JP3003135B2 - ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 - Google Patents
ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法Info
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- JP3003135B2 JP3003135B2 JP18927089A JP18927089A JP3003135B2 JP 3003135 B2 JP3003135 B2 JP 3003135B2 JP 18927089 A JP18927089 A JP 18927089A JP 18927089 A JP18927089 A JP 18927089A JP 3003135 B2 JP3003135 B2 JP 3003135B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組み替えDNA、これにより形質転換された
生物及びこの生物を培養して目的ポリペプチドを製造す
る方法に関するものである。
生物及びこの生物を培養して目的ポリペプチドを製造す
る方法に関するものである。
組み替えDNA技術を用いて大腸菌により真核生物由来
の遺伝子を高レベルで発現させるためには、一般に大腸
菌のtrpプロモーターなどのプロモーターを用い、さら
に大腸菌遺伝子の有するリボゾーム結合領域であるシャ
イン・ダルガーノ配列（SD配列）を、翻訳開始のための
ATGを付加した真核生物由来遺伝子の上流に連結する方
法がとられる。
の遺伝子を高レベルで発現させるためには、一般に大腸
菌のtrpプロモーターなどのプロモーターを用い、さら
に大腸菌遺伝子の有するリボゾーム結合領域であるシャ
イン・ダルガーノ配列（SD配列）を、翻訳開始のための
ATGを付加した真核生物由来遺伝子の上流に連結する方
法がとられる。
しかし、この方法の場合、真核生物の目的ポリペプチ
ドが大腸菌体内に顆粒状（封入体inclusion bodies）と
なって蓄積されるほど高レベルに生産されることは稀で
あり、通常は菌体内に微量、溶解した状態で蓄積される
にとどまる。このような顆粒状に蓄積されない場合の蓄
積量を顆粒状に蓄積された場合の蓄積量と比較すると、
蛋白質の性質により異なるが、通常1/100ないし1/1000
と極めて少量である。従って、真核生物由来のポリペプ
チドを大腸菌を用いて工業的に生産する場合、目的ポリ
ペプチドを顆粒状にかつ大量に蓄積せしめることが出来
るか否かは工業生産を実施する場合にはきわめて重要な
要素となる。
ドが大腸菌体内に顆粒状（封入体inclusion bodies）と
なって蓄積されるほど高レベルに生産されることは稀で
あり、通常は菌体内に微量、溶解した状態で蓄積される
にとどまる。このような顆粒状に蓄積されない場合の蓄
積量を顆粒状に蓄積された場合の蓄積量と比較すると、
蛋白質の性質により異なるが、通常1/100ないし1/1000
と極めて少量である。従って、真核生物由来のポリペプ
チドを大腸菌を用いて工業的に生産する場合、目的ポリ
ペプチドを顆粒状にかつ大量に蓄積せしめることが出来
るか否かは工業生産を実施する場合にはきわめて重要な
要素となる。
一方、外来遺伝子の発現性を高める手段として、大腸
菌が本来、高レベルに生産している蛋白質の遺伝子、例
えば、lacZ、tufB等の遺伝子に外来遺伝子を連結すると
大腸菌の高レベル発現蛋白質と外来遺伝子由来蛋白質が
融合蛋白質の形で多量に生産される場合が多いことが知
られている（ヤング（Young,R.A.）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、80、1194−1198、1983）。これは遺伝子発
現系が、大腸菌の本来的にもっている蛋白質をコードす
る遺伝子を含むものであるために翻訳反応がスムーズに
開始されることが主要因と考えられる。しかし、この方
法で得られる蛋白質はその分子内に外来目的ポリペプチ
ドの構造を含んではいるものの目的ポリペプチドそのも
のではない。また、その融合蛋白質より目的ポリペプチ
ドを切断し、分離取得するための方法として、臭化シア
ンによるMet残基のあるいはヒドロキシルアミンによるA
sn−Gly結合の特異的切断という化学処理的切断法や、
リシルエンドペプチダーゼによるLys残基のあるいは血
液凝固因子Xaを用いるIIe−Glu−Gly−Arg配列の切断と
いう酵素的切断法等の開発もあるが、これら特異的切断
法の適用にはいくつかの以下に述べるような制限があ
る。一般に、化学的切断法はその実施コストは安くなる
が、切断の特異性が１アミノ酸残基等に限定されている
ため、目的ポリペプチド中にはその該アミノ酸残基が存
在しない確率はきわめて低く適用範囲が狭まってしま
う。他方、酵素的切断法においては、その酵素が非常に
高価格で、また大量入手が困難な場合が多く、目的ポリ
ペプチドの大量工業生産に対して充分には適合しえな
い。
菌が本来、高レベルに生産している蛋白質の遺伝子、例
えば、lacZ、tufB等の遺伝子に外来遺伝子を連結すると
大腸菌の高レベル発現蛋白質と外来遺伝子由来蛋白質が
融合蛋白質の形で多量に生産される場合が多いことが知
られている（ヤング（Young,R.A.）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、80、1194−1198、1983）。これは遺伝子発
現系が、大腸菌の本来的にもっている蛋白質をコードす
る遺伝子を含むものであるために翻訳反応がスムーズに
開始されることが主要因と考えられる。しかし、この方
法で得られる蛋白質はその分子内に外来目的ポリペプチ
ドの構造を含んではいるものの目的ポリペプチドそのも
のではない。また、その融合蛋白質より目的ポリペプチ
ドを切断し、分離取得するための方法として、臭化シア
ンによるMet残基のあるいはヒドロキシルアミンによるA
sn−Gly結合の特異的切断という化学処理的切断法や、
リシルエンドペプチダーゼによるLys残基のあるいは血
液凝固因子Xaを用いるIIe−Glu−Gly−Arg配列の切断と
いう酵素的切断法等の開発もあるが、これら特異的切断
法の適用にはいくつかの以下に述べるような制限があ
る。一般に、化学的切断法はその実施コストは安くなる
が、切断の特異性が１アミノ酸残基等に限定されている
ため、目的ポリペプチド中にはその該アミノ酸残基が存
在しない確率はきわめて低く適用範囲が狭まってしま
う。他方、酵素的切断法においては、その酵素が非常に
高価格で、また大量入手が困難な場合が多く、目的ポリ
ペプチドの大量工業生産に対して充分には適合しえな
い。
以上のような現状を踏まえた上で、真核生物由来の目
的ポリペプチドを工業的に得るためには、融合蛋白質と
してではなく、目的ポリペプチドをコードする遺伝子の
効率よい直接発現系の構築が重要となってくる。
的ポリペプチドを工業的に得るためには、融合蛋白質と
してではなく、目的ポリペプチドをコードする遺伝子の
効率よい直接発現系の構築が重要となってくる。
佐藤ら（J.Biochem.,101、525−534、1987）はヒトイ
ンターロイキン２の直接発現プラスミドを構築するに当
り、trpプロモータ、SD配列であるtrpLのリボゾーム結
合配列の下流にIL−2cDNAを連結したところ、これだけ
では高発現せずに、さらにcDNA下流の３′非翻訳領域の
削除、及びtrpAターミネーターの導入によって、ヒトイ
ンターロイキン２の高発現、さらには菌体内にIL−２の
顆粒を蓄積せしむるに至った。本遺伝子発現系の構成は
trpプロモーター、trpLのSD配列、目的ポリペプチドの
コード流域、３′非翻訳領域の削除、転写終結部位（tr
pAターミネーター）という外来遺伝子発現系の基本的装
置を備えているものであった。
ンターロイキン２の直接発現プラスミドを構築するに当
り、trpプロモータ、SD配列であるtrpLのリボゾーム結
合配列の下流にIL−2cDNAを連結したところ、これだけ
では高発現せずに、さらにcDNA下流の３′非翻訳領域の
削除、及びtrpAターミネーターの導入によって、ヒトイ
ンターロイキン２の高発現、さらには菌体内にIL−２の
顆粒を蓄積せしむるに至った。本遺伝子発現系の構成は
trpプロモーター、trpLのSD配列、目的ポリペプチドの
コード流域、３′非翻訳領域の削除、転写終結部位（tr
pAターミネーター）という外来遺伝子発現系の基本的装
置を備えているものであった。
そこで、本発現ベクターに成熟型ヒトインターロイキ
ン６（IL−６）をコードするcDNAを導入し、IL−６の生
産を試みたが、その結果、大腸菌体内に微量のIL−６が
可溶化状態で生産されるにとどまっていることが判明し
た。つまり、上記の一般的に採用される基本的外来遺伝
子発現装置のみでは、まだ目的ポリペプチドの顆粒状高
