KR20100053561A

KR20100053561A - 아실 및 알킬렌 글리콜 부분을 갖는 인슐린 유사체

Info

Publication number: KR20100053561A
Application number: KR1020107003525A
Authority: KR
Inventors: 피터 메드센; 토마스 뵈글럼 켈드센; 토마스 호에그-젠슨; 티나 묄러 타그모세; 팔레 야코브센; 야노스 티보 코드라; 페트릭 윌리암 게리베이; 도테 세니아 그람
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2007-08-15
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2010-05-20
Also published as: WO2009022005A1; ES2548304T3; EP2178912B1; CN101784562A; CN101784562B; JP2010535851A; RU2514430C2; WO2009022013A1; EP2708554A1; BRPI0823154A2; ZA201001416B; AU2008288413B2; EP2178912A1; CA2695970A1; US20110098440A1; JP5730569B2; AU2008288413A1; MX2010001645A; US9150633B2; RU2010107788A

Abstract

A21 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 리신 잔기, 또는 리신 잔기를 포함하는 최대 4개 아미노산 잔기의, A21 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 펩티드 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체에 있어서, 알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 아실 부분은 A22 위치에서 리신 잔기에 부착되거나, 또는 A21 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 부착된 펩티드 잔기에 존재하는 리신 잔기에 부착되고, 이때 인슐린 유사체에 오직 하나의 리신(K, Lys)이 존재하는 것을 특징으로 하는 아실화된 인슐린 유사체를 폐로 편리하게 투여할 수 있다.

Description

아실 및 알킬렌 글리콜 부분을 갖는 인슐린 유사체{INSULIN ANALOGUES WITH AN ACYL AND ALKYLENE GLYCOL MOIETY}

본 발명은 신규의 아실화된 인슐린 유사체 및 그것의 관련 양태에 관한 것이다.

인슐린은 췌장의 β-세포에 의해 분비되는 폴리펩티드 호르몬이다. 인슐린은 두개의 쇄간 이황화 결합에 의해 함께 연결된 A 및 B 쇄로 나타내는 두개의 폴리펩티드로 구성된다. 사람, 돼지 및 소 인슐린에서, A 및 B 쇄는 각각 21개 및 30개 아미노산 잔기를 함유한다. 그러나, 종마다 두개의 쇄에서 상이한 위치에 존재하는 아미노산 잔기 중에 변형이 존재한다. 광범위한 유전자 가공의 사용은 하나 이상의 아미노산 잔기를 교환함으로써 자연 발생 인슐린의 유사체를 제조할 수 있게 하였다.

인슐린은 당뇨병 및 이와 관련되거나 이것으로부터 초래되는 질환의 치료를 위해 사용된다. 인슐린은 정상 대사 조절을 유지하는데 필수적이다. 대개 인슐린은 주사에 의해 투여된다. 공교롭게도, 많은 당뇨병 환자들은 글루코스 수준의 정밀한 조절을 유지하는데 필요한 많은 주사와 관련된 불편함 때문에 집중 요법을 받는 것을 꺼려한다. 경구 투여시, 인슐린은 소화관에서 빠르게 분해되어 혈류로 흡수되지 않는다. 그러므로, 경구, 직장, 경피 및 비강 경로와 같은 대안적 인슐린 투여 경로가 연구되어 왔다. 그러나 지금까지 이들 투여 경로가 충분히 효과적인 인슐린 흡수를 가져오지 않았다.

수십년 동안, 지속성 인슐린 제조물과 속효성 인슐린 제조물이 모두 이용가능하였으며, 많은 환자들은 하루에 2-4회 주사를 투여하였다. 지난 수십년 동안, 당뇨병 환자들에게 정밀한 혈중 글루코스 수준의 조절을 유지하는 것이 매우 중요하다는 것이 밝혀졌다.

2007년 8월 30일에 공개된 공보 번호 WO 2007/096431의 국제 특허 출원(Novo Nordisk A/S)은 알킬렌 글리콜 부분이 없는 복합 측쇄를 갖는 인슐린을 설명한다. 공보 번호가 WO 2006/082205인 국제 특허 출원(Novo Nordisk A/S)은 B쇄 중의 아미노산에 연결된 복합 측쇄를 갖는 인슐린을 설명한다. 제 1 항에 따르면, US 6,444,641 B1은 지방 아실쇄가 아미드 결합에 의해 결합된 인슐린 유사체를 포함하는 지방산-아실화된 인슐린 유사체에 관한 것이며, 여기서 상기 지방 인슐린 유사체는 인슐린의 등전위점보다 높은 등전위점을 갖는다. 제 1 항에 따르면, WO 2006/082205(Novo Nordisk A/S)는 모 인슐린 분자의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 부착된 측쇄를 갖는 인슐린 유도체에 관한 것이다. Pharm. Res. 21 (2004), 1498-1504는 인슐린 디터머의 연장의 메커니즘을 다룬다.

정의

본원에서, 용어 인슐린은 자연 발생 인슐린, 예컨대 사람 인슐린 및 인슐린 유사체를 포함한다.

본원에서, 용어 아미노산 잔기는 아미노기로부터 수소 원자가 제거된 아미노산 및/또는 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 아미노산 및/또는 메르캅토기로부터 수소 원자가 제거된 아미노산을 포함한다. 포괄적으로 아미노산 잔기는 아미노산으로 나타내어질 수 있다.

본원에서, 용어 펩티드 잔기는 아미노기로부터 수소 원자가 제거된 펩티드 및/또는 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 펩티드 및/또는 메르캅토기로부터 수소 원자가 제거된 펩티드를 포함한다. 포괄적으로 펩티드 잔기는 펩티드로 나타내어질 수 있다.

본원에서, 용어 인슐린 유사체는 자연 발생 인슐린, 예컨대 사람 인슐린의 구조로부터 자연 인슐린에서 발생하는 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 치환(대체) 및 A21 아미노산 잔기에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가에 의해 공식적으로 유도될 수 있는 분자 구조를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 부가 및/또는 치환되는 아미노산 잔기는 암호화 가능한 아미노산 잔기이다. 예를 들어, A쇄는 그것의 C-말단 끝에서 예컨대 1개, 2개, 3개 또는 4개 아미노산 잔기만큼 연장될 수 있으며 (사람 인슐린과 비교하여) 그 위치는 각각 A22, A23, A24 및 A25으로 표시된다. 인슐린 유사체가 A21/A22 위치에서 연장되더라도, 상기 인슐린 유사체 내의 다른 위치에서 결실이 있을 수 있다. 사람 인슐린과 유사하게, 본 발명의 인슐린 유사체에서 A21 아미노산 잔기는 20개 위치 중 Cys 잔기에 연결되며 Cys 잔기는 쇄간 이황화 결합의 형성에 참여한다. 본원에서, 또한 용어 모 인슐린 또는 모 인슐린 유사체가 인슐린 유사체에 사용된다. 주로 용어 모는 예컨대 화학적 아실화에 의해 유도될 수 있는 측쇄를 보유하는 인슐린 유사체와 구별할 때 사용된다.

본원에서 A1, A2, A3 등과 같은 용어는 인슐린의 A쇄에서 (N-말단 끝으로부터 카운트하여) 각각 위치 1, 2 및 3을 나타낸다. 유사하게 B1, B2, B3 등과 같은 용어는 인슐린의 B쇄에서 (N-말단 끝으로부터 카운트하여) 각각 위치 1, 2 및 3을 나타낸다. 아미노산에 대한 하나의 문자 암호를 사용하여 A21A, A21G 및 A21Q와 같은 용어는 A21 위치 내의 아미노산이 각각 A, G 및 Q인 아미노산을 나타낸다. 아미노산에 대한 세개의 문자 암호를 사용하여, 해당하는 표현은 각각 AlaA21, GlyA21 및 GlnA21이다.

본원에서 desB29 및 desB30와 같은 용어는 각각 B29 또는 B30 아미노산 잔기가 결핍된 인슐린 유사체를 나타낸다.

인슐린 유사체 및 A 및 B 쇄에서 위치의 넘버링은 모 화합물이 그것에 사용된 넘버링을 갖는 사람 인슐린이 되도록 행한다.

본원에서, 아미노산, 아미노산 잔기, 펩티드 또는 펩티드 잔기와 같은 용어와 연관하여 표현 "암호화 가능한"은 뉴클레오티드의 트리플렛("암호")에 의해 암호화될 수 있는 아미노산, 아미노산 잔기, 펩티드 또는 펩티드 잔기를 나타내는데 사용되며, 유전자 조작을 참조한다.

본원에서, 용어 돌연변이는 아미노산 서열에서의 어떤 변화를 포함한다(암호화 가능한 아미노산으로의 치환 및 삽입, 및 결실).

속효성 인슐린 또는 볼루스 인슐린은 보통의 사람 인슐린과 유사하거나 더 빠른 작용의 빠른 개시 및/또는 보통의 사람 인슐린과 유사하거나 단지 약간 더 긴 작용 기간을 갖는 인슐린을 의미한다.

지속성 인슐린 또는 기저 인슐린은 정상 또는 보통 사람 인슐린보다 더 긴 작용 기간을 갖는 인슐린을 의미한다.

높은 물리적 안정성은 사람 인슐린의 50% 미만인 피브릴화에 대한 경향을 의미한다. 피브릴화는 피브릴 형성이 주어진 조건에서 개시되기 전의 지연 시간에 의해 설명될 수 있다.

인슐린 수용체 및 IGF-1 수용체 친화성을 갖는 폴리펩티드는 적합한 결합 분석법에서 인슐린 수용체 및 사람 IGF-1 수용체와 상호작용할 수 있는 폴리펩티드이다. 이러한 수용체 분석법은 해당 분야에 잘 알려져 있으며 실시예에서 더욱 설명된다. 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 IGF-1 수용체에 결합하지 않거나 상기 수용체에 대하여 더 낮은 친화성을 가질 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 실질적으로 사람 인슐린과 동일하거나 더 낮은 정도의 IGF-1 수용체에 대한 친화성을 가질 것이다.

편의상 본원에서는 괄호 안의 통상의 3문자 암호 및 1문자 암호를 갖는 아미노산의 명칭에 따른다: 글리신 (Gly & G), 프롤린 (Pro & P), 알라닌 (Ala & A), 발린 (Val & V), 류신 (Leu & L), 이소류신 (Ile & I), 메티오닌 (Met & M), 시스테인 (Cys & C), 페닐알라닌 (Phe & F), 티로신 (Tyr & Y), 트립토판 (Trp & W), 히스티딘 (His & H), 리신 (Lys & K), 아르기닌 (Arg & R), 글루타민 (Gln & Q), 아스파라긴 (Asn & N), 글루타민산 (Glu & E), 아스파르트산(Asp & D), 세린 (Ser & S) 및 트레오닌 (Thr & T). 철자 오류로 인하여 일반적으로 사용되는 암호로부터벗어나면, 일반적으로 사용되는 암호를 적용한다. 본 발명의 인슐린에 존재하는 아미노산은, 바람직하게는 핵산에 의해 암호화될 수 있는 아미노산이다. Glu 및 Asp와 같은 아미노산은 α, γ, L 또는 D 형태일 수 있다.

명세서 및 실시예에 하기 약자를 사용한다: Da는 달톤이고(분자량), kDa는 킬로-달톤이고(= 1000 Da), Mw는 분자량이고, OSu는 1-숙신이미딜옥시 = 2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시이고, RT는 실온이고, SA는 시나핀산이고, Su는 1-숙신이미딜 = 2,5-디옥소피롤리딘-1-일이고, DCM은 디클로로메탄이고, DIEA (및 DIPEA)는 N, N-디이소프로필에틸아민이고, TSTU는 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트이고, Tri는 트리스(히드록시-메틸)아미노메탄이고, CV는 컬럼 부피이고, NMP는 N-메틸피롤리딘-2-온이고, OTBU는 tert-부톡시이고, OEG는 아미노산 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산이고, HSA는 사람 혈청 알부민이고, TNBS는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산이고, HOBT (또는 HOBt)는 1-히드록시벤조트리아졸이고, HOAt는 1-히드록시-7-아자-벤조티아졸이고, NaOH는 수산화나트륨이고, DMF는 N,N-디메틸 포름아미드이고, THF는 테트라히드로푸란이고, TFA는 트리플루오로아세트산이고, mmol은 밀리몰이고, Fmoc은 플루오렌-9-일메톡시카르보닐이고, OEG는 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (또는 이것의 잔기)이고, gGlu (본원에서 γGlu로도 나타냄)은 감마-글루탐산이고, 실시예 48에서는 편의상, 하기 주석을 사용하여 본 발명 또는 종래 분야의 인슐린의 아실 부분의 서열을 설명한다: C18는 옥타데칸디오일이고, C20은 에이코산디오일이고, gGlu는 감마-글루탐산이고, PEG3는 3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피온산이고, PEG5는 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}프로피온산이고, PEG7은 3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피온산이다(완전한 구조/서열은 실시예에서 발견할 수 있다).

