JP2575367B2 - Ｇｍ−ｃｓｆタンパク質、その誘導体、このタイプのタンパク質の調製及びそれらの用途 - Google Patents

Ｇｍ−ｃｓｆタンパク質、その誘導体、このタイプのタンパク質の調製及びそれらの用途

Info

Publication number
JP2575367B2
JP2575367B2 JP61306186A JP30618686A JP2575367B2 JP 2575367 B2 JP2575367 B2 JP 2575367B2 JP 61306186 A JP61306186 A JP 61306186A JP 30618686 A JP30618686 A JP 30618686A JP 2575367 B2 JP2575367 B2 JP 2575367B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
csf
sequence
plasmid
amino acid
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61306186A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62164695A (ja
Inventor
パウル、ハーベルマン
フーベルト、ミュルナー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Publication of JPS62164695A publication Critical patent/JPS62164695A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2575367B2 publication Critical patent/JP2575367B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト顆粒球（granulocyte）マクロファージコロニー
刺激因子（GM-CSF）は分子量約23,000ドルトンの糖タン
パク質である。哺乳類細胞におけるcDNA配列及び糖タン
パク質の発現については既に開示がなされている〔G.G.
Wong et al.,Science 228 （1985）,810-815。D.Metcal
f,Science,229（1985）,16-22）〕。
以下、“CSF"と称されるヒトGM-CSFタンパク質を細菌
中で発現させると、生物学的に活性な産物となること
が、驚くべきことに今ここに見出されたのである。この
ように、本発明は、医学的治療に使用するためのCSF及
び薬剤の製造としての用途に関する。
本発明は更に、細菌、特に大腸菌中での発現によるCS
Fの産生法に関する。特に、自体公知の方法、好ましく
は合成、により得ることが可能な公表済のcDNA配列をこ
の目的のために使用することができる。
本発明は、更に、CSF又はCSF融合タンパク質をコード
するDNAを（“作働可能に結合せしめられた”）適切な
配置で有する、細菌、特に大腸菌、中において使用する
ための発現ベクターにも関する。
本発明は、更に、自体公知のDNA配列の修正によって
得ることができるCSFの生物学的に活性な誘導体に関す
る。したがって、例えばCSFタンパク質の除去後にＣ末
端及びＮ末端の修正アミノ酸配列が残存するような融合
タンパク質に関して、そのベクターの構造中に切断部位
を組込むことが可能である。しかも、本発明は、医学的
治療におけるこのタイプのタンパク質の用途、薬剤の製
造用としてのそれらの用途、並びに、CSFタンパク質及
びその生物学的活性誘導体を含有した薬剤、特に造血細
胞の増殖刺激かつ顆粒球及びマクロファージの形成促進
の薬剤に関する。
本発明の他の側面及びその好ましい態様については、
以下で詳細に説明されており、しかも特許請求の範囲に
おいて明確化されている。
本発明は更に第１図〜第15図によって説明されるが、
各々の図は大部分が経路図として同一番号の例のプロセ
スについて説明している。これらの図は縮尺通りではな
く、特にポリリンカー領域において尺度が“拡大”され
ている。
これらの図及び例において説明される可能な変形例
は、勿論、本発明によれば可能な多数の改変例のうちの
単なる例示にしかすぎない。したがって、自体公知の方
法により融合タンパク質の“バラスト”部分として他の
タンパク質配列、特に細菌性タンパク質配列を使用する
こともでき、融合タンパク質の結合及び切断のためにあ
らゆる慣用的方法を利用することもでき、分子中に又は
分子の両末端に修正アミノ配列を有する他のCSF誘導体
を得ることもできる。IL-2配列、合成DNA配列の選択及
び融合タンパク質の切断は、自体公知の方法により変更
可能な本発明の好ましい態様であるか否かという観点に
よってのみ判断されるべきである。
インターロイキン−２をコードするDNAからなる“オ
ープン読取り枠”はペプチド及びタンパク質の発現のた
めの発現介助体として特に有利であり、しかも実質上最
初の100個のアミノ酸に対応するIL-2のＮ末端部分は融
合タンパク質の産生用として特に適切であることが明ら
かにされた。この方法で得られる一次産物は、真核細胞
のタンパク質配列から完全に構成されるか又はこの配列
から主に構成される融合タンパク質である。驚くべきこ
とに、このタンパク質は、宿主に固有のプロテアーゼに
より外来タンパク質として認識されないばかりか、再度
迅速に分解されるのである。もう１つの有利な点は、本
発明の融合タンパク質は難溶性又は不溶性であるため、
適切には遠心分離によって可溶性タンパク質から容易に
除去することができる、ということである。
本発明によれば、融合タンパク質の“バラスト部分”
の機能化は生物学的活性分子たるIL-2部分に依存してい
ないため、IL-2部の正確な構造にも同様に依存していな
い。したがって、最初の100個のＮ末端アミノ酸が実質
上存在していれば十分である。このため、例えば、所望
のタンパク質がＮ末端に存在する場合には、融合タンパ
ク質を切断するための改変をＮ末端で行なうことが可能
となる。逆に、Ｃ末端での改変も所望のタンパク質の除
去を容易化させるために行なうことができる。
ヒトIL-2をコードする天然DNA配列は、公開番号第0,0
91,539号の欧州特許出願明細書に開示されている。そこ
での引用文献もマウス及びラットのIL-2に関する。これ
ら哺乳類のDNAは本発明のタンパク質の合成のために使
用することができる。しかしながら、合成DNAから、特
に有利には西独特許公開第3,419,995号明細書及び欧州
特許公開第0,163,249号明細書に記載されたヒトIL-2のD
NAから開始することが更に適切である。この合成DNA
は、そのコードンの選択に際して最も頻繁に使用される
宿主、即ち大腸菌、の環境に適しているという利点を有
するばかりでなく、開始部分及び100番目のトリプレッ
トの領域にいくつかの制限エンドヌクレアーゼ切断部位
