TW202039539A - 具有經降低胰島素受體結合親和力的胰島素類似物 - Google Patents

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Abstract

本文係提供相對於母胰島素包括至少一突變的胰島素類似物，其中該胰島素類似物係包括在位置B16經疏水性胺基酸取代的突變，及/或在位置B25經疏水性胺基酸取代的突變。

Description

具有經降低胰島素受體結合親和力的胰島素類似物
本文係提供相對於母胰島素包括至少一突變的胰島素類似物，其中該胰島素類似物係包括在位置B16經疏水性胺基酸取代的突變，及/或在位置B25經疏水性胺基酸取代的突變。
全世界有超過4億人患有第1型或第2型糖尿病。第1型糖尿病係以胰島素替代物治療。與第1型糖尿病相比，在第2型糖尿病中基本上並無胰島素缺乏，但有許多的案例，特別是在晚期，第2型糖尿病病患係以胰島素治療。
在健康人士中，胰臟所釋放的胰島素係確切地與血糖濃度相連結。升高的血糖量(例如發生在餐後者)快速地藉由對應的增加胰島素分泌來補償。在空腹的狀態下，血漿胰島素量降至基礎值，其係足以保證持續對胰島素敏感器官和組織提供葡萄糖，並在夜晚讓肝臟之葡萄糖生成保持低量。以外生性(大多為皮下投予方式)胰島素來替代內生性胰島素分泌，通常無法達到上述的血糖生理調節之品質。可能發生血糖上升或下降的偏差，其最嚴重的情況可能危及生命。由此可見，改善糖尿病的治療方法主要是將血糖盡可能地保持在生理範圍內。
人類胰島素為51個胺基酸的多肽，其係分成2條胺基酸鏈：具有21個胺基酸的A鏈和具有30個胺基酸的B鏈。二條鏈係藉由2個雙硫鍵彼此相連接。第3個雙硫鍵係存在A鏈的位置6和11之半胱胺酸間。目前用於治 療糖尿病的某些產品為胰島素類似物，亦即胰島素變異體，其序列係在A鏈及/或B鏈中有一或多個胺基酸取代，因而與人類胰島素的序列不同。
如同許多其他的胜肽激素，人類胰島素在活體內具有短的半衰期。因此，頻繁給藥與病患的不適相關聯。因此，會希望延長胰島素類似物在體內的半衰期，從而有較長的作用時間。
目前對於延長胰島素的半衰期有不同的方法。
一種方法是在低pH值下開發可溶性調配物，但在生理pH值下相對於天然胰島素的溶解度降低。胰島素類似物利用在B鏈的C端添加2個精胺酸來提高等電點。添加2個精胺酸加上在A21以甘胺酸取代(甘精胰島素)，提供了有延長作用效期的胰島素。此胰島素類似物在鋅的存在下，於注射後係沉澱在皮下位置，並緩慢溶解，造成甘精胰島素(insulin glargine)持續存在。
另一種方法，係將長鏈的脂肪酸基團與胰島素LysB29的ε胺基基團接合。此基團的存在使得胰島素得以利用非共價可逆性鍵結與血清白蛋白附接。因此，相對於人類胰島素，此胰島素類似物係具有顯著延長的作用時間特性(參見，例如Mayer et al.,Inc.Biopolymers(Pept Sci)88：687-713,2007；or WO 2009/115469)。
WO 2016/006963揭示了相較於人類胰島素具有降低的胰島素受體介導的清除率之胰島素類似物。
WO 2018/056764揭示了相較於人類胰島素具有降低的胰島素受體介導的清除率之胰島素類似物。
WO 2008/034881揭示了蛋白酶安定的胰島素類似物。
為了增加藥物的作用效期，半衰期扮演著重要角色。半衰期(t1/2)係與分佈體積除以清除率成正比。就人類胰島素的情況而言，清除率主要係藉由與胰島素受體結合、內化及隨後降解所驅動。
因此，需要具有降低胰島素受體結合活性的胰島素類似物，從而降低受體介導的清除率，又具有訊號轉導活性，可在活體內充分地降低血糖量。
本文中係提供具有非常低的結合親和力(因此有較低的清除率)而仍保有高訊號轉導之長效型胰島素類似物。
令人驚訝地，在本發明下的研究內容顯示，在人類胰島素的位置B16及/或B25以疏水性胺基酸(例如白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸或色胺酸)取代，造成胰島素受體結合活性降低(與母胰島素(parent insulin)的胰島素受體結合活性相比，參見實例)。以支鏈胺基酸(白胺酸、異白胺酸和纈胺酸)取代觀察到對胰島素受體結合活性最強的效應。有利地，以其胰島素受體同功型B(IR-B)結合親和力為基礎，在這些位置(例如在位置B25)具有此等取代的胰島素類似物在訊號轉導上，顯示比預期增強高達6倍(參見實例)。再者，某些受試的胰島素類似物對α-胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)、細胞自溶酶D(cathepsin D)和胰島素降解酵素顯示提升的蛋白水解安定性(參見實例)。
因此，本文中係提供相對於母胰島素包括至少一突變之胰島素類似物，其中該胰島素類似物係包括在位置B16經疏水性胺基酸取代的突變，及/或在位置B25經疏水性胺基酸取代的突變。在某些具體實例中，係提供相對於母胰島素包括至少一突變之胰島素類似物，其中該胰島素類似物係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變，及/或在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變。
詞語「胰島素類似物」如本文中所用係指一胜肽，其具有藉由刪除及/或取代至少一存在天然生成胰島素的胺基酸殘基，及/或添加至少一胺基酸殘基，形式上可衍生自天然生成胰島素(本文中亦稱為「母胰島素」，例如人類胰島素)之結構的分子結構。添加及/或替換的胺基酸殘基可為可編碼胺基酸殘基、或其他天然生成的殘基，或純粹合成的胺基酸殘基。本文中所指的類似物能在活體內(例如人類對象中)降低血糖量。
在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括二條胜肽鏈，A鏈和B鏈。典型地，這二條鏈係藉由半胱胺酸殘基間的雙硫鍵相連接。例如，在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括三個雙硫鍵：一介於位置A6和A11之半胱胺酸間的雙硫鍵，一介於A鏈位置A7之半胱胺酸和B鏈位置B7之半胱胺酸間的雙硫鍵，以及一介於A鏈位置A20之半胱胺酸和B鏈位置B19之半胱胺酸間的雙硫鍵。因此，本文中所提供的胰島素類似物可包括位置A6、A7、A11、A20、B7和B19的半胱胺酸殘基。
在本文中所提供的某些具體實例中，此胰島素類似物為一單鏈胰島素。單鏈胰島素為單一多肽鏈，其中胰島素B鏈係經由一未裂解連接胜肽連續地與胰島素A鏈相連接。
胰島素的突變，亦即母胰島素的突變，在本文中係以相關鏈(亦即類似物的A鏈或B鏈)、A鏈或B鏈中突變的胺基酸殘基位置(例如A14、B16和B25)，以及取代母胰島素中該天然胺基酸的胺基酸三字母代碼指出。術語「desB30」係指缺失B30胺基酸之母胰島素的類似物(亦即在位置B30無胺基酸存在)。例如Glu(A14)Ile(B16)desB30人類胰島素為其中人類胰島素的A鏈位置14(A14)之胺基酸殘基係經麩胺酸取代，B鏈位置16(B16)之胺基酸殘基係經異白胺酸取代，以及B鏈位置30(B30)之胺基酸係為缺失(亦即不存在)的人類胺基酸類似物。
本文中所提供的胰島素類似物相對於母胰島素係包括只少一項突變(取代、缺失或添加胺基酸)。術語「至少一項」用於本文中係指一或一項以上，例如「至少二項」、「至少四項」、「至少五項」等等。在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括至少一項B鏈中的突變及至少一項A鏈中的突變。在另一具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括至少二項B鏈中的突變和至少一項A鏈中的突變。例如，胰島素類似物可包括一位置B16之取代，一位置B30之刪除以及一位置A14之取代。另一種選擇，此胰島素類似物可包括一位置B25之取代，一位置B30之刪除以及一位置A14之取代。另外，此胰島素類似物可包括一位置B16之取代，一位置B25之刪除以及一位置A14之取代。
本文中所提供的胰島素類似物除了上述突變外可包括其他突變。在某些具體實例中，突變的數目不超過特定數量。在某些具體實例中，此胰島素類似物相對於母胰島素係包括少於12項的突變(亦即刪除、取代、添加)。在另外的具體實例中，此類似物相對於母胰島素係包括少於10項的突變。在另外的具體實例中，此類似物相對於母胰島素係包括少於8項的突變。在另外的具體實例中，此類似物相對於母胰島素係包括少於7項的突變。在另外的具體實例中，此類似物相對於母胰島素係包括少於6項的突變。在另外的具體實例中，此類似物相對於母胰島素係包括少於5項的突變。在另外的具體實例中，此類 似物相對於母胰島素係包括少於4項的突變。在另外的具體實例中，此類似物相對於母胰島素係包括少於3項的突變。
詞語「母胰島素」如本文中所用係指天然生成的胰島素，亦即未突變的野生型胰島素。在某些具體實例中，此母胰島素為動物胰島素。例如，此母胰島素可為人類胰島素、豬胰島素或牛胰島素。
在某些具體實例中，此母胰島素為人類胰島素。人類胰島素的序列已為本項技術所熟知並如實例章節之表1中所示。人類胰島素包括具有如SEQ ID NO：1(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：2(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此母胰島素為牛胰島素。牛胰島素的序列已為本項技術所熟知。牛胰島素係包括具有如SEQ ID NO：81(GIVEQCCASVCSLYQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：82(FVNQHLCGSHLVEALYLVC-GERGFFYTPKA)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此母胰島素為豬胰島素。豬胰島素的序列已為本項技術所熟知。豬胰島素係包括具有如SEQ ID NO：83(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：84(FVNQHLCGSHLVEALYLVC GERGFFYTPKA)中所示之胺基酸序列的B鏈。
人類、牛和豬胰島素係包含3個雙硫鍵：一介於位置A6和A11之半胱胺酸間的雙硫鍵，一介於A鏈位置A7之半胱胺酸和B鏈位置B7之半胱胺酸間的雙硫鍵，以及一介於A鏈位置A20之半胱胺酸和B鏈位置B19之半胱胺酸間的雙硫鍵。
本文中所提供的胰島素類似物，相較於對應的母胰島素，亦即人類胰島素之胰島素受體結合親和力，係具有一降低的胰島素受體結合親和力。
胰島素受體可為任何哺乳動物胰島素受體，例如牛、豬或人類胰島素受體。在某些具體實例中，此胰島素受體為人類胰島素受體，例如人類胰島素受體同功型A或人類胰島素受體同功型B(其係用於實例章節中)。
有利地，本文中所提供的人類胰島素類似物，當相較於人類胰島素對人類胰島素受體之結合親和力時，係具有顯著降低的人類胰島素受體結合親和力(參見實例)。因此，此胰島素類似物具有非常低的清除率，亦即非常低的胰島素受體所介導的清除率。
在某些具體實例中，此胰島素類似物相較於其母胰島素係具有，亦即展現低於20%的對應胰島素受體之結合親和力。在另外的具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物相較於其母胰島素係具有低於10%的對應胰島素受體之結合親和力。另外的具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物相較於其母胰島素係具有低於5%的對應胰島素受體之結合親和力，例如相較於母胰島素低於3%的結合親和力。例如，本文中所提供的胰島素類似物相較於其母胰島素可具有介於0.1%至10%，例如介於0.3%至5%的對應胰島素受體之結合親和力。又，本文中所提供的胰島素類似物相較於其母胰島素可具有介於0.5%至3%，例如介於0.5%至2%的對應胰島素受體之結合親和力。
用於測定胰島素類似物對胰島素受體的結合親和力之方法已為本項技術所熟知。例如，胰島素受體結合親和力可藉由鄰近閃爍分析法(scintillation proximity assay)來測定，該分析係以經[125I]所標定的母胰島素，例如經[125I]所標定的人類胰島素和(未標定的)胰島素類似物間對胰島素受體的競爭結合評估為基礎。胰島素受體可存在細胞，例如過度表現一重組胰島素受體之CHO(中國倉鼠卵巢)細胞的膜中。在一具體實例中，胰島素受體結合親和力係如實例章節中所述來測定。