본 발명의 목적은 종래 기술의 단점 중 적어도 하나를 극복 또는 경감하거나, 또는 유용한 대안을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 목적은 양호한 생체이용성을 갖는 인슐린 유도체를 산출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 속효성 인슐린으로서 사용가능한 인슐린 유도체를 산출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐에 투여할 수 있는 인슐린 유도체를 산출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 연장된 작용 프로파일을 갖는 인슐린 유도체를 산출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 기저 인슐린으로서 사용할 수 있는 인슐린 유도체를 산출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 높은 인슐린 수용체 결합 친화성을 갖는 인슐린 유도체를 산출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 인슐린의 생체내 반감기를 개선시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 저혈당 상태가 되도록 하는 경향이 사람 인슐린보다 낮은 인슐린 유도체를 산출하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 특히 2년 동안 보관한 후 만족스러운 물리적 안정성을 갖는 인슐린을 발견하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 특히 2년 동안 보관한 후 만족스러운 화학적 안정성을 갖는 인슐린을 발견하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 특히 2년 동안 보관한 후 만족스러운 단백질 분해 안정성을 갖는 인슐린을 발견하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 만족스러운 용해도를 갖는 인슐린을 발견하는 것이다.

간단히 설명하면, 본 발명은 A21 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 연결된 아미노산 잔기, 또는 최대 4개 아미노산 잔기의, A21 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 연결된 펩티드 잔기를 포함하는 인슐린 유사체에 있어서, 알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 아실 부분이 A22 위치에서 리신 잔기에 부착되거나, 또는 A21 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 부착된 펩티드 잔기에 존재하는 리신 잔기에 부착된, 아실화된 인슐린 유사체에 관한 것이다. 따라서, 인슐린 유사체는 A22 위치에 아미노산을 포함한다.

본 발명의 인슐린(하나 이상의 알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 아실화된 인슐린 유사체)은, 높은 HSA (사람 혈청 알부민) 농도, 예컨대 4.5% HSA의 존재에서 수행하는 인슐린 수용체 결합 분석법으로 측정했을 때, 놀랍게도 알킬렌 글리콜 부분이 없는 유사한 아실화된 인슐린 유사체보다 더 높은 인슐린 수용체 결합 친화성을 보유하는 것으로 발견되었다.

바람직한 실시형태의 설명

놀랍게도, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 높은 HSA 농도의 존재하에서 양호한 생체이용성 및 높은 인슐린 수용체 결합 친화성을 나타낸다.

본 발명에 따른 아실화된 인슐린 유사체로 제시되는 인슐린 유사체는 위치 A21 내의 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 하나의 아미노산 잔기를 갖는 사람 인슐린으로서, 또는 위치 A21 내의 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 최대 4개 아미노산 잔기의, 펩티드 잔기를 갖는 사람 인슐린으로서 공식적으로 설명될 수 있으며, 선택적으로 위치 A1-A21 및 B1-B30 내의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 명명법에 대해서, 위치 A21 내의 아미노산 잔기에 연결된 아미노산 잔기는 A22 위치 내에 있다. 유사하게, 위치 A21 내의 아미노산 잔기에 연결된 펩티드 잔기에 존재하는 아미노산 잔기는 위치 A22, A23, A24 또는 A25 내에 있다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 인슐린 유사체 및 집합적인 식 (I): Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-을 갖는 아실 부분을 함유하는 알킬렌 글리콜로부터 공식적으로 형성될 수 있으며, 여기서 Acy, AA1 , AA2, AA3, n, m 및 p는 본원에 정의된 바와 같고, 예컨대 공식적으로는 인슐린 유사체 내의 아미노기로부터 수소 원자를 제거하고 여기에 식 (I)의 측쇄를 부착시킴으로써 형성될 수 있다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체에서, 식 (I)의 아실 부분을 함유하는 알킬렌 글리콜은 A21 아미노산 잔기의 C 말단 측 또는 끝에 있는 위치 내의 리신 잔기에 연결된다. 예컨대, 식 (I)의 아실 부분을 함유하는 알킬렌 글리콜은 위치 A22에서 리신 잔기에 연결된다. 식 (I)의 아실 부분을 함유하는 알킬렌 글리콜이 위치 A21 내의 아미노산 잔기에 연결된 펩티드 잔기에 연결되면, 식 (I)의 아실 부분을 함유하는 알킬렌 글리콜은 위치 A22, A23, A24 또는 A25 중 어느 하나에서 리신 잔기에 연결된다.

상기 설명한 바와 같이, 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-으로 제시되는 아실기는 지방산 또는 지방 이산으로부터 기원한다.

본원에서, 용어 "지방산"은 적어도 두개의 탄소 원자를 갖고 포화되거나 불포화된 선형 또는 분기형, 지방족 카르복실산을 포함한다. 지방산의 비제한적 예는 미리스트산, 팔미트산 및 스테아르산이다.

본원에서, 용어 "지방 이산"(fatty diacid)은 적어도 두개의 탄소 원자를 갖고 포화되거나 불포화된 선형 또는 분기형, 지방족 디카르복실산을 포함한다. 지방 이산의 비제한적 예는 숙신산, 헥산디온산, 옥탄디온산, 데칸디온산, 도데칸디온산, 테트라데칸디온산, 헥사데칸디온산, 헵타데칸디온산, 옥타데칸디온산 및 에이코산디온산이다.

AA1로 표시되는 중성 환상 아미노산 잔기는 포화된 6-원 탄소환상 고리를 함유하고, 선택적으로 질소 헤테로 원자를 함유하는 아미노산이며, 바람직하게는 이 고리는 시클로헥산 고리 또는 피페리딘 고리이다. 바람직하게는, 이 중성 환상 아미노산의 분자량은 약 100 내지 약 200 Da의 범위 내이다.

AA2로 표시되는 산성 아미노산 잔기는 두개의 카르복실산기 및 하나의 일차 또는 이차 아미노기를 포함하는 분자량이 최대 약 200 Da인 아미노산이다.

AA3으로 표시되는 중성 알킬렌글리콜-함유 아미노산 잔기는 알킬렌글리콜 부분, 선택적으로 한쪽 끝에 카르복실산 관능성을 함유하고 다른쪽 끝에 아미노기 관능성을 함유하는 올리고- 또는 폴리알킬렌글리콜 부분이다.

본원에서, 용어 알킬렌글리콜 부분은 올리고- 및 폴리알킬렌글리콜 부분, 및 모노알킬렌글리콜 부분을 포함한다. 폴리알킬렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜 기반쇄, 폴리프로필렌글리콜 기반쇄 및 폴리부틸렌글리콜 기반쇄, 즉 반복 단위 -CH₂CH₂O-, -CH₂CH₂CH₂O- 또는 -CH₂CH₂CH₂CH₂O-에 기반한 쇄를 포함한다. 알킬렌글리콜 부분은 단분산(명확한 길이/분자량으로) 및 다분산(덜 명확한 길이/평균 분자량으로) 될 수 있다. 모노알킬렌글리콜 부분은 각 끝에 상이한 기를 함유하는 -OCH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂CH₂O- 또는 -OCH₂CH₂CH₂CH₂O-를 포함한다.

본원에 설명한 바와 같이, 식 (I) (Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-)을 갖는 아실 부분에서 AA1, AA2 및 AA3가 나타나 있는 순서는 독립적으로 교환될 수 있다. 결론적으로, 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-는 예컨대 식 Acy-AA2_m-AA1_n-AA3_p- 및 식 Acy-AA3_p-AA2_m-AA1_n-과 같은 부분도 포함하며, 여기서 Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p는 본원에 정의된 바와 같다.

본원에 설명한 바와 같이, 부분 Acy, AA1, AA2 및/또는 AA3 사이의 연결은 아미드 결합(-CONH-, 여기서 -CO-는 부분 Acy, AA1, AA2 및 AA3 중 하나로부터 기원하고 -NH-는 부분 AA1, AA2 및 AA3 중 하나로부터 기원함)이다.

본 발명의 바람직한 실시형태

실시형태에서, 본 발명의 모 인슐린은 위치 A22 내의 리신 및 A21 아미노산 잔기에 C 말단으로 연결된 최대 4개 아미노산의 어떤 펩티드 잔기 및 B29R 및/또는 desB30 돌연변이를 제외하고, 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 여기서, 우선 A 또는 B 쇄에서 위치는 주어지며, 이후 가능한 아미노산 잔기(들)는 하나의 문자 암호로서 주어진다. 위치 A22 내의 리신 및 A21 아미노산 잔기에 C 말단으로 연결된 최대 4개 아미노산의 어떤 펩티드 잔기 및 B29R 및/또는 desB30 돌연변이를 제외하고, 한 실시형태에서 5개 돌연변이가 있고, 또 다른 실시형태에서 4개의 돌연변이가 있고, 또 다른 실시형태에서 3개의 돌연변이가 있고, 또 다른 실시형태에서 2개의 돌연변이가 있고, 또 다른 실시형태에서 1개의 돌연변이가 있고, 또 다른 실시형태에서 돌연변이가 없다:

A4: A 또는 Q.

A5: L.

A8: R, N, Q, E, H, L 또는 W.

A9: R 또는 L.

A14: E 또는 D.

A15: A 또는 T.

A16: M.

A17: D 또는 F.

A18: R, L, I, D, 또는 V.

A21 : G 또는 A.

B3: A, R, H, I, L, M, F, W, Y, S 또는 T.

B10: D 또는 E.

B25: Y, H 또는 desB25.

B26: Q, E, S 또는 desB26.

B27: H, L, M, W 또는 Y.

B28: D 또는 E.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A4A 또는 A4Q 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A5L 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A8L, A8N, A8Q, A8E, A8H, A8L 또는 A8W 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A8H 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A9R 또는 A9L 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A9L 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A14E 또는 A14D 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A15A 또는 A15T 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A16M 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A17D 또는 A17F 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A18R, A18L, A18I, A18D 또는 A18V 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A18L 또는 A18V 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A18I 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A21G 또는 A21A 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 B3A, B3R, B3H, B3I, B3L, B3M, B3F, B3W, B3Y, B3S 또는 B3T 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 B1OD 또는 B1OE 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 B25Y, B25H, 또는 desB25 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 B26Q, B26E, B26S, 또는 desB26 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 B27H, B27L, B27M, B27W, 또는 B27Y 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 B27W 또는 B27Y 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 B28D 또는 B28E 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모 인슐린은 A21Q, B1Q, desB1, B3Q, B3S, B3T, B13Q, 또는 desB27 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체에 존재할 수 있는 모 인슐린 유사체의 비제한적 특정 예는 사람 인슐린으로부터의 차이가 주어진 하기를 포함한다:

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체에 존재할 수 있는 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 아실 부분의 비제한적 특정 예는 하기와 같다:

한 실시형태에서, AA3으로 표시되는 부분은 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 하기 화합물 중에서 선택된다:

식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 아실 부분의 상기 비제한적 특정예 중 어느 것은 인슐린 유사체의 상기 비제한적 특정예 중 어느 것에 존재하는 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 부착되어 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 특정 예를 더 제공할 수 있다.

모 인슐린은 공지된 방식으로 그 자체 제조될 수 있다. 예를 들어, 이들은 예컨대 EP 1,246,845에 개시된 바와 같이 잘 알려진 기술에 의해 적절한 숙주 세포에서 해당 단일쇄 인슐린을 암호화하는 DNA 서열을 발현함으로써 제조될 수 있다. 인슐린은 예컨대 EP 163,529 및 EP 214,826에 개시된 바와 같이 효소적 및 화학적 시험관내 과정에 의해 원하는 인슐린 분자로 전환되는 전구체 분자로서 형질전환된 숙주 세포에서 발현된다. 전구체 분자는 예컨대 EP 1246,845에 개시된 바와 같이 나중에 분열되는 N-말단 연장과 함께 발현될 수 있다. 본 발명에 적합한 종류의 N-말단 연장의 예는, 예컨대 미국 특허 5,395,922 및 유럽 특허 765,395에 개시된다. 보다 구체적으로, WO 2006/082205, 37쪽 31줄 내지 39쪽 29줄을 참고할 수 있다.

모 인슐린 유사체는 인슐린 유사체 내의 리신 잔기에 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 원하는 기를 도입함으로써 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체로 전환될 수 있다. 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 원하는 기는 어떤 편리한 방법에 의해 도입될 수 있고, 이러한 반응을 위해 많은 방법이 종래 분야에 개시되어 있다. 보다 구체적인 내용은 하기 실시예에 나타나 있다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 본질적으로 아연이 없는 화합물의 형태 또는 아연 착체의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 아연 착체가 제공되는 경우, 두개의 Zn²⁺ 이온, 세개의 Zn²⁺ 이온 또는 네개의 Zn²⁺ 이온이 각 인슐린 헥사머에 결합될 수 있다. 이 아실화된 인슐린 유사체의 아연 착체의 용액은 이러한 종의 혼합물을 함유할 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 치료상 유효량의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 이것은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 과혈당을 유발하는 다른 상태를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 과혈당을 유발하는 다른 상태의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 공지된 방식으로 그 자체로 제조된다.