蓄積に至るには不完全な点が存在していることを示すも
のである。
ン６（IL−６）をコードするcDNAを導入し、IL−６の生
産を試みたが、その結果、大腸菌体内に微量のIL−６が
可溶化状態で生産されるにとどまっていることが判明し
た。つまり、上記の一般的に採用される基本的外来遺伝
子発現装置のみでは、まだ目的ポリペプチドの顆粒状高
蓄積に至るには不完全な点が存在していることを示すも
のである。
本発明の目的は真核生物由来の多くの目的ポリペプチ
ドを直接発現の形で大腸菌体内に著量、顆粒状態に蓄積
せしむる遺伝子発現系の構築並びにその目的ポリペプチ
ドの取得方法の提供にある。
ドを直接発現の形で大腸菌体内に著量、顆粒状態に蓄積
せしむる遺伝子発現系の構築並びにその目的ポリペプチ
ドの取得方法の提供にある。
真核生物のポリペプチドあるいは蛋白質を大腸菌を用
いて工業的に有利に生産するためには、融合蛋白質とし
てではなく目的とするポリペプチドだけを大腸菌の菌体
内に著量に、顆粒状に蓄積せしめる遺伝子発現系、及び
遺伝子発現ベクターを構築しなくてはならない。
いて工業的に有利に生産するためには、融合蛋白質とし
てではなく目的とするポリペプチドだけを大腸菌の菌体
内に著量に、顆粒状に蓄積せしめる遺伝子発現系、及び
遺伝子発現ベクターを構築しなくてはならない。
本発明者らは、遺伝子の直接発現能力を飛躍的に高め
るために、リボゾームのmRNAへの結合力を適度に高める
こと、及び翻訳開始反応を妨害しうるmRNA二次構造の形
成を抑えること、について、検討し改良を加えることに
よって、実際に目的ポリペプチドを大腸菌体内に顆粒状
に高蓄積させ得る遺伝子発現系の構築に成功し、本発明
を完成するに至った。
るために、リボゾームのmRNAへの結合力を適度に高める
こと、及び翻訳開始反応を妨害しうるmRNA二次構造の形
成を抑えること、について、検討し改良を加えることに
よって、実際に目的ポリペプチドを大腸菌体内に顆粒状
に高蓄積させ得る遺伝子発現系の構築に成功し、本発明
を完成するに至った。
即ち、本発明は、ペプチドの遺伝子発現系が上流から
少なくともプロモーター、５塩基から20塩基の隔たりを
もって連結された２つ以上のリボゾーム結合領域、翻訳
開始コドン、ペプチドコード領域及び転写終結部位がこ
の順序で配列している遺伝子発現ベクター、このベクタ
ーを含有する大腸菌、及び該大腸菌を用いるポリペプチ
ドの製造法に関するものである。
少なくともプロモーター、５塩基から20塩基の隔たりを
もって連結された２つ以上のリボゾーム結合領域、翻訳
開始コドン、ペプチドコード領域及び転写終結部位がこ
の順序で配列している遺伝子発現ベクター、このベクタ
ーを含有する大腸菌、及び該大腸菌を用いるポリペプチ
ドの製造法に関するものである。
遺伝子発現ベクターに組み込まれるプロモーターの由
来は問うところではなく、例えば大腸菌のtrpプロモー
ター、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモ
ーターや、さらにはλファージのλPLプロモーター、λ
PRプロモーターなどを用いることができる。
来は問うところではなく、例えば大腸菌のtrpプロモー
ター、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモ
ーターや、さらにはλファージのλPLプロモーター、λ
PRプロモーターなどを用いることができる。
リボゾーム結合領域は、例えば大腸菌のtrpLやtrpE、
lacZのリボゾーム結合領域や、λファージのC IIタンパ
クのリボゾーム結合領域を用いることができる。あるい
は化学合成したDNA配列を用いることもできる。
lacZのリボゾーム結合領域や、λファージのC IIタンパ
クのリボゾーム結合領域を用いることができる。あるい
は化学合成したDNA配列を用いることもできる。
本発明のベクターにおいては２つ以上のリボゾーム結
合領域を連結させるが、これらのリボゾーム結合領域は
同じ配列であっても、また異なった配列の組合わせでも
よい。リボゾーム結合領域の連結様式は特に制約はない
が、２つのリボゾーム結合領域の隔たりは、２塩基から
20塩基程度である。大腸菌の16SリボゾームRNAの３′末
端配列は３′−AUUCCUCCACUAであり、この部分と相補性
を有する配列をリボゾーム結合領域とすることができる
が、本発明者らは特に適度な親和性を持つ配列としてDN
A塩基配列上５′−TAAGGAGGT−３′の採用が優れている
ことを発見した。
合領域を連結させるが、これらのリボゾーム結合領域は
同じ配列であっても、また異なった配列の組合わせでも
よい。リボゾーム結合領域の連結様式は特に制約はない
が、２つのリボゾーム結合領域の隔たりは、２塩基から
20塩基程度である。大腸菌の16SリボゾームRNAの３′末
端配列は３′−AUUCCUCCACUAであり、この部分と相補性
を有する配列をリボゾーム結合領域とすることができる
が、本発明者らは特に適度な親和性を持つ配列としてDN
A塩基配列上５′−TAAGGAGGT−３′の採用が優れている
ことを発見した。
翻訳開始コドンはDNA塩基配列上、目的ポリペプチド
をコードする領域の直前にATGを付加することになる。
をコードする領域の直前にATGを付加することになる。
ペプチドコード領域は真核生物由来で目的ペプチドを
コードするものである。真核生物の種類は問うところで
はなく、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒ
ツジ、ヤギ、サケ、マグロ、酵母等である。目的ペプチ
ドの種類も問わないが、各種生理活性物質を含み、例え
ば、各種インターロイキン、インターフェロン、コロニ
ー形成因子、リンホトキシン等のリンホカイン、や各種
成長ホルモン類等である。ヒトインターロイキン６（IL
−６）はBSA−２（Ｂ−cell Stimulatory Factor−２）
とも呼ばれ、当初Ｂ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因
子（BCDF:B−cell Differenciation Factor）としてク
ローニングされたリンフォカインである。〔T.Hirano e
t.al.Nature 324,73（1986）〕しかし、その後、IL−６
は単にＢ細胞分化能を担っているのではなく、種々の細
胞で産生され、抗体産生増強能に加えて造血機能亢進
能、分化誘導能等を有することが確認されている。
コードするものである。真核生物の種類は問うところで
はなく、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒ
ツジ、ヤギ、サケ、マグロ、酵母等である。目的ペプチ
ドの種類も問わないが、各種生理活性物質を含み、例え
ば、各種インターロイキン、インターフェロン、コロニ
ー形成因子、リンホトキシン等のリンホカイン、や各種
成長ホルモン類等である。ヒトインターロイキン６（IL
−６）はBSA−２（Ｂ−cell Stimulatory Factor−２）
とも呼ばれ、当初Ｂ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因
子（BCDF:B−cell Differenciation Factor）としてク
ローニングされたリンフォカインである。〔T.Hirano e
t.al.Nature 324,73（1986）〕しかし、その後、IL−６
は単にＢ細胞分化能を担っているのではなく、種々の細
胞で産生され、抗体産生増強能に加えて造血機能亢進
能、分化誘導能等を有することが確認されている。
また、目的ポリペプチドをコードする遺伝子の前半部
分（目的ポリペプチドのＮ末端側領域をコードするDNA
部分）としては生産させるポリペプチドのアミノ酸配列
を変えない範囲でアデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）に
富む塩基配列を有するDNAを用いるほうがより好まし
い。
分（目的ポリペプチドのＮ末端側領域をコードするDNA
部分）としては生産させるポリペプチドのアミノ酸配列
を変えない範囲でアデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）に
富む塩基配列を有するDNAを用いるほうがより好まし
い。
転写終結部位は、例えば大腸菌のtrpAターミネータ
ー、rrnBターミネーター、recAターミネーターなどを用
いることができる。
ー、rrnBターミネーター、recAターミネーターなどを用
いることができる。
さらに、目的ポリペプチドの翻訳終止コドンがアンバ
ー（TAG）である時は、アンバー（TAG）よりもオーカー
（TAA）やオパール（TGA）が、さらにはTAAかつ、また
はTGAの２重の翻訳終結コドン（double stopper）を配
置することが望ましい。また、発現プラスミドのコピー
