TW201838647A - 對胰島素受體有降低親和性之胰島素類似物之接合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關於胰島素類似物接合物及其用途。

Description

對胰島素受體有降低親和性之胰島素類似物之接合物及其用途
本發明係有關於胰島素類似物之接合物及其用途。
已知體內蛋白質係藉各種途徑移除，包括藉血中蛋白酶分解、經腎臟排泄、藉受體移除等。就此方面而言，曾經作各項嘗試，試圖藉由避開蛋白質清除機轉，透過延長生理蛋白質之半生期而改良蛋白質的療效。
概略言之，胰島素是一種由人體胰臟分泌的激素，其調節血中葡萄糖濃度，且具有維持正常血中葡萄糖濃度，同時攜載血中過量葡萄糖至細胞以提供能源給細胞的角色。然而，於糖尿病患者，因缺乏胰島素、胰島素抗性、及喪失β細胞功能所致，胰島素未能適當地發揮功能。結果，糖尿病患者無法利用血中葡萄糖作為能源，反而顯示出帶有高血中葡萄糖濃度之高血糖症狀，且於尿液中排泄葡萄糖，變成了各項併發症的起因。因此，胰島 素療法乃具有胰島素異常生產(第I型)或胰島素抗性(第II型)的患者所必需，而血中葡萄糖濃度可藉胰島素之投藥而予正常地調節。
然而，如同其它蛋白質激素及肽激素，胰島素具有極短的活體內半生期，因而未能顯現連續療效。因此，為了發揮其功效，必須重複地投藥胰島素。如此頻繁地投藥，給患者造成嚴重疼痛與不適，因此從患者順從性、安全性、及便利性觀點，需要改善投藥。
據此，研究工作聚焦在發展各種蛋白質調配物、化學接合物(例如，脂肪酸接合物)等，透過延長此等蛋白質藥物諸如胰島素的活體內半生期，減少投藥頻率，而改良療效，以及改善患者的生活品質。
根據先前報告，50%或以上之胰島素係在腎臟移除，而其餘者係在標的部位(諸如肌肉、脂肪、肝臟等)透過受體媒介廓清(RMC)程序而被移除。
就此方面而言，曾經報告[J Pharmacol Exp Ther(1998)286：959；糖尿病照護(Diabetes Care)(1990)13：923；及糖尿病(Diabetes)(1990)39：1033等]降低活體外活性以避免胰島素的RMC，藉此提高血中胰島素濃度。然而，於J Pharmacol Exp Ther(1998)286：959，糖尿病照護(Diabetes Care)(1990)13：923中，提出的胰島素類似物具有至少兩個胺基酸取代，或未提供特異性結果；而於糖尿病(Diabetes)(1990)39：1033中，胰島素類似物並未顯示其對受體之結合親和性的任何改變，或藉由取代直接地 涉及結合到胰島素受體的胺基酸而其活性降低。換言之，仍然需要發展具有增加的持續時間的胰島素類似物。
本發明之目的係提供胰島素類似物之接合物。
本發明之另一目的係提供編碼該接合物之多核苷酸；包括該多核苷酸之載體；及包括該多核苷酸或含該多核苷酸之載體的轉形株。
本發明之又另一目的係提供該接合物之製備方法。
本發明之又另一目的係提供包括該胰島素類似物之接合物的組成物，例如，醫藥組成物。
本發明之又另一目的係提供較天然胰島素之接合物增加的活體內持續時間及/或提高的安定性之長效調配物，其包括該胰島素類似物之接合物。
本發明之又另一目的係提供用於預防或治療胰島素相關疾病例如糖尿病之醫藥組成物，其包含該胰島素類似物之接合物。
本發明之又另一目的係提供用於治療胰島素相關疾病例如糖尿病之方法，其包括將該胰島素類似物之接合物或其組成物投藥有需要的患者之步驟。
本發明之又另一目的係提供該胰島素類似物之接合物用於藥物之製備之用途。
本發明之又另一目的係提供該胰島素類似物之接合物用於胰島素相關疾病，特別是糖尿病之治療之用途。
為了達成以上目的，本發明之一態樣提供胰島素類似物接合物。
更明確言之，本發明之一態樣提供一種由下式1表示之接合物：[式1]X-La-F
其中於式1中，X為其包含選自於由下列所組成之組群中之一或多個胺基酸之修飾的胰島素類似物：天然胰島素的B鏈之第16個胺基酸、B鏈之第25個胺基酸、A鏈之第14個胺基酸、及A鏈之第19個胺基酸；L為連結基；a為0或自然數，但限制條件為當a為2或以上時，各個L係彼此獨立無關；及F為能够增加X的半生期之物質。
於一具體實施例中，X包含選自於由下列所組成之組群中之一或多個修飾：天然胰島素的B鏈之第16個胺基酸，酪胺酸，修飾成麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸；天然胰島素的B鏈之第25個胺基酸，苯丙胺酸，修飾成天冬胺酸或麩胺酸；天然胰島素的A鏈之第14 個胺基酸，酪胺酸，修飾成組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸；及天然胰島素的A鏈之第19個胺基酸，酪胺酸，修飾成麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸。
於另一具體實施例中，X為其包含通式2中指示的SEQ ID NO：55之A鏈及通式3中指示的SEQ ID NO：56之B鏈之所有組合的胰島素類似物(但限制條件為天然胰島素係被排除，即其中A鏈符合SEQ ID NO：53而B鏈也符合SEQ ID NO：54的肽係被排除)：[通式2]Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO：55)
其中於通式2中，Xaa1為丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、麩胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa5為丙胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa12為丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa14為酪胺酸、組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸；Xaa16為丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸；及 Xaa21為天冬醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、或丙胺酸；及[通式3]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO：56)
其中於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸；Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸；Xaa27為蘇胺酸或為不存在；及Xaa28為脯胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸、或為不存在。
於又另一具體實施例中，X包含於通式2中指示的SEQ ID NO：55之A鏈及SEQ ID NO：54之B鏈。
於又另一具體實施例中，X包含SEQ ID NO：53之A鏈及於通式3中指示的SEQ ID NO：56之B鏈。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸、組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬 胺酸，Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、或絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，X之特徵在於：(1)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為組胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(2)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為離胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(3)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為麩胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16 為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(4)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(5)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(6)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為麩胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(7)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為絲胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(8)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19 為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為蘇胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(9)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為丙胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(10)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(11)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(12)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為天冬胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(13)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸， Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，X為包含選自於由SEQ ID NO：28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、及52所組成的組群中之胺基酸序列的胰島素類似物。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為麩胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1 為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為天冬胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
於又另一具體實施例中，F係選自於由下列所組成之組群：聚合物、脂肪酸、膽固醇、白蛋白及其片段、白蛋白結合材料、特定胺基酸序列之重複單元的聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合材料、活體內結締組織、核苷酸、纖維連接蛋白、轉鐵蛋白、醣、肝素、及彈性蛋白。
於又另一具體實施例中，該聚合物係選自於由下列所組成之組群：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物分解聚合物、脂質聚合 物、甲殼素、玻尿酸、寡核苷酸、及其組合。
於又另一具體實施例中，F為免疫球蛋白Fc區。
於又另一具體實施例中，F為IgG Fc區。
於又另一具體實施例中，L係選自於由下列所組成之組群：肽、脂肪酸、醣、聚合物、低分子量化合物、核苷酸、及其組合。
於又另一具體實施例中，該聚合物係選自於由下列所組成之組群：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物分解聚合物、脂質聚合物、甲殼素、玻尿酸、寡核苷酸、及其組合。
於又另一具體實施例中，L為聚乙二醇。
於又另一具體實施例中，該聚合物具有1kDa至100kDa之分子量。
於又另一具體實施例中，該連結基係連結至胰島素類似物之B鏈的N末端或胰島素類似物中之離胺酸殘基。
於又另一具體實施例中，F為免疫球蛋白Fc區及該連結基係連結至免疫球蛋白Fc區的N末端。
於又另一具體實施例中，F為免疫球蛋白Fc區及該接合物具有於其中該連結基的兩端係連結至胰島素類似物之B鏈的N端及免疫球蛋白Fc區的N端之結構式。
於又另一具體實施例中，相較於天然胰島素，該胰島素類似物為於其中對天然胰島素受體的結合親和性為降低者。
於又另一具體實施例中，相較於天然胰島素之結合親和性，該胰島素類似物對天然胰島素受體之結合親和性為約10%至約90%。
於又另一具體實施例中，該接合物之特徵在於F為免疫球蛋白Fc區，L為聚乙二醇，及相較於天然胰島素之結合親和性，該接合物對天然胰島素受體之結合親和性為0.1%至50%。
於又另一具體實施例中，該接合物之特徵在於F為免疫球蛋白Fc區，L為聚乙二醇，及X為具有與天然胰島素相同的序列但A鏈之第14個胺基酸為天冬胺酸的胰島素類似物。
本發明之另一態樣提供一種編碼該接合物之多核苷酸；一種包括該多核苷酸之載體；及一種包括該多核苷酸或含該多核苷酸之載體的轉形株。
本發明之又另一態樣提供一種用於製備該接合物之方法。
本發明之又另一態樣提供一種包括該接合物之組成物。
於一具體實施例中，該組成物為醫藥組成物。
於另一具體實施例中，該組成物為用於預 防或治療胰島素相關疾病之醫藥組成物。
於又另一具體實施例中，該組成物為用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物。
本發明之又另一態樣提供一種相較於天然胰島素之接合物具有增加的活體內持續時間及/或安定性之長效調配物，其包括該胰島素類似物之接合物。
本發明之又另一態樣提供一種用於治療胰島素相關疾病之方法，其包括將該胰島素類似物之接合物或其組成物投藥有需要的患者之步驟。
於一具體實施例中，該胰島素相關疾病為糖尿病。
本發明之又另一態樣提供一種胰島素類似物之接合物用於藥物之製備之用途。
於一具體實施例中，該藥物係用於胰島素相關疾病之預防或治療。
於另一具體實施例中，該藥物係用於糖尿病之預防或治療。
本發明之又另一態樣提供一種胰島素類似物之接合物用於治療胰島素相關疾病，特別是糖尿病之用途。
本發明之非天然胰島素類似物接合物可改良有胰島素投藥需求的患者的順從性。
第1圖顯示藉蛋白質電泳分析胰島素類似物之純度的結果，及特定言之，代表性胰島素類似物9、10、11、及12的結果(泳道1：片段大小標記；泳道2：天然胰島素；泳道3：胰島素類似物9；泳道4：胰島素類似物10；泳道5：胰島素類似物11；及泳道6：胰島素類似物12)。
