NO177270B - Fremg. for fremstilling av terapeutisk aktive, humanegranulocytt-makrofag-"kolonistimulerende"-faktorproteiner (GM-CSF), bakteriell ekspresjonvektor som er i stand til å uttrykke GM-CSF samt bakteriecelle inneholdende vektoren - Google Patents
Fremg. for fremstilling av terapeutisk aktive, humanegranulocytt-makrofag-"kolonistimulerende"-faktorproteiner (GM-CSF), bakteriell ekspresjonvektor som er i stand til å uttrykke GM-CSF samt bakteriecelle inneholdende vektoren Download PDFInfo
- Publication number
- NO177270B NO177270B NO865191A NO865191A NO177270B NO 177270 B NO177270 B NO 177270B NO 865191 A NO865191 A NO 865191A NO 865191 A NO865191 A NO 865191A NO 177270 B NO177270 B NO 177270B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- csf
- plasmid
- sequence
- fragment
- amino acids
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 7
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 title claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title description 9
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 title 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 title 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 52
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 41
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 41
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 abstract description 3
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 abstract 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 93
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 29
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 28
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 28
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 20
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 12
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001440029 Escherichia coli 79 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 101001043827 Mus musculus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101000777480 Phyllodiscus semoni DELTA-alicitoxin-Pse1b Proteins 0.000 description 1
- 101001043830 Rattus norvegicus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ved uttrykking av et for den humane granulozyt-makrofag-"Colony Stimulating"-faktoren (CSF) kodende gen i bakterier får man CSF-proteiner som er biologisk aktive.Ved variasjon av den naturlige eller en syntetisk gen-struktur får man biologisk aktive derivater med endret aminosyrerekkefølge.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive humane-granulocytt-makrofag-"kolonistimulerende,,-faktorproteiner (GM-CSF) , bakteriell ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke GM-CSF samt bakteriecelle inneholdende vektoren.
Human granulocytt-makrofag-"kolonistimulerende"-faktor (GM-CSF) er et glykoprotein med en molvekt på ca. 23 000 dalton. cDNA-sekvensen og ekspresjonen av glykoproteinet i pattedyr-celler er allerede kjent (G.G. Wong et al. , Science 228
(1985), 810-815, D. Metcalf, Science 229 (1985), 16-22).
Overraskende er det nå funnet at ekspresjonen av humant GM-CSF-protein, idet følgende betegnet "CSF" i bakterier, fører til et biologisk aktivt produkt. Oppfinnelsen vedrører følgelig CSF for terapeutisk anvendelse hhv. anvendelsen for fremstilling av legemidler.
Oppfinnelsen vedrører videre fremstillingen av CSF ved ekspresjon i bakterier, spesielt i E. coli. For dette formålet kan de publiserte cDNA-sekvensene anvendes som kan fremstilles på i og for seg kjent måte, fortrinnsvis syntetisk.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive, humane granulocytt-makrof ag-"koloni-stimulerende"-f aktorproteiner (GM-CSF) med formelen
hvori (As)x helt eller delvis betyr de første 11 aminosyrene i den naturlige GM-CSF-sekvensen og Z betyr Glu eller Asp, i det følgende betegnet "CSF", kjennetegnet ved at man bygger inn et for CSF-kodende gen i en bakteriell ekspresjonsvektor, dermed transformerer bakterier, spesielt E. coli, og bringer dette til uttrykking deri, eller eventuelt at man uttrykker
CSF i form av et fusjonsprotein, med en N-terminalandel av IL-2, som i det vesentlige tilsvarer de første 100 aminosyrene av IL-2, som deretter spaltes enzymatisk eller kjemisk.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en bakteriell ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke GM-CSF av formelen
hvori (As)x helt eller delvis betyr de første 11 aminosyrene i den naturlige GM-CSF-sekvensen og Z betyr Glu eller Asp, kjennetegnet ved at den inneholder et strukturelt gen som koder for CM-CSF i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som muliggjør ekspresjon i en takterievert.
Endelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en bakteriecelle, spesielt E. coli, kjennetegnet ved at den inneholder vektoren omtalt ovenfor.
Ytterligere trekk ved oppfinnelsen og dens foretrukne utførelser beskrevet nærmere i det følgende hhv. definert i patentkravene.
Som illustrasjon av oppfinnelsen tjener videre figurene 1 til 15 som, for dete meste i form av flytskjemaer, anskueliggjør fremgangsmåtene fra eksemplene av samme nummer. Disse figurene er ikke i riktig målestokk, spesielt i området ved polylinkeren er målestokken "utvidet".
Følgelig viser fig. 1 og dens fortsettelser la og lb fremstillingen av vektoren pW225 som tjener til direkte ekspresjon av (Met-)CSF. De følgende figurene vedrører vektorer som fører til ekspresjon av fusjonsproteiner hvori det N-terminalt før CSF-aminosyresekvensen er anordnet et "ballast"-protein, som er avledet fra en delsekvens av humant Interleukin-2, idet følgende betegnet "IL-2" hhv. "AIL-2": Figur 2 og dens fortsettelse 2a og 2b, viser fremstillingen av vektoren pW216, som koder for et fusjonsprotein, hvorfra det ved syrespaltning oppstår et CSF-derivat som N-terminalt er forlenget ved aminosyren prolin. Figur 3 viser syntesen av vektoren pW240 som koer for et fusjonsprotein som etter syrespaltning fører til et CSF-derivat som isteden for den første aminosyren (alanin) bærer prolin. Figur 4 vedrører fremstillingen av vektoren pW241, som koder for et fusjonsprotein som etter syrespaltning fører til et CSF-derivat hvor den første aminosyren (alanin) mangler. Figur 5 demonstrerer fremstillingen av pW242, som koder for et fusjonsprotein som etter syrespaltning fører til et CSF-derivat hvori de første 5 aminosyrene er eliminert. Figur 6 vedrører fremstillingen