KR102629006B1 - 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도 - Google Patents

인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도{A conjugate of insulin analog with reduced affinity to insulin receptor and use thereof}
본 발명은 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
생체 내 단백질들은 혈중 단백질 분해효소에 의해 분해되거나 신장을 통해 배설 혹은 수용체에 의한 제거되는 등 여러 경로를 거쳐 제거되는 것이 알려져 있다. 이에, 상기와 같은 단백질 제거 기전을 회피하여 생리활성 단백질의 반감기를 증가시켜 치료학적 효능을 높이려는 여러 시도가 진행되고 있다.
한편, 인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로서, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여 인슐린이 정상적인 기능을 수행하지 못한다. 그로 인해 당뇨 환자는 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하고 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 되며, 이는 다양한 합병증의 원인이 되고 있다. 따라서 인슐린 생성에 이상이 있거나(Type I), 인슐린 내성으로 인한(Type II) 당뇨 환자는 인슐린 치료가 필요하며, 인슐린 투여로써 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다.
하지만, 인슐린의 경우 다른 단백질이나 펩티드 호르몬과 같이 생체 내 반감기가 극히 짧아 지속적인 치료 효과를 보이지 못하여, 효과를 발휘하기 위해서는 지속적으로 반복 투여를 해야 한다는 단점이 있다. 이러한 빈번한 투여는 환자에게 엄청난 고통과 불편함을 야기하게 되므로, 환자의 순응성, 안전성 및 편의성 측면에서 개선이 요구되고 있다.
이에 인슐린과 같은 단백질 약물의 생체 내 반감기를 증가시켜 투여 횟수를 줄임으로써 환자의 삶의 질과 치료적 효과를 높이기 위한 다양한 단백질 제형화 연구와 화학적 결합체 (예, 지방산 결합체) 등에 대한 연구가 진행되고 있다.
기존 보고에 따르면, 50% 이상의 인슐린은 신장에서 제거되며, 나머지 인슐린들은 근육, 지방, 간 등의 작용 부위(target site)에서 수용체 매개 제거(receptor mediated clearance, RMC) 공정을 통해 제거된다.
이와 관련하여 J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13: 923, 및 Diabetes (1990) 39: 1033 등에서 인슐린의 RMC를 피하고자 in-vitro 활성을 약화시킴으로써 혈중 농도를 증가시킨다는 등의 여러 보고가 있으나, J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13:923의 경우 제시된 인슐린 아날로그는 2개 이상의 아미노산을 치환하였거나, 구체적인 결과를 제시하지 않았으며, Diabetes (1990) 39: 1033의 경우 인슐린 아날로그들은 수용체 결합력에서 변화가 없거나 인슐린 수용체에 직접 관여하는 아미노산을 치환하여 활성이 감소한 것으로 보고되는 등 여전히 지속성이 증대된 인슐린 아날로그의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 인슐린 아날로그의 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그의 결합체를 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그의 결합체를 포함하는, 천연형 인슐린의 결합체 대비 생체 내 지속성 및/또는 안정성이 증대된, 지속성 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그의 결합체를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그의 결합체 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 결합체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 결합체의 용도를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 인슐린 아날로그의 결합체이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 하나의 양태는 하기 화학식 1로 표시되는, 결합체이다:
[화학식 1]
X - La - F
여기서, X는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는, 인슐린 아날로그이고;
L은 링커이며;
a는 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는 X의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
하나의 구체예로서, 상기 X는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 및 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 X는 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 55의 A-쇄와 하기 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄의 모든 조합을 포함하는 인슐린 아날로그로서, 천연형 인슐린을 제외한 것, 즉 A-쇄가 서열번호: 53과 일치하면서 동시에 B-쇄도 서열번호: 54와 일치하는 펩티드를 제외한 것을 특징으로 한다.
[일반식 2]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 55)
상기 일반식 2에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 3]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)
상기 일반식 3에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,
Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
다른 구체예로서, 상기 X는 상기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 55의 A-쇄와, 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 X는 상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 일반식 2에서,
Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 3에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 일반식 2에서,
Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 3에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 X는
(1) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(2) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(3) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(4) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(5) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(6) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(7) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(8) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(9) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(10) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(11) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(12) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(13) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 X는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 F는 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 F는 IgG Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 L은 펩타이드, 지방산, 사카라이드 (saccharide), 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 L은 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 고분자 중합체는 1 내지 100kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그의 B-쇄의 N-말단 또는 인슐린 아날로그 내의 라이신 잔기에 링커가 연결된 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 링커가 연결된 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, 상기 결합체는 링커의 양 말단이 각각 인슐린 아날로그의 B-쇄의 N-말단과 면역글로불린 Fc의 N-말단에 연결된 구조인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 대비 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력이 저하된 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그의 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린의 약 10% 내지 약 90%인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 결합체는 F가 면역글로불린 Fc 영역이고, L이 폴리에틸렌글리콜이며 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린의 0.1% 내지 50%인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 결합체는 F가 면역글로불린 Fc 영역이고, L이 폴리에틸렌글리콜이며 X가 A-쇄 14번 아미노산이 아스파르트산인 것 외에는 천연형 인슐린과 서열이 동일한 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체이다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 결합체의 제조방법이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 결합체를 포함하는 조성물이다.
하나의 구체예로서, 상기 조성물은 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 조성물은 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 조성물은 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 인슐린 아날로그의 결합체를 포함하는, 천연형 인슐린의 결합체 대비 생체 내 지속성 및/또는 안정성이 증대된, 지속성 제제이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 인슐린 아날로그의 결합체 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환을 치료하는 방법이다.
하나의 양태로서, 상기 인슐린 관련 질환은 당뇨병인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 결합체의 용도이다.
하나의 양태로서, 상기 약제는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 상기 약제는 당뇨병의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 결합체의 용도이다.
본 발명에 따른 비천연형인 인슐린 아날로그의 결합체는 인슐린 투여를 필요로 하는 환자들의 편리성을 증대시킬 수 있다.
도 1은 인슐린 아날로그의 순도를 단백질 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 도이다. 대표로 인슐린 아날로그인 9, 10, 11, 12번 아날로그에 대한 결과이다.
1번 레인: 절편 크기 표시(size marker), 2번 레인: 천연형 인슐린, 3번 레인: 인슐린 아날로그 9번, 4번 레인: 인슐린 아날로그 10번, 5번 레인: 인슐린 아날로그 11번, 6번 레인: 인슐린 아날로그 12번
도 2a 내지 2d는 인슐린 아날로그의 순도를 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다. 대표로 인슐린 아날로그 9, 10, 11, 12번 아날로그에 대한 결과를 차례로 나타내었다 (도 2a 내지 2d). 각 도면에서 위에서부터 차례로 RP-HPLC (C18), RP-HPLC (C4) 및 SE-HPLC 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 본 발명에 따른 대표적인 인슐린 아날로그 결합체인 「인슐린 아날로그 10 - PEG - 면역글로불린 Fc」와 천연형 인슐린 결합체인 「천연형 인슐린 - PEG - 면역글로불린 Fc」 결합체 간의 약동학적 특성을 정상 마우스 (도 3a), SD 랫트 (도 3b), 및 비글견 (도 3c)에서 비교 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 대표적인 인슐린 아날로그 결합체인 「인슐린 아날로그 10 - PEG - 면역글로불린 Fc」와 천연형 인슐린 결합체인 「천연형 인슐린 - PEG - 면역글로불린 Fc」 결합체 간의 혈당 강하 능력을 DIO/STZ 랫트에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
한편, 본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 인슐린 아날로그의 결합체를 제공한다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그의 결합체는 인슐린 아날로그에 이의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 생체적합성 물질이 결합된, 결합체 형태일 수 있다. 본 명세서에서 상기 생체적합성 물질은 캐리어와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 상기 인슐린 아날로그의 결합체는 캐리어가 결합되지 않은 상기 인슐린 아날로그에 비하여 증가된 효력의 지속성을 나타낼 수 있으며, 본 발명에서는 이러한 결합체를 "지속형 결합체"로 지칭한다.
