JP2698976B2 - 新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト インターロイキン１ポリペプチド並
びにそのＮ末端部及びＣ末端部の部分欠失体のアミノ酸
配列中、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に変換させ
たアミノ酸配列を有する新規ポリペプチド、それをコー
ドするDNA及びそれらの製造法に関する。
びにそのＮ末端部及びＣ末端部の部分欠失体のアミノ酸
配列中、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に変換させ
たアミノ酸配列を有する新規ポリペプチド、それをコー
ドするDNA及びそれらの製造法に関する。
インターロイキン１は、単球／マクロファージ細胞を
はじめとする諸々の細胞から産生される生理活性物質で
ある。ヒト インターロイキン１には、大別してα型と
β型の二種類の分子が存在することが知られている（Fu
rutani,Y.ら,Nucleic Acids Res.,14巻,3167頁,1986年;
Clark,B.D.ら,Nucleic Acids Res.,14巻,7897頁,1986
年）。その代表的な作用として、Ｔ細胞及びＢ細胞に対
する分化増殖促進作用、リンパ球活性化作用、マクロフ
ァージの活性化作用、発熱惹起作用、プロスタグランジ
ンE2の産生誘導作用及び線維芽細胞の増殖促進作用等が
知られており［Oppenheim,J.J.ら、Immunology Today,7
巻,45頁,1986年;Dinarello,C.A.,Reviews of Infectiou
s Diseases,6巻,51頁,1984年］、生体における免疫機構
等の調節因子として、重要な役割を担っており、医薬品
としての臨床応用が期待されている。
はじめとする諸々の細胞から産生される生理活性物質で
ある。ヒト インターロイキン１には、大別してα型と
β型の二種類の分子が存在することが知られている（Fu
rutani,Y.ら,Nucleic Acids Res.,14巻,3167頁,1986年;
Clark,B.D.ら,Nucleic Acids Res.,14巻,7897頁,1986
年）。その代表的な作用として、Ｔ細胞及びＢ細胞に対
する分化増殖促進作用、リンパ球活性化作用、マクロフ
ァージの活性化作用、発熱惹起作用、プロスタグランジ
ンE2の産生誘導作用及び線維芽細胞の増殖促進作用等が
知られており［Oppenheim,J.J.ら、Immunology Today,7
巻,45頁,1986年;Dinarello,C.A.,Reviews of Infectiou
s Diseases,6巻,51頁,1984年］、生体における免疫機構
等の調節因子として、重要な役割を担っており、医薬品
としての臨床応用が期待されている。
α型のヒト インターロイキン１ポリペプチドのＮ末
端側の１〜14個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜４
個のアミノ酸の欠失体（ヨーロッパ公開特許第0188920
号）やα型のヒト インターロイキン１ポリペプチドの
Ｎ末端から36番目のAsnが脱アミド化され、Aspに変化し
たポリペプチドが知られている（Cameron,P.M.ら、J.Ex
p.Med.,164巻,237頁,1986年;Wingfield,P.ら,Eur.J.Bio
chem.,165巻,537頁,1987年）。また、異なる遺伝子に由
来し上記α型のヒト インターロイキン１ポリペプチド
のＮ末端から第２番目のSerがAlaにかわっているポリペ
プチドも知られている（March,C.J.ら,Nature,315巻,64
1頁,1985年）。β型のヒト インターロイキン１ポリペ
プチドに関しては、そのＮ末端側の１〜３個のアミノ酸
及び／又はＣ末端側の１〜３個のアミノ酸欠失体が知ら
れている（Mosley,B.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84巻,
4572頁,1987年）。
端側の１〜14個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜４
個のアミノ酸の欠失体（ヨーロッパ公開特許第0188920
号）やα型のヒト インターロイキン１ポリペプチドの
Ｎ末端から36番目のAsnが脱アミド化され、Aspに変化し
たポリペプチドが知られている（Cameron,P.M.ら、J.Ex
p.Med.,164巻,237頁,1986年;Wingfield,P.ら,Eur.J.Bio
chem.,165巻,537頁,1987年）。また、異なる遺伝子に由
来し上記α型のヒト インターロイキン１ポリペプチド
のＮ末端から第２番目のSerがAlaにかわっているポリペ
プチドも知られている（March,C.J.ら,Nature,315巻,64
1頁,1985年）。β型のヒト インターロイキン１ポリペ
プチドに関しては、そのＮ末端側の１〜３個のアミノ酸
及び／又はＣ末端側の１〜３個のアミノ酸欠失体が知ら
れている（Mosley,B.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84巻,
4572頁,1987年）。
本発明者等は、ヒト インターロイキン１の構造と生
物活性との関係について鋭意研究を重ね、該ポリペプチ
ドのアミノ酸配列の特定の部分を他のアミノ酸に変換し
たポリペプチドの特性を検索したところ、まったく以外
にもリンパ球活性化作用を示すが、プロスタグランジン
E2の産生誘導能を殆ど持たない特異な活性を示すことを
見い出し、本発明を完成するに至った。
物活性との関係について鋭意研究を重ね、該ポリペプチ
ドのアミノ酸配列の特定の部分を他のアミノ酸に変換し
たポリペプチドの特性を検索したところ、まったく以外
にもリンパ球活性化作用を示すが、プロスタグランジン
E2の産生誘導能を殆ど持たない特異な活性を示すことを
見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明のポリペプチドとしては、α型ヒト インター
ロイキン１の部分的アミノ酸変換体、即ち第１表の式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド並
びにそのＮ末端から１〜14残基及び／又はＣ末端から１
〜４残基のアミノ酸又はペプチドが欠失したポリペプチ
ドが挙げられる。
ロイキン１の部分的アミノ酸変換体、即ち第１表の式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド並
びにそのＮ末端から１〜14残基及び／又はＣ末端から１
〜４残基のアミノ酸又はペプチドが欠失したポリペプチ
ドが挙げられる。
但し、上記式中ＷはSer又はAlaを意味し、ＸはAsn又
はAspを意味し、ＹはAsp以外のアミノ酸を意味する。
はAspを意味し、ＹはAsp以外のアミノ酸を意味する。
本発明の好ましいポリペプチドとしては、第１表の式
［Ｉ］に示したアミノ酸配列において、ＷがSerであ
り、ＸがAsnであり、かつＹがTyrであるポリペプチド及
び第３表の式［III］に示したアミノ酸配列を有するポ
リペプチドが挙げられる。
［Ｉ］に示したアミノ酸配列において、ＷがSerであ
り、ＸがAsnであり、かつＹがTyrであるポリペプチド及
び第３表の式［III］に示したアミノ酸配列を有するポ
リペプチドが挙げられる。
但し、上記式中ＸはAsn又はAspを意味し、ＹはTyrを
意味する。
意味する。
本発明は、前記のポリペプチドの誘導体にも関する。
該ポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの鎖上の
側鎖官能基、Ｎ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキシ
ル基を利用して形成される誘導体を意味する。例えばカ
ルボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第一
もしくは第二アミンとの酸アミド類、アミノ基のＮ−ア
シル誘導体、ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体、カル
バモイル基の水解体又はポリエチレングリコール等によ
る修飾体、更には該ポリペプチドのカルボキシル基又は