av vektoren pW243, som koder for et fusjonsprotein som etter syrespaltning fører til et CSF-derivat hvori de første 7 aminosyrene mangler. Figur 7 viser syntesen av vektoren pW244 som koder for et fusjonsprotein hvorfra det etter syrespaltning oppnås et CSF-derivat hvori de første 11 aminosyrene er eliminert. Figur 8 og dens fortsettelse 8a viser syntesen av vektoren pW246. Denne koder for et fusjonsprotein hvori det etter IL-2-delsekvensen følger to varierte sekvenser betegnet som "CSF". Etter syrespaltning får man et CSF-derivat hvorved prolin står N-terminalt før den første aminosyren og hvori den siste aminosyren er erstattet med asparaginsyre. Figur 9 viser syntesen av vektoren pW247, som koder for et fusjonsprotein hvori det etter IL-2-delsekvensen følger tre CSF'-sekvenser. Etter syrespaltning oppnås det i figur 8 angitte CSF-derivatet. Figur 10 og dens fortsettelse fig. 10a, viser fremstillingen av hybridplasmidene pS200 til 204, som inneholder syntetiske CSF-DNA-delsekvenser, hvorved plasmidet pS200 inneholder "synteseblokk I" ifølge vedlegg I, plasmidet pS201 inneholder "synteseblokk II" ifølge vedlegg II, plasmidet pS202 inneholder "synteseblokk III" ifølge vedlegg III, plasmidet pS203 inneholder hele det syntetiske genet og pS204 utgjør et ekspresjonsplasmid som også inneholder hele den syntetiske CSF-DNA-sekvensen. Etter ekspresjon og syrespaltning oppnås det samme CSF-derivatet som beskrevet i fig. 2. Figur 11 og dens fortsettelse, fig. Ila, viser syntesen av ekspresjonsplasmidet pS207 som koder for et fusjonsprotein som etter spaltning med N-bromsuksinimid gir et CSF-derivat hvori posisjonene 13 og 122 Trp er erstattet med His. Figur 12 viser en syntetiske DNA-delsekvens som tillater fremstillingen av et CSF-derivat, hvori posisjonen 100 Ile er erstattet med Thr. Figur 13 og dens fortsettelse, fig. 13a, viser syntesen av ekspresjonsplasmidet pS210, som koder for et fusjonsprotein som etter bromcyan-spaltning gir et CSF-derivat, hvori alle metionin-rester er erstattet med nøytrale aminosyrer, dvs. i posisjonene 36 med Ile og i posisjonene 46, 79 og 80 med Leu. Fig. 14 viser en syntetiske DNA-sekvens som ifølge syntetisk DNA-sekvens som ifølge synteseskjemaet i fig. 13 tillater fremstillingen av et CSF-derivat, hvori posisjonen 36 Met er erstattet med Ile og i posisjonen 46 er Met erstattet med Leu og hvori det i steden for aminosyrene 79 og 80 står en enkelt Leu-rest. Figur 15 viser endelig et syntetisk DNA hvis anvendelse i synteseskjemaet ifølge fig. 13 tillater fremstilling av et CSF-derivat hvori posisjon 36 Met er erstattet med Ile og i posisjonen 46 med Leu og hvori begge aminosyrene i posisjon 79 og 80 er utelatte.
Det har vist seg at den "åpne leserammen" fra et DNA som koder for Interleukin-2, er spesielt fordelaktig som ekspre-sjonshjelpemiddel for uttrykking av peptider hhv. proteiner, og at en N-terinal andel av IL-2, som idet vesentlige tilsvarer de første 100 aminosyrene, egner seg spesielt godt til fremstilling av fusjonsproteiner. Som primært produkt oppnås altså et fusjonsprotein som fullstendig, eller i overveiende grad, består av eukaryotiske proteinsekvenser. Overraskende gjenkjennes dette proteinet åpenbart ikke av de vertsegne proteasene som fremmedprotein og nedbrytes heller ikke straks. En ytterligere fordel er at fusjonsproteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen er tungt oppløslig til uoppløslige og følgelig lett lar seg fraskille fra de oppløslige proteinene, hensiktsmessig ved sentrifugering.
Idet det ifølge oppfinnelsen vedrørende fusjonen som "ballastandel" for fusjonsproteinet ikke er viktig at IL-2-andelen utgjør et biologisk aktivt molekyl, er heller ikke den nøyaktige strukturen av IL-2-andelen viktig. Det er tilstrekkelig at idet vesentlige de første 100 N-terminale aminosyrene foreligger. Det er altså eksempelvis mulig å foreta variasjoner på N-terminalen som muliggjør en spaltning av fusjonsproteinet dersom det ønskede proteinet er anordnet N-terminalt dertil. Omvendt kan man foreta C-terminale variasjoner for å muliggjøre eller lette avspaltningen av det ønskede proteinet.
Den for humant IL-2-kodende naturlige DNA-sekvensen er kjent fra den europeiske patentpublikasjonen med utlegningsnummer-idet følgende betegnet "EP-A" - 0 091 539. Den der angitte litteraturen vedrører mus- og rotte-IL-2. Dette pattedyr-DNA kan anvendes til syntese av proteinene. Det er imidlertid mer hensiktsmessig å ta utgangspunkt i et syntetisk DNA, spesielt fordelaktig fra DNA fra human-IL-2, som er beskrevet i det tyske utlegningsskriftet 3 419 995 hhv. i EP-A 0 163 249. Dette syntetiske DNA'et har ikke bare den fordelen at det når det gjelder kodonvalg er avstemt etter den hyppigst anvendte verten, E. coli, men det inneholder en rekke snittseter for restriksjonsendonukleaser ved begynnelsen hhv. i området for den 100. tripletten, hvorav det kan gjøres bruk ifølge oppfinnelsen. Herved skal det imidlertid ikke utelukkes at det kan foretas variasjoner i det mellomliggende området av DNA, hvorved det kan gjøres bruk av ytterligere snittseter.
Dersom det gjøres bruk av nukleasene Ban II, Sac I eller Sst I så får man en IL-2-delsekvens som koder for ca. 95 aminosyrer. Denne lengden er generelt tilstrekkelig til å oppnå et uoppløselig fusjonsprotein. Når tungtoppløsligheten, spesielt ved et ønsket hydrofilt CSF-derivat, fremdeles ikke er tilstrekkelig, men man - for å produsere så lite "ballast" som mulig - ikke ønsker å gjøre bruk av snittsetene som ligger nærmere C-terminalen, så kan man ved hjelp av tilsvarende adapter hhv. linker forlenge DNA-sekvensen ved den N- og/eller C-terminale enden og dermed "skreddersy" "ballast"-andelen. Man kan naturligvis også utnytte DNA-sekvensen, mer eller mindre, til enden og følgelig oppnå eventuelt modifisert, biologisk aktivt, IL-2 som "biprodukt".
Fusjonsproteiner kan ha den generelle formelen
eller
hvori X idet vesentlige er aminosyrerekken av de ca. 100 første aminosyrene av fortrinnsvis menneskelig IL-2, Y står for en direkte binding dersom den til det ønskede proteinet nabostående aminosyren eller aminosyrerekken muliggjør en avspaltning av det ønskede proteinet, eller ellers et broledd
av en eller flere genetiske kodbare aminosyrer som muliggjør avspaltningen, og Z er en sekvens av genetisk kodbare aminosyrer som utgjør det ønskede CSF-proteinet.