数は一般に多い方が好ましく、複製起点として、pBR系
の複製起点よりpUC系の方が望ましい。
ー（TAG）である時は、アンバー（TAG）よりもオーカー
（TAA）やオパール（TGA）が、さらにはTAAかつ、また
はTGAの２重の翻訳終結コドン（double stopper）を配
置することが望ましい。また、発現プラスミドのコピー
数は一般に多い方が好ましく、複製起点として、pBR系
の複製起点よりpUC系の方が望ましい。
本発明の遺伝子発現ベクターは他のDNA配列を含むこ
とができる。特に、リボゾーム結合領域と翻訳開始コド
ンの間にアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）に富む塩基配列
を挿入することにより目的ポリペプチドをより効率よく
発現させることが可能となる。Ａ、Ｔに富む塩基配列と
はＡあるいはＴのによる場合でも、ＡとＴの混合配列で
あってもよく、その長さは特に制約はないが、好ましく
は３塩基から13塩基である。ＡとＴがこの塩基配列に占
める割合は、70％以上が好ましい。
とができる。特に、リボゾーム結合領域と翻訳開始コド
ンの間にアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）に富む塩基配列
を挿入することにより目的ポリペプチドをより効率よく
発現させることが可能となる。Ａ、Ｔに富む塩基配列と
はＡあるいはＴのによる場合でも、ＡとＴの混合配列で
あってもよく、その長さは特に制約はないが、好ましく
は３塩基から13塩基である。ＡとＴがこの塩基配列に占
める割合は、70％以上が好ましい。
このような遺伝子の構築方法としては、まず、強力で
制御可能なプロモーター（例trpプロモーター）とそれ
に続く第１のリボゾーム結合領域、及びその顆粒に転写
終結部位（例trpAターミネーター）が配備された発現ベ
クター（複製起点はpUC系）を構築しておく。
制御可能なプロモーター（例trpプロモーター）とそれ
に続く第１のリボゾーム結合領域、及びその顆粒に転写
終結部位（例trpAターミネーター）が配備された発現ベ
クター（複製起点はpUC系）を構築しておく。
次に、目的ポリペプチドをコードする遺伝子部分を用
意するが、この時、５′側のDNA領域（Ｎ末端約10アミ
ノ酸程度をコードする領域）を、アミノ酸配列を変えな
い範囲で化学合成DNAにて置換し、さらに第２リボゾー
ム結合領域、Ａ−Ｔに富むDNA配列も同時に合成DNAにて
作製し、それらを発現ベクアー上の第１リボゾーム結合
領域とペプチドコード領域との間に挿入し、目的遺伝子
を連結することにより高発現可能な目的遺伝子の発現ベ
クターが構築できる。
意するが、この時、５′側のDNA領域（Ｎ末端約10アミ
ノ酸程度をコードする領域）を、アミノ酸配列を変えな
い範囲で化学合成DNAにて置換し、さらに第２リボゾー
ム結合領域、Ａ−Ｔに富むDNA配列も同時に合成DNAにて
作製し、それらを発現ベクアー上の第１リボゾーム結合
領域とペプチドコード領域との間に挿入し、目的遺伝子
を連結することにより高発現可能な目的遺伝子の発現ベ
クターが構築できる。
遺伝子発現ベクターを大腸菌に組込む方法も公知の方
法を利用すればよく、例えば、対数増殖期の細胞を50mM
の塩化カルシウムで氷中約30分処理する異により、大腸
菌の細胞壁の構造が変化し、続いてDNAを注入し、約10
分後30℃〜42℃で２分間の熱処理を施した後、培地を加
え30℃〜37℃で約60分培養することで遺伝子発現ベクタ
ーを大腸菌に組み込むことができる。
法を利用すればよく、例えば、対数増殖期の細胞を50mM
の塩化カルシウムで氷中約30分処理する異により、大腸
菌の細胞壁の構造が変化し、続いてDNAを注入し、約10
分後30℃〜42℃で２分間の熱処理を施した後、培地を加
え30℃〜37℃で約60分培養することで遺伝子発現ベクタ
ーを大腸菌に組み込むことができる。
目的ポリペプチドはこのような大腸菌を培養すること
によって当該大腸菌の体内あるいは培地中に蓄積させる
ことができる。培地は大腸菌を培養しうる公知の培地を
利用すればよく、培養条件も公知の条件でよい。培養後
は目的ポリペプチドを公知の方法で取得すればよい。
によって当該大腸菌の体内あるいは培地中に蓄積させる
ことができる。培地は大腸菌を培養しうる公知の培地を
利用すればよく、培養条件も公知の条件でよい。培養後
は目的ポリペプチドを公知の方法で取得すればよい。
本発明のポリペプチド発現ベクターにおいてはプロモ
ーターはDNAを鋳型にmRNA合成（転写）を開始するDNA上
のシグナルとして機能し、リボゾーム結合領域（SD配
列）はリボゾームが最初にmRNAに結合するための結合部
位として働く。またその下流に位置する翻訳開始コドン
からポリペプチドの合成が始まる。ペプチドコード領域
は対応するペプチドを作成する。そして、転写終結部位
は、プロモーターから転写されたmRNAの合成を修了する
働きをなす。
ーターはDNAを鋳型にmRNA合成（転写）を開始するDNA上
のシグナルとして機能し、リボゾーム結合領域（SD配
列）はリボゾームが最初にmRNAに結合するための結合部
位として働く。またその下流に位置する翻訳開始コドン
からポリペプチドの合成が始まる。ペプチドコード領域
は対応するペプチドを作成する。そして、転写終結部位
は、プロモーターから転写されたmRNAの合成を修了する
働きをなす。
本発明の遺伝子発現ベクターにおいては２つ以上のリ
ボゾーム結合領域を組込むことによってリボゾームのmR
NAへの親和性を高め、結合力を増している。そして、リ
ボゾーム結合領域と翻訳開始コドンの間にアデニンやチ
ミンの含有量の多い塩基配列を組込むことによって翻訳
開始反応を妨害するmRNA二次構造の形成を抑えて目的遺
伝子の発現量を高めている。
ボゾーム結合領域を組込むことによってリボゾームのmR
NAへの親和性を高め、結合力を増している。そして、リ
ボゾーム結合領域と翻訳開始コドンの間にアデニンやチ
ミンの含有量の多い塩基配列を組込むことによって翻訳
開始反応を妨害するmRNA二次構造の形成を抑えて目的遺
伝子の発現量を高めている。
（１）IL−６発現プラスミドの構築およびIL−６の取得
例 プラスミドDNAの構築と組み替え菌の取得pBSF−2D
（本プラスミドを含有するE.coli pTBCDF−02/HB101
は、FERM P−9061として寄託されている。）は、J.Bioc
hem.104、30−34（1988）に記載されているIL−６の直
接発現プラスミドである。これはpBR系の複製起点を持
ち、遺伝子発現系としてはtrpプロモーター、trpLのSD
配列を配備し、また遺伝子の下流にはtrpAターミネータ
ーが配置されている。しかしながら、pBSF−2Dはインド
ールアクリル酸（以下IAAと略す）添加によるrpプロモ
ーター誘導後もIL−６発現量は低く、また菌体内にIL−
６の顆粒は確認できなかった。
例 プラスミドDNAの構築と組み替え菌の取得pBSF−2D
（本プラスミドを含有するE.coli pTBCDF−02/HB101
は、FERM P−9061として寄託されている。）は、J.Bioc
hem.104、30−34（1988）に記載されているIL−６の直
接発現プラスミドである。これはpBR系の複製起点を持
ち、遺伝子発現系としてはtrpプロモーター、trpLのSD
配列を配備し、また遺伝子の下流にはtrpAターミネータ
ーが配置されている。しかしながら、pBSF−2Dはインド
ールアクリル酸（以下IAAと略す）添加によるrpプロモ
ーター誘導後もIL−６発現量は低く、また菌体内にIL−
６の顆粒は確認できなかった。
また、IL−６のcDNA上の翻訳終止コドンはアンバー
（TAG）であり、大腸菌HB 101はアンバーサブレッサー
を有するため完全にTAGコドンでIL−６ポリペプチドの
合成を終止させることができず、不用部分が付加したIL
−６の産生を引き起こす可能性がある。
（TAG）であり、大腸菌HB 101はアンバーサブレッサー
を有するため完全にTAGコドンでIL−６ポリペプチドの
合成を終止させることができず、不用部分が付加したIL
−６の産生を引き起こす可能性がある。
そこでます、pBSF−2Dの複製起点のpUCへの転換とIL
−６翻訳終止コドンのオーカー（TAA）へ変換を目指し
て、プラスミドpBSA2C−DUCを第１図に示すようにして
構築した。図中の黒帯部分は、trpプロモーター／オペ
レーター部分を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分
をそして白帯部分はIL−６コード領域をそれぞれ示して
いる。
−６翻訳終止コドンのオーカー（TAA）へ変換を目指し
て、プラスミドpBSA2C−DUCを第１図に示すようにして
構築した。図中の黒帯部分は、trpプロモーター／オペ
レーター部分を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分
