JP2010535851A - アシル及びアルキレングリコール部分を有するインスリンアナログ - Google Patents
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Abstract
Description
本願明細書において、インスリンなる用語は、天然に存在するインスリン、例えばヒトインスリンに加えて、インスリンアナログをカバーする。
本願明細書において、アミノ酸残基なる用語は、水素原子がアミノ基から取り除かれたアミノ酸、および/または、水酸基がカルボキシ基から取り除かれたアミノ酸、および/または、水素原子がメルカプト基から取り除かれたアミノ酸をカバーする。正確ではないが、アミノ酸残基はアミノ酸と呼ぶことができる。
インスリンアナログ及びA鎖及びB鎖の位置の番号付けがされることにより、親化合物は使用する番号付けを有するヒトインスリンである。
本発明の目的は、従来技術の欠点のうちの少なくとも1つを克服するか又は改善するか、または有用な代替物を提供することである。
本発明の1つの目的は、良好なバイオアベイラビリティーを有するインスリン誘導体を供給することにである。
本発明の別の目的は、速効性インスリンとして使用できるインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、肺に投与できるインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、延長された作用プロフィールを有するインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、基礎インスリンとして使用できるインスリン誘導体を供給することである。
本発明の他の目的は、高いインスリン受容体結合能を有するインスリン誘導体を供給することである。
本発明の別の態様は、インスリンのインビボ半減期を改良することである。
本発明の他の目的は、ヒトインスリンが有するよりも、低血糖状態を引き起こす傾向が低いインスリン誘導体を供給することである。
本発明の別の態様は、特に2年間の貯蔵後に、申し分ない物理安定性を有するインスリンを見いだすことである。
本発明の別の態様は、特に2年間の貯蔵後に、申し分ない化学安定性を有するインスリンを見いだすことである。
本発明の別の態様は、特に2年間の貯蔵後に、申し分ないタンパク質分解安定性を有するインスリンを見いだすことである。
本発明の別の態様は、申し分ない溶解性を有するインスリンを見いだすことである。
簡潔には、本発明は、A21アミノ酸残基のC末端終端に連結されたアミノ酸残基またはA21アミノ酸残基のC末端終端に連結された多くとも4アミノ酸残基のペプチド残基を含むアシル化インスリンアナログであって、アシル部分がA22位置のリジン残基に取り付けられているか又はA21アミノ酸残基のC末端終端に付属するペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられているアルキレングリコール部分を含むことを特徴とするアシル化インスリンアナログに関する。それ故、インスリンアナログは、A22位置のアミノ酸を含む。
驚くべきことに、本発明のアシル化インスリンアナログは、高いHSA濃度の存在下において良好なバイオアベイラビリティーと高いインスリン受容体結合性を示す。
本発明のアシル化インスリンアナログに存在するインスリンアナログは、場合により位置A1-A21及びB1−B30に1つ以上のアミノ酸が欠失しているか又は別のアミノ酸残基により置換されており、位置A21のアミノ酸残基にC末端に連結した1つのアミノ酸残基を有するヒトインスリンとして、または位置A21のアミノ酸残基にC末端に連結した多くとも4アミノ酸残基のペプチド残基を有するヒトインスリンとして、形式的に例示される。命名については、位置A21のアミノ酸残基に連結されるアミノ酸残基は、A22位置である。同様に、位置A21のアミノ酸残基に連結されたペプチド残基に存在するアミノ酸残基は、位置A22、A23、A24またはA25である。
本願明細書において、「脂肪酸」なる用語は、少なくとも2つの炭素原子を有する飽和又は不飽和の、直鎖状又は分枝状の、脂肪族カルボン酸を含む。脂肪酸の非限定的例は、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸である。
本願明細書において、「脂肪族二酸」なる用語は、少なくとも2つの炭素原子を有する飽和又は不飽和の、直鎖状又は分枝状の、脂肪族カルボン酸を含む。脂肪族二酸の非限定的例は、コハク酸、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカンニ酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカンニ酸、オクタデカン二酸及びエイコサンニ酸である。
AA1で示される中性の環状アミノ酸残基は、飽和6員炭素環を有するアミノ酸であり、任意に窒素ヘテロ原子を含んでおり、好ましくは環はシクロヘキサン環またはピペリジン環であるアミノ酸である。好ましくは、この中性の環状アミノ酸の分子量は、約100から200Daの範囲にある。
AA2で示される酸性アミノ酸残基は、最大約200Daの分子量を有するアミノ酸であり、2つのカルボン酸基と第1又は第2のアミノ基を含む。
AA3で示される中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基はアルキレングリコール部分であり、場合により1方の末端にカルボン酸官能基と他方の末端にアミノ基官能基を含むオリゴ-又はポリアルキレングリコール部分である。
ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールに基づく鎖、ポリプロピレングリコールに基づく鎖及びポリブチレングリコールに基づく鎖、すなわち反復単位−CH2CH2O−、−CH2CH2CH2O−または−CH2CH2CH2CH2O−に基づく鎖である。アルキレングリコール部分は、(明確な長さ/分子量を有する)単分散でも、(あまり明確でない長さ/平均分子量を有する)多分散でもよい。モノアルキレングリコール部分は、各末端に異なる基を含む−OCH2CH2O−、−OCH2CH2CH2O−またはOCH2CH2CH2CH2O−を含む。
ある実施形態において、本発明の親インスリンは、位置A22のリジンとは別に、A21アミノ酸残基のC末端に連結した多くとも4つのアミノ酸の任意のペプチド残基とは別に、B29R及び/又はdesB30変異とは別に、以下の変異の1つ以上を含む。本願明細書において、初めにA又はB鎖の位置を与えられ、その後に可能なアミノ酸残基が1文字コードとして与えられる。ある実施形態では、位置A22のリジンとは別に、A21アミノ酸残基のC末端に連結した多くとも4つのアミノ酸の任意のペプチド残基とは別に、B29R及び/又はdesB30変異とは別に、5つの変異があり、別の実施形態では4つの変異があり、別の実施形態では3つの変異があり、別の実施形態では2つの変異があり、別の実施例では1つの変異があり、別の実施形態では変異がない:
A4: AまたはQ。
A5: L。
A8: R、N、Q、E、H、LまたはW。
A9: RまたはL。
A14: EまたはD。
A15: AまたはT。
A16: M。
A17: DまたはF。
A18: R、L、I、DまたはV。
A21: GまたはA。
B3: A、R、H、I、L、M、F、W、Y、SまたはT。
B10: DまたはE。
B25: Y、HまたはdesB25。
B26: Q、E、SまたはdesB26。
B27: H、L、M、WまたはY。
B28: DまたはE。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A5L変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A8L、A8N、A8Q、A8E、A8H、A8LまたはA8W変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A8H変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A9RまたはA9L変異を含む。 他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A9L変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A14EまたはA14D変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A15AまたはA15T変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A16M変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A17DまたはA17F変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A18R、A18L、A18I、A18DまたはA18V変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A18LまたはA18V変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A18I変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A21GまたはA21A変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、B3A、B3R、B3H、B3I、B3L、B3M、B3F、B3W、B3Y、B3SまたはB3T変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、B10DまたはB10E変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、B25Y、B25HまたはdesB25変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、B26Q、B26E、B26SまたはdesB26変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、B27H、B27L、B27M、B27WまたはB27Y変異を含む。他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、B27WまたはB27Y変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、B28DまたはB28E変異を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の親インスリンは、A21Q、B1Q、desB1、B3Q、B3S、B3T、B13QまたはdesB27変異を含む。