Som det fremgår av formlene Ia og Ib - og som også nevnt ovenfor - er det mulig å bringe det ønskede proteinet til ekspresjon før eller etter IL-2-andelen. For enkelthets skyld beskrives idet følgende hovedsakelig den andre muligheten, som tilsvarer den opprinnelige fremgangsmåten til fremstilling av fusjonsproteiner. Når altså i ovenstående og i det følgende denne "klassiske" varianten beskrives, skal det andre alternativet herved ikke utelukkes.
Spaltningen av fusjonsproteinet kan foregå på i og for seg kjent måte, kjemisk eller enzymatisk. Valget av den egnede metoden avhenger først og fremst av aminosyresekvensen av det ønskede proteinet. Dersom i broleddet Y ved karboksyter-minalen står for tryptofan hhv. metionin eller Y for Trp hhv. Met, så kan det foregå en kjemisk spaltning med N-bromsuksinimid hhv. halogencyan, så fremt det syntetiseres CSF-derivater som ikke inneholder disse aminosyrene.
CSF og dets derivater som i aminosyresekvensen inneholder
og er tilstrekkelig syrestabile kan, som allerede vist ovenfor, spaltes proteolytisk på i og for seg kjent måte. Herved får man proteiner som N-terminalt inneholder prolin hhv. C-terminalt asparaginsyre. På denne måten kan det altså også syntetiseres modifiserte proteiner.
Asp-Pro-bindingen kan også utformes syrelabil når dette broleddet er (Asp)n-Pro hhv. Glu-(Asp)n-Pro, hvori n er 1 til 3.
Eksempler på enzymatiske spaltninger er også kjente, hvorved også modifiserte enzymer med forbedret spesifisitet kan anvendes (kfr. C.S. Craik et al. , Science 228 (1985) 291-297) .
Fusjonsproteinet utvinnes ved uttrykking i et bakterielt ekspresjonssystem på i og for seg kjent måte. For dette formålet egner seg alle kjente vert-vektorsystemer, som bakterier av slektene Streptomyces, B. subtilis, Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens, spesielt E. coli.
DNA-sekvensen som koder for det ønskede proteinet innbygges på kjent måte i en vektor som sikrer en god ekspresjon i det valgte ekspresj onssystemet.
Herved velges hensiktsmessig promotoren og operatoren fra gruppen trp, lac, tac, Pj^ eller Pr av fag X, hsp, omp eller en syntetisk promotor, som eksempelvis foreslått i det tyske utlegningsskrift nr. 34 30 683 hhv. i EP-A 0 173 194. Fordelaktig er tac-promotor-operator-sekvensen som i dag er kommesielt tilgjengelig (f.eks. ekspresjonsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Eguipment for MOlecular Biology", 1984, side 63).
Ved ekspresjon av fusjonsproteinet kan det vise seg hensiktsmessig å forandre enkelte tripletter av første aminosyrene etter ATG-startkodonet for å forhindre en eventuell basepar-dannelse på området ved mRNA. Slike endringer som utelatelser eller tilsatser av enkelte aminosyrer er kjente for fagman-nen.
Spesielt fordelaktig er CSF-derivater som N-terminalt inneholder prolin, idet slike proteiner er mer stabile mot angrep av proteaser. Spesielt foretrukket er CSF-derivatet som i tilslutning til det N-terinalt adderte prolinet har den samlede CSF-aminosyresekvensen. Overraskende har det imidlertid vist seg at variantene av CSF-molekylet som oppnås ved eliminering av de første 11 aminosyrene er biologisk aktive.
Fordelaktige er også varianter av oppfinnelsen som først fører til fusjonsproteiner som inneholder CSF-sekvensen mer enn en gang, fordelaktig to eller tre ganger. I disse fusjonsproteinene er nødvendigvis ballastandelen redusert og dermed utbyttet av det ønskede proteinet forøket.
Ved American Type Culture Collection er det under nr. ATCC 39900 deponert plasmid pHG23 i E. coli som ble oppnådd ved innbygning av CSF-cDNA-sekvensen i Pst I-snittsetet av pBR322. DNA-sekvensen tilsvarer herved den i fig. 3 (B) av Wong et al. omtalte varianten. Ved innbygning ble det på den ene siden gjort bruk av Pst I-snittsetet nær 5'-enden og av et ved GC-"Tailing<H> innført Pst I-sete ved 3'-enden (EP-A 0 183 350).
Eksempel 1
Direkte ekspresjon av CSF.
Den handelsvanlige vektoren pUC12 åpnes med restriksjonsenzymene Smal og Pst I og det store fragmentet (1) isoleres.
Fra cDNA-sekvensen for CSF utvinnes ved kutting med enzymene Sfa NI og Pst I fragmentet (2) , som ligeres med den syntetiske linkeren (3) og deretter med pUC 12-fragmentet (1) . Det dermed oppnådde hybridplasmidet pW201 (4) inneholder CSF-DNA-sekvensen i tilknytning til startkodonet ATG.
Hybridplasmidet (4) åpnes med Nco I og de overstående endene oppfylles til buttendet fragment (5). Vektoren pUC 12 åpnes med enzymet Eco RI, hvorpå de overstående endene oppfylles. Deretter foregår en behandling med alkalisk oksofosfatase hvorved pUC 12-derivatet (6) oppnås.
Ved liger ing av fragmentet (5) og (6) får man vektorer som inneholder CSF-DNA-sekvensen i begge orienteringer. De betegnes som pW 203 (7).
Fra vektoren (7) isoleres med Eco RI og Rsa I fragmentet (8) som inneholder kodonene for aminosyrene 63 til 127 til CSF. På den andre siden isoleres fra vektoren (4) ved skjæring med Nco I og Rsa I fragmentet (9) som inneholder kodonene for aminosyrene 1 til 61 av CSF.
Plasmidet pH 131/5 (tysk utlegningsskrift 35 14 113, hhv. EP-A 0 198 415, eksempel 1, fig. 1) (10) åpnes med Pvu II, det lille fragmentet fjernes og det større ligeres til plasmid pPH 160 (11), som foreligger i E. coli-celler i høye kopiantall. Plasmidet (11) åpnes med Nco I og Eco RI og det store fragmentet (12) isoleres.
Fragmentene (8) , (9) og (12) ligeres så til hybridplasmidet pW 206 (13). Herved fremstilles igjen kodonet for aminosyren 62.