한편, 이러한 결합체는 비자연적인(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 결합체를 제공한다:
[화학식 1]
X - La - F
여기서, X는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는, 인슐린 아날로그이고;
L은 링커이며;
a는 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는 X의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그(insulin analog)"란 천연형 인슐린과 상이한 비천연형 인슐린을 의미한다. 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인간 인슐린과 상이한 비천연형 인간 인슐린을 포함한다. 상기 인슐린 아날로그는 본 발명의 결합체를 구성하는 일 모이어티(moeity)로서, 상기 화학식 1에서 X에 해당한다.
이러한 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 일부 아미노산을 부가, 결실 또는 치환의 형태로 변형시킨 아날로그를 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 상기의 서열 동일성을 가지면서, 천연형 인슐린에 비해 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력이 저하된 것일 수 있다. 또한, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있거나/있으며 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.
본 발명에서 천연형 인슐린 수용체에 대한 어떠한 인슐린 아날로그의 결합력이란 천연형 인슐린 수용체에 대한 어떠한 탐지자 리간드의 결합이 천연형 인슐린 또는 해당 인슐린 아날로그의 존재 하에서 억제되는 경쟁적 수용체 결합 저해(competitive inhibition of receptor binding) 조건 하에서 결합 저해도를 측정하였을 때 천연형 인슐린이 나타내는 결합 저해도와 인슐린 아날로그의 결합 저해도의 백분비를 의미한다. 여기서 결합 저해도는 적절한 기준에 따라 인슐린 수용체의 리간드 결합에 의하여 나타나는 신호가 유효하게 변화하는지 측정한 수치로 간접적으로 정의할 수 있다. 예를 들어 방사능 동위원소 등의 표지로 표지한 인슐린이 인슐린 수용체에 결합할 때 이 표지로부터 발생하는 신호가 표지가 없는 천연형 인슐린이나 인슐린 아날로그의 부가 후 각각 얼마나 줄어드거나 늘어나는지 측정(예를 들어 천연형 인슐린이나 인슐린 아날로그의 신호 감소를 위한 IC50값 측정)하여 얻은 측정값의 백분비(예를 들어 해당 인슐린 아날로그의 IC50에 대한 천연형 인슐린의 IC50의 백분비)로 결합력을 정의할 수 있다. 이러한 경쟁적 저해를 통한 수용체 결합력 측정은 이 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 구체적 실시 형태에서 이러한 측정에 필요한 천연형 인슐린 수용체로는 사람 천연형 인슐린 수용체(A 아이소폼 또는 B 아이소폼 또는 양쪽 모두)를 발현하는 세포막, 예를 들어 유전공학적 방법을 통해 사람 천연형 인슐린 수용체를 과발현하도록 조작한 세포의 세포막을 이용할 수 있으며, 탐지자 리간드로는 요오드-125를 표지한 천연형 인슐린을 사용할 수 있다. 본 발명의 더 구체적인 실시 형태에서 수용체 결합의 경쟁적 저해의 측정에는 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay, SPA)을 이용할 수 있다. 더욱 구체적인 실시 형태에서는 실험예 1의 방법으로 인슐린 수용체에 대한 결합력을 측정할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 인슐린 수용체 결합력(100%)과 비교하여 약 99% 또는 그 이하, 약 95% 또는 그 이하, 약 90% 또는 그 이하, 약 85% 또는 그 이하, 약 80% 또는 그 이하, 약 75% 또는 그 이하, 약 70% 또는 그 이하, 약 65% 또는 그 이하, 약 60% 또는 그 이하, 약 55% 또는 그 이하, 약 50% 또는 그 이하, 약 45% 또는 그 이하, 약 40% 또는 그 이하, 약 35% 또는 그 이하, 약 30% 또는 그 이하, 약 25% 또는 그 이하, 약 20% 또는 그 이하, 약 15% 또는 그 이하, 약 10% 또는 그 이하, 약 9% 또는 그 이하, 약 8% 또는 그 이하, 약 7% 또는 그 이하, 약 6% 또는 그 이하, 약 5% 또는 그 이하, 약 4% 또는 그 이하, 약 3% 또는 그 이하, 약 2% 또는 그 이하, 약 1% 또는 그 이하, 또는 약 0.1% 또는 그 이하의 인슐린 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있다(다만, 본 발명의 인슐린 아날로그는 인슐린 수용체에 대한 결합력이 0%에 해당하지는 않는다). 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 인슐린 아날로그의 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린의 약 10% 내지 약 90%인 것이 적절하나 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인슐린 대비 약하면 본 발명의 범주에 속한다. 결합력이 천연형 인슐린 대비 약할경우 인슐린 수용체에 의한 인슐린 아날로그의 제거가 약화되어 혈중 반감기가 향상되고 효력의 지속력을 기대할 수 있다.
본 발명의 한 실시 형태에서 인슐린 아날로그 결합체는 링커가 폴리에틸렌글리콜이고, 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이 면역글로불린 Fc 영역이고, 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력이 천연형 인슐린의 약 99% 또는 그 이하, 약 95% 또는 그 이하, 약 90% 또는 그 이하, 약 85% 또는 그 이하, 약 80% 또는 그 이하, 약 75% 또는 그 이하, 약 70% 또는 그 이하, 약 65% 또는 그 이하, 약 60% 또는 그 이하, 약 55% 또는 그 이하, 약 50% 또는 그 이하, 약 45% 또는 그 이하, 약 40% 또는 그 이하, 약 35% 또는 그 이하, 약 30% 또는 그 이하, 약 25% 또는 그 이하, 약 20% 또는 그 이하, 약 15% 또는 그 이하, 약 10% 또는 그 이하, 약 9% 또는 그 이하, 약 8% 또는 그 이하, 약 7% 또는 그 이하, 약 6% 또는 그 이하, 약 5% 또는 그 이하, 약 4% 또는 그 이하, 약 3% 또는 그 이하, 약 2% 또는 그 이하, 약 1% 또는 그 이하, 또는 약 0.1% 또는 그 이하의 인슐린 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있다(다만, 본 발명의 인슐린 아날로그 결합체는 인슐린 수용체에 대한 결합력이 0%에 해당하지는 않는다). 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 인슐린 아날로그 결합체의 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린의 0.1 내지 50%인 것이 적절하나 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인슐린 대비 약하면 본 발명의 범주에 속한다. 결합력이 천연형 인슐린 대비 약할 경우 인슐린 수용체에 의한 인슐린 아날로그 결합체의 제거가 약화되어 혈중 반감기가 향상되고 효력의 지속력을 기대할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 글루코스 흡수능 (100%) 대비 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 약 150% 이상, 약 160% 이상, 약 170% 이상, 약 180% 이상, 약 190% 이상, 또는 약 200% 이상의 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있다.