ある態様では、本発明は、本発明のアシル化インスリンアナログと、AspB28ヒトインスリン、LysB28 ProB29ヒトインスリン及びLysB3 GluB29ヒトインスリンからなる群から選択された速効性インスリンアナログの混合物である医薬組成物を提供する。
更なる態様において、本発明のアシル化インスリンアナログは約0.02から約10、約0.1から約5;約0.5から約5;約0.2から約2;約0.2から約1;約0.1から約2;または約0.5から約2までの範囲にある疎水性インデックス(k’rel)を有する。ヒトインスリンに関連する本発明のアシル化インスリンアナログの疎水性(疎水性インデックス)K’relは、LiChrosorb RP18(5μm,250×4mm) HPLCカラムで、A)10%アセトニトリルを含有する0.1Mのリン酸ナトリウム・バッファー(pH7.3)とB)50%アセトニトリル水溶液との混合物を溶出剤として使用して、40℃の定組成溶離により、測定した。溶出は、214nmで溶出液のUV吸収に従って監視した。ボイド時間(t0)は、0.1mMの硝酸ナトリウムを注入することによって見いだされた。ヒトインスリン(tヒト)の保持時間は、A溶液とB溶液との間の比率を変化させることによって、少なくとも2t0に合わせた。k’rel=(t誘導体−t0)/(tヒト−t0)。
別の態様において、本発明は、約6.5から約8.5まで間隔のpH値において可溶性である本発明のアシル化インスリンアナログを含む医薬組成物に関する。
別の態様において、本発明は、本発明のアシル化インスリンアナログを含む延長された作用プロフィールを有する医薬組成物に関する。
別の態様において、本発明は、肝選択的又は肝優先的作用を有するインスリンに関する。
別の態様において、本発明は、約120nmol/mlから約2400nmol/mlまで、約400nmol/mlから2400nmol/mlまで、約400nmol/mlから約1200nmol/mlまで、約600nmol/mlから約2400nmol/mlまで、または約600nmol/mlから約1200nmol/mlまでの本発明のアシル化インスリンアナログまたは本発明のアシル化インスリンアナログと迅速に作用開始するインスリンアナログとの混合物を含む溶液である医薬組成物に関する。
投与経路は、例えば、皮下、筋肉内または静脈内のように非経口的に、本発明の化合物を、効果的に身体の所望又は適切な場所へ運ぶ任意の経路であってもよい。あるいは、本発明の化合物は経口、肺、鼻に投与されることができる。
非経口投与のために、本発明の化合物は、既知のインスリン製剤と同じように製剤化される。さらに、非経口投与の場合、本発明の化合物は既知のインスリンと同じように投与され、医師はこの手順に精通している。
非経口投与は、注射器(場合によりペン型注射器)によって行われることができる。あるいは、非経口投与は、インフュージョンポンプによって行われることができる。
本発明の化合物の注射可能な組成物は、所望の最終産物を得るために、溶解されること及び適切な成分と混合されることを含む医薬品工業の従来技術を使用して調製されうる。したがって、ある手順によれば、本発明の化合物は調製される組成物の最終体積よりいくらか少ない水量に溶解される。等張剤、防腐剤及びバッファーは必要に応じて加えられ、溶液のpH値は、必要に応じて、酸(例えば塩酸)または塩基(例えば水酸化ナトリウム水溶液)を使用して調整される。最後に、溶液の体積は、成分の所望の濃度を得るために、水によって調整される。
本発明のインスリン製剤が、既知のインスリン製剤の使用と同様に使用される。
投与される本発明の化合物の量、本発明の化合物を投与する頻度の決定、投与される化合物又は本発明の化合物の選択は、場合により他の抗糖尿病用化合物と共に、糖尿病の治療に精通している医者と相談して決定される。
それ故、本発明は、当該治療を必要とする患者に、本発明の化合物の有効量を投与すること含んで成る、糖尿病の治療方法にも関する。
本発明のアシル化インスリンアナログは皮下に、経口的に、又は肺に投与されることができる。
皮下投与の場合、本発明のアシル化インスリンアナログは、既知のインスリンの製剤と同じように製剤化される。さらに、皮下投与の場合、本発明のアシル化インスリンアナログは既知のインスリンの投与と同じように投与され、通常は医師はこの手順に精通している。
本発明のアシル化インスリンアナログは、循環するインスリンレベルを増加させるためにおよび/または循環するグルコース濃度を低下させるために効果的な量を吸入によって投与されてもよい。このような投与は、疾患(例えば糖尿病または高血糖)を治療するために効果的である。インスリンの有効量の達成は、本発明のアシル化インスリンアナログの約0.5μg/kgから約50μg/kgまでの範囲の吸入量の投与を必要とする。治療上の有効量は知識のある医者によって、インスリン濃度、血中グルコース濃度、患者の体調、患者の肺の状況等を含む要因を考慮して決定されることができる。
本発明のアシル化インスリンアナログは、その遅い吸収および/または減じた全身的なクリアランスを達成するために、吸入によって送達されてもよい。類似の粒径及び類似の肺の蓄積レベルを比較する場合、異なる吸入装置は通常は類似した薬物動態を提供する。
有利には乾燥粉末として投与する場合、発明のアシル化インスリンアナログは、約10μm未満、好ましくは約1から約5μmの粒径を有する粒状形態に調製される。好適な粒径は、患者の肺の肺胞への送達のために効果的である。好ましくは、乾燥粉末は粒子の大多数が所望の範囲のサイズを有するように産生される粒子から主に成る。有利には、乾燥粉末の少なくとも約50%は、約10μm未満の直径を有する粒子からなる。当該剤形は、噴霧乾燥、ミリング(milling)、マイクロ化(micronisation)、又は本発明のアシル化インスリンアナログの粒子及び他の所望の成分を含む溶液の臨界点凝結によって得ることができる。本発明で使用できる粒子を生成することに適している他の方法も公知技術である。
乾燥粉末吸入器からの投与のための本発明のアシル化インスリンアナログの剤形は通常は、誘導体を含む微細に分けられた乾燥粉末を含むが、更に粉末は充填剤、担体、賦形剤、他の添加物等を含むことができる。添加物は、例えば、特別な粉末吸入器から必要に応じて送達のための粉末を希釈するために、剤形の処理を促進するために、剤形に有利な粉体物性を提供するために、吸入装置から粉末の分散を促進するために、剤形(例えば抗酸化剤またはバッファー)を安定させるために、剤形に味を付けるため又はその類のために、アシル化インスリンアナログの乾燥粉末剤形に含めることができる。有利には、添加物は、患者の気道に悪影響を与えない。アシル化インスリンアナログは分子レベルで添加物を混合することができるか、または固体剤形は添加物の粒子と混合により又は添加物の粒子を被膜することによりアシル化インスリンアナログを含むことができる。典型的添加物は、単糖類、二糖類及び多糖類、糖アルコール及び他のポリオール(例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレチトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン又はそれらの組合せ);界面活性剤(例えばソルビトール、ジ・ホスファチジルコリンまたはレシチン);またはその類である。通常は、充填剤のような添加物は、上で記載されている目的のための有効量、しばしば製剤の約50%から約90重量%で存在する。インスリンアナログタンパク質のようなタンパク質の製剤のために当該分野で知られている添加剤は、更に製剤に含まれることができる。
噴霧器の用途に適している本発明のアシル化インスリンアナログの剤形は、通常は溶液1mlにつき約1mgから約500mgのアシル化インスリンアナログの濃度で、アシル化されたインスリンアナログを水溶液に含む。選択されるアシル化インスリンアナログ及び医学アドバイザーに知られている他の要因に応じて、上限値を低くしてもよく、例えば溶液1mlにつき450、400、350、300、250、200、150、120、100または50mgのアシル化インスリンアナログである。製剤は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤、好ましくは亜鉛のような剤を含むことができる。製剤は、バッファー、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物のようなアシル化インスリンアナログの安定化のための賦形剤または薬剤を含むこともできる。バルクタンパク質は、アルブミン、プロタミン又はその類を含むインスリンコンジュゲートの調製に役立つ。典型的な炭水化物は、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどを含むアシル化インスリンアナログの調製に役立つ。アシル化インスリンアナログ製剤はまた、エアゾールを形成する際の溶液の噴霧化によって生じるインスリンコンジュゲートの表面誘発性凝集を減少または防止することができる界面活性剤を含むことができる。さまざまな従来の界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステルとアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどを使用することができる。一般的に、量は製剤の約0.001と約4重量%との間の範囲にわたる。
本発明のアシル化インスリンアナログの注射可能な組成物は、溶解すること及び所望の最終産物を得るために適切な成分と混合されることを含む医薬品工業の従来の技術を使用して調製することができる。したがって、ある手順によれば、アシル化インスリンアナログは、調製される組成物の最終体積よりもいくらか少ない水量に溶解される。Zink、等張剤、防腐剤および/またはバッファーは必要に応じて添加され、溶液のpH値は必要に応じて、酸(例えば塩酸)又は塩基(例えば水酸化ナトリウム)を使用して調整される。最終的に、溶液の体積は、成分の所望の濃度を得るために、水によって調整される。
本発明の更なる実施態様において、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物から選択される。これらの特異的なバッファーのそれぞれは、本発明の別の実施形態を構成する。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