天然生成的胰島素或胰島素類似物與胰島素受體結合，活化了胰島素訊號傳遞路徑。所述胰島素受體具有酪胺酸激酶活性。胰島素與其受體的結合引發構形改變，其刺激了酪胺酸殘基上受體的自體磷酸化。胰島素受體的自體磷酸化刺激受體的酪胺酸激酶活性朝向涉及訊號轉導的胞內基質。因此由胰島素類似物導致之胰島素受體的自體磷酸化，係視為一種由該類似物所造成的訊號轉導之測量。
將實例章節表1中的胰島素類似物進行自體磷酸化分析。有趣的是，在位置B16和B25具有脂肪族取代的胰島素類似物，以其胰島素受體的結合親和力為基準，造成高於預期的胰島素受體自體磷酸化。因此，本文中所提供的胰島素類似物具有低結合活性，且因此具有較低的受體介導的清除率，但 仍能造成相當高的訊號轉導。因此，本文中所提供的胰島素類似物可用作為長效型胰島素。在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似相對於母胰島素(例如人類胰島素)能引發1至10%，例如2至8%胰島素受體自體磷酸化。另外，在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物相對於母胰島素(例如人類胰島素)能引發3至7%，例如5至7%胰島素受體自體磷酸化。相對於母胰島素之胰島素受體自體磷酸化可如實例章節中所述來測定。
將本文中所提供的胰島素類似物進行蛋白酶安定性分析。如表3中所示，本文中所提供的胰島素類似物相較於人類胰島素，對於至少某些受試的蛋白酶具有較高的安定性。觀察到對於α-胰凝乳蛋白酶、細胞自溶酶D和胰島素降解酵素(IDE)具提升的蛋白水解安定性。因此，本文中所提供的胰島素類似物，典型地，為蛋白水解上安定的胰島素類似物。因此，相對於母胰島素其係較緩慢被蛋白酶降解。在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物相較於母胰島素對於α-胰凝乳蛋白酶、細胞自溶酶D和胰島素降解酵素(IDE)之降解為安定的。
如上所述，此胰島素類似物相較於母胰島素係包括至少一項突變。
在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括在位置B16經疏水性胺基酸取代的突變。因此，位置B16的胺基酸(在人類、牛和豬中為酪胺酸)係經疏水性胺基酸置換。
在另外的具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括在位置B25經疏水性胺基酸取代的突變。因此，位置B25的胺基酸(在人類、牛和豬中為苯丙胺酸)係經疏水性胺基酸置換。
在另外的具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括在位置B16經疏水性胺基酸取代的突變以及在位置B25經疏水性胺基酸取代的突變。
疏水性胺基酸可為任何疏水性胺基酸。例如，疏水性胺基酸可為脂肪族胺基酸，例如支鏈胺基酸。
在某些本文中所提供的胰島素類似物之具體實例中，用於位置B16及/或B25取代作用的疏水性胺基酸為異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、 色胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸(或前面所提之胺基酸的衍生物)。
數種母胰島素，例如人、牛和豬胰島素係包括在位置B16之酪胺酸及位置B25之苯丙胺酸。因此，母胰島素位置B16的胺基酸可經異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、甘胺酸或苯丙胺酸(或前面所提之胺基酸的衍生物)取代。另外，母胰島素位置B25的胺基酸可經異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、甘胺酸或酪胺酸(或前面所提之胺基酸的衍生物)取代。
前面所提之胺基酸的衍生物已為本技術領域所知。
白胺酸的衍生物包括，但不限於高白胺酸(homo-leucine)和第三白胺酸(tert-leucine)。因此，位置B16及/或B25之胺基酸可經高白胺酸和第三白胺酸取代。
纈胺酸的衍生物為，例如3-乙基-正纈胺酸。因此，位置B16及/或B25之胺基酸可經3-乙基正纈胺酸取代。
甘胺酸的衍生物包括，但不限於環己基甘胺酸、環丙基甘胺酸和三氟乙基甘胺酸。
丙胺酸的衍生物包括，但不限於β-第三丁基丙胺酸、環丁基丙胺酸、環丙基丙胺酸和高環己基丙胺酸(homo-cyclohexylalanine)。
在某些具體實例中，用於位置B16及/或B25之取代的疏水性胺基酸為異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸或色胺酸。
在某些具體實例中，脂肪族胺基酸並非丙胺酸。因此，用於位置B16及/或B25取代作用的疏水性胺基酸可為異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或色胺酸。
在某些具體實例中，用於位置B16及/或B25之取代的疏水性胺基酸為異白胺酸、纈胺酸或白胺酸。
在某些具體實例中，本文中所指的胺基酸為L-胺基酸(例如L-異白胺酸、L-纈胺酸或L-白胺酸)。因此，用於位置B16、B25及/或A14之取代作用的胺基酸(或其衍生物)典型地為L-胺基酸。
在某些具體實例中，疏水性胺基酸為脂肪族胺基酸。因此，本文中所提供的胰島素類似物係包括在位置B16經脂肪族胺基酸取代的突變和在位 置B25經脂肪族胺基酸取代的突變(以及視需要另外的突變，包括，但不限於Des(B30)和Glu(A14))。
脂肪族胺基酸為非極性且疏水性之胺基酸，係包括脂肪族側鏈功能基團。疏水性係隨著碳氫鏈上碳原子數目的增加而增高。用於脂肪族疏水性之測量為根據Kyte和Doolittle量表之親水指數(hydropathy index)，其例如可如Kyte J.et al.Journal of Molecular Biology.1982 157(1)：105-32中所揭示來測定。在某些具體實例中，此脂肪族胺基酸為具有大於2.0，例如大於3.0或大於3.5之親水指數(根據Kyte和Doolittle量表)的脂肪族胺基酸。
脂肪族胺基酸包括，但不限於異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸和甘胺酸。例如，此脂肪族胺基酸可為選自異白胺酸、纈胺酸、白胺酸和甘胺酸之胺基酸，例如選自異白胺酸、纈胺酸和白胺酸之胺基酸。
異白胺酸、纈胺酸和白胺酸為支鏈胺基酸(縮寫為BCAA)。因此，脂肪族胺基酸可為支鏈胺基酸。在某些具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變和在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變(以及視需要另外的突變，包括，但不限於Des(B30)和Glu(A14))。
BCAA為胺基酸，例如異白胺酸、纈胺酸和白胺酸，其具有非直鏈之脂肪族側鏈，亦即支鏈胺基酸為具有帶有一支鏈之脂肪族側鏈的胺基酸(中心碳原子係與三或更多的碳原子鍵結)。
支鏈胺基酸可為蛋白BCAA，亦即在轉譯期間經生物合成併入蛋白中之胺基酸，或非蛋白BCAA，亦即非天然編碼或在任何生物之基因密碼中發現的胺基酸。因此，疏水性/脂肪族胺基酸、支鏈胺基酸可為白胺酸、異白胺酸或纈胺酸(或白胺酸、異白胺酸或纈胺酸之衍生物，例如如上述之白胺酸或纈胺酸的衍生物)。
在某些具體實例中，此支鏈的胺基酸為異白胺酸。
在某些具體實例中，此支鏈的胺基酸為纈胺酸。
在某些具體實例中，此支鏈的胺基酸為白胺酸。
除了如上述在位置B16的突變，及/或在位置B25的突變之外，本文中所提供的胰島素類似物相對於母胰島素可包括另外的突變。
，例如，胰島素類似物可進一步包括位置A14的突變。此等突變已知係增加對蛋白酶的安定性(參見，例如WO 2008/034881)。在某些具體實 例中，位置A14的胺基酸係經麩胺酸(Glu)取代。在某些具體實例中，位置A14的胺基酸係經天門冬胺酸(Asp)取代。在某些具體實例中，位置A14的胺基酸係經組胺酸(His)取代。
另外，本文中所提供的胰島素類似物可包括在位置B30的突變。在某些具體實例中，位置B30的突變為母胰島素在位置B30的蘇胺酸之缺失(亦稱為Des(B30)-突變)。
另外，本發明之胰島素類似物可進一步包括在位置B3經麩胺酸(Glu)取代的突變，及/或在位置A21經甘胺酸(Gly)取代的突變。
在一具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：22(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：24(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：50(FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：58(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：60(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：64(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：66(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：70(FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的B鏈係包括或由SEQ ID NO：80(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示的胺基酸序列所組成。
上述所彙整的B鏈係包括Des(B30)突變。因此，存在母胰島素位置B30的胺基酸(在人類胰島素中為蘇胺酸，而在豬和牛胰島素中為丙胺酸)係為缺失，亦即不存在。然而，亦設想本發明類似物的B鏈並不包括此突變，亦即在位置30包括蘇胺酸。因此，本發明之胰島素類似物的B鏈可包括下列組成之群組中選出的胺基酸序列，或由其所組成：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO：85)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：86)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：87)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：88)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：89)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：90)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：91)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：92)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：93)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：94)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：95)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：96)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：97)
在一具體實例中，本發明之胰島素類似物的A鏈係包括SEQ ID NO：1(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)中所示的胺基酸序列，或由其所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的A鏈係包括SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示的胺基酸序列，或由其所組成。
在另外的具體實例中，本發明之胰島素類似物的A鏈係包括SEQ ID NO：45(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)中所示的胺基酸序列，或由其所組成。
典型地，本發明之胰島素類似物係包括如上所述之A鏈和B鏈。