アミノ基等とで形成される塩、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プロカ
イン、塩酸、グルコン酸等との塩が挙げられる。
該ポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの鎖上の
側鎖官能基、Ｎ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキシ
ル基を利用して形成される誘導体を意味する。例えばカ
ルボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第一
もしくは第二アミンとの酸アミド類、アミノ基のＮ−ア
シル誘導体、ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体、カル
バモイル基の水解体又はポリエチレングリコール等によ
る修飾体、更には該ポリペプチドのカルボキシル基又は
アミノ基等とで形成される塩、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プロカ
イン、塩酸、グルコン酸等との塩が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、分子間Ｓ−Ｓ結合により、
更に高分子を形成する場合もあり、このような高分子体
も本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明の
ポリペプチドは産生細胞或は産生条件により、Ｎ末端に
Metが付加したポリペプチドが得られる場合があり、こ
のようなポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含さ
れる。
更に高分子を形成する場合もあり、このような高分子体
も本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明の
ポリペプチドは産生細胞或は産生条件により、Ｎ末端に
Metが付加したポリペプチドが得られる場合があり、こ
のようなポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含さ
れる。
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするDNAに
も関する。そのDNAの例としては、第４表で掲げた式［I
V］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以
下、TN−55ポリペプチドという）をコードするDNAとし
て、第５表で掲げた式［Ａ］で示される塩基配列を有す
るDNA及びその縮重が挙げられる。
も関する。そのDNAの例としては、第４表で掲げた式［I
V］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以
下、TN−55ポリペプチドという）をコードするDNAとし
て、第５表で掲げた式［Ａ］で示される塩基配列を有す
るDNA及びその縮重が挙げられる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAは、公知のヒ
ト インターロイキン１或はそのＮ末端及び／又はＣ末
端のアミノ酸又はペプチド欠失体をコードするDNAを公
知の方法、例えば前記ヨーロッパ公開特許第0188920号
に記載の方法を用いて作製し、これを例えばワングらの
方法（Wang,A.M.ら,Science,224巻,1431頁,1984年）や
クンケルらの方法（Kunkel,T.A.ら,Methods in Enzymo
l.,154巻,367頁,1987年）に準じて点変異させ目的とす
る本発明のDNAを作製するか、或は適当な制限酵素によ
りDNA断片を単離し、目的とする箇所の塩基配列を人為
的に変えた合成オリゴデオキシヌクレオチドアダプター
と結合させることにより、本発明のDNAを製造すること
ができる。
ト インターロイキン１或はそのＮ末端及び／又はＣ末
端のアミノ酸又はペプチド欠失体をコードするDNAを公
知の方法、例えば前記ヨーロッパ公開特許第0188920号
に記載の方法を用いて作製し、これを例えばワングらの
方法（Wang,A.M.ら,Science,224巻,1431頁,1984年）や
クンケルらの方法（Kunkel,T.A.ら,Methods in Enzymo
l.,154巻,367頁,1987年）に準じて点変異させ目的とす
る本発明のDNAを作製するか、或は適当な制限酵素によ
りDNA断片を単離し、目的とする箇所の塩基配列を人為
的に変えた合成オリゴデオキシヌクレオチドアダプター
と結合させることにより、本発明のDNAを製造すること
ができる。
これらのDNAを当該技術分野で公知の技術により適当
な形質発現ベクターに適切な配列を有するように挿入
し、これを宿主に導入した形質転換体を培養することに
より、本発明のポリペプチドを製造することができる。
例えば、本発明のポリペプチドそれ自身をコードする塩
基配列を有するDNAの５′末端に翻訳開始コドンATGを、
かつ３′末端には終止コドンを有するDNA断片を作製
し、これを適当なプロモーター及びSD配列に続いて結合
させ、更にこれをベクターに組み込むことにより本発明
のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを作製するこ
とができる。プロモーターとしては、例えばlac、trp、
tac、phoＳ、phoＡ、PL、SV40初期プロモーター等が挙
げられる。ベクターとしては、例えばプラスミド（pBR3
22等）、ファージ（λファージ誘導体等）、ウイルス
（SV40等）、ランナウェイプラスミド等が挙げられる。
この本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを
適当な宿主、例えば大腸菌にコーエンらの方法（Cohen,
S.N.ら,Proc.Natl.Acad,Sci.,USA,69巻,2110頁,1972
年）に準じて導入することにより形質転換体をそれに応
じた適当な培養条件下で培養することにより、目的とす
るポリペプチド或はそのＮ末端にMetが結合したポリペ
プチドを製造することができる。この培養物を、例えば
リゾチーム消化と凍結融解、超音波破砕、フレンチプレ
ス等により破壊したのち、遠心分離又は過することに
より本発明のポリペプチド含有抽出液を得ることができ
る。この抽出液を蛋白質精製の一般的な精製法、例えば
限外過、透析、電気泳動、塩析分画、ゲル過分画、
イオン交換クロマトグラフィー、抗体カラムを用いるア
フィニティークロマトグラフィー等に従い精製すること
により、本発明のポリペプチドを得ることができる。ま
た、このようにして得たポリペプチドを化学的に修飾す
ることにより、本発明のポリペプチドの誘導体を得るこ
とができる。
な形質発現ベクターに適切な配列を有するように挿入
し、これを宿主に導入した形質転換体を培養することに
より、本発明のポリペプチドを製造することができる。
例えば、本発明のポリペプチドそれ自身をコードする塩
基配列を有するDNAの５′末端に翻訳開始コドンATGを、
かつ３′末端には終止コドンを有するDNA断片を作製
し、これを適当なプロモーター及びSD配列に続いて結合
させ、更にこれをベクターに組み込むことにより本発明
のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを作製するこ
とができる。プロモーターとしては、例えばlac、trp、
tac、phoＳ、phoＡ、PL、SV40初期プロモーター等が挙
げられる。ベクターとしては、例えばプラスミド（pBR3
22等）、ファージ（λファージ誘導体等）、ウイルス
（SV40等）、ランナウェイプラスミド等が挙げられる。
この本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを
適当な宿主、例えば大腸菌にコーエンらの方法（Cohen,
S.N.ら,Proc.Natl.Acad,Sci.,USA,69巻,2110頁,1972
年）に準じて導入することにより形質転換体をそれに応
じた適当な培養条件下で培養することにより、目的とす
るポリペプチド或はそのＮ末端にMetが結合したポリペ
プチドを製造することができる。この培養物を、例えば
リゾチーム消化と凍結融解、超音波破砕、フレンチプレ
ス等により破壊したのち、遠心分離又は過することに
より本発明のポリペプチド含有抽出液を得ることができ