本発明のアシル化インスリンアナログの鼻噴投与のための組成物は、例えば、欧州特許第272097号に記載のとおり調製することができる。
本発明のアシル化インスリンアナログを含む組成物が、インスリンに感受性がある病状の治療に使用されることができる。したがって、それらは、1型糖尿病、2型糖尿病、及び例えば大手術を受けた人及び重傷患者に見られる高血糖症を治療するために使用できる。任意の患者にとっての最適な服用レベルは、使用される特異的インスリン誘導体の有効量、患者の年齢、体重、身体活動により、他の薬剤との可能な組合せにより、及び治療される病状の重症度により決まる。それは、本発明のアシル化インスリンアナログの1日の投与量は、公知のインスリン組成物と類似した方法で、当業者によって、患者ごとに決定される。
まとめると本発明の特徴のいくつかは以下の通りである:
1.A21アミノ酸残基のC末端に結合するリジン残基を含むインスリンアナログか又はリジン残基を含む最大4アミノ酸残基のペプチド残基であってペプチド残基がA21アミノ酸残基のC末端に結合するインスリンアナログであるアシル化インスリンアナログであって、アシル部分がA22位置のリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分か又はA21アミノ酸残基のC末端終端に取り付けられたペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分を含み、インスリンアナログには単一のリジン(K、Lys)が存在することを特徴とするアシル化インスリンアナログ。
2.アシル部分は式I:
Acy−AA1n−AA2m−AA3p−(I)、
[式中、nは0または範囲1−3の整数であり、
mは0又は範囲1−6の整数であり、
pは1、2または3であり、
Acyは形式的に脂肪酸のカルボキシ基から又は脂肪族二酸のカルボキシ基の一つから水酸基を除去された、約8−24の炭素原子を含む脂肪酸又は脂肪族二酸であり、
AA1は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された中性環状アミノ酸であり、
AA2は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された酸性アミノ酸であり、
AA3は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された中性アルキレングリコール含有アミノ酸であり、
AA1、AA2及びAA3が式に現れる順番は独立に交換することができ、
Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の結合は、アミド(ペプチド)結合である]
であって、親インスリンへの取り付けは式(I)のアシル部分のAA1、AA2、又はAA3残基のC末端終端または式(I)の部分に存在するAA2残基の側鎖の1つから行われる、1項に記載のアシル化インスリンアナログ。
3.A21アミノ酸残基のC末端に結合するリジン残基を含むインスリンアナログか又はリジン残基を含む最大4つのアミノ酸残基のペプチド残基がA21アミノ酸残基のC末端に結合するインスリンアナログであるアシル化インスリンアナログであって、
アシル部分がA22位置のリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分又はA21アミノ酸残基のC末端終端に取り付けられたペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分を含み、インスリンアナログには単一のリジン(K、Lys)が存在し、アシル部分が一般式I:Acy−AA1n−AA2m−AA3p−(I)
[式中、nは0または範囲1−3の整数であり、
mは0又は範囲1−6の整数であり、
pは1、2または3であり、
Acyは形式的に脂肪酸のカルボキシ基から又は脂肪族二酸のカルボキシ基から水酸基を除去された、約8−24の炭素原子を含む脂肪酸又は脂肪族二酸であり、
AA1は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された中性環状アミノ酸であり、
AA2は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された酸性アミノ酸であり、
AA3は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、アルボキシ基から水酸基が除去された中性アルキレングリコール含有アミノ酸であり、
AA1、AA2及びAA3が式に現れる順番は、独立に交換することができ、Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の結合は、アミド(ペプチド)結合である]を有するアルキレングリコール部分を含み、親インスリンへの取り付けは式(I)のアシル部分のAA1、AA2、又はAA3残基のC末端終端または式(I)の部分に存在するAA2残基の側鎖の1つから行われることを特徴とするアシル化インスリンアナログ。
4.Acyが14から20炭素原子、好ましくは16から20炭素原子、より好ましくは16から18炭素原子、あるいは18から20炭素原子、とりわけ8、10、12、14、16、17、18、20、22又は24炭素原子を有する脂肪酸又は脂肪族二酸から誘導される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
5.Acyがジカルボン酸から誘導される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
6.Acyが、水酸基が取り除かれたテトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、ヘクサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸又はエイコサン二酸である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
7.Acyが水酸基が取り除かれたヘクサデカン二酸、オクタデカン二酸、又はエイコサン二酸である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
8.AA1が、
形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された
[式中、qは0,1、2、3又は4である]
から選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
9.AA1が、形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された
から選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
10.AA2が、形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去されたGlu、Asp、D-Glu、D-Asp、γGlu、γAsp、γ-D-Glu、γ-D-Asp、又は以下の化合物の何れか:
[式中、矢印はAA1、AA2又はAA3のアミノ基への付着点を示す]から選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
11.AA2がγGluである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
12.AA3が形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された以下の化合物:
[rが範囲1−100、好ましくは1−10の整数であり、sが範囲1−30、好ましくは1−10の整数であり、tが範囲1−150、好ましくは20−70の整数である]
の何れかから選択される、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
13.rが1、2、3、4、5、7、11、23又は27である、前項のアシル化インスリンアナログ。
14.sが1、2、3、4、10、20又は30である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
15.整数tが現われている上式の平均分子量が2000Da、3400Da又は5000Daとなるように、整数tが選択される、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
16.式Acy−AA1n−AA2m−AA3p−
[式中、Acy、AA1、AA2、AA3、n、m及びpは上に定義の通りである]
のアシル部分が位置A22のリジン残基に結合する、
、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
17.式Acy−AA1n−AA2m−AA3p−
[式中、Acy、AA1、AA2、AA3、n、m及びpは上に定義の通りである]
のアシル部分が位置A23のリジン残基に結合する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
18.式Acy−AA1n−AA2m−AA3p−
[式中、Acy、AA1、AA2、AA3、n、m及びpは上に定義の通りである]
のアシル部分が位置A24のリジン残基に結合する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
19.式Acy−AA1n−AA2m−AA3p−
[式中、Acy、AA1、AA2、AA3、n、m及びpは上に定義の通りである]
のアシル部分が位置A25のリジン残基に結合する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
20.インスリンアナログが52アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
21.インスリンアナログが51アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
22.インスリンアナログが53アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
23.インスリンアナログが54アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
24.インスリンアナログが50アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