をそして白帯部分はIL−６コード領域をそれぞれ示して
いる。
第１図に示したように、まずpBSF−2Dを制限酵素EcoR
I、Pvu IIで切断し、IL−6cDNAを含むDNA断片とpUC19
（Messing,J.（1983）Methods in Enzymology,101,20−
78）を制限酵素Hinc II、EcoR Iで切断し得られる大き
いDNA断片とをT4DNAリガーゼで連結することにより複製
起点をpUC系とするpBSF2−DUCを得た。
I、Pvu IIで切断し、IL−6cDNAを含むDNA断片とpUC19
（Messing,J.（1983）Methods in Enzymology,101,20−
78）を制限酵素Hinc II、EcoR Iで切断し得られる大き
いDNA断片とをT4DNAリガーゼで連結することにより複製
起点をpUC系とするpBSF2−DUCを得た。
またpT13SNco（本プラスミドを含有するE.coli AJ−1
2447はFERM P−10757として寄託されている。）〔J.Bio
chem.104、3034（1988）に記載〕を制限酵素EcoR I、Pv
u IIで切断し、得られる小DNA断片と上記のpUC19断片を
連結することにより、pT13SNco−UCを構築した。
2447はFERM P−10757として寄託されている。）〔J.Bio
chem.104、3034（1988）に記載〕を制限酵素EcoR I、Pv
u IIで切断し、得られる小DNA断片と上記のpUC19断片を
連結することにより、pT13SNco−UCを構築した。
次に、pBSF2−DUCを制限酵素Hind III、Ban IIで切断
して得られる大きいDNA断片と、通常の方法で作成した
合成DNA断片BSCT（IL−６翻訳終止コドン変換用）と、
さらにpT13SNco−UCを制限酵素BamH I、Hind IIIで消化
して得られるtrpAターミネーターを有するDNA断片との
３つのDNA断片をT4DNAリガーゼで連結することによりpB
SA2C−DUCを構築した。尚、合成DNA断片BSCTは下記の配
列を有している。
して得られる大きいDNA断片と、通常の方法で作成した
合成DNA断片BSCT（IL−６翻訳終止コドン変換用）と、
さらにpT13SNco−UCを制限酵素BamH I、Hind IIIで消化
して得られるtrpAターミネーターを有するDNA断片との
３つのDNA断片をT4DNAリガーゼで連結することによりpB
SA2C−DUCを構築した。尚、合成DNA断片BSCTは下記の配
列を有している。
一方、IL−６コード領域の前にSD配列を２つ配備する
ためにIL−6cDNAの一部を化学合成DNAにより第２図に示
したように改変した（合成DNA断片BSFN）。図中の破線
部分はSD配列を示している。
ためにIL−6cDNAの一部を化学合成DNAにより第２図に示
したように改変した（合成DNA断片BSFN）。図中の破線
部分はSD配列を示している。
この合成DNAは39マー（mer）から45マーの化学合成DN
A断片６本（BSFN1F,1R,2F,2R,3F,3R）より次のように作
製した。すなわち、DNA合成機（Applied Biosystems社
製mode1380B）により化学合成した各DNA断片を燐酸化後
（BSFN1F,BSFN3Rは燐酸化しない）、BSFN1FとBSFN1R、B
SFN2FとBSFN2R、BSFN3FとBSFN3Rとをアニールさせ、続
いてそれらを混合し、T4DNAリガーゼにより連結させ
た。次に、その反応液を５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、泳動、エチジュウムブロマイド染色の
後、目的合成DNA断片BSFNに相当するDNAのバンド（約13
0bp）を分取し、精製することにより合成部分IL−6DNA
を得た。この合成DNA断片BSFNは、第３図に示すように
制限酵素EcoR I、Acc Iで消化したpUC19の大きいDNA断
片にT4DNAリガーゼにて連結させ、pUC−SD6Nを得た。図
中の格子帯部分は合成DNA部分を示している。なお、合
成DNA断片BSFNのDNA塩基配列は、このpUC−SD6Nを用
い、両方向からdideoxy法にて確認した。
A断片６本（BSFN1F,1R,2F,2R,3F,3R）より次のように作
製した。すなわち、DNA合成機（Applied Biosystems社
製mode1380B）により化学合成した各DNA断片を燐酸化後
（BSFN1F,BSFN3Rは燐酸化しない）、BSFN1FとBSFN1R、B
SFN2FとBSFN2R、BSFN3FとBSFN3Rとをアニールさせ、続
いてそれらを混合し、T4DNAリガーゼにより連結させ
た。次に、その反応液を５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、泳動、エチジュウムブロマイド染色の
後、目的合成DNA断片BSFNに相当するDNAのバンド（約13
0bp）を分取し、精製することにより合成部分IL−6DNA
を得た。この合成DNA断片BSFNは、第３図に示すように
制限酵素EcoR I、Acc Iで消化したpUC19の大きいDNA断
片にT4DNAリガーゼにて連結させ、pUC−SD6Nを得た。図
中の格子帯部分は合成DNA部分を示している。なお、合
成DNA断片BSFNのDNA塩基配列は、このpUC−SD6Nを用
い、両方向からdideoxy法にて確認した。
続いて、第４図に示すように、pUC−SD6Nを制限酵素C
la Iで切断し、クレノウフラグメントにより平滑末端と
した後、TthHB81で消化することにより得られるIL−６
の一部を有するDNA断片（約120bp）と、pBSF2C−DUCをP
vu II、BamH I、TthHB81で消化し得られるIL−６の後半
部分を有するDNA断片（約470bp）と、pBR322をEcoR V、
BamH Iで消化し、得られる大きいDNA断片とをT4DNAリガ
ーゼにより連結することによりpBR−SD7を構築した。図
中、黒帯部分はtrpプロモーター／オペレーター部分
を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分を、白帯部分
はIL−６コード領域をそして格子帯部分は合成DNA部分
をそれぞれ示している。
la Iで切断し、クレノウフラグメントにより平滑末端と
した後、TthHB81で消化することにより得られるIL−６
の一部を有するDNA断片（約120bp）と、pBSF2C−DUCをP
vu II、BamH I、TthHB81で消化し得られるIL−６の後半
部分を有するDNA断片（約470bp）と、pBR322をEcoR V、
BamH Iで消化し、得られる大きいDNA断片とをT4DNAリガ
ーゼにより連結することによりpBR−SD7を構築した。図
中、黒帯部分はtrpプロモーター／オペレーター部分
を、黒三角部分はtrpAターミネーター部分を、白帯部分
はIL−６コード領域をそして格子帯部分は合成DNA部分
をそれぞれ示している。
次に、同じ第４図に示すようにpBR−SD7をdam-株の大
腸菌に通常の方法により形質転換後、プラスミドを調製
しpBR−SD7（dam-）を得、これをCla I、BamH I切断す
ることにより、半合成IL−6DNAを有するDNA断片を取得
した。そして、このDNA断片に、再びpBSF2C−DUCを制限
酵素Cla I、BamH Iで切断して得られるtrpプロモーター
およびtrpAターミネーターを有するDNA断片とをT4DNAリ
ガーゼによって連結する事によりIL−６の高発現、かつ
直接発現プラスミドpBSF2−SD7を構築、取得した。
腸菌に通常の方法により形質転換後、プラスミドを調製
しpBR−SD7（dam-）を得、これをCla I、BamH I切断す
ることにより、半合成IL−6DNAを有するDNA断片を取得
した。そして、このDNA断片に、再びpBSF2C−DUCを制限
酵素Cla I、BamH Iで切断して得られるtrpプロモーター
およびtrpAターミネーターを有するDNA断片とをT4DNAリ
ガーゼによって連結する事によりIL−６の高発現、かつ
直接発現プラスミドpBSF2−SD7を構築、取得した。
続いて、pBSF2−SD7を大腸菌HB 101に形質転換し、IL
−６高生産菌（E.coli pBSF2−SD7/HB101 AJ−12448、F
ERM P−10758）を得た。
−６高生産菌（E.coli pBSF2−SD7/HB101 AJ−12448、F
ERM P−10758）を得た。
培養、及び生産物の取得 選択した形質転換E.coli pBSF2−SD7/HB101（FERM P
−10758）を50μg/mlのアンピシリンを含む2xTY（1.6％
バクトトリプトン、１％酵母エキス、0.5％NaCl、pH7.
