PT2254906T

PT2254906T - Análogos de insulina acilados, estabilizados contra proteases

Info

Publication number: PT2254906T
Application number: PT97229348T
Authority: PT
Inventors: Madsen Peter; Sten Petersen Jacob; William Garibay Patrick; Hoeg-Jensen Thomas; Møller Tagmose Tina; Børglum Kjeldsen Thomas; Jakobsen Palle; Glendorf Tine; Tibor Kodra János
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2008-03-18
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2017-01-03
Also published as: CN102037008A; IL250549B; US20190112348A1; EP2910570A1; ZA201006126B; KR20110004366A; JP2011515358A; CN102037008B; US20150210748A1; KR101755529B1; EP2910571B1; CA2718738C; HUE032287T2; CA2718738A1; IL207748A0; EP2910569A1; KR20160124929A; JP5749155B2; BRPI0910348A2; PT2910570T

Description

DESCRIÇÃO

"ANÁLOGOS DE INSULINA ACILADOS, ESTABILIZADOS CONTRA PROTEASES"

CAMPO DESTA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos análogos de insulina acilados que exibem resistência às proteases, a um método para a preparação de tais análogos de insulina, a preparações de insulina que contêm os análogos de insulina da invenção e a um método de tratamento de diabetes mellitus utilizando estes análogos de insulina.

ANTECEDENTES DESTA INVENÇÃO A diabetes mellitus é um distúrbio metabólico em que a capacidade para utilizar glicose é parcial ou completamente perdida. Cerca de 5% de todas as pessoas sofrem de diabetes e o distúrbio aproxima-se de proporções epidémicas. Desde a introdução da insulina nos anos de 1920, têm sido feitos esforços contínuos para melhorar o tratamento da diabetes mellitus. Uma vez que as pessoas que sofrem de diabetes são sujeitas a tratamento crónico durante várias décadas, há uma grande necessidade de formulações de insulina seguras, convenientes e que melhorem a qualidade de vida. A via oral é de longe a via mais amplamente utilizada para a administração de fármacos e é, em geral, muito bem aceite pelos doentes, especialmente para terapias crónicas. No entanto, a administração de péptidos ou proteínas terapêuticas está frequentemente limitada às vias parentéricas em vez da administração oral preferida devido a várias barreiras tais como a degradação enzimática no aparelho gastrointestinal (GI) e mucosa intestinal, bombas de efluxo de fármacos, absorção insuficiente e variável a partir da mucosa intestinal, bem como metabolismo na primeira passagem no fígado.

Normalmente, as formulações de insulina são administradas por injeção subcutânea. No entanto, a administração por outras vias, por exemplo, por via oral ou pulmonar, seria vantajosa devido à adesão à terapêutica pelo doente, segurança e conveniência. Algumas das formulações de insulina comercialmente disponíveis caracterizam-se por um início rápido de ação e outras formulações têm um início relativamente lento, mas exibem uma ação mais ou menos prolongada. É muito importante para os doentes diabéticos que haja, no mercado, uma grande variedade de insulinas com diferentes durações de ação (perfis de ação). Resumidamente, as insulinas podem ser classificadas como sendo de ação curta, intermédia ou prolongada. A WO 2008/034881 refere-se a certos análogos de insulina em que pelo menos dois aminoácidos hidrófobos foram substituídos por aminoácidos hidrófilos, análogos de insulina esses que não são acilados. A EP 2008/060733 e a EP 2008/060733 referem-se a certos análogos de insulina acilados em que o análogo de insulina compreende um prolongamento com um resíduo de aminoácido ou péptido ligado em posição C-terminal relativamente ao aminoácido A21. A EP 2008/060734 refere-se a certas insulinas aciladas em que uma unidade acilo está ligada à insulina parental e em que a referida unidade de acilo compreende unidades de repetição de aminoácidos que contêm alquileno glicol.

ASPETOS DESTA INVENÇÃO

Um aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que, quando administrados por via oral, podem dar um controlo satisfatório do nivel de glicose no sangue.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que, quando administrados por via oral, podem dar uma diminuição prolongada do nivel de glicose

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que, quando administrados por via oral, podem dar uma diminuição prolongada do nivel de glicose