る。この抽出液を蛋白質精製の一般的な精製法、例えば
限外過、透析、電気泳動、塩析分画、ゲル過分画、
イオン交換クロマトグラフィー、抗体カラムを用いるア
フィニティークロマトグラフィー等に従い精製すること
により、本発明のポリペプチドを得ることができる。ま
た、このようにして得たポリペプチドを化学的に修飾す
ることにより、本発明のポリペプチドの誘導体を得るこ
とができる。
以下に、本発明のポリペプチドの典型的な例として、
第４表に示したアミノ酸配列を有するTN−55ポリペプチ
ドの諸性質について述べる。
第４表に示したアミノ酸配列を有するTN−55ポリペプチ
ドの諸性質について述べる。
試験例１ TN−55ポリペプチドの物理化学的性状 TN−55ポリペプチドの分子量、等電点及び部分アミノ
酸配列の分析結果は、次のとおりであった。
酸配列の分析結果は、次のとおりであった。
分子量は、SDSを用いるポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により測定し、18±1kDと求められた。等電点
は、等電点電気泳動法により分析した結果、5.7±0.2で
あった。本ポリペプチドを、予め４−ビニルピリジンで
処理し、尿素存在下でリジルエンドペプチダーゼ（和光
純薬）を用いて35℃で一夜酵素分解したのち、シンクロ
パックRP−P300カラム（SynChrom社，米国）を用いた高
速液体クロマトグラフィーにより分取したペプチド断片
及び蛋白分解酵素未処理の本ポリペプチドについて、自
動アミノ酸配列決定装置（470A Protein Sequencer,App
lied Biosystems社，米国）により、それらのアミノ酸
配列を決定した。
泳動法により測定し、18±1kDと求められた。等電点
は、等電点電気泳動法により分析した結果、5.7±0.2で
あった。本ポリペプチドを、予め４−ビニルピリジンで
処理し、尿素存在下でリジルエンドペプチダーゼ（和光
純薬）を用いて35℃で一夜酵素分解したのち、シンクロ
パックRP−P300カラム（SynChrom社，米国）を用いた高
速液体クロマトグラフィーにより分取したペプチド断片
及び蛋白分解酵素未処理の本ポリペプチドについて、自
動アミノ酸配列決定装置（470A Protein Sequencer,App
lied Biosystems社，米国）により、それらのアミノ酸
配列を決定した。
蛋白分解酵素未処理のTN−55ポリペプチドを用いて決
定した本ポリペプチドのＮ末端から第40番目までのアミ
ノ酸配列は、次のとおりであり、第４表に示したアミノ
酸配列と完全に一致した。
定した本ポリペプチドのＮ末端から第40番目までのアミ
ノ酸配列は、次のとおりであり、第４表に示したアミノ
酸配列と完全に一致した。
一方、蛋白分解酵素分解により調製した二種類のペプ
チド断片（LP−10断片とLP−12断片と名付ける）のアミ
ノ酸配列は、次のとおりであった。
チド断片（LP−10断片とLP−12断片と名付ける）のアミ
ノ酸配列は、次のとおりであった。
LP−10断片のアミノ酸配列： LP−12断片のアミノ酸配列： これらLP−10断片とLP−12断片のアミノ酸配列は、そ
れぞれ第４表に示したアミノ酸配列のＮ末端から第101
〜119番目の領域及び第136〜159番目の領域のアミノ酸
配列と一致した。
れぞれ第４表に示したアミノ酸配列のＮ末端から第101
〜119番目の領域及び第136〜159番目の領域のアミノ酸
配列と一致した。
試験例２ TN−55ポリペプチドの生物活性 （１）リンパ球活性化作用 リンパ球活性化作用を、下記の方法により測定した。
即ち、TN−55ポリペプチド溶液を５％ウシ胎児血清を含
む組織培養用培地RPMI−1640（Flow Labs.,米国）にて
希釈した。各希釈液の50μｌを96穴平底型プレートの各
ウエルに注入し、その各ウエルに20μg/ml濃度のフィト
ヘマグルチニン−Ｐ（Difco Labs.,米国）の50μｌを添
加し、更にC3H/Heマウスの胸線細胞懸濁液（200万個/m
l）の100μｌを添加して、５％炭酸ガス含有空気中37℃
で３日間培養した。培養終了約18時間前に、［3H］−チ
ミジンの１μCiを添加し、細胞内に取り込まれた［3H］
−チミジン量を計測した。陰性対照には、供試試料のか
わりに５％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地を添加し
た系におけるマウスの胸線細胞培養時の［3H］−チミジ
ン取り込み量を示した。第６表に示すごとく、強いリン
パ球活性化作用を認めた。
即ち、TN−55ポリペプチド溶液を５％ウシ胎児血清を含
む組織培養用培地RPMI−1640（Flow Labs.,米国）にて
希釈した。各希釈液の50μｌを96穴平底型プレートの各
ウエルに注入し、その各ウエルに20μg/ml濃度のフィト
ヘマグルチニン−Ｐ（Difco Labs.,米国）の50μｌを添
加し、更にC3H/Heマウスの胸線細胞懸濁液（200万個/m
l）の100μｌを添加して、５％炭酸ガス含有空気中37℃
で３日間培養した。培養終了約18時間前に、［3H］−チ
ミジンの１μCiを添加し、細胞内に取り込まれた［3H］
−チミジン量を計測した。陰性対照には、供試試料のか
わりに５％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地を添加し
た系におけるマウスの胸線細胞培養時の［3H］−チミジ
ン取り込み量を示した。第６表に示すごとく、強いリン
パ球活性化作用を認めた。
（２）プロスタグランジンE2産生誘導能 TN−55ポリペプチドのヒト骨肉腫細胞MG−63細胞（Am
erican Type Cell Collection CRL 1427）を標的細胞と
するプロスタグランジンE2産生誘導能を、前記のリンパ
球活性化作用の測定に用いた同じ試料原液を用い、以下
の方法に従って測定した。即ち、TN−55ポリペプチド溶
液を10％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸及びピルビン酸
ナトリウムを含む組織培養用培地MEMアール液（Flow La
bs.）にて希釈した。各希釈液の100μｌを24穴平底型プ
レートの各ウエルに注入し、更に各ウエル当り約２万個
のMG−63細胞を含む細胞懸濁液の400μｌを添加して、
５％炭酸ガス含有空気中37℃で48時間培養した。培養終
了後、培養上清を採取しその上清中のプロスタグランジ
ンE2含量を、RIAキット（E.I.duPont de Nemours ＆ C
o.,米国）を用いて測定した。陰性対照には、供試試料
のかわりに上記の培養液を添加した系におけるMG−63細
胞の培養上清中のプロスタグランジンE2量を示した。
erican Type Cell Collection CRL 1427）を標的細胞と
するプロスタグランジンE2産生誘導能を、前記のリンパ
球活性化作用の測定に用いた同じ試料原液を用い、以下
の方法に従って測定した。即ち、TN−55ポリペプチド溶
液を10％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸及びピルビン酸
ナトリウムを含む組織培養用培地MEMアール液（Flow La
bs.）にて希釈した。各希釈液の100μｌを24穴平底型プ
レートの各ウエルに注入し、更に各ウエル当り約２万個
のMG−63細胞を含む細胞懸濁液の400μｌを添加して、
５％炭酸ガス含有空気中37℃で48時間培養した。培養終
了後、培養上清を採取しその上清中のプロスタグランジ
ンE2含量を、RIAキット（E.I.duPont de Nemours ＆ C
o.,米国）を用いて測定した。陰性対照には、供試試料
のかわりに上記の培養液を添加した系におけるMG−63細
胞の培養上清中のプロスタグランジンE2量を示した。
第７表に示すごとく、プロスタグランジンE2産生誘導
能は殆ど認められなかった。
能は殆ど認められなかった。
以上の結果から、TN−55ポリペプチドは、強いリンパ
球活性化作用を発揮する量においても、有意なプロスタ
グランジンE2産生誘導能は認められず、極めて特徴的な
特性を有するポリペプチドであることが証明された。
球活性化作用を発揮する量においても、有意なプロスタ
グランジンE2産生誘導能は認められず、極めて特徴的な
特性を有するポリペプチドであることが証明された。
尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を
使用する。
使用する。