본 발명의 다른 양태에서, 치료상 유효량의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 신속한 작용의 개시를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로 약학적으로 허용가능한 담체 및 첨가제과 함께 포함하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 과혈당을 유발하는 다른 상태를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 치료상 유효량의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 선택적으로 신속한 작용의 개시를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로 약학적으로 허용가능한 담체 및 첨가제과 함께 포함하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 과혈당을 유발하는 다른 상태를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하기 위한 폐 적용에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체와 AspB28 사람 인슐린; LysB28 ProB29 사람 인슐린 및 LysB3 GluB29 사람 인슐린으로 구성된 군에서 선택된 속효성 인슐린 유사체의 혼합물인 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체 및 속효성 인슐린 유사체는 약 90/10%; 약 70/30% 또는 약 50/50%의 비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 치료상 유효량의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 약학적으로 허용가능한 담체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제과 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 과혈당을 유발하는 다른 상태를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서, 치료상 유효량의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 신속한 작용의 개시를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로 약학적으로 허용가능한 담체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제과 함께 환자에게 투여하는것을 포함하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 과혈당을 유발하는 다른 상태를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서, 치료상 유효량의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 신속한 작용의 개시를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 당뇨병을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서 폐 투여를 위해 의도된 본 발명에 따른 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서, 제 1 항에 따른 치료상 유효량의 아실화된 인슐린 유사체를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 당뇨병의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서, 제 1 항에 따른 치료상 유효량의 아실화된 인슐린 유사체를 신속한 작용 개시를 갖는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 당뇨병의 치료 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 사람 인슐린에 비하여 >3%, 보다 바람직하게는 >5%, 보다 바람직하게는 >10%, 보다 바람직하게는 >15%, 보다 바람직하게는 >20%, 보다 바람직하게는 >30%, 보다 바람직하게는 >40%, 보다 바람직하게는 >50%, 보다 바람직하게는 >60% 측정된, HSA의 존재(예컨대 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4% 또는 4.5% HSA의 존재)하에 측정된 본원에 설명된 바와 같은 인슐린 수용체 결합 친화성을 갖는 본 발명의 아실화된 인슐린에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 사람 인슐린과 본질적으로 유사한 전체 소수성을 갖는 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 약 0.02 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 5; 약 0.5 내지 약 5; 약 0.2 내지 약 2; 약 0.2 내지 약 1; 약 0.1 내지 약 2; 또는 약 0.5 내지 약 2 범위 내의 소수성 지수, k'_rel를 갖는다. 사람 인슐린에 대한 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 소수성(소수성 지수), k'_rel은, 등용매 용리에 의해 40℃에서 용리액으로서 A) 10% 아세토니트릴을 함유하는 0.1M 인산나트륨 완충제, pH 7.3 및 B) 수중 50% 아세토니트릴의 혼합물을 사용하여 LiChrosorb RP18 (5μm, 250x4 mm) HPLC 컬럼에서 측정하였다. 214 nm에서 용출액의 UV 흡수에 따라 용리를 모니터하였다. 0.1 mM 질산나트륨을 주입하여 보이드(void) 시간, t₀을 발견하였다. A와 B 용액 사이의 비를 변화시킴으로써 사람 인슐린에 대한 지연 시간, t_사람을 적어도 2t₀로 조정하였다. k'_rel= (t_유도체-t0)/(t_사람-t0).

또 다른 양태에서, 본 발명은 생리학적 pH 값에서 가용성인 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약 6.5 내지 약 8.5 사이의 pH 값에서 가용성인 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 포함하는 연장된 작용 프로파일을 갖는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 간선택적(hepatoselective) 또는 간우선적(hepatopreferential) 작용을 갖는 인슐린에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약 120 nmol/ml 내지 약 2400 nmol/ml, 약 400 nmol/ml 내지 약 2400 nmol/ml, 약 400 nmol/ml 내지 약 1200 nmol/ml, 약 600 nmol/ml 내지 약 2400 nmol/ml, 또는 약 600 nmol/ml 내지 약 1200 nmol/ml의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체 또는 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 혼합물을 속효성 인슐린 유사체와 함께 함유하는 용액인, 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화합물의 사용

투여 경로는 본 발명의 화합물을 원하는 또는 적절한 신체 부위로 효과적으로 전달하는 비경구, 예컨대 피하, 근육내 또는 정맥내와 같은 임의의 경로가 될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 화합물은 경구, 폐 또는 비강으로 투여할 수 있다.

비경구 투여를 위해서, 본 발명의 화합물은 알려진 인슐린의 제형과 유사하게 제형화된다. 또한, 비경구 투여를 위해서, 본 발명의 화합물은 알려진 인슐린의 투여와 유사하게 투여되며 의사들은 이 과정에 능숙하다.

비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜형 주사기를 사용하여 행할 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 인퓨전 펌프를 사용하여 행할 수 있다.

본 발명의 화합물의 주사가능 조성물은 원하는 최종 산물을 제공하기 위한 성분들을 적절하게 용해 및 혼합하는 것을 포함하는 약학 산업의 종래 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 따라서, 한 과정에 따르면 본 발명의 화합물을 제조될 조성물의 최종 부피보다 다소 적은 양의 물에 용해한다. 등장화제, 보존제 및 완충제를 필요에 따라 첨가하고 용액의 pH값을 -필요에 따라- 산, 예컨대 염산 또는 염기, 예컨대 수성 수산화나트륨을 필요한 만큼 사용하여 조정한다. 최종적으로, 용액의 부피를 물로 조정하여 원하는 농도의 성분을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 인슐린 제조물, 예컨대 용액 또는 현탁액은 본 발명의 화합물을 수성 매체에 약간의 산성 조건에서 예컨대 약 240 내지 약 1200 nmole/ml 범위 농도로 용해하여 제조할 수 있다. 수성 매체는 예컨대 염화나트륨 또는 글리세롤을 가지고 등장성으로 만들어 진다. 또한, 수성 매체는 인슐린 활성 단위 당 최대 약 20 μg Zn⁺⁺의 농도의 아연 이온, 아세테이트 및 시트레이트와 같은 완충제 및 m-크레졸 및 페놀과 같은 보존제를 함유할 수 있다. 용액의 pH값은 침전을 피하기 위해서 본 발명의 화합물의 등전위점에 너무 근접하게 하지 않고 중성으로 조정한다. 최종 인슐린 제조물의 pH값은 본 발명의 화합물에서 선택적으로 변화하는 전하의 수, 아연 이온의 농도, 본 발명의 화합물의 농도 및 선택한 본 발명의 화합물에 의존한다. 인슐린 제조물은 예컨대 멸균 여과에 의해 여과된다.

본 발명의 인슐린 제조물은 공지된 인슐린 제조물의 사용과 유사하게 사용된다.

투여되는 본 발명의 화합물의 양, 본 발명의 화합물을 투여하는 빈도 결정 및 선택적으로 다른 항당뇨병 화합물과 함께 투여하기 위한 본 발명의 화합물 또는 화합물들의 선택은 당뇨병 치료에 능숙한 의사와 상담하여 결정한다.

그러므로, 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 화합물을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 치료방법에 관한 것이다.

약학적 조성물

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 피하, 경구 또는 폐로 투여될 수 있다.

피하 투여를 위해, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 공지된 인슐린의 제형과 유사하게 제형화될 수 있다. 추가로, 피하 투여를 위해, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 공지된 인슐린의 투여와 유사하게 투여되고, 일반적으로 임상의는 이 과정에 능숙하다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 순환하는 인슐린 수준을 증가시키고 및/또는 순환하는 글루코오스 수준을 낮추는데 효과적인 용량 방법으로 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여는 당뇨병 또는 고혈당증과 같은 장애를 치료하는데 효과적일 수 있다. 효과적인 인슐린 용량을 얻는 것은 약 0.5 μg/kg 내지 약 50 μg/kg 범위 내의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 흡입 용량의 투여를 요구한다. 치료상 유효량은 전문의에 의해 결정될 수 있으며, 인슐린 수준, 혈중 글루코스 수준, 환자의 신체 상태, 환자의 폐 상태 등을 포함하는 평가 인자를 고려할 것이다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 흡입에 의해 송달되어 그것의 느린 흡수 및/또는 감소된 전신 클리어런스를 달성할 수 있다. 다른 흡입 장치는 통상적으로 유사한 입자 크기 및 유사한 수준의 폐 침착과 비교했을 때 유사한 약물동력학을 제공한다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 흡입에 의한 치료제의 투여를 위해 당업계에서 공지된 어떤 다양한 흡입 장치로 송달될 수 있다. 이들 장치는 용량 흡입기, 네뷸라이져, 건조 분말 발생기, 스프레이어 등을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 건조 분말 흡입기 또는 스프레이어로 송달된다. 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 투여하기 위한 흡입 장치의 몇 가지의 바람직한 특징들이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 송달은 유리하게 믿을 수 있고, 재생가능하고 정확하다. 흡입 장치는 우수한 호흡 적합성을 위해 예를 들어 약 10 μm 이하, 예를 들어 약 1-5 μm의 소입자 또는 에어로졸을 송달해야 한다. 본 발명의 실행에 적당한 상업적으로 이용가능한 흡입 장치의 일부 구체예는 Cyclohaler, Turbohaler^TM (Astra), Rotahaler^® (Glaxo), Diskus^® (Glaxo), Spiros^TM 흡입기(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 판매되는 장치, AERx^TM (Aradigm), Ultravent^® 네뷸라이져 (Mallinckrodt), Acorn II^® 네뷸라이져 (Marquest Medical Products), Ventolin^® 정량 흡입기 (Glaxo), Spinhaler^® 분말 흡입기(Fisons) 등이다.

당업자에게 인식되는 것과 같이, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 제형, 송달할 제제의 양 및 단일 용량 투여의 지속기간은 사용하는 흡입 장치의 종류에 의존한다. 네뷸라이져와 같은 일부 에어로졸 송달 시스템을 위해, 투여 빈도 및 시스템이 활성화되는 시간의 길이는 에어로졸 내 아실화된 인슐린 유사체의 농도에 주로 의존할 것이다. 예를 들어, 더 짧은 투여 기간이 네뷸라이져 용액 중의 아실화된 인슐린 유사체의 더 높은 농도에서 사용될 수 있다. 정량 흡입기와 같은 장치는 더 높은 에어로졸 농도를 생성할 수 있고, 원하는 양의 본 발명의 아실화된 인슐린 유도체를 송달하기 위해 더 짧은 기간 동안 작동될 수 있다. 분말 흡입기와 같은 장치는 주어진 제제의 투입량이 장치로부터 배출될 때까지 활성 제제를 송달한다. 이런 형태의 흡입기에서, 주어진 분말의 양 중의 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 양은 단일 투여로 송달되는 용량을 결정한다.

흡입 장치로 송달되는 제형에서 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 입자 크기는 인슐린을 폐, 바람직하게는 하부 기도 또는 폐포로 들어가게 하는 능력과 관련하여 중요하다. 바람직하게는, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 송달되는 아실화된 인슐린 유사체의 적어도 약 10%, 바람직하게는 약 10 내지 약 20% 이상이 폐에 침착되도록 제형화된다. 흡입에 의해 송달되는 아실화된 인슐린 유사체의 입자는 바람직하게는 약 10 μm 이하, 보다 바람직하게는 약 1μm 내지 약 5 μm의 범위로 입자 크기를 갖는다. 아실화된 인슐린 유사체의 제형은 선택한 흡입 장치에서 원하는 입자 크기를 산출하도록 선택된다.

건조 분말로서 투여를 위해 유리하게는, 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 내지 약 5μm의 입자 크기를 갖는 미립자 형태로 제조된다. 바람직한 입자 크기는 환자 폐의 폐포에 대한 송달에 효과적이다. 바람직하게는, 건조 분말은 대부분의 입자가 원하는 범위 내 크기를 가지도록 생성된 입자로 주로 구성된다. 유리하게는, 건조분말의 적어도 약 50%는 약 10μm 미만의 직경을 갖는 입자들로 이루어진다. 이러한 제형은 스프레이 건조, 분쇄, 미세화 또는 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체 및 기타 원하는 성분을 함유하는 용액의 임계점 응축으로 달성될 수 있다. 또한 본 발명에 유용한 입자들을 발생시키는데 적합한 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다.

입자들은 보통 용기에서 건조 분말 제형으로부터 분리될 수 있고 그 후 담체 기류를 통해 환자의 폐로 전달된다. 통상적으로, 현재의 건조 분말 흡입기에서, 고체를 분쇄하기 위한 힘은 오로지 환자의 흡입에 의해 제공된다. 다른 형태의 흡입기에서, 환자의 흡입에 의해 발생된 공기 흐름은 입자를 분쇄하는 임펠러 모터를 활성한다.