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que, quando administrados por via oral, podem dar um controlo satisfatório do nivel de glicose no sangue após a administração três vezes por dia.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que, quando administrados por via oral, podem dar um controlo satisfatório do nivel de glicose no sangue após a administração duas vezes por dia.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que, quando administrados por via oral, podem dar um controlo satisfatório do nivel de glicose no sangue após a administração uma vez por dia.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que são hidrófilos.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que são mais hidrófilos do que a insulina humana.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que são menos hidrófobos do que a insulina humana, como medido pela hidrofobicidade relativa (k'rel) como se descreve aqui.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que são menos hidrófobos do que as insulinas parentais não estabilizadas contra proteases semelhantes aciladas com a mesma unidade acilo, como medido pela hidrofobicidade relativa (k'rel) como se descreve aqui. As k'rel dos análogos de insulina basal da invenção são preferencialmente inferiores a 5, mais preferencialmente inferiores a 3, mais preferencialmente inferiores a 2, mais preferencialmente inferiores a 1, mais preferencialmente inferiores a 0,8, mais preferencialmente inferiores a 0,6, mais preferencialmente inferiores a 0,5, mais preferencialmente inferiores a 0,4, mais preferencialmente inferiores a 0,3, mais preferencialmente inferiores a 0,2, mais preferencialmente inferiores a 0,1.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que, quando administrados por via oral, têm biodisponibilidades satisfatórias. Em comparação com as biodisponibilidades de insulinas aciladas semelhantes sem as mutações estabilizadoras contra as proteases administradas em doses semelhantes, a biodisponibilidade dos compostos preferidos desta invenção é pelo menos 10% superior, preferencialmente 20% superior, preferencialmente 25% superior, preferencialmente 30% superior, preferencialmente 35% superior, preferencialmente 40% superior, preferencialmente 45% superior, preferencialmente 50% superior, preferencialmente 55% superior, preferencialmente 60% superior, preferencialmente 65% superior, preferencialmente 70% superior, preferencialmente 80% superior, preferencialmente 90% superior, preferencialmente 100% superior, preferencialmente mais do que 100% superior do que aquela do comparador não estabilizado contra proteases.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que, quando administrados por via oral, têm biodisponibilidades satisfatórias. As biodisponibilidades dos compostos preferidos desta invenção (relativamente à administração i.v.) são de pelo menos 0,3%, preferencialmente >0,5%, preferencialmente >1%, preferencialmente >1,5%, preferencialmente >2%, preferencialmente >2,5%, preferencialmente >3%, preferencialmente >3,5%, preferencialmente >4%, preferencialmente >5%, preferencialmente >6%, preferencialmente >7%, preferencialmente >8%, preferencialmente >9%, preferencialmente >10%.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina basal que, quando administrados por infusão intravenosa, têm potências satisfatórias. Em comparação com a potência da insulina humana, as potências dos análogos de insulina estabilizados contra proteases preferidos da invenção são preferencialmente >5%, preferencialmente >10%, preferencialmente >20%, preferencialmente >30%, preferencialmente >40%, preferencialmente >50%, preferencialmente >75% e preferencialmente >100% .

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que, quando administrados por via pulmonar, podem dar um controlo satisfatório do nivel de glicose no sangue.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que, quando administrados por via pulmonar, podem dar um controlo satisfatório do nivel de glicose no sangue com um início relativamente lento de ação e/ou uma ação mais ou menos prolongada.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que têm uma ação prolongada satisfatória após administração pulmonar. Em comparação com uma insulina acilada semelhante sem mutações estabilizadoras contra as proteases administrada em doses semelhantes, a duração de ação dos compostos preferidos desta invenção é pelo menos 10% mais longa, preferencialmente 20% mais longa, preferencialmente 25% mais longa, preferencialmente 30% mais longa, preferencialmente 35% mais longa, preferencialmente 40% mais longa, preferencialmente 45% mais longa, preferencialmente 50% mais longa, preferencialmente 55% mais longa, preferencialmente 60% mais longa, preferencialmente 65% mais longa, preferencialmente 70% mais longa, preferencialmente 80% mais longa, preferencialmente 90% mais longa, preferencialmente 100% mais longa, preferencialmente mais do que 100% mais longa do que aquela do comparador. A duração de ação pode ser medida pelo tempo em que a glicose no sangue é suprimida, ou medindo propriedades farmacocinéticas relevantes, por exemplo tu ou MRT (tempo de residência médio).

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que têm uma biodisponibilidade pulmonar satisfatória. Em comparação com a biodisponibilidade da insulina humana ou em comparação com a insulina acilada semelhante sem mutações estabilizadoras contra as proteases administradas em doses semelhantes, a biodisponibilidade dos compostos preferidos desta invenção é pelo menos 10% superior, preferencialmente 20% superior, preferencialmente 25% superior, preferencialmente 30% superior, preferencialmente 35% superior, preferencialmente 40% superior, preferencialmente 45% superior, preferencialmente 50% superior, preferencialmente 55% superior, preferencialmente 60% superior, preferencialmente 65% superior, preferencialmente 70% superior, preferencialmente 80% superior, preferencialmente 90% superior, preferencialmente 100% superior, preferencialmente mais do que 100% superior àquela do comparador.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que têm potência in vivo aparente aumentada.