を有しており、このため本発明においてこれらを使用す
ることができる。しかしながら、このことはそれらの間
に位置する領域でのDNA改変を不可能ならしめているわ
けではないので、他の切断部位を利用することもでき
る。
ヌクレアーゼBan II、Sac I又はSst Iを使用する場合
には、得られるIL-2部分配列は約95個のアミノ酸をコー
ドする。この長さは、通常、不溶性融合タンパク質を得
る上で十分である。例えば、所望の親水性CSF誘導体の
場合に、溶解性の欠如がなおも不十分であるが、しかし
できるだけ小さな“バラスト”を産生するためにＣ末端
の近くに位置する切断部位を利用することが望まれない
ときにおいては、DNA配列は適切なアダプター又はリン
カーによりＮ末端及び／又はＣ末端で延長させることが
できるため、“バラスト”部分は必要に応じ“装飾する
（tailored）”ことができる。勿論、ほぼ末端近くまで
DNA配列を使用することにより、適切であれば修正され
た“副産物”としての生物学的活性IL-2を産生すること
もできる。
このように、本発明は下記一般式の融合タンパク質に
関する。
（上記式中、Ｘは、好ましくはヒトIL-2の適切な100個
のアミノ酸のアミノ酸配列を実質上表わす。Ｙは、所望
のタンパク質に隣接したアミノ酸又はアミノ酸配列が所
望のタンパク質から分離される場合には直接結合を表わ
すが、それ以外の場合には１または２以上の通常遺伝的
にコード可能なアミノ酸から構成されかつ分離せしめら
れる架橋部分を表わし、Ｚは所望のCSFタンパク質から
なる通常コード可能なアミノ酸配列である） 式Ia及びIbからも、更には上記記載からも明らかなよ
うに、IL-2部分の前又は後で所望のタンパク質を発現さ
せることができる。簡略化のために、融合タンパク質の
慣用的産生方法に相当する実質的な第二の選択可能な方
法について以下説明する。この“古典的”変形例が以上
及び以下において記載されているけれども、この方法は
他の代替方法を排除する趣旨のものではない。
融合蛋白質の切断は、自体公知の方法により化学的又
は酵素的に行なわれる。適切な方法の選択については、
特に所望のタンパク質のアミノ酸配列いかんにかかわっ
ている。架橋部分ＹのＣ末端にトリプトファン又はメチ
オニンが存在しているか、又はＹがTrp又はMetを表わす
場合には、Ｎ−ブロモスクシンイミド又はハロゲン化シ
アンによる化学的切断は、合成された特定のCSF誘導体
がこれらアミノ酸を有していないときに行なうことがで
きる。
アミノ酸配列： Asp-Pro を有し、かつ酸に対し十分に安定なCSF及びその誘導体
は、上記のように、自体公知の方法によりタンパク質分
解で切断することができる。これにより、Ｎ末端にプロ
リンを有するか、又はＣ末端にアスパラギン酸を有する
タンパク質が得られる。したがって、この方法により改
変タンパク質を合成することもできる。
Asp-Pro結合は、この架橋部分が(Asp)n‐Pro又はGlu-
(Asp)n‐Pro（ｎは１〜３を表わす）である場合には、
酸に対する安定性が低下することがある。
酵素的切断の例も同様に公知であり、改良された特異
性を有する改変酵素を使用することもできる〔例えば、
C.S.Craik et al.,Science,228 （1985） 291-29
7）〕。
融合タンパク質は、細菌性発現系での発現により自体
公知の方法で得られる。このような目的に適しているも
のは、すべての宿主ベクター系、例えば、各種のストレ
プトミセス属細菌、バチルス・スブチリス（Bacillus s
ubtilis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella
typhimurium）又はセラチア・マルセセンス（Serratia
marcescens）、特に大腸菌（Eschericha coli）であ
る。
所望のタンパク質をコードするDNA配列は、選択され
た発現系において良好な発現を確実化するベクター中に
公知の方法で組込まれる。
trp、lac、tac、ファージλのPLもしくはPR、hsp、om
p又は例えば西独特許公開第3,430,683号明細書もしくは
欧州特許公開第0,173,149号明細書で提案されている合
成プロモーターからなる群よりプロモーター及びオペレ
ーターを選択することがこのためには適している。tac
プロモーター−オペレーター配列が有利であり、これは
現在市販されている〔例えば、発現ベクターpKK223-3,P
harmacia,“Molecular Biologicals,Chemicals and Equ
ipment for Molecular Biology",1984,page63）〕。
本発明の融合タンパク質の発現において、mRNAのレベ
ルでの塩基対形成を防止するために、ATG開始コードン
の後の最初の数個のアミノ酸について個々のトリプレッ
トを改変することが適切であることが明らかにされてい
る。このタイプの改変、例えば個々のアミノ酸の削除又
は付加、は熟練者にとって周知であって、本発明は同様
にそれらにも関する。
本発明によるCSF誘導体としては、下記アミノ酸配列
で表されるものが挙げられる。
（上記式中、（AS）ｘは、天然GM-CSF配列の最初の11個
のアミノ酸配列の完全配列またはこの完全配列からその
末端が切り取られた配列を表し、ＺはGluまたはAspを表
す） 特に有利なCSF誘導体はＮ末端にプロリンを有するも
のであるが、その理由はこのタイプのタンパク質はプロ
テアーゼによる攻撃に対し安定だからである。Ｎ末端に
付加されたプロリンの後に完全なCSFアミノ酸配列を有
するCSF誘導体が特に好ましい。しかしながら、驚くべ
きことに、最初の11個のアミノ酸を除去して得た各種CS
F分子も生物学的に活性であることが判明した。
有利な本発明の変形例としては、２倍以上、有利には
２倍又は３倍のCSF配列を有する融合タンパク質が最初
に得られる変形例である。それらの性質からみて、これ
ら融合タンパク質中のバラスト部分は減少するため、所
望のタンパク質の収量は増大する。
CSFcDNA配列をpBR322のPst I切断部位に組込むことに
よって得られたプラスミドpHG23は、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（American Type Caltur
e Collection）にATCC第39900号として大腸菌中で寄託
されている。このDNA配列は、ウォング（wong）らの第
３図（Ｂ）に記載された変形体と一致する。組込みに際
しては、５′末端近くのPst I切断部位と、一方ではGC
尾部形成により３′末端に導入されたPst I部位とを利
用した（欧州特許公開第0,183,350号明細書）。
例１ CSFの直接発現 市販ベクターpUC12を制限酵素Sma IおよびPst Iで開
環し、大きなフラグメント（１）を分離する。
CSFに関するcDNA配列を酵素SfaN I及びPst Iで切断す
るとによりフラグメント（２）を得、これを合成リンカ