25.インスリンアナログが49アミノ酸残基を含む、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
26.インスリンアナログの位置A1−A21及びB1−B30の唯一のアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
27.インスリンアナログの位置A1−A21及びB1−B30の2つのみのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
28.インスリンアナログの位置A1−A21及びB1−B30の3つのみのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
29.インスリンアナログの位置A1−A21及びB1−B30の4つのみのアミノ酸残基がヒトインスリンに存在するそれらのアミノ酸残基から逸脱する、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
30.位置A1またはB1に存在するアミノ酸残基のN末端終端に結合されるアミノ酸残基がないか、または位置B30に存在するアミノ酸残基のC末端終端に連結されるアミノ酸残基がない、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
31.インスリンアナログのA14位置のアミノ酸残基がEである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
32.インスリンアナログのA18位置のアミノ酸残基がQである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
33.インスリンアナログのA21位置のアミノ酸残基がA、GまたはQである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
34.インスリンアナログのA22位置のアミノ酸残基がKまたはGである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
35.インスリンアナログのA22位置のアミノ酸残基がKである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
36.インスリンアナログのA22位置のアミノ酸残基がKであり、当該A22Kアミノ酸残基のC末端終端に結合するアミノ酸残基がない、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
37.インスリンアナログのA23位置のアミノ酸残基がKまたはGである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
38.インスリンアナログのA24位置のアミノ酸残基がKまたはGである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
39.インスリンアナログのA25位置のアミノ酸残基がKである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
40.インスリンアナログのB1位置のアミノ酸残基がQまたは欠失である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
41.インスリンアナログのB3位置のアミノ酸残基がQまたはTである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
42.インスリンアナログのB13位置のアミノ酸残基がQである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
43.インスリンアナログのB25位置のアミノ酸残基がHである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
44.インスリンアナログのB27位置のアミノ酸残基が欠失している、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
45.インスリンアナログのB28位置のアミノ酸残基がD、EまたはRである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
46.インスリンアナログのB28位置のアミノ酸残基がRであり、B29位置のアミノ酸残基がPである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
47.インスリンアナログのB29位置のアミノ酸残基がRである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
48.インスリンアナログのB30位置のアミノ酸残基が欠失している、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
49.インスリンアナログのA14位置のアミノ酸残基がYまたはEであり、
インスリンアナログのA18位置のアミノ酸残基がNまたはQであり、
インスリンアナログのA21位置のアミノ酸残基がN、A、GまたはQであり、
インスリンアナログのA22位置のアミノ酸残基がKまたはGであり、
インスリンアナログのA23位置のアミノ酸残基が欠失、KまたはGであり、
インスリンアナログのA24位置のアミノ酸残基が欠失、KまたはGであり、
インスリンアナログのA25位置のアミノ酸残基が欠失またはKであり、
インスリンアナログのB1位置のアミノ酸残基がF、Q又は欠失であり、
インスリンアナログのB3位置のアミノ酸残基がN、Q又はTであり、
インスリンアナログのB13位置のアミノ酸残基がEまたはQであり、
インスリンアナログのB25位置のアミノ酸残基がFまたはHであり、
インスリンアナログのB27位置のアミノ酸残基がTまたは欠失しており、
インスリンアナログのB28位置のアミノ酸残基がP、D、E又はRであり、
インスリンアナログのB29位置のアミノ酸残基がK又はRであり、
インスリンアナログのB30位置のアミノ酸残基がT又は欠失である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
50.インスリンアナログの全てのアミノ酸残基がコード可能アミノ酸の残基である、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
51.AA2がgGluである、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
52.一般式Acy−AA1n−AA2m−AA3p−のアシル部分が、Acy-AA3-、Acy-AA2-AA3-、Acy-AA2-AA3-AA2-、Acy-AA2-(AA3)2-、Acy-AA2-(AA3)2-AA2又はAcy-AA3-AA2-[式中、Acy、AA2及びAA3の各々は本願明細書に定義の通りである]を有する、
上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
53.特に本願明細書において言及される化合物、例えば本願明細書の具体的な例に記載されている化合物の何れか一つある、上記可能な項の何れか一つのアシル化インスリンアナログ。
54.医薬として使用されるための、あるいは医薬に使用されるための上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物。
55.糖尿病の治療用の上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物、あるいは糖尿病の治療用医薬の調製のための上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物。
56.上記の可能な生産物の項の何れか一つに記載の化合物の治療的な有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病の治療方法。
57.本願明細書に記載されている新規な特徴あるいは特徴の組合せ。
本明細書に引用する刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各文献が個々に且つ特定の形で参照により本明細書に包含されるとして示され、且つその内容全体が本明細書に開示されたように、参照によりその内容全体及び同じ範囲が(準拠法によって許される最大の範囲を限度として)本発明の開示に含まれる。
全ての表題及び副題は本明細書において、説明のためにのみ便宜上使用されるのであり、決して本発明を制限するものとして捉えられるべきではない。
本明細書で使用されたあらゆる実施例、又は例示表現(例えば「〜などの」)は、単に、本発明を理解し易く説明するために用いたのであり、特に断らない限り、本発明の技術範囲を制限するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、特許請求されない要素を本発明の実施に必須のものとして示すものではない。
本明細書における特許文献の引用及び援用は単に、本発明を理解し易くするために行なわれるのであり、決して、このような特許文献が持つ有効性、特許性、及び/又は強制力の側面を提示するためのものではない。本願明細書の参考文献の記載が、従来技術を構成することは許されない。
本願明細書において、「含む」なる言葉は、「備える」、「含有する」又は「包含する」を意味するものとして広義に解釈される(EPOガイドラインC4.13)。
本発明は、本明細書に添付する請求項において列挙される特許発明の主題の全ての変形物及び均等物を、準拠法によって許される範囲を限度として含む。
以下の実施例は、非限定的な具体例として提供される。
発現ベクター、イースト細胞の形質転換、及び本発明のインスリン前駆体の発現
C−POT型の全ての発現プラスミドは、EP171142に記載のものと類似しており、S. cerevisiaeのプラスミド選択及び安定化の目的において、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含むことによって特徴づけられる。また、プラスミドは、S. cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼ・プロモーター及びターミネーターを含む。これらの配列は、リーダーとインスリン生成物の融合タンパク質をコードするEcoRI−XbaI断片の配列以外の全ての配列について、プラスミドpKFN1003(WO90/10075に記載される)の対応配列と類似している。異なる融合タンパク質を発現するために、pKFN1003のEcoRI−XbaI断片は、単純に関心のリーダーインスリン融合をコードするEcoRI−XbaI断片と置き換えられる。当該EcoRI−XbaI断片は、基準技術に従って合成オリゴヌクレオチドおよびPCRを使用して合成されてよい。