A アデニン C シトシン G グアニン T チミン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補cDNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA ATP アデノシン三リン酸 dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 bp 塩基対 kbp キロ塩基対 kD キロダルトン SDS ラウリル硫酸ナトリウム 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
る。
る。
実施例１ TN−55ポリペプチドの製造 前記第４表の式［IV］で示されるアミノ酸配列を有す
るTN−55ポリペプチドを以下の方法で製造した。
るTN−55ポリペプチドを以下の方法で製造した。
（１）形質発現プラスミドの構築 参考例２に記載の組み換え体プラスミドpHIP312ECを
出発材料として用い、このプラスミドDNA中のヒトイン
ターロイキン１ポリペプチドのＣ末端から第９番目のア
ミノ酸（Asp）をコードするコドン（GAC）を、クンケル
らの方法（Kunkel,T.A.ら,Methods in Enzymol.,154巻,
367頁,1987年）に準じた部位特異的変異誘導法によりチ
ロシンに対応するコドンTACに変換することにより、TN
−55ポリペプチド生産用の形質発現プラスミド（pHTN5
5）を構築した。
出発材料として用い、このプラスミドDNA中のヒトイン
ターロイキン１ポリペプチドのＣ末端から第９番目のア
ミノ酸（Asp）をコードするコドン（GAC）を、クンケル
らの方法（Kunkel,T.A.ら,Methods in Enzymol.,154巻,
367頁,1987年）に準じた部位特異的変異誘導法によりチ
ロシンに対応するコドンTACに変換することにより、TN
−55ポリペプチド生産用の形質発現プラスミド（pHTN5
5）を構築した。
その構築方法は以下のとおりであり、部位特異的変異
誘導には、MUTA−GENインビトロムタジェネシスキット
（Bio−Rad Labs.,米国）を用いた。即ち、プラスミドp
HIP312ECを制限酵素Pvu IIとHind IIIにて消化し、ヒト
インターロイキン１ポリペプチドをコードする領域及
び大腸菌トリプトファンプロモーター領域を含むDNA断
片を単離した。このDNA断片を、M13mp19ベクターの制限
酵素Hind IIIとHinc II認識部位間に挿入した。この組
み換え体DNAを大腸菌JM105株に感染させ、これを培養し
て該ファージを採取した。次いで、このファージを大腸
菌CJ236株に感染させるとともに、ウリジン（１μg/m
l）及びクロラムフェニコール（20μg/ml）を含有する2
xTY培地［組成:1.6％トリプトン、１％酵母エキス、0.5
％塩化ナトリウム］中、37℃で５時間培養し、その培養
上清からファージDNAを精製分離した。培養容量10ml当
り、約２μｇのファージDNAが得られた。
誘導には、MUTA−GENインビトロムタジェネシスキット
（Bio−Rad Labs.,米国）を用いた。即ち、プラスミドp
HIP312ECを制限酵素Pvu IIとHind IIIにて消化し、ヒト
インターロイキン１ポリペプチドをコードする領域及
び大腸菌トリプトファンプロモーター領域を含むDNA断
片を単離した。このDNA断片を、M13mp19ベクターの制限
酵素Hind IIIとHinc II認識部位間に挿入した。この組
み換え体DNAを大腸菌JM105株に感染させ、これを培養し
て該ファージを採取した。次いで、このファージを大腸
菌CJ236株に感染させるとともに、ウリジン（１μg/m
l）及びクロラムフェニコール（20μg/ml）を含有する2
xTY培地［組成:1.6％トリプトン、１％酵母エキス、0.5
％塩化ナトリウム］中、37℃で５時間培養し、その培養
上清からファージDNAを精製分離した。培養容量10ml当
り、約２μｇのファージDNAが得られた。
別途、下記式［Ｂ］で示される塩基配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを常法に従って化学合成した。
キシリボヌクレオチドを常法に従って化学合成した。
５′−CTATCACTTACTTTCA−３′ ［Ｂ］ この塩基配列は、第８表の塩基配列において第787番
目の塩基を除いて、第779〜794番目の配列と一致する。
この化学合成DNAを変異誘導プライマーという。
目の塩基を除いて、第779〜794番目の配列と一致する。
この化学合成DNAを変異誘導プライマーという。
この変異誘導プライマーの５′末端にリン酸基を付加
し、このプライマーを先に調製したファージDNAとアニ
ール緩衝液［組成:2mM塩化マグネシウム及び50mM塩化ナ
トリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液（p7.4）］中、70
℃で10分間反応させのち、１分間に１℃の割合で30℃ま
で徐々に冷却し、プライマーをファージDNAに結合させ
た。次いで、T4DNAポリメラーゼ及びT4DNAリガーゼを用
いてdGTP、dATP、dCTP、dTTP及びATP等の存在下で、フ
ァージDNAに対して相補的なDNAを合成し環状二本鎖DNA
とした。これを大腸菌JM105株に感染させ、各クローン
についてそれぞれ培養し、その培養菌体から複製型二本
鎖DNAを単離した。その塩基配列は、培養上清から単離
した単鎖DNAを用いて蛋白翻訳領域を中心に塩基配列を
決定し、TN−55ポリペプチドをコードする塩基配列を有
していることを確認した。次いで、複製型二本鎖DNAか
ら制限酵素Hpa IとXho Iによる消化にて、該蛋白翻訳領
域を含むDNA断片を切り出した。このDNA断片を、TN−55
DNA断片という。
し、このプライマーを先に調製したファージDNAとアニ
ール緩衝液［組成:2mM塩化マグネシウム及び50mM塩化ナ
トリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液（p7.4）］中、70
℃で10分間反応させのち、１分間に１℃の割合で30℃ま
で徐々に冷却し、プライマーをファージDNAに結合させ
た。次いで、T4DNAポリメラーゼ及びT4DNAリガーゼを用
いてdGTP、dATP、dCTP、dTTP及びATP等の存在下で、フ
ァージDNAに対して相補的なDNAを合成し環状二本鎖DNA
とした。これを大腸菌JM105株に感染させ、各クローン
についてそれぞれ培養し、その培養菌体から複製型二本
鎖DNAを単離した。その塩基配列は、培養上清から単離
した単鎖DNAを用いて蛋白翻訳領域を中心に塩基配列を
決定し、TN−55ポリペプチドをコードする塩基配列を有
していることを確認した。次いで、複製型二本鎖DNAか
ら制限酵素Hpa IとXho Iによる消化にて、該蛋白翻訳領
域を含むDNA断片を切り出した。このDNA断片を、TN−55
DNA断片という。
別途、参考例１に記載の組み換え体プラスミドpHIPH3
83aから制限酵素Hpa IとXho Iを用いて、アンピシリン
耐性遺伝子及び複製開始点を含む大きなDNA断片を切り
出し、これを上記のTN−55DNA断片とT4DNAリガーゼを用
いて結合させることにより、形質発現プラスミドpHTN55
を構築した。
83aから制限酵素Hpa IとXho Iを用いて、アンピシリン
耐性遺伝子及び複製開始点を含む大きなDNA断片を切り
出し、これを上記のTN−55DNA断片とT4DNAリガーゼを用
いて結合させることにより、形質発現プラスミドpHTN55
を構築した。
この形質発現プラスミドpHTN55を、次の方法に従って
大腸菌HB101株に導入し形質転換体を作製した。即ち、
大腸菌HB101株をLB培地［組成:1％トリプトン、0.5％酵
母エキス、１％塩化ナトリウム（pH7.5）〕に接種し、3
0℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の1mlを100mlのLB
培地に接種し、濁度（波長600nmの吸光度）が約0.6に達
するまで、30℃で培養した。この培養液を氷水中で30分
間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。この菌
体を50mlの50mM塩化カルシウム液中に再懸濁させ、氷水
中で60分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取し20
