CN113396157A - 具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。

Description

具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物
本文提供了包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。
背景技术
在世界范围内，超过4亿人患有1型或2型糖尿病。1型糖尿病用胰岛素替代治疗。与1型糖尿病相比，2型糖尿病基本没有胰岛素缺乏，但是在大量病例中，尤其是在晚期，2型糖尿病患者用胰岛素治疗。
在健康人中，胰腺的胰岛素释放与血糖浓度严格相关。血糖水平升高，如饭后发生，并且通过相应的胰岛素分泌增加迅速补偿。在空腹状态下，血浆胰岛素水平降至基础值，这足以保证连续向胰岛素敏感的器官和组织供应葡萄糖并且在夜间保持低的肝葡萄糖产生。通常，通过外源性(主要是皮下)施用胰岛素代替内源性胰岛素分泌不能达到上述血糖的生理性调节的质量。可能发生血糖向上或向下的偏差，这可能以最严重的形式危及生命。由此可得出，改善的糖尿病疗法主要旨在将血糖尽可能接近地保持在生理范围内。
人胰岛素是51个氨基酸的多肽，其分为2条氨基酸链：具有21个氨基酸的A链和具有30个氨基酸的B链。所述链借助2个二硫桥彼此连接。在A链的位置6与11处的半胱氨酸之间存在第三个二硫桥。目前用于治疗糖尿病的一些产品是胰岛素类似物，即胰岛素变体，其序列与人胰岛素序列的不同之处在于A链和/或B链中的一个或多个氨基酸取代。
与许多其他肽激素一样，人胰岛素的体内半衰期很短。因此，它被频繁施用，这与患者的不适相关。因此，需要这样的胰岛素类似物，其具有增加的体内半衰期，并且因此具有延长的作用持续时间。
当前有不同的方法来延长胰岛素的半衰期。
一种方法是基于开发在低pH下可溶，但是在生理pH下相对于天然胰岛素具有降低的溶解度的配制品。通过在B链的C末端添加两个精氨酸来增加胰岛素类似物的等电点。两个精氨酸的添加与A21处的甘氨酸取代的组合(甘精胰岛素)提供了具有延长的作用持续时间的胰岛素。胰岛素类似物在皮下部位注射时在锌的存在下沉淀并且缓慢溶解，这导致甘精胰岛素的持续存在。
在另一种方法中，使长链脂肪酸基团与胰岛素的LysB29的ε氨基缀合。此基团的存在允许胰岛素通过非共价的可逆结合与血清白蛋白附接。因此，此胰岛素类似物相对于人胰岛素具有显著延长的时间-作用曲线(参见例如May er等,Inc.Biopolymers(Pept Sci)88:687-713,2007；或WO 2009/115469)。
WO 2016/006963公开了与人胰岛素相比具有降低的胰岛素受体介导的清除率的胰岛素类似物。
WO 2018/056764公开了与人胰岛素相比具有降低的胰岛素受体介导的清除率的胰岛素类似物。
WO 2008/034881公开了蛋白酶稳定的胰岛素类似物。
为了增加药物的作用持续时间，半衰期起着主要作用。半衰期(t1/2)与分布体积除以清除率成比例。在人胰岛素的情况下，清除主要是通过与胰岛素受体的结合、内化和随后的降解来驱动的。
因此，需要这样的胰岛素类似物，其具有降低的胰岛素受体结合活性，并且因此具有降低的受体介导的清除率，但是具有允许充分降低体内血糖水平的信号转导活性。
发明内容
本文提供了长效胰岛素类似物，其具有非常低的结合亲和力(因此具有较低的清除率)，同时仍维持高信号转导。
出乎意料地是，在作为本发明的基础的研究的上下文中显示，在人胰岛素的位置B16和/或B25处用疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和色氨酸)取代导致胰岛素受体结合活性降低(与亲本胰岛素的胰岛素受体结合活性相比，参见实施例)。观察到用支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)取代对胰岛素受体结合活性的影响最强。有趣的是，基于它们的胰岛素受体亚型B(IR-B)结合亲和力，在这些位置处(如位置B25处)具有此类取代的胰岛素类似物显示出与预期相比高达6倍的信号转导增强(参见实施例)。此外，一些测试的胰岛素类似物显示出对α-胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶D和胰岛素降解酶的改善的蛋白水解稳定性(参见实施例)。
因此，本文提供了包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。在一些实施方案中，提供了一种胰岛素类似物，其包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变。
如本文所用，表述“胰岛素类似物”是指具有这样的分子结构的肽，所述分子结构可以通过缺失和/或取代在天然存在的胰岛素(本文也称为“亲本胰岛素”，例如人胰岛素)中存在的至少一个氨基酸残基和/或添加至少一个氨基酸残基而在形式上衍生自天然存在的胰岛素的结构。所添加和/或交换的氨基酸残基可以是可编码氨基酸残基或其他天然存在的残基或纯合成的氨基酸残基。如本文所指的类似物能够降低体内的血糖水平，如在人类受试者中。
在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含两条肽链，即A链和B链。通常，两条链通过半胱氨酸残基之间的二硫桥连接。例如，在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含三个二硫桥：一个二硫桥在位置A6与A11处的半胱氨酸之间，一个二硫桥在A链的位置A7处的半胱氨酸与B链的位置B7处的半胱氨酸之间，并且一个在A链的位置A20处的半胱氨酸与B链的位置B19处的半胱氨酸之间。因此，本文提供的胰岛素类似物可以包含位置A6、A7、A11、A20、B7和B19处的半胱氨酸残基。
在本文提供的一些实施方案中，所述胰岛素类似物是单链胰岛素。单链胰岛素是单条多肽链，其中胰岛素B链经由未切割的连接肽与胰岛素A链连续连接。
胰岛素的突变(即亲本胰岛素的突变)在本文中通过参考链(即类似物的A链或B链)、A链或B链中突变的氨基酸残基的位置(如A14、B16和B25)和取代亲本胰岛素中天然氨基酸的氨基酸的三字母密码来指示。术语“desB30”是指缺乏来自亲本胰岛素的B30氨基酸的类似物(即位置B30处的氨基酸不存在)。例如，Glu(A14)Ile(B16)desB30人胰岛素是这样的人胰岛素类似物，其中人胰岛素A链位置14(A14)处的氨基酸残基被谷氨酸取代，B链位置16(B16)处的氨基酸残基被异亮氨酸取代，并且B链位置30处的氨基酸被缺失(即不存在)。
本文提供的胰岛素类似物包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变(氨基酸的取代、缺失或添加)。如本文所用，术语“至少一个”意指一个或超过一个，如“至少两个”、“至少三个”、“至少四个”、“至少五个”等。在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含B链中的至少一个突变和A链中的至少一个突变。在一个进一步的实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含B链中的至少两个突变和A链中的至少一个突变。例如，所述胰岛素类似物可以包含位置B16处的取代、位置B30处的缺失和位置A14处的取代。可替代地，所述胰岛素类似物可以包含位置B25处的取代、位置B30处的缺失和位置A14处的取代。此外，所述胰岛素类似物可以包含位置B16处的取代、位置B25处的取代、位置B30处的缺失和位置A14处的取代。
本文提供的胰岛素类似物还可以包含除以上突变外的突变。在一些实施方案中，突变的数量不超过一定数量。在一些实施方案中，所述胰岛素类似物包含相对于亲本胰岛素的少于十二个突变(即缺失、取代、添加)。在另一个实施方案中，所述类似物包含相对于亲本胰岛素的少于十个突变。在另一个实施方案中，所述类似物包含相对于亲本胰岛素的少于八个突变。在另一个实施方案中，所述类似物包含相对于亲本胰岛素的少于七个突变。在另一个实施方案中，所述类似物包含相对于亲本胰岛素的少于六个突变。在另一个实施方案中，所述类似物包含相对于亲本胰岛素的少于五个突变。在另一个实施方案中，所述类似物包含相对于亲本胰岛素的少于四个突变。在另一个实施方案中，所述类似物包含相对于亲本胰岛素的少于三个突变。
如本文所用，表述“亲本胰岛素”是指天然存在的胰岛素，即是指未突变的野生型胰岛素。在一些实施方案中，所述亲本胰岛素是动物胰岛素，如哺乳动物胰岛素。例如，所述亲本胰岛素可以是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。
在一些实施方案中，所述亲本胰岛素是人胰岛素。人胰岛素的序列是本领域熟知的并且示于实施例部分的表1中。人胰岛素包含具有如SEQ ID NO：1(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:2(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述亲本胰岛素是牛胰岛素。牛胰岛素的序列是本领域熟知的。牛胰岛素包含具有如SEQ ID NO:81(GIVEQCCASVCSLYQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:82(FVNQHLCGSHLVEALYLVC-GERGFFYTPKA)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述亲本胰岛素是猪胰岛素。猪胰岛素的序列是本领域熟知的。猪胰岛素包含具有如SEQ ID NO:83(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:84(FVNQHLCGSHLVEALYLVC GERGFFYTPKA)所示的氨基酸序列的B链。
人、牛和猪胰岛素包含三个二硫桥：一个二硫桥在位置A6与A11处的半胱氨酸之间，一个二硫桥在A链的位置A7处的半胱氨酸与B链的位置B7处的半胱氨酸之间，并且一个在A链的位置A20处的半胱氨酸与B链的位置B19处的半胱氨酸之间。
本文提供的胰岛素类似物具有这样的胰岛素受体结合亲和力，其与相应的亲本胰岛素(例如人胰岛素)的胰岛素受体结合亲和力相比降低。
胰岛素受体可以是任何哺乳动物胰岛素受体，如牛、猪或人胰岛素受体。在一些实施方案中，所述胰岛素受体是人胰岛素受体，例如人胰岛素受体亚型A或人胰岛素受体亚型B(其在实施例部分中有使用)。
有利地，本文提供的人胰岛素类似物与人胰岛素受体具有和人胰岛素与人胰岛素受体的结合亲和力相比显著降低的结合亲和力(参见实施例)。因此，所述胰岛素类似物具有非常低的清除率，即非常低的胰岛素受体介导的清除率。
在一些实施方案中，所述胰岛素类似物与相应的胰岛素受体具有(即展现)与其亲本胰岛素相比小于20％的结合亲和力。在另一个实施方案中，本文提供的胰岛素类似物与相应的胰岛素受体具有与其亲本胰岛素相比小于10％的结合亲和力。在另一个实施方案中，本文提供的胰岛素类似物与相应的胰岛素受体具有与其亲本胰岛素相比小于5％的结合亲和力，如与其亲本胰岛素相比小于3％的结合亲和力。例如，本文提供的胰岛素类似物与相应的胰岛素受体可具有与其亲本胰岛素相比为0.1％-10％(如0.3％-5％)的结合亲和力。例如，本文提供的胰岛素类似物与相应的胰岛素受体也可以具有与其亲本胰岛素相比在0.5％至3％之间(如在0.5％至2％之间)的结合亲和力。
用于确定胰岛素类似物与胰岛素受体的结合亲和力的方法是本领域熟知的。例如，可以通过临近闪烁测定来确定胰岛素受体结合亲和力，所述测定是基于[125I]标记的亲本胰岛素(如[125I]标记的人胰岛素)与(未标记的)胰岛素类似物之间对胰岛素受体的竞争性结合的评估。胰岛素受体可以存在于过表达重组胰岛素受体的细胞(例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞)的膜中。在一个实施方案中，如实施例部分所述确定胰岛素受体结合亲和力。
天然存在的胰岛素或胰岛素类似物与胰岛素受体的结合活化胰岛素信号传导通路。胰岛素受体具有酪氨酸激酶活性。胰岛素与其受体的结合诱导构象变化，这刺激酪氨酸残基上的受体的自磷酸化。胰岛素受体的自磷酸化刺激受体对参与信号转导的细胞内底物的酪氨酸激酶活性。因此，胰岛素受体通过胰岛素类似物的自磷酸化被认为是由所述类似物引起的信号转导的量度。