例如，本發明之胰島素類似物係由下列組成之群組中選出：Leu(B16)-胰島素(例如，人類胰島素，亦即Leu(B16)-人類胰島素)，Val(B16)-胰島素(例如，人類胰島素，亦即Val(B16)-人類胰島素)，Ile(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，Leu(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Val(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Ile(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Leu(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Leu(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Leu(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)， Glu(A14)Val(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Leu(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，以及Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)。
在另外的具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係由下列組成之群組中選出： Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素，亦即Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Val(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Leu(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Val(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Leu(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Leu(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)， Asp(A14)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，及Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)。
在另外的具體實例中，本文中所提供的胰島素類似物係由下列組成之群組中選出：His(A14)Leu(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B16)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Leu(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B16)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Leu(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Leu(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)， His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Ile(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B16)Ile(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)，及His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-胰島素(例如，人類胰島素)。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Leu(B25)Des(B30)-胰島素(例如Leu(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物11)。例如，Leu(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：21(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：22(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物12)。例如，Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：23(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：24(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物22)。例如，Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物24)。例如，Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物25)。例如，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：49(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：50(FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物29)。例如，Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：57(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：58(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物30)。例如，Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：56(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：60(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物32)。例如，Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：63(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示 之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：64(FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物33)。例如，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：65(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：66(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物35)。例如，Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：69(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：70(FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物38)。例如，Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：75(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：76(FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物39)。例如，Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
在另外的具體實例中，此胰島素類似物為Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素(例如Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素)。此類似物的序列係例如，如實例章節表1中所示(參見類似物40)。例如，Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-胰島素係包括一具有如SEQ ID NO：79(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：80(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
胰島素類似物可藉由任何視為適當的方法來製備。例如，胰島素類似物可藉由重組的方法或藉由固相合成來製備。
上文中所給予的定義和說明係準用於下文。
本文中係提供胰島素B鏈，亦即B鏈胜肽，其如上文中所定義與本文中所提供的胰島素類似物之B鏈有關。因此，本文中係提供相對於母胰島素的B鏈其係包括至少一項突變的B鏈，其中該B鏈係包括在位置B16經疏水性胺基酸取代的突變，及/或在位置B25經疏水性胺基酸取代的突變。胰島素B可包括如上文所述之另外的突變，例如des(B30)刪除。
本文中亦提供包括本文中所提供的胰島素類似物之胰島素A鏈及/或胰島素B鏈的前胰島素。此B鏈可為如本文中所提供之胰島素類似物本文中所定義的任何B鏈。例如，本文中係提供包括胰島素A鏈和胰島素B鏈的前胰島素，其中該B鏈相對於母胰島素的B鏈係包括至少一項突變，其中該突變係在位置B16經疏水性胺基酸取代，及/或其中該突變係在位置B25經疏水性胺基酸取代。胰島素B可包括如上文B鏈所述之另外的突變。
本文中提供的前胰島素所包括之A鏈可為如本文中所提供之胰島素類似物本文中所定義的任何A鏈。在某些具體實例中，該前胰島素的A鏈係包括在位置A14的突變，其係經選自麩胺酸(Glu)、天門冬胺酸(Asp)和組胺酸(His)的胺基酸取代。
除了胰島素A鏈及/或胰島素B鏈之外，本文中所提供的前胰島素可包括另外的元件，例如領導序列或C胜肽。在某些具體實例中，此前胰島 素可另外包括位於胰島素B鏈和胰島素A鏈之間的C胜肽。此C胜肽可具有4至10個胺基酸的長度，例如4至9個胺基酸的長度。向位可如下(從N端到C端)：B鏈，C胜肽，A鏈。
本文中係提供聚核苷酸，其編碼本文中所提供的胰島素類似物、胰島素B鏈和前胰島素。該聚核苷酸可操作上連接一能表現該聚核苷酸的啟動子。在某些具體實例中，此啟動子就該聚核苷酸而言為異質性的。在某些具體實例中，該啟動子為持續型啟動子(constitiutive promoter)。在另外的具體實例中，該啟動子為誘導型啟動子。
另外，本文中係提供包括聚核苷酸之載體，而該聚核苷酸係編碼本文中所提供之胰島素類似物。在某些具體實例中，該載體為一表現載體。
本文中係提供包括核酸、其聚核苷酸及/或其載體之宿主細胞，而該核酸係編碼本文中所提供的胰島素類似物、胰島素B鏈和前胰島素。在某些具體實例中，此宿主細胞為細菌細胞，例如屬於埃希氏菌屬(Escherichia)的細胞，如大腸桿菌(E.coli)細胞。在另外的具體實例中，此宿主細胞為酵母菌細胞，例如嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)細胞或乳酸克魯維斯酵母(Klyveromyces lactis)細胞。
本文中係提供醫藥組成物，其包括醫藥上有效量之本文中所提供的胰島素類似物和醫藥上可接受賦形劑。
本文中係提供用於治療疾病的方法，其包括將醫藥上有效量之一或多個本文中所提供的胰島素類似物或其醫藥組成物投予個體。
在某些具體實例中，該疾病為糖尿病，例如第II型糖尿病。
本文中係提供胰島素類似物或醫藥組成物係用於醫藥。
本文中係提供胰島素類似物或其醫藥組成物係用於治療糖尿病，例如第II型糖尿病。