건조 분말 흡입기로부터 투여를 위한 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 제형은 통상적으로 유도체를 함유하는 미세하게 분리된 건조 분말을 포함하지만, 분말은 또한 공극개량제(bulking agent), 담체, 부형제, 기타 첨가제 등을 포함할 수 있다. 첨가제는, 예를 들어 특정 분말 흡입기로부터 송달을 위해 요구되는 분말을 희석시키는 것, 제형화의 과정을 용이하게 하는 것, 제형에 유리한 분말 특성을 제공하는 것, 흡입 장치로부터 분말의 분산을 용이하게 하는 것, 제형을 안정화시키는 것(예를 들어, 산화방지제 또는 완충제), 제형에 맛을 제공하는 것 등을 위해 아실화된 인슐린 유사체의 건조 분말 제형에 포함될 수 있다. 유리하게는, 첨가제는 환자의 기도에 불리하게 영향을 미치지 않는다. 아실화된 인슐린 유사체는 분자 수준에서 첨가제와 함께 혼합될 수 있거나 또는 고체 제형은 첨가제의 입자와 함께 혼합되거나 코팅된 아실화된 인슐린 유사체의 입자들을 포함할 수 있다. 전형적인 첨가제는 단당류, 이당류 및 다당류; 당 알콜 및 기타 폴리올, 예로써, 락토스, 글루코스, 라피노스, 멜레지토스, 락티톨, 말티톨, 트레할로스, 수크로스, 만니톨, 전분 또는 이들의 조합; 계면활성제, 예로써, 소르비톨, 디포스파티딜 콜린, 또는 레시틴 등을 포함한다. 통상적으로 공극개량제와 같은 첨가제는 종종 제형의 약 50중량% 내지 약 90중량%에서 상기 기재된 목적에 유효한 양으로 존재한다. 인슐린 유사체 단백질과 같은 단백질의 제형을 위한 당업계에 공지된 추가 제제가 또한 제형에 포함될 수 있다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 포함하는 스프레이는 압력하에서 노즐을 통해 아실화된 인슐린 유사체의 현탁액 또는 용액에 힘을 가함으로써 제조될 수 있다. 노즐 크기 및 원심분리, 가해지는 압력 및 액체 공급속도는 원하는 출력 및 입자 크기를 얻도록 선택될 수 있다. 전기분무는, 예를 들어 모세관 또는 노즐 공급과 연결되는 전기장에 의해 생성될 수 있다. 유리하게는, 스프레이어로 송달되는 인슐린 접합체의 입자들은 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1μm 내지 약 5 μm의 범위의 입자 크기를 갖는다.

스프레이어와 함께 사용하는데 적당한 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 제형은 통상적으로 용액의 ml 당 아실화된 인슐린 유사체 약 1 mg 내지 약 500 mg의 농도로 수용액에 아실화된 인슐린 유사체를 포함할 것이다. 선택한 아실화된 인슐린 유사체 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자에 따라 상한은 예컨대 용액의 ml 당 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100 또는 50mg의 아실화된 인슐린 유사체로 낮아질 수 있다. 제형은 부형제, 완충제, 등장제, 보존제, 계면활성제 및 바람직하게는 아연과 같은 제제를 포함할 수 있다. 제형은 또한 완충제, 환원제, 벌크 단백질 또는 탄수화물과 같은 아실화된 인슐린 유사체의 안정화를 위한 부형제 또는 제제를 포함할 수 있다. 인슐린 접합체를 제형화하는데 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 아실화된 인슐린 유사체를 제형화하는데 유용한 통상적인 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 아실화된 인슐린 유사체 제형은 또한 계면활성제를 포함할 수 있는데, 이는 에어로졸을 형성함에 있어 용액의 원자화에 의해 초래되는 인슐린 접합체의 표면-유도 응집을 감소 또는 예방할 수 있다. 다양한 통상적인 계면활성제는, 예로써, 폴리에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제제의 약 0.001 내지 약 4중량%의 범위에 있을 것이다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 함유하는 약학적 조성물은 또한 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜형 주사기에 의해 피하, 근육내, 또는 정맥 주사로 행할 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 인퓨전 펌프를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 주사가능 조성물은 원하는 최종 산물을 제공하기 위해 성분들을 적절하게 용해 및 혼합하는 것을 포함하는 약학 산업의 종래 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 따라서, 한 과정에 따르면 아실화된 인슐린 유도체를 제조될 조성물의 최종 부피보다 다소 적은 양의 물에 용해한다. 아연, 등장화제, 보존제 및/또는 완충제를 필요에 따라 첨가하고 용액의 pH값을 -필요에 따라- 산, 예컨대 염산 또는 염기, 예컨대 수성 수산화나트륨을 필요한 만큼 사용하여 조정한다. 최종적으로, 용액의 부피를 물로 조정하여 원하는 농도의 성분을 제공한다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 완충제는 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산 2수소 나트륨, 인산수소 2나트륨, 인산 나트륨 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 비신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이들 특정 완충제의 각각은 본 발명의 대안적 실시형태를 구성한다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 제제는 추가로 약학적으로 허용가능한 보존제를 포함하며, 이는 페놀, o-크레솔, m-크레솔, p-크레솔, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드우레아, 클로로헥시딘, 데히드로아세테이트나트륨, 클로로크레솔, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 염화벤제토늄, 클로로페네신 3-(4-클로로페녹시)-1,2-프로판디올 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 보존제는 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 보존제는 약 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 보존제는 약 5 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 보존제는 약 10 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 이러한 특정 보존제 각각은 본 발명의 대안적 실시형태를 구성한다. 약학적 조성물에서 보존제의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995을 참조한다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 제제는 추가로 염 (예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알콜, 아미노산(예를 들어, 글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어, 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 또는 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG400), 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있는 등장화제를 포함한다. 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 어떤 당, 또는 예를 들어, 프룩토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na을 포함하는 수용성 글루칸이 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 당 첨가제는 수크로스이다. 당 알콜은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아리비톨을 포함한다. 한 실시형태에서, 당 알콜 첨가제는 만니톨이다. 상기 언급된 당 또는 당 알콜은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알콜이 액체 제조물에서 가용성이고 본 발명의 방법을 사용하여 달성되는 안정화 효과에 역효과를 미치지 않는다면 사용되는 양에 고정된 제한은 없다. 한 실시형태에서, 당 또는 당 알콜 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml이다. 본 발명의 추가 실시형태에서, 등장화제는 약 1 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 등장화제는 약 1 mg/ml 내지 7 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 등장화제는 약 8 mg/ml 내지 24 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 등장화제는 약 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 이러한 특정 등장화제 각각은 본 발명의 대안적 실시형태를 구성한다. 약학적 조성물에서 등장화제의 사용은 당업자에게 공지되어 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995를 참고한다.

전형적인 등장화제는 염화나트륨, 만니톨, 디메틸 술폰 및 글리세롤이고, 전형적인 보존제는 페놀, m-크레솔, 메틸 p-히드록시벤조에이트 및 벤질 알콜이다.

적합한 완충제의 예는 아세트산나트륨, 글리실글리신, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) 및 인산나트륨이다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 비강 투여를 위한 조성물은 예를 들어, 유럽 특허 No. 272097에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체를 함유하는 조성물은 인슐린에 민감한 상태의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 이들은 예를 들어 때때로 심각하게 다친 사람 및 주로 외과적 수술을 받은 사람들에서 보이는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고혈당증의 치료에 사용될 수 있다. 어떤 환자의 최적의 용량 수준은 사용되는 특정 인슐린 유도체의 효능, 연령, 체중, 신체 활동 및 환자의 식단, 다른 약물과의 조합가능성, 치료할 상태의 심각성을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 일일 투약량은 공지된 인슐린 조성물과 유사한 방식으로 당업자에 의해 각 개별 환자에 대하여 결정하는 것이 권고된다.

본 발명의 중요한 특징

요약하여, 본 발명의 일부 특징은 다음과 같다:

1. A21 아미노산 잔기에 C 말단으로 연결된 리신 잔기, 또는 리신 잔기를 포함하는 최대 4개 아미노산 잔기의, A21 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 펩티드 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체에 있어서, 알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 아실 부분이 A22 위치에서 리신 잔기에 부착되거나, 또는 A21 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 부착된 펩티드 잔기에 존재하는 리신 잔기에 부착되고, 이때 인슐린 유사체에 오직 하나의 리신(K, Lys)이 존재하는 아실화된 인슐린 유사체.

2. 1항목에 있어서, 아실 부분이 일반식 I을 갖는 아실화된 인슐린 유사체.

Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- (I),

상기 식에서

n은 0 또는 1-3 범위 내의 정수이고,

m은 0 또는 1-6 범위 내의 정수이고,

p는 1, 2 또는 3이고,

Acy는 공식적으로는 지방산의 카르복시기 또는 지방 이산의 카르복시기 중 하나로부터 히드록시기가 제거된 약 8-24개 탄소 원자를 포함하는 지방산 또는 지방 이산이고,

AA1는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 중성 환상 아미노산이고,

AA2는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 산성 아미노산이고,

AA3는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 중성, 알킬렌글리콜-함유 아미노산이고,

식에 나타나 있는 AA1, AA2 및 AA3의 순서는 독립적으로 교환될 수 있고,

Acy, AA1, AA2 및/또는 AA3 사이의 연결은 아미드 (펩티드) 결합이고,

모 인슐린에 대한 부착은 식 (I)의 아실 부분 중의 AA1, AA2 또는 AA3 잔기의 C-말단 끝으로부터 또는 식 (I)의 부분에 존재하는 AA2 잔기의 측쇄(들) 중 하나로부터 일 수 있다.

3. A21 아미노산 잔기에 C 말단으로 연결된 리신 잔기, 또는 리신 잔기를 포함하는 최대 4개 아미노산 잔기의, A21 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 펩티드 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체에 있어서, 알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 아실 부분은 A22 위치에서 리신 잔기에 부착되거나, 또는 A21 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 부착된 펩티드 잔기에 존재하는 리신 잔기에 부착되고, 이때 인슐린 유사체에 오직 하나의 리신(K, Lys)이 존재하고, 알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 아실 잔기는 일반식 I: Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- (I)을 갖고, 상기 식에서 n은 0 또는 1-3 범위 내의 정수이고, m은 0 또는 1-6 범위 내의 정수이고, p는 1, 2 또는 3이고, Acy는 공식적으로는 지방산의 카르복시기 또는 지방 이산의 카르복시기 중 하나로부터 히드록시기가 제거된 약 8-24개 탄소 원자를 포함하는 지방산 또는 지방 이산이고, AA1는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 중성 환상 아미노산이고, AA2는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 산성 아미노산이고, AA3는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 중성, 알킬렌글리콜-함유 아미노산이고, AA1, AA2 및 AA3가 식에 나타난 순서는 독립적으로 교환될 수 있고, Acy, AA1, AA2 및/또는 AA3 사이의 연결은 아미드 (펩티드) 결합이고, 모 인슐린에 대한 부착은 식 (I)의 아실 부분 중의 AA1, AA2 또는 AA3 잔기의 C-말단 끝으로부터 또는 식 (I)의 부분에 존재하는 AA2 잔기의 측쇄(들) 중 하나로부터 일 수 있는, 아실화된 인슐린 유사체.

4. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy는 14 내지 20개 탄소 원자, 바람직하게는 16 내지 20개 탄소원자, 보다 바람직하게는 16 내지 18개 탄소 원자, 대안적으로 18 내지 20개 탄소 원자, 구체적으로 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 20, 22 또는 24개 탄소 원자를 갖는 지방산 또는 지방 이산으로부터 기원한 아실화된 인슐린 유사체.

5. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy는 디카르복실산으로부터 기원한 아실화된 인슐린 유사체.

6. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy는 히드록시기가 제거된 테트라데칸디온산, 펜타데칸디온산, 헥사데칸디온산, 헵타데칸디온산, 옥타데칸디온산 또는 에이코산디온산인 아실화된 인슐린 유사체.

7. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy는 히드록시기가 제거된 헥사데칸디온산, 옥타데칸디온산 또는 에이코산디온산인 아실화된 인슐린 유사체.

8. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, AA1은

으로부터 선택되고,

상기 식에서 q는 0, 1, 2, 3 또는 4이고, 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 아실화된 인슐린 유사체.

9. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, AA1은

이고, 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 아실화된 인슐린 유사체.

10. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, AA2은 Glu, Asp, D-Glu, D-Asp, γGlu, γAsp, γ-D-Glu, γ-D-Asp 또는 하기 화합물 중 어느 것에서 선택되고,

상기 식에서 화살표는 AA1, AA2 또는 AA3의 아미노기에 대한 부착점이고, 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 아실화된 인슐린 유사체.

11. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, AA2는 γGlu인 아실화된 인슐린 유사체.

12. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, AA3은 하기 화합물 중 어느 것으로부터 선택되고,

r은 1-100, 바람직하게는 1-10 범위 내의 정수이고,

s는 1-30, 바람직하게는 1-10 범위 내의 정수이고,

t는 1-150, 바람직하게는 20-70 범위 내의 정수이고,

공식적으로는 수소 원자가 아미노기로부터 제거되고 히드록시기가 카르복시기로부터 제거된 아실화된 인슐린 유사체.

13. 선행하는 항목에 있어서, r은 1, 2, 3, 4, 5, 7, 11, 23 또는 27인 아실화된 인슐린 유사체.

14. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, s는 1, 2, 3, 4, 10, 20 또는 30인 아실화된 인슐린 유사체.

15. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 정수 t는 정수 t가 나타나 있는 상기 식의 평균 분자량이 2000 Da, 3400 Da 또는 5000 Da이도록 선택된 아실화된 인슐린 유사체.

16. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p가 상기와 같이 정의된 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 아실 부분이 위치 A22에서 리신 잔기에 연결된 아실화된 인슐린 유사체.

17. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p가 상기와 같이 정의된 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 아실 부분이 위치 A23에서 리신 잔기에 연결된 아실화된 인슐린 유사체.

18. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p가 상기 정의된 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 아실 부분이 위치 A24에서 리신 잔기에 연결된 아실화된 인슐린 유사체.

19. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, Acy, AA1, AA2, AA3, n, m 및 p가 상기 정의된 바와 같은 식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 아실 부분이 위치 A25에서 리신 잔기에 연결된 아실화된 인슐린 유사체.

20. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체가 52개 아미노산 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체.

21. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체가 51개 아미노산 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체.

22. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체가 53개 아미노산 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체.

23. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체가 54개 아미노산 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체.

24. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체가 50개 아미노산 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체.

25. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체가 49개 아미노산 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체.

26. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 위치 A1-A21 및 B1-B30 내의 아미노산 잔기 중 오직 하나가 사람 인슐린에 존재하는 아미노산 잔기로부터 벗어난 아실화된 인슐린 유사체.

27. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 위치 A1-A21 및 B1-B30 내의 아미노산 잔기 중 오직 두개가 사람 인슐린에 존재하는 아미노산 잔기로부터 벗어난 아실화된 인슐린 유사체.

28. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 위치 A1-A21 및 B1-B30 내의 아미노산 잔기 중 오직 세개가 사람 인슐린에 존재하는 아미노산 잔기로부터 벗어난 아실화된 인슐린 유사체.

29. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 위치 A1-A21 및 B1-B30 내의 아미노산 잔기 중 오직 네개가 사람 인슐린에 존재하는 아미노산 잔기로부터 벗어난 아실화된 인슐린 유사체.

30. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 위치 A1 또는 B1에 존재하는 아미노산 잔기의 N 말단 끝에 연결된 아미노산 잔기 및 위치 B30에 존재하는 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 연결된 아미노산 잔기가 존재하지 않는 아실화된 인슐린 유사체.

31. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A14 위치 내의 아미노산 잔기는 E인 아실화된 인슐린 유사체.

32. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A18 위치 내의 아미노산 잔기는 Q인 아실화된 인슐린 유사체.

33. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A21 위치 내의 아미노산 잔기는 A, G 또는 Q인 아실화된 인슐린 유사체.

34. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A22 위치 내의 아미노산 잔기는 K 또는 G인 아실화된 인슐린 유사체.

35. 선행하는 항목에 있어서, 인슐린 유사체의 A22 위치 내의 아미노산 잔기는 K인 아실화된 인슐린 유사체.

36. 선행하는 항목에 있어서, 인슐린 유사체의 A22 위치 내의 아미노산 잔기는 K이고 상기 A22K 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 연결된 아미노산 잔기가 존재하지 않는 아실화된 인슐린 유사체.

37. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A23 위치 내의 아미노산 잔기는 K 또는 G인 아실화된 인슐린 유사체.

38. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A24 위치 내의 아미노산 잔기는 K 또는 G인 아실화된 인슐린 유사체.

39. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A25 위치 내의 아미노산 잔기는 K인 아실화된 인슐린 유사체.

40. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B1 위치 내의 아미노산 잔기는 Q이거나 부재인 아실화된 인슐린 유사체.

41. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B3 위치 내의 아미노산 잔기는 Q 또는 T인 아실화된 인슐린 유사체.

42. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B13 위치 내의 아미노산 잔기는 Q인 아실화된 인슐린 유사체.

43. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B25 위치 내의 아미노산 잔기는 H인 아실화된 인슐린 유사체.

44. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B27 위치 내의 아미노산 잔기는 부재인 아실화된 인슐린 유사체.

45. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B28 위치 내의 아미노산 잔기는 D, E 또는 R인 아실화된 인슐린 유사체.

46. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, B28 위치 내의 아미노산 잔기는 R이고 B29 위치 내의 아미노산 잔기는 P인 아실화된 인슐린 유사체.

47. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B29 위치 내의 아미노산 잔기는 R인 아실화된 인슐린 유사체.

48. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 B30 위치 내의 아미노산 잔기는 부재인 아실화된 인슐린 유사체.

49. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체의 A14 위치 내의 아미노산 잔기는 Y 또는 E이고, 인슐린 유사체의 A18 위치 내의 아미노산 잔기는 N 또는 Q이고, 인슐린 유사체의 A21 위치 내의 아미노산 잔기는 N, A, G 또는 Q이고, 인슐린 유사체의 A22 위치 내의 아미노산 잔기는 K 또는 G이고, 인슐린 유사체의 A23 위치 내의 아미노산 잔기는 K 또는 G이고, 인슐린 유사체의 A24 위치 내의 아미노산 잔기는 K 또는 G이고, 인슐린 유사체의 A25 위치 내의 아미노산 잔기는 부재이거나 K이고, 인슐린 유사체의 B1 위치 내의 아미노산 잔기는 F, Q 또는 부재이고, 인슐린 유사체의 B3 위치 내의 아미노산 잔기는 N, Q 또는 T이고, 인슐린 유사체의 B13 위치 내의 아미노산 잔기는 E 또는 Q이고, 인슐린 유사체의 B25 위치 내의 아미노산 잔기는 F 또는 H이고, 인슐린 유사체의 B27 위치 내의 아미노산 잔기는 T 또는 부재이고, 인슐린 유사체의 B28 위치 내의 아미노산 잔기는 P, D, E 또는 R이고, 인슐린 유사체의 B29 위치 내의 아미노산 잔기는 K 또는 R이고, 인슐린 유사체의 B30 위치 내의 아미노산 잔기는 T 또는 부재인 아실화된 인슐린 유사체.

50. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 유사체 내의 모든 아미노산 잔기는 암호화 가능한 아미노산의 잔기인 아실화된 인슐린 유사체.

51. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, AA2는 gGlu인 아실화된 인슐린 유사체.

52. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 일반식 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-의 아실 부분은 일반식 Acy-AA3-, Acy-AA2-AA3-, Acy-AA2-AA3-AA2-, Acy-AA2-(AA3)₂-, Acy-AA2-(AA3)₂-AA2 또는 Acy-AA3-AA2- 중 하나를 갖고, Acy, AA2 및 AA3 각각은 본원에 정의된 바와 같은 아실화된 인슐린 유사체.

53. 선행하는 가능한 항목 중 어느 하나에 있어서, 본원에 구체적으로 언급된 화합물, 예컨대 본원의 특정 실시예에 설명된 화합물 중 어느 하나인 아실화된 인슐린 유사체.

54. 의약품으로서 사용하기 위한 또는 의약품에서 사용하기 위한 선행하는 가능한 산물 항목 중 어느 하나에 따른 화합물.

55. 당뇨병을 치료하기 위한 선행하는 가능한 산물 항목 중 어느 하나에 따른 화합물, 또는 당뇨병의 치료를 위한 의약품의 제조를 위한 선행하는 가능한 산물 청구항 중 어느 하나에 다른 화합물의 사용.

56. 선행하는 가능한 산물 항목 중 어느 하나에 따른 치료상 유효량의 화합물을 그것을 필요로 하는 피험체에 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료방법.

57. 본원에 설명된 어떤 신규한 특징 또는 특징들의 조합.

선택적으로 하기 청구항 중 하나 이상 및 본원에 언급된 항목 중 하나 이상과 함께 본원에 설명된 실시형태 중 하나 이상의 조합은, 또 다른 실시형태를 형성하며 본 발명은 상기 실시형태, 항목 및 청구항의 모든 가능한 조합에 관한다.

본원에 인용된 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 그들 전체로, 그리고 각 참고문헌이 참고로 포함되도록 개별적이고 구체적으로 나타내어지고 본원에 그 전체로 설명된 것과 동일한 정도로 본원에 포함된다(법에 의해 허용되는 최대 정도로).

본원에서 모든 제목 및 소제목은 단지 편의상 사용된 것이고 본 발명을 어떤 방식으로 제한하도록 구성되어서는 안된다.

본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적 언어(예컨대 "와 같은")의 사용은 본 발명은 더 잘 설명하기 위해서 의도된 것이며 달리 청구하지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 본 명세서 내의 언어는 본 발명의 수행에 필수적인 비청구된 요소를 나타내도록 구성되어서는 안된다.

본원에서 특허 문헌의 인용 및 포함은 단지 편의상 행하였고 이러한 특허 문헌의 어떤 유효성, 특허성 및/또는 집행성의 관점을 반영하는 것은 아니다. 본원에서 참조문헌의 언급은 종래 기술을 구성하는 것으로 허용되지 않는다.

본원에서, 단어 "포함"은 의미 "포괄", "함유" 또는 "내포"로 폭넓게 해석된다(EPO 가이드 라인 C 4.13).

본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구항에 언급된 해당 내용의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.

하기 실시예는 설명으로서 제공된 것이고 제한하는 것은 아니다.

실시예

일반 과정:

발현 벡터의 구성, 효모 세포의 형질전환 및 본 발명의 인슐린 전구체의 발현

모든 발현 플라스미드는 EP 171142에 설명된 것과 유사하게 C-POT 형태이며, 이것은 플라스미드 선택 및 S. cerevisiae에서의 안정화를 목적으로 Schizosaccharomyces pombe 트리오스 포스페이트 이소메라제 유전자(POT)를 함유하는 것을 특징으로 한다. 플라스미드는 또한 S. cerevisiae 트리오스 포스페이트 이소메라제 프로모터 및 터미네이터를 함유한다. 이들 서열은 리더의 융합 단백질 및 인슐린 산물을 암호화하는 EcoRI-XbaI 단편의 서열을 제외하고, 모든 서열이 플라스미드 pKFN1003 내의 해당 서열(WO 90/10075에 설명됨)과 유사하다. 상이한 융합 단백질을 발현하기 위해서, pKFN1003의 EcoRI-XbaI는 해당 리더-인슐린 융합 단백질을 암호화하는 EcoRI-XbaI 단편에 의해 간단히 대체된다. 이러한 EcoRI-XbaI 단편은 합성 올리고뉴클레오티드 및 표준 기술에 따른 PCR을 사용하여 합성할 수 있다.

효모 형질전환체는 숙주 균주 S. cerevisiae 균주 MT663 (MATalMATα pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir⁺)의 형질전환에 의해 제조되었다. 효모 균주 MT663를 WO 92/11378 출원과 관련하여 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen에 기탁하였고 기탁 번호 DSM 6278를 받았다.