Det handelsvanlige plasmidet pKK 65-10 (PL Biochemical Inc.) spaltes med Eco RI og fragmentet (14) isoleres, dette inneholder begge terminatorene T 1 og T 2. Dette fragmentet (14) føres inn i det med Eco RI åpnede plasmidet (13) , hvorved plasmidet pW 225 (15) oppnås.
E. coli 24-bakterier som inneholder plasmidet (15) dyrkes i LB-medium (J.H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory", 1972) med 30 til 50 pg/ml ampicillin over natten ved 37°C. Kulturen fortynnes med M9-medium (j.M. Miller, supra) som inneholder 2 000 pm/l casaminosyrer og 1 jjg/l tiamin i forholdet 1:100 og inkuberes ved 37°C under stadig gjennomblanding. Ved en OD60o = 0, 5 hhv. 1 tilsettes indolyl-3-akrylsyre til en sluttkonsentra-sjon på 15 jig/l og det inkuberes 2 til 3 timer hhv. 16 timer. Deretter frasentrifugeres bakteriene. Bakteriene kokes i 5 minutter i en bufferblanding (7M urea, 0,1% SDS, 0,1M natriumfosfat, pH 7,0) og prøver påføres på en SDS-gelelektroforeseplate. Det viser seg at proteinmønsteret for celler hvis trp-operon er indusert, inneholder et nytt protein i området på 14 000 - 18 000 dalton, som ikke finnes ved ikke-induserte celler.
De angitte induksjonsbetingelsene gjelder for rystekulturer; ved større fermenteringer kan tilsvarende endrede OD-verdier og eventuelt lett varierte induktor-konsentrasjoner være hensiktsmessige.
Eksempel 2
Pro°-CSF
Vektoren pUC 12 åpnes med Eco RI og Pst I og det store fragmentet (16) isoleres. Dette fragmentet (16) ligeres med det syntetiske DNA-fragmentet (17.) og fragmentet (2) (eksempel 1; figur 1). Kompetente celler av E. coli JM 103 transfor-meres med ligeringsblandingen og de ønskede klonene utvelges som inneholder plasmid pW 212 (18).
Fra plasmid-DNA utspaltes med Pvu I og Pst I fragmentet (19) som inneholder CSF-sekvensen.
Ved innføring av lac-repressoren (P.J. Farabaugh, Nature 274
(1978) 765-769) i plasmid pKK 177-3 med pUC 8-polylinkeren (Amann et al., Gene 25 (1983) 167; EP-A 0 133 282) får man plasmidet pJF 118 (20) (Fig. 1; kfr. tysk patentpublikasjon P 35 26 995.2, eksempel 6, fig. 6). Dette åpnes på det singulære restriksjonssetet for Ava I og forminskes på i og for seg kjent måte ved eksonuklease-behandling med ca. 1 000 bp. Etter ligering oppnås plasmidet pEW 1000 (21), hvori lac-rep-ressorgenet er fullstendig inneholdt, men som p.g.a. for-minskelsen foreligger i betydelig høyere kopiantall enn ut-gangsplasmidet.
I steden for plasmidet pKK 177-3 kan man også ta utgangspunkt
i det nevnte handelsvanlige plasmidet pKK 223-3, innbygge lac-repressoren og forkorte det oppnådde produktet på tilsvarende måte.
Plasmidet pEW 1000 (21) åpnes med restriksjonsenzymene EcoR I og Sal I og fragmentet (22) isoleres.
Plasmidet pl59/6 (23), fremstilt ifølge det tyske utlegningsskriftet 3 419 995 (EP-A 0 163 249), eksempel 4 (figur 5), åpnes med restriksjonsenzymene EcoR I og Sal I og det lille fragmentet (24) isoleres, som inneholder IL-2-sekvensen.
Ved ligering av fragmentene (22) og (24) får man hybridplasmidet pEW 1001 (25).
Plasmidet (25) åpnes på den ene siden med EcoR I og Pvu I, hvorved fragmentet (26) oppnås, som inneholder den største delen av IL-2-sekvensen. Denne delsekvensen betegnes i fig. med "IL-2".
På den andre siden åpnes plasmidet (25) med EcoR I og Pst I
og det store fragmentet (27) isoleres.
Ved ligering av fragmentene (19), (26) og (27), transforma-sjon av kompetente E. coli 294-celler og seleksjon får man kloner som inneholder plasmidet pW216 (28). Plasmid-DNA1 et karakteriseres ved restriksjons- og DNA-sekvensanalyse.
En kultur som har stått over natten av E. coli-celler som inneholder plasmidet (28), fortynnes med LB-medium (J.H. Miller, supra) som inneholder 50 yg/ml ampicillin, i forhold 1:100
og veksten følges ved hjelp av OD-måling. Ved OD = 0,5 inn-stilles kulturen på lmM isopropyl-B-galactopyranosid (IPTG)
og bakteriene frasentrifugeres etter 150 til 180 minutter.
Bakteriene kokes i 5 minutter i en bufferblanding (7M
urea, 0,1% SDS, 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0) og prøver på-føres på en SDS-gelelektroforeseplate. Etter elektroforese oppnås fra bakterier som inneholder plasmidet (28), et protein-bånd som tilsvarer størrelsen av det ventede fusjonsproteinet. Etter oppslutning av bakteriene ("French Press"; "Dyno"-Muhle) og sentrifugering befinner fusjonsproteinet seg i bunnfallet, slik at det med supernatanten kan fraskilles betydelige mengder av de øvrige proteinene. Etter isolering av fusjonsproteinet settes ved syrespaltning det ventede CSF-derivatet fri, som N-terminalt i tillegg inneholder prolin. Dette viser aktivitet i biologiske forsøk.
De angitte induksjonsbetingelsene gjelder for visse kulturer; ved større fermenteringer kan tilsvarende endrede OD-verdier og eventuelt lett varierte IPTG-konsentrasjoner være hensiktsmessige .
Eksempel 3
Pro<1->CSF(2-127)
Ved ligering av fragmentene (2) (fig. 1) og (16) (fig. 2) med den syntetiske DNA-sekvensen (29) får man hybridplasmidet (30), som bortsett fra den syntetiske DNA-sekvensen tilsvarer plasmidet pw 212 (18).
Fra plasmidet (30) utspaltes med Pvu I og Pst I fragmentet (31), som inneholder CSF-DNA-sekvensen, men hvor kodonet for den første aminosyren er erstattet av et kodon for prolin.
Ved ligering av fragmentet (31) med fragmentene (26) og (27) får man hybridplasmidet pW240 (32). Ved ekspresjon i E. coli, som gjennomføres som i eksempel 2, oppnås et CSF-derivat hvori den første aminosyren er erstattet med prolin. Også dette derivatet viser biologisk aktivitet.
