KR940005585B1

KR940005585B1 - 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR940005585B1
Application number: KR1019860011011A
Authority: KR
Inventors: 하베르만 폴; 뮐네르 후베르트
Original assignee: 훽스트 아크티엔게젤샤프트; 하인리히 벡커·베른하르트 벡
Priority date: 1985-12-21
Filing date: 1986-12-20
Publication date: 1994-06-21
Also published as: EP0228018B1; NO177270C; IE59779B1; ES2055686T3; EP0228018A3; HU202584B; AU601959B2; ATE71144T1; NO865191L; FI91168B; AU6268390A; KR870006188A; CA1341197C; HUT44615A; IL81020A0; NO177270B; ZA869557B; AU6675686A; DE3683267D1; PT83972A

Abstract

내용 없음.

Description

과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(GM-CSF)단백질의 제조방법

제1a도 및 그의 연속도면인 제1b, c도는 (Met-) CSF의 직접 발현용 벡터 pW 225의 제법이다. 다음의 도면들은 이후 "△L-2" 또는 "-IL-2"로 언급할 사람 인터루킨-2의 부분-서열로부터 유도되는 "밸러스트(ballast)" 단백질이 CSF 아미노산 서열의 앞인 N-종결 말단에 위치하고 있는 융합 단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.

제2a도 및 그의 연속도면인 제2b, c도는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 pW 216의 제법이며, 이로부터 산 절단에 의해 N-종결 말단에 아미노산 프롤린이 연장된 CSF 유도체를 수득한다.

제3도는 산 절단후 첫 번째 아미노산(알라닌)의 위치에 프롤린이 있는 CSF 유도체를 생성시키는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 pW 240의 합성을 나타낸다.

제4도는 산 절단후 첫 번째 아미노산(알라닌)이 결실된 CSF 유도체를 생성시키는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 pW 241의 제법이다.

제5도는 산 절단후 처음 5개의 아미노산이 제거된 CSF 유도체를 생성시키는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 pW 242의 제법이다.

제6도는 산 절단후 처음 7개의 아미노산이 결실된 CSF 유도체를 생성시키는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 pW 243의 제법이다.

제7도는 산 절단후 처음 11개의 아미노산이 제거된 CSF-유도체를 생성시키는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 pW 244의 제법이다.

제8a도 및 그의 연속도면인 제8b도는 벡터 pW 246의 합성을 나타낸다. 이것은 IL-2 부분-서열 뒤에 2개의 변형된 서열 "CSF"이 있는 단백질을 암호화한다. 산 절단결과 프롤린이 첫 번째 아미노산 프롤린의 앞 N-종결 말단에 위치하고, 마지막 아미노산이 아스파르트산으로 대치된 CSF 유도체를 생성한다.

제9도는 3개의 CSF서열이 IL-2 부분-서열을 뒤따르는 융합 단백질을 암호화하는 벡터 pW 247의 제법이다. 산 절단결과 제8도에서 수득된 특성화된 CSF 유도체를 생성 시킨다.

제10a도 및 그의 연속도면인 제10b도는 합성 CSF DNA 부분-서열을 함유하는 하이브리드 플라스미드 pS 200 내지 204의 제법이다. 플라스미드 pS 200은 별첨 Ⅰ에서와 같이 "합성 블록 Ⅰ(Synthesis block Ⅰ)"을 함유하고 플라스미드 pS 201은 별첨 Ⅱ의 "합성 블록 Ⅱ", 플라스미드 pS 202는 별첨 Ⅲ의 "합성 블록 Ⅲ", 플라스미드 pS 203은 전체 합성 유전자를 함유하며, pS 204는 전체 합성 CSF DNA 서열을 마찬가지로 함유하는 발현 플라스미드를 나타낸다. 발현 및 산 절단결과 제2도에 기술한 것과 동일한 CSF 유도체가 수득된다.

제11a도 및 그의 연속도면인 제11b도는 N-브로모 석신이마이드 절단후 각각 위치 13 및 122의 Trp가 His으로 대치된 CSF 유도체를 생성하는 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pS 207의 합성을 나타낸다.

제12도는 위치 100의 Ile이 Thr로 대치된 CSF 유도체의 제조를 가능케하는 합성 DNA 부분-서열이다.

제13a도 및 그의 연속도면인 제13b도는 시아노겐 브로마이드 절단후 모든 메티오닌 잔기가 중성 아미노산, 즉 위치 36에서는 Ile으로, 위치 46, 79 및 80에서는 Leu로 대치된 CSF 유도체를 생성시키는 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pS 210의 합성을 나타낸다.

제14도는 제13도의 합성 도식에 따라, 위치 36의 Met이 Ile으로 대치되고, 위치 46의 Met이 Leu으로 대치되며, 단일 Leu 잔기가 아미노산 79 및 80 대신 존재하는 CSF 유도체의 제조를 가능케하는 합성 DNA 서열이다.

제15도는 제13도의 합성 도식을 사용하여 위치 36의 Met가 Ile로 대치되고, 위치 46의 Met이 Leu로 대치되며, 위치 79 및 80의 두 아미노산이 결실되는 CSF 유도체의 제조를 가능케하는 합성 DNA이다.

사람 과립구 대식세포 콜로니-촉진 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor;GM-CSF)는 분자향 약 23,000달톤의 당단백질이다.

포유동물 세포에서의 당단백질의 발현 및 cDNA 서열이 이미 기술된 바 있다.[G.G.Wong et al.,Science 228(1985),810-815,D.Metcalf,Science 229(1985),16-22].