0）5ml中で30℃一晩生育させた。ついで、その培養懸濁
液5mlを100mlのM9−カザミノ酸培地（0.6％Na2HPO4・12
H2O,0.3％KH2PO4,0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,0.05％MgSO4
・7H2O,0.00147％CaCl2,0.2％グルコース,0.2％カザミ
ノ酸,0.02％Ｌ−ロイシン,0.02％Ｌ−ブロリン,0.0002
％チアミン塩酸塩,100μg/mlアンビシリンpH6.9）へ接
種し、37℃にて、３時間培養した。その後、25μg/mlに
なるように３−インドールアクリル酸（IAA）を添加
し、さらに、37℃にて、21時間誘導培養した。
−10758）を50μg/mlのアンピシリンを含む2xTY（1.6％
バクトトリプトン、１％酵母エキス、0.5％NaCl、pH7.
0）5ml中で30℃一晩生育させた。ついで、その培養懸濁
液5mlを100mlのM9−カザミノ酸培地（0.6％Na2HPO4・12
H2O,0.3％KH2PO4,0.05％NaCl,0.1％NH4Cl,0.05％MgSO4
・7H2O,0.00147％CaCl2,0.2％グルコース,0.2％カザミ
ノ酸,0.02％Ｌ−ロイシン,0.02％Ｌ−ブロリン,0.0002
％チアミン塩酸塩,100μg/mlアンビシリンpH6.9）へ接
種し、37℃にて、３時間培養した。その後、25μg/mlに
なるように３−インドールアクリル酸（IAA）を添加
し、さらに、37℃にて、21時間誘導培養した。
この一部の菌体懸濁液を位相差顕微鏡により、約1500
0倍にて観察すると大腸菌体内の顆粒の形成が認められ
た。
0倍にて観察すると大腸菌体内の顆粒の形成が認められ
た。
続いて、上記の如く培養した菌体懸濁液を遠心分離機
にかけ、菌体を集め２倍濃縮になるように、30mM NaCl
を含む20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）を添加し、懸濁
液、そこへ0.5M EDTA（pH8.0）で1mg/mlになるように溶
かしたリゾチーム溶液37.5mlを添加し、撹拌した後、氷
中にて１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊
し、6000rpm,5minの遠心分離で顆粒を回収した。
にかけ、菌体を集め２倍濃縮になるように、30mM NaCl
を含む20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）を添加し、懸濁
液、そこへ0.5M EDTA（pH8.0）で1mg/mlになるように溶
かしたリゾチーム溶液37.5mlを添加し、撹拌した後、氷
中にて１時間放置した。ついで超音波破砕で菌体を破壊
し、6000rpm,5minの遠心分離で顆粒を回収した。
この顆粒を6M塩酸グアニジンで可溶化し、目的ポリペ
プチドIL−６濃度が100μg/ml、及び2M塩酸グアニジン
溶液となるように、濃度調製を行い、これに酸化型グル
タオチン1mMと還元型グルタチオン10mMとなるように添
加し、pH8.0で室温で10〜16時間放置した。次に、Sepha
dex G−25によるゲル濾過で塩酸グアニジンを除去し、I
L−６画分を得た。
プチドIL−６濃度が100μg/ml、及び2M塩酸グアニジン
溶液となるように、濃度調製を行い、これに酸化型グル
タオチン1mMと還元型グルタチオン10mMとなるように添
加し、pH8.0で室温で10〜16時間放置した。次に、Sepha
dex G−25によるゲル濾過で塩酸グアニジンを除去し、I
L−６画分を得た。
本物質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、その分子量はアミノ酸組成から計算した値とほぼ一
致し、またプロテインシークエンサーにてＮ末端側のア
ミノ酸配列を検定した結果、目的産物である成熟型IL−
６の初列と一部そのＮ末端にメチオニンが付加したIL−
６の配列であることが確認された。
り、その分子量はアミノ酸組成から計算した値とほぼ一
致し、またプロテインシークエンサーにてＮ末端側のア
ミノ酸配列を検定した結果、目的産物である成熟型IL−
６の初列と一部そのＮ末端にメチオニンが付加したIL−
６の配列であることが確認された。
また、生理活性としてはIgMを産生するヒトＢ細胞株C
L4（T.Hiranoら、Proc.Natl.Acad.S−ci.,82.,5490.198
5）を用いて、IgM産生活性を測定した。つまり、抗体産
生活性を測定する検液と6x103個のCL4を200μの10％F
CSを含むRPMI1640培地（1ml当りペニシリン100単位、ス
トレプトマイシン100μｇ、ゲンタマイシン10μｇ及びN
aHCO316mMを含む）に入れ、この混合物を96穴マイクロ
プレート中で３日間、５％CO2存在下、37℃で培養し、
培養上清のIgM産生量（最高のCL4の反応）の50％を示す
抗体産生活性を1u/mlとした。
L4（T.Hiranoら、Proc.Natl.Acad.S−ci.,82.,5490.198
5）を用いて、IgM産生活性を測定した。つまり、抗体産
生活性を測定する検液と6x103個のCL4を200μの10％F
CSを含むRPMI1640培地（1ml当りペニシリン100単位、ス
トレプトマイシン100μｇ、ゲンタマイシン10μｇ及びN
aHCO316mMを含む）に入れ、この混合物を96穴マイクロ
プレート中で３日間、５％CO2存在下、37℃で培養し、
培養上清のIgM産生量（最高のCL4の反応）の50％を示す
抗体産生活性を1u/mlとした。
その結果、上記の如く取得した組み替えIL−６は、約
6.0u/ngの比活性を示し、それは、動物細胞より得られ
た天然のIL−６と同程度の生理活性を持つことが判明し
た。
6.0u/ngの比活性を示し、それは、動物細胞より得られ
た天然のIL−６と同程度の生理活性を持つことが判明し
た。
以上のようにして、本発明によるポリペプチド製造方
法を用いることにより、効率よくIL−６ポリペプチドを
製造、取得することができた。
法を用いることにより、効率よくIL−６ポリペプチドを
製造、取得することができた。
なお、第１表に従来から構築されていた直接発現プラ
スミドpBSF−2Dと今回作製した高効率型の直接発現プラ
スミドpBSF2−SD7との発現性を比較して示した。
スミドpBSF−2Dと今回作製した高効率型の直接発現プラ
スミドpBSF2−SD7との発現性を比較して示した。
（２）ヒトα−グロビン蛋白誘導体の例 グロビン蛋白質はヘモグロビンを構成する蛋白部分で
あるが、成人ヒトの場合、それはα−グロビンとβ−グ
ロビンで構成されている。
あるが、成人ヒトの場合、それはα−グロビンとβ−グ
ロビンで構成されている。
本発明者らは、各々のグロビンを大腸菌で直接大量発
現させるにあたり、それらのＮ末端に遺伝子の翻訳開始
に必要なメチオニン残基（Met）とブロリン残基（Pro）
を付加した各グロビン蛋白の誘導体を計画し、これらの
大腸菌体内に顆粒状蓄積させ得る直接発現プラスミドの
構築を行い、上記、各ヒト−グロビン蛋白誘導体の効率
よい、かつ経済的な取得に成功した。
現させるにあたり、それらのＮ末端に遺伝子の翻訳開始
に必要なメチオニン残基（Met）とブロリン残基（Pro）
を付加した各グロビン蛋白の誘導体を計画し、これらの
大腸菌体内に顆粒状蓄積させ得る直接発現プラスミドの
構築を行い、上記、各ヒト−グロビン蛋白誘導体の効率
よい、かつ経済的な取得に成功した。
プラスミドDNAの構築と組み替え菌の取得M.O.Dayhof
f,“Atlas of Protein Sequence and structure",Natio
nal Biomedical Foundation,washington D.C.,Vol.5（1
972）に記載のヒトα−グロビンのアミノ酸配列に従
い、第５図に示すようにそれをコードしうる合成DNAを
作製した。
f,“Atlas of Protein Sequence and structure",Natio
nal Biomedical Foundation,washington D.C.,Vol.5（1
972）に記載のヒトα−グロビンのアミノ酸配列に従
い、第５図に示すようにそれをコードしうる合成DNAを
作製した。
α−グロビン141アミノ酸を含む領域をコードしうる
合成DNAを３つのブロック、AOPT1（サブフラグメント12
本）、AOPT2（サブフラグメント10本）、AOPT3（サブフ
ラグメント14本）に分割して、実施例（１）と同様にし
て組み立てた。なお、AOPT1の末端はSac I、Hind III
で、AOPT2はEcoR I、Sph Iで、そしてAOPT3はSph I、Ba
m IでそれぞれpUC18またはpUC19にクローニングされる
ようにデザインした。
合成DNAを３つのブロック、AOPT1（サブフラグメント12