イースト形質転換体は、宿主株S. cerevisiae菌株MT663の形質転換によって調製された(MATa/MATα pep4−3/pep4−3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir+)。イースト菌株MT663は、WO92/11378の出願に関連してDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託され、寄託番号DSM6278を与えられた。
形質転換のために、1mlのCAS−懸濁細胞は、約0.1mgのプラスミドDNAを混合され、15分間室温に置かれた。
1mlの(20%のポリエチレングリコール4000、10mMのCaCl2、10mMのTris HCl、pH=7.5)を加えて、混合物は室温で更なる30分間放置した。混合物は遠心分離し、ペレットを0.1のSOS(1.2Mのソルビトール、33%(v/v)YPD、6.7mMのCaCl2)に再懸濁し、30℃で2時間インキュベートした。次に、懸濁液は遠心分離し、ペレットは1.2Mのソルビトールの0.5mlに再懸濁された。次に、6mlの上層寒天(Sherman等(1982)Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor LaboratoryのSC培地、1.2Mのソルビトール及び2.5%寒天含有)を52℃で加え、懸濁液を同じ寒天凝固したソルビトール含有培地を含むプレートの上に流した。発現プラスミドによって形質転換したS. cerevisiae菌株MT663は、YPDにおいて30℃72時間増殖させた。
以下の実施例は、明細書及び実施例において同定される中間化合物及び最終生産物に関連する。本発明のアシル化インスリンアナログの調製は以下の実施例を使用して詳細に記載されているが、記載の化学反応及び精製スキームは本発明のインスリン誘導体の調製に対するそれらの一般的適用に関して開示される。場合により、本発明の開示された範囲の中に含まれる各々の化合物に記載されているとおり、反応が適用できないかもしれない。これが起こる化合物は当業者によって容易に認められるだろう。これらの場合、反応は、当業者に知られている従来修飾によって、すなわち干渉基の適切な保護によって、他の従来の試薬との交換によって、又は反応条件のルーチンの修飾によって、成功裏に実施できる。あるいは、本願明細書において開示される他の反応またはその他の従来のものは、本発明の対応する化合物の調製に適用できる。全ての準備方法において、全ての開始材料は公知であるか、又は当然知られている方法を使用している開始材料から容易に調製されることができる。全ての温度は摂氏度で記載され、特に明記しない限り、収率を記載する全ての割合及びパーセンテージは重量により記載され、溶媒と溶出剤を記載する割合は体積により記載される。
本発明のアシル化インスリンアナログは、当該分野で典型的である以下の手順の一つ以上を使用することによって精製することができる。これらの手順は ― 必要に応じて ― 勾配、pH、塩類、濃度、流速、カラムその他に関して変更することができる。不純物プロフィール、問題のインスリンの溶解性のような要因に応じて、これらの修飾は容易に認識され、当業者により作ることができる。
(II):Acy−AA1n−AA2m−AA3p−Act
[式中、Acy、AA1、AA2、AA3、n、m、及びpは上に定義の通りであり、ActはN-ヒドロキシスクシンイミド(OSu)または1-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのような活性エステルの脱離基であって、アシル部分内のカルボキシル酸はtert-ブチルエステルとして保護されている]
のアシル化試薬の固相合成のための一般的手順
本発明の一般式(II)の化合物は、固相ペプチド合成の分野の当業者によく知られている手順を使用して固体支持体上で合成することができる。この手順は、ポリスチレン2-クロロトリチルクロリド樹脂にFmoc保護されたアミノ酸を付加することを含む。付加は、例えば、トリエチルアミン又はN,N-ジイソプロピルエチルアミン(下記の文献を参照)のような第3アミンの存在下で、遊離N-保護アミノ酸を使用して達成することができる。このアミノ酸のC末端終端(樹脂に取り付けられる)は、本発明の親インスリンに結合された合成配列の終端にある。樹脂へのFmocアミノ酸の付加後、Fmoc基は、例えばピペリジンまたはジエチル・アミンのような第ニアミンを使用して脱保護され、続いて他の(または同じ)Fmoc保護されたアミノ酸の結合及び脱保護される。合成配列は、モノ-tert-ブチル保護された脂肪族(α,ω)二酸、例えばヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸又はエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルの結合によって終了する。樹脂から化合物の切断は0.5−5%のTFA/DCM(トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液)、酢酸(例えばCDM中の10%、HOAc/トリフルオロエタノール/DCM 1:1:8)、又はヘキサフルオロイソプロパノールのDCM溶液のような希釈された酸を使用して達成することができる(参照 "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Dorwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 又は "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, 及びそれらの引用文献)。これは化合物に存在するtert-ブチル・エステルについて、カルボキシル酸保護基が脱保護されないことを確実にする。最後に、例えば、(樹脂から遊離された)C末端カルボキシ基は、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(OSu)として活性化され、直接的に又は精製後に、本発明の親インスリンへの付加におけるカップリング試薬として使われる。この手順は、実施例4に例示される。
ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸又はエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルのようなモノ-tert-ブチル保護された脂肪族二酸は、例えば後述のようなOSuエステル又は当業者に公知の任意の他の活性化エステル(HOBt−又はHOAt-エステル)として活性化される。この活性化エステルは、THF、DMF、NMP(又は溶媒混合物)のような適切な溶媒中、適切な塩基(例えばDIPEA又はトリエチルアミン)の存在下で、アミノ酸AA1、モノ-tert-ブチル保護されたAA2、又はAA3の一つと結合することができる。例えば抽出手順によって又はクロマトグラフィー手順によって、中間体は単離される。結果として生じる中間体は、再度(上記の通り)活性化され、上記の通りアミノ酸AA1、モノ-tert-ブチル保護されたAA2、又はAA3の一つと結合される。所望の脱保護中間体Acy−AA1n−AA2m−AA3p−OHが得られるまで、この手順は繰り返される。これは、一般式(II) Acy−AA1n−AA2m−AA3p−Actのアシル化試薬を供給するために、次々に活性化される。この手順は、実施例9に例示される。
一般的手順(A)は次に概説され、最初の実施例に例示される:
実施例1、一般的手順(A):
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
このインスリンは、desB30ヒトインスリンの代わりに、A22K、B29R desB30ヒトインスリン使用しているWO2006/082205(実施例3)に記載されているインスリンと同様に調製された。
LC-MS (エレクトロスプレー); m/z: 1627 (M+4)+/4; 1302 (M+5)+/5
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30ヒトインスリン:
工程1:
ヘキサデカンニ酸tert-ブチルエステル2,5-ジ・オキソピロリジン-1-イルエステル(218mg、0.497mmol)はDCM(10mL)に溶解され、プロピルアミン−PEG−カルボキシル酸MW2000(NOF法人のSUNBRIGHT(登録商標)PA−20HC、1000mg、約0.497mmol)を添加し、混合物は一夜窒素下で撹拌された。反応混合物は、シリカゲルカラムへ移されてエタノール勾配(0−10%)を有するDCMによって溶出して、tert−ブチルヘキサデカンジオイルプロピルアミン−PEG−カルボキシル酸(MW2000)中間体を得る。
tert-ブチルヘキサデカンジオイルプロピルアミン-PEG-カルボン酸(MW2000)(72mg、0.031mmol)はTHF(4mL)に溶解され、DIPEA(6.3L、0.037mmol)及びTSTU(11.1mg、0.037mmol)を添加し、混合物は窒素下で一晩撹拌し、DMSO(1mL)を添加し、混合物にA22K、B29R desB30ヒトインスリン(180mg、0.031mmol)をトリエチルアミン(43L、0.31mmol)と共にDMSO(2mL)に溶解した溶液を加えた。混合物は氷上で冷却し、水(15mL)を加え、pHは1NのHClにより5.2に合わせ、次に1%のアンモニア水によりpH 7−8に調整した。混合物は、0.1%のTFAを含むアセトニトリル水溶液の35−75%勾配を使用して分取HPLCで精製された。分画はLC−MSで分析され、所望の生成物を含む分画はプールされ、真空中で溶媒を除去後、凍結乾燥した。凍結乾燥された物質は30分間のTFA/水 95:5によって処理され、溶媒は真空で除去された。粗生成物は陰イオン交換クロマトグラフィー(Ressource Qカラム,1 ml(Amersham Biosciences))を使用して精製し、42.5%EtOH,0.25%TRIS(pH7.5)中の酢酸アンモニウム(25CVにつき0.25%〜1.25%)の勾配により溶出し、続いてJupiterC4,5カラムを使用する分取HPLCで、0.1%TFA含有する30−70%アセトニトリル/水勾配により90分以上表記化合物を得るために溶出した。
HPLC-MS: m/z around 1360 (M+/6).
