JP7252280B2 - 新規なインスリンアナログ及びその用途 - Google Patents
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Description
vitro)効力が増加したインスリンアナログ及びその用途に関する。
要であり、インスリン投与により血糖を正常レベルに調節することができる。
ン作用の薬動学的効果の面で広く研究されている。
ナログが、天然型インスリンに比べて著しく増加したインビトロ効力を示し、糖尿病の治療に効果的に用いられることを確認し、本発明を完成した。
一般式(1)
Xaa1は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa2は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa3は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa4は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa6は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa7は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
Xaa8は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであるか、不在であり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である
(ここで、配列番号1のA鎖及び配列番号2のB鎖を含むペプチドは除く)。
のB鎖で、Xaa8はチロシンであり、Xaa9はフェニルアラニンであり、Xaa10はトレオニンであり、Xaa11はプロリンであることを特徴とする。
タミンであり、Xaa3はセリンであり、Xaa4はグルタミン酸であり、Xaa5はロイシンであり、Xaa6はチロシンであり、Xaa7はアスパラギンであり、配列番号4のB鎖で、Xaa8はチロシンであり、Xaa9は不在であり、Xaa10はトレオニンであり、Xaa11はプロリンであることを特徴とする。
タミンであり、Xaa3はセリンであり、Xaa4はアラニンであり、Xaa5はロイシンであり、Xaa6はチロシンであり、Xaa7はアスパラギンであり、配列番号4のB鎖で、Xaa8はグルタミン酸であり、Xaa9は不在であり、Xaa10はトレオニンであり、Xaa11はプロリンであることを特徴とする。
本発明に係るインスリンアナログは、配列番号3のA鎖でXaa4がグルタミン酸であり、配列番号4のB鎖でXaa9がフェニルアラニンであるか;
配列番号3のA鎖でXaa4がアスパラギンであり、配列番号4のB鎖でXaa9がフェニルアラニンであるか、
配列番号3のA鎖でXaa4がグルタミン酸であり、配列番号4のB鎖でXaa9が不在であるか、
配列番号3のA鎖でXaa4がアラニンであり、配列番号4のB鎖でXaa8がグルタミン酸であり、Xaa9が不在であることを特徴とするが、これに限定されない。
a)前記インスリンアナログペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階;
b)前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を収得する段階;
c)前記形質転換体を培養して、インスリンアナログペプチドを発現させる段階;
d)発現されたインスリンアナログペプチドを分離及び精製する段階。
Gly‐Ile‐Val‐Glu‐Gln‐Cys‐Cys‐Thr‐Ser‐Ile‐Cys‐Ser‐Leu‐Tyr‐Gln‐Leu‐Glu‐Asn‐Tyr‐Cys‐Asn(配列番号1)
B鎖:
Phe‐Val‐Asn‐Gln‐His‐Leu‐Cys‐Gly‐Ser‐His
‐Leu‐Val‐Glu‐Ala‐Leu‐Tyr‐Leu‐Val‐Cys‐Gly‐Glu‐Arg‐Gly‐Phe‐Phe‐Tyr‐Thr‐Pro‐Lys‐Thr(配列番号2)
遺伝子組換え法だけでなく、固相(solid phase)方法でも製造することができ、これに
制限されるものではない。
、インスリン誘導体(insulin derivative)、インスリン断片(insulin fragment)、インスリン変異体(insulin variant)などをすべて含む。
ので、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドも、本発明の範囲に含まれる。
Aldrich、ChemPep及びGenzymepharmaceuticalsが含まれてもよい。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと典型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のAmerican peptide company、Bachemや韓国のAnygenを通じて合成及び購入可能である。
れたり、欠失されたものであってもよい。
よい。
一般式(1)
Xaa1は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa2は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa3は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa4は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa6は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa7は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
Xaa8は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであるか、不在であり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である。
前記一般式(1)において、
Xaa1は、グリシンであり、
Xaa2は、グルタミンであり、
Xaa3は、セリンであり、
Xaa4は、アラニン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、ロイシンであり、
Xaa6は、チロシンであり、
Xaa7は、アスパラギンであり、
前記一般式(2)において、
Xaa8は、チロシンまたはグルタミン酸であり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに制限されない。