第2a至2d圖顯示藉高壓層析術分析胰島素類似物之純度的結果，及特定言之，結果係按代表性胰島素類似物9、10、11、及12的順序排列(第2a至2d圖)。於各圖中，RP-HPLC(C18)、RP-HPLC(C4)、及SE-HPLC的結果係從頂至底依序顯示。
第3a至3c圖顯示於正常小鼠(第3a圖)、SD大鼠(第3b圖)、及米格魯犬(第3c圖)在「胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物」(其為代表性本發明之胰島素類似物接合物)與「天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物」(其為天然胰島素接合物)間之藥物動力學特徵的比較結果。
第4圖顯示於DIO/STZ大鼠在「胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物」(其為本發明之代表性胰島素類似物接合物)與「天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物」(其為天然胰島素接合物)間之血中葡萄糖濃度降低能力的比較結果。
[較佳實施例之詳細說明]
後文中，將以細節描述本發明之具體實施例。
同時，本文中揭示的該等解說及具體實施例中之各者可適用至其它解說及具體實施例。換言之，本文中揭示的各項因素的全部組合皆係屬本發明之範圍。又復，本發明之範圍不應受下文中提供的特定揭示內容所限。
此外，基於常規實驗，熟悉該領域技術之人員將能認知或確認於本案中描述的本發明之特定實施例的許多均等物，及此等均等物係意圖涵括於本發明。
全文說明書中，使用習知用於胺基酸的1-字母代碼及3-字母代碼。此外，本文中以縮寫述及的胺基酸係根據IUPAC-IUB規則描述。
本發明之一態樣提供一種胰島素類似物接合物。
更明確言之，胰島素類似物接合物可呈接合物形式，於其中胰島素類似物係連結到生物相容性材料，用以增加該胰島素類似物的活體內半生期。於本發明中，生物相容性材料可與載劑互換使用。
於本發明中，相較於未接合到載劑的胰島素類似物，胰島素類似物接合物可展現增加的功效持續時間，及於本發明中，此種接合物被稱作為「長效接合物」。
同時，此種接合物可以是非天然發生的接合物。
更明確言之，本發明提供一種由下式1表示之接合物： [式1]X-La-F
其中於式1中，X為其包含選自於由下列所組成之組群中之一或多個胺基酸之修飾的胰島素類似物：天然胰島素的B鏈之第16個胺基酸、B鏈之第25個胺基酸、A鏈之第14個胺基酸、及A鏈之第19個胺基酸；L為連結基；a為0或自然數，但限制條件為當a為2或以上時，各個L係彼此獨立無關；及F為能够增加X的半生期之物質。
如於本文中使用，術語「胰島素類似物」係指與天然胰島素不同的非天然胰島素。胰島素類似物包括與天然人類胰島素不同的非天然人類胰島素。胰島素類似物為組成本發明之接合物的部分，及對應於式1中之X。
此種胰島素類似物包括於其中天然胰島素之若干胺基酸係藉添加、刪除、或取代而予以修飾的類似物。
更明確言之，相較於天然胰島素序列之序列相同性，本發明之胰島素類似物可具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%之序列相同性。此外，當對於天然胰島素序列具有 前述的序列相同性時，本發明之胰島素類似物相較於天然胰島素者對於天然胰島素受體可具有較低的結合親和性。此外，如天然胰島素中顯示，胰島素類似物可具有葡萄糖吸收能力及/或降低活體內血中葡萄糖濃度之能力。
於本發明中，任何胰島素類似物對於天然胰島素受體的結合親和性，係指當結合抑制程度在受體結合的競爭性抑制條件下測量時，其中任何檢測劑配位體對於天然胰島素受體的結合於天然胰島素或對應該天然胰島素的胰島素類似物之存在下係受抑制，於胰島素類似物及於天然胰島素中所呈現的結合抑制作用之百分比。結合抑制作用可被間接地定義為經測量以判定信號是否有效地改變之值，該等信號係根據適當標準因胰島素受體之配位體結合所致而顯示者。舉例言之，結合親和性可藉測量多少信號被增加或減少所獲得的測量值百分比(例如，天然胰島素之IC50對其對應的胰島素類似物之IC50的百分比)加以界定；換言之，當以放射性同位素加標記的胰島素結合至胰島素受體時，由此標記所產生的信號係經測量以判定，於添加未加標記的天然胰島素或未加標記的胰島素類似物之後，該等信號各自被減少或增加的量(例如，藉由測量天然胰島素或胰島素類似物的信號減低之IC50值)。此種透過競爭性抑制的受體之結合親和性的測量為業界眾所周知。於本發明之一具體實施例中，至於此種測量要求的天然胰島素受體，可運用表達人類天然胰島素受體(A同功型或B同功型、或二者)之細胞膜，例如，已經經由遺傳工程 方法操控以過度表達人類天然胰島素受體的細胞的細胞膜。此外，至於檢測劑配位體，可使用以碘-125加標記的天然胰島素。於本發明之一更特定實施例中，閃爍鄰近性分析試驗(SPA)可用來測量受體結合的競爭性抑制作用。於本發明之又一特定實施例中，對於胰島素受體的結合親和性可使用實驗例1中描述之方法測定。
更明確言之，相較於天然胰島素對胰島素受體的結合親和性(100%)，本發明之胰島素類似物對於胰島素受體的結合親和性可具有約99%或以下、約95%或以下、約90%或以下、約85%或以下、約80%或以下、約75%或以下、約70%或以下、約65%或以下、約60%或以下、約55%或以下、約50%或以下、約45%或以下、約40%或以下、約35%或以下、約30%或以下、約25%或以下、約20%或以下、約15%或以下、約10%或以下、約9%或以下、約8%或以下、約7%或以下、約6%或以下、約5%或以下、約4%或以下、約3%或以下、約2%或以下、約1%或以下、或約0.1%或以下(然而，本發明之胰島素類似物對胰島素受體的結合親和性並不相當於0%)。於本發明之一特定具體例中，胰島素類似物對於胰島素受體的結合親和性適合地為約10%至約90%，但其值並非受此所限。此外，若該結合親和性相對於天然胰島素之結合親和性為弱，則該胰島素類似物係落入於本發明之範圍內。若該結合親和性比天然胰島素之結合親和性更弱，則該胰島素類似物藉胰島素受體的移除被弱化，因而可預期改良的血中半生期以及 功效的持續性。
於本發明之一具體例中，於胰島素類似物接合物中，連結基可以是聚乙二醇；能增加半生期之物質可以是免疫球蛋白Fc區；及相較於天然胰島素的結合親和性，對天然胰島素受體的結合親和性可以是約99%或以下、約95%或以下、約90%或以下、約85%或以下、約80%或以下、約75%或以下、約70%或以下、約65%或以下、約60%或以下、約55%或以下、約50%或以下、約45%或以下、約40%或以下、約35%或以下、約30%或以下、約25%或以下、約20%或以下、約15%或以下、約10%或以下、約9%或以下、約8%或以下、約7%或以下、約6%或以下、約5%或以下、約4%或以下、約3%或以下、約2%或以下、約1%或以下、或約0.1%或以下(然而，本發明之胰島素類似物接合物對於胰島素受體的結合親和性並不相當於0%)。於本發明之一特定具體例中，胰島素類似物接合物對於天然胰島素受體的結合親和性適合地為0.1%至50%，但其值並非受此所限。此外，若該結合親和性相較於天然胰島素之結合親和性為弱，則其係落入於本發明之範圍內。若該結合親和性比天然胰島素之結合親和性更弱，則該胰島素類似物接合物藉胰島素受體的移除被弱化，因而可預期改良的血中半生期以及功效的持續性。
如於本文中使用，術語「約」係指涵括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等之範圍，因而包括相等於或相似於根據此術語所述之範圍的全部數值，但並非受此所限。
此外，如天然胰島素顯示，本發明之胰島素類似物可具有葡萄糖攝取能力。
更明確言之，相對於天然胰島素之葡萄糖攝取能力(100%)，依據本發明之胰島素類似物可具有葡萄糖攝取能力為約10%或以上、約20%或以上、約30%或以上、約40%或以上、約50%或以上、約55%或以上、約60%或以上、約65%或以上、約70%或以上、約75%或以上、約80%或以上、約85%或以上、約90%或以上、約95%或以上、約100%或以上、約110%或以上、約120%或以上、約130%或以上、約140%或以上、約150%或以上、約160%或以上、約170%或以上、約180%或以上、約190%或以上、或約200%或以上。
葡萄糖攝取能力之測量可使用業界已知之用於量測葡萄糖攝取能力的各種方法達成。
特定言之，胰島素類似物可以是單鏈，於其中對應於其天然形式的A鏈及B鏈之二序列區之各者係連結於一個多肽鏈；或者可以呈二多肽鏈形式，於其中二序列區各自係由個別多肽鏈組成。後文中，當於本說明書中述及胰島素類似物的A鏈或B鏈時，須取決於下述情況而予解譯：當對應的胰島素類似物係呈二多肽鏈形式時，其係指A鏈或B鏈；及其分別地係指對應於在對應單鏈多肽中之天然A鏈的一序列區，或係指對應於在對應單鏈多肽中之天然B鏈的一序列區，即使當類似物係呈單鏈形式時亦復如此。本發明之胰島素類似物可呈單鏈形式或可呈 二多肽鏈形式，為其中之一鏈選自於天然胰島素的A鏈或其對應多肽及一鏈選自於天然胰島素的B鏈或其對應多肽的組合。特別地，對應於天然胰島素之A鏈或B鏈可指下述情況，舉例言之，於其中相較於天然胰島素之A鏈或B鏈，該等二多肽鏈之任一個多肽鏈具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%之序列相同性，但並非特別地受此所限，及藉由組成對應多肽之序列與天然胰島素之A鏈或B鏈之序列間之比較，熟諳技藝人士將能容易地判定之。
如前文描述，本文中揭示的內容意圖適用至胰島素類似物的子構想的全部相關描述。
天然胰島素乃由胰臟分泌的激素，通常具有促進細胞內葡萄糖攝取及抑制脂肪分解的角色，藉此調控活體內血中葡萄糖濃度。能够調控血中葡萄糖濃度的胰島素係從其前驅物(胰島素原，其不具有調控血中葡萄糖濃度的功能)的處理過程產生。胰島素係由二多肽鏈組成，亦即，A鏈及B鏈，其分別含有21個及30個胺基酸，且由兩個雙硫鍵互連。A鏈及B鏈中之各者可包括由下示SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：54表示的胺基酸序列。
A鏈：Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：53)
B鏈： Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：54)
於一具體實施例中，本發明中描述的胰島素類似物可以是對受體具有降低的結合親和性，同時類似天然胰島素，具有調控活體內血中葡萄糖濃度之功能者。更明確言之，胰島素類似物可具有降低活體內血中葡萄糖濃度的能力。
此外，於一具體實施例中，胰島素類似物的種類及大小可能不受特殊限制，只要其具有減低的受體媒介之內化或減低的受體媒介廓清率即可。據此，相較於天然胰島素，本發明之胰島素類似物可具有改良之血中半生期。
本發明之胰島素類似物包括倒置胰島素、天然胰島素衍生物、天然胰島素片段等。胰島素類似物不僅可藉基因重組法製備，同時也可藉固相合成製備，及製備方法並非受此所限。
如於本文中使用，術語「天然胰島素衍生物」係指相較於天然胰島素之胺基酸序列，具有至少一個胺基酸序列差異的肽；藉修飾天然胰島素序列製備的肽；及如同天然胰島素，可調控活體內血中葡萄糖濃度的天然胰島素模擬物。此種天然胰島素之衍生物可以是具有調控活體內血中葡萄糖濃度之功能者。
更明確言之，天然胰島素之衍生物可於天 然胰島素之胺基酸的一部分藉取代、添加、刪除、修飾中之任一種方法或該等方法之組合，透過修飾而予以製備。
更明確言之，天然胰島素之衍生物與天然胰島素之A鏈及B鏈之胺基酸序列中之各者具有80%或更高的同源性；及/或胺基酸殘基中之基團的一部分可藉化學取代(例如，α-甲基化、α-羥基化)、刪除(例如，去胺化)、或修飾(例如，N-甲基化)等加以修飾，但非受此所限。
本發明中應用的天然胰島素之衍生物可藉用於製備衍生物之各種方法的組合加以製備。
此外，用於製備天然胰島素之衍生物的此種修飾包括：使用L型或D型胺基酸、及/或非天然胺基酸之修飾；及/或天然序列之修飾或轉譯後修飾(例如，甲基化、醯基化、泛素化、分子間共價鍵等)。
此外，天然胰島素之衍生物全部皆涵括於其中一個或多個胺基酸添加至天然胰島素的胺基端及/或羧基端者。
至於胺基酸之取代或插入，不僅可使用人類蛋白質中習見的20個胺基酸，同時也可使用非典型胺基酸或非天然胺基酸。非典型胺基酸之商業來源可包括西格瑪-亞利胥(Sigma-Aldrich)、化學製備(ChemPep)、琴載藥物(Genzyme pharmaceuticals)等。含此等胺基酸之肽序列及典型肽序列可由商業肽合成公司合成或購得，諸如美國肽公司(American Peptide Company)、拜肯(Bachem(USA))、及恩琴(Anygen(韓國))，但非特別受此所限。
如於本文中使用，術語「天然胰島素之片段或天然胰島素之衍生物之片段」係指於其中在天然胰島素或天然胰島素衍生物的胺基端及/或羧基端的至少一個胺基酸被移除的胰島素形式。此種胰島素片段可具有調控活體內血中葡萄糖濃度的功能。
此外，本發明之胰島素類似物可以是獨立地或組合地使用用於製備天然胰島素之衍生物及片段之方法所製備者。
特定言之，依據本發明之胰島素類似物可包括前文描述的天然胰島素之A鏈及B鏈具有修飾者，更特定言之，於其中天然胰島素之A鏈的特定胺基酸殘基係經修飾者及/或於其中天然胰島素之B鏈的特定胺基酸殘基係經修飾者。
特定言之，胰島素類似物可以是於其中胺基酸(其係選自於由下列所組成之組群：天然胰島素的B鏈之第16個胺基酸、B鏈之第25個胺基酸、天然胰島素的A鏈之第14個胺基酸、及A鏈之第19個胺基酸)中之至少一個修飾係以不同的胺基酸取代者；及更明確言之，其可以麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、組胺酸、離胺酸、或丙胺酸取代，但非受此所限。
更明確言之，胰島素類似物可以是於其中前文描述的胺基酸中至少一個、至少二個、至少三個、或四個胺基酸係以其它胺基酸取代者。
更明確言之，修飾可以是胰島素B鏈之第 16個胺基酸(亦即，酪胺酸)修飾成麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸；胰島素B鏈之第25個胺基酸(亦即，苯丙胺酸)修飾成天冬胺酸或麩胺酸；胰島素A鏈之第14個胺基酸(亦即，酪胺酸)修飾成組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸；或胰島素A鏈之第19個胺基酸(亦即，酪胺酸)修飾成麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸。
因此，胰島素類似物可包括天然胰島素B鏈之第16個胺基酸(亦即，酪胺酸)修飾成麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸；及/或天然胰島素B鏈之第25個胺基酸(亦即，苯丙胺酸)修飾成天冬胺酸或麩胺酸；及/或天然胰島素A鏈之第14個胺基酸(亦即，酪胺酸)修飾成組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸；及/或天然胰島素A鏈之第19個胺基酸(亦即，酪胺酸)修飾成麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸，但非受此所限。