ー（３）しかる後、pUC12フラグメント（１）と結合さ
せる。かくして得られるハイブリッドプラスミトpW201
（４）は、開始コードンATGの後にCSFDNA配列を有して
いる。
ハイブリッドプラスミド（４）をNco Iで開環し、突
出末端（Protruding end）を埋填して、ブラント末端化
されたフラグメント（５）を得る。ベクターpUC12を酵
素EcoR Iで開環し、しかる後突出末端を埋填する。次い
で、ウシアルカリホスファクターゼで処理し、pUC12誘
導体（６）を得る。
フラグメント（５）及び（６）を結合し、両方向にCS
FDNA配列を有するベクターを得る。それらはpW203
（７）と称される。
ベクター（７）上のEcoR I及びRsa Iを利用し、CSFの
63位〜127位のアミノ酸コードンを有するフラグメント
（８）を分離する。一方、ベクター（４）をNco I及びR
sa Iで切断し、CSFの１位〜61位のアミノ酸コードンを
有するフラグメント（９）を分離する。
プラスミドpH131/5（西独特許公開第3,514,113号明細
書又は欧州特許公開第0,198,415号明細書、例１、第１
図）（10）をPvu IIで切断し、小さなフラグメントを除
去し、大きなフラグメントを結合させてプラスミドpPH1
60（11）を得るが、これはpH131/5よりも多い複製数で
大腸菌細胞中に存在している。プラスミド（11）をNco
I及びEcoR Iで開環し、大きなフラグメント（12）を分
離する。
フラグメント（８）、（９）及び（12）を次いで結合
し、ハイブリッドプラスミドpW206（13）を得る。これ
は62位のアミノ酸のコードンを保持している。
市販プラスミドpKK65-15〔PL Biochemical Inc.〕をE
coR Iで切断し、２個のターミネーターT1及びT2を有す
るフラグメントを分離する。このフラグメント（14）を
EcoR Iで開環させたプラスミド（13）に挿入して、プラ
スミドpW225（15）を得る。
プラスミド（15）を有する大腸菌24細胞を、アンピシ
リン30〜50μg/ml含有LB培地〔J.H.Miller,Experiments
in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laborato
ry,1972〕中37℃で一夜培養する。培養物をカザミノ酸2
00μg/l及びチアミン１μg/l含有M9培地（ジェイ・エム
・ミラー、同上）で1:100の比に希釈し、混合物を攪拌
しながら37℃インキュベートする。OD600＝0.5又は１の
時点でインドリル−３−アクリル酸を最終濃度15μ/lま
で加え、混合物をそれぞれ２〜３時間又は16時間インキ
ュベートする。細菌をしかる後遠心除去する。細菌を緩
衝混合液（7M尿素、0.1％SDS、0.1Mリン酸ナトリウム、
pH7.0）中で５時間沸騰し、試料をSDSゲル電気泳動プレ
ートに塗布する。trpオペロンが誘導された細胞のタン
パク質パターンでは約14,000〜18,000ドルトンの新規タ
ンパク質を有しているが、このタンパク質は非誘導細胞
では見られない。
上記誘導条件は培養物を振盪する場合に妥当するが、
大規模発酵の場合はOD値を適度に調整しかつ適切であれ
ば誘導物質濃度を若干変更することが有利である。
例２ Pro0‐CSF ベクターpUC12をEcoR I及びPst Iで開環し、大きなフ
ラグメント（16）を分離する。このフラグメント（16）
を合成DNAフラグメント（17）及びフラグメント（２）
（例１、第１図）と結合する。大腸菌JM103のコンピテ
ント細胞を結合混合物で形質転換し、プラスミドpW212
（18）含有の望ましいクローンを選択する。
CSF配列含有フラグメント（19）“Pvu I及びPst Iに
よりプラスミドDNAから切断する。
pUC8ポリリンカー含有プラスミドpKK177-3〔Amann et
al.,Gene 25（1983）167、欧州特許公開第0,133,282号
明細書〕中にlacリプレッサー〔P.J.Farabough,Nature2
74（1978）765-769〕を挿入し、プラスミドpJF118（2
0）（第２図ａ、西独特願第P3526 995.2、例６、第６図
参照）を得る。後者をAva Iについての唯一の制限部位
で開環し、自体公知の方法でエキソヌクレアーゼ処理す
ることにより約1,000bp大きさを減少させる。結合によ
りプラスミドpEW1000（21）を得るが、lacリプレッサー
遺伝子は完全に残っているものの、大きさが減少してい
るため、最初のプラスミドよりも著しく多い複製数で存
在している。
lacリプレッサーを組込み、かつ得られる産物を同様
に短縮させるため、プラスミドpKK177-3に代って、上記
市販プラスミドpKK223-3から開始することもできる。
プラスミドpEW1000（21）を制限酵素EcoR I及びSal I
で開環し、フラグメント（22）で分離する。
西独特許公開第3,419,995号明細書（欧州特許公開第
0,163,249号明細書）例４（第５図）に記載のとおりに
して製造されたプラスミドp159/6（23）を制限酵素EcoR
I及びSal Iで開環し、IL-2配列を有する小さなフラグ
メント（24）を分離する。
ハイブリッドプラスミドpEW1001（25）をフラグメン
ト（22）及び（24）の結合により得る。
一方、プラスミド（25）をEcoR I及びPvu Iで開環
し、IL-2配列の最大部分を有するフラグメント（26）を
得る。この部分配列は図中“ΔIL2"と記載されている。
他方、プラスミド（25）をEcoR I及びPst Iで開環
し、大きなフラグメント（27）を分離する。
フラグメント（19）、（26）及び（27）を結合し、コ
ンピテント大腸菌294細胞を形質転換し、しかる後選択
して、プラスミドpW216（28）含有クローンを得る。プ
ラスミドDNAを制限分析及びDNA配列分析により特定す
る。
プラスミド（28）含有大腸菌細胞の一夜培養物をアン
ピシリン50μg/ml含有LB培地（ジェイ・エッチ・ミラ
ー、同上）で約1:100の比に希釈し、増殖を吸光度測定
により追跡する。OD＝0.5の時点で、培養物をイソプロ
ピルβ−ガラスクトピラノシド（IPTG）で1mMに調整
し、150〜180分間後に細菌を遠心除去する。細菌を緩衝
混合液（7M尿素、0.1％SDS、0.1Mリン酸ナトリウム、pH
7.0）中で５分間沸騰し、試料をSDSゲル電気泳動プレー
トに塗布する。電気泳動後、期待する融合タンパク質の
大きさと一致するタンパク質バンドをプラスミド（28）
含有細菌から得る。細菌を破壊し〔フレンチプレス（Fr
ench press）、ダイノミル（(R)Dyno mill）〕、遠心分
離した後、多量の他のタンパク質を上澄と一緒に除去す
ることが事前に可能となるように、融合タンパク質を沈
降させる。融合タンパク質を単離した後、酸開裂させ、
更にＮ末端プロリンを含有する所望のCSF誘導体を遊離