前記一般式(1)において、
Xaa1は、グリシンであり、
Xaa2は、グルタミンであり、
Xaa3は、セリンであり、
Xaa4は、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、ロイシンであり、
Xaa6は、チロシンであり、
Xaa7は、アスパラギンであり、
前記一般式(2)において、
Xaa8は、チロシンであり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに制限されない。
インスリンアナログのグルコース吸収能(glucose uptake)を意味するもので、本発明では、脂肪細胞に分化させたマウス由来の3T3 L1細胞を対象にグルコース吸収能のE
C50を測定した結果で表される。
とができ、自動化されたDNA合成器を用いる標準合成技術を用いて製造しうる。
酸配列またはそれをコードする塩基配列との類似度を示すためのものであって、本発明のアミノ酸配列または塩基配列と前記のようなパーセント以上の同一配列を有する配列を含む。このような相同性は2つの配列を肉眼で比較して決定してもよいが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析してくれる生物情報アルゴリズム(bioinformatic algorithm)を用いて決定してもよい。前記二つのアミノ酸配列間の相同性はパーセントで示
してもよい。有用な自動化されたアルゴリズムは、Wisconsin Genetic
s Software Package(Genetics Computer Group、Madison、W、USA)のGAP、BESTFIT、FASTAとTFASTAコンピュータソフトウェアモジュー
ルで利用可能である。前記モジュールの自動化された配列アルゴリズムは、Needleman&WunschとPearson&LipmanとSmith&Waterman配列の配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLASTとCLUSTAL Wを含
むソフトウェアで自動化されている。
する核酸を含む組換えベクターを製造することができるが、前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換(transformation)または形質感染(transfection)させることで、本発明のインスリンアナログを収得してもよい。
6プロモーター、trpプロモーター及びT7プロモーターなど)、解読の開始のためのリボゾーム結合部位及び転写/解読終結配列を含むことが一般的である。
、pLAFR1、pHV14 、pGEXシリーズ、pETシリーズ、pPICZαシリ
ーズ、pUC19など)、ファージ(例えば、λgt4・λB、λ-Charon、λΔ
z1及びM13など)またはウイルス(例えば、SV40など)を操作して製作されうる。
アデニル化配列)を一般的に有する。
、USA)、マルトース結合タンパク質(NEB、USA)、FLAG(IBI、USA)及び6つのヒ
スチジン(hexahistidine)などがあるが、前記例によって目的タンパク質の精製のため
に必要な配列の種類が制限されるものではない。
殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリア媒介形質転換法、PEGを用いた形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥/
抑制媒介された形質転換法などがある。
リキア(Escherichia)属細菌;バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のようなバチルス(Bacillus)属細菌;シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のようなシュードモナス(Pseudomonas)属細菌;ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、 シゾサッカロミセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe)のような酵母;スポドプテラ・フルギペルダ(SF9)
のような昆虫細胞;と及びCHO、COS、BSCなどのような動物細胞がある。好ましくは、宿主細胞に大腸菌を用いる。
細胞内封入体形態で発現させるためにpET22bベクターを制限酵素NdeI及びBamHIで処理して、信号配列を除去し、インスリンアナログのPCR増幅産物を同じ制限酵素NdeIとBamHIで処理して分離された個々のDNAをT4 DNAリガーゼを
用いて、pET22bクローニングベクターに挿入した。前記結果として得られた発現ベクターを、それぞれpET22b‐インスリンアナログ1~4と命名した。
a)インスリンアナログをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階;
b)前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を収得する段階;
c)前記形質転換体を培養して、インスリンアナログを発現させる段階;及び
d)発現されたインスリンアナログを分離及び精製する段階を含む、インスリンアナログの製造方法を提供する。
d‐2)破砕された細胞溶解物から発現されたインスリンアナログペプチドを回収してリフォールディングする段階;
d‐3)リフォールディングされたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する段階;
d‐4)精製されたインスリンアナログペプチドをトリプシン及びカルボキシぺプチダーゼBで処理する段階;
d‐5)処理されたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーで順次的に精製する段階 。
して用いてもよく、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤などを使用してもよい。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造してもよい。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウエハーなどの形態で製造してもよく、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造してもよい。その他にも溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル及び徐放性製剤などで剤形化してもよい。