Outro aspeto refere-se ao provimento de insulinas de ação prolongada com biodisponibilidade oral.

Outro aspeto refere-se ao provimento de análogos de insulina que têm uma estabilidade proteolitica aumentada em comparação com a estabilidade da insulina humana. Em comparação com a insulina humana, a estabilidade proteolitica dos compostos preferidos desta invenção é pelo menos 2 vezes mais estável, preferencialmente 3 vezes mais estável, preferencialmente 4 vezes mais estável, preferencialmente 5 vezes mais estável, preferencialmente 6 vezes mais estável, preferencialmente 7 vezes mais estável, preferencialmente 8 vezes mais estável, preferencialmente 9 vezes mais estável, preferencialmente 10 vezes mais estável, preferencialmente 12 vezes mais estável, preferencialmente 14 vezes mais estável, preferencialmente 16 vezes mais estável, preferencialmente 18 vezes mais estável, preferencialmente 20 vezes mais estável, preferencialmente 25 vezes mais estável, preferencialmente mais do que 25 vezes mais estável do que aquela do comparador. A estabilidade proteolitica pode ser medida por exposição das insulinas a (uma mistura de) enzimas proteolíticas, por exemplo um extrato de enzimas intestinais como se descreve aqui. 0 objetivo desta invenção é superar ou melhorar pelo menos uma das desvantagens da técnica anterior, ou proporcionar uma alternativa útil.

DEFINIÇÕES

Aqui, o termo insulina cobre insulinas naturais, por exemplo, insulina humana, bem como análogos de insulina das mesmas. A insulina humana consiste em duas cadeias polipeptidicas, as chamadas cadeias A e B que contêm 21 e 30 resíduos de aminoácidos, respetivamente, e que estão interconectadas por duas pontes dissulfureto entre cistinas.

Aqui, o termo resíduo de aminoácido cobre um aminoácido a partir do qual um átomo de hidrogénio foi removido de um grupo amino e/ou um grupo hidroxilo foi removido de um grupo carboxilo e/ou um átomo de hidrogénio foi removido de um grupo mercapto. Impreciso, um resíduo de aminoácido pode ser designado um aminoácido.

Aqui, os aminoácidos hidrófobos devem ser entendidos como os aminoácidos naturais triptofano (Trp, W) , fenilalanina (Phe, F) , valina (Vai, V), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L) e tirosina (Tyr, Y) (com a abreviatura de três letras e a de uma letra entre parêntesis).

Aqui, os aminoácidos hidrófilos devem ser entendidos como os aminoácidos naturais que não são aminoácidos hidrófobos de acordo com a definição anterior. Numa forma de realização, os ácidos hidrófilos de acordo com a invenção são selecionados do grupo que consiste em: ácido glutâmico (Glu, E) , ácido aspártico (Asp, D) , histidina (His, H) , glutamina (Gin, Q) , asparagina (Asn, N) , serina (Ser, S) , treonina (Thr, T) , prolina (Pro, P) , glicina (Gly, G) , lisina (Lys, K) e arginina (Arg, R) . Numa outra forma de realização, os aminoácidos hidrófilos de acordo com a invenção são selecionados do grupo que consiste em: ácido glutâmico (Glu, E) , ácido aspártico (Asp, D) , histidina (His, H) , glutamina (Gin, Q) , asparagina (Asn, N), lisina (Lys, K) e arginina (Arg, R).

Aqui, o termo análogo de insulina cobre um polipéptido que tem uma estrutura molecular que formalmente pode ser derivada da estrutura de uma insulina natural, por exemplo, insulina humana, por supressão e/ou substituição (troca) de um ou mais resíduos de aminoácidos que ocorrem na insulina natural e/ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos. Os resíduos de aminoácidos adicionados e/ou substituídos podem ser resíduos de aminoácidos codificáveis ou outros resíduos de aminoácidos naturais ou resíduos de aminoácidos puramente sintéticos. Numa forma de realização preferida, o análogo de insulina tem duas ou mais mutações em comparação com a insulina humana.

Aqui, o termo insulina estabilizada contra proteases significa a insulina sem uma unidade acilo apensa. As referidas insulinas estabilizadas contra proteases têm uma estabilidade melhorada contra a degradação por proteases.

Aqui, o termo insulina parental significa a insulina sem uma unidade acilo apensa e sem mutações para melhorar a estabilidade contra a degradação por proteases. As referidas insulinas parentais têm opcionalmente mutações relativamente à insulina humana. Assim, as insulinas parentais são também análogos de insulina como definidos acima. Aqui, os termos insulina parental e insulina não estabilizada contra proteases cobrem os mesmos compostos.