％グリセリンを含む50mM塩化カルシウム液の10mlに懸濁
させた。この懸濁液に上記の形質発現プラスミドpHTN55
を添加し、氷水中で20分間、室温で10分間反応させたの
ち、LB培置を添加して37℃で60分間振盪培養した。その
菌体懸濁液の一定量を、25μg/ml濃度のインピシリンを
含むLB寒天平板（寒天濃度1.5％）に播き、37℃で一夜
培養し、アンピシリン耐性クローンを得た。このアンピ
シリン耐性クローン、即ち形質転換体をHB101/pHTN55と
名付け、TN−55ポリペプチドの生産菌とした。
大腸菌HB101株に導入し形質転換体を作製した。即ち、
大腸菌HB101株をLB培地［組成:1％トリプトン、0.5％酵
母エキス、１％塩化ナトリウム（pH7.5）〕に接種し、3
0℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の1mlを100mlのLB
培地に接種し、濁度（波長600nmの吸光度）が約0.6に達
するまで、30℃で培養した。この培養液を氷水中で30分
間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。この菌
体を50mlの50mM塩化カルシウム液中に再懸濁させ、氷水
中で60分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取し20
％グリセリンを含む50mM塩化カルシウム液の10mlに懸濁
させた。この懸濁液に上記の形質発現プラスミドpHTN55
を添加し、氷水中で20分間、室温で10分間反応させたの
ち、LB培置を添加して37℃で60分間振盪培養した。その
菌体懸濁液の一定量を、25μg/ml濃度のインピシリンを
含むLB寒天平板（寒天濃度1.5％）に播き、37℃で一夜
培養し、アンピシリン耐性クローンを得た。このアンピ
シリン耐性クローン、即ち形質転換体をHB101/pHTN55と
名付け、TN−55ポリペプチドの生産菌とした。
（２）TN−55ポリペプチドの製造 第１項で得たTN−55ポリペプチド生産菌HB101/pHTN55
を、LB培地にて37℃で一夜培養したのち、その菌体懸濁
液を約100倍量の栄養倍地［組成:1.5％リン酸二ナトリ
ウム・12水塩、0.3％リン酸一カリウム、0.1％塩化アン
モニウム、2mg/1ビタミンB1、0.5％カザミノ酸、2mM硫
酸マグネシウム、0.1mM塩化カルシウム、１％トリプト
ン、0.5％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、0.4％グリ
セリン］に接種し、更にインドール−３−アクリル酸を
最終濃度20μg/mlになるように添加したのち28時間培養
した。菌体を遠心分離により採取し、0.1％リゾチーム
及び30mM塩化ナトリウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）に懸濁させた。氷水中で30分間静置したのち
ドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃での融解を
繰り返して菌体を破壊した。これに1/50容量の10％ポリ
エチレンイミンを加えて静置ののち遠心分離にて菌体残
査等を除いた抽出液を得た。この抽出液に硫酸アンモニ
ウムを最終70％飽和になるように添加し、静置ののち遠
心分離により沈澱を採取した。この沈澱を蒸留水に溶解
させ、5mMリン酸塩緩衝換生理食塩液（pH6.5）［以下、
PBSと記す］に対して透析したのちセファクリルＳ−200
カラム（Pharmacia,スウェーデ）を用いるゲル過に付
した。分子量約15〜20kDの溶出位置に相当する画分から
TN−55ポリペプチドを含む溶出液を集め、これを予め5m
Mリン酸塩緩衝液（pH6.5）［以下、PBと記す］にて平衡
化したDEAE−セファロースCL−6Bカラム（Pharmacia）
に負荷し、PBにてカラムを洗浄した。同カラムに吸着し
たTN−55ポリペプチドを、PB中０〜0.5Mの塩化ナトリウ
ム濃度勾配にて溶出したところ、TN−55ポリペプチドの
計算分子量と一致する分子量を有するポリペプチドが、
二分画に分離されて溶出された。低濃度の塩化ナトリウ
ムで溶出させた画分をTN−55（ａ）ポリペプチド画分と
名付け、より高い塩化ナトリウム濃度で溶出される画分
をTN−55（ｂ）ポリペプチド画分と名付けた。
を、LB培地にて37℃で一夜培養したのち、その菌体懸濁
液を約100倍量の栄養倍地［組成:1.5％リン酸二ナトリ
ウム・12水塩、0.3％リン酸一カリウム、0.1％塩化アン
モニウム、2mg/1ビタミンB1、0.5％カザミノ酸、2mM硫
酸マグネシウム、0.1mM塩化カルシウム、１％トリプト
ン、0.5％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、0.4％グリ
セリン］に接種し、更にインドール−３−アクリル酸を
最終濃度20μg/mlになるように添加したのち28時間培養
した。菌体を遠心分離により採取し、0.1％リゾチーム
及び30mM塩化ナトリウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）に懸濁させた。氷水中で30分間静置したのち
ドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃での融解を
繰り返して菌体を破壊した。これに1/50容量の10％ポリ
エチレンイミンを加えて静置ののち遠心分離にて菌体残
査等を除いた抽出液を得た。この抽出液に硫酸アンモニ
ウムを最終70％飽和になるように添加し、静置ののち遠
心分離により沈澱を採取した。この沈澱を蒸留水に溶解
させ、5mMリン酸塩緩衝換生理食塩液（pH6.5）［以下、
PBSと記す］に対して透析したのちセファクリルＳ−200
カラム（Pharmacia,スウェーデ）を用いるゲル過に付
した。分子量約15〜20kDの溶出位置に相当する画分から
TN−55ポリペプチドを含む溶出液を集め、これを予め5m
Mリン酸塩緩衝液（pH6.5）［以下、PBと記す］にて平衡
化したDEAE−セファロースCL−6Bカラム（Pharmacia）
に負荷し、PBにてカラムを洗浄した。同カラムに吸着し
たTN−55ポリペプチドを、PB中０〜0.5Mの塩化ナトリウ
ム濃度勾配にて溶出したところ、TN−55ポリペプチドの
計算分子量と一致する分子量を有するポリペプチドが、
二分画に分離されて溶出された。低濃度の塩化ナトリウ
ムで溶出させた画分をTN−55（ａ）ポリペプチド画分と
名付け、より高い塩化ナトリウム濃度で溶出される画分
をTN−55（ｂ）ポリペプチド画分と名付けた。
TN−55（ａ）ポリペプチド画分を5mMリン酸塩緩衝液
（pH6.5）［以下、PB5と記す］に対して透析したのち、
予めPB5にて平衡化したＳ−セファロースファーストフ
ローカラム（Pharmacia）に負荷し、PB5にてカラムを洗
浄し、次いでPB5中０〜0.25Mの塩化ナトリウム濃度勾配
にて溶出した。TN−55（ａ）ポリペプチド画分を当め限
外過にて濃縮したのち、トヨパールHW−55カラム（東
ソー）を用いるゲル過により精製し、最終的にSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析にて不純物を認め
ない高度精製品を得た。
（pH6.5）［以下、PB5と記す］に対して透析したのち、
予めPB5にて平衡化したＳ−セファロースファーストフ
ローカラム（Pharmacia）に負荷し、PB5にてカラムを洗
浄し、次いでPB5中０〜0.25Mの塩化ナトリウム濃度勾配
にて溶出した。TN−55（ａ）ポリペプチド画分を当め限
外過にて濃縮したのち、トヨパールHW−55カラム（東
ソー）を用いるゲル過により精製し、最終的にSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析にて不純物を認め
ない高度精製品を得た。
ここで得たTN−55（ａ）ポリペプチド画分から精製分
離したポリペプチドを、前記試験例（１）及び（２）に
供した。
離したポリペプチドを、前記試験例（１）及び（２）に
供した。
前記試験例の結果等により、このポリペプチドが目的
とするTN−55ポリペプチドであると結論された。
とするTN−55ポリペプチドであると結論された。
実施例２ TN−55ポリペプチドの脱アミド体の製造 TN−55ポリペプチドのアミノ酸配列中、Ｎ末端から第
36番目のアミノ酸がAspに変化したポリペプチド（TN−5