글루코스 흡수능의 측정은 당업계에 공지된 다양한 글루코스 흡수능 측정 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 천연형의 A쇄와 B쇄에 각각 대응하는 두 서열 부위들이 하나의 폴리펩타이드 사슬 안에 연결되어 있는 단쇄이거나, 이러한 서열 부위들이 각각 독립된 폴리펩타이드 사슬로 이루어져 있는 두 폴리펩타이드 사슬 형태일 수 있다. 이하 본 명세서에서 인슐린 아날로그의 A-쇄 또는 B-쇄라고 일컬을 때에는 해당 인슐린 아날로그가 두 폴리펩타이드 사슬 형태일 때의 그 구성 A-쇄 또는 B-쇄를 가리키는 것뿐 아니라, 아날로그가 단쇄 형태일 때에도 해당 단쇄 폴리펩타이드 내에서 천연형 A-쇄에 대응하는 서열 부위 혹은 천연형 B-쇄에 대응하는 서열 부위를 각각 가리키는 의미로 경우에 맞게 해석하여야 한다. 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A-쇄 또는 이에 대응되는 폴리펩타이드로부터 선택하는 하나와 천연형 인슐린의 B-쇄 혹은 이에 대응되는 폴리펩타이드로부터 선택한 한 사슬의 조합인 단쇄 또는 두 폴리펩타이드 사슬 형태일 수 있다. 여기서, 상기 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄에 대응된다는 것은 예를 들어 해당 폴리펩타이드 중 어느 하나를 천연형 인슐린의 A-쇄 또는 B-쇄와 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 경우인데, 특별히 이에 제한되지는 않으며, 해당 폴리펩타이드를 구성하는 서열과 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄의 서열과의 비교를 통하여 당업자가 용이하게 파악할 수 있다.
상술한 바와 같이, 여기에 기술된 내용은 인슐린 아날로그의 하위 개념에 대한 설명에도 모두 적용되는 것으로 의도된다.
천연형 인슐린은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당 조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린은 2개의 폴리펩티드 쇄, 즉 각각 21개 및 30개 아미노산 잔기를 포함하는 A-쇄 및 B-쇄로 구성되어 있고, 이들은 2개의 이황화 다리로 상호 연결되어 있다. 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄는 각각 하기 서열번호: 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
A-쇄:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호: 53)
B-쇄:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호: 54)
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본원에 기술된 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 생체 내에서 혈당 조절 기능을 보유하면서 수용체 결합력이 저하된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 인슐린 아날로그는 낮은 수용체-매개 내재화 (receptor-mediated internalization) 또는 수용체-매개 제거 (receptor-mediated clearance)를 나타낼 수 있다면 특별히 그 종류 및 크기에 제한되지 않을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 증가된 혈중 반감기를 나타낼 수 있다.
본 발명의 인슐린 아날로그는 역방향 인슐린, 천연형 인슐린의 유도체, 천연형 인슐린의 단편 등을 포함한다. 이러한 인슐린 아날로그는 유전자 재조합법뿐만 아니라, 고상(solid phase) 방법으로도 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린의 유도체"는 천연형 인슐린과 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 인슐린 서열을 개질 (modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드, 천연형 인슐린과 같이 생체 내의 혈당 조절 기능을 조절하는 천연형 인슐린의 모방체를 포함한다. 이러한 천연형 인슐린의 유도체는 생체 내 혈당 조절 기능을 가지는 것일 수 있다.
구체적으로, 천연형 인슐린의 유도체는 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환 (substitution), 추가 (addition), 제거 (deletion) 및 수식 (modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형시킬 수 있다.
구체적으로, 천연형 인슐린의 A-쇄, B-쇄와 각각 적어도 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이는 것일 수 있고/있거나 인슐린의 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환 (예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거 (예; deamination) 또는 수식 (예; N-methylation) 된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유도체 제조를 위한 여러 방법들의 조합으로 본 발명에 적용되는 천연형 인슐린의 유도체를 제조할 수 있다.
또한, 천연형 인슐린의 유도체의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질 혹은 번역 후 변형 (예, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자 내 공유결합 등) 함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 상기 천연형 인슐린의 유도체는 천연형 인슐린의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 단편"은 천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다. 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유할 수 있다.
또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 상기 천연형 인슐린의 유도체 및 단편의 제조에 사용된 각각의 제조 방법이 독립적으로 사용되거나, 조합되어 사용되어 제조된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기와 같은 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄에서 특정 아미노산 잔기의 변형을 포함하는 것으로, 구체적으로는 천연형 인슐린의 A-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형되고/되거나 B-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산, A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 그 예로 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 히스티딘, 라이신, 또는 알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 기술된 아미노산들 중 1 이상, 2 이상, 3 이상, 또는 4개 가 본래의 아미노산이 아닌 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 변이는 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 또는 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이일 수 있다.
따라서, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이를 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로는, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 하기 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그일 수 있다. 이러한 인슐린 아날로그는 A-쇄와 B-쇄 서열이 이황화 결합으로 상호 연결된 형태이거나, 프로인슐린의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[일반식 2]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21 (서열번호: 55)
상기 일반식 2에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 3]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)
상기 일반식 3에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,
Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
여기서, A-쇄가 서열번호: 53과 일치하면서도, B-쇄가 서열번호: 54의 B-쇄와 일치하는 펩티드는 제외될 수 있다.또한, 상기 기술한 특징적인 아미노산 잔기, 특히 A-쇄의 14번 아미노산 및/또는 19번 아미노산 및/또는 B-쇄의 16번 아미노산, 및/또는 25번 아미노산에 대한 특징적인 변이 (즉, 천연형 인슐린에 존재하지 않는 아미노산 잔기)를 포함하면서, 상기 일반식 2의 A-쇄 및 일반식 3의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지며, 천연형 인슐린에 비하여 수용체 결합력이 감소된 펩타이드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어, "상동성(homology)"은 천연형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.
구체적인 하나의 양태예서, 상기 인슐린 아날로그는 상기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 55의 A-쇄와, 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그일 수도 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 인슐린 아날로그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 하기에 해당할 수 있다:
(1) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(2) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(3) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(4) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(5) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(6) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(7) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(8) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(9) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(10) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(11) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(12) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(13) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
또한, 구체적인 일 실시양태에 따르면, 상기 인슐린 아날로그는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 아날로그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기 기술된 특정 서열을 포함하는 것, 상기 기술된 특정 서열로 (필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본원에서 '특정 서열번호로 구성되는 펩타이드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
한편, 상기 인슐린 아날로그는 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다.
또한, 펩타이드는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산， 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
상기 인슐린 아날로그는 펩타이드 제조에 대해 당업계에 공지된 방법을 이용하여 당업자가 용이하게 생산할 수 있다. 예컨대, 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로 생산할 수 있다.
a) 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그를 발현시키는 단계; 및
b) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.
본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.
사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.
본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 인슐린 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.
전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인슐린 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 인슐린 아날로그는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.
본 발명의 구체예에서는, 형질전환체로부터 봉입체 형태로 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하기 위하여 하기 단계를 추가적으로 포함할 수 있다:
b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;
b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계;
b-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;
b-4) 정제된 인슐린 아날로그를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;
b-5) 처리된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계.
본 발명에서 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산은 구체적으로는 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 및 51로 기재되는 염기서열을 포함한다. 본 발명은 일 실시양태에서 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 및 51로 기재되는 염기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 상동성, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 더욱 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 핵산이 코딩한 펩티드가 생체 내 혈당조절 기능을 보유하면서, 천연형 인슐린에 비해 수용체 결합력이 저하된 것을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인슐린 아날로그를 수득할 수 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
목적 핵산인 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다. 구체적으로는, 숙주세포로 대장균을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 상기 결합체에서 F는 X의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질로서, 본 발명의 상기 결합체를 구성하는 모이어티의 일 구성에 해당한다.
상기 F는 X와 공유 화학결합 또는 비공유 화학결합으로 서로 결합되는 것일 수 있으며, 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L을 통하여 F와 X가 서로 결합되는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, X와 L, 및 L과 F는 공유결합으로 서로 연결되는 것일 수 있으며, 이때 상기 결합체는 화학식 1의 순서로, X, L, 및 F가 공유결합을 통하여 각각 연결된 결합체이다.