最後，本文中係提供本文中所提供的胰島素類似物或其醫藥組成物，係用於製備治療糖尿病(例如第II型糖尿病)之醫藥品或藥物的用途。
胰島素類似物、胰島素B鏈、前胰島素及用途係藉由下列各自依附關係和反向參照所指出的具體實例及具體實例的組合進一步說明。上文中所給予的定義和說明係準用於下列具體實例。
1.一種胰島素類似物，其相對於母胰島素係包括至少一項的突變，其中該胰島素類似物係包括在位置B16經一疏水性胺基酸取代的突變及/或在位置B25經一疏水性胺基酸取代的突變。
2.如具體實例1之胰島素類似物，其中該母胰島素為人類胰島素、豬胰島素或牛胰島素。
3.如具體實例1和2之胰島素類似物，其中在位置B16及/或在位置B25之疏水性胺基酸為脂肪族胺基酸。
4.如具體實例1至3中任一項之胰島素類似物，其中在位置B16及/或位置B25的該脂肪族胺基酸為支鏈胺基酸，例如由纈胺酸(Val)、異白胺酸(Ile)和白胺酸(Leu)組成之群組中選出的支鏈胺基酸。
5.如具體實例1至3中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置A14的突變，其係經由麩胺酸(Glu)，天門冬胺酸(Asp)和組胺酸(His)組成之群組中選出的胺基酸取代。
6.如具體實例1至5中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置B30的突變，例如，其中在位置B30的突變為母胰島素在位置B30的胺基酸缺失(Des(B30)-突變)。
7.如具體實例1至6中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置B3經麩胺酸(Glu)取代的突變。
8.如具體實例1至7中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素進一步係包括在位置A21經甘胺酸(Gly)取代的突變。
9.如具體實例1至8中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物的B鏈係包括或由下列組成之群組中選出的胺基酸序列所組成：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK(SEQ ID NO：22)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：44)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：48)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：50)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：58)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：60)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：64)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：66)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：70)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：76)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：78)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：80)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO：85)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：86)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：87)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：88)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：89)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：90)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：91)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：92)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：93)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：94)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：95)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：96)，及
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：97)。
10.如具體實例1至9中任一項之胰島素類似物，其係包括
(a)具有如SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈，
(b)具有如SEQ ID NO：47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈，或
(c)具有如SEQ ID NO：77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和一具有如SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
11.一種胰島素類似物，係由下列組成之群組中選出
Leu(B16)-人類胰島素，
Val(B16)-人類胰島素，
Ile(B16)-人類胰島素，
Leu(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Val(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Ile(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Leu(B25)-人類胰島素，
Val(B25)-人類胰島素，
Ile(B25)-人類胰島素，
Leu(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B16)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素，和
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素。
12.一種胰島素B鏈，其相對於母胰島素B鏈係包括至少一項突變，其中該B鏈係包括在位置B16經一疏水性胺基酸取代的突變，及/或在位置B25經一疏水性胺基酸取代的突變。
13.根據具體實例12之胰島素B鏈，其中該母胰島素為人類胰島素、豬胰島素或牛胰島素。
14.根據具體實例12和13之胰島素B鏈，其中在位置B16及/或位置B25的疏水性胺基酸為脂肪族胺基酸。
15.根據具體實例12至14中任一項之胰島素B鏈，其中該脂肪族胺基酸為支鏈胺基酸，例如由纈胺酸(Val)、異白胺酸(Ile)和白胺酸(Leu)組成之群組中選出的支鏈胺基酸。
16.根據具體實例12至15中任一項之胰島素B鏈，其中該胰島素B鏈進一步係包括在位置B3經麩胺酸(Glu)取代的突變。
17.根據具體實例12至16中任一項之胰島素B鏈，其中該胰島素B鏈進一步係包括在位置B30的突變，其中在位置B30的突變為母胰島素在位置B30的胺基酸缺失(Des(B30)-突變)。
18.一種包括胰島素A鏈和胰島素B鏈之前胰島素，其中該胰島素B鏈相對於母胰島素B鏈係包括至少一項突變，其中該B鏈係包括在位置B16經疏水性胺基酸取代的突變及/或在位置B25經疏水性胺基酸取代的突變。
19.如具體實例18之前胰島素，其中該前胰島素的胰島素A鏈係包括在位置A14經選自麩胺酸(Glu)、天門冬胺酸(Asp)和組胺酸(His)之胺基酸取代的突變。
20.根據具體實例18和19之前胰島素，其中該母胰島素為人類胰島素、豬胰島素或牛胰島素。
21.根據具體實例18至20中任一項之前胰島素，其中在位置B16及/或位置B25的疏水性胺基酸為脂肪族胺基酸。
22.根據具體實例18至21中任一項之前胰島素，其中該脂肪族胺基酸為支鏈胺基酸，例如由纈胺酸(Val)、異白胺酸(Ile)和白胺酸(Leu)組成之群組中選出的支鏈胺基酸。
23.根據具體實例18至22中任一項之前胰島素，其中該前胰島素進一步係包括在位置B3經麩胺酸(Glu)取代的突變。
24.根據具體實例18至23中任一項之前胰島素，其中該前胰島素進一步係包括在位置B30的突變，其中在位置B30的突變為母胰島素在位置B30的胺基酸缺失(Des(B30)-突變)。
25.一種聚核苷酸，其係編碼如具體實例1至11中任一項之胰島素類似物、如具體實例12至17中任一項之胰島素B鏈，及/或如具體實例18至24中任一項之前胰島素。
26.一種表現載體，其係包括如具體實例25之聚核苷酸。
27.一種宿主細胞，其係包括如具體實例1至11中任一項之胰島素類似物、如具體實例12至17中任一項之胰島素B鏈，如具體實例18至24中任一項之前胰島素，如具體實例25之聚核苷酸，及/或如具體實例26之表現載體。
28.一種治療患有糖尿病病患之方法，其係包括投予該病患一或多種如具體實例1至11中任一項所定義的胰島素類似物。
29.一種如具體實例1至11中任一項所定義的胰島素類似物，係用於治療糖尿病。
所有本說明書中所引述的參考文獻，就其整體揭示內容及在本說明中特別提及的揭示內容而言，係據此以引用的方式併入。
實例1：人類胰島素和胰島素類似物之製造
以重組方式製造人類胰島素以及胰島素類似物。編碼前胰島素原(pre-pro-insulin)的聚核苷酸係由Geneart®訂購。將設計的聚核苷酸就酵母菌中的表現進行最適化。藉由能在乳酸克魯維斯酵母中表現功能及分泌的傳統限制性選殖將其插入至一表現載體中。作為分泌前導序列，此基因係以C端與編碼釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之α-交配因子訊號的DNA序列融合。此重組的基因表現係藉由乳糖可誘導的乳酸克魯維斯酵母啟動子來控制。
如前胰島素原製造人類胰島素以及胰島素類似物。利用遺傳融合的N端前序列來改善表現和分泌產率及穩定培養基中的胜肽。就此目的可使用各式各樣的序列，並檢測其功效。前胰島素本身係由與C胜肽融合的B鏈和接著C端的A鏈所組成。作為各式各樣C胜肽之胺基酸胜肽組合已有描述。1至10個胺基酸的短胜肽作為C序列，效果很好。。對於胰島素的後續處理，特定蛋白酶的辨識位置是重要的，這些辨識位置位於C胜肽的側邊，使其能夠被切除。
藉由化學方法使乳酸克魯維斯酵母細胞成為勝任細胞。隨後，以編碼個別前胰島素原的表現質體轉化細胞。插入質體後，將細胞植入含有遺傳黴素(geneticin)的選擇性瓊脂盤上。將長出的菌落分離並檢測重組基因的表現。於添補遺傳黴素的酵母菌蛋白腖葡萄糖培養基上讓細胞生長至足夠高的細胞密度。在初生長期之後，將添補乳糖之帶有遺傳黴素的鹽類緩衝酵母菌萃取培養液加到培養物中，以引發重組基因的表現。讓培養物生長數天，並以離心收取上清液。
藉由過濾程序開始功能性胰島素或胰島素類似物的純化。以離子交換樹脂進行最初的層析捕捉程序。以高特異性蛋白酶將前胰島素原裂解為胰島素。耗盡宿主細胞蛋白，藉由串連二個另外的層析步驟產生產物有關的前序列和產物。在疏水性交互作用層析之後，額外施以離子交換程序，達成此目標。 藉由逆相層析進行最後的優化。使用過濾、沉澱和冷凍乾燥完成胰島素分子的製造處理。
與活化的羧酸衍生物進行偶和反應後，將帶有接合胰島素分子的溶液過濾。以逆相層析進行最後的純化。使用過濾、沉澱和冷凍乾燥完成目標分子的合成。
產生帶有突變，例如在位置B16、B25及/或A14的各種胰島素類似物。表1係提供所產生之胰島素的綜述。
Figure 108145066-A0202-12-0027-1
Figure 108145066-A0202-12-0028-2
Figure 108145066-A0202-12-0029-3