させる。この誘導体は、生物学的試験で活性を示す。
上記誘導条件は、培養物を振盪する場合に妥当する
が、大規模発酵の場合はOD値を適度に調整しかつ適切で
あればIPTG濃度を若干変更することが有利である。
例３ Pro1‐CSF（2-127） フラグメント（２）（第１図）及び（16）（第２図）
を合成DNA（29）と結合し、合成DNA配列以外はプラスミ
ド（18）と一致するハイブリッドプラスミド（30）を得
る。
Pvu I及びPst Iを使用して、CSF DNA配列含有フラグ
メント（31）をプラスミド（30）から切り離すが、しか
しながら、フラグメント（31）における最初のアミノ酸
に関するコードンはプロリンに関するコードンで置換さ
れている。フラグメント（31）をフラグメント（26）及
び（27）と結合し、ハイブリッドプラスミドpW240（3
2）を得る。大腸菌中での発現を例２と同様に行ない、
最初のアミノ酸がプロリンで置換されたCSF誘導体を得
る。この誘導体も生物学的活性を示す。
例４ CSF（2-127） ３′末端にPst I制限部位を有するCSF DNA配列を含有
したプラスミド、例えばプラスミドpHG23（ATCC39900）
をSfaN Iで切断し、直鎖化したプラスミド（34）をクレ
ノウポリメラーゼ及びGTPで部分的に埋填する。突出ヌ
クレオチドＡをS1ヌクレアーゼにより除去し、しかる後
フラグメント（35）をPst Iで切断することにより得
る。
フラグメント（35）を合成DNA配列（36）及びフラグ
メント（16）（第２図）と結合し、プラスミド（18）と
類似したプラスミド（37）を得る。
Pvu I及びPst Iを使用してプラスミド（37）を切断
し、フラグメント（38）を得る。このフラグメントをフ
ラグメント（26）及び（27）と結合することにより、プ
ラスミドpW241（39）を得る。
例２のように発現させて融合タンパク質を得、これを
酸で開裂させた後、最初のアミノ酸を欠くCSF誘導体を
得る。この誘導体は生物学的に活性である。
例５ CSF（6-127） プラスミド（33）（又はCSFDNA配列を有した相当する
プラスミド）をまず全体的にPst Iで切断し、しかる後
部分的にBstN Iで切断し、フラグメント（40）を分離す
る。
合成DNA配列（41）及び（36）（第４図）をまず結合
して配列（42）を得、後者をしかる後フラグメント（4
0）及びフラグメント（16）（第２図）と結合してプラ
スミドpW212（43）を得る。
Pvu I及びPst Iを使用し、プラスミド（43）から、CS
F誘導体に関するDNA配列を有するフラグメント（44）を
分離する。このフラグメント（44）をフラグメント（2
6）及び（27）と結合し、ハイブリッドプラスミドpW242
（45）を得る。
例２のように発現させて融合タンパク質を得、この融
合タンパク質から、酸開裂後に、最初の５個のアミノ酸
を欠くCSF誘導体を得る。この産物も生物学的に活性で
ある。
例６ CSF（8-127） まず合成DNA配列（36）（第４図）を合成DNA配列（4
6）と結合し、しかる後得られたDNAフラグメント（47）
をフラグメント（40）及び（16）と結合させて、ハイブ
リッドプラスミド（48）を得る。Pvu I及びPst Iを使用
して後者を切断し、CSF誘導体に関するDNA配列を有する
フラグメント（49）を得る。フラグメント（49）、（2
6）及び（27）を結合し、CSF誘導体に関する短縮DNA配
列以外はプラスミド（45）と一致するハイブリッドプラ
スミドpW243（50）を得る。
例２のように発現させて融合タンパク質を得、次いで
酸開裂後に、最初の７個のアミノ酸を欠くCSF誘導体を
得る。この誘導体も生物学的に活性である。
例７ CSF（12-127） 合成DNA配列（51）をフラグメント（33）及び（16）
と結合し、ハイブリッドプラスミド（52）を得る。Pvu
I及びPst Iを使用して後者を切断することにより、CSF
誘導体に関するDNA配列を有する配列（53）を得、この
フラグメント（53）をフラグメント（26）及び（27）と
結合し、短縮CSF配列以外以外はプラスミド（45）と一
致するハイブリッドプラスミドpW244（54）を得る。
例２のように発現させて融合タンパク質を得、次いで
酸開裂後に、１〜11位のアミノ酸を欠くCSF誘導体を得
る。この短縮分子も生物学的に活性である。
例８ Pro0‐CSF（1-126）‐Asp DNA配列（19）（第２図）を部分的にBstN Iで切断
し、最大のCSF配列部分を有するフラグメント（55）を
分離する。
プラスミド（33）（第４図）（又はCSFDNA配列を有し
た相当するプラスミド）をまずPst Iでしかる後部分的
にBstN Iで切断し、最大のCSF配列部分を有するDNA配列
（56）を得る。
DNA配列（57）を合成するが、これは配列（56）と一
緒になって、Ｃ末端のグルタミン酸がアスパラギン酸で
置換されたCSF誘導体をコードするDNA配列となる。
ベクターpUC13をPst I及びSma Iで開環し、大きなフ
ラグメント（58）を分離する。この直鎖プラスミド（5
8）をフラグメント（56）及び（57）と結合し、Ｃ末端
配列が修正されたハイブリッドプラスミドpW245（59）
を得る。
SfaN I及びPst Iを使用してプラスミド（59）を切断
して、改変CSFDNA配列を有するフラグメント（60）を得
る。このフラグメント（60）を合成DNA配列（61）及び
フラグメント（55）と結合し、DNA配列（62）を得る。
後者をDNAフラグメント（26）及び（27）（第２図）と
結合し、ハイブリッドプラスミドpW246（63）を得る。
このプラスミドは第8a図において２箇所に示されている
が、下の方はコードされた融合タンパク質のアミノ酸配
列を示している。
例２のように発現させて融合タンパク質を得、次いで
酸開裂後に、Ｎ末端にピロリンが延長し、更に最終アミ
ノ酸がアスパラギン酸で置換されたCSF誘導体を得る。
この誘導体は生物学的に活性である。
例９ Pro0‐CSF（1-126）‐Asp ハイブリッドプラスミド（63）（第８図）をEcoR I及
びPst Iで切断し、IL-2部分配列の後に２つの修正CSF配
列を有するフラグメントを分離する。この配列（64）を
部分的にRsa Iで切断し、２個のフラグメント（65）及
び（66）を分離する。フラグメント（66）をBstN Iで切
断し、フラグメント（67）を分離する。DNA配列（2
7）、（65）、（67）、（61）及び（60）を結合し、結
合した配列が特定の配列で並ぶハイブリッドプラスミド
pW247（68）を得る。
例２のように発現させて融合タンパク質を得、次いで
酸開裂後に、例８と同一のCSF誘導体を得る。
例10 （Pro0‐CSFに関する）合成遺伝子 自体公知の方法、例えばホスファイド法（西独特許公
開第3,327,007号、第3,328,793号、第3,409,966号、第
3,414,831号及び第3,419,995号明細書）を適用し、３種