놀랍게도 세균에서 사람 GM-CSF 단백질(이후 "CSF"라 칭함)의 발현물이 생물학적 활성 생성물임이 현재 밝혀졌다. 따라서 본 발명은 의학적 치료 용도의 CSF 및 의약품 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세균, 특히 이 콜라이(E.coli)에서 발현시켜 CSF를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히 이 목적을 위해 자체 공지된 방법, 바람직하게는 합성에 의해 수득할 수 있는 공개된 cDNA 서열을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한 CSF 또는 CSF 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 적당한 배열("작동적으로 연결된")로 함유하는 세균, 특히 이 콜라이용 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 DNA 서열의 자체 공지된 변형에 의해 수득할 수 있는 CSF의 생물학적으로 활성인 유도체에 관한 것이다. 따라서, 예를 들면, CSF 단백질의 제거후 아미노산 서열에 C-말단 및 N-말단 변형물을 갖는 융합 단백질용 벡터의 작제시 절단부위를 혼입시킬 수 있다. 또한 본 발명은 의학적 치료시 이런 형태의 단백질의 용도 및 의약품 제조를 위한 이의 용도, 및 CSF 단백질과 이의 생물학적 활성 유도체를 함유하는 의약품, 특히 조혈 세포의 증식 촉진 및 과립구와 대식세포 형성 촉진용 의약품에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양태 및 이의 바람직한 양태가 하기에 상세히 설명되어 있으며 특허청구의 범위에 정의되어 있다.

본 발명은 또한 도면 제1도 내지 제15도에 의해 설명되고 있으며, 대부분 연속적 도식 형태인 각각은 동일한 번호의 실시예 방법을 설명한다.

이들 도면은 일정한 비율로 도식화되어 있지 않으며, 특히 폴리링커 (polylinkers) 영역에서는 규모가 "확대"되어 있다.

이들 도면 및 실시예에서 설명되는 가능한 변형들은 물론 본 발명에 따라 가능한 다수 변형의 단순한 실례에 불과하다. 따라서 그 자체가 공지된 방법으로 다른 단백질 서열, 특히 세균 단백질 서열을 융합 단백질의 "밸러스트" 부분으로 사용할 수 있으며, 융합 단백질의 연결 및 절단시 모든 통상의 방법을 사용할 수 있고, 분자에 또는 분자의 양 말단에 변형된 아미노산을 갖는 다른 CSF 유도체가 가능하다. IL-2 서열 및 합성 DNA 서열의 선택 및 융합 단백질의 절단은 따라서 그 자체가 공지된 방법으로 다양화할 수 있는 본 발명의 바람직한 태양으로서 단순히 조망되어져야 한다.

인터루킨-2를 암호화하는 DNA를 포함하는 "개환 판독 프레임"이 펩타이드 및 단백질의 발현을 보조하는데 특히 유리하며, 필수적으로 첫 번째 100개 아미노산에 상응하는 IL-2의 N-종결 부의가 특히 융합 단백질 제조시 적합함이 밝혀졌다.

이 방법으로 수득한 1차 생성물은 전부 또는 거의 진핵 단백질 서열로 이루어진 융합 단백질이다. 놀랍게도 이 단백질이 숙주에게 고유한 단백 효소에 의해 외래 단백질로 인식되지 않으며 즉시 분해되지도 않았다. 또다른 장점은 본 발명에 따른 융합 단백질이 난용성이거나 불용성이어서 원심분리에 의해 가용성 단백질로부터 적절하게 회수할 수 있다는 것이다.

본 발명에 따르면 융합 단백질 중 "밸러스트 단백질"의 기능은 생물학적으로 활성 분자인 IL-2 부분에 의존하지 않으며, 마찬가지로 IL-2 부분의 정확한 구조에 의해 좌우되지 않는다. 필수적으로 처음 100개의 N-종결 아미노산이 존재하면 이 목적은 충분하다.

따라서 예를 들면 목적하는 단백질이 N-종결부에 위치하는 경우 융합 단백질의 절단을 가능케하는 N-종결 말단 변형을 수행할 수 있다. 반대로 C-종결 말단에서의 변형을 수행하여 목적 단백질의 제거를 가능 또는 용이하게 할 수 있다.

사람 IL-2를 암호화하는 천연 DNA 서열이 유럽 특허원(이후 "EP-A")공고 제 0,091,539호에 기술되어 있다. 인용문헌에는 또는 마우스 및 래트 IL-2도 있다. 이들 포유동물 DNA를 본 발명에 따른 단백질 합성시 사용할 수 있다. 그러나 합성 DNA, 특히 유리하게는 독일연방공화국 공개공보 제 3,419,995호 및 Ep-A 0,163,249에 기술된 사람 IL-2의 DNA로 시작하는 것이 더 적합하다.

이 합성 DNA는, 코돈의 선택에 있어, 가장 빈번하게 사용되는 숙주인 이 콜라이에서의 환경에 적합할 뿐아니라, 또한 개시부 및 100번째 삼중자(triplet) 영역에 다수의 제한 엔도뉴클레아제 절단부위를 함유함으로써, 본 발명에 따라 이들을 사용하는 것이 가능하다. 그러나 이는, 그들 사이에 있는 영역에서 수행되는 DNA에 대한 변형을 배제하지 않으므로 다른 절단 부위를 사용할 수 있다.