Figure 108145066-A0202-12-0030-4
Figure 108145066-A0202-12-0031-5
Figure 108145066-A0202-12-0032-6
Figure 108145066-A0202-12-0033-7
實例2：胰島素受體結合親和力分析/胰島素受體自體磷酸化分析
藉由結合分析法和受體自體磷酸化分析法，來測定產生的各種胰島素類似物之胰島素結合和訊號轉導。
A)胰島素受體結合親和力分析
列於表1之類似物的胰島素受體結合親和力分析係如Hartmann 等人中所述來測定(Effect of the long-acting insulin analogs glargine and degludec on cardiomyocyte cell signaling and function.Cardiovasc Diabetol.2016；15：96)：如之前所述方式分離嵌有胰島素受體的細胞膜(M-IR)及進行競爭結合實驗(Sommerfeld et al.,PLoS One.2010；5(3)：e9540)。簡言之，收集過度表現IR的CHO細胞，並再懸浮於冰的2.25STM緩衝液中(2.25M蔗糖，5mM Tris-HCl pH 7.4,5mM MgCl2，全蛋白酶抑制劑)及使用Dounce均質機攪動，然後以超音波處理。於均質液上覆加0.8STM緩衝液(0.8M蔗糖，5mM Tris-HCl pH 7.4,5mM MgCl2，全蛋白酶抑制劑)並以100,000g超離心90min。收集在界面的細胞膜，並以磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)清洗2次。將最後的團塊再懸浮於稀釋緩衝液中(50mM Tris-HCl pH 7.4,5mM MgCl2，全蛋白酶抑制劑)，並再度以Dounce均質機均質化。競爭結合實驗以結合緩衝液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1% BSA，全蛋白酶抑制劑，調整至pH 7.8)於96孔微量盤中進行。在各孔槽中，將2μg分離出的膜以0.25mg小麥胚芽凝集素聚乙烯基甲苯聚乙烯亞胺鄰近閃爍分析(SPA)微珠進行培養。於室溫(23℃)加入固定濃度之[125I]所標定的人類胰島素 (100pM)和各種濃度之個別未標定的胰島素(0.001至1000nM)，歷經12h。以微量盤閃爍計數器(德國弗萊堡Wallac Microbeta公司)於平衡時測量放射活性。
受試類似物相對於人類胰島素之胰島素受體結合親和力分析結果，係如表2所示。
B)胰島素受體自體磷酸化分析(為訊號轉導之測量)
為了測定胰島素類似物與胰島素受體B結合之訊號轉導，係測量活體外的自體磷酸化作用。
使用如先前所述之In-Cell Western技術(Sommerfeld et al.,PLoS One.2010；5(3)：e9540)，使用表現有人類胰島素受體同功型B(IR-B)之CHO細胞來進行IR自體磷酸化分析。就IGF1R的自體磷酸化分析，係將受體過度表現在小鼠胚胎纖維母細胞3T3 Tet off細胞株中(BD Bioscience,Heidelberg,Germany)，該細胞株係轉染有可被四環黴素調控表現之質體。為了測定受體酪胺酸磷酸化的量，係將細胞種入96孔盤中，並生長44h。以無血清培養基Ham’s F12培養基(德國達姆施塔特Life Technologies公司)，將細胞進行血清飢餓，歷時2h。隨後在37℃下，將細胞以遞增濃度的人類胰島素或胰島素類似物處理20min。培養後，將培養基丟棄，並將細胞以3.75%新鮮製備的多聚甲醛固定20min。以0.1% Triton X-100溶於PBS之溶液將細胞通透化20min。以Odyssey阻斷緩衝液(LICOR,Bad Homburg,Germany)於室溫下阻斷1小時。於室溫將抗-pTyr 4G10(德國施瓦爾巴赫Millipore公司)培養2h。在初級抗體培養後，以PBS+0.1% Tween 20(美國密蘇里州聖路易斯Sigma-Aldrich公司)清洗細胞。將二級抗小鼠-IgG-800-CW抗體(德國巴特洪堡LICOR公司)培養1h。藉由以TO-PRO3染劑(德國爾斯魯厄Invitrogen公司)定量DNA將結果正常化。得到的數據為相對單位(RU)。
受試類似物相對於人類胰島素之胰島素受體自體磷酸化分析的結果係如表2所示。
Figure 108145066-A0202-12-0034-8
Figure 108145066-A0202-12-0035-10
Figure 108145066-A0202-12-0036-11
Figure 108145066-A0202-12-0037-13
C)結論
從表2可得知，對在位置B16/或B2之各種疏水性取代(色胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸和異白胺酸進行了檢測。儘管程度不同，但在所有這些位置經疏水性取代的受試胰島素類似物，係顯示降低的胰島素受體結合活性。當相較於Trp取代(參見，例如類似物4、15和23)，經脂肪族胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸和異白胺酸取代)對於胰島素受體結合活性具有較強的效應。在支鏈的胺基酸：纈胺酸、白胺酸和異白胺酸中觀察到最強的效應。經異白胺酸、纈胺酸和白胺酸取代造成胰島素受體結合活性顯著下降。有趣的是，此等在位置B25經取代的胰島素類似物(例如在位置B25之纈胺酸、白胺酸或異白胺酸取代，類似物11、12、22、24、25、29、30、32、33、35、38、39、40)，以其IR-B結合親和力為基準，在訊號轉導上比預期顯示高達6倍的增強。尤其是Leu(B25)Des(B30)-胰島素和Val(B25)Des(B30)-胰島素(分別為類似物11和12)，相對於人類胰島素顯示僅1%的胰島素受體B結合度及6%的自體磷酸化。同樣地，在位置B16的單一白胺酸取代(類似物3)，儘管程度略低，亦顯示類似的訊號轉導增強。除了類似物26外，帶有組胺酸B25取代的類似物(類似物10、13、14、21、28)，藉由比較亦顯示受體結合降低，然而伴隨自體磷酸化降低。
在某些案例中(類似物30、32、35、38、39)，胰島素受體結合度為0%，但在自體磷酸化分析中仍顯現活性。這些類似物皆具有在位置B16和B25之纈胺酸及/或異白胺酸取代組合的共通點，顯示該組合造成胰島素受體結合進一步的下降。在位置B25無取代但在位置B16有被替換的胰島素，相較於其自體磷酸化數值，顯示略高的結合親和力(類似物3、4、16、17、18、19、20)。
雖然程度較低，但位置B25的丙胺酸顯現與纈胺酸、白胺酸或異白胺酸取代類似的效應(類似物11、12、22)。經纈胺酸、白胺酸或異白胺酸取代之類似物，其受體結合親和力和自體磷酸化活性低於經丙胺酸取代的類似物。
實例3：在不同重組蛋白酶和人工胃液中測定活體外安定性
檢測胰島素類似物對蛋白水解之安定性(α-胰凝乳蛋白酶、細胞自溶酶D、胰島素降解酵素(IDE)和人工胃液)。
A)分析條件
Figure 108145066-A0202-12-0038-15
B)製備人工胃液
將2克的氯化鈉和3.2g的純化的胃蛋白酶(來自豬胃黏膜，每毫克(mg)的蛋白具有800至2500單位的活性)溶於7.0ml的鹽酸中。以水調整體積至1000ml。將生成的溶液與0.2N氫氧化鈉或0.2N鹽酸混合並調整至pH 1.2±0.1。
C)通用分析程序
使用適當的時間點進行安定性測定(就SIF和SGF為15、30、60、120和240分鐘；就蛋白酶為15、30、60和120分鐘)。於37℃進行培養並參照T0時間點計算剩餘的母化合物%。
就母化合物之測定，係在以乙醇(1eq.v/v)沉澱蛋白和離心步驟後使用上清液，使用適當的生物分析LC-MS/MS或LC-HRMS法。
D)製備樣本
將化合物於40μM的最終濃度溶於稀鹽酸中。在此分析中化合物濃度為2μM。於蛋白緩衝液中製作1：20稀釋度的工作液及然後將樣本於37℃在攪拌下培養。於適當的時間點及取等分，以乙醇中止反應(1eq.v/v)，然後離心。分析上清液。
E)結論
特言之，評估在B鏈中位置16和25之親脂性胺基酸取代，例如纈胺酸和異白胺酸。在受試的類似物(2、7、11、12、14、16、19、22、23、24和38)中，相對於人類胰島素(數據未顯示)，僅觀察到對胰蛋白酶、羧肽酶A和羧肽酶B等蛋白酶，有些微的安定性差異。一般而言，所有帶有A14和B25(類似物22、24、38)取代的類似物，顯示對α-胰凝乳蛋白酶、細胞自溶酶D和胰島素降解酵素(IDE)有提升的蛋白水解安定性。例如，就α-胰凝乳蛋白酶的情況，人類胰島素在2小時內完全降解，而類似物22幾乎完全保留。同樣地，所有受試的B25經取代類似物顯示對細胞自溶酶D有提升的安定性，然而相較於其他B25變體，類似物38(B16/B25變體)顯示優越的安定性。
在IDE情況中，觀察到一項值得注意的例外，其中在A14/B16經取代的類似物19，相較於B25變體顯現提升的表現。然而數據顯示，A14的取代，本處係以麩胺酸檢測，對於增加安定性為重要的。其他的取代亦顯示有利於增加安定性：例如位置B16和位置B25的取代。例如，在位置B25經胺基酸替換的類似物7，造成安定性增加。
Figure 108145066-A0202-12-0040-16
Figure 108145066-A0202-12-0041-18
條款
下列條款為本說明書之部分：
1.一種胰島素類似物，其相對於母胰島素係包括至少一項的突變，其中該胰島素類似物係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變及/或在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變。
2.如條款1之胰島素類似物，其中該母胰島素為人類胰島素、豬胰島素或牛胰島素。
3.如條款1和2之胰島素類似物，其中該支鏈胺基酸係由纈胺酸(Val)、異白胺酸(Ile)和白胺酸(Leu)組成之群組中選出。
4.如條款1至3中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置A14的突變，其係經由麩胺酸(Glu)，天門冬胺酸(Asp)和組胺酸(His)組成之群組中選出的胺基酸取代。
5.如條款1至4中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置B30的突變。
6.如條款5之胰島素類似物，其中在位置B30的突變為母胰島素在位置B30的胺基酸缺失(Des(B30)-突變)。
7.如條款1至6中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置B3經麩胺酸(Glu)取代的突變。
8.如條款1至7中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素進一步係包括在位置A21經甘胺酸(Gly)取代的突變。
9.如條款1至8中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物的B鏈係包括或由下列組成之群組中選出的胺基酸序列所組成：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK(SEQ ID NO：22)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：44)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：48)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：50)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：58)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：60)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：64)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：66)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：70)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：76)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：78)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：80)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO：85)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：86)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：87)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：88)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：89)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：90)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：91)