の“合成ブロック”、即ち、図中（69）のＩ（CSF-
I）、図中（70）のII（CSF-II）及び図中（71）のIII
（CSF-III）を合成する。合成されたオリゴヌクレオチ
ドI a〜I m、II a〜II f及びIII a〜III lは、これら合
成ブロックのヌクレオチド配列中に示されている（表
中）。
合成遺伝子のためのヌクレオチドを選択するために
は、３種の合成ブロックの結合部分に特有の切断部位を
入れるのみならず、遺伝子フラグメント中にいくつかの
特有の制限部位を入れることが必要である。これらは下
記表中に記載されている。これらの特有の制限部位は、
自体公知の方法でアミノ酸のコードンを交換、挿入又は
削除するために利用することができる。
３種の合成ブロックをまず個別的に大腸菌中で複製、
増幅させ、再び分離した： 合成ブロックCSF-I（69）をpUC12誘導体（16）中に組
込み、プラスミドpS200（72）を得る。
pUC12を制限酵素Pst I及びHind IIIで開環し、直鎖プ
ラスミド（73）を合成ブロックCSF-II（70）と結合し、
プラスミドpS201（74）を得る。
pUC13をHind III及びSma Iで開環し、直鎖プラスミド
（75）をCSF-III（71）と結合し、プラスミドpS202（7
6）を得る。
再度分離された合成ブロック（69）、（70）及び（7
1）を、EcoR I及びSma Iで直鎖化されたベクターpUC12
（77）中で結合させるが、ここで得られるものはプラス
ミドpS203（78）である。このハイブリッドプラスミド
を、各合成ブロック含有プラスミドとして、大腸菌79/0
2中で増幅させ、合成遺伝子を制限分析及び配列分析に
より特定する。
プラスミド（78）をPvu Iで部分的に及びBamH Iで切
断し、完全CSF配列含有の小さなフラグメント（79）を
分離する。
発現プラスミド（21）をEcoR I及びBamH Iで開環し、
大きなフラグメント（80）を分離する。このフラグメン
ト（80）をIL-2部分配列含有フラグメント（26）及び合
成遺伝子（79）と結合する。これにより融合タンパク質
をコードするプラスミドpS204（81）を得るが、この融
合タンパク質においてはIL-2部分配列の後にまず酸開裂
される架橋部分、次いでCSFのアミノ酸配列が位置す
る。したがって、酸開裂により、Ｎ末端にプロリンが延
長したCSF誘導体が得られる。
例11 CSF（1-12）His（14-121）His（123-127） 48位（Hpa Iの切断部位）までの合成ブロックＩのヌ
クレオチドを合成配列（82）及び（83）で置換すると、
最初のアミノ酸（Ala）の前にTrpがありかつ13位のTrp
がHisで置換されたCSF I類似体をコードする改変合成ブ
ロックＩが得られる。
プラスミド（72）（第10図）をEcoR I及びHpa Iで開
環し、大きなフラグメント（84）を分離する。後者を合
成フラグメント（82）及び（83）と結合し、この修正CS
F I（CSF I′）をコードするプラスミドpS205（85）を
得る。
プラスミド（76）（第10図）をHind III及びSal Iで
開環し、小さなフラグメント（86）及び大きなフラグメ
ント（87）を分離する。小さなフラグメント（86）をし
かる後Taq Iで切断し、フラグメント（88）を分離す
る。
大きなフラグメント（87）をフラグメント（88）及
び、122位のTrpのコードンがHisで置換された合成フラ
グメント（89）と結合し、改変CSF III（CSF III′）を
コードするプラスミドpS206（90）を得る。このプラス
ミドを大腸菌に入れて形質転換し、増幅し、再度分離
し、Hind III及びSal Iで切断し、CSF III′をコードす
る小さなフラグメント（91）を分離する。
プラスミド（85）をPvu Iで部分的に及びPst Iで切断
し、CSF I′をコードする小さいなフラグメント（92）
を分離する。
フラグメント（22）、（26）、（92）、（70）及び
（91）を結合して、プラスミドpS207（93）を得る。こ
のプラスミドは、IL-2部分配列の後に、CSFの最初のア
ミノ酸（Ala）の直前にTrpを有する架橋部分が存在する
ような融合タンパク質をコードするものである。CSF分
子の13位及び122位のTrpはHisで置換されているため、
融合タンパク質をＮ−ブロモスクシンイミドで切断する
ことができる。これにより、両位置のトリプトファンが
ヒスチジンで置換されたCSF誘導体が得られる。
例12 CSF（1-99）Thr（101-127） 合成ブロック IIIの合成に際し、オリゴヌクレオチド
III e及びIII fを合成配列（94）で置換し、操作を例10
のとおりに行なうと、100位のIleがThrで置換されたCSF
誘導体が得られる。
例13 CSF（1-35）Ile（37-45）Leu（47-78）Leu-Leu（83-12
7） 最初に、36位においてMetの代わりにIleのコードンを
有するオリゴヌクレオチド（95）、及び46位におけるMe
tのコードンがLeuのコードンで置換されたオリゴヌクレ
オチド（96）を合成する。
プラスミド（72）（第10図）をしかる後Pvu I及びXma
IIIで開環し、フラグメント（97）を分離する。
更に、Metのコードンが最初のアミノ酸のコードンの
前に位置する配列（98）を合成する。
フラグメント（16）、（98）、（97）、（95）及び
（96）を結合して、プラスミドpS208（99）を得る。こ
のプラスミドはプラスミド（72）と一致するが、但し、
CSF I配列の０位にMetのコードン、36位にIleのコード
ン及び46位のLeuのコードンを有する。
更に、79位及び80位がMetの代わりにLeuをコードする
配列（100）を合成する。
プラスミド（76）（第10図）をHind III及びNhe Iで
開環し、大きなフラグメント（101）を分離し、かつ合
成配列（100）と結合させると、CSF III配列の79位及び
80位の二つのコードンが置換されていること以外はプラ
スミド（76）と一致するプラスミドpS209（102）が得ら
れる。
プラスミド（93）（第11a図）を部分的Pvu I及びSal
Iで切断し、大きなフラグメント（103）を分離する。プ
ラスミド（99）を同様に部分的にPvu I及びPst Iで開環
し、修正CSF I配列有する小さなフラグメント（104）を
分離する。更に、プラスミド（102）をHind III及びSal
Iで開環し、修正CSF III配列を有する小さなフラグメ
ント（105）を分離する。
フラグメント（103）、（104）、（70）及び（105）
を結合してプラスミドpS210（106）を得るが、このプラ
スミドはプラスミド（93）（第11a図）と一致するもの
の、０位にMetを有し、他方４個のMet残基が他のアミノ
酸で置換されたCSF誘導体をコードするものである。
大腸菌をプラスミド（106）で形質転換すると、誘導