使实施例部分的表1中的胰岛素类似物经受自磷酸化测定。有趣的是，基于它们的胰岛素受体结合亲和力，具有位置B16和B25处的脂肪族取代的胰岛素类似物导致比预期的胰岛素受体自磷酸化更高的胰岛素受体自磷酸化。因此，本文提供的胰岛素类似物具有低的结合活性，并且因此具有较低的受体介导的清除率，但是仍然能够引起相对较高的信号转导。因此，本文提供的胰岛素类似物可以用作长效胰岛素。在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物能够诱导相对于亲本胰岛素(如人胰岛素)1％至10％(如2％至8％)的胰岛素受体自磷酸化。此外，在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物能够诱导相对于亲本胰岛素(如人胰岛素)3％至7％(如5％至7％)的胰岛素受体自磷酸化。可以如实施例部分中所述确定相对于亲本胰岛素的胰岛素受体自磷酸化。
使本文提供的胰岛素类似物经受蛋白酶稳定性测定。如表3所示，与人胰岛素相比，本文提供的胰岛素类似物对至少一些测试的蛋白酶具有更高的稳定性。观察到对α-胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶D和胰岛素降解酶(IDE)的改善的蛋白水解稳定性。因此，本文提供的胰岛素类似物通常是蛋白水解稳定的胰岛素类似物。因此，相对于亲本胰岛素，它们被蛋白酶降解更慢。在一些实施方案中，与亲本胰岛素相比，本文提供的胰岛素类似物对α-胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶D和胰岛素降解酶(IDE)的降解是稳定的。
如上所阐述的，与亲本胰岛素相比，所述胰岛素类似物包含至少一个突变。
在一些实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变。因此，位置B16处的氨基酸(人、牛和猪胰岛素中的酪氨酸)被疏水性氨基酸替代。
在另一个实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。因此，位置B25处的氨基酸(人、牛和猪胰岛素中的苯丙氨酸)被疏水性氨基酸替代。
在另一个实施方案中，本文提供的胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。
所述疏水性氨基酸可以是任何疏水性氨基酸。例如，所述疏水性氨基酸可以是如支链氨基酸的脂肪族氨基酸。
在本文提供的胰岛素类似物的一些实施方案中，用于在位置B16和/或B25处取代的疏水性氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸(或上述氨基酸的衍生物)。
几种亲本胰岛素(如人、牛和猪胰岛素)包含位置B16处的酪氨酸和位置B25处的苯丙氨酸。因此，亲本胰岛素位置B16处的氨基酸可以被异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸(或被上述氨基酸的衍生物)取代。此外，亲本胰岛素位置B25处的氨基酸可以被异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、甘氨酸或酪氨酸(或被上述氨基酸的衍生物)取代。
上述氨基酸的衍生物是本领域已知的。
亮氨酸的衍生物包括但不限于高亮氨酸和叔亮氨酸。因此，位置B16和/或B25处的氨基酸可以被高亮氨酸或叔亮氨酸取代。
缬氨酸的衍生物是例如3-乙基正缬氨酸。因此，位置B16和/或B25处的氨基酸可以被3-乙基正缬氨酸取代。
甘氨酸的衍生物包括但不限于环己基-甘氨酸、环丙基甘氨酸和三氟乙基甘氨酸。
丙氨酸的衍生物包括但不限于β-叔丁基丙氨酸、环丁基-丙氨酸、环丙基-丙氨酸和高环己基丙氨酸。
在一些实施方案中，用于在位置B16和/或B25处取代的疏水性氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸或色氨酸。
在一些实施方案中，所述脂肪族氨基酸不是丙氨酸。因此，用于在位置B16和/或B25处取代的疏水性氨基酸可为异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或色氨酸。
在一些实施方案中，用于在位置B16和/或B25处取代的疏水性氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸。
在一些实施方案中，本文所指的氨基酸是L-氨基酸(如L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-亮氨酸)。因此，用于例如在位置B16、B25和/或A14处取代的氨基酸(或其衍生物)通常是L-氨基酸。
在一些实施方案中，所述疏水性氨基酸是脂肪族氨基酸。因此，本文提供的胰岛素类似物包含位置B16处被脂肪族氨基酸取代的突变和位置B25处被脂肪族氨基酸取代的突变(以及任选地包括但不限于Des(B30)和Glu(A14)的其他突变)。
脂肪族氨基酸是包含脂肪族侧链官能团的非极性的疏水性氨基酸。疏水性随着烃链上碳原子的数量增加而增加。脂肪族的疏水性的量度是根据Kyte和Doolittle标度的亲水性指数，其例如可以如Kyte J.等Journal of Molecular Biology.1982 157(1):105-32所公开的确定。在一些实施方案中，所述脂肪族氨基酸是具有大于2.0(如大于3.0或大于3.5)的亲水性指数(根据Kyte和Doolittle标度)的脂肪族氨基酸。
脂肪族氨基酸包括但不限于异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸。例如，所述脂肪族氨基酸可以是选自异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甘氨酸的氨基酸，如选自异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的氨基酸。
异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸是支链氨基酸(缩写为BCAA)。因此，所述脂肪族氨基酸可以是支链氨基酸。在一些实施方案中,本文提供的胰岛素类似物包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和位置B25处被支链氨基酸取代的突变(以及任选地包括但不限于Des(B30)和Glu(A14)的其他突变)。
BCAA是如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的氨基酸，是具有非线性脂肪族侧链的氨基酸，即支链氨基酸是具有带有分支(中心碳原子与三个或更多个碳原子结合)的脂肪族侧链的氨基酸。
所述支链氨基酸可以是蛋白BCAA(即在翻译过程中生物合成地掺入蛋白质中的氨基酸)或非蛋白BCAA(即不是在任何生物的遗传密码中天然编码或存在的氨基酸)。例如，蛋白BCAA是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。因此，所述疏水性/脂肪族氨基酸支链氨基酸可以是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸(或亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的衍生物，如如以上所阐述的亮氨酸或缬氨酸的衍生物)。
在一些实施方案中，所述支链氨基酸是异亮氨酸。
在一些实施方案中，所述支链氨基酸是缬氨酸。
在一些实施方案中，所述支链氨基酸是亮氨酸。
除了如上所述位置B16处的突变和/或位置B25处的突变之外，本文提供的胰岛素类似物还可以包含相对于亲本胰岛素的其他突变。
例如，所述胰岛素类似物可以进一步包含位置A14处的突变。此类突变已知提高蛋白酶稳定性(参见例如WO 2008/034881)。在一些实施方案中，位置A14处的氨基酸被谷氨酸(Glu)取代。在一些实施方案中，位置A14处的氨基酸被天冬氨酸(Asp)取代。在一些实施方案中，位置A14处的氨基酸被组氨酸(His)取代。
此外，本文提供的胰岛素类似物可以包含位置B30处的突变。在一些实施方案中，位置B30处的突变是亲本胰岛素的位置B30处的苏氨酸的缺失(也称为Des(B30)-突变)。
此外，本发明的胰岛素类似物可以进一步包含位置B3处被谷氨酸(Glu)取代的突变和/或位置A21处被甘氨酸(Gly)取代的突变。
在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO:22(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO：24(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO:44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO:48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO:50(FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO：58(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO：60(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO：64(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO:66(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO：70(FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的B链包含SEQ ID NO：80(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列或由其组成。
以上总结的B链包含Des(B30)突变。因此，亲本胰岛素的位置B30处存在的氨基酸(人胰岛素中的苏氨酸、以及猪和牛胰岛素中的丙氨酸)被缺失，即不存在。然而，也设想了本发明的类似物的B链不包含此突变，即包含位置30处的苏氨酸。因此，本发明的胰岛素类似物的B链可以包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
·FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO：85)
·FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：86)
·FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：87)
·FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：88)
·FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：89)
·FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：90)
·FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：91)
·FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：92)
·FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：93)
·FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：94)
·FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：95)
·FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：96)
·FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：97)
在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的A链包含SEQ ID NO：1(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的A链包含SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物的A链包含SEQ ID NO：45(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)所示的氨基酸序列或由其组成。
通常，本发明的胰岛素类似物包含如以上所阐述的A链和B链。
例如，本发明的胰岛素类似物选自：
Leu(B16)-胰岛素(例如人胰岛素，即Leu(B16)-人胰岛素)、
Val(B16)-胰岛素(例如人胰岛素，即Val(B16)-人胰岛素)、
Ile(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Leu(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Val(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Ile(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Leu(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Leu(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Leu(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Leu(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)+胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B 16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)和
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)。
在另一个实施方案中，本文提供的胰岛素类似物选自：
Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素，即Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Leu(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Leu(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Leu(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)和
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)。
在另一个实施方案中，本文提供的胰岛素类似物选自：
His(A14)Leu(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B16)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Leu(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B16)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Leu(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Leu(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Ile(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B16)Ile(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)、
His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)和
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰岛素(例如人胰岛素)。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Leu(B25)Des(B30)-胰岛素(如Leu(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物11)。例如，Leu(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：21(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：22(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物12)。例如，Val(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：23(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：24(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物22)。例如，Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物24)。例如，Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物25)。例如，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO∶49(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：50(FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物29)。例如，Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：57(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：58(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物30)。例如，Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：56(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：60(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物32)。例如，Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：63(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：64(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)I1e(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物33)。例如，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：65(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：66(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物35)。例如，Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO：69(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：70(FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物38)。例如，Glu(A14)Va1(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO∶75(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：76(FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物39)。例如，Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)+胰岛素包含具有如SEQ ID NO：77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
在另一个实施方案中，所述胰岛素类似物是Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素(如Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素)。此类似物的序列例如示于实施例部分的表1中(参见类似物40)。例如，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰岛素包含具有如SEQ ID NO∶79(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO∶80(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
可以通过认为合适的任何方法制备所述胰岛素类似物。例如，可以通过重组方法或通过固相合成来制备所述胰岛素类似物。
上文给出的定义和解释经过必要的修正后适用于下文。
本文提供了如上文结合本文提供的胰岛素类似物的B链所定义的胰岛素B链，即胰岛素B链肽。因此，本文提供了包含相对于亲本胰岛素的胰岛素B链的至少一个突变的胰岛素B链，其中所述B链包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。所述胰岛素B链可以包含如上文所述的其他突变，如des(B30)缺失。
本文还提供了包含本文提供的胰岛素类似物的胰岛素A链和/或胰岛素B链的胰岛素原。所述B链可以是如上文针对本文提供的胰岛素类似物所定义的任何B链。例如，本文提供了包含胰岛素A链和胰岛素B链的胰岛素原，其中所述B链包含相对于亲本胰岛素的B链的至少一个突变，其中所述突变在被疏水性氨基酸取代的位置B16中和/或其中所述突变在被疏水性氨基酸取代的位置B25中。所述胰岛素B链可以包含如上文针对B链所述的其他突变。
本文提供的胰岛素原包含的A链可以是如上文针对本文提供的胰岛素类似物所定义的任何A链。在一些实施方案中，所述胰岛素原的A链包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。
除了胰岛素A链和/或胰岛素B链之外，本文提供的胰岛素原还可以包含其他元件，如前导序列或C肽。在一些实施方案中，所述胰岛素原可以进一步包含位于所述胰岛素B链与所述胰岛素A链之间的C肽。所述C肽可以具有4-10个氨基酸的长度，如4至9个氨基酸的长度。取向可以如下(从N末端到C末端)：B链，C肽，A链。
本文提供了编码本文提供的胰岛素类似物、胰岛素B链和胰岛素原的多核苷酸。所述多核苷酸可以与允许所述多核苷酸表达的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子相对于所述多核苷酸是异源的。在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在另一个实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。