Eksempel 4
CSF(2-127)
Et plasmid, som inneholder CSF-DNA-sekvensen med et Pst-I-restriksjonssete ved 3'-enden, eksempelvis plasmidet pHG23
(ATCC 39900), spaltes med SfaN I og det lineariserte plasmidet (34) oppfylles partielt ved hjelp av Klenow-polymerase og GTP. Med Sl-nuklease avspaltes det overstående nukleotidet A og deretter utspaltes med Pst I fragmentet (35).
Ved ligering av fragmentet (35) med den syntetiske DNA-sekvensen (36) og fragmentet (16) (fig. 2) får man plasmidet (37), som er analogt med plasmid (18).
Fra plasmidet (37) utspaltes med Pvu I og Pst I fragmentet (38). Dette fragmentet ligeres med fragmentene (26) og (27), hvorved plasmidet pW 241 (39) oppnås.
Ved uttrykking ifølge eksempel 2 får man et fusjonsprotein som etter syrespaltning gir et CSF-derivat hvori den første aminosyren mangler. Dette derivatet er biologisk aktivt.
Eksempel 5
CSF(6-127)
Plasmidet pHG23 (33), (eller et tilsvarende plasmid som inneholder CSF-DNA-sekvensen) spaltes først fullstendig med Pst I og deretter partielt med Bst NI og fragmentet (40) isoleres.
De syntetiske DNA-sekvensene (41) og (36) (fig. 4) ligeres først til sekvens (42) og deretter ligeres denne med fragmentet (16) (fig. 2) og fragmentet (40), hvorved plasmidet pW 212
(43) oppnås.
Fra plasmidet (43) isoleres med Pvu I og Pst I fragmentet (44) som inneholder DNA-sekvensen for CSF-derivatet. Dette fragmentet (44) ligeres med fragmentene (26) og (27), hvilket fører til hybridplasmidet pW242 (45).
Ekspresjonen ifølge eksempel 2 fører til et fusjonsprotein hvorfra det etter syrespaltning oppnås et CSF-derivat hvori de første 5 aminosyrene mangler. Også dette produktet er biologisk aktivt.
Eksempel 6
CSF(8-127)
Ligerer man først den syntetiske DNA-sekvensen (36) (fig. 4) med den syntetiske DNA-sekvensen (46) og deretter det derved oppnådde DNA-fragmentet (47) med fragmentene (40) og (16)
så får man hybridplasmidet (48). Fra dette utspaltes med Pvu I og Pst I fragmentet (49) som inneholder DNA-sekvensen for CSF-derivatet. Ligeringen av fragmentene (49), (26) og (27) gir hybridplasmidet pW243 (50), som tilsvarer plasmidet (45) bortsett fra den forkortede DNA-sekvensen for CSF-derivatet.
Ekspresjonen ifølge eksempel 2 fører til et fusjonsprotein som etter syrespaltning gir et CSF-derivat hvori de første 7 aminosyrene mangler. Også dette derivatet er biologisk aktivt.
Eksempel 7
CSF(12-127)
Ligerer man den syntetiske DNA-sekvensen (51) med fragmentene (33) og (16), så får man hybridplasmidet (52). Spaltes fra denne med Pvu I og Pst I sekvensen (53), som inneholder DNA-sekvensen for CSF-derivatet, og ligerer dette fragmentet (53) med fragmentene (26) og (27), så får man hybridplasmidet pW244 (54), som bortsett fra den forkortede CSF-sekvensen tilsvarer plasmidet (45).
Ekspresjonen ifølge eksempel 2 fører til et fusjonsprotein som etter syrespaltning gir et CSF-derivat hvori aminosyrene 1 til 11 er eliminert. Også dette forkortede molekylet er biologisk aktivt.
Eksempel 8
Pro°-CSF(1-12 6)-Asp
DNA-sekvensen (19) (Fig. 2) spaltes delvis med Bst NI og fragmentet (55) isoleres som inneholder den største delen av CSF-sekvensen .
Ved spaltning av plasmidet (33) (fig. 4) (eller et tilsvarende plasmid som inneholder CSF-DNA-sekvensen) først med Pst I og deretter partielt med Bst NI får man DNA-sekvensen (56) som omfatter den største delen av CSF-sekvensen.
Man syntetiserer DNA-sekvensen (57) som fullstendiggjør sekvensen (56) til en DNA-sekvens som koder for et CSF-derivat hvori C-terminal glutaminsyre er erstattet med asparaginsyre.
Vektoren pUC13 åpnes med Pst I og Smal og det store fragmentet (58) isoleres. Ligeres dette restplasmidet (58) med fragmentene (56) og (57), så får man hybridplasmidet pW245 (59) med den C-terminalt modifiserte sekvensen.
Fra plasmidet pW245 (59) utspaltes med Sfa NI og Pst I fragmentet (60) , som inneholder den modifiserte CSF-DNA-sekvensen. Dette fragmentet (60) ligeres med den syntetiske DNA-sekvensen (61)
og fragmentet (55), hvorved DNA-sekvensen (62) oppnås. Denne ligeres med DNA-fragmentene (26) og (27) (fig. 2), hvorved hybridplasmidet pW246 (63) oppnås. Dette plasmidet er gjen-
gitt to ganger i fig. 8a, fra den nederste fremstillingen fremgår aminosyresekvensen av det kodede fusjonsproteinet.
Ekspresjonen ifølge eksempel 2 gir et fusjonsprotein hvorfra
det etter syrespaltning oppstår et CSF-derivat som N-terminalt er forlenget med prolin og hvori i tillegg den siste amino-
syren er erstattet med asparaginsyre. Dette derivatet er biologisk aktivt.
Eksempel 9
Pro°-CSF(1-126)-Asp
Hybridplasmidet (pW246 (63) (fig. 8) spaltes med Eco RI og Pst I o< fragmentet som i tilslutning til IL-2-delsekvensen inneholder begge de modifiserte CSF-sekvensene. D.enne sekvensen (64)
spaltes partielt med Rsa I og begge fragmentene (65) og (66) isoleres. Ved ligering av DNA-sekvensene (27), (65), (67), (61) og (60) får man hybridplasmidet pW247 (68), hvori de ligerte sekvensene er anordnet i den nevnte rekkefølgen.
Ekspresjonen ifølge eksempel 2 gir et fusjonsprotein hvorfra
det samme CSF-derivatet oppstår ved syrespaltning som i eksempel 8.