本）、AOPT2（サブフラグメント10本）、AOPT3（サブフ
ラグメント14本）に分割して、実施例（１）と同様にし
て組み立てた。なお、AOPT1の末端はSac I、Hind III
で、AOPT2はEcoR I、Sph Iで、そしてAOPT3はSph I、Ba
m IでそれぞれpUC18またはpUC19にクローニングされる
ようにデザインした。
第６図に示したように、AOPT1をSac I、Hind IIIで処
理したpUC18へ組み入れ、pUC−Hb（Ａ）を構築した。同
様に、AOPT2はEcoR I、Sph I処理したpUC18へ組み入れ
ることにより、またAOPT3はSph I、BamH I処理したpUC1
9にクローニングする事により、それぞれ、pUC−Hb
（Ｂ）、pUC−Hb（Ｃ）を構築した。次にこれらのプラ
スミドはサンガー法によるDA塩基配列決定法を用いて、
正しい塩基配列を有していることを確認した。
理したpUC18へ組み入れ、pUC−Hb（Ａ）を構築した。同
様に、AOPT2はEcoR I、Sph I処理したpUC18へ組み入れ
ることにより、またAOPT3はSph I、BamH I処理したpUC1
9にクローニングする事により、それぞれ、pUC−Hb
（Ｂ）、pUC−Hb（Ｃ）を構築した。次にこれらのプラ
スミドはサンガー法によるDA塩基配列決定法を用いて、
正しい塩基配列を有していることを確認した。
続いて、α−グロビンの合成DNAを完成させるため、
第７図に示したようにSac I、BamH I処理したpT13SNco
の大きいDNA断片に、pUC−Hb（Ａ）をSac I、Nsp（752
4）Ｖ処理し得られる合成DNA部分と、dam-株から調製し
たpUC−Hb（Ｂ）dam-をCla I、Sph I消化し得られる合
成DNA断片、そして、pUC−Hb（Ｃ）をSph I、BamH I処
理し得られる合成DNA断片をT4DNAリガーゼにより連結す
ることによりヒトインターロイキン２蛋白質の一部と融
合したヒトα−グロビンを発現し得るプラスミドpT13SH
bα（S1）を構築した。図中、白三角はtrpプロモーター
部分を表している。他の記号は第４図と同じ意味を表し
ている。
第７図に示したようにSac I、BamH I処理したpT13SNco
の大きいDNA断片に、pUC−Hb（Ａ）をSac I、Nsp（752
4）Ｖ処理し得られる合成DNA部分と、dam-株から調製し
たpUC−Hb（Ｂ）dam-をCla I、Sph I消化し得られる合
成DNA断片、そして、pUC−Hb（Ｃ）をSph I、BamH I処
理し得られる合成DNA断片をT4DNAリガーゼにより連結す
ることによりヒトインターロイキン２蛋白質の一部と融
合したヒトα−グロビンを発現し得るプラスミドpT13SH
bα（S1）を構築した。図中、白三角はtrpプロモーター
部分を表している。他の記号は第４図と同じ意味を表し
ている。
一方、Met−Pro−グロビン直接発現のための合成DNA
としては第８図に示したものを用いた。
としては第８図に示したものを用いた。
合成DNA;AMPはMet−Pro−α−グロビンの単純な直接
遺伝子発現系の構築用 合成DNA;AMPS1は翻訳開始コドンの直前をアデニンに
富むDNA塩基配列にしたMet−Pro−α−グロビンの直接
遺伝子発現系の構築用 合成DNA;AMPS2は翻訳開始コドンの直前をアデニンに
富むDNA塩基配列にし、かつ２つのSD配列が配備される
ようにデザインしたMet−Pro−α−グロビンの直接遺伝
子発現系の構築用 そこで、第９図に示すように、先ず合成DNA;AMPを用
いてMet−Pro−α−グロビンの直接発現系の作製を行っ
た。プラスミドpT13SHbα（S1）を制限酵素Cla I、Afl
IIで切断し得られるグロビン遺伝子を有するDNA断片と
合成DNA;AMPをT4DNAリガーゼにより連結し、Met−Pro−
α−グロビン直接発現プラスミドpTHb（α）−MPを構築
した。
遺伝子発現系の構築用 合成DNA;AMPS1は翻訳開始コドンの直前をアデニンに
富むDNA塩基配列にしたMet−Pro−α−グロビンの直接
遺伝子発現系の構築用 合成DNA;AMPS2は翻訳開始コドンの直前をアデニンに
富むDNA塩基配列にし、かつ２つのSD配列が配備される
ようにデザインしたMet−Pro−α−グロビンの直接遺伝
子発現系の構築用 そこで、第９図に示すように、先ず合成DNA;AMPを用
いてMet−Pro−α−グロビンの直接発現系の作製を行っ
た。プラスミドpT13SHbα（S1）を制限酵素Cla I、Afl
IIで切断し得られるグロビン遺伝子を有するDNA断片と
合成DNA;AMPをT4DNAリガーゼにより連結し、Met−Pro−
α−グロビン直接発現プラスミドpTHb（α）−MPを構築
した。
本プラスミドはtrpプロモーターの制御下でMet−Pro
−α−グロビンを直接発現させ得る従来用いられている
型の遺伝子発現系である。
−α−グロビンを直接発現させ得る従来用いられている
型の遺伝子発現系である。
次に、同じ第９図に示すように、pTHb（α）−MPの複
製開始部位をpUC19のものに変換した。プラスミドpUC19
をEcoR I、Hinc IIで切断し得られる大きいDNA断片に、
pTHb（α）−MPをEcoR I、Pvu IIで処理し得られるグロ
ビン遺伝子を有するDNA断片とをT4 DNAリガーゼで連結
する事によりpNHb（α）−MPを構築した。
製開始部位をpUC19のものに変換した。プラスミドpUC19
をEcoR I、Hinc IIで切断し得られる大きいDNA断片に、
pTHb（α）−MPをEcoR I、Pvu IIで処理し得られるグロ
ビン遺伝子を有するDNA断片とをT4 DNAリガーゼで連結
する事によりpNHb（α）−MPを構築した。
また、上で構築したpNHb（α）−MPを制限酵素Cla
I、Afl IIで切断し得られた大きいDNA断片に合成DNA断
片;AMPS1をT4 DNAリガーゼにより連結することにより、
SD配列と翻訳開始コドン間領域がアデニンに富む配列で
あるMet−Pro−α−グロビン遺伝子直接発現系を有する
pNHb（α）−MPS1を構築した。さらに２つのSD配列を有
するMet−Pro−α−グロビン遺伝子直接発現系は、同様
にCla I、Afl II処理したpNHb（α）−MPの大きいDNA断
片に合成DNA断片;AMPS2を連結する事により構築し、第1
0図に示すようにpNHb（α）−MPS2を作製した。
I、Afl IIで切断し得られた大きいDNA断片に合成DNA断
片;AMPS1をT4 DNAリガーゼにより連結することにより、
SD配列と翻訳開始コドン間領域がアデニンに富む配列で
あるMet−Pro−α−グロビン遺伝子直接発現系を有する
pNHb（α）−MPS1を構築した。さらに２つのSD配列を有
するMet−Pro−α−グロビン遺伝子直接発現系は、同様
にCla I、Afl II処理したpNHb（α）−MPの大きいDNA断
片に合成DNA断片;AMPS2を連結する事により構築し、第1
0図に示すようにpNHb（α）−MPS2を作製した。
以上の如く、作製したプラスミドは通常の方法により
大腸菌HB 101株へ形質転換し、形質転換株を取得した。
なお、E.coli pTHb（α）−MP/HB 101 AJ−12449は微工
研菌寄第10759号、E.coli pNHb（α）−MP/HB 101 AJ−
12450は微工研菌寄第10760号、E.coli pNHb（α）−MPS
1/HB 101 AJ−12451は微工研菌寄第10761号、E.coli pN
Hb（α）−MPS2/HB101 AJ−12452は微工研菌寄第10762
号である。
大腸菌HB 101株へ形質転換し、形質転換株を取得した。
なお、E.coli pTHb（α）−MP/HB 101 AJ−12449は微工
研菌寄第10759号、E.coli pNHb（α）−MP/HB 101 AJ−
12450は微工研菌寄第10760号、E.coli pNHb（α）−MPS
1/HB 101 AJ−12451は微工研菌寄第10761号、E.coli pN
Hb（α）−MPS2/HB101 AJ−12452は微工研菌寄第10762
号である。
培養及び生産物の取得 選択した各形質転換株を実施例（１）と同様にして培
養を行い、α−グロビン誘導体の生産性を検討した結
果、SD配列を２つ有するpNHb（α）−MPS2においてα−
グロビン誘導体の生産性が飛躍的に増大し、大腸菌体内
に顆粒形成が認められた。なお、各pTHb（α）−MP、pN
Hb（α）−MP、pNHb（α）−MPS1、pNHb（α）−MPS2の
生産性比較は第２表にまとめた。
養を行い、α−グロビン誘導体の生産性を検討した結
果、SD配列を２つ有するpNHb（α）−MPS2においてα−
グロビン誘導体の生産性が飛躍的に増大し、大腸菌体内
に顆粒形成が認められた。なお、各pTHb（α）−MP、pN