MT663를 YPGaL (1% Bacto 효모 추출물, 2% Bacto 펩톤, 2% 갈락토스, 1% 락테이트) 상에서 600nm에서 0.6의 O.D.로 성장시켰다. 100ml 배양물을 원심분리에 의해 수확하고, 10ml 물로 세정하고, 재원심분리하고, 1.2M 소르비톨, 25mM Na₂EDTA pH = 8.0 및 6.7 mg/ml 디티오트레이톨을 함유하는 10 ml 용액에 재현탁하였다. 현탁물을 30℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 원심분리하고, 세포를 1.2 M 소르비톨, 10 mM Na₂EDTA, 0.1 M 시트르산나트륨, pH O 5.8, 및 2 mg Novozym^®234을 함유하는 10ml 용액에 재현탁하였다. 현탁물을 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 세포를 원심분리에 의해 수집하고 10 ml의 1.2 M 소르비톨 및 10 ml의 CAS (1.2 M 소르비톨, 1 O mM CaCl₂, 1O mM Tris HCl (pH = 7.5)로 세정하고 2 ml의 CAS에 재현탁하였다. 형질전환을 위해서, 1 ml CAS-현탁 세포를 약 0.1 mg의 플라스미드 DNA와 혼합하고 실온에서 15분간 방치하였다. 1 ml의 (20% 폴리에틸렌 글리콜 4000, 10 mM CaCl₂, 10 mM Tris HCl, pH = 7.5)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 더 방치하였다. 혼합물을 원심분리하고 펠릿을 0.1 ml의 SOS (1.2 M 소르비톨, 33% v/v YPD, 6.7 mM CaCl₂)에 재현탁하고 30℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 현탁물을 원심분리하고 펠릿을 0.5 ml의 1.2 M 소르비톨에 재현탁하였다. 그 다음, 1.2 M 소르비톨 플러스 2.5% 한천을 함유하는 6 ml 상단 한천(top agar) (Sherman et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory의 SC 배지)를 52℃에서 첨가하고 현탁물을 동일한 한천-고체화된, 소르비톨 함유 배지를 함유하는 플레이트의 상단에 부었다. 발현 플라스미드로 형질전환된 S. cerevisiae 균주 MT663는 YPD에서 72시간 동안 30℃에서 성장하였다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 제조, 정제 및 특징화

하기 실시예는 본 명세서 및 실시예에서 확인되는 중간체 화합물 및 최종 산물을 언급한다. 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 제조는 하기 실시예를 사용하여 상세히 설명되지만, 설명된 화학 반응 및 정제 도식은 본 발명의 인슐린 유도체의 제조에 일반적인 적용성의 관점에서 개시된다. 경우에 따라, 반응은 본 발명의 개시 범위 내에 포함되는 각 화합물에 설명한 대로 적용가능하지 않을 수 있다. 이것이 발생하는 화합물은 당업자에게 인식될 것이다. 이들 경우, 반응은 당업자에게 알려진 종래의 변형, 즉 적절한 방해기의 보호, 다른 종래 시약의 변화 또는 반응 조건의 통상의 변형에 의해 성공적으로 행해질 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시되거나 다른 종래의 반응은 본 발명의 해당 화합물의 제조에 적용가능할 것이다. 모든 제조방법에서, 모든 출발 물질은 공지되어 있거나 공지된 방법을 사용하여 공지된 출발 물질로부터 용이하게 제조할 수 있다. 모든 온도는 섭씨로 설명되며, 달리 설명하지 않는 한 모든 부 및 퍼센트는 수율을 말하는 경우 중량기준이며, 모든 부는 용매 및 용리액을 말하는 경우 부피기준이다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체는 기술분야에서 통상적인 하기 과정 중 하나 이상을 사용하여 정제될 수 있다. 이들 과정은 - 필요에 따라 - 구배, pH, 염, 농도, 흐름, 컬럼 등에 관하여 변형될 수 있다. 해당 인슐린의 불순물 프로파일, 용해도 등과 같은 인자에 따라, 이들 변형은 당업자에 의해 용이하게 인식되고 이루어질 수 있다.

일반식 (II)의 아실화 시약의 고체상 합성을 위한 일반 과정:

(II): Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-Act,

상기 식에서 Acy, AA1, AA2, AA3, n, m, 및 p는 상기 정의된 바와 같고 Act는 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미드(OSu), 또는 1-히드록시벤조트리아졸, 에스테르의 이탈기이고, 여기서 아실 부분 내의 카르복실산은 tert-부틸 에스테르로서 보호된다.

본 발명에 따른 일반식 (II)의 화합물은 고체상 펩티드 합성 분야의 당업자에게 잘 알려진 과정을 사용하여 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 이 과정은 폴리스티렌 2-클로로트리틸클로라이드 수지에 대한 Fmoc 보호 아미노산의 부착을 포함한다. 이 부착은, 예컨대 트리에틸 아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민과 같은 3차 아민의 존재하에서 자유 N-보호 아미노산을 사용하여 달성될 수 있다(하기 참고문헌 참조). 이 아미노산의 C-말단 끝(수지에 부착됨)은 본 발명의 모 인슐린에 커플링되는 합성 서열의 끝에 있다. 수지에 Fmoc 아미노산을 부착한 후, Fmoc 기를 예컨대 피페리딘 또는 디에틸 아민과 같은 2차 아민을 사용하여 탈보호한 다음 또 다른(또는 동일한) Fmoc 보호 아미노산의 커플링 및 탈보호를 행한다. 합성 서열은 헥사데칸디온산, 헵타데칸디온산, 옥타데칸디온산 또는 에이코산디온산 모노-tert-부틸 에스테르와 같은 모노-tert-부틸 보호 지방(α, ω) 이산의 커플링에 의해 종결된다. 수지로부터 화합물의 분열은 0.5-5% TFA/DCM (디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산), 아세트산(예컨대 DCM 중 10%, 또는 HOAc/트리플루오로에탄올/DCM 1:1:8), 또는 DCM 중 헤카플루오로이소프로판올과 같은 희석산을 사용하여 달성된다(예컨대 "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Doerwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 또는 "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, 및 본원에 언급된 참고문헌 참조). 이것은 카르복실산 보호기로서 화합물에 존재하는 tert-부틸 에스테르가 탈보호되지 않는 것을 확실하게 한다. 최종적으로, C-말단 카르복시기(수지로부터 유리됨)는 예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르(OSu)로서 활성화되고 직접 또는 정제 후 본 발명의 모 인슐린에 부착시 커플링 시약으로서 사용된다. 이 과정은 실시예 4에 설명된다.

대안적으로, 상기 일반식 (II)의 아실화 시약은 하기 설명된 바와 같이 용액상 합성에 의해 제조될 수 있다.

헥사데칸디온산, 헵타데칸디온산, 옥타데칸디온산 또는 에이코산디온산 모노-tert-부틸 에스테르와 같은 모노-tert-부틸 보호 지방 이산은 예컨대 하기 설명된 바와 같이 OSu-에스테르로서, 또는 HOBt- 또는 HOAt-에스테르와 같은 당업자에게 공지된 다른 활성화된 에스테르로서 활성화된다. 이 활성 에스테르는 아미노산 AA1, 모노-tert-부틸 보호 AA2, 또는 AA3 중 하나와 THF, DMF, NMP (또는 용매 혼합물)와 같은 적절한 용매에서 DIPEA 또는 트리에틸아민과 같은 적합한 염기의 존재하에서 커플링된다. 중간체는 예를 들면 추출 과정 또는 크로마토그래피 과정에 의해 분리된다. 얻어진 중간체는 다시 활성화되며(상기 설명한 바와 같이) 상기 설명한 바와 같이 아미노산 AA1, 모노-tert-부틸 보호 AA2, 또는 AA3 중 하나와 커플링된다. 이 과정은 원하는 보호된 중간체 Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_P-OH가 얻어질 때까지 반복된다. 이것은 결국 활성화되어 일반식 (II) Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-Act의 아실화 시약을 산출한다. 이 과정은 실시예 9에서 설명된다.

본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 제조를 위한 일반 과정 (A)

일반 과정 (A)는 하기 개관되며 첫번째 실시예에서 설명된다:

실시예 1, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린

이 인슐린은 WO 2006/082205, 실시예 3에 설명된 인슐린과 유사하게 desB30 사람 인슐린 대신 A22K, B29R desB30 사람 인슐린을 사용하여 제조되었다.

LC-MS (전자분사); m/z: 1627 (M+4)⁺/4; 1302 (M+5)⁺/5.

실시예 2, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-(2-아미노에틸-PEG2000-일아세틸)), B29R desB30 사람 인슐린

단계 1:

헥사데칸디온산 tert-부틸 에스테르 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 에스테르 (218 mg, 0.497 mmol)를 DCM (10 mL)에 용해하고, 프로필아민-PEG-카르복실산 MW 2000 (NOF coporation의 SUNBRIGHT® PA-20HC, 1000 mg, 약 0.497 mmol)을 첨가하고 혼합물을 질소하에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카겔 컬럼으로 이동시키고 DCM로 에탄올(0-10%)의 구배로 용리하여 tert-부틸헥사데칸디오일프로필아민-PEG- 카르복실산 (MW 2000) 중간체를 얻었다.

단계 2: A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-(2-아미노에틸-PEG2000-일아세틸)), B29R, desB30 사람 인슐린의 합성.

tert-부틸헥사데칸디오일프로필아민-PEG-카르복실산 (MW 2000) (72 mg, 0.031 mmol)을 THF (4 mL)에 용해하고, DIPEA (6.3 μL, 0.037 mmol) 및 TSTU (11.1 mg, 0.037 mmol)을 첨가하고 혼합물을 질소하에서 밤새 교반하고, DMSO (1 mL)를 첨가하고 혼합물을 DMSO (2 mL) 중의 트리에틸아민(43 μL, 0.31 mmol)과 함께 용해된 A22K, B29R desB30 사람 인슐린 (180 mg, 0.031 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에서 냉각시키고 물 (15 mL)을 첨가하고, pH를 먼저 1N HCl을 가지고 5.2로 조정한 다음 다시 수중 1% 암모니아를 가지고 pH 7-8로 조정한다. 혼합물을 예비 HPLC 상에서 0.1% TFA를 함유하는 35-75% 수중 아세토니트릴 구배를 사용하여 정제하였다. 분획을 LC-MS 상에서 분석하고 원하는 산물을 함유하는 분획을 모으로, 진공에서 용매를 제거한 다음 동결건조하였다. 동결건조된 물질을 TFA/물 95:5로 30분 동안 처리하고 용매를 진공에서 제거하였다. 미정제 산물을 음이온 교환 크로마토그래피(Ressource Q 컬럼, 1ml (Amersham Biosciences) 및 42.5% EtOH, 0.25% TRIS, pH 7.5에서 아세트산암모늄 (0.25% 내지 1.25%, 25 CV)의 구배로의 용리를 사용하여 정제한 다음 0.1% TFA를 함유하는 30-70% 아세토니트릴/물 구배로 용리되는 Jupiter C4, 5μ 컬럼을 사용하는 예비 HPLC로 90분 동안 정제하여 표제 화합물을 산출하였다. HPLC-MS: m/z 약 1360 (M⁺/6).

실시예 3, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(5-카르복시펜타노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린

이 인슐린을 WO 2006/082205, 실시예 8에 설명된 인슐린과 유사하게, desB30 사람 인슐린 대신 A22K, B29R desB30 사람 인슐린을 사용하고 옥타디온산 모노-tert-부틸 에스테르 대신 헥산디온산 모노-tert-부틸 에스테르를 사용하여 제조하였다.

MALDI-TOF MS(매트릭스: 시나핀산); m/z: 6411.

실시예 4, 일반 과정 (A): A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(옥타데칸디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-TOF MS (매트릭스: 시나핀산); m/z: 6581.

하기 설명한 바와 같이 본 인슐린의 제조를 위한 아실화 시약을 제조하였다:

출발 수지: 2-클로로트리틸 수지, 1.60 mmol/g

1.0g 수지를 30분 동안 DCM (10 ml)에서 팽윤시켰다.

1. Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산의 아실화:

0.39 g (0.63 eq, 1.0 mmol)의 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(Fmoc-OEG-OH)을 DCM (15ml)에 용해하고 수지에 첨가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA) (0.44 ml, 2.5 mmol)을 적하 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 소용돌이 형성한 다음 메탄올 (2 ml)을 첨가하고 혼합물을 추가 15분 동안 소용돌이 형성하였다. 수지를 여과하고 NMP (2x8 ml) 및 DCM (8x8 ml)으로 세정하였다.

20% 피페리딘/NMP (8 ml)을 첨가하고, 10분 유지 1회 반복.

여과, 및 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml) 및 NMP (5x8 ml)으로 세정.

양성 TNBS 테스트는 적색 수지를 제공하였다.

2. Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산으로의 아실화:

0.78 g (2 eq, 2.0 mmol)의 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산을 NMP/DCM 1:1 (10 ml)에 용해하였다. 0.28g (2.2eq, 2.4mmol)의 HOSu을 첨가한 다음 0.37 ml (2.2 eq, 2.4 mmol) DIC를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 유지한 다음 수지를 첨가하고 마지막으로 0.407 ml (2.2 eq) DIEA를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 소용돌이 형성하고, 여과하고, NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml) 및 NMP (5x8 ml)으로 세정하였다.

양성 TNBS 테스트는 무색 수지를 제공하였다.

20% 피페리딘/NMP (10ml)을 첨가하고, 10분 유지 1회 반복.

여과, 및 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml) 및 NMP (5x8 ml)으로 세정.

양성 TNBS 테스트는 적색 수지를 제공하였다.

Fmoc-Glu-OtBu으로의 아실화:

0.86 g (2 eq, 2.0 mmol)의 Fmoc-Glu-OtBu를 NMP/DCM 1:1 (10 ml)에 용해하였다. 0.32g (2.2 eq, 2.4 mmol)의 HOBT를 첨가한 다음 0.37 ml (2.2 eq, 2.4 mmol)의 DIC를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 유지한 다음 수지로 이동시키고 마지막으로 0.407 ml (2.2 eq)의 DIEA를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 소용돌이 형성하고, 여과하고, NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml) 및 NMP (5x8 ml)으로 세정하였다.