後に、ハロゲン化シアンで切断可能な融合タンパク質が
得られるが、この融合タンパク質から、36位にIleと4
6、79及び80位にLeuを有するCSF誘導体が得られる。
例14 CSF（1-35）Ile（37-45）Leu（47-78）Leu（81-127） 操作は例13と同様に行なうが、但し合成配列（100）
の代わりに合成配列（107）を使用した場合は、36位にI
leと46位にLeuを有し、かつアミノ酸のLeuが79位及び80
位のアミノ酸の代わりに存在する削除産物が得られる。
例15 CSF（1-35）Ile（37-45）Leu（47-78）‐（81-127） 操作は例13と同様に行なうが、但し合成配列（100）
の代わりに合成配列（108）を使用した場合は、36位にI
leと46位にLeuを有し、かつ79位及び80位のアミノ酸が
削除された削除産物が得られる。
【図面の簡単な説明】
第１図並びにその続きの第1a図及び第1b図は、（Met
−）CSFの直接発現のために使用されるベクターpW225の
製造法について示す説明図である。後の図は融合タンパ
ク質を発現するベクターに関するが、そのうちヒトイン
ターロイキン−２（以下、“IL-2"又は“ΔIL-2"と呼
ぶ）の部分配列から得られる“バラスト（ballast）”
タンパク質はCSFアミノ酸配列前部のＮ末端に位置して
いる。 第２図並びにその続きの第2a図及び第2b図は、Ｎ末端が
アミノ酸のプロリンで延長されたCSF誘導体が酸開裂に
より得られるような融合タンパク質についてコードする
ベクターpW216の製造法を示す説明図である。 第３図は、最初のアミノ酸（アラニン）としてプロリン
を有するCSF誘導体が酸開裂後に得られるような融合タ
ンパク質についてコードするベクターpW240の合成を示
す説明図である。 第４図は、最初のアミノ酸（アラニン）が欠落したCSF
誘導体が酸開裂後に得られるような融合タンパク質につ
いてコードするベクターpW241の製造法を示す説明図で
ある。 第５図は、最初の５個のアミノ酸が欠落したCSF誘導体
が酸開裂後に得られるような融合タンパク質についてコ
ードするベクターpW242の製造法を示す説明図である。 第６図は、最初の７個のアミノ酸が欠落したCSF誘導体
が酸開裂後に得られるような融合タンパク質についてコ
ードするベクターpW243の製造法を示す説明図である。 第７図は、最初の11個のアミノ酸が欠落したCSF誘導体
が酸開裂後に得られるような融合タンパク質についてコ
ードするベクターpW244の合成法を示す説明図である。 第８図及びその続きの第8a図はベクターpW246の合成法
について示す説明図である。このベクターは、二つの修
正配列“CSF′”がIL-2部分配列の後に続くような融合
タンパク質についてコードする。酸開裂により、最初の
アミノ酸たるプロリンの前にＮ末端にプロリンが位置
し、かつ最後のアミノ酸がアスパラギン酸で置換された
CSF誘導体が得られる。 第９図は、三つのCSF′配列がIL-2部分配列の後に続く
融合タンパク質についてコードするベクターpW247の合
成法を示す説明図である。酸開裂により第８図で特徴付
けたCSF誘導体が得られる。 第10図及びその続きの第10a図は、合成DNA部分配列を含
有するハイブリッドプラスミドpS200〜204の製造法につ
いて示しているが、プラスミドpS200は表１で示される
“合成ブロックI"を有し、プラスミドpS201は表２で示
される“合成ブロックII"を有し、プラスミドpS202は表
３で示される“合成ブロックIII"を有し、プラスミドpS
203は完全な合成遺伝子を有し、pS204は同様に完全な合
成CSFDNA配列を有する発現プラスミドを表わす。発現と
酸開裂により、第２図で示されたものと同一のCSF誘導
体が得られる。 第11図及びその続きの第11a図は、13位及び122位の各Tr
pがHisで置換されたCSF誘導体がＮ−ブロモスクシンイ
ミドによる開裂後に得られるような融合タンパク質につ
いてコードする発現プラスミドpS207の合成法を示す説
明図である。 第12図は、100位のIleがThrで置換されたCSF誘導体が得
られる合成DNA部分配列について示す説明図である。 第13図及びその続きの第13a図は、すべてのメチオニン
残基が天然アミノ酸、即ち36位がIleで、46、79及び80
位がLeuで置換されたCSF誘導体が臭化シアンによる開裂
後に得られるような融合タンパク質についてコードする
発現プラスミドpS210の合成法を示す説明図である。 第14図は、36位のMetがIleで置換され、46位のMetがLeu
で置換され、１個のLeu残基がアミノ酸79及び80位の位
置に存在するCSF誘導体が第13図の合成経路に従い得ら
れる合成DNA配列について示す説明図である。 第15図は、36位のMetがIleで置換され、46位のMetがLeu
で置換され、79及び80位の２個のアミノ酸が削除された
CSF誘導体が第13図で示される合成経路に従い得られる
合成DNAについて示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭60−500480（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−502682（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−501259（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−502795（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−199787（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．10（1985．10）ｐ. 2575−2581 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．228（1985. ５）ｐ．810−815 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．82（1985．７) ｐ．4360−4364 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．82（1985．９) ｐ．6250−6254

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記アミノ酸配列で表されるヒト顆粒球マ
    クロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）活性を有する
    タンパク質。 （上記式中、（AS）ｘは、天然GM-CSF配列の最初の11個
    のアミノ酸配列の完全配列またはこの完全配列からその
    末端が切り取られた配列を表し、ＺはGluまたはAspを表
    す（以下ヒトGM-CSFを「CSF」という））