Hb（α）−MP、pNHb（α）−MPS1、pNHb（α）−MPS2の
生産性比較は第２表にまとめた。
次に、培養した形質転換体pNHb（α）−MPS2/HB101よ
り実施例（１）と同様にして、α−グロビン誘導体を取
得した。本物質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、その分子量はアミノ酸組成物から計算した値と
ほぼ一致し、またプロテインシークエンサーにてＮ末端
側のアミノ酸配列を検定した結果、目的産物であるα−
グロビン誘導体配列であることが確認された。
り実施例（１）と同様にして、α−グロビン誘導体を取
得した。本物質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、その分子量はアミノ酸組成物から計算した値と
ほぼ一致し、またプロテインシークエンサーにてＮ末端
側のアミノ酸配列を検定した結果、目的産物であるα−
グロビン誘導体配列であることが確認された。
（３）ヒトβ−グロビン蛋白誘導体の例 プラスミドDNAの構築と組み替え菌の取得 Met−Pro−β−グロビンの直接発現プラスミドも実施
例（２）と同様にして構築した。
例（２）と同様にして構築した。
第11図に示したようなβ−グロビン遺伝子を含む合成
遺伝子を化学合成DNAオリゴマーにより作製した。第12
図に示すように、それらは３つのブロック、BOPT1、BOP
T2、BOPT3をまず合成し、それぞれ、pUC18をSac I、Sal
Iで、Kpn I、Sal Iで、そしてKpn I、BamH Iで各々処
理した大きいDNA断片に連結させることにより、pUC−Hb
（Ｄ）、pUC−Hb（Ｅ）、pUC−Hb（Ｆ）を得た。またこ
れらのプラスミドを用いて、３つのブロックのDNA塩基
配列を決定し、目的どおりの塩基配列であることを確認
した。
遺伝子を化学合成DNAオリゴマーにより作製した。第12
図に示すように、それらは３つのブロック、BOPT1、BOP
T2、BOPT3をまず合成し、それぞれ、pUC18をSac I、Sal
Iで、Kpn I、Sal Iで、そしてKpn I、BamH Iで各々処
理した大きいDNA断片に連結させることにより、pUC−Hb
（Ｄ）、pUC−Hb（Ｅ）、pUC−Hb（Ｆ）を得た。またこ
れらのプラスミドを用いて、３つのブロックのDNA塩基
配列を決定し、目的どおりの塩基配列であることを確認
した。
続いて、第13図に示すようにSac I、BamH I処理したp
T13SNcoの大きいDNA断片に、pUC−Hb（Ｄ）をSal I、Sa
c I処理し得られる合成DNA部分と、pUC−Hb（Ｅ）をSal
I、Kpn I処理し得られる合成DNA断片、そしてpUC−Hb
（Ｆ）をKpn I、BamH I処理し得られる合成DNA断片をT4
DNAリガーゼにより連結することによりヒトインターロ
イキン２蛋白質の一部と融合したヒトβ−グロビン誘導
体を発現し得るプラスミドpT13SHbβ（S1）を構築し
た。
T13SNcoの大きいDNA断片に、pUC−Hb（Ｄ）をSal I、Sa
c I処理し得られる合成DNA部分と、pUC−Hb（Ｅ）をSal
I、Kpn I処理し得られる合成DNA断片、そしてpUC−Hb
（Ｆ）をKpn I、BamH I処理し得られる合成DNA断片をT4
DNAリガーゼにより連結することによりヒトインターロ
イキン２蛋白質の一部と融合したヒトβ−グロビン誘導
体を発現し得るプラスミドpT13SHbβ（S1）を構築し
た。
一方、Met−Pro−グロビン直接発現のための合成DNA
としては第８図に示したものを用いた。
としては第８図に示したものを用いた。
合成DNA;BMPはMet−Pro−β−グロビンの単純な直接
遺伝子発現系の構築用 合成DNA;BMPS2は翻訳開始コドンの直前をアデニンに
富むDNA塩基配列にし、かつ２つのSD配列が配備される
ようにデザインしたMet−Pro−β−グロビンの直接遺伝
子発現系の構築用 そこで、先ず合成DNA;BMPを用いてMet−Pro−β−グ
ロビンの直接発現系の作製を行った。第14図に示したよ
うに、pT13SHbβ（S1）を制限酵素Nco I、BamH Iで処理
し得られるtrpプロモーターを有するDNA断片と、同じpT
13SHbβ（S1）をPst I、BamH Iで消化し得られるβ−グ
ロビン遺伝子の多くを含むDNA断片、そして合成DNA断面
BMPをT4DNAリガーゼにより連結することでMet−Pro−β
−グロビン直接発現プラスミドpTHb（β）−MPを構築し
た。本プラスミドは、trpプロモーターの制御下でMet−
Pro−β−グロビン直接発現させ得る従来用いられてい
る型の遺伝子発現系である。次に、pTHb（β）−MPの複
製開始部位をpUC19のものに変換した。プラスミドPUC19
をEcoR I、Hinc IIで切断し、得られる大きいDNA断片
に、pTHb（β）−MPをEcoR I、Pvu IIで処理し得られる
グロビン遺伝子を有するDNA断片とをT4 DNAガーゼで連
結する事によりpNHb（β）−MPを構築した。さらに２つ
のSD配列を有するMet−Pro−β−グロビン遺伝子直接発
現系は、Cla I、Pst I処理したpNHb（β）−MPの大きい
DNA断片に合成DNA断片;BMPS2を連結する事により構築
し、第15図に示すようにpNHb（β）−MPS2を作製した。
遺伝子発現系の構築用 合成DNA;BMPS2は翻訳開始コドンの直前をアデニンに
富むDNA塩基配列にし、かつ２つのSD配列が配備される
ようにデザインしたMet−Pro−β−グロビンの直接遺伝
子発現系の構築用 そこで、先ず合成DNA;BMPを用いてMet−Pro−β−グ
ロビンの直接発現系の作製を行った。第14図に示したよ
うに、pT13SHbβ（S1）を制限酵素Nco I、BamH Iで処理
し得られるtrpプロモーターを有するDNA断片と、同じpT
13SHbβ（S1）をPst I、BamH Iで消化し得られるβ−グ
ロビン遺伝子の多くを含むDNA断片、そして合成DNA断面
BMPをT4DNAリガーゼにより連結することでMet−Pro−β
−グロビン直接発現プラスミドpTHb（β）−MPを構築し
た。本プラスミドは、trpプロモーターの制御下でMet−
Pro−β−グロビン直接発現させ得る従来用いられてい
る型の遺伝子発現系である。次に、pTHb（β）−MPの複
製開始部位をpUC19のものに変換した。プラスミドPUC19
をEcoR I、Hinc IIで切断し、得られる大きいDNA断片
に、pTHb（β）−MPをEcoR I、Pvu IIで処理し得られる
グロビン遺伝子を有するDNA断片とをT4 DNAガーゼで連
結する事によりpNHb（β）−MPを構築した。さらに２つ
のSD配列を有するMet−Pro−β−グロビン遺伝子直接発
現系は、Cla I、Pst I処理したpNHb（β）−MPの大きい
DNA断片に合成DNA断片;BMPS2を連結する事により構築
し、第15図に示すようにpNHb（β）−MPS2を作製した。
以上の如く、作製したプラスミドは通常の方法により
大腸菌HB 101株へ形質転換し、形質転換株を取得した。
なお、E.coli pTHb（β）−MP/HB101 AJ−12453は微工
研菌寄第10763号、E.coli pNHb（β）−MP/HB101 AJ−1
2454は微工研菌寄第10764号、E.coli pNHb（β）−MPS2
/HB101 AJ−12455は微工研菌寄第10765号である。
大腸菌HB 101株へ形質転換し、形質転換株を取得した。
なお、E.coli pTHb（β）−MP/HB101 AJ−12453は微工
研菌寄第10763号、E.coli pNHb（β）−MP/HB101 AJ−1
2454は微工研菌寄第10764号、E.coli pNHb（β）−MPS2
/HB101 AJ−12455は微工研菌寄第10765号である。
培養及び生産物の取得 選択した各形質転換株を実施例（１）と同様にして培
養を行い、β−グロビン誘導体の生産性を検討した結
果、α−グロビン誘導体の場合と同じくSD配列を２つ有
するpNHb（β）−MPS2においてβ−グロビン誘導体の生
産性が飛躍的に増大し、大腸菌体内に顆粒形成が認めら
れた。なお、各pTHb（β）−MP、pNHb（β）−MP、pNHb
（β）−MPS2の生産性比較は第３表にまとめた。
養を行い、β−グロビン誘導体の生産性を検討した結
果、α−グロビン誘導体の場合と同じくSD配列を２つ有
するpNHb（β）−MPS2においてβ−グロビン誘導体の生
産性が飛躍的に増大し、大腸菌体内に顆粒形成が認めら
れた。なお、各pTHb（β）−MP、pNHb（β）−MP、pNHb
（β）−MPS2の生産性比較は第３表にまとめた。
次に、培養した形質転換体pNHb（β）−MPS2/HB 101
より実施例（１）と同様にして、β−グロビン誘導体を