Eksempel 10
Syntetisk gen (for Pro°-CSF)
Ved i og for seg kjente fremgangsmåter, f.eks. ifølge fosfit-fremgangsmåten (tyske utlegningsskrift nr. 3 327 007, 3 328 793, 3 409 966, 3 414 831 og 3 419 995) syntetiseres de tre "synteseblokkene" I (CSF-I), i figurene betegnet som (69), II (CSF-II), i figurene angitt (70), og III (CSF-III), i figurene angitt som (71). I nukleotidrekken av disse synteseblokkene er de synte-tiserte oligonukleotidene Ia til Im, Ila til Ilf og Illa til lill inntegnet (vedlegg).
Ved valget av nukleotider for det syntetiske genet ble det ikke bare tilveiebragt singulære snittseter ved sammenkoblingssetene for de tre synteseblokkene, men også innenfor genfragmentene en rekke singulære restriksjonsseter. Disse er oppført i de følgende tabellene. Disse singulære restriksjonssetene kan på
i og for seg kjent måte tjene til å bytte ut kodoner for aminosyrer, eller fullstendiggjøre eller utelate disse.
Synteseblokk I ( CSF I)
Synteseblokk I ( CSF I) - forts. Synteseblokk II ( CSF- II)
Synteseblokk III ( CSF- III)
S<y>nteseblokk III (CSF-III) - forts.
De tre synteseblokkene ble først klonet enkeltvis, amplifisert i E. coli og reisolert: Synteseblokken CSF-I (69) innbygges i pUC 12-derivatet (16), hvorved plasmidet pS200 (72) oppnås.
pUC12 åpnes med restriksjonsenzymene Pst I og Hind III og ligeres med det lineariserte plasmidet (73) av synteseblokken CSF-II (70), hvorved plasmidet pS201 (74) oppnås.
pUC13 åpnes med Hind III og Sma I og det lineariserte plasmidet (75) ligeres med CSF-III (71), hvorved plasmidet pS202 (76) oppnås.
De reisolerte synteseblokkene (69), (70) og (71) ligeres så i den med EcoRI og Sma I lineariserte vektoren pUC12 (77), hvorved plasmidet pS203 (78) oppstår. Dette hybridplasmidet amplifiseres - som plasmidene med de enkelte synteseblokkene - i E. coli 79/02 og det syntetiske genet karakteriseres ved restriksjons- og sekvensanalyse.
Plasmidet (78) spaltes partielt med Pvu I og med Barn HI,~og det lille fragmentet (79) med hele CSF-sekvensen isoleres.
Uttrykkingsplasmidet pEWlOOO (21) åpnes med Eco RI og Barn HI og det store fragmentet (80) isoleres. Dette fragmentet (80) ligeres så med fragmentet (26) (se eksempel 2) , som inneholder IL-2 delsekvensen, og det syntetiske genet (79). Herved oppnås plasmidet pS204 (81), som koder for et fusjonsprotein hvori det etter IL-2 delsekvensen først følger et broledd, som tillater syrespaltningen, og deretter aminosyresekvensen av CSF. Syrespaltningen resulterer følgelig i et CSF-derivat, som N-terminalt er forlenget med prolin.
Eksempel 11
CSF(1-12)His(14-121)His(123-127)
Erstattes i synteseblokk I oligonukleotidene Ia og Ib samt Ic
og Id med de syntetiske sekvensene (82) og (83), så får man en modifisert synteseblokk I som koder for en CSF-I-analog, hvori Trp står foran den første aminosyren (Ala) og i posisjon 13 er Trp erstattet med His.
Plasmidet (72) (fig. 10) åpnes med Eco RI og Hpa I og det store fragmentet (84) isoleres. Dette ligeres så med de; syntetiske fragmentene (82) og (83), hvorved plasmidet pS205 (85) oppnås, som koder for dette modifiserte CSF-I (CSF-I').
Man åpner plasmidet (76) (fig. 10) med Hind III og Sal I og isolerer det lille (86) og det store (87) fragmentet. Det lille fragmentet (86) etterskjæres med Taq I og fragmentet (88) isoleres .
Det store fragmentet (87) ligeres så med (88) og det syntetiske fragmentet (89), hvori i posisjon 122 kodonet for Trp er erstattet med His, hvorved man får plasmidet pS206 (90), som koder for det modifiserte CSF-III (CSF-III<1>). Dette plasmidet trans-formeres med E. coli, amplifiseres, reisoleres, skjæres med Hind III og Sal I og det lille fragmentet (91), som koder for CSF-III1, isoleres.
Plasmidet (85) skjæres partielt med Pvu I og med Pst I og det lille fragmentet (92), som koder for CSF-I', isoleres.
Ligeres så fragmentene (22), (26), (92), (70) og (91), så får
man plasmidet pS207 (93). Dette koder for et fusjonsprotein hvori det etter IL-2 delsekvenser følger et broledd, som umiddel-
bart foran den første aminosyren av CSF (Ala) inneholder Trp.
I det i CSF-molekylet Trp i posisjonene 13 cg 122 er er-
stattet med His, kan det så foregå en spaltning av fusjonsproteinet med N-bromsuksinimid. Herved får man CSF-derivatet hvori tryptofan i begge posisjonene er erstattet med histidin.
Eksempel 12
CSF(1-99)Thr(101-12 7)
Erstatter man ved oppbygning av synteseblokken III oligonukleotidene Ille og Ulf med den syntetiske sekvensen (94) og forøvrig går frem som angitt i eksempel 10, så får man et CSF-derivat hvori i posisjonen 100 Ile er erstattet med Thr.
Eksempel 13
CSF(l-35)Ile(3 7-4 5)Leu(4 7-78)Leu-Leu(81-12 7)
Man syntetiserer først oligonukleotidet (95), som i posisjon
3 6 inneholder kodonet for Ile i steden for Met, og oligonukleotidet (96), hvori i posisjon 46 kodonen for Met er erstattet med Leu.
Deretter åpnes plasmidet (72) (fig. 10) med Pvu I og Xma III
og fragmentet (97) isoleres.
Videre syntetiserer man sekvensen (98), hvori kodonet for Met
er anordnet foran kodonet for den første aminosyren.
Ligerer man så fragmentene (16), (98), (97), (95) og (96),
så får man plasmidet pS208 (99). Dette tilsvarer plasmidet (72), men inneholder i CSF-I-sekvensen i posisjon O kodonet for Met, i posisjon 36 et kodon for Ile og i posisjon 46 et kodon for Leu.
Man syntetiserer videre sekvensen (100), som i posisjonene 79
og 80 koder for Leu i stedet for Met.