뉴클레아제 BanⅡ, SacⅠ 또는 SstⅠ을 사용하면 수득한 IL-2 부분-서열은 약 95개 아미노산을 암호화한다. 일반적으로, 이 길이는 불용성 융합 단백질을 수득하는데 충분하다.

가용성의 결여가, 예를 들어 바람직한 친수성 CSF 유도체인 경우에 있어 여전히 부적합하나-가능한한 작은 "밸런스트"를 생성하기 위해-C-종결 말단 가까이 위치한 절단 부위를 사용하기를 원치않을 경우, DNA 서열을 적당한 어댑터(adapter) 또는 링커로 N-종결 및/또는 C-종결 말단에서 연장함으로써 "밸러스트" 부위를 필요한 만큼 짜맞출(tailored) 수 있다.

물론-다소-말단까지의 DNA 서열을 사용하여 "부산물"로서-적합하게는 변형된-생물학적 활성 IL-2를 생성시킬 수도 있다.

따라서 본 발명은 하기 일반식(Ia) 또는 (Ib)의 융합 단백질에 관한 것이다.

Met-X-Y-Z (Ia)

Met-Z-Y-X (Ib)

상기식에서, X는 바람직하게는 사람 IL-2의 처음 약 100개의 아미노산 서열을 나타내고, Y는 목적 단백질에 인접한 아미노산 또는 아미노산 서열이 목적 단백질을 절단해 낼 수 있도록 하는 경우 직접 결합을 나타내고, 그밖에는, 유전적으로 암호화할 수 있는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진, 절단을 허용하는 가교원(bridge member)을 나타내며 : Z는 목적하는 CSF 단백질을 나타내는 유전적으로 암호화할 수 있는 아미노산 서열이다.

일반식(Ia) 및 (Ib) 및 상술한 바에서 입증된 바와 같이 IL-2부분의 전 또는 후에서 목적 단백질을 발현시키는 것이 효과적일 수 있다.

간결히 하기 위해 이후 융합 단백질의 제조를 위한 통상의 방법에 상응하는 두 번째 내용을 설명할 것이다.

따라서 비록 이 "표준적" 변법이 상기 및 하기에 기술될 지라도, 이것은 다른 변형을 제외시키고자 하는 것이 아니다.

융합 단백질의 절단은 자체가 공지된 방법에 의해 화학적 또는 효소학적으로 수행할 수 있다.

적당한 방법의 선정은 특히 목적 단백질의 아미노산 서열에 따른다.

합성된 특정 CSF 유도체가 Trp 또는 Met 같은 아미노산을 함유하지 않는 경우 만일 가교원 Y의 카복실 종결 말단에 트립토판 또는 메티오닌이 있거나, Y가 Trp 또는 Met을 나타내면, N-브로모석신이마이드 또는 시아노겐 할라이드로 화학적 절단을 수행할 수 있다.

아미노산 서열 중에 Asp-Pro을 함유하고 산에 충분히 안정한 CSF 및 이의 유도체들은 이미 상술한 바와 같이 자체 공지된 방법으로 단백질 분해 절단할 수 있다.

이로써 N-말단에 프롤린을 또는 C-말단에 아스파르트산을 함유하는 단백질이 수득된다. 따라서 이 방법으로 또한 변형된 단백질을 합성하는 것이 가능하다.

Asp-Pro 결합은 이 가교원이 (Asp)n-Pro 또는 Glu-(Asp)n-Pro이고 n이 1내지 3을 나타내는 경우 산에 더 불안정하다.

효소 절단의 실례가 역시 공지되어 있으며, 증진된 특이성을 갖는 변형된 효소를 사용할 수도 있다[참조:C.S.Craik et al.,Science 228(1985) 291-297].

융합 단백질은 세균 발현 시스템에서 그 자체가 공지된 방법에 의해 발현시킴으로써 수득한다. 이 목적에는 모든 공지의 숙주-벡터 시스템, 예를 들면 여러 가지 스트렙토마이세스, 비.섭틸리스(B.subtilis), 살모넬라 타이피머리엄(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens), 특히 이.콜라이와 같은 세균이 적합하다.

목적 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 선택된 발현 시스템에서 발현이 양호한 벡터에 공지의 방법으로 혼입된다.

이를 위해 trp, Lac, tac, λ파지의 P_L또는 P_R, hsp, omp 또는 독일연방공화국 공개공보 제3,430,683호 또는 EP-A 0,173,149에서 제안한 합성 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 프로모터 및 오퍼레이터를 선택하는 것이 적합하다. tac 프로모터-오퍼레이터 서열이 유리하며, 이 서열은 현재 상업적으로 시판된다[예를 들면 발현 벡터 pKK 223-3,Pharmacia,"Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology",1984,p.63].

본 발명에 따른 융합 단백질의 발현시 mRNA 수준에서 염기가 짝짓는 것을 방지하기 위해 ATG 개시코돈 다음에 처음 몇몇 아미노산에 대한 각각의 삼중자를 변형시킴이 적합하다고 입증되었다. 각 아미노산의 결실 또는 첨가와 같은 이런 유형의 변형은 전문가에게 숙지되어 있으며 본 발명은 또한 이들에 관한 것이다.

특히 유리한 CSF 유도체 N-말단 프롤린을 함유하는 것인데, 이런 유형의 단백질은 단백 효소의 공격에 더욱 안정하기 때문이다.