此外，本文提供了包含编码本文提供的胰岛素类似物的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。
本文提供了包含本文提供的编码胰岛素类似物、胰岛素B链和胰岛素原的核酸、多核苷酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，如属于埃希菌属(Escherichia)属的细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞，如毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞或乳酸克鲁维酵母(Klyveromyceslactis)细胞。
本文提供了包含药学有效量的本文提供的胰岛素类似物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文提供了用于治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用药学有效量的一种或多种本文提供的胰岛素类似物或其药物组合物。
在一些实施方案中，所述疾病是糖尿病，如II型糖尿病。
本文提供了用于医学的胰岛素类似物或其药物组合物。
本文提供了用于治疗糖尿病(如II型糖尿病)的胰岛素类似物或其药物组合物。
最后，本文提供了本文提供的胰岛素类似物或其药物组合物用于制备治疗糖尿病(如II型糖尿病)用的药剂或药物的用途。
所述胰岛素类似物、胰岛素B链、胰岛素原和用途通过以下实施方案和实施方案的组合进一步说明，如通过各自的从属和反向引用所指示的。上文给出的定义和解释经过必要的修正后适用于以下实施方案。
1.一种胰岛素类似物，其包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。
2.根据实施方案1所述的胰岛素类似物，其中所述亲本胰岛素是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。
3.根据实施方案1和2所述的胰岛素类似物，其中位置B16和/或位置B25处的所述疏水性氨基酸是脂肪族氨基酸。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的胰岛素类似物，其中位置B16和/或位置B25处的所述脂肪族氨基酸是支链氨基酸，如选自缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的支链氨基酸。
5.根据实施方案1至3中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B30处的突变，例如其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的氨基酸的缺失(Des(B30)-突变)。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B3处被谷氨酸(Glu)取代的突变。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素进一步包含位置A21处被甘氨酸(Gly)取代的突变。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物的B链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK(SEQ ID NO：22)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：44)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：48)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：50)
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FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：78)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：80)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO：85)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：86)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：87)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：88)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：89)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：90)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：91)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：92)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：93)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：94)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：95)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：96)和
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：97)。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的胰岛素类似物，其包含
(a)具有如SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链，
(b)具有如SEQ ID NO：47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链，或
(c)具有如SEQ ID NO：77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
11.一种胰岛素类似物，其选自：
Leu(B16)-人胰岛素、
Val(B16)-人胰岛素、
Ile(B16)-人胰岛素、
Leu(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Val(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Ile(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Leu(B25)-人胰岛素、
Val(B25)-人胰岛素、
Ile(B25)-人胰岛素、
Leu(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B 16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素和
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素。
12.一种胰岛素B链，其包含相对于亲本胰岛素的B链的至少一个突变，其中所述B链包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。
13.根据实施方案12所述的胰岛素B链，其中所述亲本胰岛素是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。
14.根据实施方案12和13所述的胰岛素B链，其中位置B16和/或位置B25处的所述疏水性氨基酸是脂肪族氨基酸。
15.根据实施方案12至14中任一项所述的胰岛素B链，其中所述脂肪族氨基酸是支链氨基酸，如选自缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的支链氨基酸。
16.根据实施方案12至15中任一项所述的胰岛素B链，其中所述胰岛素B链进一步包含位置B3处被谷氨酸(Glu)取代的突变。
17.根据实施方案12至16中任一项所述的胰岛素B链，其中所述胰岛素B链进一步包含位置B30处的突变，其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的氨基酸的缺失(Des(B30)-突变)。
18.一种胰岛素原，其包含胰岛素A链和胰岛素B链，其中所述胰岛素B链包含相对于亲本胰岛素的B链的至少一个突变，其中所述B链包含位置B16处被疏水性氨基酸取代的突变和/或位置B25处被疏水性氨基酸取代的突变。
19.根据实施方案18所述的胰岛素原，其中所述胰岛素原的胰岛素A链包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。
20.根据实施方案18和19所述的胰岛素原，其中所述亲本胰岛素是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。
21.根据实施方案18至20中任一项所述的胰岛素原，其中位置B16和/或位置B25处的所述疏水性氨基酸是脂肪族氨基酸。
22.根据实施方案18至21中任一项所述的胰岛素原，其中所述脂肪族氨基酸是支链氨基酸，如选自缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的支链氨基酸。
23.根据实施方案18至22中任一项所述的胰岛素原，其中所述胰岛素原进一步包含位置B3处被谷氨酸(Glu)取代的突变。
24.根据实施方案18至23中任一项所述的胰岛素原，其中所述胰岛素原进一步包含位置B30处的突变，其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的氨基酸的缺失(Des(B30)-突变)。
25.一种多核苷酸，其编码根据实施方案1至11中任一项所述的胰岛素类似物、根据实施方案12至17中任一项所述的胰岛素B链和/或根据实施方案18至24中任一项所述的胰岛素原。
26.一种表达载体，其包含根据实施方案25所述的多核苷酸。
27.一种宿主细胞，其包含根据实施方案1至11中任一项所述的胰岛素类似物、根据实施方案12至17中任一项所述的胰岛素B链、根据实施方案18至24中任一项所述的胰岛素原、根据实施方案25所述的多核苷酸和/或根据实施方案26所述的表达载体。
28.一种用于治疗患有糖尿病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用一种或多种根据实施方案1至11中任一项所述的胰岛素类似物。
29.根据实施方案1至11中任一项所述的胰岛素类似物，其用于治疗糖尿病。
将本说明书中引用的所有参考文献关于它们的全部公开内容和本说明书中特别提及的公开内容通过引用随同并入。
实施例1：人胰岛素和胰岛素类似物的产生
重组产生人胰岛素以及胰岛素类似物。编码前胰岛素原的多核苷酸从
Figure BDA0003196075260000231
订购。优化了所设计的多核苷酸以用于在酵母中表达。通过经典的限制性克隆将它们插入表达载体中，从而使得能够在乳酸克鲁维酵母K中进行功能性表达和分泌。作为分泌前导序列，将基因与编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α交配因子信号的DNA序列进行C末端融合。重组基因表达由乳糖诱导型乳酸克鲁维酵母(K.lactis)启动子控制。
人胰岛素以及胰岛素类似物被制造为前胰岛素原。使用遗传融合的N末端前序列来改善表达和分泌产率，并且稳定培养肉汤中的肽。多种多样的序列可以用于此目的，并且针对效率进行了测试。胰岛素原本身由与C肽融合的B链、然后是C末端A链组成。作为C肽，描述了多种氨基酸组合。显示1-10个氨基酸的短肽与C序列一样起作用。对于以后的胰岛素加工，特定蛋白酶的识别位点是重要的，所述位点侧接C肽以使其能够切除。