更明確言之，胰島素類似物可以是包括由如下通式2表示之SEQ ID NO：55的A鏈及由如下通式3表示之SEQ ID NO：56的B鏈者。此等胰島素類似物可呈A鏈及B鏈由雙硫鍵互連的形式，或呈胰島素原的形式，但非受此所限。
[通式2]Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO：55)
於通式2中， Xaa1為丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、麩胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa5為丙胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa12為丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa14為酪胺酸、組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸；Xaa16為丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸；及Xaa21為天冬醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、或丙胺酸。
[通式3]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO：56)
於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸；Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸；Xaa27為蘇胺酸或為不存在；及Xaa28為脯胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸、或為不存在。
於本文中，其中A鏈符合SEQ ID NO：53而B鏈也符合SEQ ID NO：54的肽可被排除。
此外，對包括如上通式2之A鏈及如上通式3之B鏈，同時包括如前文描述之A鏈的第14及/或19個胺基酸、及/或B鏈的第16及/或25個胺基酸的特徵性修飾(亦即，不存在於天然胰島素中之胺基酸殘基)的對應胰島素類似物之序列具有70%或更高，特別地80%或更高，更特別地90%或更高，及又更特別地95%或更高的同源性，且相較於天然胰島素，對受體具有降低的結合親和性之該等肽也涵括於本發明之範圍。
如於本文中使用，術語「同源性」係指就野生型蛋白質之胺基酸序列或編碼其之多核苷酸序列而言的相似性程度，且包括該等序列，其具有與本發明之胺基酸序列或多核苷酸序列相同序列之如上百分比或更高的序列。同源性可藉肉眼透過比較加以判定，或可藉排列二序列，透過分析同源性程度的生物資訊演算法加以判定。二胺基酸序列間之同源性可以百分比指示。有用的自動化演算法可被使用於威斯康辛遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package)(遺傳學電腦群(Genetics Computer Group)，美國威斯康辛州麥迪遜)的GAP、BESTFIT、及FASTA；及TFASTA電腦軟體模組兩者。自動化陣列演算法包括Needleman & Wunsch、Pearson & Lipman、及Smith & Waterman之序列陣列演算法。演算法及同源性之判定係於軟體中自動化，包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST、及CLUSTAL W。
於一具體實施例中，胰島素類似物可以是 包括由如上通式2表示的SEQ ID NO：55之A鏈及SEQ ID NO：54之B鏈的胰島素類似物；或由如上通式3表示的SEQ ID NO：53之A鏈及SEQ ID NO：56之B鏈的胰島素類似物，但非特別受此所限。
更明確言之，胰島素類似物可以是一種胰島素類似物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸、組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸，但非受此所限。
更明確言之，胰島素類似物可以是一種胰島素類似物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、或絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸，但非受此所限。
更明確言之，胰島素類似物可以是一種胰島素類似物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸或天冬胺酸， Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸，但非受此所限。
於一具體實施例中，依據本發明之胰島素類似物可對應於下列胰島素類似物：(1)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為組胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(2)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為離胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(3)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為麩胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(4)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16 為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(5)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(6)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為麩胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(7)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為絲胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(8)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為蘇胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(9)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為丙胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19 為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(10)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(11)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(12)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為天冬胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；及(13)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
此外，於一具體實施例中，胰島素類似物 可以是包括選自於由SEQ ID NO：28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、及52所組成的組群中之胺基酸序列的胰島素類似物，但非受此所限。
依據本發明之胰島素類似物可以是包括上述特定序列者，及(主要)係由上述特定序列組成者，但非受此所限。
此外，雖然於本發明中描述為「由特定SEQ ID NO所組成的肽」，但其並不排除在對應SEQ ID NO之胺基酸序列的上游或下游之任何無意義序列(nonsense sequence)的添加或自然發生突變、或其緘默突變(silent mutation)，只要該肽具有與由對應SEQ ID NO之胺基酸序列所組成的肽相同的活性或相當的活性即可，顯然地涵括此種序列添加或突變的肽也係落入於本發明之範圍內。
同時，胰島素類似物包括肽本身、其鹽類(例如，肽之醫藥上可接受之鹽)、或其溶劑合物。
此外，肽可呈任何醫藥上可接受之形式。
鹽的種類並無特殊限制。然而，較佳地，鹽係呈對個體(例如，哺乳類)為安全有效的形式，但非特別受此所限。
如於本文中使用，術語「醫藥上可接受之」係指於醫藥決策範圍內，可有效地應用於期望目的而不會造成過度毒性、刺激性、過敏反應等的材料。
如於本文中使用，術語「醫藥上可接受之鹽」包括衍生自醫藥上可接受之無機酸、有機酸、或鹼之 鹽。合宜的酸之實例可包括氫氯酸、溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、丁二酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、2-萘磺酸、苯磺酸等。衍生自合宜鹼之鹽可包括鹼金屬諸如鈉、鉀等；鹼土金屬諸如鎂等；銨等。
此外，如於本文中使用，術語「溶劑合物」係指在依據本發明之肽或其鹽與溶劑分子間形成的複合物。
胰島素類似物可由熟諳技藝人士藉業界已知之肽製備方法容易地製造。舉例言之，胰島素類似物可藉包括下列步驟之方法製造：a)藉培養含編碼胰島素類似物之核酸的轉形株而表達胰島素類似物；及b)分離及純化所表達的胰島素類似物。
於本發明中，用於培養轉形株的培養基可以適當方式滿足宿主細胞培養的要求。欲涵括於用於宿主細胞生長的培養基之碳源可由熟諳技藝人士根據其製備的轉形株加以適當地選擇，及合宜培養條件可經選擇以調控培養的時間及數量。
欲使用之糖源的實例可包括糖類及碳水化合物類諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、及纖維素；油類及脂肪類諸如大豆油、葵花子油、蓖麻油、及椰子油；脂肪酸類諸如棕櫚酸、硬脂酸、及亞麻仁油酸； 醇類諸如甘油及乙醇；及有機酸類諸如乙酸。此等材料可單獨使用或可組合使用。
欲使用之氮源的實例可包括蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米浸液、大豆粉、及尿素；或無機化合物諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、及硝酸銨。氮源也可單獨使用或可組合使用。
欲使用之磷源的實例可包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或對應含鈉鹽。此外，培養基可含有轉形株生長需要的金屬鹽，諸如硫酸鎂或硫酸鐵。
最後，可使用必需生長物質，諸如胺基酸類及維生素類。此外，也可使用培養基的適當前驅物質。於藉批次式培養或連續式培養的培養期間，如上來源可適當地添加至培養中。培養之pH可使用鹼性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、及氨，或酸性化合物諸如磷酸或硫酸適當地調整。此外，可添加消泡劑(諸如脂肪酸聚乙二醇酯)以防止泡沫生成。此外，為了維持培養的需氧狀態，氧氣或其它含氧氣體(例如，空氣)可注入培養中。
本發明之轉形株可於20℃至45℃培養，及特別地於25℃至40℃培養。此外，持續培養直到獲得期望胰島素類似物的最大產量為止，就此方面而言，培養通常持續10小時至160小時。
如前文描述，當根據宿主細胞提供適當培養條件時，本發明之轉形株可製造胰島素類似物，及根據載體組成及宿主細胞之特性，所製造的胰島素類似物可分 泌於細胞質內部，或分泌至宿主細胞的胞外質空間，或分泌至細胞外。
於宿主細胞內部或外部表達的蛋白質可藉習知方法純化。純化方法之實例可包括鹽析(例如，硫酸銨沈澱、磷酸鈉沈澱等)、溶劑沈澱(例如，使用丙酮或乙醇之蛋白質分段沈澱等)、透析、凝膠過濾、層析術諸如離子交換層析術、或逆管柱層析術、超濾等，及此等方法可單獨使用或可組合使用。
於一具體實施例中，本發明可進一步包括分離與純化轉形株所表達呈包涵體形式的胰島素類似物：b-1)自步驟a)中之培養獲得轉形株及粉化之；b-2)自已粉化的細胞溶解產物回收所表達的胰島素類似物，接著再摺疊之；b-3)藉陽離子交換層析術純化已再摺疊的胰島素類似物；b-4)以胰蛋白酶及羧肽酶B處理已純化的胰島素類似物；及b-5)藉陽離子交換層析術及陰離子交換層析術或逆相層析術循序地純化已處理的胰島素類似物。
於本發明中，編碼胰島素類似物之核酸包括由SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51表示之核苷酸序列。於一具體實施例中，本發明之核酸不僅包括由SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51表示之核苷酸序 列，同時也包括具有對如上序列至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，又更佳地至少95%，及最佳地至少98%之序列同源性的全部序列，於其中由如上核酸編碼的肽相較於天然胰島素具有對受體降低的結合親和性，同時實質上具有調控活體內血中葡萄糖濃度的功能。
依據本發明之重組載體可被組成為用於轉殖或用於表達的典型載體，且可被組成為使用真核細胞或原核細胞作為宿主細胞的載體。
如於本文中使用，術語「載體」係指可於適當宿主細胞內表達標靶蛋白質的重組載體，其乃包括必需調節因子可操作式連結以使得核酸插子能够表達的核酸組成體。本發明可製備重組載體，其包括編碼胰島素類似物之核酸，及本發明之胰島素類似物可透過重組載體之轉形或轉染入宿主細胞獲得。
於本發明中，編碼胰島素類似物之核酸可操作式連結至啟動子。
依據本發明用於轉形包括編碼胰島素類似物之核酸的重組載體之方法並非限於此等方法，惟可使用業界常用的任何轉形或轉染方法而無任何限制。
本發明之轉形株可藉將包括編碼胰島素類似物之標靶核酸的重組載體導入宿主細胞獲得。
本發明使用的適當宿主可能並無特殊限制，只要其可表達本發明之核酸即可。適當宿主之實例可包括屬於埃希氏菌(Escherichia)屬的細菌諸如大腸桿菌(E. coli)、屬於芽胞桿菌(Bacillus)屬的細菌諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)、屬於假單胞菌(Pseudomonas)屬的細菌諸如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、酵母諸如畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆蟲細胞諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9)；及動物細胞諸如CHO、COS、及BSC。更明確言之，大腸桿菌可被使用作為宿主細胞，但宿主並非受此所限。