N-종결 말단에 프롤린이 가해진 전체 CSF 아미노산 서열을 갖는 CSF 유도체가 특히 바람직하다. 그러나 놀랍게도 처음 11개의 아미노산을 제거해서 수득한 CSF 분자의 변이체가 생물학적으로 활성임이 밝혀졌다.

또한 유리한 본 발명의 변이체는 CSF 서열을 하나 이상, 유리하게는 2배 또는 3배 함유하는 융합 단백질을 초기에 생성시키는 것들이다. 그들의 특성에 의해 이들 융합 단백질 중 밸러스트 부부은 감소되며, 따라서 목적 단백질의 수율은 증가한다.

CSF cDNA 서열이 pBR 322의 PstⅠ 절단부위에 혼입된 플라스미드 pHG 23이 이.콜라이에 포함되어 ATCC(American Type Culture Collection)에 ATCC 39900으로 기탁되어 있다.

이 DNA 서열은 제3b도(Wong et al.)에 기술된 변이체와 상응한다.

5′말단 가까이의 PstⅠ절단부위 및, 한편 GC 테일링(tailing)에 의해 3' 말단에 유도한 PstⅠ부위를 이용하여 삽입하였다.

[실시예 1 : CSF의 직접 발현]

상업적으로 시판되는 벡터 pUC 12"를 제한효소 Sma Ⅰ및 Pst Ⅰ으로 개환하고, 대형 단편(1)을 분리한다.

CSF의 cDNA 서열을 효소 Sfa NⅠ 및 PstⅠ으로 절단하여 단편(2)를 수득하고, 합성 링커(3) 및 이어서 pUC 12 단편(1)을 연결시킨다.

수득한 하이브리드 플라스미드 pW 201(4)는 출발 코돈 ATG 다음에 CSF DNA 서열을 함유한다.

하이브리드 플라스미드(4)를 NcoⅠ으로 개환하고, 돌출 말단을 충진시켜 평활 말단 단편(5)을 수득한다.

벡터 pUC 12를 효소 EcoRI으로 개환하고, 돌출 말단을 충진시킨다. 이어서 소의 알칼리 포스파타제를 처리하여 pUC 12 유도체(6)을 수득한다. 단편(5) 및 (6)을 연결하면 두 배향으로 삽입된 CSF DNA 서열을 함유하는 벡터가 생성된다. pW 203(7)이라 명명한다.

벡터(7)에 EcoRⅠ 및 RsaⅠ을 사용하여 CSF 아미노산 63 내지 127의 코돈을 함유하는 단편(8)을 분리한다. 한편 벡터(4)를 NcoⅠ 및 RsaⅠ으로 절단하여 CSF 아미노산 1 내지 61의 코돈을 함유하는 단편(9)을 분리한다.

플라스미드 pH 131/5(독일연방공화국 공개공보 제 3,514,113호 또는 EP-A 0,198,415, 실시예 1,제1도)(10)을 PvuⅡ로 절단하고, 작은 단편을 제거하며, 큰 단편을 연결하여 플라스미드 pPH 160(11)을 수득한다.

이것은 pH 131/5보다 이.콜라이에서 높은 복사수로 존재한다. 플라스미드(11)을 NciⅠ 및 EcorⅠ으로 개환하고 큰 단편(12)을 분리한다. 단편 (8),(9) 및 (12)을 연결하여 하이브리드 플라스미드 pW 206(13)을 수득한다. 이것은 아미노산 62에 대한 코돈을 보유한다. 단편(8), (9) 및 (12)을 연결하여 하이브리드 플라스미드 pW 206(13)을 수득한다. 이것은 아미노산 62에 대한 코돈을 보유한다.

상업적으로 시판되는 플라스미드 pKK 65-10(PL Biochemical Inc.)을 EcoRⅠ으로 절단하고 2개의 터미네이터 T1 및 T2를 함유하는 단편 (14)를 분리한다.

이 단편을 EcoRⅠ으로 개환한 플라스미드(13)에 삽입하여 플라스미드 pW 225(15)를 수득한다.

플라스미드(15)를 함유하는 이.콜라이 24 세균을 앰피실린 30 내지 50㎍/m1 함유하는 LB 배지(J.H.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,1972)에 37℃로 밤새 배양한다. 배양물을 카사미노산 200㎛/ℓ 및 티아민 1㎍/ℓ 함유하는 M9 배지(J.H.Miller, 상기 인용)로 1:100 비율 희석하고, 혼합물을 연속 교반하면서 37℃로 배양한다. OD₆₀₀=0.5 또는 1에서 인돌릴-3-아크릴산을 최종농도 15㎍/1로 가하고, 혼합물을 각각 2 내지 3시간 또는 16시간 배양한다. 세균을 원심분리기로 회수한다.

세균을 완충 혼합물(7M) 우레아, 0.1% SDS 0.1M 인산나트륨, pH7.0)중에서 5분동안 비등시키고, 샘플을 SDS 겔 전기영동 플레이트에 적용한다. trp 오페론이 유도된 세포의 단백질 패턴이 약 14,000-18,000달톤 범위의 새로운 단백질을 함유함을 발견하였는데, 이는 비유도한 세포에서는 발견되지 않는다.

상술한 유도 조건을 진탕 배양물에 적용한다 ; 대형 발효시에는 적당히 변형된 OD 값 및, 경우에 따라 유도물질 농도를 약간 변화시키는 것이 유리하다.

[실시예 2 : PRO^o-CSF]

벡터 pUC 12를 EcoR I 및 Pst I 으로 개환하고, 큰 단편(16)를 분리한다.