天然型インスリンのA鎖及び/またはB鎖のアミノ酸を変形させたインスリンアナログ
を作製するために、その変形が導入されたインスリンアナログの増幅のための正方向及び逆方向プライマーペアを合成した後、プロインスリンcDNAを鋳型としてPCRを行った。このとき、鋳型としては、プロインスリンcDNA(SC128255、OriGene)(参照配
列:BC005255.1及びAAH05255)がpET22bベクター(Novagen)
にクローニングされたものを用い、インスリンの円滑な組換え発現のためにクローニングされたプロインスリンcDNAのN末端に融合パートナー(N-terminal fusion partner
)としてMet Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Argの
アミノ酸配列(配列番号24)をコードする配列番号23の塩基配列(ATG GCA ACA ACA TCA ACA GCA ACT ACG CGT)を挿入した。
インスリンアナログ2は、配列番号1で表される天然型インスリンのA鎖アミノ酸配列で14番目のアミノ酸であるチロシンのアスパラギンへの置換を含むものであり、
インスリンアナログ3は、配列番号1で表される天然型インスリンのA鎖アミノ酸配列で14番目のアミノ酸であるチロシンのグルタミン酸への置換と配列番号2で表される天然型インスリンのB鎖アミノ酸配列で25番目のアミノ酸であるフェニルアラニンの欠失を含むものである。
置換と、25番目のアミノ酸であるフェニルアラニンの欠失を含むものである。
のアミノ酸であるチロシンをアスパラギンに置換するためのものであり、配列番号9及び10のプライマーペアは、天然型インスリンのB鎖アミノ酸配列で25番目のアミノ酸であるフェニルアラニンを欠失させるためのものであり、配列番号11及び12のプライマーペアは、天然型インスリンのA鎖アミノ酸配列で14番目のアミノ酸であるチロシンをアラニンに置換するためのものであり、配列番号13及び14のプライマーペアは、天然型インスリンのB鎖アミノ酸配列で16番目のアミノ酸であるチロシンをグルタミン酸に置換するものである。
100pMプライマーそれぞれ1mlずつ、2.5mM dNTP 5ml、pfxポリメラーゼ10単位(Invitrogen社、USA)及び10×緩衝液を混合して反応溶液を製造し、
95℃で30秒間の初期変性に続いて95℃で30秒、55℃で30秒及び68℃で6分のアニーリング過程を18回繰り返した後、最後に68℃で5分間反応させた。これから収得したPCR増幅産物をゲル抽出キット(キアゲン、ドイツ)を用いて抽出した後、制限酵素NdeIとBamHIで処理して挿入切片を製造した。続いて、pET22bベクター(Novagen、USA)を同一の制限酵素で切断し、同一のゲル抽出キットを用いて抽出した。このように用意されたベクターに前記挿入切片をT4リガーゼを用いて連結させて発現ベクターpET22b‐インスリンアナログ1~4を製造した。前記発現ベクターは、T7プロモーターの調節下でインスリンアナログ1~4のアミノ酸配列をコードする核酸を含み、宿主内でインスリンアナログのタンパク質を封入体形態で発現させうる。
T7プロモーターの調節下で、本発明に係るインスリンアナログの組換え発現を下記のように行った。前記実施例1で製造されたそれぞれのインスリンアナログ発現ベクターに大腸菌BL21‐DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3)(Novagen, USA)を形質転換した。形質転換は、前記大腸菌BL21‐DE3のメーカーであるNovagenで推奨する方法に従って行われた。インスリンアナログ発現ベクターが形質転換された個々の単一コロニーをとり、50μg/mlのアンピシリン含有2×LB(Luria Broth、LB)培地に接種した後、37℃で15時間培養した。組換え菌株の培養液と30%グリセロールを含む2xLB培地を1:1(v/v)の割合で混合して、各1mlずつクラ
イオチューブ(cryo-tube)に分注して、-140℃で保管した。これを本発明に係るイン
スリンアナログの組換え生産のための細胞ストック(cell stock)として用いた。
vvm)、及び攪拌速度500rpmに設定し、30%アンモニア水を使用してpHを6.7に維持させた。発酵の進行は、培養液内の栄養素が制限されたとき、追加の培地(feeding solution)を添加して、流加培養を行った。OD値により菌株の成長をモニタリングし、OD値が100以上に達した場合、最終的な濃度500μMのIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)を導入した。培養はIPTG導入後、約23~25時間までさらに進行して、培養終了後、遠心分離器を使用して組換え菌株を収穫し、これを以後の使用時まで-80℃で保管した。
前記実施例2で形質転換体から発現させた組換えインスリンアナログを分離、精製するために、まず不溶性封入体形態で発現されたインスリンアナログを可溶性形態に変えるため、下記のように細胞を破砕してリフォールディングを行った。
具体的に、細胞ペレット100g(wet weight)を1Lの溶解緩衝液(50mM Tr
is-HCl(pH 9.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl及
び0.5%トリトンX-100)に再浮遊した後、微細溶液化(microfluidizer)プロセ
ッサーM-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)を用いて15,000ps
iの圧力を加えて細胞を破砕した。破砕された細胞溶解物を7,000rpmで4℃で20分間遠心分離して上澄液を捨て、3Lの洗浄緩衝液(0.5%トリトンX-100及び
50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl、1mM EDTA)に
再浮遊した。7,000rpmで4℃で20分間遠心分離してペレットを蒸留水に再浮遊した後、同様の方法で遠心分離した。このことからペレットをとり、400mlの緩衝液(1M グリシン、3.78g システイン-HCl、pH 10.6)に再浮遊した後、常温で1時間攪拌した。再浮遊された遺伝子組換えインスリンアナログを回収するために、400mlの8M尿素を追加した後、40℃で1時間撹拌した。可溶化された組換えインスリンアナログのリフォールディング(refolding)のために7,000rpmで4℃で
30分間遠心分離した後、上澄液を取り、ここで7.2Lの蒸留水を連動ポンプ(peristaltic pump)を用いて、1000ml/時間の流速で添加し、4℃で16時間攪拌した。