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(5-カルボキシペンタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
このインスリンは、desB30ヒトインスリンの代わりに、A22K、B29R desB30ヒトインスリン使用し、オクタン二酸モノ-tert-ブチルエステルの代わりにヘキサン二酸モノ-tert-ブチルエステルを使用して、WO2006/082205(実施例8)に記載されているインスリンと同様に調製された。
MALDI-TOF MS (マトリックス:シナピン酸); m/z: 6411.
MALDI-TOF MS (マトリックス:シナピン酸); m/z: 6581.
本インスリンの調製のためのアシル化試薬は以下のように調製した:
開始樹脂:2-クロロトリチル樹脂、1.60mmol/g
1.0gの樹脂は、DCM(10ml)で30分間膨張させた。
0.39g(0.63eq、1.0mmol)のFmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(Fmoc−OEG−OH)をDCM(15ml)に溶解し、樹脂に加えた。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(0.44ml、2.5mmol)は滴下で加えた。反応混合物は、30分間ボルテックスにかけ、次にメタノール(2ml)を添加し、混合物は更なる15分間ボルテックスにかけた。樹脂はろ過し、NMP(2×8ml)及びDCM(8×8ml)によって洗浄した。
20%のピペリジン/NMP(8ml)を添加して、10分間静置した。再度繰り返した。
ろ過し、NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)及びNMP(5×8ml)によって洗浄した。
陽性TNBSテストは、赤色樹脂を生じる。
0.78g(2eq、2.0mmol)のFmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸は、NMP/DCM 1:1(10ml)に溶解した。0.28g(2.2eq、2.4mmol)のHOSuを加え、続いて0.37ml(2.2eq、2.4mmol)のDICを追加した。反応混合物は1時間静置し、次に樹脂に加え、最後に0.407ml(2.2eq)のDIEAを加えた。混合物を16時間ボルテックスし、ろ過し、NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)及びNMP(5×8ml)によって洗浄した。
陽性TNBSテストは、無色の樹脂を生じた。
20%のピペリジン/NMP(10ml)を加え、10分間静置した。再度繰り返した。
ろ過し、NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)及びNMP(5×8ml)によって洗浄した。
陽性TNBSテストは、赤色の樹脂を生じた。
0.86g(2eq、2.0mmol)のFmoc−Glu−OtBuは、NMP/DCM 1:1(10ml)に溶解した。0.32g(2.2eq、2.4mmol)のHOBTを加え、続いて0.37ml(2.2eq、2.4mmol)のDICの追加した。反応混合物を20分間静置し、次に樹脂に移され、最後に0.407ml(2.2eq)のDIEAを添加した。混合物を16時間ボルテックスし、ろ過し、NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)及びNMP(5×8ml)によって洗浄した。
陽性TNBSテストは、無色の樹脂を生じた。
20%のピペリジン/NMP(10ml)を加え、10分間静置した。再度繰り返した。
ろ過し、NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)及びNMP(5×8ml)によって洗浄した。
陽性TNBSテストは、赤色の樹脂を生じた。
0.75g(2eq、2.0mmol)のオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステルは、NMP/DCM 1:1(10ml)に溶解された。0.32g(2.2eq、2.4mmol)のHOBTを加え、続いて0.37ml(2.2eq、2.4mmol)のDICを加えた。反応混合物を20分間静置し、次に樹脂に加え、最後に0.41ml(2.2eq)のDIEAを加えた。混合物を16時間ボルテックスし、ろ過し、NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)及びNMP(5×8ml)によって洗浄した。
8mlの5%TFA/DCMを樹脂に加え、混合物を2時間ボルテックスし、ろ過し、ろ液を収集した。さらに5%TFA/DCM(8ml)を樹脂に加え、混合物を10分間ボルテックスし、ろ過し、樹脂はDCM(2×10ml)で洗浄した。ろ液と洗浄液を混合したものを、約800ulのDIEAを使用してPHを塩基性に調製した。混合物は油(3.5g)を与えて真空で蒸発させた。ジエチル・エーテル(30ml)を加え、溶解しない油は、デカンテーションによって分離され、真空で蒸発させた。これは、1.1gの17-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシエトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸 tert-ブチルエステル (別名:Tert-ブチルオクタデカンジオイル−Glu(OEG−OEG−OH)−OTBU) を油として産出した。
LCM(Sciex100 API):m/z = 846.6(M+1)+。
上記のtert-ブチルオクタデカンジオイル−Glu(OEG−OEG−OH)−OTBU(0.63g)を、THF(35ml)に溶解した。DIEA(0.255ml,2eq.) 、続いてTSTU(0.45g,2eq.)が加えられ、混合物は16時間室温で撹拌された。
混合物は、酢酸エチル(250ml)と水性のNaHSO4(3×100ml)との間で分割された。有機相を乾燥し(MgSO4)、真空で濃縮し0.65gの17-((S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン二酸 tert-ブチルエステル(別名:tert-ブチルオクタデカンジオイル-Glu(OEG-OEG-OSu)-OTBU) を油として得た。
LC-MS: m/z = 943.4 (M+1)+.
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z = 1630, (M+4)+/4
A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B29R, desB30ヒトインスリン
MALDI-MS (マトリックス:シナピン酸); m/z: 6606
A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(オクタデカンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン
LC-MS (エレクトロスプレー): m/z = 1634, (M+4)+/4
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), desB29, desB30ヒトインスリン
63mgのA22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン(実施例4)はTrisバッファー、pH8(50mM、10ml)に溶解し、20%エタノール含有Trisバッファー、pH8(50mM、0.2mL)中セファロース・ゲルに固定化したカルボキシペプチダーゼBに加え、混合物は室温で16時間穏やかに振盪した。更に20%エタノール含有Trisバッファー、pH8(50mM、0.8mL)中のセファロースゲルに固定化したカルボキシペプチダーゼBを加え、24時間優しく振盪した。混合物はろ過され、フィルターは20%エタノール含有TrisバッファーpH8(50mM、0.8mL)で洗浄した。混合したろ液と洗浄液は凍結乾燥された。残留物は、表題のインスリンを得るために、HPLCによって精製された
MALDI-TOF MS: m/z = 6424
A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
アシル化試薬19-{1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカン酸 tert-ブチル エステルN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの調製及び親インスリンへの結合:
エイコサン二酸 tert-ブチルエステルN-ヒドロキシスクシンイミドエステル:
エイコサン二酸モノ−tert−ブチル・エステル(5g、12.54mmol)とTSTU(4.53g、15.05mmol)をTHF(50mL)中で混合し、DIPEA(2.62mL)を加えて、結果物の濁った混合物は2時間RTで撹拌され、次にDMF(30mL)を加え透明溶液を生じさせ、更に一晩撹拌した。結果として生じる混合物はほとんど乾燥するまで蒸発させ、残留物は冷却したアセトニトリルと混合させ、沈殿物の沈殿に結果としてなった。これはろ過され、一晩真空において乾燥し、6.01g(97%)のエイコサン二酸tert-ブチルエステルN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを得た。
MS (エレクトロスプレー): m/z: 440 (M-56 (tBu)).