Åpner man plasmidet (76) (fig. 10) med Hind III og Nhe I, isolerer det store fragmentet (101) og ligerer dette med den syntetiske sekvensen (100), så får man plasmidet pS209 (102),
som tilsvarer plasmidet (76) bortsett fra utvekslingen av begge kodonene i posisjon 79 og 80 i CSF-III-sekvensen.
Deretter skjæres plasmidet (93) (fig. Ila) partielt med Pvu I og med Sal I, og det store fragmentet (103) isoleres. Plasmidet (99) åpnes også partielt med Pvu I og Pst I og det lille fragmentet (104) isoleres, dette inneholder den modifiserte CSF-I-sekvensen. Videre åpner man plasmidet (102) med Hind III og Sal I og isolerer det lille fragmentet (105), som omfatter den modifiserte CSF-III-sekvensen.
Videre ligerer man fragmentene (103), (104), (70) og (105), hvorved plasmidet pS210 (106) oppnås, som tilsvarer plasmidet (93) (fig. Ila), men koder for et CSF-derivat hvori Met står i posisjon 0 og på den andre siden de fire Met-restene er erstattet med andre aminosyrer.
Transformerer man med plasmidet (106) E. coli, så får man etter induksjon et fusjonsprotein som er spaltbart med halogencyan hvorved det oppnås et CSF-derivat som i posisjon 36 inneholder Ile og i posisjonene 46, 79 og 80 inneholder Leu.
Eksempel 14
CSF(1-35)Ile(37-45)Leu(47-78)Leu(81-127)
Dersom man følger fremgangsmåten fra eksempel 13, men isteden for den syntetiske sekvensen (100) anvender den syntetiske sekvensen (107), så får man et utelatelsesprodukt hvori Ile står i posisjon 36 og Leu står i posisjon 46 og hvori isteden for aminosyrene 79 og 80 aminosyren Leu forekommer.
Eksempel 15
CSF(l-3 5)Ile(3 7-4 5)Leu(4 7-78)-(81-127)
Dersom man følger fremgangsmåten fra eksempel 13, men isteden for den syntetiske sekvensen (100) anvender den syntetiske sekvensen (108), så får man et utelatelsesprodukt hvori Ile står i posisjon 36 og Leu står i posisjon 46 og aminosyrene i posisjonene 79 og 80 er utelatt.
Claims (4)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive, humane granulocytt-makrof ag-"koloni-stimulerende"-faktorproteiner (GM-CSF) med formelen
hvori (As)x helt eller delvis betyr de første 11 aminosyrene i den naturlige GM-CSF-sekvensen og Z betyr Glu eller Asp, i det følgende betegnet "CSF",
karakterisert ved at man bygger inn et for CSF-kodende gen i en bakteriell ekspresjonsvektor, dermed transformerer bakterier, spesielt E. coli, og bringer dette til uttrykking deri, eller eventuelt at man uttrykker CSF i form av et fusjonsprotein, med en N-terminalandel av IL-2, som i det vesentlige tilsvarer de første 100 aminosyrene av IL-2, som deretter spaltes enzymatisk eller kjemisk.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fusjonsproteinet N-terminalt nabostilt CSF inneholder aminosyresekvensen
(Glu)m-(Asp)n-Pro,
hvori m er null eller 1 og n er 1, 2 eller 3, og spaltes proteolytisk.
3.
Bakteriell ekspresjonsvektor som er i stnd til å uttrykke GM-CSF av formelen
hvori (As)x helt eller delvis betyr de første 11 aminosyrene i den naturlige GM-CSF-sekvensen og Z betyr Glu eller Asp, karakterisert ved at den inneholder et strukturelt gen som koder for CM-CSF i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som muliggjør ekspresjon i en bakterievert.
4.
Bakteriecelle, spesielt E. coli, karakterisert ved at den inneholder en vektor ifølge krav 3.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853545568 DE3545568A1 (de) | 1985-12-21 | 1985-12-21 | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO865191D0 NO865191D0 (no) | 1986-12-19 |
| NO865191L NO865191L (no) | 1987-06-22 |
| NO177270B true NO177270B (no) | 1995-05-08 |
| NO177270C NO177270C (no) | 1995-08-16 |
Family
ID=6289242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO865191A NO177270C (no) | 1985-12-21 | 1986-12-19 | Fremg. for fremstilling av terapeutisk aktive, humane granulocytt-makrofag-"kolonistimulerende"-faktorproteiner (GM-CSF), bakteriell ekspresjonvektor som er i stand til å uttrykke GM-CSF samt bakteriecelle inneholdende vektoren |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0228018B1 (no) |
| JP (1) | JP2575367B2 (no) |
| KR (1) | KR940005585B1 (no) |
| AT (1) | ATE71144T1 (no) |
| AU (2) | AU601959B2 (no) |
| CA (1) | CA1341197C (no) |
| DE (2) | DE3545568A1 (no) |
| DK (1) | DK170346B1 (no) |
| ES (1) | ES2055686T3 (no) |
| FI (1) | FI91168C (no) |
| GR (1) | GR3003999T3 (no) |
| HU (1) | HU202584B (no) |
| IE (1) | IE59779B1 (no) |
| IL (1) | IL81020A (no) |
| NO (1) | NO177270C (no) |
| PT (1) | PT83972B (no) |
| ZA (1) | ZA869557B (no) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5078996A (en) * | 1985-08-16 | 1992-01-07 | Immunex Corporation | Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| WO1987002060A1 (en) * | 1985-10-03 | 1987-04-09 | Biogen N.V. | Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and processes for producing them in high yields in microbial cells |
| DE3712985A1 (de) * | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
| US5359035A (en) * | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
| JP2583770B2 (ja) * | 1986-09-17 | 1997-02-19 | 大塚製薬株式会社 | 遺伝子 |
| JPS6420097A (en) * | 1987-03-02 | 1989-01-24 | Sumitomo Chemical Co | Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| PT87133B (pt) * | 1987-04-02 | 1992-07-31 | Amrad Corp Ltd | Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif |
| AU609128B2 (en) * | 1987-04-02 | 1991-04-26 | Amrad Operations Pty. Limited | Leukaemia-inhibitory factor |
| WO1988010310A1 (en) * | 1987-06-25 | 1988-12-29 | Immunex Corporation | Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| JPH0649655B2 (ja) * | 1987-11-12 | 1994-06-29 | シェリング・コーポレーション | Ｇｍ‐ｃｓｆによる骨形成の促進 |
| GB2212159B (en) * | 1987-11-13 | 1992-01-22 | British Bio Technology | Synthetic gene for human granulocyte/macrophage colony stimulating factor. |
| JPH03503897A (ja) * | 1988-04-21 | 1991-08-29 | メドベット・サイエンス・プロプライアテリー・リミテッド | ひとｇｍ‐ｃｓｆ変異形類 |