45%エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)で平衡化された陽イオン交換カラム(Source S、GE Healthcare社)に、前記実施例<3-1>でリ
フォールディングが終結した試料をローディングして結合させた。続いて塩化カリウム0.5Mと45%エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)を用いて濃度が0%→100%になるように10xカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
前記実施例<3-2>で脱塩カラム(Desalting column)で溶出された試料から塩を除去し、緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 8.0)に交換した。得られた試料の
タンパク質の量の1000モル比に該当するトリプシン(trypsin)と2000モル比に
該当するカルボペプチダーゼ(carboxypeptidase)Bを添加した後、16℃で16時間攪
拌した。1Mクエン酸ナトリウム(pH2.0)を用いてpHを3.5に下げて反応を終結した。
前記実施例<3-3>で反応が終結した試料を45%エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)で平衡化された陽イオン交換カラム(Source S、GE Healthcare社)に再びローディングして結合させた。続いて塩化カリウム0.5Mと45%
エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)を用いて濃度が0%→100%になるように10xカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
前記実施例<3-4>で脱塩カラムで溶出された試料から塩を除去し、緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.5)に交換した。これから収得された試料で純粋なインスリンアナログを分離するために、10mMトリス緩衝液(pH7.5)で平衡化された陰イオン交換カラム(Source Q、GE Healthcare社)にローディングして結合させた。続い
て、0.5M塩化ナトリウムを含む10mMトリス緩衝液(pH7.5)を用いて濃度が0%→100%になるように10xカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
、逆相及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析し、前記結果をそれぞれ図1及び2に示した。また、アミノ酸の変形は、ペプチドマップ化(mapping)と各ピークの分子
量分析を通じて確認し、これは図3に示した。
前記実施例3で分離、精製されたインスリンアナログのインビトロ効力を測定するために、脂肪細胞に分化させたマウス由来の3T3‐L1細胞株を用いたグルコース吸収能(glucose uptake、または脂質合成能)試験を実施した。3T3‐L1細胞株(ATCC、CL-173)を10%NBCS(新生仔牛血清)を含むDMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium、Gibco、Cat.No、12430)培地を用いて、週2~3回継代培養し維持した。3T3
‐L1細胞株を分化用培地(10%FBSを含むDMEM)に懸濁した後、48ウェルプレートにウェル当たり5×104細胞となるように接種した後、37℃で48時間培養した。脂肪細胞への分化のために分化用培地に1μg/mlのヒトインスリン(Sigma, Cat.
No. I9278)、0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879)、1μMデキサメタゾン(Dexamethasone、Sigma, Cat. No. D4902)を混合し、既存の培地を除去した後、ウェル当たり250μlずつ添加した。48時間後、分化用培地に1μg/mlのヒトインスリンのみを添加した培地に再度交換した。以後、48時間ご
とに1μg/mlのヒトインスリンを添加した分化用培地に交換しながら7~9日間、脂
肪細胞への分化が誘導されることを確認した。
た培地のグルコース残量を測定するために、200μlの培地を取って、D‐PBSでそれぞれ5倍希釈した後、GOPOD分析(GOPOD Assay Kit、Megazyme、Megazyme, Cat. No. K-GLUC)を行った。グルコース標準溶液の吸光度を基準に培地の残りのグルコース濃度を換算し、インスリンアナログのグルコース吸収能のEC50をそれぞれ算出し、下記表4に示した。
Claims (9)
- 請求項1に記載のインスリンアナログペプチドをコードする、核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項3に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、形質転換体。
- 前記形質転換体が、大腸菌である、請求項4に記載の形質転換体。
- 下記段階を含む請求項1に記載のインスリンアナログペプチドを製造する方法:
a)請求項1に記載のインスリンアナログペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階;
b)前記組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を収得する段階;
c)前記形質転換体を培養してインスリンアナログペプチドを発現させる段階;及び
d)発現されたインスリンアナログペプチドを分離及び精製する段階。 - 前記宿主細胞が、大腸菌である、請求項6に記載の方法。
- 前記分離及び精製が、
d‐1)培養液から形質転換体細胞を収穫して破砕する段階;
d‐2)破砕された細胞溶解物から前記発現されたインスリンアナログペプチドを回収してリフォールディングする段階;
d‐3)リフォールディングされたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する段階;
d‐4)精製されたインスリンアナログペプチドをトリプシン及びカルボキシぺプチダーゼBで処理する段階;及び
d‐5)処理されたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーで順次的に精製する段階を含むものである、請求項6に記載の方法。 - 有効成分として請求項1に記載のインスリンアナログペプチドと、薬剤学的に許容可能な担体を含む、糖尿病治療用薬学的組成物。
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