同時，接合物中之F為能够增加X的半生期之物質，及對應於組成本發明之接合物的部分。
F及X可藉共價化學鍵或非共價化學鍵彼此連結；及另外，F及X可藉共價化學鍵、非共價化學鍵、或其組合彼此連結。
更明確言之，X與L、及L與F可透過共價鍵彼此連結。於本文中，接合物為於其中X、L、與F透過共價鍵以式1之順序彼此連結的接合物。
能够增加X的半生期之物質可以是生物相容性材料，及例如，其可選自於由下列所組成之組群：聚合物、脂肪酸、膽固醇、白蛋白及其片段、白蛋白結合材料、特定胺基酸序列之重複單元的聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合材料、活體內結締組織、核苷酸、纖維連接蛋白、轉鐵蛋白、醣、肝素、及彈性蛋白，但非特別受此所限。
至於彈性蛋白，其可以是屬水溶性前驅物 的人類原彈性蛋白(human tropoelastin)，且可以是其部分序列或其部分重複單元的聚合物。舉例言之，彈性蛋白可包括類彈性蛋白多肽，但非特別受此所限。
聚合物之實例包括選自於由下列所組成之組群中之聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧基乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物分解聚合物、脂質聚合物、甲殼素、玻尿酸、寡核苷酸、及其組合，但非特別受此所限。
聚乙二醇為集合性地包括乙二醇均聚物、PEG共聚物、或經一甲基取代之PEG(mPEG)聚合物之全部形式的術語，但非特別受此所限。
此外，生物相容性材料包括聚胺基酸諸如聚離胺酸、聚天冬胺酸、及聚麩胺酸，但非受此所限。
此外，脂肪酸可以是對體內白蛋白具有結合能力者，但非特別受此所限。
至於更特定實例，FcRn結合材料可以是免疫球蛋白Fc區，及更特別地，IgG Fc區，但非特別受此所限。
為了增加胰島素類似物的活體內溶解度及/或增強半生期及/或生物利用率，生物相容性材料可連結到本發明之胰島素類似物中之一個或多個胺基酸的側鏈。此種修飾也可減低治療性蛋白質及肽的廓清率。
上述生物相容性材料可以是水溶性(兩親性 或親水性)及/或無毒性，及/或醫藥上可接受性。
F可直接連結至X(亦即，式1中之a為0)，或可透過連結基(L)連結至X。
特定言之，L可以是肽連結基或非肽連結基。
當L為肽連結基時，其可包括一個或多個胺基酸，例如1至1000個胺基酸，但非特別受此所限。於本發明中，可使用各種已知之肽連結基以便將F連結至X。舉例言之，可包括[GS]x連結基、[GGGS]x連結基、[GGGGS]x連結基等，及如上連結基中之x可以是大於或等於1的自然數。但連結基並非限於如上實例。
於本發明中，「非肽連結基」包括具有彼此連結的二或多個重複單元之生物相容性聚合物。重複單元係藉任何共價鍵連結，但肽鍵除外。非肽連結基可以是本發明之接合物之一部分的組成分，且對應於式1中之L。於本發明中，當L為作為非肽連結基的生物相容性聚合物時，用於透過共價鍵而連結連結基L與胰島素類似物X及/或F的連結元件可進一步涵括於非肽連結基的遠端。只要為原子或原子團，此種連結元件並無特殊限制，其非為生物相容性聚合物之重複單元，且係適用於透過共價鍵而連結生物相容性聚合物與X及/或F。
於La中，a可以是1或以上，及當a為2或以上時，各個L可獨立無關。
於本發明中，非肽連結基可與非肽聚合物 互換使用。
此外，於一具體實施例中，接合物可以是於其中透過含有能够在兩端接合F(尤其免疫球蛋白Fc區)與X的反應基之非肽連結基，而使F與X彼此共價連結者。
特定言之，非肽連結基可選自於由下列所組成之組群：脂肪酸、醣、聚合物、低分子量化合物、核苷酸、及其組合。
本發明之聚合物可於大於0kDa至約100kDa之範圍，特別地於約1kDa至約100kDa之範圍，及更特別地於約1kDa至約20kDa之範圍，但非特別受此所限。
非肽連結基可選自於由下列所組成之組群：可生物分解聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧基乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、聚乳酸(PLA)、及聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、及脂質聚合物、甲殼素、玻尿酸、寡核苷酸、及其組合，但非特別受此所限。
於一具體實施例中，非肽聚合物可以是聚乙二醇，但非受此所限。此外，業界已知之其衍生物及易藉業界已知技術製備者也係涵括於本發明之範圍內。
非肽連結基可使用於本發明而無任何限制，只要其為對活體內蛋白解酶具有抗性之聚合物即可。非肽聚合物之分子量係於大於0kDa至約100kDa之範 圍，特別地於約1kDa至約100kDa之範圍，及更特別地於約1kDa至約20kDa之範圍，但非特別受此所限。
如於本文中使用，術語「約」係指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等之範圍，及因而包括相等於或相似於根據此術語所述之範圍的全部數值，但並非受此所限。
此外，至於其欲連結至對應F之該多肽的本發明之非肽連結基，不僅可使用一種聚合物，同時也可使用不同種聚合物的組合。
如前文陳述，於一具體實施例中，非肽連結基的兩端可經由連結元件各自連結至F及X。舉例言之，於本發明之一特定具體例中，本發明之胰島素類似物接合物的製備方式係藉由免疫球蛋白Fc區及/或胰島素類似物與非肽聚合物(具有反應基的非肽聚合物)反應(連結反應)，該非肽聚合物具有經由在其端末的化學反應而能與免疫球蛋白Fc區之胺基或硫醇基及X之胺基或硫醇基生成共價鍵的反應基(亦即，該反應基被轉換成接合物的連結元件)。換言之，具有反應基的非肽聚合物變成了藉由連結反應而組成接合物的一部分之非肽連結基。於本文中，於接合物中之非肽連結基係由重複單元及具有反應基的非肽聚合物之連結元件組成。
特定言之，至於能够用於接合物之製備的具有反應基的非肽聚合物，該非肽聚合物可包括其可分別地連結至在其兩端的F(例如，免疫球蛋白Fc區)及X的 反應基，及尤其是其可連結至X之位在N末端或離胺酸殘基的胺基或半胱胺酸殘基中之硫醇基；或F(例如，免疫球蛋白Fc區)之位在N末端或離胺酸殘基的胺基或半胱胺酸殘基中之硫醇基，但反應基並非受此所限。
此外，可與F(亦即，免疫球蛋白Fc區)及X生成共價鍵的非肽聚合物之反應基可選自於由醛基、順丁烯二醯亞胺基、及丁二醯亞胺衍生物所組成的組群，但非受此所限。
於上文中，丙醛基或丁醛基可涵括作為醛基之實例，但醛基並非受此所限。
丁二醯亞胺衍生物可包括丁二醯亞胺基戊酸酯、丁二醯亞胺基甲基丁酸酯、丁二醯亞胺基甲基丙酸酯、丁二醯亞胺基丁酸酯、丁二醯亞胺基丙酸酯、N-羥基丁二醯亞胺、羥基丁二醯亞胺基、丁二醯亞胺基羧基甲基、或丁二醯亞胺基碳酸酯，但非受此所限。
經由反應基的轉換，透過此種連結元件，非肽連結基可連結至X及F，但非特別受此所限。
此外，經由具有醛鍵結的還原胺化製造的終產物，係比具有醯胺鍵結者更為穩定。醛反應基於低pH於N端選擇性地反應，而於高pH，例如pH 9.0，可與離胺酸殘基生成共價鍵。
此外，於具有反應基之非肽聚合物兩端的反應基，其可彼此相同或相異；舉例言之，可在一端具有順丁烯二醯亞胺基，及在另一端具有醛基、丙醛基、或丁 醛基。然而，反應基並無特殊限制，只要F(亦即，免疫球蛋白Fc區)及X可連結在具有反應基的該非肽聚合物的兩端即可。
舉例言之，順丁烯二醯亞胺基可被涵括作為在具有反應基之非肽聚合物的一端的反應基；及醛基、丙醛基、丁醛基等可被涵括作為在該非肽聚合物的另一端的反應基。
當在兩端具有羥基反應基的聚乙二醇被使用作為非肽聚合物時，可使用業界已知之化學反應活化羥基，以產生前述各種反應基，或本發明之長效蛋白質接合物可使用具有商業化之經修飾反應基的聚乙二醇製備。
於一具體實施例中，非肽聚合物可以是連結至X者，例如，胰島素類似物之N末端區或離胺酸殘基，但非特別受此所限。特定言之，非肽聚合物，例如PEG，可連結至胰島素類似物之N末端區，例如，端末胺基酸之胺基或存在於胰島素類似物中之離胺基之胺基，但非特別受此所限。
此外，於一具體實施例中，非肽聚合物可連結至F(例如，免疫球蛋白Fc)之N末端區，但非特別受此所限。特定言之，非肽聚合物可連結至免疫球蛋白Fc之N末端區，尤其連結至端末胺基酸之胺基，但非特別受此所限。
如於本文中使用，術語「N末端區」係指胰島素類似物或免疫球蛋白Fc的胺基末端區，也係指可連結 至用於本發明之目的的連結基。舉例言之，N末端區不僅可包括N末端區之端末胺基酸殘基，同時也包括接近N末端胺基酸殘基的該等胺基酸殘基，及特別可包括自遠端算起的第1至第20個胺基酸殘基，但非特別受此所限。
若醛基存在於具有反應基之非肽聚合物的一端，且連結至位在胰島素類似物之N末端的胺基，則醛基可經由還原胺化反應而連結至胺基。此外，若醛基存在於具有反應基之非肽聚合物的另一端，且連結至位在免疫球蛋白Fc之N末端的胺基，則醛基也可經由還原胺化反應而連結至胺基。
於本發明之具體例中，用於接合物之製備的具有反應基之非肽聚合物為在兩端具有反應基之PEG，及因此，接合物係透過還原胺化，經由將非肽聚合物連結至X及F的胺基而予以生成。於本文中，該接合物具有如下結構式：X-NHCH2-W-PEG部分-Z-CH2NH-F
其中，-CH2W-為連結非肽聚合物與X的連結元件；及-Z-CH2-為連結非肽聚合物與F的連結元件。此外，W及Z為不存在或為二價官能基，諸如伸烷基等。-CH2W-及-Z-CH2-之亞甲基係衍生自醛反應基，及X-NH及NH-F之氮原子分別地係衍生自使用於連結反應的胰島素類似物及F之胺基。
於如上結構式中，PEG部分不僅可含有結構式-(CH2CH2O)n-，同時也可含有位在連結元件與 -(CH2CH2O)n-間的氧原子。
於本發明中，「免疫球蛋白Fc區」係指涵括免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)及/或重鏈恆定區3(CH3)，但排除重鏈可變區及輕鏈可變區的區。免疫球蛋白Fc區可以是組成本發明之接合物的一部分之一個元件。
免疫球蛋白Fc區可包括重鏈恆定區中之鉸鏈區，但非受此所限。此外，本發明之免疫球蛋白Fc區可以是涵括免疫球蛋白之重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)的部分或全部的延伸Fc區，但排除重鏈可變區及輕鏈可變區，只要相較於天然型別者，免疫球蛋白Fc區具有實質上相同效果或改良效果即可。此外，本發明之免疫球蛋白Fc區可以是於其中對應於CH2及/或CH3之胺基酸序列的相當長部分被移除的區。
舉例言之，本發明之免疫球蛋白Fc區可以是1)CH1域、CH2域、CH3域、及CH4域；2)CH1域及CH2域；3)CH1域及CH3域；4)CH2域及CH3域；5)CH1域、CH2域、CH3域、及CH4域中之一個或二個或更多個域與免疫球蛋白鉸鏈區(或部分鉸鏈區)間之組合；及6)重鏈恆定區及輕鏈恆定區之各個域間之二聚體，但非受此所限。
此外，於一具體實施例中，免疫球蛋白Fc區可呈二聚體形式，及於二聚體形式中，一個X分子可共價連結至一個Fc區，其中免疫球蛋白Fc與X可藉非肽聚 合物而彼此連結。同時，也可能於二聚體形式中，兩個X分子係各自對稱性地連結至一個Fc區。更明確言之，免疫球蛋白Fc與X可透過非肽連結基而彼此連結，但非受限於前述實例。
此外，本發明之免疫球蛋白Fc區不僅包括天然胺基酸序列，同時也包括其序列衍生物。胺基酸序列衍生物係指因刪除、插入、非保留取代或保留取代、或其組合而在至少一個胺基酸殘基有差異的胺基酸序列。
舉例言之，已知在免疫球蛋白Fc的接合中，在位置214至238、297至299、318至322、或327至331的胺基酸殘基可使用作為合宜修飾位置。
此外，經由移除用以形成雙硫鍵的位點，移除在天然Fc之N末端的數個胺基酸，插入在天然Fc之N末端的蛋胺酸殘基等而可製備各種其它衍生物。此外，為了去除效應子(effector)功能，補體結合位點(例如，Clq結合位點)可被去除，或抗體依賴型細胞媒介胞毒性(ADCC)位點可被去除。用於製備免疫球蛋白Fc區之此等序列衍生物之技術係揭示於國際公開案第WO 97/34631、WO 96/32478號等。
不會完全變更蛋白質或肽之活性的蛋白質及肽中之胺基酸交換已知於該技術領域中(H.Neurath,R.L.Hill，蛋白質(The Proteins),Academic Press,New York,1979)。最常見的交換為於雙向的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、 Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及Asp/Gly。視情況而定，Fc區可藉磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、醣基化、甲基化、法尼基化、乙醯化、醯胺化等修飾。
上述Fc衍生物顯示與本發明之Fc區相同的生物活性，及其對熱、pH等可具有改良的結構穩定性。
又復，免疫球蛋白Fc區可得自從人類或動物(諸如牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等)活體內分離的天然形式，或可以是得自已轉形的動物細胞或微生物的其重組株或其衍生物。於本文中，可從藉由自活人體或動物體分離完整免疫球蛋白，並以蛋白酶處理所分離的免疫球蛋白而獲得Fc區。當完整免疫球蛋白係以木瓜蛋白酶處理時，被裂解成Fab區及Fc區；而當完整免疫球蛋白係以胃蛋白酶處理時，被裂解成pF’c片段及F(ab)2片段。Fc或pF’c可使用尺寸排除層析術等分離。於一更特定具體例中，人體衍生的Fc區為得自微生物的重組免疫球蛋白Fc區。
此外，免疫球蛋白Fc區可呈天然聚醣形式，相較於天然類型之增加或減少聚醣，或呈去醣基化形式。免疫球蛋白Fc聚醣的增、減、或去除可藉習知方法達成，諸如化學法、酶催化法、及使用微生物之基因工程法。藉由自Fc區移除聚醣所得的免疫球蛋白Fc區顯示對C1q部分的結合親和性顯著地減低，及抗體依賴型胞毒性或補體依賴型胞毒性的減低或消失，因此於活體內不會誘生不必 要的免疫反應。就此方面而言，去醣基化或無醣基化免疫球蛋白Fc區中之免疫球蛋白Fc區，可能是滿足本發明作為藥物載劑的原先目的之更合宜形式。
如於本文中使用，術語「去醣基化」係指自Fc區藉酶催化去除醣部分，及術語「無醣基化」係指原核生物，更尤其大腸桿菌製造的未經醣基化的Fc區。
同時，免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或其它動物，包括牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、及天竺鼠。於更特定具體例中，其係衍生自人類。
此外，免疫球蛋白(Ig)Fc區可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其組合或其雜合物。於更特定具體例中，其係衍生自IgG或IgM，其屬人血中最豐富的蛋白質；及於又更特定具體例中，其係衍生自IgG，其已知可增強配體結合蛋白質的半生期。於甚至又更特定具體例中，免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區；及於最特定具體例中，IgG4 Fc區為衍生自人類IgG4的無醣基化Fc區，但非受此所限。