양성 TNBS 테스트는 무색 수지를 제공하였다.

20% 피페리딘/NMP (10ml)을 첨가하고 10분 유지 1회 반복.

여과, 및 NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml) 및 NMP (5x8 ml)으로 세정.

양성 TNBS 테스트는 적색 수지를 제공하였다.

옥타데칸디온산 모노 tert-부틸 에스테르로의 아실화:

0.75 g (2eq, 2.0mmol) 옥타데칸디온산 모노 tert-부틸 에스테르를 NMP/DCM 1:1 (10 ml)에 용해하였다. 0.32g (2.2eq, 2.4mmol) HOBT를 첨가한 다음 0.37 ml (2.2 eq, 2.4 mmol)의 DIC를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 유지한 다음 수지로 이동시키고 마지막으로 0.41 ml (2.2 eq)의 DIEA를 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 소용돌이 형성하고, 여과하고, NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml) 및 NMP (5x8 ml)으로 세정하였다.

TFA로의 분열:

8 ml의 5% TFA/DCM를 수지에 첨가하고 반응 혼합물을 2시간 동안 소용돌이 형성하고, 여과하고, 여과액을 수집하였다. 5% TFA/DCM (8 ml)을 수지에 더 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 소용돌이 형성하고, 여과하고, 수지를 DCM (2x10 ml)으로 세정하였다. 조합된 여과액 및 세정물을 약 800 ul의 DIEA를 사용하여 염기성으로 pH 조정하였다. 혼합물을 진공에서 증발시켜서 오일을 산출하였다(3.5 g). 디에틸에테르(30 ml)를 첨가하고 미용해 오일을 디캔팅에 의해 분리하고 진공에서 증발시켰다. 이것은 오일로서 1.1 g의 17-{(S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{[2-(2-카르복시메톡시에톡시)에틸카르바모일]메톡시}에톡시)에틸카르바모일]프로필카르바모일}헵타데칸산 tert-부틸 에스테르 (대안적 명칭: Tert-부틸 옥타데칸디오일-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU)를 산출하였다.

LC-MS (Sciex 100 API): m/z = 846.6 (M+1)⁺.

OSu-활성화:

상기 tert-부틸옥타데칸디오일-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU (0.63 g)을 THF (35 ml)에 용해하였다. DIEA (0.255 ml, 2 eq.)를 첨가한 다음 TSTU (0.45 g, 2 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물이 에틸 아세테이트(250 ml)와 수성 NaHSO₄ (3 x 100 ml)으로 분리되었다. 유기상을 건조하고(MgSO₄) 진공에서 농축하여 오일로서 0.65 g의 17-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)에톡시]에틸카르바모일}메톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)헵타데칸산 tert-부틸 에스테르를 산출하였다(대안적 명칭: tert-부틸 옥타데칸디오일-Glu(OEG-OEG-OSu)-OTBU).

LC-MS: m/z = 943.4 (M+1)⁺.

실시예 5, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(13-카르복시트리데카노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린

LC-MS (전자분사): m/z = 1630, (M+4)⁺/4

실시예 6, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(에이코산디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-MS (매트릭스: 시나핀산); m/z: 6606

실시예 7, 일반 과정 (A):

A14E, A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(옥타데칸디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린

LC-MS (전자분사): m/z = 1634, (M+4)⁺/4

실시예 8, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), desB29, desB30 사람 인슐린

63 mg A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린 (실시예 4)을 Tris 완충제, pH 8 (50 mM, 10 mL)에 용해하고, 20% 에탄올을 함유하는 Tris 완충제, pH 8 (50 mM, 0.2 mL) 중의 세파로스 겔 상에 고정된 카르복시펩티다아제 B를 첨가하고 혼합물을 실온에서 16시간 동안 서서히 흔들었다. 20% 에탄올을 함유하는 Tris 완충제, pH 8 (50 mM, 0.8 mL) 중의 세파로스 겔 상에 고정된 카르복시펩티다아제 B를 더 첨가하고 혼합물을 24시간 동안 서서히 흔들었다. 혼합물을 여과하고 필터를 20% 에탄올을 함유하는 Tris 완충제, pH 8 (50 mM, 0.8 mL)로 세정하였다. 조합된 여과액 및 세정물을 냉동건조하였다. 잔류물을 HPLC로 정제하여 표제 인슐린을 산출하였다.

MALDI-TOF MS: m/z = 6424

실시예 9, 일반 과정 (A):

A14E, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐)), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린

아실화 시약 19-{1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에틸카르바모일]프로필카르바모일}노나데칸산 tert-부틸 에스테르 N-히드록시-숙신이미드 에스테르의 제조 및 모 인슐린에 대한 커플링:

에이코산디온산 tert-부틸 에스테르 N -히드록시숙신이미드 에스테르:

에이코산디온산 모노-tert-부틸 에스테르 (5 g, 12.54 mmol)와 TSTU (4.53g, 15.05 mmol)을 THF (50 mL)에서 혼합하고, DIPEA (2.62 mL)를 첨가하고 얻어진 탁한 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반한 다음 얻어진 투명 용액에 DMF (30 mL)를 첨가하고, 이것을 밤새 더 교반하였다. 얻어진 혼합물을 거의 건조상태로 증발시키고 잔류물을 차가운 아세토니트릴과 혼합하여 침전물을 침전시켰다. 이것을 여과하고 진공에서 밤새 건조하고, 6.01 g (97 %)의 에이코산디온산 tert-부틸 에스테르 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 산출하였다.

MS (전자분사): m/z: 440 (M-56 (tBu)).

2-(19-tert-부톡시카르보닐노나데카노일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르

에이코산디온산 tert-부틸 에스테르 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르 (6.01g, 12.124 mmol)를 THF (150 mL)에 용해하고 H-GIu-OtBu (2.71 g, 13.33 mmol)의 슬러리와 DMF/물 (1/1, 40 mL)에서 혼합하였다.

이것은 겔-유사 용액으로 되었고, 이를 가열하여 투명한 용액을 제공하고 RT에서 3시간 동안 교반하였다. 그 다음 용액을 증발시키고, 100 mL 물을 첨가하고, 혼합물을 60℃로 가열하였고, 이것은 용액으로 되었으며 냉각하여 결정화화였다. 침전물을 아세토니트릴로 재결정화하고 결정을 진공에서 건조하였다. 수율 6.82 g (96%).

MS (전자분사): m/z 584 (M+1).

2-(19-tert-부톡시카르보닐노나데카노일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르

2-(19-tert-부톡시카르보닐노나데카노일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 (6.52g, 11.17 mmol)를 THF (100 mL)에 용해하고, DIPEA (2.14 mL)를 첨가한 다음 아세토니트릴 (25 mL) 중의 TSTU (3.7O g, 12.29 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 RT에서 교반한 다음, 이것을 증발시켜서 갈색을 띄는 잔류물을 얻고, 아세토니트릴로부터 재결정화하였다. 밤새 5℃에서 냉각시킨 후 분말을 형성하였다. 이것을 THF에 용해하고 MgSO₄로 건조하고, 여과하고, 건조상태로 증발시켜서 6.17 g (81 %)의 표제 화합물을 산출하였다.

MS (전자분사): m/z: 681 (M+1).

19-{1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에틸카르바모일]프로필카르바모일}노나데칸산 tert-부틸 에스테르

2-(19-tert-부톡시카르보닐노나데카노일아미노)펜탄디온산 1-tert-부틸 에스테르 5-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 에스테르 (0.56g, 0.822 mmol)를 THF (20 mL)에 용해하고, THF (20 mL) 중의 3-(2-{2-[2-(2-아미노-에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피온산 (0.22 g, 0.82 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 3시간 동안 교반하였다. 반응을 나타내는 LCMS를 종료하였고(MS: m/z 831 (M+1)) 반응 혼합물을 TSTU와의 하기 반응에 직접 사용하였다.

19-(1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카르보닐)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르

19-{1-tert-부톡시카르보닐-3-[2-(2-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에틸카르바모일]프로필카르바모일}노나데칸산 tert-부틸 에스테르 (THF 40 mL 중의 0.68 g 미정제 용액, 0.82 mmol) 및 TSTU (0.296g, 0.982 mmol)을 혼합하고, DIPEA (0.171 mL)를 첨가하여 pH를 조정하고, 얻어진 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 이는 투명한 용액으로 되었으며 건조상태로 증발시키고 디에틸에테르로 처리하였고, 납빛의 덩어리로서 표제 화합물 1.2 g를 산출하였으며, 이것을 더 정제하지 않고 사용하였다.

MS (전자분사): m/z 816 (M-2 tBu)(계산 816).

A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 사람 인슐린에 대한 19-(1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카르보닐)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르의 커플링:

A14E, A22K, B25H, B29R, desB30 사람 인슐린 (0.3g, 0.052 mmol)을 아세토니트릴(4 mL)과 Na₂CO₃ (0.1 M, 10 mL)의 혼합물에 용해하고, NaOH (1M)을 가지고 pH를 10.6으로 조정하였다. 아세토니트릴(4 mL) 중의 19-(1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2,5-디옥소-피롤리딘-1-일옥시카르보닐)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에틸카르바모일}프로필카르바모일)노나데칸산 tert-부틸 에스테르 (0.048 g, 0.052 mmol)를 용액에 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 서서히 교반하였다. 메틸아민 용액 (MeOH 중 40%) 5방울을 첨가하고 혼합물을 5분 동안 더 교반하였다. 그 다음 아세트산 (빙상결정, 5 mL)을 한 부분으로 첨가하고 얻어진 혼합물을 예비 HPLC (C18, 3 cm 컬럼, 구배 0-7분 20% 아세토니트릴, 7-32분 20-100% 아세토니트릴, 32-37분 100% 아세토니트릴)로 정제하였다.

순수한 분획을 모으로 동결 건조시켰다.

얻어진 화합물을 TFA(30 mL)에 용해하고, RT에서 2시간 동안 교반한 다음 아세토니트릴(20 mL) 및 물(20 mL)을 첨가하고 혼합물을 예비 HPLC (C18, 3cm 컬럼, 구배 0-7분 20% 아세토니트릴, 7-32분 20-60% 아세토니트릴, 32-37분 60% 아세토니트릴)로 정제하였다.

순수한 분획을 모으로 동결 건조시켰다.

HPLC (C18, 3cm 컬럼, 구배 0-7분 25% 아세토니트릴, 7-47분 25-60% 아세토니트릴, 47-52분 60% 아세토니트릴)에 의한 재정제, 순수한 분획을 모으로 동결 건조시켰다. 이는 13 mg 최종 산물을 제공하였다.

MS (전자분사): m/z 6520 (계산6520).

실시예 10, 일반 과정 (A):

A18L, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

MS (전자분사): m/z: 6578 (Calcd:6578).

실시예 11, 일반 과정 (A):

A8H, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-TOF MS: m/z = 6615 (계산: 6615).

실시예 12, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린

MS (전자분사): m/z = 1677 (m+4)/4.

실시예 13, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}프로피오닐)), B29R, desB30 사람 인슐린

MS (전자분사): m/z = 6653 (계산: 6653).

실시예 14, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐)), B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-TOF MS: m/z = 6535 (계산: 6535)

실시예 15, 일반 과정 (A):

A14E, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피오닐)), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린

MS (전자분사): m/z = 1667.9 (m+4)/4.