  2. 【請求項２】下記アミノ酸配列で表されるCSF活性を有
    するタンパク質をコードする遺伝子を細菌性発現ベクタ
    ー中に組み込み、細菌を該ベクターで形質転換し、そし
    て発現を誘導させることを含んでなる、下記アミノ酸配
    列で表されるCSF活性を有するタンパク質の製造法。 （上記式中、（AS）ｘは、天然GM-CSF配列の最初の11個
    のアミノ酸配列の完全配列またはこの完全配列からその
    末端が切り取られた配列を表し、ＺはGluまたはAspを表
    す）
  3. 【請求項３】細菌が大腸菌である、請求項２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】CSF活性を有するタンパク質を融合タンパ
    ク質の形で発現させ、次いで酵素的にまたは化学的に切
    断する、請求項２または３に記載の方法。
  5. 【請求項５】下記アミノ酸配列で表されるCSF活性を有
    するタンパク質を含んでなるか、または下記アミノ酸配
    列で表されるCSF活性を有するタンパク質からなる、造
    血細胞増殖刺激用医薬組成物。 （上記式中、（AS）ｘは、天然GM-CSF配列の最初の11個
    のアミノ酸配列の完全配列またはこの完全配列からその
    末端が切り取られた配列を表し、ＺはGluまたはAspを表
    す）
  6. 【請求項６】下記アミノ酸配列で表されるCSF活性を有
    するタンパク質を含んでなるか、または下記アミノ酸配
    列で表されるCSF活性を有するタンパク質からなる、顆
    粒球およびマクロファージ形成促進用医薬組成物。 （上記式中、（AS）ｘは、天然GM-CSF配列の最初の11個
    のアミノ酸配列の完全配列またはこの完全配列からその
    末端が切り取られた配列を表し、ＺはGluまたはAspを表
    す）
JP61306186A 1985-12-21 1986-12-22 Ｇｍ−ｃｓｆタンパク質、その誘導体、このタイプのタンパク質の調製及びそれらの用途 Expired - Lifetime JP2575367B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853545568 DE3545568A1 (de) 1985-12-21 1985-12-21 Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung
DE3545568.3 1985-12-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62164695A JPS62164695A (ja) 1987-07-21
JP2575367B2 true JP2575367B2 (ja) 1997-01-22

Family

ID=6289242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61306186A Expired - Lifetime JP2575367B2 (ja) 1985-12-21 1986-12-22 Ｇｍ−ｃｓｆタンパク質、その誘導体、このタイプのタンパク質の調製及びそれらの用途

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0228018B1 (ja)
JP (1) JP2575367B2 (ja)
KR (1) KR940005585B1 (ja)
AT (1) ATE71144T1 (ja)
AU (2) AU601959B2 (ja)
CA (1) CA1341197C (ja)
DE (2) DE3545568A1 (ja)
DK (1) DK170346B1 (ja)
ES (1) ES2055686T3 (ja)
FI (1) FI91168C (ja)
GR (1) GR3003999T3 (ja)
HU (1) HU202584B (ja)
IE (1) IE59779B1 (ja)
IL (1) IL81020A (ja)
NO (1) NO177270C (ja)
PT (1) PT83972B (ja)
ZA (1) ZA869557B (ja)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5078996A (en) * 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
EP0238655A4 (en) * 1985-10-03 1989-09-11 Biogen Nv POLYPEPTIDES LIKE THE GRANULOCYTE-MACROPHOUS COLONY STIMULATION FACTORS (GM-CSF) AND THEIR METHODS OF PRODUCING LARGE QUANTITIES IN MICROBIAL CELLS.
DE3712985A1 (de) * 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
US5359035A (en) * 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
JP2583770B2 (ja) * 1986-09-17 1997-02-19 大塚製薬株式会社 遺伝子
JPS6420097A (en) * 1987-03-02 1989-01-24 Sumitomo Chemical Co Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor
PT87133B (pt) * 1987-04-02 1992-07-31 Amrad Corp Ltd Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif
AU609128B2 (en) * 1987-04-02 1991-04-26 Amrad Operations Pty. Limited Leukaemia-inhibitory factor
EP0383764B1 (en) * 1987-06-25 1995-04-12 Immunex Corporation Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor
EP0386109A1 (en) * 1987-11-12 1990-09-12 Schering Corporation Acceleration of bone formation with gm-csf
GB2212159B (en) * 1987-11-13 1992-01-22 British Bio Technology Synthetic gene for human granulocyte/macrophage colony stimulating factor.