更明確言之，如於本文中使用，術語「組合」係指編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽係連結至不同來源的單鏈多肽以生成二聚體或多聚體。換言之，二聚體或多聚體可自選自於由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、及IgE Fc片段所組成的組群中之二或多個片段形成。
本發明之另一態樣提供一種編碼接合物的 多核苷酸、涵括多核苷酸的載體、及涵括多核苷酸或涵括多核苷酸的載體的轉形株。
接合物係如同前文解說。
多核苷酸可以是呈融合蛋白質形式的編碼接合物者。
此外，於本發明之範圍內，經分離的編碼接合物之多核苷酸包括與對應序列具有75%或以上、特別地85%或以上、更特別地90%或以上、及甚至更特別地95%或以上的序列相同性的多核苷酸序列。
載體及轉形株之以上說明也適用於本具體例。
本發明之又另一態樣提供一種製備接合物之方法。
接合物係如前文描述。
特定言之，該方法可包括下列步驟：(a)含二或更多個反應性端基的非肽聚合物與胰島素類似物及載劑中之一者反應以製備非肽聚合物，於其中該胰島素類似物或載劑係附接至一端，及該等反應性端基係附接至另一端；及(b)於步驟(a)中製備的非肽聚合物(於其中該胰島素類似物或載劑係附接至一端，及該等反應性端基係附接至另一端)與載劑或胰島素類似物中之另一者反應以製備一接合物(於其中該胰島素類似物及載劑係透過非肽聚合物連結)。
非肽聚合物、載劑、及胰島素類似物及其連結組成體(linking constitutions)全部係如前文描述。
本發明之又另一態樣提供一種涵括該接合物之組成物。
接合物係如前文說明。
於本發明中，組成物可以是醫藥組成物。特定言之，組成物可以是用於預防或治療胰島素相關疾病之醫藥組成物。更明確言之，組成物可以是用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物。
如於本文中使用，術語「胰島素相關疾病」係指因胰島素生物活性低或缺乏所致而出現的或進行的疾病；及胰島素相關疾病之實例可包括糖尿病，但非特別受此所限。
如於本文中使用，術語「預防」係指藉由投藥如上接合物或含接合物之組成物而抑制或延遲胰島素相關疾病的全部活動；及術語「治療」係指藉由投藥如上接合物或含接合物之組成物而改善或優異地改變胰島素相關疾病之症狀的全部活動。
依據本發明含有胰島素類似物接合物之醫藥組成物可包括醫藥上可接受之載劑。此種載劑可以是非天然出現者。
如於本文中使用，術語「醫藥上可接受之」係指具有足够量以發揮療效且不會引發不良效應的性質，可由熟諳技藝人士基於醫學界眾所周知的因素容易地決 定，諸如疾病種類、患者之年齡、體重、健康狀況、性別、藥物感受度、投藥途徑、投藥方法、投藥頻率、治療持續時間、欲混合使用或同時投藥的藥物等。
用於口服投藥，醫藥上可接受之載劑可含有黏合劑、潤滑劑、崩散劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、香味劑等。用於注射製劑，醫藥上可接受之載劑可含有緩衝劑、保藏劑、止痛劑、增溶劑、等張劑、及安定劑。用於局部投藥用製劑，醫藥上可接受之載劑可含有基劑、賦形劑、潤滑劑、保藏劑等。本發明之醫藥組成物可組合前述醫藥上可接受之載劑而調配成各種劑型。舉例言之，用於口服投藥，醫藥組成物可被調配成錠劑、片劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液劑、漿劑、或薄片劑。用於注射製劑，醫藥組成物可被調配成單劑安瓿或多劑容器。醫藥組成物也可被調配成溶液劑、懸浮液劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、及持續釋放製劑。
同時，適合用於調配的載劑、賦形劑、及稀釋劑可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、金合歡膠、褐藻膠、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦油類等。此外，醫藥調配物可進一步含有填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、矯味劑、乳化劑、保藏劑等。
如於本文中使用，術語「投藥」係指藉適 當方式將特定物質導引至患者，及本發明之接合物可藉任一種常用途徑投藥，只要藥物可到達標靶組織即可。舉例言之，可進行腹內、靜脈、肌肉、皮下、皮內、經口、經局部、鼻內、肺內、及直腸內投藥，但投藥途徑並非受此所限。然而，因肽類當口服投藥時被消化，用於口服投藥之組成物的活性成分須經包衣或經調配以保護避免於胃內分解。特別地，本組成物可呈注射劑型投藥。此外，醫藥組成物可使用能將活性成分轉運至標靶細胞的某種裝置投藥。
此外，本發明之醫藥組成物可由作為活性成分的藥物類型以及數個相關因素決定，該等因素包括欲治療的疾病類型、投藥途徑、患者之年齡、性別、及體重、及病情嚴重程度。
本發明之組成物的總有效劑量可以單劑投藥患者，或可根據分段治療方案以多劑長時間投藥。本發明之醫藥組成物中所含的活性成分之含量可取決於疾病嚴重程度而改變。特定言之，本發明之接合物的總每日劑量可以是1公斤患者體重約0.0001毫克至500毫克。除了醫藥組成物之投藥途徑及治療頻率之外，接合物之有效劑量係考慮各項因素決定，包括患者之年齡、體重、健康情況、性別、疾病嚴重程度、膳食、及排泄速率。就此方面而言，熟諳技藝人士可容易地判定適合本發明之醫藥組成物的特定用途的有效劑量。依據本發明之醫藥組成物並非特別受限於配方及投藥途徑及投藥模式，只要其顯示本發明之效 果即可。
為了達成本發明，本發明之又另一態樣提供一種相較於天然胰島素之接合物，具有增加的活體內持續時間及/或安定性的包括胰島素類似物接合物之長效調配物。
胰島素類似物及接合物係如前文描述。
為了達成本發明，本發明之又另一態樣提供一種治療胰島素相關疾病之方法，包含對有需要的個體投藥胰島素類似物接合物或其組成物。
胰島素類似物及接合物係如前文描述。
於一具體例中，胰島素相關疾病為糖尿病，但非特別受此所限。
為了達成本發明，本發明之又另一態樣提供一種胰島素類似物接合物用於藥物之製備的用途。
於一具體例中，該藥物係用於預防或治療胰島素相關疾病，但非特別受此所限。
於一具體例中，該藥物係用於預防或治療糖尿病，但非特別受此所限。
為了達成本發明，本發明之又另一態樣提供一種胰島素類似物接合物用於胰島素相關疾病尤其糖尿病之治療的用途。
胰島素類似物、接合物、及胰島素相關疾病係如前文描述。
後文中，將參考下列實施例以進一步細節 描述本發明。然而，此等實施例係僅提供用於例示目的，本發明之範圍不應以任何形式受此所限。
實施例1：單鏈胰島素類似物表達載體之製備
為了製備於A鏈或B鏈分別具有單一修飾胺基酸的胰島素類似物，使用擁有的天然胰島素表達載體作模版，合成正向寡核苷酸及反向寡核苷酸(表2)，及然後進行PCR以擴增類似物的各個基因。
A鏈或B鏈中經修飾的胺基酸序列及類似物名稱顯示於下表1。於表1中，類似物1表示於其中A鏈的第14個胺基酸(亦即，酪胺酸，Y)係經以組胺酸(H)取代的類似物，及類似物6表示於其中B鏈的第16個胺基酸(亦即，酪胺酸，Y)係經以麩胺酸(E)取代的類似物。
用於胰島素類似物擴增之引子顯示於下表2。
用於胰島素類似物擴增之PCR反應係於95 ℃歷時30秒，55℃歷時30秒，及68℃歷時6分鐘之條件下進行，共18個重複週期。於該等條件下獲得的胰島素類似物片段被插入pET22b載體內，表達成為胞內包涵體，如此獲得的表達載體命名為pET22b-胰島素類似物1至13。表達載體含有在T7啟動子之調控下的編碼胰島素類似物1至13之胺基酸序列的核酸，及胰島素類似物蛋白質係於涵括該等表達載體的宿主細胞內表達為包涵體。
胰島素類似物1至13之DNA序列及蛋白質序列顯示於下表3。
各個序列修飾係藉DNA序列分析檢驗，結果證實各個胰島素類似物序列已經根據預期目的被修飾。
實施例2：重組胰島素類似物融合肽之表達
重組胰島素類似物之表達係於T7啟動子之調控下進行。大腸桿菌BL21-DE3(E.coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)gal λDE3；諾華金(Novagen))係以各重組胰島素類似物表達載體轉形。轉形係根據推薦的方案進行(諾 華金)。收集以各個重組表達載體轉形的單一群落，接種在含安比西林(ampicillin)(50微克/毫升)的2X魯利亞肉湯(Luria Broth(LB))內，及於37℃培養15小時。重組菌株培養醪與含30%甘油的2X LB培養基以1：1(v/v)之比混合，各1毫升混合物分配至低溫保存管及儲存於-140℃，其係用作為生產重組融合蛋白質的細胞儲備液。
為了表達重組胰島素類似物，一小瓶的細胞儲備液經解凍及接種入500毫升2X魯利亞肉湯內，及於37℃振搖培養歷時14小時至16小時。當OD600達5.0或以上時結束培養，作為種子培養醪。種子培養醪使用50升發酵槽(MSJ-U2，丸菱(B.E.MARUBISHI)，日本)接種至17升培養基，並開始初始浴槽發酵。培養條件維持於37℃溫度，20升/分鐘(1vvm)空氣流速，500rpm攪動速度，及使用30%氨溶液於pH 6.70。當培養醪中之營養素耗盡時，藉添加饋料液以饋料批次模式進行發酵。藉OD值監控菌株的生長。當OD值達100或以上時，導入IPTG至500μM之終濃度。在導入之後，進一步進行培養歷時23小時至25小時。培養結束時，藉離心收集重組株，及儲存於-80℃至需用時為止。
實施例3：重組胰島素類似物之回收與再摺疊
為了將實施例2中表達的重組胰島素類似物改變成可溶形式，細胞經破解，接著再摺疊。細胞團(100克；濕重)再懸浮於1升裂解緩衝液內[50mM Tris-HCl(pH 9.0)，1mM EDTA(pH 8.0)，0.2M NaCl，及0.5%崔頓 (Triton)X-100]。細胞係於15,000psi之操作壓力使用微流化床(微流體公司(Microfluidic Inc.)型號M-110EH-30)破解。如此已破解的細胞溶解物於4℃至8℃之溫度於7,000rpm離心20分鐘。拋棄上清液，再懸浮團粒於3升洗滌緩衝液(0.5%崔頓X-100及50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.2M NaCl，及1mM EDTA)。於4℃至8℃之溫度於7,000rpm離心20分鐘之後，再懸浮細胞團於蒸餾水，接著以相同方式離心。如此所得團粒再懸浮於緩衝液內(1M L-甘胺酸，3.78克L-半胱胺酸-HCl，pH 10.6)及於室溫攪拌1小時。為了回收如此已再懸浮的重組胰島素類似物，添加8M尿素至其中及攪拌3小時至5小時。為了再摺疊已溶解的重組胰島素原類似物，於4℃至8℃之溫度於7,000rpm進行離心30分鐘，收集上清液，及以15mM L-半胱胺酸-HCl亦即還原劑處理一小時。使用蠕動泵將預定容積的蒸餾水添加至其中，及於4℃至8℃之溫度攪拌歷時至少12小時。
實施例4：陽離子交換層析術純化
當再摺疊完成時，載入樣本至以含有45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液平衡的已平衡SP FF(奇異健康照護(GE healthcare))管柱上，然後，使用含有0.5M氯化鉀及45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液，以0%至100%線性梯度之10倍管柱體積洗提胰島素類似物蛋白質。
實施例5：以胰蛋白酶及羧肽酶B處理
使用超濾膜，自已洗提的樣本去除鹽類， 接著置換緩衝溶液(10mM Tris-HCl，pH 8.0)。如此獲得的樣本蛋白質以對應於相對樣本的蛋白質含量為約30,000莫耳比之莫耳比的胰蛋白酶及對應於相對樣本的蛋白質含量為約3,000莫耳比之莫耳比的羧肽酶B處理，及於4℃至8℃之溫度攪拌至少16小時。
實施例6：陽離子交換層析術純化
當反應完成時，載入樣本於以含有45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液平衡的已平衡SP HP(奇異健康照護)管柱上，使用含有0.5M氯化鉀及45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液，以0%至100%線性梯度之10倍管柱體積洗提胰島素類似物蛋白質。
實施例7：逆相層析術純化
為了自實施例6所得樣本中純粹地分離純質胰島素類似物，其被載荷至逆相層析術索爾斯30RPC(Source 30RPC)(奇異健康照護，美國)上，其係以磷酸鈉及異丙醇平衡，並使用含磷酸鈉及異丙醇的緩衝液，以線性梯度洗提胰島素類似物蛋白質。
如此經純化的胰島素類似物藉蛋白質電泳(SDS-PAGE，第1圖)及HPLC分析，及其中，代表性胰島素類似物9、10、11、及12的純度結果顯示於第2圖。
實施例8：長效胰島素類似物接合物之製備
實施例1至7中製備的胰島素類似物接合物係藉下述方法製備。
類似物10之長效接合物係代表性地製備如 下。
為了在胰島素類似物10之B鏈N末端以3.4K propion-ALD(2)PEG[於兩端各有一個丙醛基的PEG(3.4kDA)；NOF公司(NOF Inc.)美國]PEG化，胰島素類似物10之濃度(5毫克/毫升)，其具有與PEG之莫耳比為1：4於4℃反應約2小時。於本文中，反應係藉於50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 5.0)與45%異丙醇之混合溶劑內添加3mM氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)之還原劑進行。反應溶液係藉SP-HP(奇異健康照護)管柱純化，其使用KCl濃度梯度及含檸檬酸鈉(pH 3.0)及45%乙醇的緩衝液。
為了將附接於胰島素類似物上的PEG與免疫球蛋白Fc片段連結，已純化的經單PEG化胰島素類似物與免疫球蛋白Fc片段之莫耳比經確定為1：1.2，於25℃進行15小時反應，同時將總蛋白質濃度設定為20毫克/毫升。於此，使用的反應溶液為100mM HEPES緩衝液(pH 8.2)，其中添加作為還原劑的20mM氰基硼氫化鈉及氯化鈉。
反應完成後，反應溶液施加至使用Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)及NaCl濃度梯度的Q-HP管柱，及施加至使用硫酸銨及Tris-HCl(pH 7.5)濃度梯度的索爾斯15ISO(GE，美國)管柱，藉此純化胰島素類似物10-3.4K PEG-免疫球蛋白Fc接合物。
比較例：天然胰島素之長效接合物之製備
為了在天然胰島素(拜孔公司(Biocon Inc.)， 印度)的B鏈N末端以3.4K丙醛基-ALD(2)PEG(在兩端各有丙醛基的PEG(3.4kDa)；NOF公司，美國)PEG化，進行PEG化反應，及經單PEG化的天然胰島素係藉如同實施例8的純化管柱純化。
為了將附接於天然胰島素上的PEG與免疫球蛋白Fc片段連結，施用如實施例8中描述的反應條件及純化管柱至已純化的單PEG化天然胰島素及免疫球蛋白Fc片段，及藉此製備天然胰島素-3.4K PEG-免疫球蛋白Fc接合物。