실시예 16, 일반 과정 (A):

A14E, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피오닐)), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-TOF MS: m/z = 6824 (계산: 6825)

실시예 17, 일반 과정 (A):

A14E, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐)-γGlu), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-TOF MS: m/z = 6620 (계산: 6621 )

실시예 18, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B28E, B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-TOF MS: m/z = 6610 (계산: 6610)

실시예 19, 일반 과정 (A):

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

MALDI-TOF MS: m/z = 6724 (계산: 6724)

하기 실시예의 인슐린을 유사한 과정을 사용하여 제조하였다:

실시예 20:

A14E, A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(에이코산디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 21:

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 22:

A22K(N ^ε-에이코산디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 23:

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-(2-아미노에틸-PEG2000-일아세틸)), B29R desB30 사람 인슐린

실시예 24:

A22K(N ^ε-에이코산디오일-(2-아미노에틸-PEG2000-일아세틸)), B29R desB30 사람 인슐린

실시예 25:

A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(15-카르복시펜타데카노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R desB30 사람 인슐린

실시예 26:

A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(17-카르복시헵타데카노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R desB30 사람 인슐린

실시예 27:

A22K(N ^ε-테트라데칸디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 28:

A8H, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 29:

A18L, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 30:

A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시]에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 31:

A8H, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 32:

A18L, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 33:

A8H, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 34:

실시예 35:

A18L, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 36:

A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 37:

A8H, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 38:

A18L, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 39:

A8H, A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 40:

실시예 41:

A18L, A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 42:

A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 43:

A8H, A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 44:

A18L, A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 45:

A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 46:

A8H, A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 47:

A18L, A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린

실시예 48:

본 발명의 인슐린 유도체의 인슐린 수용체 결합

SPA 분석법 (섬광 근접 분석법) 마이크로티터플레이트 항체 포획 분석법에 의해 사람 인슐린 수용체에 대한 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 친화성을 결정한다. SPA-PVT 항체-결합 비드, 항-마우스 시약 (Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017)을 25 ml의 결합 완충체(100 mM HEPES pH 7.8; 10O mM 염화나트륨, 10mM MgSO₄, 0.025% Tween-20)와 혼합한다. 단일 Packard Optiplate (Packard No. 6005190)를 위한 시약 믹스는 2.4 μl의 1:5000 희석 정제된 재조합 사람 인슐린 수용체 (exon 11 존재 또는 부재), 100 μl의 시약 믹스 당 5000 cpm에 해당하는 A14Tyr[¹²⁵I]-사람 인슐린의 스톡 용액 상당량, 12 μl의 F12 항체 1:1000 희석액, 3ml의 SPA-비드 및 결합 완충제로 총 12 ml로 구성된다. 그 다음 총 100 μl 시약 믹스를 Packard Optiplate 내의 각 웰에 첨가하고, 적절한 샘플로부터 Optiplate에 인슐린 유도체의 희석 시리즈를 만든다. 그 다음 샘플을 서서히 흔들면서 16시간 동안 인큐베이션한다. 그 다음 원심분리에 의해 1분 동안 상을 분리하고 Topcounter에서 플레이트를 카운트한다. GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA)의 비선형 회귀 알고리즘을 사용하여 결합 데이터를 피팅한다.

선택된 본 발명 인슐린의 인슐린 수용체 친화성:

실시예 49:

본 발명의 인슐린 유도체의 래트에서 i.v. 볼루스 주사 후 혈중 글루코스 저하 효과

18시간 동안 절식한 수컷 Wistar 래트, 200-300g를 하이프놈-도미컴(Hypnorm-Dormicum) s.c. (1.25 mg/ml 도미컴, 2.5 mg/ml 플루아니손, 0.079 mg/ml 펜타닐 시트레이트)를 사용하여 초기 용량으로서 2 ml/kg (테스트 물질 투여 전 -30분 시점까지) 및 추가로 20분 마다 1 ml/kg로 마취한다.

1ml/kg의 대조 및 실험 화합물(통상 0.125-20 nmol/kg 용량 범위)을 동물에게 정맥 주사(꼬리 정맥)로 투여한다. 시간 -20분 및 0분 (투여 전), 및 투여 후 시간 10, 20, 30, 40, 60, 80, 120, 및 180 분에, 꼬리 끝의 모세관 혈관을 찔러서 총 혈중 글루코스 농도의 측정을 위한 핼액 샘플을 헤파린처리된 10 μl 유리관에 수집한다. EBIO Plus 자동분석기 (Eppendorf, Germany)를 사용하여 고정 글루코스 옥시다아제법에 의해 분석 완충제에 희석한 후 혈중 글루코스 농도를 측정한다. 각 용량 및 각 화합물에 대하여 평균 혈장 글루코스 농도 경과(평균 ± SEM)가 만들어진다.

실시예 50:

사람 인슐린과 비교한 본 발명의 아실화된 인슐린 유사체의 효능

실험일에 체중이 238-383g인 Sprague Dawley 수컷 래트를 클램프 실험에 사용한다. 래트는 제어된 주변 조건하에서 먹이로의 접근이 자유롭고 클램프 실험 전에 밤새(오후 3시부터) 절식시킨다.

실험 프로토콜:

시술 과정의 적어도 1주 전에 래트를 동물 시설에 적응시킨다. 클램프 실험의 약 1주 전에, 타이곤 카테터를 할로세인 마취하에서 경정맥 (주입을 위해) 및 경동맥 (혈액 샘플링을 위해)에 삽입하고 목 뒷부분에 외면화 및 고정시킨다. 래트에 Streptocilin vet. (Boehringer Ingelheim; 0.15 ml/래트, i.m.)를 시술 후 투여하고 회복 기간 동안 동물 보호 유닛(25℃)에 둔다. 무통증을 얻기 위해서, 마취동안 아노르핀 (0.06 mg/래트, s.c.)를 투여하고 마취로부터 완전히 회복한 후(2-3h) 리마딜 (1.5 mg/kg, s.c.)을 투여하고 2일 동안 일일 1회 다시 투여한다.

실험일 오전 7시에 밤새 절식한 (전일 오후 3시부터) 래트의 체중을 측정하고 샘플링 주사기 및 주입 시스템(Harvard 22 Basic 펌프, Harvard 및 Perfectum Hypodermic 유리 주사기, Aldrich)에 연결한 다음 실험을 시작하기 전 약 45분 동안 이들이 휴식하는 개별 클램프 케이지에 둔다. 래트는 전체 실험 동안 그들의 통상의 베딩에서 자유롭게 이동가능하며, 음용수에 자유롭게 접근가능하다. 혈장 글루코스 수준을 10분 간격으로 측정하는 30분 기저 기간 후, 테스트하는 인슐린 유사체 및 사람 인슐린(래트 당 하나의 용량 수준, 용량 수준 당 n = 6-7)을 300분 동안 일정한 비율로 주입한다(i.v.). 10분 간격으로 혈장 글루코스 수준을 측정하고 이에 따라 정상 혈당을 유지하게 위해서 20% 수성 글루코스의 주입을 조정한다. 재현탁된 적혈구의 샘플을 각 래트로부터 모으로 경동맥 카테터를 통해 약 ½ ml 부피로 되돌린다.

각 실험일에, 클램프 실험 전후에 테스트하는 개별 인슐린 유도체의 용액 및 사람 인슐린 용액의 샘플을 채취하고 HPLC에 의해 펩티드 농도를 확인한다. 래트 인슐린 및 C-펩티드, 및 테스트하는 인슐린 유사체 및 사람 인슐린의 혈장 농도를 연구 전후의 적절한 시점에 측정한다. 펜토바르비탈 과량투여를 사용하여 실험의 마지막에 래트를 사살한다.

실시예 51:

래트에 대한 인슐린 유도체의 폐 송달

방울 점적주사법에 의해 테스트 물질을 폐에 투여할 것이다. 간단히 말해서, 수컷 Wistar 래트(약 250g)를 약 60 ml 펜타닐/데히드로덴즈페리돌/-도미컴으로 6.6 ml/kg sc 초기 용량 및 이어서 30분 간격으로 3회 유지 용량 3.3 ml/kg sc으로 마취한다. 마취 유도 후 10분에 꼬리 정맥으로부터 기저 샘플을 얻고(t = -20분) 테스트 물질을 투여하기 직전에 기저 샘플을 얻는다(t=0). t=0에, 테스트 물질을 하나의 폐에 기관내로 투여한다. 끝이 둥근 특수 캐뉼라를 200 ul 공기 및 테스트 물질 (1 ml/kg)을 함유하는 주사기에 장착한다. 오리피스를 통해 캐뉼라를 기관으로 유도하고 주 기관지 중 하나를 향하게 한다 -단지 분기점을 통과. 삽입하는 동안, 목을 외부에서 촉진하여 기관내 위치를 확인한다. 주사기의 내용물을 주입한 후 2초간 정지한다. 그 후, 캐뉼라를 서서히 뒤로 당긴다. 테스트하는 동안 래트를 마취상태로 유지하고(최대 4 또는 8시간 동안 혈액 샘플) 실험 후 안락사시킨다.

서열 목록

SEQ ID NO:1은 실시예 1-6, 8, 12-14, 18 및 19의 A1-A21 쇄이다. SEQ ID NO:2는 실시예 1-6, 10-14 및 19의 B1-B29 쇄이다. SEQ ID NO:3은 실시예 7, 9 및 15-17의 A1-A21 쇄이다. SEQ ID NO:4는 실시예 7, 9 및 15-17의 B1-B29 쇄이다. SEQ ID NO:5는 실시예 10의 A1-A21 쇄이다. SEQ ID NO:6은 실시예 11의 A1-A21 쇄이다. SEQ ID NO:7은 실시예 18의 B1-B29 쇄이다. SEQ ID NO:8은 실시예 8의 B1-B28 쇄이다.

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Insulin analogues with an acyl and alkylene glycol moiety <130> 7701.204-WO <160> 8 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A1-A21 <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> B1-B29 <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Arg 20 25 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A1-A21 <400> 3 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> B1-B29 <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Arg 20 25 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A1-A21 <400> 5 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Cys Asn 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A1-A21 <400> 6 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> B1-B29 <400> 7 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Arg 20 25 <210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> B1-B28 <400> 8 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro 20 25

Claims

A21 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 리신 잔기, 또는 리신 잔기를 포함하는 최대 4개 아미노산 잔기의, A21 아미노산 잔기에 C-말단으로 연결된 펩티드 잔기를 포함하는 아실화된 인슐린 유사체에 있어서, 알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 아실 부분이 A22 위치에서 리신 잔기에 부착되거나, 또는 A21 아미노산 잔기의 C 말단 끝에 부착된 펩티드 잔기에 존재하는 리신 잔기에 부착되고, 이때 인슐린 유사체에 오직 하나의 리신(K, Lys)이 존재하는 것을 특징으로 하는 아실화된 인슐린 유사체.
제 1 항에 있어서, 아실 부분은 일반식 I을 갖는 것을 특징으로 하는 아실화된 인슐린 유사체.
Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- (I)
상기 식에서
n은 0 또는 1-3 범위 내의 정수이고,
m은 0 또는 1-6 범위 내의 정수이고,
p는 1, 2 또는 3이고,
Acy는 공식적으로는 지방산의 카르복시기 또는 지방 이산의 카르복시기 중 하나로부터 히드록시기가 제거된 약 8-24개 탄소 원자를 포함하는 지방산 또는 지방 이산이고,
AA1는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 중성 환상 아미노산이고,
AA2는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 산성 아미노산이고,
AA3는 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 중성, 알킬렌글리콜-함유 아미노산이고,
식에서 AA1, AA2 및 AA3가 나타나 있는 순서는 독립적으로 교환될 수 있고,
Acy, AA1, AA2 및/또는 AA3 사이의 연결은 아미드 (펩티드) 결합이고,
모-인슐린에 대한 부착은 식 (I)의 아실 부분 중의 AA1, AA2 또는 AA3 잔기의 C-말단 끝으로부터 또는 식 (I)의 부분에 존재하는 AA2 잔기의 측쇄(들) 중 하나로부터 일 수 있다.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, AA1은

로부터 선택되고, 여기서 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거되며, 상기 식에서 q는 0, 1, 2, 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 아실화된 인슐린 유사체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, AA1은

이고, 여기서 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거된 것을 특징으로 하는 아실화된 인슐린 유사체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, AA2는 γGlu, βAsp 또는 하기 화합물 중 어느 것에서 선택되고,

여기서 공식적으로는 아미노기로부터 수소 원자가 제거되고 카르복시기로부터 히드록시기가 제거되며, 화살표는 AA1, AA2 또는 AA3의 아미노기의 부착점을 나타내는 것을 특징으로 하는 아실화된 인슐린 유사체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화합물: A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)-프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-(2-아미노에틸-PEG2000-일-아세틸)), B29R desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(5-카르복시펜타노일아미노)프로폭시]부톡시}-프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(옥타데칸디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(13-카르복시트리데카노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(에이코산디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B29R, desB30 사람 인슐린; A14E, A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(옥타데칸디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), desB29, desB30 사람 인슐린; A14E, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐)), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린; A18L, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A8H, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}프로피오닐)), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐)), B29R, desB30 사람 인슐린; A14E, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피오닐)), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린; A14E, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피오닐)), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린; A14E, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)-프로피오닐)-γGlu), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2- 아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B28E, B29R, desB30 사람 인슐린; 22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A14E, A22K(N ^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(에이코산디오일-γGlu)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸]), B25H, B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-에이코산디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-(2-아미노에틸-PEG2000-일아세틸)), B29R desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-에이코산디오일-(2-아미노에틸-PEG2000-일-아세틸)), B29R desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(15-카르복시펜타데카노일아미노)프로폭시]-부톡시}프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-3-(3-{4-[3-(17-카르복시헵타데카노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)프로피오닐-γGlu), B29R desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-테트라데칸디오일-(3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)프로피오닐-γGlu), B29R, desB30 사람 인슐린; A8H, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A18L, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-옥타데칸디오일- γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A8H, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A18L, A22K(N ^ε-옥타데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A8H, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A8H, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A18L, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A8H, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A18L, A22K(N ^ε-에이코산디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; A8H, A22K(N ^ε-헥사데칸디오일-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸아미노}에톡시)에톡시]아세틸), B29R, desB30 사람 인슐린; 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