mM Calciumchlorid, 12
mM Magnesiumchlorid und 0,6 M Natriumchlorid durchgeführt
und die Reaktion durch die Zugabe von EDTA bis zu einer
Endkonzentration von 50 mM beendet. Die Verkürzung durch BAL31-
Behandlung ließ sich durch die Reaktionszeit bestimmen. Die
mit BAL31 verdaute DNA wurde zur Erzeugung glatter Enden mit
dem E. coli-Polymerase I Klenow-Fragment weiterbehandelt.
Nach Spaltung mit HindIII wurden Fragmente von etwa 400 bis
600 bp aus dem Agarosegel gewonnen. pUCACT wurde, nach
Spaltung mit SalI, mit dem E. coli-Polymerase I Klenow-Fragment
und HindIII behandelt. Das so erhaltene Plasmid und die
vorstehend erwähnte BAL31- behandelte DNA wurden unter
Verwendung
von T4-DNA-Ligase miteinander verbunden. Mit der so
erhaltenen DNA wurde E. coli JM103, wie vorstehend
beschrieben, transformiert und die Transformanten auf einer
Ampicillin enthaltenden Agarplatte selektioniert. Aus etwa 40
Kolonien wurden, nachdem diese inkubiert worden waren, Plasmide
präpariert. Aus der Größe der durch Spaltung mit BglII
erhaltenen DNA-Fragmente wurde die durch BAL31 Verkürzung der
DNA-Länge ungefähr abgeschätzt. Es wurde ein Clon
selektiert, der die DNA mit der gewünschten Verkürzung besaß, und
die Basensequenz an dem verbindenden Bereich zwischen den
Actin- und den A?H-Genen unter Verwendung des
Sequenzierungskits von Takara Shuzo Co., Ltd. bestimmt. Auf diese
Weise konnte das Expressionsplasmid für Actin isoliert
werden, das den Leserahmen, der der codierenden Region für
Act in entsprach und außerdem den verkürzten Bereich des APH-
Gens aufwies. Auf diese Weise wurden pUCKMFACT2, das das
Rattenactin nach 44 Aminosäureresten von APH und 1
Aminosäurerest der verbindenden Sequenz exprimiert, und pUCKMFACT3
erhalten, das das Rattenactin nach 24 Aminosäureresten von
APH und 1 Aminosäurerest der verbindenden Sequenz
exprimiert.
-
Die von den so erhaltenen Vektoren pUCKMFACT,
pUCKMFACT1, pUCKMFACT2, pUCKMFACT3, pUCKMFACT4 und pUCKMACT
exprimierten Fusionsproteine (wobei jedoch pUCKMACT reifes
Rattenactin exprimiert) sind in Fig. 14 gezeigt.
-
Die Ausbeute an dem jeweiligen Fusionsprotein wurde
durch Polyacrylamidgelelektrophorese der Proteine bestimmt
und die Untersuchungsergebnisse sind in Fig. 15 gezeigt. Die
Proteine wurden dazu extrahiert und durch Inkubation der das
jeweilige Plasmid enthaltenden E. coli und deren Aufbrechen
in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat solubilisiert. Die
Menge des jeweiligen Fusionsproteins wurde bestimmt aus der
an das fusionierte Act in nach dessen Überführung auf eine
Nitrocellulosemembran gebundenen Menge an monoclonalem Anti-
Actin-Antikörper oder durch die Anfärbung der Bande mit
Coomassie-Brilliant-Blau-R250.
-
Mit der Abnahme des fusionierten Bereichs von APH von
25 auf 13 Aminosäurereste (tatsächlich beträgt die Anzahl
der aminoterminalen Reste von APH 24 bzw. 12, da ein
Aminosäurerest als verbindender Anteil enthalten ist) konnte
gleichzeitig eine signifikante Abnahme in der Ausbeute
beobachtet werden. Dieses in der Ausbeute reduzierte fusionierte
Actin wurde jedoch 5 bis 10mal höher exprimiert als das von
pUCKMACT exprimierte reife Actin.