5Aspポリペプチドという）を以下の方法により分離精製
した。
36番目のアミノ酸がAspに変化したポリペプチド（TN−5
5Aspポリペプチドという）を以下の方法により分離精製
した。
実施例１第２項に記載したDEAE−セファロースCL−6B
カラムクロマトグラフィーにおいて、より高い塩化ナト
リウム濃度で溶出されたTN−55（ｂ）ポリペプチド画分
に含まれるポリペプチドを、実施例１第２項記載の方法
に準じて精製した。即ち、Ｓ−セファロースファースト
フローカラムクロマトグラフィー及びトヨパールHW−55
カラムを用いるゲル過により精製し、高度精製品を得
た。
カラムクロマトグラフィーにおいて、より高い塩化ナト
リウム濃度で溶出されたTN−55（ｂ）ポリペプチド画分
に含まれるポリペプチドを、実施例１第２項記載の方法
に準じて精製した。即ち、Ｓ−セファロースファースト
フローカラムクロマトグラフィー及びトヨパールHW−55
カラムを用いるゲル過により精製し、高度精製品を得
た。
このTN−55（ｂ）ポリペプチド画分から単離精製した
ポリペプチドのアミノ酸配列を、Ｎ末端から順次エドマ
ン分解法により分析したところ、本ポリペプチドのＮ末
端から40番目までのアミノ酸配列は、次のとおりであっ
た。
ポリペプチドのアミノ酸配列を、Ｎ末端から順次エドマ
ン分解法により分析したところ、本ポリペプチドのＮ末
端から40番目までのアミノ酸配列は、次のとおりであっ
た。
即ち、Ｎ末端から第36番目のアミノ酸はAspと同定さ
れた。この結果から、このポリペプチド精製品は、TN−
55Aspポリペプチドであると結論された。尚、このTN−5
5Aspポリペプチドの等電点は、等電点電気泳動法により
5.4±0.2と求められた。
れた。この結果から、このポリペプチド精製品は、TN−
55Aspポリペプチドであると結論された。尚、このTN−5
5Aspポリペプチドの等電点は、等電点電気泳動法により
5.4±0.2と求められた。
実施例３ TN−55（141）ポリペプチドの製造 前記第３表の式［III］に示したアミノ酸配列を有す
るポリペプチド（但し、第３表中のＸはAsnであり、Ｙ
はTyrである）、即ちTN−55ポリペプチドのアミ酸配列
中、Ｎ末端から14残基のペプチド及びＣ末端から４残基
のペプチドを欠失させたアミノ酸配列に対応するポリペ
プチド［TN−55（141）ポリペプチドという］を以下の
方法により分離精製した。
るポリペプチド（但し、第３表中のＸはAsnであり、Ｙ
はTyrである）、即ちTN−55ポリペプチドのアミ酸配列
中、Ｎ末端から14残基のペプチド及びＣ末端から４残基
のペプチドを欠失させたアミノ酸配列に対応するポリペ
プチド［TN−55（141）ポリペプチドという］を以下の
方法により分離精製した。
（１）形質発現プラスミドの構築 ヨーロッパ公開特許第0188920号に記載の方法で得た
ヒト インターロイキン１前駆体ポリペプチドをコード
するクローン化cDNAが組み込まれた組み換え体プラスミ
ドpHL4から、制限酵素Pst Iによる消化にて、cDNA領域
を切り出した。このcDNAがコードするヒトインターロイ
キン１前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列及びその塩基
配列を第８表に示す。このクローン化cDNAから、制限酵
素EcoR IとSau96 Iによる消化にて、第８表に示した塩
基配列の第398〜769番目までに相当するDNA断片を単離
した。
ヒト インターロイキン１前駆体ポリペプチドをコード
するクローン化cDNAが組み込まれた組み換え体プラスミ
ドpHL4から、制限酵素Pst Iによる消化にて、cDNA領域
を切り出した。このcDNAがコードするヒトインターロイ
キン１前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列及びその塩基
配列を第８表に示す。このクローン化cDNAから、制限酵
素EcoR IとSau96 Iによる消化にて、第８表に示した塩
基配列の第398〜769番目までに相当するDNA断片を単離
した。
このDNA断片に、下記の式［Ｃ］及び［Ｄ］で示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプラーをT4
DANリガーゼを用いて結合させた。
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプラーをT4
DANリガーゼを用いて結合させた。
式［Ｃ］及び［Ｄ］の化学合成オリゴヌクレオチドア
ダプラーの塩基配列は、次の通りである。
ダプラーの塩基配列は、次の通りである。
ここで得られたDNA断片を、IL1（141）断片という。
形質発現ベクターpEP302を、古谷らの方法（Furutan
i,Y.ら,Nucleic Acids Res.,13巻、5869頁,1985年）に
従って作製し、これを制限酵素Hpa IとBamH Iにて消化
し、大腸菌トリプトファン プロモーター領域部分及び
アンピシリン耐性遺伝子を含む大きなDNA断片を単離し
た。この断片に下記式［Ｅ］で示される化学合成オリゴ
ヌクレオチドアダプラーをT4DNAリガーゼを用いて結合
させた。
i,Y.ら,Nucleic Acids Res.,13巻、5869頁,1985年）に
従って作製し、これを制限酵素Hpa IとBamH Iにて消化
し、大腸菌トリプトファン プロモーター領域部分及び
アンピシリン耐性遺伝子を含む大きなDNA断片を単離し
た。この断片に下記式［Ｅ］で示される化学合成オリゴ
ヌクレオチドアダプラーをT4DNAリガーゼを用いて結合
させた。
更に、この得られたDNA断片を、上記のIL1（141）断
片と、T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、T
N−55（141）ポリペプチド生産用の形質発現プラスミド
を構築した（図１参照）。この形質発現プラスミドをpH
TN55（141）と名付けた。
片と、T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、T
N−55（141）ポリペプチド生産用の形質発現プラスミド
を構築した（図１参照）。この形質発現プラスミドをpH
TN55（141）と名付けた。
（２）TN−55（141）ポリペプチドの製造 第１項で作製した形質発現プラスミドをpHTN55（14
1）を用いて実施例１に記載した方法に準じて、形質転
換体を作製し、その培養菌体よりTN−55（141）ポリペ
プチドを分離精製した。
1）を用いて実施例１に記載した方法に準じて、形質転
換体を作製し、その培養菌体よりTN−55（141）ポリペ
プチドを分離精製した。
得られたTN−55（141）ポリペプチド精製品につい
て、そのＮ末端部分のアミノ酸配列をエドマン分解法に
より分析した結果、そのＮ末端から第40番目までのアミ
ノ酸配列は、次のとおりであり、前記第３表の式［II
I］に示したアミノ酸配列と一致した（但し、第３表中
のＸはAsnである）。
て、そのＮ末端部分のアミノ酸配列をエドマン分解法に
より分析した結果、そのＮ末端から第40番目までのアミ
ノ酸配列は、次のとおりであり、前記第３表の式［II
I］に示したアミノ酸配列と一致した（但し、第３表中
のＸはAsnである）。
また、カルボキシペプチダーゼ酵素分解及びアミノ酸
分析の結果では、ロイシンが検出された。
分析の結果では、ロイシンが検出された。
このTN−55（141）ポリペプチドの精製過程中、実施
例２に示したと同様により酸性側の等電点を有する脱ア
ミド体の存在を確認した。その脱アミド体ポリペプチド
のアミノ酸配列分析の結果から、Ｎ末端から第22番目の
アミノ酸がAspに変化していることを確認した。
例２に示したと同様により酸性側の等電点を有する脱ア
ミド体の存在を確認した。その脱アミド体ポリペプチド
のアミノ酸配列分析の結果から、Ｎ末端から第22番目の
アミノ酸がAspに変化していることを確認した。
TN−55（141）ポリペプチドの等電点は5.4±0.2であ
り、その脱アミド体ポリペプチドの等電点は5.2±0.2と
求められた。
り、その脱アミド体ポリペプチドの等電点は5.2±0.2と
求められた。
参考例１ 形質発現プラスミドpHIPH383aの構築 ヒト インターロイキン１前駆体ポリペプチドをコー
ドするクローン化cDNA（第８表参照）が組み込まれた組
み換え体プラスミドpHL4から、制限酵素Pst Iによる消
化にて、cDNA領域を切り出した。このクローン化cDNAか