實驗例1：胰島素類似物對胰島素受體之結合親和性的比較
為了度量胰島素類似物對胰島素受體的結合親和性，分析係藉閃爍鄰近性分析試驗(SPA)進行。首先，為了獲得表達胰島素受體B同功型的細胞膜，製備過度表達胰島素受體B同功型的CHO細胞株，其係經由使用該CHO細胞株及採用脂質體載體(lipofectamine)(生命技術(Life Technology)，美國)的轉染方法製備。然後，所製備的細胞株以均化器(惠頓(Wheaton)，美國)均化，及使用蔗糖墊層法分離細胞膜。於其中表達人類天然胰島素受體B同功型的所得的CHO細胞株細胞膜及PVT SPA珠粒添加至96孔皮米孔板(pico plates)內(柏京艾瑪(PerkinElmer)，型號6005162，美國)。此外，作為競爭者，人類胰島素或各胰島素類似物(50mM Tris-HCl pH 7.8，150mM NaCl，0.1% BSA)稀釋成多於10個不同濃度，連同作為檢測劑配 體的放射性同位素I125-標記的人類天然胰島素(柏京艾瑪，型號NEX-420，美國)一起添加，於室溫競爭反應歷時4小時。四小時之後，使用貝他計數器(柏京艾瑪，型號C9904V1，美國)測量對胰島素受體之結合親和性。藉貝他計數器測量的各種材料之值係使用GraphPad Prism 6軟體以IC50計算，胰島素類似物的胰島素受體IC50之百分率係被數位化成相對於人類胰島素對胰島素受體的相對結合親和性。
結果，與人類胰島素作比較，對胰島素受體之結合親和性顯示為：針對胰島素類似物1為90%；針對胰島素類似物2為95%；針對胰島素類似物3為1.0%；針對胰島素類似物4為<0.1%；針對胰島素類似物6為20%；針對胰島素類似物7為8.5%；針對胰島素類似物9為79%；針對胰島素類似物10為79%；針對胰島素類似物11為24%；針對胰島素類似物12為<0.1%；及針對胰島素類似物13為<0.1%(表4)。因此，相較於天然胰島素，本發明之胰島素類似物觀察得具有對胰島素受體降低的結合親和性。
實驗例2：長效胰島素類似物接合物之受體結合親和性的確證
長效胰島素類似物對胰島素受體及IGF-1受體之結合親和性係藉如上實驗例1描述之方法確證。
結果，與天然人類胰島素作比較，對胰島素受體之結合親和性：針對天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物為2.4±0.4%，及針對胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物為1.3±0.2%。此外，與人類天然IGF-1作比較，針對天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物及針對胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物兩者的對 IGF-1受體之結合親和性係小於1%。因此，確證相較於天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物，胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物具有對胰島素受體降低的結合親和性，且因PEG與免疫球蛋白Fc接合故，兩種物質皆對IGF-1受體具有降低的結合親和性。
實驗例3：長效胰島素類似物接合物之藥物動力學分析
為了確證長效胰島素類似物接合物之藥物動力學，隨時間推移之血中濃度的比較研究係於正常大鼠(SD大鼠，雄性，6週齡)、正常小鼠、及犬進行，動物於實驗室中馴養某一段時間。
天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物及胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物各自以單劑經皮下，以43.05nmol/kg投藥小鼠，及以65.1nmol/kg投藥大鼠。其後，於0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、 及168小時採集血樣。此外，天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物及胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物各自以單劑經皮下以6.3nmol/kg投藥犬。其後，於0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、及240小時採集血樣。
於各個時間點，藉酵素連結免疫吸附分析試驗(ELISA)測量天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物及胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物之血中濃度，及使用胰島素ELISA(亞爾帕可(ALPCO)，美國)作為套組。然而，作為檢測抗體，使用小鼠抗人IgG4 HRP接合物(阿爾發診斷國際公司(Alpha Diagnostic Intl,Inc)，美國)。
結果，相較於天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物，胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物的半生期於小鼠、大鼠、及犬分別增加1.9倍、1.2倍、及1.6倍；及MRT分別增加2.5倍、1.9倍、及2.0倍。因此，確證相較於天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物，胰島素類似物-PEG-免疫球蛋白Fc接合物顯示於血液中之持續時間延長。
實驗例4：長效胰島素類似物接合物的葡萄糖濃度降低效果之測定
為了確證長效胰島素類似物接合物於第二型糖尿病模型的藥效學，高脂膳食(60%脂肪)餵食正常大鼠(SD大鼠，雄性，7週齡)歷時兩週，及能够破壞胰β細胞的STZ以每週兩次，每次30毫克/千克劑量投藥，以製造第二型糖尿病模型(後文中稱作為DIO/STZ大鼠)。連續地餵食高脂膳食給所製造的模型以維持連續的糖尿病。
天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物及胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物分別以12.1nmol/kg及8.09nmol/kg皮下投藥DIO/STZ大鼠，及投藥係以3日間隔進行。為了測定藉投藥天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物及胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白 Fc接合物而降低活體內血中葡萄糖濃度之功效，於投藥的第0、1、3、6、7、9、10、12、13、15、16、21、22、24、25、27、及28日自尾靜脈採集血樣，及使用活體內血糖儀(一鍵式®(OneTouch®)Ultra®，生命掃描公司(LifeScan,Inc.)，美國)測量活體內血中葡萄糖濃度。
結果，相較於天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物，確證胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物具有降低活體內血中葡萄糖濃度之均等效果，即便當該接合物係以50%劑量投藥DIO/STZ大鼠時亦復如此。基於上述結果，如此確證相較於天然胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc接合物，本發明之胰島素類似物10-PEG-免疫球蛋白Fc接合物的改良活體內血中持續性，能够連續維持降低活體內血中葡萄糖濃度的優異效果，即便其使用小劑量時亦復如此。
自前文描述，熟諳本發明相關技藝人士將能瞭解，未修改本發明之技術構思或主要特點，本發明可以其它特定形式具體實施。就此方面而言，本文中揭示的具體實施例僅用於例示目的，而不應解譯為限制本發明之範圍。相反地，本發明意圖不僅涵蓋具體實施例，同時也涵蓋落入於如由隨附之申請專利範圍界定的本發明之精髓及範圍內的各種替代、修飾、均等物及其它具體例。
<110> 南韓商韓美藥品股份有限公司
<120> 對胰島素受體有降低親和性之胰島素類似物之接合物及其用途
<130> OPA18124
<150> KR 10-2017-0037101
<151> 2017-03-23
<160> 56
<170> KoPatentIn 3.0
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<223> 胰島素類似物，A鏈
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa為丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、麩胺酸、或天冬醯胺酸
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<222> (5)
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<223> Xaa為丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、或 天冬醯胺酸
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<222> (14)
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 55
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 胰島素類似物，B鏈
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<223> Xaa為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸
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<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸
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<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa為蘇胺酸或為不存在
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<222> (28)
<223> Xaa為脯胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸、或為不存在
<400> 56

Claims (31)

  1. 一種由式1表示之接合物，[式1]X-L a-F其中於式1中，X為包含選自於由下列所組成之組群中之一或多個胺基酸修飾的胰島素類似物：天然胰島素的B鏈之第16個胺基酸、B鏈之第25個胺基酸、A鏈之第14個胺基酸、及A鏈之第19個胺基酸；L為連結基；a為0或自然數，但限制條件為當a為2或以上時，各個L係彼此獨立；F為能够增加X的半生期之物質；及X、L、及F係藉共價鍵而以式1之順序彼此連結。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之接合物，其中X包含選自於由下列所組成之組群中之一或多個修飾：天然胰島素的B鏈之第16個胺基酸，酪胺酸，修飾成麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸；天然胰島素的B鏈之第25個胺基酸，苯丙胺酸，修飾成天冬胺酸或麩胺酸；天然胰島素的A鏈之第14個胺基酸，酪胺酸，修飾成組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸；及天然胰島素的A鏈之第19個胺基酸，酪胺酸，修飾成麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之接合物，其中X為 包含通式2中指示的SEQ ID NO：55之A鏈及通式3中指示的SEQ ID NO：56之B鏈的胰島素類似物(但限制條件為其中A鏈符合SEQ ID NO：53而B鏈也符合SEQ ID NO：54的肽係被排除)：[通式2] Xaa1-Ile-Val-Glu- Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys- Xaa12-Leu- Xaa14-Gln- Xaa16-Glu-Asn- Xaa19-Cys- Xaa21(SEQ ID NO：55)其中於通式2中，Xaa1為丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、麩胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa5為丙胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa12為丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa14為酪胺酸、組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸；Xaa16為丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸、或天冬醯胺酸；Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸；及Xaa21為天冬醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、或丙胺酸；及[通式3]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Va l-Glu-Ala-Leu- Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- Xaa25-Tyr- Xaa27- Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO：56)其中於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸；Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸；Xaa27為蘇胺酸或為不存在；及Xaa28為脯胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸、或為不存在。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸、組胺酸、離胺酸、丙胺酸、或天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、或天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  5. 如申請專利範圍第3或4項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸、麩胺酸、或絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及 於通式3中，Xaa16為酪胺酸、麩胺酸、絲胺酸、或天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之接合物，其中X包含於通式2中指示的SEQ ID NO：55之A鏈及SEQ ID NO：54之B鏈。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之接合物，其中X包含於通式3中指示的SEQ ID NO：53之A鏈及SEQ ID NO：56之B鏈。