이 단편(16)을 합성 DNA 단편(17) 및 단편(2) (실시예 1:제i도)와 연결한다. 이 콜라이 JM 103의 캄피턴트(competent)세포를 연결 혼합물로 형질전환시키고 플라스미드 pW 212(18)을 함유하는 목적 클론을 선별한다.

CSF 서열을 함유하는 단편(19)를 Pvu I 및 Pst I을 사용하여 플라스미드 DNA로부터 절단해낸다. Lac 엑제인자[P.J.Farabaugh, Nature 274(1978) 765-769]를 pUC 8 폴리링커 함유 플라스미드 pKK 177-3[Amann et al,Gene 25(1983)167;EP-A 0,133,282]에 삽입하여 플라스미드 pJF 118(20)을 수득한다(제2a도;독일연방공화국 특허원 제 p 35 26 995.2호,실시예 6,제6도 참조). 후자를 Ava I 에 독특한 제한 부위에서 개환하고, 그 자체가 공지된 방법에 의해 엑소뉴클레아제 처리로 크기 약 1,000bp를 감소 시킨다.

연결 결과 플라스미드 pEW 1000(21)이 수득되며, 여기에서 Lac 억제인자 유전자는 완전히 보유되나 크기의 감소로 인해 초기 플라스미드보다 현저히 높은 복사수로 존재하게 된다.

플라스미드 pKK177-3 대신에 상술한 상업적으로 시판되는 플라스미드 pKK-223-3으로부터 시작해서 Lac 억제 인자를 혼입하고 유사하게 생성된 생성물을 단축시키는 것도 가능하다.

플라스미드 pEW 1000(21)을 제한효소 EcoR I 및 Sal I 으로 개환하고 단편(22)를 분리한다. 독일연방공화국 공개공보 제 3,419,995호(EP-A 0,163,249) 실시예 4(제5도)에 기술된 바와 같이 제조한 플라스미드 p 159/6(23)을 제한효소 EcoR I 및 Sal I 으로 개환하고, IL-2 서열을 함유하는 작은 단편(24)을 분리한다.

단편(22) 및 (24)를 연결시켜 하이브리드 플라스미드 pEW 1001(25)를 수득한다. 한편 플라스미드(25)를 EcoR I 및 Pvu I 으로 개환하여 IL-2 서열의 가장 큰 부분을 함유하는 단편(26)을 수득한다. 이 부분 - 서열이 도면에서 "△IL2"로 표시되어 있다.

한편 플라스미드(25)를 EcoR I 및 Pst I 로 개환하고 큰 단편(27)을 분리한다.

단편(19), (26) 및 (27)을 연결시키고, 캄피턴트 이.콜라이 294 세포를 형질전환시키며, 선별하여 플라스미드 pW 216(28)을 함유하는 클론을 수득한다. 이 플라스미드 DNA는 제한 분석 및 DNA는 제한 분석 및 DNA 서열 분석으로 특성화한다.

플라스미드(28)를 함유하는 이.콜라이 세포의 밤새 배양물을 앰피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 배지(J.H. Miller, 상기 인용)로 약 1 : 100 비율로 희석하며, 생장 상태를 OD로 측정한다. OD =0.5에서 배양물을 이소프로필 β-갈락토피라노시드(IPTG) 중에서 1mM로 조정하고 150 내지 180분 후 원심분리하여 세균을 회수한다. 세균을 완충 혼합물(7M 우레아,0.1% SDS,0.1M 인산나트륨,pH 7.0)에서 5분 동안 비등시키고, 샘플을 SDS 겔 전기영동 플레이트에 적용한다. 전기영동에 이어서 예기된 융합 단백질의 크기에 해당하는 단백질 밴드를 플라스미드(28) 함유 세균으로부터 수득한다. 세균의 파괴(French press:

Dyno mill) 및 원심분리 후, 융합 단백질은 침전물에 위치하게 되어 상등액과 함께 이미 상당량의 다른 단백질을 제거할 수 있다. 융합 단백질의 분리에 이어 산절단으로 부가적 N-말단 프롤린을 함유하는 예기된 CSF 유도체를 유리시킨다. 이것은 생물학적 시험에서 활성을 나타낸다.

상술한 유도조건을 진탕 배양에 적용한다; 대형 발효시 적당히 변형된 OD 값 및 경우에 따라 약간 수정된 IPTG 농도가 유리한다.

[실시예 3: Pro¹-CSF(2-127)

단편(2)(제1도) 및 (16)(제2도)를 합성 DNA 서열(29)로 연결하여 합성 DNA 서열과는 별개로 플라스미드(18)에 상응하는 하이브리드 플라스미드(30)을 수득한다.

Pvu I 및 Pst I을 사용하여 플라스미드(30)으로부터 단편(31)을 절단하는데, 이 단편 (31)은 CSF DNA 서열을 함유하나 첫 번째 아미노산의 코돈이 프롤린 코돈으로 대치되어 있다. 단편(31)을 단편(26) 및 (27)과 연결하여 하이브리드 플라스미드 pW 240(32)을 수득한다. 실시예 2와 같이 이.콜라이에서 발현시켜 첫 번째 아미노산이 프롤린으로 대치된 CSF 유도체를 수득한다.

이 유도체로 생물학적 활성을 갖고 있다.