エイコサン二酸tert-ブチルエステル2,5−ジオキソ−ピロリジン−1−イルエステル(6.01g、12.124mmol)をTHF(150mL)に溶解し、DMF/水(1/1、40ml)中でH−Glu−OtBu(2.71g、13.33mmol)のスラリーを混合させる。これはゲル状溶液に結果としてなり、加熱して透明溶液を得て、3時間RTで撹拌する。次に溶液を蒸発させ、100mLの水を加えて、混合物は60℃まで加熱され、溶液を生じさせ、冷却することで結晶化される。沈殿物はアセトニトリルから再結晶され、結晶は真空において乾燥した。収率6.82g(96%)。
MS (エレクトロスプレー): m/z 584 (M+1).
2-(19-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル 5-(2,5-ジオキソピロリジン-1-yl)エステル(6.52g、11.17mmol)はTHF(100ml)に溶解され、DIPEA(2.14ml)を加え、続いてTSTU(3.70g、12.29mmol)のアセトニトリル溶液(25mL)を加えた。混合物はRTで一晩撹拌し、次に蒸発させ、アセトニトリルから再結晶した褐色の残留物に結果としてなった。5℃で一晩冷却した後に、粉末が形成された。これはTHFに溶解され、MgSO4によって乾燥され、乾燥するまで蒸発させ、6.17g(81%)の表記化合物を得た。
MS(エレクトロスプレー):m/z:681(M+1)。
2-(19-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸1-tert-ブチル エステル 5-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) エステル (0.56g, 0.822 mmol) をTHF(20mL)に溶解し、3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオン酸(0.22g,0.82mmol)のTHF溶液(20mL)を加えられ、混合物は3時間RTで撹拌した。LCMSは反応が終了したことを示し(MS:m/z 831(M+1))、反応混合物がTSTUとの以下の反応のために直接用いられた。
19-{1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカン酸 tert-ブチル エステル (THF40mL中の0.68g粗溶液、0.82mmol)とTSTU(0.296g、0.982mmol)を混合し、pHはDIPEA(0.171mL)の添加により調製し、結果の混合物は一晩RTで撹拌した。これは透明溶液を生じ、乾燥まで蒸発させ、ジエチルエーテルにより処理し、1.2gの表記化合物をワックス状の塊として得て、それは更なる精製なしに使用した。
MS(エレクトロスプレー):m/z 816(M-2 tBu)(calcd. 816)。
A14E、A22K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン(0.3g、0.052mmol)をアセトニトリル(4ml)とNa2CO3(0.1M、10ml)の混合物に溶解し、pHはNaOH(1M)で10.6に調製した。 19-(1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニル)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ノナデカン酸 tert-ブチル エステル (0.048g,0.052 mmol)のアセトニトリル溶液(4mL)をこの溶液に加え、混合物を穏やかにRTで撹拌した。5滴のメチルアミン溶液(MeOH中40%)を加え、混合物は更に5分間撹拌された。次に酢酸(氷酢酸、5ml)を1部分加え、結果として生じる混合物は分取HPLC(C18、3cmのカラム、勾配0−7分の20%アセトニトリル、7−32分の20−100%アセトニトリル、32−37分の100%のアセトニトリル)によって精製された。
純粋な分画はプールされ、凍結は乾燥した。
結果として生じる化合物はTFA(30ml)に溶解され、RTで2時間撹拌された、次にアセトニトリル(20ml)と水(20ml)を加え、混合物は分取HPLC(C18、3cmカラム、勾配0−7分の20%アセトニトリル、7−32分の20−60 % アセトニトリル、32−37分の60%アセトニトリル)によって精製された。
純粋な分画はプールされ、凍結乾燥された。
HPLC(C18、3cmカラム、勾配0−7分の25%アセトニトリル、7−47分の25−60%アセトニトリル、47−52分の60%アセトニトリル)によって再精製され、純粋な分画はプールされ、凍結乾燥した。
これにより13mgの最終生産物を得た。
MS(エレクトロスプレー):m/z 6520(calcd.6520)。
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
MS (エレクトロスプレー): m/z: 6578 (Calcd:6578).
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
MALDI-TOF MS: m/z = 6615 (Calcd.: 6615).
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
MS(エレクトロスプレー):m/z = 1677(m+4)/4。
A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}プロピオニル)), B29R, desB30ヒトインスリン
MS (エレクトロスプレー): m/z = 6653 (Calcd.: 6653).
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)), B29R, desB30 ヒトインスリン
MALDI-TOF MS: m/z = 6535 (Calcd.: 6535)
A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
MS(エレクトロスプレー):m/z = 1667.9(m+4)/4。
A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
MALDI-TOF MS: m/z = 6824 (Calcd.: 6825)
A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)-γGlu), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
MALDI-TOF MS: m/z = 6620 (Calcd.: 6621)
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B28E, B29R, desB30ヒトインスリン
MALDI-TOF MS: m/z = 6610 (Calcd.: 6610)
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
MALDI-TOF MS: m/z = 6724 (Calcd.: 6724)
以下の実施例のインスリンは、類似した手順を使用して調製することができる:
A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30ヒトインスリン
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
A22K(Nε-エイコサンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30ヒトインスリン
A22K(Nε-エイコサンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30 ヒトインスリン
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R desB30ヒトインスリン
A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R desB30ヒトインスリン
A22K(Nε-テトラデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30ヒトインスリン
本発明のインスリン誘導体のインスリン受容体結合性
ヒトインスリン受容体に対する本発明のアシル化インスリンアナログの親和性は、SPAアッセイ(シンチレーション近接性アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕獲アッセイによって測定される。SPA−PVT抗体−結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences,CatNo.PRNQ0017)は25mlの結合バッファーと混合される(100mMのHEPES pH7.8;100mMの塩化ナトリウム、10mMのMgSO4、0.025%のTween−20)。単一のパッカードオプティプレート(Packard No.6005190)用の試薬ミックスは、2.4μlの1:5000希釈の精製組換えヒトインスリン受容体(エクソン11を有するものまたは有しないもののどちらか)、100μlの試薬混合物につき5000cpmに対応するA14Tyr[125I]−ヒトインスリンのストック溶液の量、12μlの1:1000希釈のF12抗体、3mlのSPA−ビーズ及び総量12mlまでの結合バッファーから成る。トータル100μlの試薬混合物は次にパッカードオプティプレートの各ウェルに加えられ、インスリン誘導体の希釈シリーズはオプティプレートにおいて適切な試料から作られる。試料は次に穏やかに振とうしながら、16時間インキュベートされる。次に、相は1分間の遠心によって分離され、プレートはTopcounterで計測される。結合性データは、GraphPad Prism2.01(GraphPad Software,San Diego,CA)の非線形回帰アルゴリズムを使用してフィットさせた。
本発明のインスリン誘導体のラットにおけるi.v.ボーラス注射後の血中グルコース低下効果
18時間絶食させた雄ウィスターラット(200−300g)は、Hypnorm−Dormicum s.c.(1.25mg/mlのドルミカム、2.5mg/mlのフルアニソン、0.079mg/mlのクエン酸フェンタニル)をプライミング投与量として2ml/kgを使用して(試験物質の投与の30分前の時点)、さらに20分ごとに1ml/kgの追加を使用して、麻酔をかける。
動物は、1ml/kgの対照と試験化合物(通常用量範囲0.125−20nmol/kg)を静注(尾静脈)で投与される。全血グルコース濃度の決定のための血液サンプルは(投与前)−20分及び0分に、並びに投与後の時間10、20、30、40、60、80、120、及び180分に、尾部の毛細血管穿刺によって、ヘパリン添加10μlガラス管に収集される。