  8. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中(1)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為組胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(2)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為離胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(3)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為麩胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通 式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(4)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(5)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(6)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為麩胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(7)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為絲胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(8)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺 酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為蘇胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(9)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為丙胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(10)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(11)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為天冬胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(12)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為天冬胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸；(13)於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺 酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之接合物，其中X為包含選自於由SEQ ID NO：28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、及52所組成的組群中之胺基酸序列的胰島素類似物。
  10. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為麩胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  11. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為絲胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  12. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為蘇胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3 中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  13. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為天冬胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為苯丙胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  14. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為天冬胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  15. 如申請專利範圍第3項所述之接合物，其中於通式2中，Xaa1為甘胺酸，Xaa5為麩醯胺酸，Xaa12為絲胺酸，Xaa14為酪胺酸，Xaa16為白胺酸，Xaa19為酪胺酸，及Xaa21為天冬醯胺酸；及於通式3中，Xaa16為酪胺酸，Xaa25為麩胺酸，Xaa27為蘇胺酸，及Xaa28為脯胺酸。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之接合物，其中F係選自於由下列所組成之組群：聚合物、脂肪酸、膽固醇、白蛋白及其片段、白蛋白結合材料、特定胺基酸序列之重複單元的聚合物、抗體、抗體片段、 FcRn結合材料、活體內結締組織、核苷酸、纖維連接蛋白、轉鐵蛋白、醣、肝素、及彈性蛋白。
  17. 如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之接合物，其中該聚合物係選自於由下列所組成之組群：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧基乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物分解聚合物、脂質聚合物、甲殼素、玻尿酸、寡核苷酸、及其組合。
  18. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述之接合物，其中F為免疫球蛋白Fc區。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之接合物，其中F為IgG Fc區。
  20. 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之接合物，其中L係選自於由下列所組成之組群：肽、脂肪酸、醣、聚合物、低分子量化合物、核苷酸、及其組合。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之接合物，其中該聚合物係選自於由下列所組成之組群：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧基乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、可生物分解聚合物、脂質聚合物、甲殼素、玻尿酸、寡核苷酸、及其組合。
  22. 如申請專利範圍第1至21項中任一項所述之接合物，其中L為聚乙二醇。
  23. 如申請專利範圍第20項所述之接合物，其中該聚合物 具有1kDa至100kDa之分子量。
  24. 如申請專利範圍第1至23項中任一項所述之接合物，其中該連結基係連結至胰島素類似物之B鏈的N末端或胰島素類似物中之離胺酸殘基。
  25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項所述之接合物，其中F為免疫球蛋白Fc區及該連結基係連結至免疫球蛋白Fc區的N末端。
  26. 如申請專利範圍第1至25項中任一項所述之接合物，其中F為免疫球蛋白Fc區及該接合物具有於其中該連結基的兩端係連結至胰島素類似物之B鏈的N末端及免疫球蛋白Fc區的N末端之結構式。
  27. 如申請專利範圍第1至26項中任一項所述之接合物，其中相較於天然胰島素，該胰島素類似物對天然胰島素受體具有降低的結合親和性。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之接合物，其中相較於天然胰島素之結合親和性，該胰島素類似物對天然胰島素受體之結合親和性為約10%至約90%。
  29. 如申請專利範圍第27項所述之接合物，其中F為免疫球蛋白Fc區，L為聚乙二醇，及相較於天然胰島素之結合親和性，該接合物對天然胰島素受體之結合親和性為0.1%至50%。
  30. 如申請專利範圍第1至29項中任一項所述之接合物，其中F為免疫球蛋白Fc區，L為聚乙二醇，及X為具有與天然胰島素相同的序列但A鏈之第14個胺基酸為 天冬胺酸的胰島素類似物。
  31. 一種用於預防或治療糖尿病之醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至30項中任一項所述之接合物。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3517544A4 (en) 2016-09-23 2020-06-03 Hanmi Pharm. Co., Ltd. INSULIN ANALOG HAVING REDUCED INSULIN RECEPTOR BINDING FORCE AND USE THEREOF
TW201831207A (zh) * 2017-02-03 2018-09-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 生理活性物質之長效接合物及其用途
WO2020120463A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Sanofi Insulin conjugates
CN114675019B (zh) * 2022-02-10 2022-12-16 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） 一种检测胰岛素受体胞外段抗体的试剂盒

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2536040A1 (de) 1975-08-13 1977-02-24 Hoechst Ag Insulin-analoga mit biologischer wirkung
US5175145A (en) 1988-08-26 1992-12-29 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of diabetes mellitus with amylin agonists
JPH04502465A (ja) 1988-12-23 1992-05-07 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ヒトインシュリン類似物質
US5716927A (en) 1988-12-23 1998-02-10 Novo Nordisk A/S Insulin analogs having a modified B-chain
US5422339A (en) 1991-03-19 1995-06-06 Joslin Diabetes Center, Inc. Peptides having insulin autoantibody but not insulin receptor binding capacity
US5424286A (en) 1993-05-24 1995-06-13 Eng; John Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
IL143866A0 (en) 1999-01-06 2002-04-21 Genentech Inc Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants
WO2003020201A2 (en) 2001-08-28 2003-03-13 Eli Lilly And Company Pre-mixes of glp-1 and basal insulin
AR036711A1 (es) 2001-10-05 2004-09-29 Bayer Corp Peptidos que actuan como agonistas del receptor del glp-1 y como antagonistas del receptor del glucagon y sus metodos de uso farmacologico
EP1448222A4 (en) 2001-10-19 2006-05-17 Lilly Co Eli BIPHASIC MIXTURES OF GLP-1 AND INSULIN
US7737260B2 (en) 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
DE10227232A1 (de) 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
KR20050121748A (ko) 2003-04-29 2005-12-27 일라이 릴리 앤드 캄파니 연장된 시간 작용을 갖는 인슐린 유사체
EP2085406A1 (en) 2003-07-25 2009-08-05 ConjuChem Biotechnologies Inc. Long lasting insulin derivatives and methods thereof
EP2194064A1 (en) 2004-05-13 2010-06-09 Eli Lilly &amp; Company FGF-21 fusion proteins