상기 X의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질은 생체적합성 물질일 수 있으며, 예를 들어, 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 엘라스틴의 경우 수용성 전구체인 인간 트로포엘라스틴 (tropoelastin) 일 수 있으며, 이들 중 일부 서열 혹은 일부 반복단위의 중합체일 수 있으며, 예컨대, 엘라스틴 유사 폴리펩타이드인 경우를 모두 포함하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 고분자 중합체의 예로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고분자 중합체를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리에틸렌 글리콜은, 에틸렌 글리콜 동종 중합체, PEG 공중합체, 또는 모노메틸-치환된 PEG 중합체 (mPEG)의 형태를 모두 포괄하는 용어이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 생체적합성 물질은 폴리-리신, 폴리-아스파르트산 및 폴리-글루탐산과 같은 폴리-아미노산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 지방산은 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적인 예로, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으며, 보다 구체적으로 IgG Fc 영역일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
인슐린 아날로그의 생체 내에서 가용성 및/또는 반감기를 증가시키고/시키거나 생체이용율을 증가시키기 위해 본 발명의 인슐린 아날로그 내의 하나 이상의 아미노산 측쇄에 생체적합성 물질에 접합될 수 있다. 이러한 변형은 또한 치료학적 단백질 및 펩타이드의 소거 (clearance)를 감소시킬 수 있다.
상술한 생체적합성 물질은 수용성 (양친매성 또는 친수성) 및/또는 무독성 및/또는 약학적으로 허용가능한 것일 수 있다.
상기 F는 X와 직접적으로 연결되거나 (즉, 상기 화학식 1에서 a가 0이거나), 또는 링커 (L)를 통해 연결된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 L은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커일 수 있다.
상기 L이 펩타이드성 링커일 때, 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 예컨대 1개부터 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 F와 X를 연결하기 위하여 공지의 다양한 펩타이드 링커가 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 예로 [GS]x 링커, [GGGS]x 링커 및 [GGGGS]x 링커 등을 포함하며, 여기서 x는 1 이상의 자연수일 수 있다. 그러나, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "비펩타이드성 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 포함한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 비펩타이드성 링커는 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있으며, 상기 화학식 1에서 L에 해당된다. 본 발명에서 L이 비펩타이드성 링커로서 생체적합성 중합체일 때에는 비펩타이드성 링커의 말단 부에는 이 링커 L을 인슐린 아날로그 X 및/또는 F와 공유결합으로 연결시키기 위한 연결 요소를 더 포함할 수 있다. 이 연결 요소는 상기 생체적합성 중합체의 반복 단위가 아닌 원자 또는 원자단으로서 상기 생체적합성 중합체와 X 및/또는 F를 공유결합으로 연결하기 적절한 것이면 특별히 제한이 없다.
상기 La에서 a는 1 이상일 수 있으며, a가 2 이상일 때 각각의 L은 독립적일 수 있다.
본 발명에서 상기 비펩타이드성 링커는 비펩타이드성 중합체와 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 양쪽 말단에 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역 및 X와 결합될 수 있는 반응기를 포함하는 비펩타이드성 링커를 통하여 F와 X가 서로 공유결합적으로 연결된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 지방산, 사카라이드 (saccharide), 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명에서 상기 고분자 중합체는 0 초과 약 100 kDa 범위, 구체적으로 약 1 내지 약 100 kDa 범위, 보다 더 구체적으로 약 1 내지 약 20 kDa 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(polylactic acid) 및 PLGA(polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
보다 구체적인 실시형태에서 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질 분해 효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0 초과 약 100 kDa 범위, 구체적으로 약 1 내지 약 100 kDa 범위, 보다 더 구체적으로 약 1 내지 약 20 kDa 범위이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 F에 해당하는 폴리펩타이드와 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
전술한 바와 같이 하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 링커의 양 말단은 연결 요소들을 통하여 각각 F와 X에 연결될 수 있다. 예컨대 이 구체적인 실시 형태에서는 면역글로불린 Fc 영역의 아민기 또는 티올기 및 X의 아민기 또는 티올기에 화학 반응을 일으켜 공유결합을 형성할 수 있는(즉 결합체의 연결 요소로 변환되는) 반응기를 그 말단에 보유한 비펩타이드성 중합체(반응기 보유 비펩타이드성 중합체)와 면역글로불린 Fc 영역 및/또는 인슐린 아날로그를 반응(연결 반응)시켜 본 발명의 인슐린 아날로그 결합체를 제조한다. 즉 여기서 반응기 보유 비펩타이드성 중합체는 연결 반응을 통하여 결합체의 일부를 구성하는 비펩타이드성 링커가 되는데, 이때 결합체 내에서 이 비펩타이드성 링커는 상기 반응기 보유 비펩타이드성 중합체의 반복 단위들과 연결 요소로 이루어진다.
구체적으로, 상기 결합체 제조를 위하여 사용할 수 있는 반응기 보유 비펩타이드성 중합체로는 양쪽 말단에 각각 F (예컨대, 면역글로불린 Fc 영역) 및 X와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 X 혹은 F (예컨대, 면역글로불린 Fc 영역)의 N-말단 또는 리신에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 티올기와 결합될 수 있는 반응기가 있는 비펩타이드성 중합체를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, F, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역 및 X와 공유결합을 형성할 수 있는, 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석시니미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
비펩타이드성 링커는 이러한 반응기의 변환을 통하여 X와 F에 연결 요소를 거쳐 이어질 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 아민화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 반응기 보유 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단의 반응기는 서로 동일하거나 또는 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기, 또는 부틸 알데히드기를 가질 수 있다. 그러나, 반응기 보유 비펩타이드성 중합체의 각 말단에 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역과 X가 결합될 수 있다면, 특별히 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 반응기 보유 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에는 반응기로서 말레이미드기를 포함하고, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기 등을 포함할 수 있다.
양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 중합체는 X, 즉 인슐린 아날로그의 N-말단 영역 또는 라이신 잔기에 연결되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 인슐린 아날로그의 N-말단 영역, 구체적으로 최말단 아미노산의 아민기, 또는 인슐린 아날로그 내부에 존재하는 라이신의 아민기에 상기 비펩타이드성 중합체, 구체적으로 PEG가 연결되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또한, 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 중합체는 F, 예컨대 면역글로불린 Fc의 N-말단 영역에 연결되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc의 N-말단 영역, 구체적으로 최말단 아미노산의 아민기에 상기 비펩타이드성 중합체가 연결되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기에서 용어 "N-말단 영역"은 인슐린 아날로그 또는 면역글로불린 Fc의 아미노 말단 영역을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, N-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 아미노산 잔기 주변의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
만약, 상기 반응기 보유 비펩타이드성 중합체의 하나의 말단에 알데히드기가 존재하여 이 알데히드기를 인슐린 아날로그의 N-말단에 위치한 아민기에 연결하는 경우에는 환원성 아민화 반응을 통하여 연결할 수 있으며, 상기 반응기 보유 비펩타이드성 중합체의 다른 하나의 말단에 알데히드기가 존재하고, 면역글로불린 Fc의 N-말단에 위치한 아민기에 연결하는 경우 역시 환원성 아민화 반응을 통하여 서로 연결될 수 있다.
본 발명 결합체의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 제조에 사용한 반응기 보유 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 알데히드기 반응기를 갖춘 PEG인 경우로서, 환원적 아민화를 통하여 X와 F의 아미노기에 연결되어 결합체를 형성한 것인데 이 때 이 결합체는 다음과 같은 형태의 구조이다.
X-NHCH2-W-PEG모이어티-Z-CH2NH-F
여기서, -CH2W-는 비펩타이드성 중합체와 X를, -Z-CH2-는 비펩타이드성 중합체와 F를 잇는 연결 요소로서 W와 Z는 부존재하거나 알킬렌 등의 2가 작용기이다. -CH2W-와 -Z-CH2-의 메틸렌은 각각의 알데히드 반응기에서 유래한 것이며, X-NH와 NH-F의 질소 원자는 각각 연결 반응에 이용된 인슐린 아날로그와 F의 아미노기에서 유래한다.
상기 구조에서 PEG 모이어티는, -(CH2CH2O)n-구조 뿐만 아니라 연결 요소와 이 -(CH2CH2O)n- 사이에 개재하는 산소 원자도 포함할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이합체 형태 (dimeric form)일 수 있으며, 이합체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 공유결합적으로 연결될 수 있으며, 이때 상기 면역글로불린 Fc와 X는 비펩타이드성 중합체에 의해 서로 연결될 수 있다. 한편, 이합체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 두 분자가 대칭적으로 결합하는 것 역시 가능하다. 이때 상기 면역글로불린 Fc와 X는 비펩타이드성 링커에 의해 서로 연결될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
상기 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질 형태의 결합체를 코딩하는 것일 수 있다.
또한, 상기 결합체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 해당 서열과 75% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 발명의 범주에 포함한다.
상기 벡터, 형질전환체에 대해 앞서 기술한 설명이 본 양태에도 모두 적용된다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 결합체의 제조 방법을 제공한다.
상기 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 방법은
(a) 2 이상의 말단 반응기를 가지는 비펩타이드성 중합체와 인슐린 아날로그 또는 캐리어 중 하나를 반응시켜 인슐린 아날로그 또는 캐리어가 한쪽 말단에 부착되고, 다른 쪽 말단에 반응기 (reactive end group)를 가지는, 비펩타이드성 중합체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된, 인슐린 아날로그 또는 캐리어가 한쪽 말단에 부착되고, 다른 쪽 말단에 말단 반응기을 가지는, 비펩타이드성 중합체와 캐리어 또는 인슐린 아날로그 중 다른 하나를 반응시켜 인슐린 아날로그와 캐리어가 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결된, 결합체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체, 캐리어, 인슐린 아날로그와 이들의 연결 구성에 대해서는 앞서 기술한 설명이 모두 적용된다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 결합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 조성물은 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다. 보다 더 구체적으로 상기 조성물은 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 관련 질환"은 인슐린의 생리활성이 없거나 낮아 발생하거나 진행하는 질환으로서, 예컨대 당뇨병을 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 인슐린 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 인슐린 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그 결합체를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 비자연적으로 존재하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 그 외에도 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 유효성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합체의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 인슐린 아날로그의 결합체를 포함하는, 천연형 인슐린의 결합체 대비 생체 내 지속성 및/또는 안정성이 증대된, 지속성 제제를 제공한다.
상기 인슐린 아날로그 및 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 인슐린 아날로그의 결합체 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 인슐린 아날로그 및 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
하나의 양태로서, 상기 인슐린 관련 질환은 당뇨병이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 결합체의 용도를 제공한다.
하나의 양태로서, 상기 약제는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
다른 양태로서, 당뇨병의 예방 또는 치료용이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 결합체의 용도를 제공한다.
상기 인슐린 아날로그, 결합체, 인슐린 관련 질환에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 단쇄 인슐린 아날로그 발현 벡터의 제작
보유 중인 천연형 인슐린 발현 벡터를 주형으로 하여 A-쇄 또는 B-쇄의 아미노산을 하나씩 변형시킨 인슐린 아날로그들을 제작하기 위해 순방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드를 합성한 후(표 2), PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
하기 표 1에 각각의 A 쇄 또는 B쇄의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 즉, 아날로그 1의 경우 A 쇄의 14번 티로신(Y)이 히스티딘(H)으로 치환, 아날로그 6의 경우 B쇄의 16번 티로신이 글루탐산(E)으로 치환된 형태이다.
인슐린 아날로그 번호 변화서열
아날로그1 A 14Y -> H
아날로그2 A 14Y -> K
아날로그3 A 19Y -> E
아날로그4 A 19Y -> S
아날로그5 A 19Y -> T
아날로그6 B 16Y -> E
아날로그7 B 16Y -> S
아날로그8 B 16Y -> T
아날로그9 A 14Y -> A
아날로그10 A 14Y -> D
아날로그11 B 16Y -> D
아날로그12 B 25F -> D
아날로그13 B 25F -> E
인슐린 아날로그 증폭을 위한 프라이머는 하기 표 2에 나타냈다.
아날로그 서열 서열 번호
아날로그 1 5' CAGCATCTGCTCCCTCCATCAGCTGGAGAACTAC 3'
5' GTAGTTCTCCAGCTGATGGAGGGAGCAGATGCTG 3'		 서열번호 1
서열번호 2
아날로그 2 5' CAGCATCTGCTCCCTCAAGCAGCTGGAGAACTAC 3'
5' GTAGTTCTCCAGCTGCTTGAGGGAGCAGATGCTG 3'		 서열번호 3
서열번호 4
아날로그 3 5' CTACCAGCTGGAGAACGAGTGCAACTGAGGATCC 3'
5' GGATCCTCAGTTGCACTCGTTCTCCAGCTGGTAG 3'		 서열번호 5
서열번호 6
아날로그 4 5' CTACCAGCTGGAGAACTCCTGCAACTGAGGATCC 3'
5' GGATCCTCAGTTGCAGGAGTTCTCCAGCTGGTAG 3'		 서열번호 7
서열번호 8
아날로그 5 5' CTACCAGCTGGAGAACACCTGCAACTGAGGATCC 3'
5' GGATCCTCAGTTGCAGGTGTTCTCCAGCTGGTAG 3'		 서열번호 9
서열번호 10
아날로그 6 5' CTGGTGGAAGCTCTCGAGCTAGTGTGCGGGGAAC 3'
5' GTTCCCCGCACACTAGCTCGAGAGCTTCCACCAG 3'		 서열번호 11
서열번호 12
아날로그 7 5' CTGGTGGAAGCTCTCTCCCTAGTGTGCGGGGAAC 3'
5' GTTCCCCGCACACTAGGGAGAGAGCTTCCACCAG 3'		 서열번호 13
서열번호 14
아날로그 8 5' CTGGTGGAAGCTCTCACCCTAGTGTGCGGGGAAC 3'
5' GTTCCCCGCACACTAGGGTGAGAGCTTCCACCAG 3'		 서열번호 15
서열번호 16
아날로그 9 5' CAGCATCTGCTCCCTCGCCCAGCTGGAGAACTAC 3'
5' GTAGTTCTCCAGCTGGGCGAGGGAGCAGATGCTG 3'		 서열번호 17
서열번호 18
아날로그 10 5' CAGCATCTGCTCCCTCGACCAGCTGGAGAACTAC 3'
5' GTAGTTCTCCAGCTGGTCGAGGGAGCAGATGCTG 3'		 서열번호 19
서열번호 20
아날로그 11 5' CTGGTGGAAGCTCTCGACCTAGTGTGCGGGGAAC 3'
5' GTTCCCCGCACACTAGGTCGAGAGCTTCCACCAG 3'		 서열번호 21
서열번호 22
아날로그 12 5' GGGGAACGAGGCTTCGACTACACACCCAAGACC 3'
5' GGTCTTGGGTGTGTAGTCGAAGCCTCGTTCCCC 3'		 서열번호 23
서열번호 24
아날로그 13 5' GGGGAACGAGGCTTCGAGTACACACCCAAGACC 3'
5' GGTCTTGGGTGTGTACTCGAAGCCTCGTTCCCC 3'		 서열번호 25
서열번호 26
인슐린 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였다. 이와 같은 조건에서 얻어진 인슐린 아날로그 단편은 세포내의 봉입체 형태로 발현시키기 위하여 pET22b 벡터에 삽입되어 있으며 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 13라 명명하였다. 상기 발현 벡터는 T7 프로모터의 조절 하에 인슐린 아날로그 1 내지 13의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 내에서 인슐린 아날로그 단백질을 봉입체 형태로 발현시켰다.
하기 표 3에 각각의 인슐린 아날로그 1 내지 13의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다.
각각의 서열 변경 확인은 DNA 서열 분석을 통하여 확인하였고, 그 결과, 각각의 인슐린 아날로그가 목적하는 바에 따라, 서열이 변경이 되었음을 확인할 수 있었다.