AU615550B2 (en) * 1988-04-21 1991-10-03 Medvet Science Pty. Ltd. Human gm-csf variants
WO1990012877A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-01 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
DK0489116T3 (da) * 1989-08-22 1994-05-02 Immunex Corp Fusionsproteiner omfattende GM-CSF og IL-3
NZ236819A (en) * 1990-02-03 1993-07-27 Max Planck Gesellschaft Enzymatic cleavage of fusion proteins; fusion proteins; recombinant dna and pharmaceutical compositions
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
AU7095796A (en) * 1995-09-28 1997-04-17 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Neutrophil chemotactic lymphokine, and drug and kit for the diagnosis of drug hypersensitive granulocytopenia containing the same
RU2144083C1 (ru) * 1998-03-13 2000-01-10 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Способ промышленного получения рекомбинантного гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующего фактора человека
KR100448021B1 (ko) * 2001-12-28 2004-09-08 크레아젠 주식회사 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자 발현벡터 ｐＧＭ-ＣＳＦ로 형질전환된 대장균 및 상기 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자의 대량생산방법
WO2011079070A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Gradalis, Inc. Furin-knockdown bi-functional rna
CN108295087B (zh) 2009-12-23 2021-01-15 格兰达利斯有限公司 弗林蛋白酶敲减和gm-csf增强的(fang)癌症疫苗

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4438032A (en) * 1981-01-30 1984-03-20 The Regents Of The University Of California Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
IL71991A (en) * 1983-06-06 1994-05-30 Genentech Inc Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes
AU594014B2 (en) * 1984-03-21 1990-03-01 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant DNA molecules
EP0188479B1 (en) * 1984-07-06 1991-09-11 Sandoz Ag Lymphokine production and purification
AU588819B2 (en) * 1984-10-29 1989-09-28 Immunex Corporation Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene
ZA856108B (en) * 1984-10-29 1986-10-29 Immunex Corp Cloning of human granulocyte-macrophage colony simulating factor gene
EP0202300B1 (en) * 1984-11-20 1992-11-11 Schering Biotech Corporation Cdna clones coding for polypeptides exhibiting human granulocyte macrophage and eosinophil cellular growth factor activity
EP0238655A4 (en) * 1985-10-03 1989-09-11 Biogen Nv POLYPEPTIDES LIKE THE GRANULOCYTE-MACROPHOUS COLONY STIMULATION FACTORS (GM-CSF) AND THEIR METHODS OF PRODUCING LARGE QUANTITIES IN MICROBIAL CELLS.
DE3636903A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-02 Hoechst Ag Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil
DE3541856A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．８２（１９８５．７）ｐ．４３６０−４３６４
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．８２（１９８５．９）ｐ．６２５０−６２５４
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２８（１９８５．５）ｐ．８１０−８１５
Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１０（１９８５．１０）ｐ．２５７５−２５８１

Also Published As

Publication number Publication date
HUT44615A (en) 1988-03-28
NO865191L (no) 1987-06-22
EP0228018A2 (de) 1987-07-08
GR3003999T3 (ja) 1993-03-16
AU637139B2 (en) 1993-05-20
ES2055686T3 (es) 1994-09-01
NO177270B (no) 1995-05-08
NO865191D0 (no) 1986-12-19
DK619086A (da) 1987-06-22
KR870006188A (ko) 1987-07-09
CA1341197C (en) 2001-03-06
AU6268390A (en) 1990-12-13
KR940005585B1 (ko) 1994-06-21
DK619086D0 (da) 1986-12-19
AU601959B2 (en) 1990-09-27
FI865186A0 (fi) 1986-12-18
NO177270C (no) 1995-08-16
EP0228018B1 (de) 1992-01-02
DK170346B1 (da) 1995-08-07
JPS62164695A (ja) 1987-07-21
FI865186L (fi) 1987-06-22
HU202584B (en) 1991-03-28
IE59779B1 (en) 1994-04-06
PT83972A (de) 1987-01-01
IL81020A0 (en) 1987-03-31
ZA869557B (en) 1987-10-28
PT83972B (pt) 1989-07-31
FI91168B (fi) 1994-02-15
AU6675686A (en) 1987-06-25
IL81020A (en) 1995-11-27
EP0228018A3 (en) 1987-12-02
DE3545568A1 (de) 1987-07-16
FI91168C (fi) 1994-05-25
DE3683267D1 (de) 1992-02-13
ATE71144T1 (de) 1992-01-15
IE863335L (en) 1987-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2575367B2 (ja) Ｇｍ−ｃｓｆタンパク質、その誘導体、このタイプのタンパク質の調製及びそれらの用途
JP2566933B2 (ja) 真核細胞融合タンパク質、その生産及び用途、並びに方法
AU663489B2 (en) Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
KR960011919B1 (ko) IgA 단백질 분해효소를 이용한 재조합 단백질의 효소적 절단방법
JP2939283B2 (ja) 大腸菌でペプチドを分泌させるためのシグナルペプチドおよびその取得方法
HU204303B (en) Process for producing bifunction proteines
JP2620479B2 (ja) 豚成長ホルモンのポリペプチドおよびその製造方法
NZ199391A (en) Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin
EP0602144B1 (en) Dna sequences encoding gelonin polypeptide
JPH07113040B2 (ja) 融合タンパク質、その生産方法及びその用途
EP0446283A1 (en) Synthetic interleukin-6
AU623518B2 (en) Processes and compositions for the isolation of human relaxin
JPH06153957A (ja) ヒトγ−インターフェロンの部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
US4659669A (en) Microbial expression of human influenza hemagglutinin proteins
AU617999B2 (en) A genetic engineering process for the preparation of angiogenins
EP0371041A1 (en) A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
US5298603A (en) GM-CSF protein, its derivatives, the preparation of proteins of this type, and their use
US5545564A (en) Vector for expression and secretion of polypeptide microorganism transformed by the vector and production of polypeptide with the same microorganism
JPH02219588A (ja) ストレプトミセスにおけるインシュリン前駆体の製造
JPS63230095A (ja) テンダミスタット誘導体
JP2594535B2 (ja) 高発現ベクターおよびその利用
JP2845558B2 (ja) メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列
EP0105521A2 (en) Novel DNA, microorganism transformed therewith and use thereof
JP2887060B2 (ja) グリセンチンの生産方法
JP2508775B2 (ja) 組換えｄｎａおよびこれを用いたポリペプチドの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term