[실시예 4 : CSF(2-127)]

CSF DNA 서열 및 그의 3'말단에 Pst I 제한부위를 함유하는 플라스미드, 예를 들면 플라스미드 pHG23(ATCC 39900)을 Sfa NI로 절단하고, 선형화된 플라스미드(34)를 클레나우 폴리머라제 및 GTP를 사용하여 부분적으로 충진시킨다. 돌출한 뉴클레오타이드 A를 SI 뉴클레아제를 사용하여 제거하고 이어서 단편 (35)를 Pst I 으로 절단한다.

단편(35)를 합성 DNA 서열(36) 및 단편(16) (제2도)와 연결하여 플라스미드(18)과 유사한 플라스미드(37)을 수득한다.

Pvu I 및 Pst I을 사용하여 플라스미드(37)로 부터 단편(38)을 절단해낸다.

이 단편을 단편(26) 및 (27)과 연결하여 플라스미드 pW 241(39)를 수득한다.

실시예 2에서와 같이 발현시켜 융합 단백질을 수득하고 산 절단후 첫 번째 아미노산이 결여된 CSF 유도체를 제공한다. 이 유도체는 생물학적으로 활성이다.

[실시예 5 : CSF(6-127)]

플라스미드(33)(또는 CSF DNA 서열을 함유하는 상응하는 플라스미드)을 우선 Pst I 으로 완전히 절단한 후 , 이어서 BstN I 으로 부분절단하여 단편 (40)을 분리한다.

합성 DNA 서열(41) 및 (36)(제 4도)을 먼저 연결시켜 서열(42)를 수득하고, 후자를 다시 단편(40) 및 단편(16) (제 2도)와 연결시켜 플라스미드 pW 212(43)을 수득한다.

Pvu I 및 Pst I을 사용하여 플라스미드 (43) 으로부터 CSF 유도체의 DNA 서열을 함유하는 단편(44)를 분리한다.

이 단편(44)를 단편(26) 및 (27)과 연결하여 하이브리드 플라스미드 pW 242(45)를 수득한다.

실시예 2와 같이 발현시켜 융합 단백질을 수득하고, 산 분해후 처음 5개 아미노산이 결여된 CSF 유도체를 수득한다. 이 생성물도 생물학적으로 활성이 있다.

[실시예 6 : CSF(8-127)]

우선 합성 DNA 서열(36) (제4도)을 합성 DNA 서열 (46)과 연결시키고, 그 결과 생성된 DNA 단편(47)을 단편(40) 및 (16)과 연결시켜 하이브리드 플라스미드(48)을 수득한다. Pvu I 및 Pst I 을 사용하여 후자로부터 CSF 유도체의 DNA 서열을 함유하는 단편(49)을 절단해낸다. 단편 (49), (26) 및 (27)을 연결시켜, CSF 유도체의 단축된 DNA 서열과는 별개로 플라스미드(45)에 상응하는 하이브리드 플라스미드 pW243(50) 수득한다.

실시예 2와 같이 발현시켜 융합 단백질을 수득하고, 산 분해하여 처음 7개 아미노산이 결여된 CSF 유도체를 제공한다. 이 유도체는 생물학적으로 활성적이다.

[실시예 7 : CSF(12-127)]

합성 DNA 서열(51)을 단편(33) 및 (16)과 연결하여 하이브리드 플라스미드(52)를 수득한다. Pvu I 및 Pst I 을 사용하여 후자로부터 CSF 유도체의 DNA 서열을 함유하는 서열(53)을 절단해내고 이 단편을 단편 (26) 및 (27) 과 연결하여 단축된 CSF 서열과는 별개로 플라스미드(45)에 상응하는 하이브리드 플라스미드 pW 244(54)를 수득한다.

실시예 2와 같이 발현시켜 융합 단백질을 산출하고, 산 분해하여 아미노산 1에서 11이 제거된 CSF 유도체를 수득한다.

이 단축 분자도 생물학적으로 활성이 있다.

[실시예 8 : Pro^o-CSF(1-126)-Asp]

DNA 서열(19)(제 2도)를 BstN I 로 부분절단하고, CSF 서열의 가장 큰 부분을 함유하는 단편(55)를 분리한다.

플라스미드(33)(제 4도) (또는 CSF DNA 서열을 함유하는 상응하는 플라스미드)을 우선 Pst I 으로 절단 하고 이어서 BstN I 으로 부분절단하여 CSF 서열의 가장 큰 부분을 함유하는 DNA 서열(56)을 수득한다.

DNA 서열(57)을 서열(56)과 함께 합성하여 C-종결 글루탐산이 아스파르트산으로 대치된 CSF 유도체를 암호화하는 DNA 서열을 제공한다.

벡터 pUC 13을 Pst I 및 Sma I 으로 개환하여 큰 단편(58)을 분리한다.

이 선형 플라스마드(58)을 단편(56) 및 (57)과 연결시켜 변형된 C-말단 서열을 갖는 하이브리드 플라스미드 pW245(59)를 수득한다.

Sfan I 및 Pst I을 사용하여 플라스미드(59)로부터 변형된 CSF DNA 서열을 함유하는 단편(60)을 절단해 낸다. 이 단편 (60)을 합성 DNA 서열(61) 및 단편(55)와 연결하여 DNA 서열 (62)를 수득한다. 후자를 DNA 단편(26) 및 (27)(제 2도)과 연결하여 하이브리드 플라스미드 pW 246(63)을 수득한다. 이 플라스미드가 제8a도에 2번 나타나있는데, 아래 것은 암호화된 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

실시예 2와 같이 발현시켜 융합 단백질을 수득하고, 산 분해하여 N-말단 프롤린에 의해 연장되고, 부가적으로 최종 아미노산이 아스파르트산으로 대치된 CSF 유도체를 유도한다. 이 유도체는 생물학적으로 활성이다.