| WO1990012877A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-01 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| WO1991002754A1 (en) * | 1989-08-22 | 1991-03-07 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising gm-csf and il-3 |
| NZ236819A (en) * | 1990-02-03 | 1993-07-27 | Max Planck Gesellschaft | Enzymatic cleavage of fusion proteins; fusion proteins; recombinant dna and pharmaceutical compositions |
| US5270181A (en) * | 1991-02-06 | 1993-12-14 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
| WO1997012054A1 (fr) * | 1995-09-28 | 1997-04-03 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Lymphokine chemotactique neutrophile, medicament et necessaire de diagnostic de la granulopenie hypersensible aux medicaments la contenant |
| KR100448021B1 (ko) * | 2001-12-28 | 2004-09-08 | 크레아젠 주식회사 | 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자 발현벡터 ｐＧＭ-ＣＳＦ로 형질전환된 대장균 및 상기 마우스 과립구 대식세포 콜로니 촉진인자의 대량생산방법 |
| US9157084B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-13 | Gradalis, Inc. | Furin-knockdown bi-functional RNA |
| KR101589951B1 (ko) | 2009-12-23 | 2016-01-29 | 그래댈리스, 인코포레이티드 | 푸린―녹다운 및 ｇｍ―ｃｓｆ―증강된 (ｆａｎｇ) 암 백신 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4438032A (en) * | 1981-01-30 | 1984-03-20 | The Regents Of The University Of California | Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom |
| SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
| IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| AU594014B2 (en) * | 1984-03-21 | 1990-03-01 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant DNA molecules |
| UA39161C2 (uk) * | 1984-07-06 | 2001-06-15 | Новартіс Аг | Рекомбінантний білок gm-csf для збільшення продукції гранулоцитів і макрофагів у пацієнтів, вектор і кднк, що його кодують |
| ZA856108B (en) * | 1984-10-29 | 1986-10-29 | Immunex Corp | Cloning of human granulocyte-macrophage colony simulating factor gene |
| AU588819B2 (en) * | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| KR920003822B1 (ko) * | 1984-11-20 | 1992-05-15 | 쉐링 바이오텍 코포레이션 | 인체 과립구 대식 세포 및 호산성 세포 성장 인자 활성을 나타내는 폴리펩티드 |
| WO1987002060A1 (en) * | 1985-10-03 | 1987-04-09 | Biogen N.V. | Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and processes for producing them in high yields in microbial cells |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE3636903A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-02 | Hoechst Ag | Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil |
-
1985
- 1985-12-21 DE DE19853545568 patent/DE3545568A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-12-16 AT AT86117484T patent/ATE71144T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-16 DE DE8686117484T patent/DE3683267D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-16 EP EP86117484A patent/EP0228018B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-16 ES ES86117484T patent/ES2055686T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-18 FI FI865186A patent/FI91168C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-12-18 IL IL8102086A patent/IL81020A/en active IP Right Grant
- 1986-12-19 DK DK619086A patent/DK170346B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 NO NO865191A patent/NO177270C/no unknown
- 1986-12-19 AU AU66756/86A patent/AU601959B2/en not_active Ceased
- 1986-12-19 PT PT83972A patent/PT83972B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 ZA ZA869557A patent/ZA869557B/xx unknown
- 1986-12-19 IE IE333586A patent/IE59779B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 CA CA000525856A patent/CA1341197C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-19 HU HU865355A patent/HU202584B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-12-20 KR KR1019860011011A patent/KR940005585B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-12-22 JP JP61306186A patent/JP2575367B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-09-19 AU AU62683/90A patent/AU637139B2/en not_active Ceased
-
1992
- 1992-03-11 GR GR920400222T patent/GR3003999T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO177270B (no) | Fremg. for fremstilling av terapeutisk aktive, humanegranulocytt-makrofag-"kolonistimulerende"-faktorproteiner (GM-CSF), bakteriell ekspresjonvektor som er i stand til å uttrykke GM-CSF samt bakteriecelle inneholdende vektoren | |
| JP2566933B2 (ja) | 真核細胞融合タンパク質、その生産及び用途、並びに方法 | |
| JP7252280B2 (ja) | 新規なインスリンアナログ及びその用途 | |
| JP2541761B2 (ja) | ミュレル管抑制物質様ポリペプチドおよびその製造方法 | |
| DK170741B1 (da) | Bifunktionelle proteiner, deres fremstilling, et lægemiddel deraf og anvendelse deraf til fremstilling af et lægemiddel | |
| NZ199391A (en) | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin | |
| HU220098B (hu) | Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok | |
| HU209747B (en) | Process for producing fusion proteins with eukaryotic ballastparts | |
| JPH04504953A (ja) | ヒトリラキシンの単離のための方法および組成物 | |
| EP0409098A1 (en) | The expression and secretion of mature human beta interleukin-1 in bacillus subtilis and means and methods for its achievement | |
| JP2568383B2 (ja) | ポリペプチドをコード化するｄｎａ配列 | |
| JPH04182497A (ja) | ポリペプチド | |
| JPH03297388A (ja) | 新規なｔｎｆ変異体、その製造法及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤 | |
| JP2845558B2 (ja) | メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列 | |
| JPH04182498A (ja) | ポリペプチド | |
| JP2887060B2 (ja) | グリセンチンの生産方法 | |
| PT1704234E (pt) | Produção do péptido tipo glucagon 2 e de análogos do mesmo | |
| JPS62501071A (ja) | 成長因子活性を有する新規なポリペプチド及び該ポリペプチドをコ−ドする核酸配列 | |
| KR890003715B1 (ko) | 신규한 플라스미드 제조방법 및 그를 함유한 균주를 배양하여 인터루킨-2 또는 변이 인터루킨-2를 생산하는 방법 | |
| Santos et al. | Obtaining biologically active IL-15 in Escherichia coli | |
| FI97239B (fi) | Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi | |
| KR19990009995A (ko) | 신규한 인간성장호르몬방출인자-인간상피세포성장인자 융합유전자, 이의 발현벡터 및 이를 이용한 인간성장호르몬방출인자의 제조방법 | |
| JP2003189865A (ja) | 繊維芽細胞成長因子をコードする組み換えベクター | |
| Sachse et al. | Synthesis, molecular cloning and expression of genes coding for atrial natriuretic factors from rat and human | |
| JPS62248498A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド |