KR20180033105A - 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그 및 이의 용도 - Google Patents
인슐린 수용체와의 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180033105A KR20180033105A KR1020170122759A KR20170122759A KR20180033105A KR 20180033105 A KR20180033105 A KR 20180033105A KR 1020170122759 A KR1020170122759 A KR 1020170122759A KR 20170122759 A KR20170122759 A KR 20170122759A KR 20180033105 A KR20180033105 A KR 20180033105A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- tyrosine
- xaa16
- insulin
- serine
- threonine
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 364
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 title description 17
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 title description 17
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims abstract description 176
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 148
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 148
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 148
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 109
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 91
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 91
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 88
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 88
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 79
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 79
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 74
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 74
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 74
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 73
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 68
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 62
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 62
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 57
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 57
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 57
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 56
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 56
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 56
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 54
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 52
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 52
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 37
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 35
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 35
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 33
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 32
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 24
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 17
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 15
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 12
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 8
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 76
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 28
- IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N Gln-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 28
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 28
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 108010038088 glutamyl-glycyl-seryl-leucyl-glutamine Proteins 0.000 description 25
- 108010073093 leucyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 24
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 23
- DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 23
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- VLDMQVZZWDOKQF-AUTRQRHGSA-N Val-Glu-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N VLDMQVZZWDOKQF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 17
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 16
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 16
- TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 16
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 16
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 16
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 16
- XLILXFRAKOYEJX-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XLILXFRAKOYEJX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 14
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 14
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 14
- XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XYEXCEPTALHNEV-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 14
- ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 14
- BEGDZYNDCNEGJZ-XVKPBYJWSA-N Val-Gly-Gln Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O BEGDZYNDCNEGJZ-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 14
- FAAHJOLJYDXKKU-ZHDGNLTBSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CN)C1=CC=C(O)C=C1 FAAHJOLJYDXKKU-ZHDGNLTBSA-N 0.000 description 13
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 13
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 13
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 13
- GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 13
- XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 11
- FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N Val-Cys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 11
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 11
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 10
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 10
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 10
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 10
- KTDXIOQSLSGDPM-QHJSVBGUSA-N (2s,3r)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=C(O)C=C1 KTDXIOQSLSGDPM-QHJSVBGUSA-N 0.000 description 9
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N Gln-Leu-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QKCZZAZNMMVICF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 9
- FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 9
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 9
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- GURIQZQSTBBHRV-SRVKXCTJSA-N Gln-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GURIQZQSTBBHRV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- XQDGOJPVMSWZSO-SRVKXCTJSA-N Gln-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(=O)N)N XQDGOJPVMSWZSO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000852815 Homo sapiens Insulin receptor Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 2
- IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N L-cysteine hydrochloride Chemical compound Cl.SC[C@H](N)C(O)=O IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Lys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 102000047882 human INSR Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- -1 magnesium Chemical compound 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 2-[[2-[[2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical class C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- MECFLTFREHAZLH-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MECFLTFREHAZLH-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KYQJHBWHRASMKG-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Cys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O KYQJHBWHRASMKG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GOPFMQJUQDLUFW-LKXGYXEUSA-N Asn-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O GOPFMQJUQDLUFW-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N Asp-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- GNDJOCGXGLNCKY-ACZMJKKPSA-N Gln-Cys-Cys Chemical compound N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O GNDJOCGXGLNCKY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- QGWXAMDECCKGRU-XVKPBYJWSA-N Gln-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O QGWXAMDECCKGRU-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KLJMRPIBBLTDGE-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KLJMRPIBBLTDGE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- QPDUVFSVVAOUHE-XVKPBYJWSA-N Gly-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CN)C(O)=O QPDUVFSVVAOUHE-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N Gly-Pro-Gly Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QDSKNVXKLPQNOJ-GVXVVHGQSA-N Leu-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QDSKNVXKLPQNOJ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N Lys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CUMXHKAOHNWRFQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- UAMFZRNCIFFMLE-FHWLQOOXSA-N Phe-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N UAMFZRNCIFFMLE-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- ZHYMUFQVKGJNRM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O ZHYMUFQVKGJNRM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N Thr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N Tyr-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFWGBTUBHOSCRE-UHFFFAOYSA-K [Na+].[Na+].[Na+].CCO.OC(CC([O-])=O)(CC([O-])=O)C([O-])=O Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCO.OC(CC([O-])=O)(CC([O-])=O)C([O-])=O DFWGBTUBHOSCRE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012528 insulin ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C21 KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 108010078692 yeast proteinase B Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
본 발명은 신규한 인슐린 아날로그, 이의 용도 및 상기 아날로그를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 인슐린 아날로그, 이의 용도 및 상기 아날로그를 제조하는 방법에 관한 것이다.
생체 내 단백질들은 혈중 단백질 분해효소에 의해 분해되거나 신장을 통해 배설 혹은 수용체에 의한 제거되는 등 여러 경로를 거쳐 제거되는 것이 알려져 있다. 이에, 상기와 같은 단백질 제거 기전을 회피하여 생리활성 단백질의 반감기를 증가시켜 치료학적 효능을 높이려는 여러 시도가 진행되고 있다.
한편, 인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로서, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여 인슐린이 정상적인 기능을 수행하지 못한다. 그로 인해 당뇨 환자는 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하고 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 되며, 이는 다양한 합병증의 원인이 되고 있다. 따라서 인슐린 생성에 이상이 있거나(Type I), 인슐린 내성으로 인한(Type II) 당뇨 환자는 인슐린 치료가 필요하며, 인슐린 투여로써 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다.
하지만, 인슐린의 경우 다른 단백질이나 펩티드 호르몬과 같이 생체 내 반감기가 극히 짧아 지속적인 치료 효과를 보이지 못하여, 효과를 발휘하기 위해서는 지속적으로 반복 투여를 해야 한다는 단점이 있다. 이러한 빈번한 투여는 환자에게 엄청난 고통과 불편함을 야기하게 되므로, 환자의 순응성, 안전성 및 편의성 측면에서 개선이 요구되고 있다.
이에 인슐린과 같은 단백질 약물의 생체 내 반감기를 증가시켜 투여 횟수를 줄임으로써 환자의 삶의 질과 치료적 효과를 높이기 위한 다양한 단백질 제형화 연구와 화학적 결합체 (예, 지방산 결합체) 등에 대한 연구가 진행되고 있다.
기존 보고에 따르면, 50% 이상의 인슐린은 신장에서 제거되며, 나머지 인슐린들은 근육, 지방, 간 등의 작용 부위(target site)에서 수용체 매개 제거(receptor mediated clearance, RMC) 공정을 통해 제거된다.
이와 관련하여 J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13: 923, 및 Diabetes (1990) 39: 1033 등에서 인슐린의 RMC를 피하고자 in-vitro 활성을 약화시킴으로써 혈중 농도를 증가시킨다는 등의 여러 보고가 있으나, J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13: 923의 경우 제시된 인슐린 아날로그는 2개 이상의 아미노산을 치환하였거나, 구체적인 결과를 제시하지 않았으며, Diabetes (1990) 39: 1033의 경우 인슐린 아날로그들은 수용체 결합력에서 변화가 없거나 인슐린 수용체에 직접 관여하는 아미노산을 치환하여 활성이 감소한 것으로 보고되었다.
본 명세서는 인슐린 수용체 결합에 직접적인 관여하지 않는 아미노산을 치환하여 인슐린 수용체의 결합력만을 감소시키는 아날로그를 개발하였으며 인슐린 수용체와의 결합감소를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 인슐린 아날로그를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 유효성분으로 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그를 유효성분으로 포함하는 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 신규한 인슐린 아날로그, 구체적으로 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는, 인슐린 아날로그이다.
하나의 구체예로서, 상기 변이는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 또는 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄의 모든 조합을 포함하는 인슐린 아날로그로서, 천연형 인슐린을 제외한 것, 즉 A-쇄가 서열번호: 53과 일치하면서 동시에 B-쇄도 서열번호: 54와 일치하는 펩티드를 제외한 것이다.
[일반식 1]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 55)
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,
Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는,
상기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와, 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는, 상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56 의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서,
상기 인슐린 아날로그는
(1) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(2) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(3) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(4) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(5) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(6) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(7) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(8) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(9) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(10) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(11) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(12) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(13) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인슐린 아날로그는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체이다.
하나의 구체예로서, 상기 형질전환체가 대장균인 것인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 하기 단계를 포함하는 상기 인슐린 아날로그를 제조하는 방법이다:
a) 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그를 발현시키는 단계; 및
b) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.
하나의 구체예로서,
상기 분리 및 정제가
b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;
b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계;
b-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;
b-4) 정제된 인슐린 아날로그를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;
b-5) 처리된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 유효성분으로서 상기 인슐린 아날로그를 포함하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 유효성분으로서 상기 인슐린 아날로그를 포함하는 인슐린 관련 질환, 예컨대, 당뇨병 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대, 당뇨병을 치료하는 방법이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도이다.
하나의 양태로서, 상기 약제는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 당뇨병의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도이다.
본 발명의 비천연형인 인슐린 아날로그는 인슐린 투여를 필요로 하는 환자들의 편리성을 증대시킬 수 있다.
도 1은 인슐린 아날로그의 순도를 단백질 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 도이다. 대표로 인슐린 아날로그인 9, 10, 11, 12번 아날로그에 대한 결과이다.
1번 레인: size marker, 2번 레인: 천연형 인슐린, 3번 레인: 인슐린 아날로그 9번, 4번 레인: 인슐린 아날로그 10번, 5번 레인: 인슐린 아날로그 11번, 6번 레인: 인슐린 아날로그 12번
도 2a 내지 2d는 인슐린 아날로그의 순도를 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다. 대표로 인슐린 아날로그 9, 10, 11, 12번 아날로그에 대한 결과를 나타내었다. 각 도면에서 위에서부터 차례로 RP-HPLC (C18), RP-HPLC (C4) 및 SE-HPLC 결과를 나타낸다.
도 3은, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 글루코스 흡수능을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 4는, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 세포 안정성을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
1번 레인: size marker, 2번 레인: 천연형 인슐린, 3번 레인: 인슐린 아날로그 9번, 4번 레인: 인슐린 아날로그 10번, 5번 레인: 인슐린 아날로그 11번, 6번 레인: 인슐린 아날로그 12번
도 2a 내지 2d는 인슐린 아날로그의 순도를 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다. 대표로 인슐린 아날로그 9, 10, 11, 12번 아날로그에 대한 결과를 나타내었다. 각 도면에서 위에서부터 차례로 RP-HPLC (C18), RP-HPLC (C4) 및 SE-HPLC 결과를 나타낸다.
도 3은, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 글루코스 흡수능을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 4는, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 세포 안정성을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 신규한 인슐린 아날로그, 구체적으로 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는 인슐린 아날로그를 제공한다.
본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그(insulin analog)"란 천연형 인슐린과 상이한 비천연형 인슐린을 의미한다. 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인간 인슐린과 상이한 비천연형 인간 인슐린을 포함한다.
이러한 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 일부 아미노산을 부가, 결실 또는 치환의 형태로 변형시킨 아날로그를 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 상기의 서열 동일성을 가지면서, 천연형 인슐린에 비해 수용체 결합 능력이 저하된 것일 수 있다. 또한, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있거나/있으며 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 인슐린 수용체 결합력 (100%)과 비교하여 약 99% 또는 그 이하, 약 95% 또는 그 이하, 약 90% 또는 그 이하, 약 85% 또는 그 이하, 약 80% 또는 그 이하, 약 75% 또는 그 이하, 약 70% 또는 그 이하, 약 65% 또는 그 이하, 약 60% 또는 그 이하, 약 55% 또는 그 이하, 약 50% 또는 그 이하, 약 45% 또는 그 이하, 약 40% 또는 그 이하, 약 35% 또는 그 이하, 약 30% 또는 그 이하, 약 25% 또는 그 이하, 약 20% 또는 그 이하, 약 15% 또는 그 이하, 약 10% 또는 그 이하, 약 9% 또는 그 이하, 약 8% 또는 그 이하, 약 7% 또는 그 이하, 약 6% 또는 그 이하, 약 5% 또는 그 이하, 약 4% 또는 그 이하, 약 3% 또는 그 이하, 약 2% 또는 그 이하, 약 1% 또는 그 이하, 또는 약 0.1% 또는 그 이하의 인슐린 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있다 (다만, 본 발명의 인슐린 아날로그는 인슐린 수용체에 대한 결합력이 0%에 해당하지는 않는다).
인슐린 아날로그의 수용체 결합 능력은 재조합 인간 인슐린 수용체를 과발현하는 세포막에서 인슐린 아날로그와 요오드 125가 결합된 인슐린간의 경쟁반응을 이용하는 SPA (Scintillation Proximity Assay)법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 또한 인슐린 아날로그의 수용체 결합 능력 평가에 이용될 수 있다. 상기 방법의 구체적인 예로 실시예 8에서 사용된 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 글루코스 흡수능 (100%) 대비 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 약 150% 이상, 약 160% 이상, 약 170% 이상, 약 180% 이상, 약 190% 이상, 또는 약 200% 이상의 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있다.
글루코스 흡수능의 측정은 당업계에 공지된 다양한 글루코스 흡수능 측정 방법을 이용하여 달성될 수 있으며, 그 예로 실시예 9에 기재된 글루코스 흡수능 측정 방법을 통하여 측정될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 단쇄이거나, 이중쇄 (two polypeptide chains) 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이중쇄 형태이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 이중쇄 형태인 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A-쇄에 대응되는 폴리펩타이드와 천연형 인슐린의 B-쇄에 대응되는 폴리펩타이드, 두 개의 폴리펩타이드로 구성되는 것일 수 있다. 여기서, 상기 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄에 대응된다는 것은 상기 이중쇄의 폴리펩타이드 중 어느 하나인 쇄를 천연형 인슐린의 A-쇄 또는 B-쇄와 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 경우를 들 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으며, 이중쇄를 구성하는 서열과 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄의 서열과의 비교를 통하여 당업자가 용이하게 파악할 수 있다.
천연형 인슐린은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당 조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린은 2개의 폴리펩티드 쇄, 즉 각각 21개 및 30개 아미노산 잔기를 포함하는 A-쇄 및 B-쇄로 구성되어 있고, 이들은 2개의 이황화 다리로 상호 연결되어 있다. 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄는 각각 하기 서열번호: 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
A-쇄:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호: 53)
B-쇄:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호: 54)
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본원에 기술된 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 생체 내에서 혈당 조절 기능을 보유하면서 수용체 결합 능력이 저하된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 인슐린 아날로그는 낮은 수용체-매개 내재화(receptor-mediated internalization) 또는 수용체-매개 제거(receptor-mediated clearance)를 나타낼 수 있다면 특별히 그 종류 및 크기에 제한되지 않을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 증가된 혈중 반감기를 나타낼 수 있다.
본 발명의 인슐린 아날로그는 역방향 인슐린, 천연형 인슐린의 유도체, 천연형 인슐린의 단편 등을 포함한다. 이러한 인슐린 아날로그는 유전자 재조합법뿐만 아니라, 고상(solid phase) 방법으로도 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린의 유도체"는 천연형 인슐린과 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 인슐린 서열을 개질(modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드, 천연형 인슐린과 같이 생체 내의 혈당 조절 기능을 조절하는 천연형 인슐린의 모방체를 포함한다. 이러한 천연형 인슐린의 유도체는 생체 내 혈당 조절 기능을 가지는 것일 수 있다.
구체적으로, 천연형 인슐린의 유도체는 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형시킬 수 있다.
구체적으로, 천연형 인슐린의 A 쇄, B 쇄와 각각 적어도 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이는 것일 수 있고/있거나 인슐린의 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation) 된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유도체 제조를 위한 여러 방법들의 조합으로 본 발명에 적용되는 천연형 인슐린의 유도체를 제조할 수 있다.
또한, 천연형 인슐린의 유도체의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질 혹은 번역 후 변형 (예, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자 내 공유결합 등) 함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 인슐린의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 단편"은 천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다. 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유할 수 있다.
또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 상기 천연형 인슐린의 유도체 및 단편의 제조에 사용된 각각의 제조 방법이 독립적으로 사용되거나, 조합되어 사용되어 제조된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기와 같은 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄에서 특정 아미노산 잔기의 변형을 포함하는 것으로, 구체적으로는 천연형 인슐린의 A-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형되고/되거나 B-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산, 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 구체적으로는 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 히스티딘, 라이신, 또는 알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 기술된 아미노산들 중 1 이상, 2 이상, 3 이상, 또는 4개 가 본래의 아미노산이 아닌 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 변이는 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 또는 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이일 수 있다.
따라서, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 및/또는 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이를 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로는, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그일 수 있다. 이러한 인슐린 아날로그는 A-쇄와 B-쇄 서열이 이황화 결합으로 상호 연결된 형태이거나, 프로인슐린의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[일반식 1]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 55)
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,
Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
여기서, 서열번호: 53의 A-쇄 및 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는 펩티드는 제외될 수 있다.
또한, 상기 기술한 특징적인 아미노산 잔기, 특히 A-쇄의 14번 아미노산, 및/또는 19번 아미노산 및/또는 B-쇄의 16번 아미노산 및/또는 25번 아미노산에 대한 특징적인 변이 (즉, 천연형 인슐린에 존재하지 않는 아미노산 잔기)를 포함하면서, 상기 일반식 1의 A-쇄 및 일반식 2의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지며, 천연형 인슐린에 비하여 수용체 결합 능력이 감소된 펩타이드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어, "상동성(homology)"은 천연형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.
구체적인 하나의 양태예서, 상기 인슐린 아날로그는 상기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55의 A-쇄와, 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그일 수도 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인, 인슐린 아날로그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 하기에 해당할 수 있다:
(1) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(2) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(3) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(4) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(5) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(6) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(7) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(8) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(9) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(10) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(11) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(12) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
(13) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 인슐린 아날로그.
또한, 구체적인 일 실시양태에 따르면, 상기 인슐린 아날로그는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인슐린 아날로그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기 기술된 특정 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 기술된 특정 서열로 (필수적으로) 구성된 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본원에서 '특정 서열번호로 구성되는' 펩타이드 또는 인슐린 아날로그라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 인슐린 아날로그와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
한편, 상기 인슐린 아날로그는 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다.
또한, 펩타이드 또는 인슐린 아날로그는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서,과도한 독성,자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산,말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산,숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산,시트르산, 메탄설폰산,포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속,마그네슘 등의 알칼리 토금속,및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체를 제공한다.
상기 인슐린 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)로, 게놈 DNA, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA를 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990). 본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 천연형 인슐린 유전자 서열(NM_000207.2, NCBI)로부터 PCR(중합효소 연쇄반응)을 통해 증폭할 수 있고, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 핵산은 구체적으로는 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 및 51로 기재되는 염기서열을 포함한다. 본 발명은 일 실시양태에서 서열번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 및 51로 기재되는 염기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 상동성, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 더욱 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 핵산이 코딩한 펩티드가 생체 내 혈당조절 기능을 보유하면서, 천연형 인슐린에 비해 수용체 결합 능력이 저하된 것을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인슐린 아날로그를 수득할 수 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에서 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 대개 코딩 영역의 상위(upstream)에 위치한 비해독된 핵산 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5'-부위에 위치할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합부위 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pPICZα 시리즈, pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 진핵세포를 숙주로 하는 경우에, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 회수되는 목적 단백질, 즉 단쇄 인슐린 아날로그, 프로인슐린 또는 인슐린 아날로그의 정제를 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6개 히스티딘(hexahistidine) 등이 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 태그 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6개 히스티딘 태그가 이용된 경우에는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2침전법, CaCl2침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등이 있다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
목적 핵산인 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다. 구체적으로는, 숙주세포로 대장균을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 형질전환체를 이용하여 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 하기 단계를 포함하는 상기 인슐린 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다:
a) 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그를 발현시키는 단계; 및
b) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.
본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.
사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.
본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 인슐린 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.
전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인슐린 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 인슐린 아날로그는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.
본 발명의 구체예에서는, 형질전환체로부터 봉입체 형태로 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하기 위하여 하기 단계를 추가적으로 포함할 수 있다:
b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;
b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계;
b-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;
b-4) 정제된 인슐린 아날로그를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;
b-5) 처리된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 유효성분으로서 상기 인슐린 아날로그를 포함하는 조성물, 예컨대, 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
상기 인슐린 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "인슐린 관련 질환"은 인슐린의 생리활성이 없거나 낮아 발생하거나 진행하는 질환으로서, 예컨대 당뇨병을 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 그 외에도 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 인슐린 아날로그는 본 출원의 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인슐린 아날로그 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환, 예컨대, 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 인슐린 아날로그 및 약학적 조성물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 아날로그의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 유효성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성이 우수하므로, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다.
그러나 상기 인슐린 아날로그의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 약제의 제조에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도이다.
하나의 양태로서, 상기 약제는 인슐린 관련 질환의 예방 또는 치료용이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
다른 양태로서, 당뇨병의 예방 또는 치료용이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 인슐린 관련 질환, 구체적으로 당뇨병의 치료에 있어 상기 인슐린 아날로그의 용도이다.
상기 인슐린 아날로그, 인슐린 관련 질환에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 단쇄 인슐린 아날로그 발현 벡터의 제작
보유 중인 천연형 인슐린 발현 벡터를 주형으로 하여 A-쇄 또는 B-쇄의 아미노산을 하나씩 변형시킨 인슐린 아날로그들을 제작하기 위해 순방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드를 합성한 후(표 2), PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
하기 표 1에 각각의 A 쇄 또는 B쇄의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 즉, 아날로그 1의 경우 A 쇄의 14번 티로신(Y)이 히스티딘(H)으로 치환, 아날로그 6의 경우 B쇄의 16번 티로신이 글루탐산(E)으로 치환된 형태이다.
인슐린 아날로그 번호 | 변화서열 |
아날로그1 | A 14Y -> H |
아날로그2 | A 14Y -> K |
아날로그3 | A 19Y -> E |
아날로그4 | A 19Y -> S |
아날로그5 | A 19Y -> T |
아날로그6 | B 16Y -> E |
아날로그7 | B 16Y -> S |
아날로그8 | B 16Y -> T |
아날로그9 | A 14Y -> A |
아날로그10 | A 14Y -> D |
아날로그11 | B 16Y -> D |
아날로그12 | B 25F -> D |
아날로그13 | B 25F -> E |
인슐린 아날로그 증폭을 위한 프라이머는 하기 표 2에 나타냈다.
아날로그 | 서열 | 서열 번호 |
아날로그 1 | 5' CAGCATCTGCTCCCTCCATCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGATGGAGGGAGCAGATGCTG 3' |
서열번호 1 서열번호 2 |
아날로그 2 | 5' CAGCATCTGCTCCCTCAAGCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGCTTGAGGGAGCAGATGCTG 3' |
서열번호 3 서열번호 4 |
아날로그 3 | 5' CTACCAGCTGGAGAACGAGTGCAACTGAGGATCC 3' 5' GGATCCTCAGTTGCACTCGTTCTCCAGCTGGTAG 3' |
서열번호 5 서열번호 6 |
아날로그 4 | 5' CTACCAGCTGGAGAACTCCTGCAACTGAGGATCC 3' 5' GGATCCTCAGTTGCAGGAGTTCTCCAGCTGGTAG 3' |
서열번호 7 서열번호 8 |
아날로그 5 | 5' CTACCAGCTGGAGAACACCTGCAACTGAGGATCC 3' 5' GGATCCTCAGTTGCAGGTGTTCTCCAGCTGGTAG 3' |
서열번호 9 서열번호 10 |
아날로그 6 | 5' CTGGTGGAAGCTCTCGAGCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGCTCGAGAGCTTCCACCAG 3' |
서열번호 11 서열번호 12 |
아날로그 7 | 5' CTGGTGGAAGCTCTCTCCCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGGGAGAGAGCTTCCACCAG 3' |
서열번호 13 서열번호 14 |
아날로그 8 | 5' CTGGTGGAAGCTCTCACCCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGGGTGAGAGCTTCCACCAG 3' |
서열번호 15 서열번호 16 |
아날로그 9 | 5' CAGCATCTGCTCCCTCGCCCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGGGCGAGGGAGCAGATGCTG 3' |
서열번호 17 서열번호 18 |
아날로그 10 | 5' CAGCATCTGCTCCCTCGACCAGCTGGAGAACTAC 3' 5' GTAGTTCTCCAGCTGGTCGAGGGAGCAGATGCTG 3' |
서열번호 19 서열번호 20 |
아날로그 11 | 5' CTGGTGGAAGCTCTCGACCTAGTGTGCGGGGAAC 3' 5' GTTCCCCGCACACTAGGTCGAGAGCTTCCACCAG 3' |
서열번호 21 서열번호 22 |
아날로그 12 | 5' GGGGAACGAGGCTTCGACTACACACCCAAGACC 3' 5' GGTCTTGGGTGTGTAGTCGAAGCCTCGTTCCCC 3' |
서열번호 23 서열번호 24 |
아날로그 13 | 5' GGGGAACGAGGCTTCGAGTACACACCCAAGACC 3' 5' GGTCTTGGGTGTGTACTCGAAGCCTCGTTCCCC 3' |
서열번호 25 서열번호 26 |
인슐린 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 6분으로 이 과정을 18회 반복하였다. 이와 같은 조건에서 얻어진 인슐린 아날로그 단편은 세포내의 봉입체 형태로 발현시키기 위하여 pET22b 벡터에 삽입되어 있으며 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인슐린 아날로그 1 내지 13라 명명하였다. 상기 발현 벡터는 T7 프로모터의 조절 하에 인슐린 아날로그 1 내지 13의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 내에서 인슐린 아날로그 단백질을 봉입체 형태로 발현시켰다.
하기 표 3에 각각의 인슐린 아날로그 1 내지 13의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타냈다.
각각의 서열 변경 확인은 DNA 서열 분석을 통하여 확인하였고, 그 결과, 각각의 인슐린 아날로그가 목적하는 바에 따라, 서열이 변경이 되었음을 확인할 수 있었다.
아날로그 | 서열 | 서열번호 | |
아날로그 1 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC CAT CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 27 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 28 | |
아날로그 2 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC AAG CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 29 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 30 | |
아날로그 3 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC GAG TGC AAC | 서열번호 31 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Glu Cys Asn | 서열번호 32 | |
아날로그 4 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TCC TGC AAC | 서열번호 33 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Ser Cys Asn | 서열번호 34 | |
아날로그 5 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC ACC TGC AAC | 서열번호 35 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Thr Cys Asn | 서열번호 36 | |
아날로그 6 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC GAG CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 37 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 38 | |
아날로그 7 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TCC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 39 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 40 | |
아날로그 8 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC ACC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 41 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 42 | |
아날로그 9 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GCC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 43 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 44 | |
아날로그 10 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 45 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 46 | |
아날로그 11 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC GAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 47 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 48 | |
아날로그 12 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC GAC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 49 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 50 | |
아날로그 13 | DNA | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC CTA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC GAG TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC | 서열번호 51 |
단백질 | Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 서열번호 52 |
실시예 2: 재조합 인슐린 아날로그 융합 펩타이드의 발현
T7 프로모터 조절하의 재조합 인슐린 아날로그 발현을 수행 하였다. 각각의 재조합 인슐린 아날로그 발현 벡터로 E.coli BL21-DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3); 노바젠)을 형질전환하였다. 형질 전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 따랐다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50 ㎍/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1 ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 인슐린 아날로그들의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알을 녹여 500 ml의 2X 루리아 브로스에 접종하고 37℃에서 14~16시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 5.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 50 L 발효기(MSJ-U2, B.E.MARUBISHI, 일본)를 이용하여 종 배양액을 17 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스(bath) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 20 L/분(1 vvm), 교반 속도 500 rpm 그리고 30% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 100이상에서 최종 농도 500 μM의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 재조합 인슐린 아날로그의 회수 및 재접힘 (refolding)
상기 실시예 2에서 발현시킨 재조합 인슐린 아날로그들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 세포 펠렛 100 g(wet weight)을 1 L 용해 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M NaCl 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재 부유하였다. 미세용액화 프로세서 Microfluidizer (Microfluidic Corp. Model M-110EH-30)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 7,000 rpm으로 4~8℃에서 20분 원심분리하여 상층액을 버리고, 3 L 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA)에 재부유하였다. 7,000 rpm으로 4~8℃에서 20분 동안 원심 분리하여 펠렛을 증류수에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심 분리하였다. 펠렛을 취하여 완충액(1 M L-Glycine, 3.78 g L-Cysteine-HCl, pH 10.6)에 재 부유하여 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 재 부유된 재조합 인슐린 아날로그 회수를 위하여 8M 우레아를 추가한 후 3~5시간 교반하였다. 가용화된 재조합 프로인슐린 아날로그의 재접힘(refolding)을 위하여 7,000 rpm으로 4~8℃에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한 후, 환원제(15mM L-Cysteine-HCL)을 1시간 처리하고 여기에 일정 배수의 증류수를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 넣어주면서 4~8℃에서 12시간 이상 교반하였다.
실시예 4: 양이온 교환 크로마토그래피 정제
45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 SP FF (GE healthcare사) 컬럼에 재접합이 끝난 시료를 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
실시예 5: 트립신(Trypsin)과 카복시펩티데이즈 B(Carboxypeptidase B) 처리
용출된 시료를 한외여과막으로 염을 제거하고, 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 교체하였다. 얻어진 시료 단백량의 약 30,000 몰비에 해당하는 트립신과 약 3,000 몰비에 해당하는 카복시펩티데이즈 B를 첨가한 후, 4~8℃에서 16시간이상 교반하였다.
실시예 6: 양이온 교환 크로마토 그래피 정제
반응이 끝난 시료를 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH 2.0) 완충액으로 평형화된 SP HP (GE healthcare사) 컬럼에 다시 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M과 45% 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트(pH 2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
실시예 7: 역상 크로마토 그래피 정제
상기 실시예 6에서 얻어진 시료에서 순수한 인슐린 아날로그를 순수 분리하기 위해 소디움포스페이트와 아이소프로판올을 포함한 버퍼로 평형화된 역상 크로마토 그래피 Source30RPC (GE healthcare, 미국)에 결합시킨 후, 소디움포스페이트와 이소프로판올을 포함한 완충액을 사용하여 선형 농도 구배로 인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
이와 같이 정제된 인슐린 아날로그는 단백질 전기영동(SDS-PAGE, 도 1) 및 고압 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였으며 이중 대표로 인슐린 아날로그 9번, 10번, 11번, 12번의 순도 분석 결과 나타내었다 (도 2).
실시예 8: 인슐린 아날로그들의 인슐린 수용체 결합력 비교
인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력을 측정하기 위하여, SPA (Scintillation proximity assay) 방법을 이용하여 분석하였다. 96-웰 피코 플레이트(pico-plate)에 인슐린 수용체가 발현된 CHO 세포주의 세포막과 PVT SPA 비드를 함께 넣어 주었다. 인슐린 수용체에 대한 결합력을 확인 하기 위하여, 10개 이상의 농도로 희석한 인간 인슐린 및 각각의 인슐린 아날로그, 그리고 경쟁자로서 방사성 동위원소인 125 요오드가 부착된 인슐린을 함께 넣은 뒤 상온에서 4시간동안 경쟁 반응 시켰다. 4 시간 뒤 베타 카운터를 이용하여 인슐린 수용체의 결합력을 측정하였다. 각 물질의 결합력은 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 이용 IC50로 산출 하였으며, 인간 인슐린의 인슐린 수용체 결합력에 대한 상대적인 인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력으로 수치화 하였다.
그 결과, 인간 인슐린과 대비하여 인슐린 아날로그(1번)은 90%, 인슐린 아날로그(2번)은 95%, 인슐린 아날로그(3번)은 1.0%, 인슐린 아날로그(4번)은 <0.1%, 인슐린 아날로그(6번)은 20%, 인슐린 아날로그(7번)은 8.5%, 인슐린 아날로그(9번)은 79%, 인슐린 아날로그(10번)은 79%, 인슐린 아날로그(11번)은 24%, 인슐린 아날로그(12번)은 <0.1%, 인슐린 아날로그(13번)은 <0.1%의 수용체 결합력이 확인되었다(표 4). 이와 같이 본 발명의 인슐린 아날로그들은 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소되었음을 관찰하였다.
물질명 |
인슐린 수용체 결합력
( vs . 인간 인슐린) |
|
인슐린 아날로그 | 인슐린 아날로그 (1번) | 90% |
인슐린 아날로그 (2번) | 95% | |
인슐린 아날로그 (3번) | 1.0% | |
인슐린 아날로그 (4번) | <0.1% | |
인슐린 아날로그 (6번) | 20% | |
인슐린 아날로그 (7번) | 8.5% | |
인슐린 아날로그 (9번) | 79% | |
인슐린 아날로그 (10번) | 79% | |
인슐린 아날로그 (11번) | 24% | |
인슐린 아날로그 (12번) | <0.1% | |
인슐린 아날로그 (13번) | <0.1% |
실시예 9: 인슐린 아날로그10의
in-vitro
효력 비교
인슐린 아날로그 10의 in vitro 효력을 측정하기 위하여, 지방세포로 분화시킨 마우스 유래의 3T3-L1 세포주를 이용한 글루코스 흡수능(glucose uptake, 또는 지질 합성능) 시험을 실시하였다. 3T3-L1 세포를 10% NBCS(신생 송아지 혈청)를 포함한 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco, Cat.No, 12430) 배지를 이용하여 주 2~3회 계대 배양하며 유지하였다. 3T3-L1 세포를 분화용 배지(10% FBS를 포함한 DMEM)를 이용하여 현탁한 후, 48구판에 구 당 5 x 104개 되도록 접종하여 48시간 동안 배양하였다. 지방세포로의 분화를 위하여 분화용 배지에 1 μg/mL 인간 인슐린(Sigma, Cat. No. I9278), 0.5 μM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879), 및 1 μM 덱사메타손 (Sigma, Cat. No. D4902)을 혼합하고, 기존 배지를 제거한 후 구당 250 ㎕씩 넣어주었다. 48시간 후 분화용 배지에 1 μg/mL의 인간 인슐린만을 첨가한 배지로 다시 교환하였다. 이후, 48시간마다 1 μg/mL의 인간 인슐린을 첨가한 분화용 배지로 교환하면서 12일 간 지방세포로의 분화가 유도되는 것을 확인하였다. 글루코스 흡수능 시험을 위하여, 분화가 끝난 세포를 무혈청 DMEM 배지로 1회 수세한 후 250 ㎕씩 무혈청 DMEM을 넣어 4시간 동안 혈청 고갈을 유도하였다. 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10을 10 μM부터 0.001 nM까지 무혈청 DMEM 배지로 10배씩 순차적으로 희석하여 준비하였다. 준비된 시료를 세포에 각각 250 ㎕씩 첨가한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양이 끝난 배지의 글루코스 잔량을 측정을 위해 200 ㎕의 배지를 취해 D-PBS로 각각 5배 희석하여 GOPOD(GOPOD Assay Kit, Megazyme, Cat. No. K-GLUC)분석을 진행하였다. 글루코스 표준용액의 흡광도를 기준으로 배지의 잔여 글루코스 농도를 환산하고, 글루코스 흡수능에 대한 EC50를 각각 산출하였다.
총 3번의 시험을 반복하였고, 그 결과, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10의 EC50는 각각 14.4 ± 1.0 nM 및 7.8 ± 0.7 nM 으로 산출 되었다. 즉, 인간 인슐린과 대비하여 인슐린 아날로그 10은 185.5 ± 25.7 % 의 글루코스 흡수능을 가짐이 확인되었다(도 3).
실시예 10: 인슐린 아날로그 10의 세포 안정성 비교
인슐린 아날로그 10의 세포 안정성을 확인하기 위하여 인간 유래의 HepG2 세포주를 이용하여 시험을 실시하였다. 우선 HepG2 세포를 10% FBS을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 주 2~3회 계대 배양하며 유지하였다. 24 구판에 폴리-L-라이신 (Trevigen, Cat.No. 3438-100-01) 을 구당 300㎕ 씩 넣어 37oC 에서 2시간 동안 코팅해 주었다. 차가운 D-PBS로 2회 수세한 후 HepG2 세포를 배양용 배지(10% FBS를 포함한 DMEM)를 이용하여 현탁한 후, 24구판에 구 당 1 x 105개 되도록 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 시험용 배지 (2% FBS를 포함한 DMEM)을 이용하여 세포를 수세한 후, 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10을 500nM씩 포함하는 시험용 배지 배지를 각 구당 500㎕ 씩 넣어주었다. 이후, 0, 2, 6, 9, 24, 48시간동안 37℃, 5% CO2배양기에서 배양한 후 배양이 끝나면 배지를 회수 하여 냉동 보관 하였다. 배지 내 인슐린 잔량 측정을 위해 PBS-T로 100배 희석하여 인간 인슐린 ELISA 키트 (Alpco, Cat.No. 80-INSHU-E10.1)를 이용하여 분석을 진행하였다.
총 3번의 시험을 반복하였고, 그 결과, 0시간 대비 48 시간 배양 후 배지 내 인슐린 잔량이 인간 인슐린과 인슐린 아날로그 10 각각 20.9 ± 11.4 % 및 72.7 ± 5.7 %으로 산출 되었다. 즉, 인간 인슐린과 대비하여 인슐린 아날로그 10은 더 우수한 세포 안정성을 보임을 확인하였다(도 4).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD.
Sanofi-Aventis Deutschland GmbH
<120> Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use
thereof
<130> KPA161084-KR-FR-P1
<150> KR 10-2016-0122484
<151> 2016-09-23
<160> 56
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
cagcatctgc tccctccatc agctggagaa ctac 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
gtagttctcc agctgatgga gggagcagat gctg 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
cagcatctgc tccctcaagc agctggagaa ctac 34
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
gtagttctcc agctgcttga gggagcagat gctg 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
ctaccagctg gagaacgagt gcaactgagg atcc 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
ggatcctcag ttgcactcgt tctccagctg gtag 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
ctaccagctg gagaactcct gcaactgagg atcc 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
ggatcctcag ttgcaggagt tctccagctg gtag 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
ctaccagctg gagaacacct gcaactgagg atcc 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
ggatcctcag ttgcaggtgt tctccagctg gtag 34
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg gaac 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
gttccccgca cactagctcg agagcttcca ccag 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg gaac 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
gttccccgca cactagggag agagcttcca ccag 34
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg gaac 34
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
gttccccgca cactagggtg agagcttcca ccag 34
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
cagcatctgc tccctcgccc agctggagaa ctac 34
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
gtagttctcc agctgggcga gggagcagat gctg 34
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
cagcatctgc tccctcgacc agctggagaa ctac 34
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 20
gtagttctcc agctggtcga gggagcagat gctg 34
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 21
ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg gaac 34
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 22
gttccccgca cactaggtcg agagcttcca ccag 34
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 23
ggggaacgag gcttcgacta cacacccaag acc 33
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 24
ggtcttgggt gtgtagtcga agcctcgttc ccc 33
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 25
ggggaacgag gcttcgagta cacacccaag acc 33
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 26
ggtcttgggt gtgtactcga agcctcgttc ccc 33
<210> 27
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 1
<400> 27
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctccatcag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 28
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 1
<400> 28
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 29
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 2
<400> 29
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaagcag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 30
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 2
<400> 30
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 31
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 3
<400> 31
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaacg agtgcaac 258
<210> 32
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 3
<400> 32
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Glu Cys Asn
85
<210> 33
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 4
<400> 33
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact cctgcaac 258
<210> 34
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 4
<400> 34
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Ser Cys Asn
85
<210> 35
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 5
<400> 35
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaaca cctgcaac 258
<210> 36
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 5
<400> 36
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Thr Cys Asn
85
<210> 37
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 6
<400> 37
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 38
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 6
<400> 38
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 39
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 7
<400> 39
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 40
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 7
<400> 40
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 41
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 8
<400> 41
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 42
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 8
<400> 42
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 43
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 9
<400> 43
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgcccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 44
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 9
<400> 44
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 45
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 10
<400> 45
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 46
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 10
<400> 46
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 47
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 11
<400> 47
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 48
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 11
<400> 48
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 49
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 12
<400> 49
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgactacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 50
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 12
<400> 50
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 51
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 13
<400> 51
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgagtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 52
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analog 13
<400> 52
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin analog, A-chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa is alanine, glycine, glutamine, histidine, glutamic acid, or
asparagine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa is alanine, glutamic acid, glutamine, histidine, or
asparagine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa is alanine, serine, glutamine, glutamic acid, histidine, or
asparagine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa is tyrosine, histidine, lysine, alanine, or aspartic acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa is alanine, leucine, tyrosine, histidine, glutamic acid, or
asparagine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, serine, or threonine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa is asparagine, glycine, histidine, or alanine
<400> 55
Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa
1 5 10 15
Glu Asn Xaa Cys Xaa
20
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Insulin analog, B-chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, serine, threonine, or aspartic
acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)
<223> Xaa is phenylalanine, aspartic acid, or glutamic acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa is threonine, or is absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa is proline, glutamic acid, or aspartic acid, or is absent
<400> 56
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr
20 25 30
Claims (22)
- 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산, B-쇄의 25번 아미노산, A-쇄의 14번 아미노산 및 A-쇄의 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 변이를 포함하는, 인슐린 아날로그.
- 제1항에 있어서,
상기 변이는 천연형 인슐린 B-쇄의 16번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 천연형 인슐린 B-쇄의 25번 아미노산인 페닐알라닌의 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 변이; 천연형 인슐린 A-쇄의 14번 아미노산인 티로신의 히스티딘, 라이신, 알라닌, 또는 아스파르트산으로의 변이; 또는 천연형 인슐린 A-쇄의 19번 아미노산인 티로신의 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌으로의 변이인,
인슐린 아날로그.
- 제1항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는
하기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56의 B-쇄를 포함하는 인슐린 아날로그(다만 상기 인슐린 아날로그들 중 그 A-쇄가 서열번호: 53과 일치하면서 동시에 B-쇄가 서열번호: 54와 일치하는 것은 제외한다):
[일반식 1]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 55)
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 56)
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고,
Xaa27은 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
- 제3항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는,
상기 일반식 1로 표시되는 서열번호: 55 의 A-쇄와 서열번호: 54의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는,
상기 서열번호: 53의 A-쇄와 일반식 2로 표시되는 서열번호: 56 의 B-쇄를 포함하는, 인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신, 히스티딘, 라이신, 알라닌 또는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서
상기 일반식 1에서,
Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신, 글루탐산, 또는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 2에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 또는 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌, 아스파르트산, 또는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 인슐린 아날로그는
(1) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(2) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(3) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(4) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(5) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(6) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(7) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(8) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(9) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(10) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(11) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(12) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(13) 상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제1항에 있어서,
상기 인슐린 아날로그는 서열번호: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 및 52로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,
인슐린 아날로그.
- 제3항에 있어서,
상기 일반식 1에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며, 상기 일반식 2에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인,인슐린 아날로그.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 인슐린 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산.
- 제16항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제17항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체.
- 제18항에 있어서, 상기 형질전환체가 대장균인 것인 형질전환체.
- 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그를 제조하는 방법:
a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인슐린 아날로그를 발현시키는 단계; 및
b) 발현된 인슐린 아날로그를 분리 및 정제하는 단계.
- 제20항에 있어서, 상기 분리 및 정제가
b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;
b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인슐린 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계;
b-3) 리폴딩된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;
b-4) 정제된 인슐린 아날로그를 트립신 및 카복시펩티다제 B로 처리하는 단계;
b-5) 처리된 인슐린 아날로그를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로 순차적으로 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 유효성분으로서 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20160122484 | 2016-09-23 | ||
KR1020160122484 | 2016-09-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20180033105A true KR20180033105A (ko) | 2018-04-02 |
Family
ID=61690584
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020170122759A KR20180033105A (ko) | 2016-09-23 | 2017-09-22 | 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그 및 이의 용도 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11396534B2 (ko) |
EP (1) | EP3517544A4 (ko) |
JP (1) | JP7158378B2 (ko) |
KR (1) | KR20180033105A (ko) |
CN (1) | CN110546161B (ko) |
AR (1) | AR109552A1 (ko) |
AU (1) | AU2017332408B2 (ko) |
BR (1) | BR112019005637A2 (ko) |
CA (1) | CA3037844A1 (ko) |
RU (1) | RU2764197C1 (ko) |
TW (1) | TWI774694B (ko) |
WO (1) | WO2018056764A1 (ko) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3939605A1 (en) | 2016-12-09 | 2022-01-19 | Akston Biosciences Corporation | Insulin-fc fusions and methods of use |
EP3604328A4 (en) * | 2017-03-23 | 2021-01-06 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | REDUCED INSULIN ANALOGUE COMPLEX FOR INSULIN RECEPTOR AND ITS USE |
US11267862B2 (en) | 2018-06-29 | 2022-03-08 | Akston Biosciences Corporation | Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use |
DK3655006T3 (da) | 2018-06-29 | 2022-02-21 | Akston Biosciences Corp | Ultralangtidsvirkende insulin-Fc-fusionsproteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
KR20210102346A (ko) * | 2018-12-11 | 2021-08-19 | 사노피 | 인슐린 콘쥬게이트 |
FI4073098T3 (fi) | 2019-12-19 | 2023-11-15 | Akston Biosciences Corp | Ultrapitkävaikutteiset insuliini-Fc-fuusioproteiinit ja niiden käyttömenetelmät |
US11186623B2 (en) | 2019-12-24 | 2021-11-30 | Akston Bioscience Corporation | Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use |
WO2021207599A1 (en) | 2020-04-10 | 2021-10-14 | Akston Biosciences Corporation | Antigen specific immunotherapy for covid-19 fusion proteins and methods of use |
US11192930B2 (en) | 2020-04-10 | 2021-12-07 | Askton Bioscences Corporation | Ultra-long acting insulin-Fc fusion protein and methods of use |
US11667689B2 (en) | 2021-07-23 | 2023-06-06 | Akston Biosciences Corporation | Insulin-Fc fusion proteins and methods of use to treat cancer |
Family Cites Families (84)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2536040A1 (de) | 1975-08-13 | 1977-02-24 | Hoechst Ag | Insulin-analoga mit biologischer wirkung |
US5175145A (en) | 1988-08-26 | 1992-12-29 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of diabetes mellitus with amylin agonists |
US5716927A (en) | 1988-12-23 | 1998-02-10 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogs having a modified B-chain |
HUT56857A (en) | 1988-12-23 | 1991-10-28 | Novo Nordisk As | Human insulin analogues |
NZ232375A (en) * | 1989-02-09 | 1992-04-28 | Lilly Co Eli | Insulin analogues modified at b29 |
US5422339A (en) | 1991-03-19 | 1995-06-06 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Peptides having insulin autoantibody but not insulin receptor binding capacity |
US5424286A (en) | 1993-05-24 | 1995-06-13 | Eng; John | Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same |
US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
DE69731289D1 (de) | 1996-03-18 | 2004-11-25 | Univ Texas | Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten |
EP1141014B1 (en) | 1999-01-06 | 2004-12-08 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variant |
WO2003020201A2 (en) | 2001-08-28 | 2003-03-13 | Eli Lilly And Company | Pre-mixes of glp-1 and basal insulin |
AR036711A1 (es) | 2001-10-05 | 2004-09-29 | Bayer Corp | Peptidos que actuan como agonistas del receptor del glp-1 y como antagonistas del receptor del glucagon y sus metodos de uso farmacologico |
US7179788B2 (en) | 2001-10-19 | 2007-02-20 | Eli Lilly And Company | Biphasic mixtures of GLP-1 and insulin |
DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
BRPI0409600A (pt) | 2003-04-29 | 2006-04-18 | Lilly Co Eli | análogo de insulina, composição, método de tratamento de hiperglicemia, e, análogo de pró-insulina |
SI1648933T1 (sl) | 2003-07-25 | 2010-01-29 | Conjuchem Biotechnologies Inc | Dolgo delujoäś inzulinski derivat in metoda zanj |
EP1682584B1 (en) | 2003-11-13 | 2013-04-17 | Hanmi Science Co., Ltd. | A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin fc region as a carrier |
EP2279758B1 (en) | 2005-06-16 | 2015-02-25 | Nektar Therapeutics | Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates |
US9056921B2 (en) | 2005-08-16 | 2015-06-16 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
CN101573133B (zh) | 2006-07-31 | 2014-08-27 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | Peg化延长的胰岛素 |
EP2074141B1 (en) * | 2006-09-22 | 2016-08-10 | Novo Nordisk A/S | Protease resistant insulin analogues |
US7790677B2 (en) | 2006-12-13 | 2010-09-07 | Elona Biotechnologies | Insulin production methods and pro-insulin constructs |
JP2008169195A (ja) | 2007-01-05 | 2008-07-24 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体 |
WO2008145721A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Novo Nordisk A/S | N-terminal modification of polypeptides for protection against degradation by aminopeptidases |
JP5688969B2 (ja) | 2007-07-16 | 2015-03-25 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | プロテアーゼに対して安定しているペグ化インスリンアナログ |
JP2009019027A (ja) | 2007-07-16 | 2009-01-29 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体 |
EP2017288A1 (en) | 2007-07-16 | 2009-01-21 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, pegylated insulin analogues |
CA2695970A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A\S | Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety |
JP5241849B2 (ja) | 2007-11-16 | 2013-07-17 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | インスリン及びインスリン分泌性ペプチドを含む薬学的組成物 |
DE102008025008A1 (de) | 2008-05-24 | 2009-11-26 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil |
NZ586589A (en) | 2008-01-09 | 2012-04-27 | Sanofi Aventis Deutschland | Novel insulin analogues having an extremely delayed time-action profile |
DE102008003568A1 (de) | 2008-01-09 | 2009-07-16 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil |
RU2524423C2 (ru) | 2008-01-09 | 2014-07-27 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Новые производные инсулина с чрезвычайно замедленным профилем время/действие |
US9260502B2 (en) * | 2008-03-14 | 2016-02-16 | Novo Nordisk A/S | Protease-stabilized insulin analogues |
EP2910571B1 (en) | 2008-03-18 | 2016-10-05 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
US8993516B2 (en) | 2008-04-14 | 2015-03-31 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
ES2650621T3 (es) | 2008-10-17 | 2018-01-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Combinación de una insulina y un agonista de GLP-1 |
AU2009335715B2 (en) | 2008-12-19 | 2016-09-15 | Indiana University Research And Technology Corporation | Amide-based insulin prodrugs |
US8481485B2 (en) | 2008-12-19 | 2013-07-09 | Indiana University Research And Technology Corporation | Insulin analogs |
MX2011010151A (es) | 2009-03-27 | 2011-12-14 | Glaxo Group Ltd | Fusiones y conjugados de farmaco. |
WO2011028813A2 (en) | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Case Western Reserve University | Insulin analogues of enhanced receptor-binding specificity |
PE20121362A1 (es) | 2009-11-13 | 2012-10-17 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica que comprende despro36exendina-4(1-39)-lys6-nh2, insulina gly(a21)-arg(b31)-arg(b32) y metionina |
WO2011075606A2 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
US8703701B2 (en) | 2009-12-18 | 2014-04-22 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists |
KR101058209B1 (ko) | 2009-12-30 | 2011-08-22 | 전자부품연구원 | Ofdm 방식의 디지털 방송 시스템의 빠른 동기 방법 |
AR081066A1 (es) | 2010-04-02 | 2012-06-06 | Hanmi Holdings Co Ltd | Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina |
KR101330868B1 (ko) | 2010-06-08 | 2013-11-18 | 한미사이언스 주식회사 | 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 유도체 약물 결합체 |
KR101324828B1 (ko) | 2010-06-08 | 2013-11-01 | 한미사이언스 주식회사 | 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체 |
CN103068842B (zh) | 2010-06-16 | 2016-10-19 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 对胰岛素受体具有高活性的单链胰岛素激动剂 |
KR101382593B1 (ko) | 2010-07-21 | 2014-04-10 | 한미사이언스 주식회사 | 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
CA2806399A1 (en) | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Smartcells, Inc. | Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof |
AU2012208349A1 (en) | 2011-01-20 | 2013-07-18 | Zealand Pharma A/S | Combination of acylated glucagon analogues with insulin analogues |
US9528180B2 (en) | 2011-03-02 | 2016-12-27 | Oerlikon Surface Solutions Ag, Pfaffikon | Sliding component coated with metal-comprising carbon layer for improving wear and friction behavior by tribological applications under lubricated conditions |
CN102675452B (zh) | 2011-03-17 | 2015-09-16 | 重庆富进生物医药有限公司 | 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物 |
EP2705325B1 (en) | 2011-05-03 | 2015-04-08 | Teijin Aramid B.V. | Antiballistic panel |
UA113626C2 (xx) | 2011-06-02 | 2017-02-27 | Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії | |
CN104023739A (zh) | 2011-06-02 | 2014-09-03 | Opko生物科学有限公司 | 长效glp-1/胰高血糖素受体激动剂 |
DK2718318T3 (en) | 2011-06-10 | 2018-11-05 | Hanmi Science Co Ltd | New oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical compositions for the treatment of obesity comprising these |
US9260503B2 (en) | 2011-06-15 | 2016-02-16 | Novo Nordisk A/S | Multi-substituted insulins |
PT2721062T (pt) | 2011-06-17 | 2019-02-12 | Hanmi Science Co Ltd | Conjugado que compreende oxintomodulina e um fragmento de imunoglobulina e utilização do mesmo |
WO2013089463A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | Lg Innotek Co., Ltd. | Method for deposition of silicon carbide and silicon carbide epitaxial wafer |
WO2013110069A1 (en) | 2012-01-20 | 2013-07-25 | Case Western Reserve University | Glutamic acid-stabilized insulin analogues |
WO2013128003A1 (en) | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Novo Nordisk A/S | N-terminally modified oligopeptides and uses thereof |
KR101665009B1 (ko) | 2012-03-09 | 2016-10-11 | 한미사이언스 주식회사 | 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
AR091902A1 (es) | 2012-07-25 | 2015-03-11 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada |
KR101968344B1 (ko) | 2012-07-25 | 2019-04-12 | 한미약품 주식회사 | 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물 |
AR092862A1 (es) | 2012-07-25 | 2015-05-06 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion |
AR094821A1 (es) | 2012-07-25 | 2015-09-02 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada |
WO2014049610A2 (en) | 2012-09-26 | 2014-04-03 | Cadila Healthcare Limited | Peptides as gip, glp-1 and glucagon receptors triple-agonist |
KR101993393B1 (ko) | 2012-11-06 | 2019-10-01 | 한미약품 주식회사 | 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물 |
WO2014073842A1 (en) | 2012-11-06 | 2014-05-15 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment |
RU2677800C2 (ru) | 2013-02-26 | 2019-01-21 | Ханми Фарм. Ко., Лтд. | Сайт-специфичный конъюгат инсулина |
CA2901873C (en) * | 2013-02-26 | 2022-05-03 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Novel insulin analog and use thereof |
AR096891A1 (es) | 2013-07-12 | 2016-02-03 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo |
SG10201800751WA (en) | 2013-07-29 | 2018-03-28 | Berkeley Information Tech Pty Ltd | Systems and methodologies for managing document access permissions |
EP3098235A4 (en) * | 2014-01-20 | 2017-10-18 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Long-acting insulin and use thereof |
AR100639A1 (es) * | 2014-05-29 | 2016-10-19 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada |
TWI684458B (zh) | 2014-05-30 | 2020-02-11 | 南韓商韓美藥品股份有限公司 | 包含胰島素及glp-1/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物 |
KR20160001391A (ko) * | 2014-06-27 | 2016-01-06 | 한미약품 주식회사 | 신규한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도 |
KR20160007295A (ko) * | 2014-07-11 | 2016-01-20 | 한미약품 주식회사 | 인슐린 아날로그 |
KR101676542B1 (ko) | 2014-12-30 | 2016-11-16 | 건국대학교 산학협력단 | 프로인슐린의 면역학적 용도 |
UY36870A (es) | 2015-08-28 | 2017-03-31 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Análogos de insulina novedosos |
CN108473548A (zh) * | 2015-09-24 | 2018-08-31 | 韩美药品股份有限公司 | 胰岛素生产方法 |
EP3604328A4 (en) | 2017-03-23 | 2021-01-06 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | REDUCED INSULIN ANALOGUE COMPLEX FOR INSULIN RECEPTOR AND ITS USE |
-
2017
- 2017-09-22 US US16/335,490 patent/US11396534B2/en active Active
- 2017-09-22 CN CN201780071757.1A patent/CN110546161B/zh active Active
- 2017-09-22 EP EP17853478.0A patent/EP3517544A4/en active Pending
- 2017-09-22 KR KR1020170122759A patent/KR20180033105A/ko not_active Application Discontinuation
- 2017-09-22 AU AU2017332408A patent/AU2017332408B2/en active Active
- 2017-09-22 CA CA3037844A patent/CA3037844A1/en active Pending
- 2017-09-22 WO PCT/KR2017/010504 patent/WO2018056764A1/ko unknown
- 2017-09-22 BR BR112019005637A patent/BR112019005637A2/pt unknown
- 2017-09-22 JP JP2019515862A patent/JP7158378B2/ja active Active
- 2017-09-22 RU RU2019109608A patent/RU2764197C1/ru active
- 2017-09-22 TW TW106132612A patent/TWI774694B/zh active
- 2017-09-25 AR ARP170102640A patent/AR109552A1/es unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3037844A1 (en) | 2018-03-29 |
BR112019005637A2 (pt) | 2019-07-30 |
TWI774694B (zh) | 2022-08-21 |
US11396534B2 (en) | 2022-07-26 |
AU2017332408B2 (en) | 2022-02-10 |
JP7158378B2 (ja) | 2022-10-21 |
US20190300593A1 (en) | 2019-10-03 |
CN110546161B (zh) | 2024-01-26 |
EP3517544A1 (en) | 2019-07-31 |
EP3517544A4 (en) | 2020-06-03 |
RU2764197C1 (ru) | 2022-01-14 |
AR109552A1 (es) | 2018-12-19 |
WO2018056764A1 (ko) | 2018-03-29 |
CN110546161A (zh) | 2019-12-06 |
TW201813977A (zh) | 2018-04-16 |
AU2017332408A1 (en) | 2019-05-16 |
JP2019531075A (ja) | 2019-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20180033105A (ko) | 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그 및 이의 용도 | |
JP7252280B2 (ja) | 新規なインスリンアナログ及びその用途 | |
JP5695909B2 (ja) | 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体 | |
KR102406654B1 (ko) | 지속형 인슐린 및 그 용도 | |
CA2575753A1 (en) | Muteins of fibroblast growth factor 21 | |
CN113396157A (zh) | 具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物 | |
JPH11500925A (ja) | 抗肥満症タンパク質 | |
HU223718B1 (hu) | Eljárás humán inzulin előállítására, proinzulin-tartalmú hibridpolipeptid expressziójából kiindulva | |
KR20160007295A (ko) | 인슐린 아날로그 | |
JP2023040155A (ja) | 組換え神経成長因子のための組成物及び方法 | |
KR20180108510A (ko) | 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도 | |
KR20190036956A (ko) | 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체 | |
KR20160001391A (ko) | 신규한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도 | |
CN113166222B (zh) | 长效胰岛素类似物及其复合物 | |
RU2337964C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAS-2, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ПРОИНСУЛИНА Aspart ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BAS2 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА Aspart | |
EA045778B1 (ru) | Новые аналоги инсулина и их применение | |
KR102646845B1 (ko) | 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 | |
EA041658B1 (ru) | Новые аналоги инсулина и их применение |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E601 | Decision to refuse application |