[실시예 9: Pro^o-CSF(1-126)-Asp]

하이브리드 플라스미드(63) (제8도)를 EcoR I 및 Pst I으로 절단하고, IL-2 부분-서열에 이어 2개의 변형된 CSF 서열을 함유하는 단편을 분리한다. 이 서열(64)를 Rsa I 으로 부분 절단하고 2개의 단편(65) 및 (66)을 분리한다. 단편 (66)을 BstN I 으로 절단하고 단편(67)을 분리한다. DNA 서열(27), (65), (67), (61) 및 (60)을 연결하여 연결 서열이 특이한 서열로 배열된 하이브리드 플라스미드 pW 247(68)을 수득한다.

실시예 2와 같이 발현시켜 융합 단백질을 수득하고, 산 분해하여 실시예 8과 동일한 CSF 유도체를 수득한다.

[실시예 10 : 합성 유전자(Pro^o-CSF에 대한)]

그 자체가 알려진 방법, 예를 들면 아인산염 방법(독일연방공화국 공개공보 제3,327,007호, 제3,328,793호, 제3,409,966호, 제3,414,831호 및 제3,419,995호)를 사용하여 도면에서(69)로 표기된 "합성 블럭" I(CSF-I), 도면에서(70) 으로 표기된 II(CSF-II) 및 도면에서 (71)로 표기된 III(CSF-III) 3가지를 합성한다. 합성 올리고뉴클레오타이드 I_a내지 I_m,II_a내지 II_f및 III_a내지 III₁은 이들 합성 블록의 뉴클레오타이드 서열 중 지적된다(별첨).

합성 유전자에 대한 뉴클레오타이드의 선택은 3가지 합성 블록의 합체점에 독특한 절단부위 뿐 아니라 유전자 단편내의 다수의 독특한 제한부위를 전제조건으로 수반한다. 이들이 하기 표에 정리되어 있다. 이들의 독특한 제한부위는 그 자체 공지된 방법을 사용하여 아미노산 코돈을 교환, 첨가 또는 결실시킬 수 있다.

3가지 합성 블록을 우선 각각 클론화 하여 이.콜라이에서 증폭시키고 다시 분리한다;

합성 블럭 CSF-I(69)를 pUC 12유도체(16)에 혼입하여 플라스미드 pS 200(72)을 수득한다,

pUC 12를 제한효소 Pst I 및 HindⅢ로 개환 하고 선형 플라스미드(73)을 합성 블록 CSF-Ⅱ(70)과 연결하여 플라스미드 pS 201(74)를 수득한다.

pUC 13을 HindⅢ 및 Sma Ⅰ으로 개환하고, 선형 플라스미드(75)를 CSF-Ⅲ(71)과 연결하여 플라스미드 pS 202(76)를 수득한다.

재-분리된 합성 블록(69),(70)및 (71)은 EcoR I 및 SmaI 으로 선형화한 벡터 pYC 12(77)에 연결하여 플라스미드 pS 203(78)을 수득한다. 이 하이브리드 플라스미드를 -각 합성 블록을 함유하는 플라스미드와 같이 -이.콜라이 79/02에서 증폭시키고 , 합성유전자의 특성을 제한 분석 및 서열분석으로 확인한다.

플라스미드(78)을 Pvu I으로 부분적 절단 및 BamH I으로 절단하고 완전한 CSF 서열을 함유하는 작은 단편(79)을 분리한다.

발현 플라스미드(21)를 EcoR I 및 BamH I으로 개환하고 큰 단편(80)을 분리한다. 이 단편을 IL-2부분-서열 및 합성 유전자(79)를 함유하는 단편(26)과 연결한다. 이 결합 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 pS 204(81)을 수득하며 여기에서 IL-2부분 서열 다음에 산 절단을 가능하게 하는 가교원 및 이어서 CSF 아미노산 서열이 뒤따른다. 따라서 산 절단은 N-종결 말단에 프롤린이 연장된 CSF 유도체를 생성한다.

[실시예 11 : CSF(1-12) His(14-121) His(123-127)]

합성 블록 I에서 제48번(Hpa I절단부위)까지의 뉴클레오타이드를 합성 서열(82) 및 (83)으로 대치하면, 이 결과 첫 번째 아미노산(Ala)앞에 Trp가 있고 위치 13의 Trp가 His로 대치된 CSF I 동족체를 암호화하는 변형된 합성블럭 I이 수득된다.

플라스미드(72)(제10도)를 EcoR I 및 Hpa I으로개환하고 큰 단편(84)을 분리한다. 후자를 합성 단편(82)및(83)과 연결시켜 이 변형된 CSF I(CSF I')을 암호화하는 플라스미드pS 205(85)를 수득한다.

플라스미드(76)(제10도)을 HindⅢ 및 Sal I으로 개환하고 , 작은 단편(86) 및 큰 단편(87)을 분리한다.

작은 단편(86)을 Taq I으로 단편(88)을 분리한다.