通过化学手段使乳酸克鲁维酵母细胞成为感受态的。随后，将细胞用编码相应前胰岛素原的表达质粒转化。在插入质粒后，将细胞在含有遗传霉素的选择性琼脂板上铺板。分离生长的菌落并且测试其重组基因表达。在补充有遗传霉素的酵母蛋白胨右旋糖培养基中，使细胞生长至足够高的细胞密度。在初始生长期后，将补充有乳糖的具有遗传霉素的盐缓冲酵母提取物培养基添加到培养物中以诱导重组基因的表达。使培养物生长几天，并且通过离心收获上清液。
通过过滤程序开始功能性胰岛素或胰岛素类似物的纯化。用离子交换树脂进行最初的色谱捕获程序。用高特异性蛋白酶将前胰岛素原切割为胰岛素。通过一连串两个另外的色谱步骤进行宿主细胞蛋白、前序列和产品相关产物的耗尽。紧接疏水相互作用色谱法，应用另一种离子交换程序来实现此目标。通过反相色谱法进行最终的精制。使用过滤、沉淀和冷冻干燥来完成胰岛素分子的生产过程。
在与活化的羧酸衍生物发生偶联反应后，将具有缀合的胰岛素分子的溶液过滤。通过反相色谱法进行最终的纯化。使用过滤、沉淀和冷冻干燥来完成目标分子的合成。
产生了具有例如位置B16、B25和/或A14处的突变的各种胰岛素类似物。
表1提供了所产生的胰岛素的概述。
Figure BDA0003196075260000251
Figure BDA0003196075260000261
Figure BDA0003196075260000271
Figure BDA0003196075260000281
Figure BDA0003196075260000291
实施例2：胰岛素受体结合亲和力测定/胰岛素受体自磷酸化测定
通过结合测定和受体自磷酸化测定来确定所产生的各种胰岛素类似物的胰岛素结合和信号转导。
A)胰岛素受体结合亲和力测定
如Hartmann等(Effect of the long-acting insulin analogs glargine anddegludec on cardiomyocyte cell signaling and function.CardiovascDiabetol.2016；15：96)所述确定表1中所列的类似物的胰岛素受体结合亲和力。如前所述(Sommerfeld等，PLoS One.2010；5(3)：e9540)进行了嵌入胰岛素受体的质膜(M-IR)的分离和竞争结合实验。简言之，收集过表达IR的CHO细胞并且将其重新悬浮于冰冷的2.25STM缓冲液(2.25M蔗糖，5mM Tris-HCl pH7.4，5mM MgCl2，完全蛋白酶抑制剂)中并且使用Dounce均质器破坏然后进行超声处理。将匀浆用0.8STM缓冲液(0.8M蔗糖，5mM Tris-HCl pH7.4，5mM MgCl2，完全蛋白酶抑制剂)覆盖并且在100,000g下超速离心90min。收集界面处的质膜并且将其用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将最终的沉淀重新悬浮于稀释缓冲液(50mMTris-HCl pH 7.4，5mM MgCl2，完全蛋白酶抑制剂)中并且用Dounce均质器再次均质化。在96孔微孔板中的结合缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％BSA，完全蛋白酶抑制剂，调节至pH7.8)中进行竞争结合实验。在每个孔中，将2μg分离的膜与0.25mg麦胚凝集素聚乙烯基甲苯聚乙烯亚胺临近闪烁测定(SPA)珠一起孵育。在室温(23℃)下在12h内添加恒定浓度的[125I]标记的人胰岛素(100pM)和各种浓度的相应未标记的胰岛素(0.001-1000nM)。在微孔板闪烁计数器(Wallac Microbeta，德国弗莱堡)中在平衡下测量放射性。
所测试的类似物相对于人胰岛素的胰岛素受体结合亲和力测定的结果示于表2中。
B)胰岛素受体自磷酸化测定(作为信号转导的量度)
为了确定胰岛素类似物与胰岛素受体B结合的信号转导，在体外测量了自磷酸化。
如前所述(Sommerfeld等，PLoS One.2010；5(3)：e9540)，使用In-Cell Western技术，将表达人胰岛素受体亚型B(IR-B)的CHO细胞用于IR自磷酸化测定。为了分析IGF1R自磷酸化，使受体在用IGF1R四环素调控型表达质粒稳定转染的小鼠胚胎成纤维细胞3T3 Tetoff田胞系(BD Bioscience，德国海德堡)中过表达。为了确定受体酪氨酸磷酸化水平，将细胞接种到96孔板中并且使其生长44h。将细胞用无血清培养基Ham氏F12培养基(LifeTechnologies，德国达姆施塔特)血清饥饿2h。随后将细胞用递增浓度的人胰岛素或胰岛素类似物在37℃下处理20min。在孵育后，将培养基弃去，并且将细胞在3.75％新鲜制备的多聚甲醛中固定20min。将细胞用在PBS中的0.1％Triton X-100透化20min。用Odyssey封闭缓冲液(LICOR，德国巴特霍姆堡)在室温下封闭1小时。将抗pTyr 4G10(Millipore，德国施瓦尔巴赫)在室温下孵育2h。在孵育第一抗体后，将细胞用PBS+0.1％Tween 20(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)洗涤。将第二抗小鼠-IgG-800-CW抗体(LICOR，德国巴特霍姆堡)孵育1h。将结果通过用TO-PRO3染料(Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄)对DNA定量进行归一化。以相对单位(RU)获得数据。
所测试的类似物相对于人胰岛素的胰岛素受体自磷酸化测定的结果示于表2中。
表2：所测试的人胰岛素类似物(关于序列，请参见表1)的相对胰岛素受体结合亲和力和自磷酸化活性。
Figure BDA0003196075260000311
Figure BDA0003196075260000321
Figure BDA0003196075260000331
*相对于人胰岛素，nd：未确定
**为0的值意味着结合亲和力低于检测限
C)结途
正如可以从表2得到的，测试了位置B16和/或B25处的各种疏水性取代(色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)。尽管程度不同，具有这些位置处的疏水性取代的所测试的所有胰岛素类似物都显示出胰岛素受体结合活性的降低。与Trp取代(参见例如类似物4、15和23)相比，用脂肪族氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代对胰岛素受体结合活性具有更强的影响。观察到缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(其是支链氨基酸)的作用最强。用异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代导致胰岛素受体结合活性显著降低。有趣的是，基于它们的IR-B结合亲和力，具有位置B25处的此类取代的胰岛素类似物(如B25处的缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代，类似物11、12、22、24、25、29、30、32、33、35、38、39、40)显示出与预期相比高达6倍的信号转导增强。特别地，Leu(B25)Des(B30)-胰岛素和Val(B25)Des(B30)-胰岛素(分别为类似物11和12)仅显示出相对于人胰岛素的1％的与胰岛素受体B的结合和6％的自磷酸化。类似地，位置B16处的单个亮氨酸取代(类似物3)也显示出类似的信号转导增强，但是程度略低。通过比较，除类似物26外，带有组氨酸B25取代的类似物(类似物10、13、14、21、28)也显示出降低的受体结合，然而伴随着自磷酸化降低。
在一些情况下(类似物30、32、35、38、39)，胰岛素受体结合是0％，然而在自磷酸化测定中仍显示出活性。所有这些类似物共同地具有位置B16和B25处的缬氨酸和/或异亮氨酸取代的组合，这表明所述组合是胰岛素受体结合进一步下降的原因。与它们的自磷酸化值相比，在位置B25处没有取代但是在位置B16处具有交换的胰岛素展现稍高的结合亲和力(类似物3、4、16、17、18、19、20)。
位置B25中的丙氨酸显示出与缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代(类似物11、12、22)相似的作用，但是程度较低。具有缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代的类似物的受体结合亲和力和自磷酸化活性低于具有丙氨酸取代的类似物。
实施例3：在不同的重组蛋白酶和模拟胃液中体外稳定性的确定
测试了胰岛素类似物的蛋白水解稳定性(α-胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶D、胰岛素降解酶(IDE)和模拟胃液。
A)测定条件
Figure BDA0003196075260000341
B)模拟胃液的制备
将两克氯化钠和3.2g纯化的胃蛋白酶(来自猪胃粘膜，活性为800至2500单位/mg蛋白质)溶解于7.0ml的盐酸中。将体积用水调节至多达1000ml。将所得的溶液混合并且用0.2N氢氧化钠或0.2N盐酸调节至1.2±0.1的pH。
C)通用测定程序
使用适当的时间点(对于SIF和SGF，15、30、60、120和240分钟；对于蛋白酶，15、30、60和120分钟)进行稳定性确定。在37℃下进行孵育，并且参考T0时间点计算剩余的母体化合物的％。
为了确定母体化合物，在用乙醇(1当量v/v)沉淀蛋白质和离心步骤后，使用上清液，使用适当的生物分析型LC-MS/MS或LC-HRMS方法。
D)样品的制备
将化合物以40μM的最终浓度溶解于稀盐酸中。测定中的化合物浓度为2μM。将工作溶液1：20稀释到蛋白酶缓冲液中，并且然后将样品在搅拌下在37℃下孵育。在适当的时间点并且取等分试样，将反应用乙醇(1当量v/v)淬灭，然后离心。对上清液进行分析。
E)结论
具体地，研究了B链中位置16和25处的亲脂性氨基酸取代，如缬氨酸和异亮氨酸。仅观察到所测试的类似物(2、7、11、12、14、16、19、22、23、24和38)相对于人胰岛素针对蛋白酶胰蛋白酶、羧肽酶A和羧肽酶B的稳定性的微小差异(数据未显示)。总体上，带有A14和B25取代的所有类似物(类似物22、24、38)都显示出针对α-胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶D和胰岛素降解酶(IDE)的改善的蛋白水解稳定性。例如，在α-胰凝乳蛋白酶的情况下，人胰岛素在2小时内完全降解，而类似物22几乎完全耐降解。类似地，所测试的所有B25取代的类似物都显示出针对组织蛋白酶D的改善的稳定性，但是与其他B25变体相比，类似物38(B16/B25变体)显示出优异的稳定性。
在IDE的情况下观察到一个值得注意的例外，其中与B25变体相比，具有A14/B16取代的类似物19显示出改善的性能。然而，数据表明在此测试的A14处用谷氨酸取代对于提高稳定性是重要的。其他取代也显示出对于提高稳定性有益：如位置B16处和位置B25处的取代。例如，具有位置B25中的氨基酸交换的类似物7导致不稳定性提高。
表3：不同的胰岛素类似物(关于所测试的类似物的序列，参见表1)与四种不同的蛋白酶孵育30或120分钟后剩余的胰岛素类似物的百分比。
Figure BDA0003196075260000351
Figure BDA0003196075260000361
nd：未确定
项
以下各项是本说明书的一部分：
1.一种胰岛素类似物，其包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变。
2.根据项1所述的胰岛素类似物，其中所述亲本胰岛素是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。
3.根据项1和2所述的胰岛素类似物，其中所述支链氨基酸选自缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)。