血中グルコース濃度は、EBIO Plus autoanalyzer(エッペンドルフ、ドイツ)を使用して、固定化グルコースオキシダーゼ法によって、解析バッファーへの希釈後に測定される。平均血漿グルコース濃度コース(平均±SEM)は、各量及び各化合物について作られる。
ヒトインスリンに比較した本発明のアシル化されたインスリンアナログの効力
実験日に体重238−383gになっているスピローグ・ドーリー雄ラットがクランプ実験のために使われる。ラットは制御された周囲条件下で餌に自由にアクセスでき、クランプ実験より前に(午後3時から)絶食させる。
実験プロトコル:
ラットは、外科的処置の少なくとも1週間前に動物設備に順応させる。クランプ実験の約1週前に、Tygonカテーテルを(注入のための)頸静脈と(採血のための)頸動脈にハロタン麻酔下で挿入し、外面化し、首の裏に固定する。ラットは、Streptocilin vet.(Boehringer Ingelheim; 0.15ml/ラット, i.m.)を術後に与えられ、回復期間中、動物ケアユニット(25℃)に置かれる。無痛にするために、Anorphin(0.06mg/ラット、s.c.)が麻酔中投与され、Rimadyl(1.5mg/kg、s.c.)は麻酔(2−3h)から完全に回復した後に、及びさらに1日1回2日間投与される。
実験日の午前7時に、(前日午後3時から)一晩の絶食させたラットは体重を計測され、サンプリングシリンジ及び注入システム(ハーバード22ベーシックポンプ、ハーバード、及びPerfectum皮下注射ガラスシリンジ、アルドリッチ)をつなぎ、次に
実験のスタート前に約45分間休んだ個々のクランプケージに入れられる。ラットは、全実験の間それらの通常の寝床で自由に動くこと、飲料水を自由に摂取することが可能である。血漿グルコース濃度が10分間隔で測定された30分の基礎期間後、試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリン(ラットにつき1用量レベル、用量レベルにつきn=6−7)は、300分間の一定速度で注入される(i.v.)。
血漿グルコース濃度は終始10分間隔で測定され、20%のグルコース水溶液の注入は正常血糖を維持するために調整される。再懸濁された赤血球の試料は、各々のラットからプールされて、頸動脈のカテーテルを介して1/2ml体積について戻された。
各実験日に、試験される個々のインスリン誘導体の溶液とヒトインスリン溶液の試料はクランプ実験の前と終わりに取り出され、ペプチド濃度はHPLCによって確認される。ラットインスリン及びC−ペプチド、同様に試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリンの血漿中濃度は、研究の前及び終わりの適切な時点で試験される。ラットは、ペントバルビタールオーバードースにより実験終了後死亡させた。
ラットに対するインスリン誘導体の肺送達
試験物質は滴下注入法によって肺投与される。簡単に言うと、雄ウィスターラット(約250 g)は、約60mlのフェンタニル/デヒドロベンズペリドール/ドルミカムを6.6ml/kgのscプライミング投与量として麻酔され、続いて30分間隔で3.3ml/kg scの3回維持量を投与される。
麻酔誘導の10分後に、基礎試料は尾静脈(t=−20分)から採られ、続いて試験物質投与(t=0)の直前に基礎試料が採られる。t=0で、試験物質は、一方の肺内に気管内に投与される。丸い終末を有する特別なカニューレは、200μlの空気及び試験物質(1ml/kg)を含むシリンジに載置する。開口部を経て、カニューレは気管に導入され、主な気管支のうちの1つに進められ、ちょうどbifurcatureを通過する。挿入の間、気管内の位置を確実にするために、首は外部から触診される。シリンジの内容は2秒の休止に続いて射出される。その後、カニューレはゆっくり引き戻される。ラットは、テスト(血液サンプルのため、4又は8時間まで)の間麻酔されたままであり、実験後に安楽死する。
配列番号1は、実施例1−6、8、12−14、18及び19のA1−A21鎖である。
配列番号2は、実施例1−6、10−14及び19のB1−B29鎖である。配列番号3は、実施例7、9及び15−17のA1−A21鎖である。配列番号4は、実施例7、9及び15−17のB1−B29鎖である。配列番号5は、実施例10のA1−A21鎖である。配列番号6は、実施例11のA1−A21鎖である。配列番号7は、実施例18のB1−B29鎖である。配列番号8は、実施例8のB1−B28鎖である。
Claims (6)
- A21アミノ酸残基のC末端に結合するリジン残基を含むインスリンアナログか又はリジン残基を含む最大4アミノ酸残基のペプチド残基がA21アミノ酸残基のC末端に結合するインスリンアナログであるアシル化インスリンアナログであって、アシル部分がA22位置のリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分か又はA21アミノ酸残基のC末端終端に取り付けられたペプチド残基に存在するリジン残基に取り付けられたアルキレングリコール部分を含み、インスリンアナログには1つのみのリジン(K、Lys)が存在することを特徴とするアシル化インスリンアナログ。
- アシル部分は一般式I:
Acy−AA1n−AA2m−AA3p−(I)、
[式中、nは0または範囲1−3の整数であり、mは0又は範囲1−6の整数であり、pは1、2または3であり、
Acyは形式的に脂肪酸のカルボキシ基から又は脂肪族二酸のカルボキシ基の一つから水酸基を除去された、約8−24の炭素原子を含む脂肪酸又は脂肪族二酸であり、
AA1は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された中性環状アミノ酸であり、
AA2は形式的にアミノ基から水素原子を除去され、カルボキシ基から水酸基を除去された酸性アミノ酸であり、
AA3は形式的にアミノ基から水素原子が除去され、カルボキシ基から水酸基が除去された中性アルキレングリコール含有アミノ酸であり、
AA1、AA2及びAA3が式に現れる順番は、独立に交換することができ、
Acy、AA1、AA2および/またはAA3の間の結合は、アミド(ペプチド)結合である]であって、親インスリンへの取り付けは式(I)のアシル部分のAA1、AA2、又はAA3残基のC末端終端または式(I)の部分に存在するAA2残基の側鎖の1つから行われる請求項1に記載のアシル化インスリンアナログ。 - A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(5-カルボキシペンタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(オクタデカンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B29R, desB30 ヒトインスリン; A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(オクタデカンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), desB29, desB30 ヒトインスリン; A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}プロピオニル)), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)), B29R, desB30 ヒトインスリン; A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; A14E, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; A14E, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル)-γGlu), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B28E, B29R, desB30 ヒトインスリン; 22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A14E, A22K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(エイコサンジオイル-γGlu)アミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]), B25H, B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-エイコサンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-オクタデカンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-イルアセチル)), B29R desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-エイコサンジオイル-(2-アミノエチル-PEG2000-ylアセチル)), B29R desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γGlu), B29R desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-テトラデカンジオイル-(3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)プロピオニル-γGlu), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A18L, A22K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A18L, A22K(Nε-エイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ] アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン;
A18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン; A8H, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリン及びA18L, A22K(Nε-ヘキサデカンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル), B29R, desB30 ヒトインスリンの何れか1つの化合物である、請求項1から5の何れか一項に記載のアシル化インスリンアナログ。
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