ら、制限酵素EcoR IとBstN Iにて消化し、第８表に示し
た塩基配列の第398〜808番目までに相当するDNA断片を
単離した。
ドするクローン化cDNA（第８表参照）が組み込まれた組
み換え体プラスミドpHL4から、制限酵素Pst Iによる消
化にて、cDNA領域を切り出した。このクローン化cDNAか
ら、制限酵素EcoR IとBstN Iにて消化し、第８表に示し
た塩基配列の第398〜808番目までに相当するDNA断片を
単離した。
このDNA断片に、下記の式［Ｆ］及び［Ｇ］で示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをT4
DNAリガーゼを用いて結合させた。ここで得られたDNA断
片を、SD−IL1断片という。但し、式［Ｆ］の化学合成
オリゴヌクレオチド アダプラーとは、下記式［ａ］〜
［ｅ］で示される５種類のDNA断片を、順次結合させて
作製したDNAアダプターである（以下、化学合成DNA
［Ｆ］と記す）。
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをT4
DNAリガーゼを用いて結合させた。ここで得られたDNA断
片を、SD−IL1断片という。但し、式［Ｆ］の化学合成
オリゴヌクレオチド アダプラーとは、下記式［ａ］〜
［ｅ］で示される５種類のDNA断片を、順次結合させて
作製したDNAアダプターである（以下、化学合成DNA
［Ｆ］と記す）。
式［Ｇ］の化学合成オリゴヌクレオチド アダプター
の塩基配列は、次の通りである。
の塩基配列は、次の通りである。
別途に、形質発現ベクターpEP302を、制限酵素Hpa I
とBamH Iにて消化し、大腸菌トリプトファンプロモータ
ー領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなDN
A断片（以下、ベクター断片という）を単離した。この
ベクター断片と上記のSD−IL1断片を、T4DNAリガーゼを
用いて結合させることにより、ヒトインターロイキン１
ポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを構築した
（第２図参照）。
とBamH Iにて消化し、大腸菌トリプトファンプロモータ
ー領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなDN
A断片（以下、ベクター断片という）を単離した。この
ベクター断片と上記のSD−IL1断片を、T4DNAリガーゼを
用いて結合させることにより、ヒトインターロイキン１
ポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを構築した
（第２図参照）。
この形質発現プラスミドをpHIPH383aと名付けた。
参考例２ 形質発現プラスミドpHIP312ECの構築 プラスミドpBR322を、制限酵素Ava IとPvu IIにて消
化し、得られた大きなDNA断片（約3.7kbp）を単離し
た。このDNA断片の両端を、DNAポリメラーゼＩ（クレノ
ーフラグメント）及びdGTP、dATP、dCTP、dTTPを用いて
平滑末端としたのちT4DNAリガーゼによて結合させ、pBR
322の複製開始点近傍のコピー数制御領域を欠失させた
プラスミドベクター（pBRS6という）を作製した。
化し、得られた大きなDNA断片（約3.7kbp）を単離し
た。このDNA断片の両端を、DNAポリメラーゼＩ（クレノ
ーフラグメント）及びdGTP、dATP、dCTP、dTTPを用いて
平滑末端としたのちT4DNAリガーゼによて結合させ、pBR
322の複製開始点近傍のコピー数制御領域を欠失させた
プラスミドベクター（pBRS6という）を作製した。
このプラスミドベクターpBRS6を、制限酵素EcoR Iに
て消化し、直鎖状DNAとしたのち、その両端をDNAポリメ
ラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びdGTP、dATP、dC
TP、dTTPを用いて平滑末端とした。このDNA断片の両端
に、下記式［Ｈ］で示されるオリゴヌクレオチド リン
カーをT4DNAリガーゼを用いて結合させた。
て消化し、直鎖状DNAとしたのち、その両端をDNAポリメ
ラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びdGTP、dATP、dC
TP、dTTPを用いて平滑末端とした。このDNA断片の両端
に、下記式［Ｈ］で示されるオリゴヌクレオチド リン
カーをT4DNAリガーゼを用いて結合させた。
化学合成リンカーの塩基配列は、次の通りである。
５′−CCTCGAGG−３′ ［Ｈ］ 次いで、得られたDNA断片を制限酵素Pst IとXho Iに
より消化し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む大きな
DNA断片を単離した。このDNA断片を、pBRS6−断片とい
う。
より消化し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む大きな
DNA断片を単離した。このDNA断片を、pBRS6−断片とい
う。
別途、参考例１に記載した組み換え体プラスミドpHIP
H383aを、制限酵素Pst IとXho Iにより消化し、ヒト
インターロイキン１ポリペプチドをコードする領域を含
むDNA断片を単離した。このDNA断片を、上記のpBRS6−
断片と結合させることにより、テトラサイクリン耐性遺
伝子を有するヒト インターロイキン１ポリペプチド生
産用形質発現プラスミドを構築した（第３図参照）。
H383aを、制限酵素Pst IとXho Iにより消化し、ヒト
インターロイキン１ポリペプチドをコードする領域を含
むDNA断片を単離した。このDNA断片を、上記のpBRS6−
断片と結合させることにより、テトラサイクリン耐性遺
伝子を有するヒト インターロイキン１ポリペプチド生
産用形質発現プラスミドを構築した（第３図参照）。
この形質発現プラスミドをpHIP312ECと名付けた。
第１図は、形質発現プラスミドpHTN55（141）の構築工
程を示す。図中の合成DNAアダプター［Ｃ］、［Ｄ］及
び［Ｅ］は、実施例３に記載した化学合成オリゴヌクレ
オチド アダプターである。 第２図は、形質発現プラスミドpHIPH383aの構築工程を
示す。図中の合成DNAアダプター［Ｆ］と［Ｇ］は、参
考例１に記載した化学合成オリゴヌクレオチド アダプ
ターである。 第３図は、形質発現プラスミドpHIP312ECの構築工程を
示す。図中の合成DNAリンカー［Ｈ］は、参考例２に記
載した化学合成オリゴヌクレオチド リンカーである。
程を示す。図中の合成DNAアダプター［Ｃ］、［Ｄ］及
び［Ｅ］は、実施例３に記載した化学合成オリゴヌクレ
オチド アダプターである。 第２図は、形質発現プラスミドpHIPH383aの構築工程を
示す。図中の合成DNAアダプター［Ｆ］と［Ｇ］は、参
考例１に記載した化学合成オリゴヌクレオチド アダプ
ターである。 第３図は、形質発現プラスミドpHIP312ECの構築工程を
示す。図中の合成DNAリンカー［Ｈ］は、参考例２に記
載した化学合成オリゴヌクレオチド リンカーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】リンパ球活性化作用を示すが、プロスタグ
ランジンE2の産生誘導能を殆ど持たない性質を有する、
少なくともＹの部分を変換した、下記式〔Ｉ〕で示され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのＮ末端側
の１〜14個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜４個の
アミノ酸が欠失したポリペプチド。 （式中ＷはSer又はAlaを意味し、ＸはAsn又はAspを意味
し、ＹはAsp以外のアミノ酸を意味する。） - 【請求項２】下記式〔III〕で示されるアミノ酸配列を
有する特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （式中ＸはAsn又はAspを意味し、ＹはAsp以外のアミノ
酸を意味する。） - 【請求項３】特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
式〔Ｉ〕又は〔III〕で示されるアミノ酸配列中、ＹがT
yrであるアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１項又
は第２項記載のポリペプチド。 - 【請求項４】特許請求の範囲第１項〜３項のいずれかに
記載のポリペプチドをコードするDNA。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63024613A JP2698976B2 (ja) | 1988-02-03 | 1988-02-03 | 新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ |
| ES89301007T ES2059717T3 (es) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Nuevos polipeptidos y adn codante para estos. |
| AT89301007T ATE108207T1 (de) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Polypeptide und dafür kodierende dna. |
| KR1019890001221A KR960016705B1 (ko) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | 신규폴리펩티드 및 그것을 코우드하는 dna |
| EP89301007A EP0327360B1 (en) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Novel polypeptides and DNA encoding said polypeptides |
| DE68916559T DE68916559T2 (de) | 1988-02-03 | 1989-02-02 | Polypeptide und dafür kodierende DNA. |
| US07/681,077 US5290917A (en) | 1988-02-03 | 1991-04-05 | Modified polypeptides of IL-1α |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63024613A JP2698976B2 (ja) | 1988-02-03 | 1988-02-03 | 新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01199998A JPH01199998A (ja) | 1989-08-11 |
| JP2698976B2 true JP2698976B2 (ja) | 1998-01-19 |
Family
ID=12142999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63024613A Expired - Lifetime JP2698976B2 (ja) | 1988-02-03 | 1988-02-03 | 新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0327360B1 (ja) |
| JP (1) | JP2698976B2 (ja) |
| KR (1) | KR960016705B1 (ja) |
| AT (1) | ATE108207T1 (ja) |
| DE (1) | DE68916559T2 (ja) |
| ES (1) | ES2059717T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2667601A1 (fr) * | 1990-10-05 | 1992-04-10 | Rhone Poulenc Sante | Polypeptides derives de l'interleukine-1 beta, procede de preparation et utilisation, notamment dans le cadre des pathologies osteoarticulaires. |
| US7176179B1 (en) | 1997-05-30 | 2007-02-13 | The Regents Of The University Of California | Selective induction of cell death by delivery of amino-terminal interleukin-1-α pro-piece polypeptide |
| US20030154504A1 (en) | 1998-06-24 | 2003-08-14 | Farese Robert V. | Methods and compositions for modulating carbohydrate metabolism |
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|---|---|---|---|---|
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| DE3683186D1 (de) * | 1985-04-25 | 1992-02-13 | Hoffmann La Roche | Rekombinantes humaninterleukin-1. |
| JP2591615B2 (ja) * | 1986-03-14 | 1997-03-19 | 大塚製薬株式会社 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
| US5008374A (en) * | 1986-03-14 | 1991-04-16 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1α derivatives and drugs |
| US5017692A (en) * | 1986-09-04 | 1991-05-21 | Schering Corporation | Truncated human interleukin-a alpha |
-
1988
- 1988-02-03 JP JP63024613A patent/JP2698976B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-02 EP EP89301007A patent/EP0327360B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-02 KR KR1019890001221A patent/KR960016705B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-02-02 DE DE68916559T patent/DE68916559T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-02 AT AT89301007T patent/ATE108207T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-02-02 ES ES89301007T patent/ES2059717T3/es not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0327360A3 (en) | 1990-05-02 |
| JPH01199998A (ja) | 1989-08-11 |
| DE68916559D1 (de) | 1994-08-11 |
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| ATE108207T1 (de) | 1994-07-15 |
| KR960016705B1 (ko) | 1996-12-20 |
| EP0327360B1 (en) | 1994-07-06 |
| KR890013177A (ko) | 1989-09-21 |
| EP0327360A2 (en) | 1989-08-09 |
| DE68916559T2 (de) | 1994-11-03 |
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