큰 단편(87)을 (88) 및 위치 122의 Trp 코돈을 His로 대치한 합성 단편(89)와 연결시켜 변형된 CSFⅢ(CSFⅢ')를 암호화 하는 플라스미드 pS 206(90)을 수득한다. 이 플라스미드를 이.콜라이에 형질전환하고 증폭시키며 재-분리하고 HindⅢ 및 Sal I으로 절단하여 CSFⅢ'을 암호화하는 작은 단편(91)을 분리한다.

플라스미드(85)를 Pvu I으로 부분절단 및 Pst I으로 절단하고 ,CSF I'을 암호화하는 작은 단편(92)를 분리한다.

단편(22), (26), (92), (70) 및 (91)을 연결하여 플라스미드 pS 207(93)을 수득한다. 이것은 IL-2부분 서열에 이어 CSF의 첫 번째 아미노산(Ala) 바로 앞에 Trp을 함유하는 가교원이 뒤따르는 융합 단백질을 암호화한다. CSF 분자의 위치 13 및 122에 있는 Trp가 His으로 대치되었기 때문에 N-브로모 석신이마이드로 융합 단맥질을 절단하는 것이 가능하다. 이 결과 두 군데에서 트립토판이 히스티딘으로 대치된 CSF 유도체가 수득된다.

[실시예 12 : CSF(1-99) Thr(101-127)]

합성블럭 Ⅲ 합성시 올리고 뉴클레오타이드 Ⅲ_e및 Ⅲ_f를 합성서열 (94)로 대치 하고 실시예 10과 같이 제조하여 위치 100의 Ile이 Thr로 대치된 CSF 유도체를 수득한다.

[실시예 13 : CSF(1-35) Ile(37-45) Leu(47-78) Leu-Leu(81-127)]

위치 36에 Met 대신 Ile 코돈을 함유하는 올리고뉴클레오타이드(95) 및 위치 46의 Met 코돈이 Leu코돈으로 대치된 올리고뉴클레오타이드(96)을 합성한다.

플라스미드(72)(제10도)를 Pvu I 및 XmaⅢ로 개환하고 단편(97)을 분리한다.

또한 Met 코돈이 첫 번째 아미노산 코돈 앞에 있는 서열(98)을 합성하다.

단편(16), (98), (97) 및 (96)을 연결해서 플라스미드 pS 208(99)을 수득한다. 이것이 플라스미드(72)에 상응하나 CSF I서열의 위치 0에 Met 코돈, 위치 36에 Ile 코돈 및 위치 46에 Leu 코돈을 함유한다.

더불어, 위치 79 및 80에 Met 대신 Leu을 암호화하는 서열(100)을 합성한다.

플라스미드(76)(제10도)를 HindⅢ 및 Nhe I으로 개환하여 큰 단편(101)을 분리하여 합성서열(1000과 연결하여 , CSF Ⅲ서열에서 위치 79 및 80에 있는 두 개 코돈의 대치는 별개로 하고 플라스미드(76)과 상응하는 플라스미드 pS209(102)를 수득한다.

플라스미드(93)(제11a도)을 Pvu I 및 Sal I으로 부분 절단하고 큰 단편(103)을 분리한다. 플라스미드(99)를 역시 Pvu I 및 Pst I으로 부분 개환하고 변형된 CSF I서열을 함유하는 작은 단편(104)을 분리한다. 또한 플라스미드(102)를 HindⅢ 및 Sal I으로 개환하고 변형된 CSFⅢ서열을 포함하는 작은 단편(105)을 분리한다. 단편(103),(104),(70) 및 (105)를 연결하여 플라스미드(93)(제11a도)에 상응하나 위치0에 Met이 있고 한편 4개의 Met 잔기가 다른 아미노산으로 대치된 CSF 유도체를 암호화하는 플라스미드 pS 210(106)을 수득한다.

이.콜라이를 플라스미드(106)으로 형질전환하고, 유도한 다음 융합 단백질을 수득하여 시아노겐 할라이드로 절단하여 위치 36에 Ile 및 위치 46,79 및 80에 Leu를 함유하는 CSF 유도체를 수득한다.

[실시예 14 : CSF(1-35) Ile(37-45) Leu(47-78) Leu(81-127)]

실시예 13과 같이 수행하나 합성서열(100) 대신에 합성 서열(107)을 사용하여 위치 36에 Ile 및 위치 46에 Leu, 그리고 아미노산 Leu가 아미노산79 및 80대신에 존재하는 결실 생성물을 수득한다.

[실시예 15 : CSF(1-35) Ile(37-45) Leu(47-78)-(81-127)]

실시예 13에서와 같이 수행하나 합성 서열(100) 대신에 합성서열(108)을 사용하여 위치 36에 Ile 및 위치 46에 Leu 및 위치 79 및 80의 아미노산이 결실된 결실생성물을 수득한다

별첨

Claims

CSF 암호화 유전자르 세균성 발현 벡터에 혼입하고 세균을 상기 벡터로 형질전환시키며 발현을 유도함을 특징으로 하여 사람 과립구 대식세포 콜로니-촉진인자 단백질(CSF)을 제조하는 방법.
제1항에 있어서 세균이 이.콜라이(E.coli)인 방법.
제1 또는 2항에 있어서 CSF를 융합 단백질 형태로 발현시키고 이어서 효소적으로 또는 화학적으로 절단하는 방법.
제3항에 있어서 융합 단백질이 CSF에 인접한 N-종결부에 아미노산 서열(Glu)m-(Asp)n-Pro[여기서 ,m은 0또는 1이고, n은 1,2또는 3이다]을 함유하여 이를 단백 분해적으로 절단하는 방법.