BRPI0611872B8 (pt) 2005-06-16 2021-05-25 Nektar Therapeutics reagente polimérico, conjugado, método para preparação de um conjugado e composição farmacêutica
WO2007020256A1 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
EP2049149B1 (en) 2006-07-31 2015-04-15 Novo Nordisk A/S Pegylated extended insulins
PL2074141T3 (pl) 2006-09-22 2017-02-28 Novo Nordisk A/S Analogi insuliny oporne na proteazę
US7790677B2 (en) 2006-12-13 2010-09-07 Elona Biotechnologies Insulin production methods and pro-insulin constructs
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
TW200907056A (en) 2007-03-28 2009-02-16 Astrazeneca Ab New method
WO2008145721A2 (en) 2007-06-01 2008-12-04 Novo Nordisk A/S N-terminal modification of polypeptides for protection against degradation by aminopeptidases
CN101743252A (zh) 2007-07-16 2010-06-16 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶稳定化的、peg化的胰岛素类似物
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
EP2017288A1 (en) 2007-07-16 2009-01-21 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues
EP2708554A1 (en) 2007-08-15 2014-03-19 Novo Nordisk A/S Insulin analogues with an acyl and alkylene glycol moiety
CN101861333A (zh) 2007-11-16 2010-10-13 诺沃-诺迪斯克有限公司 包含glp-1肽或毒蜥外泌肽-4和基础胰岛素肽的药物组合物
WO2009087081A2 (de) 2008-01-09 2009-07-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit-/wirkungsprofil
DE102008003568A1 (de) 2008-01-09 2009-07-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
DE102008025008A1 (de) 2008-05-24 2009-11-26 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
CA2711752A1 (en) 2008-01-09 2009-07-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile
US9260502B2 (en) 2008-03-14 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
US8691759B2 (en) 2008-03-18 2014-04-08 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
WO2009129250A2 (en) 2008-04-14 2009-10-22 Case Western Reserve University Meal-time insulin analogues of enhanced stability
BR122013025625B1 (pt) 2008-10-17 2021-08-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Composição farmacêutica, seu uso e método de preparação da mesma, kit e dispositivo
JP5789515B2 (ja) 2008-12-19 2015-10-07 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ インスリン類似体
JP5755566B2 (ja) 2008-12-19 2015-07-29 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ アミド系インスリンプロドラッグ
MA33221B1 (fr) 2009-03-27 2012-04-02 Glaxo Group Ltd Fusions de médicament et conjugués afférents
WO2011028813A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Case Western Reserve University Insulin analogues of enhanced receptor-binding specificity
DK2498802T3 (en) 2009-11-13 2015-04-13 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist, insulin and a methionine
US8703701B2 (en) 2009-12-18 2014-04-22 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
WO2011075606A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
KR101058209B1 (ko) 2009-12-30 2011-08-22 전자부품연구원 Ｏｆｄｍ 방식의 디지털 방송 시스템의 빠른 동기 방법
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
KR101324828B1 (ko) 2010-06-08 2013-11-01 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체
KR101330868B1 (ko) 2010-06-08 2013-11-18 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 유도체 약물 결합체
US8940860B2 (en) 2010-06-16 2015-01-27 Indiana University Research And Technology Corporation Single-chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
JP2013535467A (ja) 2010-07-28 2013-09-12 スマートセルズ・インコーポレイテツド 組換えにより発現されたインスリンポリペプチドおよびその使用
UY33872A (es) 2011-01-20 2012-08-31 Zealand Pharma As Uso de análogos de glucagón acilados
EP2681346B1 (en) 2011-03-02 2017-09-06 Oerlikon Surface Solutions AG, Pfäffikon Sliding component coated with metal-comprising carbon layer for improving wear and friction behavior by tribological applications under lubricated conditions
CN102675452B (zh) 2011-03-17 2015-09-16 重庆富进生物医药有限公司 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
CA2834876A1 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Teijin Aramid B.V. Antiballistic panel
CN104023739A (zh) 2011-06-02 2014-09-03 Opko生物科学有限公司 长效glp-1/胰高血糖素受体激动剂
UA113626C2 (xx) 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
UA126465C2 (uk) 2011-06-10 2022-10-12 Ханмі Сайенс Ко., Лтд. Пептид, що має активність оксинтомодуліну, та фармацевтична композиція для лікування ожиріння, яка його містить
JP6058646B2 (ja) 2011-06-15 2017-01-11 ノヴォ ノルディスク アー／エス 多置換インスリン
EP3502129B1 (en) 2011-06-17 2021-04-07 Hanmi Science Co., Ltd. A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
WO2013089463A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Lg Innotek Co., Ltd. Method for deposition of silicon carbide and silicon carbide epitaxial wafer
WO2013110069A1 (en) 2012-01-20 2013-07-25 Case Western Reserve University Glutamic acid-stabilized insulin analogues
WO2013128003A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Novo Nordisk A/S N-terminally modified oligopeptides and uses thereof
KR101665009B1 (ko) 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
AR092862A1 (es) 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
AR094821A1 (es) 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
WO2014049610A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Cadila Healthcare Limited Peptides as gip, glp-1 and glucagon receptors triple-agonist
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
KR102311517B1 (ko) 2012-11-06 2021-10-14 한미약품 주식회사 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 단백질 결합체의 액상 제제
KR102185311B1 (ko) 2013-02-26 2020-12-01 한미약품 주식회사 인슐린 위치 특이적 결합체
MX366400B (es) * 2013-02-26 2019-07-08 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Analogo de insulina novedoso y su uso.
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
SG10201800751WA (en) 2013-07-29 2018-03-28 Berkeley Information Tech Pty Ltd Systems and methodologies for managing document access permissions
MA39301A1 (fr) 2014-01-20 2018-01-31 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Insuline à action prolongée et utilisation associée
AR100639A1 (es) * 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR20160001391A (ko) * 2014-06-27 2016-01-06 한미약품 주식회사 신규한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도
KR20160007295A (ko) 2014-07-11 2016-01-20 한미약품 주식회사 인슐린 아날로그
KR101676542B1 (ko) 2014-12-30 2016-11-16 건국대학교 산학협력단 프로인슐린의 면역학적 용도
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
CN108473548A (zh) * 2015-09-24 2018-08-31 韩美药品股份有限公司 胰岛素生产方法
EP3517544A4 (en) * 2016-09-23 2020-06-03 Hanmi Pharm. Co., Ltd. INSULIN ANALOG HAVING REDUCED INSULIN RECEPTOR BINDING FORCE AND USE THEREOF

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