아날로그 서열 서열번호
아날로그 1 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC CAT CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 27
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 28
아날로그 2 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC AAG CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 29
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 30
아날로그 3 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC GAG TGC AAC 서열번호 31
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Glu Cys Asn 서열번호 32
아날로그 4 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TCC TGC AAC 서열번호 33
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Ser Cys Asn 서열번호 34
아날로그 5 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC ACC TGC AAC 서열번호 35
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Thr Cys Asn 서열번호 36
아날로그 6 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC GAG CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 37
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 38
아날로그 7 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TCC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 39
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 40
아날로그 8 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC ACC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 41
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 42
아날로그 9 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GCC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 43
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 44
아날로그 10 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 45
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 46
아날로그 11 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC GAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 47
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 48
아날로그 12 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC GAC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 49
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 50
아날로그 13 DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC GAG TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 서열번호 51
단백질 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 서열번호 52
실시예 2: 재조합 인슐린 아날로그 융합 펩타이드의 발현
T7 프로모터 조절하의 재조합 인슐린 아날로그 발현을 수행 하였다. 각각의 재조합 인슐린 아날로그 발현 벡터로 E. coli BL21-DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3); 노바젠)을 형질전환하였다. 형질 전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 따랐다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50 ㎍/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 인슐린 아날로그들의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알을 녹여 500 ml의 2X 루리아 브로스에 접종하고 37℃에서 14~16시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 5.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 50 L 발효기(MSJ-U2, B.E.MARUBISHI, 일본)를 이용하여 종 배양액을 17 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스(bath) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 20 L/분(1 vvm), 교반 속도 500 rpm 그리고 30% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 100이상에서 최종 농도 500 μM의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 재조합 인슐린 아날로그의 회수 및 재접힘 ( refolding )
상기 실시예 2에서 발현시킨 재조합 인슐린 아날로그들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 세포 펠렛 100 g(wet weight)을 1 L 용해 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M NaCl 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재 부유하였다. 미세용액화 프로세서 Microfluidizer (Microfluidic Corp. Model M-110EH-30)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 7,000 rpm으로 4~8℃에서 20분 원심분리하여 상층액을 버리고, 3 L 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA)에 재부유하였다. 7,000 rpm으로 4~8℃에서 20분 동안 원심 분리하여 펠렛을 증류수에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심 분리하였다. 펠렛을 취하여 완충액(1 M L-Glycine, 3.78 g L-Cysteine-HCl, pH 10.6)에 재 부유하여 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 재 부유된 재조합 인슐린 아날로그 회수를 위하여 8M 우레아를 추가한 후 3~5시간 교반하였다. 가용화된 재조합 프로인슐린 아날로그의 재접힘(refolding)을 위하여 7,000 rpm으로 4~8℃에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한 후, 환원제(15mM L-Cysteine-HCL)을 1시간 처리하고 여기에 일정 배수의 증류수를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 넣어주면서 4~8℃에서 12시간 이상 교반하였다.
실시예 4: 양이온 교환 크로마토그래피 정제
45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 SP FF (GE healthcare사) 컬럼에 재접합이 끝난 시료를 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
실시예 5: 트립신( Trypsin )과 카복시펩티데이즈 B( Carboxypeptidase B) 처리
용출된 시료를 한외여과막으로 염을 제거하고, 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 교체하였다. 얻어진 시료 단백량의 약 30,000 몰비에 해당하는 트립신과 약 3,000 몰비에 해당하는 카복시펩티데이즈 B를 첨가한 후, 4~8℃에서 16시간이상 교반하였다.
실시예 6: 양이온 교환 크로마토 그래피 정제
반응이 끝난 시료를 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 SP HP (GE healthcare사) 컬럼에 다시 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트(pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
실시예 7: 역상 크로마토 그래피 정제
상기 실시예 6에서 얻어진 시료에서 순수한 인슐린 아날로그를 순수 분리하기 위해 소디움포스페이트와 아이소프로판올을 포함한 버퍼로 평형화된 역상 크로마토 그래피 Source30RPC (GE healthcare, 미국)에 결합시킨 후, 소디움포스페이트와 이소프로판올을 포함한 완충액을 사용하여 선형 농도 구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
이와 같이 정제된 인슐린 아날로그는 단백질 전기영동(SDS-PAGE, 도 1) 및 고압 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였으며 이중 대표로 인슐린 아날로그 9번, 10번, 11번, 12번의 순도 분석 결과 나타내었다 (도 2).
실시예 8: 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 제조
상기 실시예 1 내지 7을 통하여 제조한 인슐린 아날로그의 결합체를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
대표적으로, 아날로그 10의 지속형 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
3.4K propion-ALD(2) PEG (양 말단에 각각 프로피온 알데히드기를 하나씩 지니고 있는 3.4kDa의 PEG, 미국 NOF사)를 인슐린 아날로그 10의 B-쇄의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 인슐린 아날로그 10 : PEG의 몰 비를 1 : 4로, 인슐린 아날로그 10의 농도를 5 mg/ml로 4oC에서 약 2시간 반응시켰다. 이때 반응은 50mM 구연산 나트륨 완충액 (pH 5.0)과 45% 아이소프로판올의 혼합 용매에서, 3mM 농도의 소디움 시아노보로하이드라이드 (sodium cyanoborohydride (NaCNBH3))환원제를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 구연산 나트륨 (pH 3.0), 45% EtOH가 포함된 버퍼와 KCl 농도 구배를 이용한 SP-HP (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 정제하였다.
다음으로, 상기 인슐린 아날로그가 부착된 PEG를 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결시키기 위하여, 상기 정제된 모노 페길화된 (mono-PEGylated) 인슐린 아날로그와 면역글로불린 Fc 단편의 몰비가 1 : 1.2가 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 20 mg/ml로 하여 25oC에서 15시간 반응시켰다. 이때 반응액은 100 mM 헤페스 (HEPES) 완충액(pH 8.2)과 염화 나트륨에 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다.
반응이 종결된 후 반응액은 Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼와 NaCl 농도 구배를 이용하여 Q-HP(GE, 미국) 컬럼에 적용하고, 황산암모늄 (ammoniumsulfate)과 Tris-HCl (pH 7.5)의 농도 구배를 이용하여, Source 15ISO (GE, 미국)에 적용하여, 인슐린 아날로그 10 - 3.4K PEG - 면역글로불린 Fc 결합체를 정제하였다.
비교예 : 지속형 천연형 인슐린 결합체의 제조
천연형 인슐린(인도 Biocon사) B-쇄의 N-말단에 3.4K propion-ALD(2) PEG (양 말단에 각각 프로피온 알데히드기를 하나씩 지니고 있는 3.4kDa의 PEG, 미국 NOF사)를 페길화시키기 위하여, 실시예 8과 같이 페길화 반응 및 정제 컬럼을 적용하여 모노 페길화된 (mono-PEGylated) 천연형 인슐린을 정제하였다.
다음으로, 상기 천연형 인슐린이 부착된 PEG를 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결시키기 위하여, 상기 정제된 모노 페길화된 (mono-PEGylated) 천연형 인슐린과 면역글로불린 Fc 단편을 실시예 8과 같은 반응 조건과 정제 컬럼을 적용하여, 천연형 인슐린-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조하였다.
실험예 1: 인슐린 아날로그들의 인슐린 수용체 결합력 비교
인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력을 측정하기 위하여, SPA(Scintillation proximity assay) 방법을 이용하여 분석하였다. 먼저, 인슐린 수용체 B 아이소폼이 발현된 세포막을 획득하기 위하여 lipofectamine (Life technology사, 미국)을 이용하여 CHO 세포주에 트랜스팩션 시켜 인슐린 수용체 B 아오소폼이 과발현된 CHO 세포주를 제작하였고, 제작된 세포주로부터 호모게나이저 (Wheaton사, 미국)로 균질화 한 뒤, sucrose cushion법으로 세포막을 분리하여 획득 하였다. 획득한 사람 천연형 인슐린 수용체 B 아이소폼이 발현된 CHO 세포주의 세포막과 PVT SPA 비드를 96-웰 피코 플레이트(PerkinElmer사, 모델번호 6005162, 미국)에 함께 넣고, 경쟁자로서 10 가지 이상의 농도로 반응액(50mM Tris-HCl pH 7.8, 150mM NaCl, 0.1% BSA)에 희석한 인간 인슐린 또는 각각의 인슐린 아날로그, 그리고 탐지자 리간드로서 방사성 동위원소인 요오드-125로 표지한 사람 천연형 인슐린(PerkinElmer사, 모델번호 NEX-420, 미국)을 함께 넣은 뒤 상온에서 4시간 동안 경쟁 반응시켰다. 4 시간 뒤 베타 카운터(PerkinElmer 사, 모델번호 C9904V1, 미국)를 이용하여 인슐린 수용체의 결합력을 측정하였다. 베타카운터에서 측정된 수치는 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 이용하여 실험한 각 물질의 IC50을 산출하였으며, 인간 인슐린의 인슐린 수용체 결합력에 대한 인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 IC50의 백분비를 결합력으로 수치화하였다.
그 결과, 인간 인슐린과 대비하여 인슐린 아날로그(1번)은 90%, 인슐린 아날로그(2번)은 95%, 인슐린 아날로그(3번)은 1.0%, 인슐린 아날로그(4번)은 <0.1%, 인슐린 아날로그(6번)은 20%, 인슐린 아날로그(7번)은 8.5%, 인슐린 아날로그(9번)은 79%, 인슐린 아날로그(10번)은 79%, 인슐린 아날로그(11번)은 24%, 인슐린 아날로그(12번)은 <0.1%, 인슐린 아날로그(13번)은 <0.1%의 수용체 결합력이 확인되었다(표 4). 이와 같이 본 발명의 인슐린 아날로그들은 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소되었음을 관찰하였다.
물질명 인슐린 수용체 결합력
( vs . 인간 인슐린)
인슐린 아날로그 인슐린 아날로그 (1번) 90%
인슐린 아날로그 (2번) 95%
인슐린 아날로그 (3번) 1.0%
인슐린 아날로그 (4번) <0.1%
인슐린 아날로그 (6번) 20%
인슐린 아날로그 (7번) 8.5%
인슐린 아날로그 (9번) 79%
인슐린 아날로그 (10번) 79%
인슐린 아날로그 (11번) 24%
인슐린 아날로그 (12번) <0.1%
인슐린 아날로그 (13번) <0.1%
실험예 2: 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 수용체 결합력 확인
상기 실험예 1에 기재된 방법으로 지속형 인슐린 아날로그의 인슐린 수용체와 IGF-1 수용체에 대한 결합력을 확인하였다.
그 결과, 인간 천연형 인슐린과 대비하여 인슐린 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체가 2.4±0.4%, 인슐린 아날로그 10-PEG-면역글로불린 Fc 결합체가 1.3±0.2%로 확인되었으며, IGF-1 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체와 인슐린 아날로그 10-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 모두 사람 천연형 IGF-1에 대하여 1% 미만임을 확인하였다. 이와 같이 본 발명의 인슐린 아날로그 10-PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 천연형 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소되었고, 두 물질 모두 PEG-면역글로불린 Fc 결합을 통해 낮은 IGF-1 수용체 결합력을 가지는 것을 확인하였다.
In vitro 결합 천연형 인슐린- PEG -면역글로불린 Fc 결합체 인슐린 아날로그 10- PEG -면역글로불린 Fc 결합체
수용체 결합 친화도
(% vs 인슐린, SPA 방법)		 IR-B 결합 2.4±0.4 1.3±0.2
IGF-1R 결합1 ) <1% <1%
1) 용량 반응 곡선이 가장 높은 농도에서도 포화에 도달하지 않았기 때문에, 정확한 값은 측정되지 않았음
실험예 3: 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 약동학적 분석
지속형 인슐린 아날로그 결합체의 약동학을 확인하기 위하여, 일정 기간 실험실에 적응한 정상 랫트 (SD rat, 수컷, 6주령), 정상 마우스, 및 개에서 시간에 따른 혈중 농도 비교 시험을 진행하였다.
천연형 인슐린 - PEG - 면역글로불린 Fc 결합체와 인슐린 아날로그 10 - PEG - 면역글로불린 Fc 결합체들을 마우스에는 43.05 nmol/kg으로, 랫트에는 65.1 nmol/kg으로 각각 단회 피하 투여한 후 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168시간에서 채혈하였다. 천연형 인슐린- PEG - 면역글로불린 Fc 결합체와 인슐린 아날로그 10 - PEG - 면역글로불린 Fc 결합체를 개에는 6.3 nmol/kg으로 각각 단회 피하 투여한 후, 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240시간에서 채혈하였다.
각 시간에서의 천연형 인슐린- PEG - 면역글로불린 Fc 결합체 및 인슐린 아날로그 10 - PEG - 면역글로불린 Fc 결합체들의 혈중 내 잔여 농도는 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA, enzyme linked immunosorbent assay)이용하여 측정하였으며, 사용된 키트는 Insulin ELISA (ALPCO, 미국)을 사용하였다. 단, 측정항체 (detection antibody)로는 mouse anti-human IgG4 HRP conjugate (Alpha Diagnostic Intl, Inc, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 천연형 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 대비하여 인슐린 아날로그 10-PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 마우스, 랫트, 개에서의 반감기가 각각 1.9배, 1.2배, 1.6배 증가하였고, MRT는 2.5배, 1.9배, 2.0배 증가하였다. 이와 같이 본 발명의 인슐린 아날로그 10-PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 천연형 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체에 비해 혈중 지속성이 증가되는 결과를 확인하였다.
시험물질 천연형 인슐린- PEG -면역글로불린 Fc 결합체 인슐린 아날로그 10- PEG -면역글로불린 Fc 결합체
마우스
(43.05 nmol/kg sc, n=3)		 t1/2 (hr) 15.4 29.7
랫트(65.1 nmol/kg, sc, n=3) t1/2 (hr) 18.5 ± 1.4 22.8 ± 2.2
개(6.3 nmol/kg, sc, n=3) t1/2 (hr) 28.8 ± 2.0 44.9 ± 7.1
실험예 4: 지속형 인슐린 아날로그 결합체의 글루코스 강하 효능 확인
지속형 인슐린 아날로그 결합체의 약력학을 2형 당뇨모델에서 확인하기 위하여, 정상 랫트 (SD rat, 수컷, 7주령)에 2주간 고지방식 사료 (60% Fat)을 먹인 후, 췌장베타세포를 파괴할 수 있는 STZ를 30 mg/kg의 용량으로 1주 간격으로 총 2회 투여하여 제2형 당뇨모델을 제작하였다 (이하, DIO/STZ 랫트). 제작한 모델은 지속적 당뇨병 유지를 위해 고지방식 사료섭취를 계속 진행하였다.
천연형 인슐린- PEG - 면역글로불린 Fc 결합체와 인슐린 아날로그 10 - PEG - 면역글로불린 Fc 결합체들을 DIO/STZ 랫트에 각각 12.1 nmol/kg, 8.09 nmol/kg로 피하투여를 진행하되, 3일 간격으로 반복투여를 진행하였다. 천연형 인슐린- PEG - 면역글로불린 Fc 결합체와 인슐린 아날로그 10 - PEG - 면역글로불린 Fc 결합체에 의한 혈중 글루코스 강하 효능을 확인하기 위해 투여 0일, 1일, 3일, 6일, 7일, 9일, 10일, 12일, 13일, 15일, 16일, 21일, 22일, 24일, 25일, 27일, 28일에 미정맥으로 혈액을 채취, 혈중 글루코스 측정기(OneTouch® Ultra®, LifeScan, Inc., USA)를 이용하여 혈중 글루코스 수치를 확인하였다.