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：92)
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：93)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：94)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：95)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：96)，及
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：97)。
10.如條款1至9中任一項之胰島素類似物，係包括
(a)具有如SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈，
(b)具有如SEQ ID NO：47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈，或
(c)具有如SEQ ID NO：77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
11.一種胰島素類似物，係由下列組成之群組中選出
Leu(B16)-人類胰島素，
Val(B16)-人類胰島素，
Ile(B16)-人類胰島素，
Leu(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Val(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Ile(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Leu(B25)-人類胰島素，
Val(B25)-人類胰島素，
Ile(B25)-人類胰島素，
Leu(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B16)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Leu(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素，
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素，和
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素。
12.一種胰島素B鏈，其相對於母胰島素的B鏈係包括至少一項突變，其中該B鏈係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變及/或在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變，以及視需要其中該胰島素B鏈進一步係包括在位置B30的突變，其中在位置B30的突變為母胰島素在位置B30的蘇胺酸缺失(Des(B30)-突變)。
13.一種包括胰島素A鏈和胰島素B鏈之前胰島素，其中該胰島素B鏈相對於母胰島素B鏈係包括至少一項突變，其中該B鏈係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變及/或在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變，以及視需要其中該前胰島素的胰島素A鏈係包括在位置A14經選自麩胺酸(Glu)、天門冬胺酸(Asp)和組胺酸(His)之胺基酸取代的突變。
14.一種聚核苷酸，其係編碼如條款1至11中任一項之胰島素類似物、如條款12之胰島素B鏈，及/或如條款13之前胰島素。
15.一種宿主細胞，其係包括如條款1至11中任一項之胰島素類似物、如條款12之胰島素B鏈、如條款13之前胰島素，及/或如條款14之聚核苷酸。
<110> 法商賽諾菲公司(Sanofi)
<120> 具有經降低胰島素受體結合親和力的胰島素類似物
<130> DE2018/059
<150> EP 18 306 657.0
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 658.8
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 659.6
<151> 2018-12-11
<160> 97
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> A鏈
<400> 1
Figure 108145066-A0202-12-0046-19
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> B鏈
<400> 2
Figure 108145066-A0202-12-0047-20
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 3
Figure 108145066-A0202-12-0047-21
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 4
Figure 108145066-A0202-12-0048-22
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 5
Figure 108145066-A0202-12-0048-23
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 6
Figure 108145066-A0202-12-0048-24
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 7
Figure 108145066-A0202-12-0049-25
<210> 8
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 8
Figure 108145066-A0202-12-0049-26
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 9
Figure 108145066-A0202-12-0049-27
Figure 108145066-A0202-12-0050-28
<210> 10
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 10
Figure 108145066-A0202-12-0050-29
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 11
Figure 108145066-A0202-12-0050-30
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 12
Figure 108145066-A0202-12-0051-31
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 13
Figure 108145066-A0202-12-0051-32
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 14
Figure 108145066-A0202-12-0051-33
Figure 108145066-A0202-12-0052-34
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 15
Figure 108145066-A0202-12-0052-35
<210> 16
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 16
Figure 108145066-A0202-12-0052-36
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 17
Figure 108145066-A0202-12-0053-37
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 18
Figure 108145066-A0202-12-0053-38
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 19
Figure 108145066-A0202-12-0053-39
Figure 108145066-A0202-12-0054-40
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 20
Figure 108145066-A0202-12-0054-41
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 21
Figure 108145066-A0202-12-0054-42
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 22
Figure 108145066-A0202-12-0055-43
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 23
Figure 108145066-A0202-12-0055-44
<210> 24
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 24
Figure 108145066-A0202-12-0055-45
<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
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Figure 108145066-A0202-12-0056-46
<210> 26
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> B鏈
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Figure 108145066-A0202-12-0056-47
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 27
Figure 108145066-A0202-12-0057-48
<210> 28
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 28
Figure 108145066-A0202-12-0057-49
<210> 29
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 29
Figure 108145066-A0202-12-0057-50
<210> 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 30
Figure 108145066-A0202-12-0058-51
<210> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