取得した。本物質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、その分子量はアミノ酸組成から計算した値と
ほぼ一致し、またプロテインシークエンサーにてＮ末端
側のアミノ酸配列を検定した結果、目的産物であるβ−
グロビン誘導体配列であることが確認された。
より実施例（１）と同様にして、β−グロビン誘導体を
取得した。本物質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、その分子量はアミノ酸組成から計算した値と
ほぼ一致し、またプロテインシークエンサーにてＮ末端
側のアミノ酸配列を検定した結果、目的産物であるβ−
グロビン誘導体配列であることが確認された。
２つ以上のSD配列をIL−６ポリペプチドコード領域の
上流に配備すること（プラスミドpBSF2−SD7の場合）に
より既存の一般的な遺伝子発現装置を配置したもの（プ
ラスミドpBSF−2Dの場合）に比べ飛躍的にIL−６生産性
の向上が確認できた。また、IL−６以外にもα−グロビ
ン誘導体、β−グロビン誘導体の飛躍的発現、生産にお
いても本発明の効果が確認できた。
上流に配備すること（プラスミドpBSF2−SD7の場合）に
より既存の一般的な遺伝子発現装置を配置したもの（プ
ラスミドpBSF−2Dの場合）に比べ飛躍的にIL−６生産性
の向上が確認できた。また、IL−６以外にもα−グロビ
ン誘導体、β−グロビン誘導体の飛躍的発現、生産にお
いても本発明の効果が確認できた。
本発明によれば、目的ポリペプチドが従来の一般的な
直接発現法では高発現せず、菌体内に顆粒状蓄積されな
いものであっても、本遺伝子発現系を適用することによ
り、目的ポリペプチドを多量に、かつ安価に製造するこ
とが出来る。
直接発現法では高発現せず、菌体内に顆粒状蓄積されな
いものであっても、本遺伝子発現系を適用することによ
り、目的ポリペプチドを多量に、かつ安価に製造するこ
とが出来る。
第１図はプラスミドpBSF2C−DUCの構築工程を示す図面
である。 第２図は合成DNA断片BSFNの塩基配列を示す図面であ
る。 第３図はプラスミドpUC−SD6Nの構築工程を示す図面で
ある。 第４図はIL−６の直接発現プラスミドであるpBSF2−SD7
の構築工程を示す図面である。 第５図はヒトα−グロビン誘導体をコードする合成DNA
の塩基配列を示す図面である。 第６図はプラスミドpUC−Hb（Ａ）、pUC−Hb（Ｂ）、pU
C−Hb（Ｃ）の構築工程を示す図面である。 第７図はプラスミドpT13SHbα（S1）の構築工程を示す
図面である。 第８図はMet−Pro−グロビンの直接発現に必要な合成DN
A断片である。AMP、BMP、AMPS1、AMPS2、BMPS2の塩基配
列を示した図面である。 第９図はプラスミドpTHb（α）−MP及びpNHb（α）−MP
の構築工程を示す図面である。 第10図はプラスミドpNHb（α）−MPS1及びpNHb（α）−
MPS2の構築工程を示す図面である。 第11図はヒトβ−グロビン誘導体をコードする合成DNA
の塩基配列を示す図面である。 第12図はプラスミドpUC−Hb（Ｄ）、pUC−Hb（Ｅ）、pU
C−Hb（Ｆ）の構築工程を示す図面である。 第13図はプラスミドpT13SHbβ（S1）の構築工程を示す
図面である。 第14図はプラスミドpTHb（β）−MP及びpNHb（β）−MP
の構築工程を示す図面である。 第15図はプラスミドpNHb（β）−MPS2の構築工程を示す
図面である。
である。 第２図は合成DNA断片BSFNの塩基配列を示す図面であ
る。 第３図はプラスミドpUC−SD6Nの構築工程を示す図面で
ある。 第４図はIL−６の直接発現プラスミドであるpBSF2−SD7
の構築工程を示す図面である。 第５図はヒトα−グロビン誘導体をコードする合成DNA
の塩基配列を示す図面である。 第６図はプラスミドpUC−Hb（Ａ）、pUC−Hb（Ｂ）、pU
C−Hb（Ｃ）の構築工程を示す図面である。 第７図はプラスミドpT13SHbα（S1）の構築工程を示す
図面である。 第８図はMet−Pro−グロビンの直接発現に必要な合成DN
A断片である。AMP、BMP、AMPS1、AMPS2、BMPS2の塩基配
列を示した図面である。 第９図はプラスミドpTHb（α）−MP及びpNHb（α）−MP
の構築工程を示す図面である。 第10図はプラスミドpNHb（α）−MPS1及びpNHb（α）−
MPS2の構築工程を示す図面である。 第11図はヒトβ−グロビン誘導体をコードする合成DNA
の塩基配列を示す図面である。 第12図はプラスミドpUC−Hb（Ｄ）、pUC−Hb（Ｅ）、pU
C−Hb（Ｆ）の構築工程を示す図面である。 第13図はプラスミドpT13SHbβ（S1）の構築工程を示す
図面である。 第14図はプラスミドpTHb（β）−MP及びpNHb（β）−MP
の構築工程を示す図面である。 第15図はプラスミドpNHb（β）−MPS2の構築工程を示す
図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭61−88882（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−224991（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−95798（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 1/21 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】ペプチドの遺伝子発現系が上流から少なく
ともプロモーター、５塩基から20塩基の隔たりをもって
連結された２つ以上のリボゾーム結合領域、翻訳開始コ
ドン、ペプチドコード領域及び転写終結部位がこの順序
で配列している遺伝子発現ベクター - 【請求項２】リボゾーム結合領域が２つである請求項
（１）に記載のベクター - 【請求項３】２つ以上のリボゾーム結合領域と翻訳開始
コドンの間がアデニン及び／又はチミンに富む塩基配列
を有する請求項（１）に記載の遺伝子発現ベクター - 【請求項４】ペプチドコード領域がインターロイキン６
をコードする領域である請求項（１）に記載のベクター - 【請求項５】請求項第（１）、（２）、（３）又は
（４）記載のベクターが組み込まれた大腸菌 - 【請求項６】請求項（５）に記載の大腸菌を培地中で培
養し、ペプチドコード領域に対応するアミノ酸配列を有
するポリペプチドを菌体内及び／又は培地中に蓄積せし
め該ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペ
プチドの製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18927089A JP3003135B2 (ja) | 1989-07-21 | 1989-07-21 | ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18927089A JP3003135B2 (ja) | 1989-07-21 | 1989-07-21 | ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0353884A JPH0353884A (ja) | 1991-03-07 |
| JP3003135B2 true JP3003135B2 (ja) | 2000-01-24 |
Family
ID=16238506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18927089A Expired - Lifetime JP3003135B2 (ja) | 1989-07-21 | 1989-07-21 | ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3003135B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4857497B2 (ja) * | 2001-08-06 | 2012-01-18 | パナソニック株式会社 | Ｌｅｄ表示装置 |
-
1989
- 1989-07-21 JP JP18927089A patent/JP3003135B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0353884A (ja) | 1991-03-07 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
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Year of fee payment: 10 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091119 |