그 결과, 천연형 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 대비하여 인슐린 아날로그 10-PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 DIO/STZ 랫트에서 50% 적은 용량을 투여해도 동등한 혈중 글루코스 강하 효능을 가짐을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 인슐린 아날로그 10-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 개선된 혈중 지속성이, 천연형 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 대비 적은 용량만으로도 우수한 혈중 글루코스 강하효능을 지속적으로 유지할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> A conjugate of insulin analog with reduced affinity to insulin receptor and use thereof <130> KPA170215-KR-P1 <150> KR 10-2017-0037101 <151> 2017-03-23 <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 cagcatctgc tccctccatc agctggagaa ctac 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gtagttctcc agctgatgga gggagcagat gctg 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cagcatctgc tccctcaagc agctggagaa ctac 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gtagttctcc agctgcttga gggagcagat gctg 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ctaccagctg gagaacgagt gcaactgagg atcc 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcctcag ttgcactcgt tctccagctg gtag 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ctaccagctg gagaactcct gcaactgagg atcc 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatcctcag ttgcaggagt tctccagctg gtag 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctaccagctg gagaacacct gcaactgagg atcc 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggatcctcag ttgcaggtgt tctccagctg gtag 34 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg gaac 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gttccccgca cactagctcg agagcttcca ccag 34 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg gaac 34 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gttccccgca cactagggag agagcttcca ccag 34 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg gaac 34 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gttccccgca cactagggtg agagcttcca ccag 34 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 cagcatctgc tccctcgccc agctggagaa ctac 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gtagttctcc agctgggcga gggagcagat gctg 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 cagcatctgc tccctcgacc agctggagaa ctac 34 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gtagttctcc agctggtcga gggagcagat gctg 34 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg gaac 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gttccccgca cactaggtcg agagcttcca ccag 34 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ggggaacgag gcttcgacta cacacccaag acc 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ggtcttgggt gtgtagtcga agcctcgttc ccc 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ggggaacgag gcttcgagta cacacccaag acc 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ggtcttgggt gtgtactcga agcctcgttc ccc 33 <210> 27 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 1 <400> 27 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctccatcag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 28 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 1 <400> 28 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 29 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 29 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaagcag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 30 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 2 <400> 30 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 31 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 3 <400> 31 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaacg agtgcaac 258 <210> 32 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 3 <400> 32 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Glu Cys Asn 85 <210> 33 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 4 <400> 33 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact cctgcaac 258 <210> 34 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 4 <400> 34 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Ser Cys Asn 85 <210> 35 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 5 <400> 35 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaaca cctgcaac 258 <210> 36 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 5 <400> 36 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Thr Cys Asn 85 <210> 37 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 6 <400> 37 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 38 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 6 <400> 38 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 39 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 7 <400> 39 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 40 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 7 <400> 40 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 41 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 8 <400> 41 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 42 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 8 <400> 42 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 43 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 9 <400> 43 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgcccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 44 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 9 <400> 44 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 45 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 10 <400> 45 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 46 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 10 <400> 46 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 47 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 11 <400> 47 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 48 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 11 <400> 48 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 49 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 12 <400> 49 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcgactacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 50 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 12 <400> 50 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 51 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 13 <400> 51 ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcgagtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaac 258 <210> 52 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Analog 13 <400> 52 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 53 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 54 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 55 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analog, A-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is alanine, glycine, glutamine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is alanine, glutamic acid, glutamine, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa is alanine, serine, glutamine, glutamic acid, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is tyrosine, histidine, lysine, alanine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is alanine, leucine, tyrosine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) <223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, serine, or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> Xaa is asparagine, glycine, histidine, or alanine <400> 55 Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa 1 5 10 15 Glu Asn Xaa Cys Xaa 20 <210> 56 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analog, B-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, serine, threonine, or aspartic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25) <223> Xaa is phenylalanine, aspartic acid, or glutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa is threonine, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa is proline, glutamic acid, or aspartic acid, or is absent <400> 56 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr 20 25 30

Claims (31)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 하기 화학식 1로 표시되는, 결합체:
    [화학식 1]
    X - La - F
    상기 X는 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 55의 A-쇄와 하기 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그인, 결합체:
    L은 링커이며;
    a는 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때 각각의 L은 서로 독립적이고;
    F는 X의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이며;
    상기 결합체에서 X, L, 및 F가 화학식 1의 순서로 공유결합으로 서로 연결됨;

    [일반식 2]
    Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 55)
    상기 일반식 2에서,
    Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
    Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
    Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
    Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,
    Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
    Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,
    Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.

    [일반식 3]
    Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)
    상기 일반식 3에서,
    Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,
    Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,
    Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,
    Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함;
    단 여기서 A-쇄가 서열번호: 53과 일치하면서, B-쇄도 서열번호: 54의 B-쇄와 일치하는 펩티드는 제외한다.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 일반식 2에서,
    Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
    상기 일반식 3에서,
    Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
    결합체.
  5. 제3항에 있어서
    상기 일반식 2에서,
    Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
    상기 일반식 3에서,
    Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
    결합체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 X는 일반식 2로 표시되는 서열번호: 55의 A-쇄와, 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인, 결합체.
  7. 제3항에 있어서, 상기 X는
    서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인, 결합체.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 X는
    (1) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (2) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (3) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (4) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (5) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (6) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (7) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (8) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (9) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (10) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (11) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (12) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
    (13) 상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
    결합체.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 X는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 아날로그인, 결합체.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 결합체.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 결합체.
  12. 제3항에 있어서,
    상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 결합체.
  13. 제3항에 있어서,
    상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 결합체.
  14. 제3항에 있어서,
    상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 결합체.
  15. 제3항에 있어서,
    상기 일반식 2에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 3에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 결합체.
  16. 제3항에 있어서,
    F는 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는, 결합체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합체.
  18. 제3항에 있어서,
    상기 F는 면역글로불린 Fc 영역인, 결합체.
  19. 제3항에 있어서, 상기 F는 IgG Fc 영역인, 결합체.
  20. 제3항에 있어서,
    상기 L은 펩타이드, 지방산, 사카라이드 (saccharide), 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합체.
  22. 제3항에 있어서, 상기 L은 폴리에틸렌 글리콜인, 결합체.
  23. 제20항에 있어서, 상기 고분자 중합체는 1 내지 100kDa의 분자량을 가지는, 결합체.
  24. 제3항에 있어서, 인슐린 아날로그의 B-쇄의 N-말단 또는 인슐린 아날로그 내의 라이신 잔기에 링커가 연결된, 결합체.
  25. 제3항에 있어서, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 링커가 연결된, 결합체.
  26. 제3항에 있어서,
    상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, 상기 결합체는 링커의 양 말단이 각각 인슐린 아날로그의 B-쇄의 N-말단과 면역글로불린 Fc의 N-말단에 연결된 구조인,
    결합체.
  27. 제3항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 대비 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력이 저하된 결합체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그의 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린의 10% 내지 90%인 결합체.
  29. 제27항에 있어서, 상기 결합체는 F가 면역글로불린 Fc 영역이고, L이 폴리에틸렌글리콜이며 천연형 인슐린 수용체에 대한 결합력은 천연형 인슐린의 0.1% 내지 50%인 결합체.
  30. 제3항에 있어서, 상기 결합체는 F가 면역글로불린 Fc 영역이고, L이 폴리에틸렌글리콜이며 X가 A-쇄 14번 아미노산이 아스파르트산인 것 외에는 천연형 인슐린과 서열이 동일한 인슐린 아날로그인 결합체.
  31. 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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