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Figure 108145066-A0202-12-0058-52
<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 32
Figure 108145066-A0202-12-0059-53
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 33
Figure 108145066-A0202-12-0059-54
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 34
Figure 108145066-A0202-12-0059-55
<210> 35
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 35
Figure 108145066-A0202-12-0060-56
<210> 36
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 36
Figure 108145066-A0202-12-0060-57
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 37
Figure 108145066-A0202-12-0061-58
<210> 38
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 38
Figure 108145066-A0202-12-0061-59
<210> 39
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 39
Figure 108145066-A0202-12-0061-60
<210> 40
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 40
Figure 108145066-A0202-12-0062-61
<210> 41
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 41
Figure 108145066-A0202-12-0062-62
<210> 42
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 42
Figure 108145066-A0202-12-0063-63
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 43
Figure 108145066-A0202-12-0063-64
<210> 44
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 44
Figure 108145066-A0202-12-0063-65
<210> 45
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 45
Figure 108145066-A0202-12-0064-66
<210> 46
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 46
Figure 108145066-A0202-12-0064-67
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 47
Figure 108145066-A0202-12-0064-68
Figure 108145066-A0202-12-0065-69
<210> 48
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 48
Figure 108145066-A0202-12-0065-70
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 49
Figure 108145066-A0202-12-0065-71
<210> 50
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 50
Figure 108145066-A0202-12-0066-72
<210> 51
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 51
Figure 108145066-A0202-12-0066-73
<210> 52
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 52
Figure 108145066-A0202-12-0066-74
Figure 108145066-A0202-12-0067-75
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 53
Figure 108145066-A0202-12-0067-77
<210> 54
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 54
Figure 108145066-A0202-12-0067-78
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 55
Figure 108145066-A0202-12-0068-79
<210> 56
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 56
Figure 108145066-A0202-12-0068-80
<210> 57
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 57
Figure 108145066-A0202-12-0068-81
Figure 108145066-A0202-12-0069-82
<210> 58
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 58
Figure 108145066-A0202-12-0069-83
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 59
Figure 108145066-A0202-12-0069-84
<210> 60
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 60
Figure 108145066-A0202-12-0070-85
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 61
Figure 108145066-A0202-12-0070-86
<210> 62
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 62
Figure 108145066-A0202-12-0070-88
<210> 63
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 63
Figure 108145066-A0202-12-0071-89
<210> 64
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 64
Figure 108145066-A0202-12-0071-90
<210> 65
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 65
Figure 108145066-A0202-12-0072-91
<210> 66
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 66
Figure 108145066-A0202-12-0072-92
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 67
Figure 108145066-A0202-12-0072-93
<210> 68
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 68
Figure 108145066-A0202-12-0073-94
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 69
Figure 108145066-A0202-12-0073-95
<210> 70
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 70
Figure 108145066-A0202-12-0074-96
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 71
Figure 108145066-A0202-12-0074-97
<210> 72
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 72
Figure 108145066-A0202-12-0074-98
<210> 73
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 73
Figure 108145066-A0202-12-0075-99
<210> 74
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 74
Figure 108145066-A0202-12-0075-100
<210> 75
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 75
Figure 108145066-A0202-12-0076-101
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 76
Figure 108145066-A0202-12-0076-102
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 77
Figure 108145066-A0202-12-0076-103
<210> 78
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 78
Figure 108145066-A0202-12-0077-104
<210> 79
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A鏈
<400> 79
Figure 108145066-A0202-12-0077-105
<210> 80
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 80
Figure 108145066-A0202-12-0078-106
<210> 81
<211> 21
<212> PRT
<213> Bos
<220>
<223> A鏈
<400> 81
Figure 108145066-A0202-12-0078-107
<210> 82
<211> 30
<212> PRT
<213> Bos
<220>
<223> B鏈
<400> 82
Figure 108145066-A0202-12-0078-108
<210> 83
<211> 21
<212> PRT
<213> Sus
<220>
<223> A鏈
<400> 83
Figure 108145066-A0202-12-0079-109
<210> 84
<211> 30
<212> PRT
<213> Sus
<220>
<223> B鏈
<400> 84
Figure 108145066-A0202-12-0079-110
<210> 85
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 85
Figure 108145066-A0202-12-0079-111
Figure 108145066-A0202-12-0080-112