4.根据项1至3中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。
5.根据项1至4中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B30处的突变。
6.根据项5所述的胰岛素类似物，其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的氨基酸的缺失(Des(B30)-突变)。
7.根据项1至6中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B3处被谷氨酸(Glu)取代的突变。
8.根据项1至7中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素进一步包含位置A21处被甘氨酸(Gly)取代的突变。
9.根据项1至8中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物的B链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK(SEQ ID NO：22)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：44)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：48)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：50)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：58)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：60)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO∶64)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：66)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：70)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：76)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：78)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：80)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO∶85)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：86)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：87)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：88)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO∶89)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：90)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：91)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：92)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：93)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：94)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：95)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：96)和
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：97)。
10.根据项1至9中任一项所述的胰岛素类似物，其包含
(a)具有如SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链，
(b)具有如SEQ ID NO：47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链，或
(c)具有如SEQ ID NO：77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
11.一种胰岛素类似物，其选自：
Leu(B16)-人胰岛素、
Val(B16)-人胰岛素、
Ile(B16)-人胰岛素、
Leu(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Val(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Ile(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Leu(B25)-人胰岛素、
Val(B25)-人胰岛素、
Ile(B25)-人胰岛素、
Leu(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B 16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素，和
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素。
12.一种胰岛素B链，其包含相对于亲本胰岛素的B链的至少一个突变，其中所述B链包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变，并且任选地其中所述胰岛素B链进一步包含位置B30处的突变，其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的苏氨酸的缺失(Des(B30)-突变)。
13.一种胰岛素原，其包含胰岛素A链和胰岛素B链，其中所述胰岛素B链包含相对于亲本胰岛素的B链的至少一个突变，其中所述B链包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变，并且任选地其中所述胰岛素原的胰岛素A链包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。
14.一种多核苷酸，其编码根据项1至11中任一项所述的胰岛素类似物、根据项12所述的胰岛素B链和/或根据项13所述的胰岛素原。
15.一种宿主细胞，其包含根据项1至11中任一项所述的胰岛素类似物、根据项12所述的胰岛素B链、根据项13所述的胰岛素原和/或根据项14所述的多核苷酸。
序列表
<110> 赛诺菲(Sanofi)
<120> 具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物
<130> DE2018/059
<150> EP 18 306 657.0
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 658.8
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 659.6
<151> 2018-12-11
<160> 97
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<223> A链
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<223> B链
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 3
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 5
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 6
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 7
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 8
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 8
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 9
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 10
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 10
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 11
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 12
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 13
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 14
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 15
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 16
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 16
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 17
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 18
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 19
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 20
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 21
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 22
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Leu Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 23
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 24
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 24
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 25
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 25
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 26
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 26
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 27
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 28
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 28
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 29
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 29
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 30
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 30
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 31
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 32
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 32
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 33
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 34
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 35
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 35
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 36
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 36
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 37
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 38
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 38
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 39
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 39
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 40
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 40
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 41
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 41
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 42
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 42
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 43
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 44
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 44
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 45
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 45
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 46
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 46
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 47
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 48
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 48
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 49
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 50
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 50
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 51
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 51
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 52
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 52
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 53
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 54
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 54
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 55
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 56
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 56
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 57
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 57
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 58
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 58
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 59
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 60
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 60
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 61
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 62
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 62
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 63
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 63
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 64
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 64
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 65
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 65
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 66
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 66
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 67
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 68
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 68
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 69
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 70
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 70
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 71
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 72
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 72
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 73
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 73
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 74
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 74
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 75
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 75
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 76
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 77
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 78
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 78
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 79
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A链
<400> 79
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 80
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 80
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 81
<211> 21
<212> PRT
<213> 牛(Bos)
<220>
<223> A链
<400> 81
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 82
<211> 30
<212> PRT
<213> 牛(Bos)
<220>
<223> B链
<400> 82
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
20 25 30
<210> 83
<211> 21
<212> PRT
<213> 猪(Sus)
<220>
<223> A链
<400> 83
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 84
<211> 30
<212> PRT
<213> 猪(Sus)
<220>
<223> B链
<400> 84
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
20 25 30
<210> 85
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 85
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Leu Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 86
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 86
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 87
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 87
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 88
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 88
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 89
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 89
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 90
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 90
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 91
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 91
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 92
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 92
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 93
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 93
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 94
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 94
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 95
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 95
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 96
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 96
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 97
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B链
<400> 97
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25

Claims (15)

1.一种胰岛素类似物，其包含相对于亲本胰岛素的至少一个突变，其中所述胰岛素类似物包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变。
2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述亲本胰岛素是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。
3.根据权利要求1和2所述的胰岛素类似物，其中所述支链氨基酸选自缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B30处的突变。
6.根据权利要求5所述的胰岛素类似物，其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的氨基酸的缺失(Des(B30)-突变)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物进一步包含位置B3处被谷氨酸(Glu)取代的突变。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素进一步包含位置A21处被甘氨酸(Gly)取代的突变。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物的B链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK(SEQ ID NO:22)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:44)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:48)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:50)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:58)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:60)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:64)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:66)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO:70)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:76)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:78)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO:80)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO:85)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:86)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:87)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:88)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:89)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:90)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:91)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:92)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:93)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO:94)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:95)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:96)和
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO:97)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的胰岛素类似物，其包含
(a)具有如SEQ ID NO:43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)所示的氨基酸序列的B链，
(b)具有如SEQ ID NO:47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链，或
(c)具有如SEQ ID NO:77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)所示的氨基酸序列的A链和具有如SEQ ID NO:78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)所示的氨基酸序列的B链。
11.一种胰岛素类似物，其选自：
Leu(B16)-人胰岛素、
Val(B16)-人胰岛素、
Ile(B16)-人胰岛素、
Leu(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Val(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Ile(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Leu(B25)-人胰岛素、
Val(B25)-人胰岛素、
Ile(B25)-人胰岛素、
Leu(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Leu(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素、
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素和
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人胰岛素。
12.一种胰岛素B链，其包含相对于亲本胰岛素的B链的至少一个突变，其中所述B链包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变，并且任选地其中所述胰岛素B链进一步包含位置B30处的突变，其中位置B30处的所述突变是所述亲本胰岛素的位置B30处的苏氨酸的缺失(Des(B30)-突变)。
13.一种胰岛素原，其包含胰岛素A链和胰岛素B链，其中所述胰岛素B链包含相对于亲本胰岛素的B链的至少一个突变，其中所述B链包含位置B16处被支链氨基酸取代的突变和/或位置B25处被支链氨基酸取代的突变，并且任选地其中所述胰岛素原的胰岛素A链包含位置A14处被选自谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的氨基酸取代的突变。
14.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的胰岛素类似物、根据权利要求12所述的胰岛素B链和/或根据权利要求13所述的胰岛素原。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的胰岛素类似物、根据权利要求12所述的胰岛素B链、根据权利要求13所述的胰岛素原和/或根据权利要求14所述的多核苷酸。
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