<210> 86
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 86
Figure 108145066-A0202-12-0080-113
<210> 87
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 87
Figure 108145066-A0202-12-0080-114
<210> 88
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 88
Figure 108145066-A0202-12-0081-115
<210> 89
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 89
Figure 108145066-A0202-12-0081-116
<210> 90
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 90
Figure 108145066-A0202-12-0081-117
Figure 108145066-A0202-12-0082-118
<210> 91
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 91
Figure 108145066-A0202-12-0082-119
<210> 92
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 92
Figure 108145066-A0202-12-0082-120
<210> 93
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 93
Figure 108145066-A0202-12-0083-121
<210> 94
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 94
Figure 108145066-A0202-12-0083-122
<210> 95
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 95
Figure 108145066-A0202-12-0083-123
Figure 108145066-A0202-12-0084-124
<210> 96
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 96
Figure 108145066-A0202-12-0084-125
<210> 97
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B鏈
<400> 97
Figure 108145066-A0202-12-0084-126

Claims (15)

  1. 一種胰島素類似物，其相對於母胰島素係包括至少一項突變，其中該胰島素類似物係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變及/或在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變。
  2. 如請求項1之胰島素類似物，其中該母胰島素為人類胰島素、豬胰島素或牛胰島素。
  3. 如請求項1和2之胰島素類似物，其中該支鏈胺基酸係由纈胺酸(Val)、異白胺酸(Ile)和白胺酸(Leu)組成之群組中選出。
  4. 如請求項1至3中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置A14的突變，其係經由麩胺酸(Glu)，天門冬胺酸(Asp)和組胺酸(His)組成之群組中選出的胺基酸取代。
  5. 如請求項1至4中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置B30的突變。
  6. 如請求項5之胰島素類似物，其中在位置B30的突變為母胰島素在位置B30的胺基酸缺失(Des(B30)-突變)。
  7. 如請求項1至6中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物進一步係包括在位置B3經一麩胺酸(Glu)取代的突變。
  8. 如請求項1至7中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素進一步係包括在位置A21經甘胺酸(Gly)取代的突變。
  9. 如請求項1至8中任一項之胰島素類似物，其中該胰島素類似物的B鏈係包括下列組成之群組中選出的胺基酸序列，或由其組成：
    FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK(SEQ ID NO：22)
    FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：44)
    FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：48)
    FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：50)
    FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：58)
    FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：60)
    FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：64)
    FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：66)
    FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK(SEQ ID NO：70)
    FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：76)
    FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：78)
    FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK(SEQ ID NO：80)
    FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT(SEQ ID NO：85)
    FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：86)
    FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：87)
    FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：88)
    FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：89)
    FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：90)
    FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：91)
    FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：92)
    FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：93)
    FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT(SEQ ID NO：94)
    FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：95)
    FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：96)，及
    FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT(SEQ ID NO：97)。
  10. 如請求項1至9中任一項之胰島素類似物，其係包括：
    (a)具有如SEQ ID NO：43(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：44(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈，
    (b)具有如SEQ ID NO：47(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：48(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈，或
    (c)具有如SEQ ID NO：77(GIVEQCCTSICSLEQLENYCN)中所示之胺基酸序列的A鏈和具有如SEQ ID NO：78(FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK)中所示之胺基酸序列的B鏈。
  11. 一種胰島素類似物，其係由下列組成之群組中選出：
    Leu(B16)-人類胰島素，
    Val(B16)-人類胰島素，
    Ile(B16)-人類胰島素，
    Leu(B16)Des(B30)-人類胰島素，
    Val(B16)Des(B30)-人類胰島素，
    Ile(B16)Des(B30)-人類胰島素，
    Leu(B25)-人類胰島素，
    Val(B25)-人類胰島素，
    Ile(B25)-人類胰島素，
    Leu(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Leu(B16)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B16)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B16)-人類胰島素，
    Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Leu(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-人類胰島素，
    Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素，
    Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素，及
    Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-人類胰島素。
  12. 一種胰島素B鏈，其相對於母胰島素的B鏈係包括至少一項突變，其中該B鏈係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變及/或在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變，以及視需要其中該胰島素B鏈進一步係包括在位置B30的突變，其中在位置B30的突變為母胰島素在位置B30的蘇胺酸缺失(Des(B30)-突變)。
  13. 一種包括胰島素A鏈和胰島素B鏈之前胰島素，其中該胰島素B鏈相對於母胰島素B鏈係包括至少一項突變，其中該B鏈係包括在位置B16經支鏈胺基酸取代的突變及/或在位置B25經支鏈胺基酸取代的突變，以及視需要其中該前胰島素的胰島素A鏈係包括在位置A14經選自麩胺酸(Glu)、天門冬胺酸(Asp)和組胺酸(His)之胺基酸取代的突變。
  14. 一種聚核苷酸，其係編碼如請求項1至11中任一項之胰島素類似物、如請求項12之胰島素B鏈，及/或如請求項13之前胰島素。
  15. 一種宿主細胞，其係包括如請求項1至11中任一項之胰島素類似物、如請求項12之胰島素B鏈、如請求項13之前胰島素，及/或如請求項14之聚核苷酸。
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