Aqui, o termo mutação cobre qualquer alteração na sequência de aminoácidos (substituições e inserções com aminoácidos codificáveis bem como supressões).

Aqui, o termo análogos da cadeia A e análogos da cadeia B de insulina humana cobrem as cadeias A e B de insulina humana, respetivamente, que têm uma ou mais substituições, supressões e ou extensões (adições) das cadeias de aminoácidos A e B, respetivamente, relativamente às cadeias A e B, respetivamente, de insulina humana.

Aqui, termos como Al, A2, A3 etc. indicam a posição 1, 2 e 3, respetivamente, na cadeia A de insulina (contada a partir da extremidade N-terminal). De forma semelhante, os termos como Bl, B2, B3 etc. indicam a posição 1, 2 e 3, respetivamente, na cadeia B de insulina (contada a partir da extremidade N-terminal). Utilizando os códigos de uma letra para aminoácidos, os termos como A21A, A21G e A21Q indicam que o aminoácido na posição A21 é A, G e Q, respetivamente. Utilizando os códigos de três letras para os aminoácidos, as expressões correspondentes são AlaA21, GlyA21 e GlnA21, respetivamente.

Aqui, os termos A(0) ou B(0) indicam as posições que estão contíguas N-terminalmente em relação às posições Al ou Bl, respetivamente, nas cadeias A ou B, respetivamente. Os termos A(-l) ou B(-l) indicam as posições dos primeiros aminoácidos em posição N-terminal relativamente A(0) ou B(0), respetivamente. Assim, A(-2) e B(-2) indicam posições que estão N-terminalmente em relação a A(-l) e B(-l), respetivamente, A(-3) e B(-3) indicam posições que estão N-terminalmente em relação a A(-2) e B(-2), respetivamente, e assim sucessivamente.

Aqui, termos como desB29 e desB30 indicam um análogo de insulina que carece do resíduo de aminoácido B29 ou B30, respetivamente.

Aqui, o termo "insulina de ação rápida" cobre uma insulina que tem um início de ação mais rápido do que a insulina humana normal ou regular.

Aqui, o termo "insulina de ação prolongada" ou o termo "insulina basal" cobre uma insulina que tem uma duração de ação mais longa do que a insulina humana normal ou regular. Preferencialmente, o tempo de ação é mais do que 5 ou 8 horas, em particularmente de pelo menos 9 horas. Preferencialmente, a insulina basal tem um tempo de ação de pelo menos 10 horas. Assim, a insulina basal pode ter um tempo de ação na gama desde cerca de 8 a 24 horas, preferencialmente na gama desde cerca de 9 a cerca de 15 horas. A numeração das posições nos análogos de insulina, insulinas e cadeias A e B é feita de tal forma que o composto parental seja insulina humana com a numeração utilizada para esta.

Aqui, o termo "insulina acilada" cobre a modificação de insulina por fixação de uma ou mais unidades acilo através de uma unidade de ligação à insulina estabilizada contra proteases.

Por insulina acilada que tem atividade de insulina entende-se uma insulina acilada quer com capacidade para diminuir a glicose no sangue em mamíferos como medida num modelo animal adequado, o qual pode ser, por exemplo, um modelo de ratazana, coelho ou porco, após administração adequada, por exemplo, por administração intravenosa ou subcutânea, quer com uma afinidade de ligação ao recetor de insulina.

Aqui, o termo alquilo cobre um grupo hidrocarboneto linear ou ramificado, saturado.

Aqui, o termo alcoxilo cobre o radical "alquil-O-". Os exemplos representativos são metoxilo, etoxilo, propoxilo (por exemplo, 1-propoxilo e 2-propoxilo) , butoxilo (por exemplo, 1-butoxilo, 2-butoxilo e 2-metil-2-propoxilo), pentoxilo (1-pentoxilo e 2-pentoxilo), hexoxilo (1-hexoxilo e 3-hexoxilo), e semelhantes.

Aqui, o termo alquileno cobre um grupo hidrocarboneto bivalente linear ou ramificado, saturado que tem desde 1 a 12 átomos de carbono. Os exemplos representativos incluem, mas não se limitam a, metileno; 1,2-etileno; 1,3-propileno; 1,2-propileno; 1,3-butileno; 1,4-butileno; 1,4-pentileno; 1,5-pentileno; 1,5-hexileno; 1,6-hexileno; e semelhantes.

Aqui, o termo "aminoácido linear neutro" cobre. Os exemplos não limitativos de aminoácidos lineares neutros são.

Aqui, o termo "aminoácido cíclico" cobre. Os exemplos não limitativos de aminoácidos cíclicos são.

Aqui, o termo "aminoácido ácido" cobre. Os exemplos não limitativos de aminoácidos ácidos são.

Aqui, o termo "ácido gordo" cobre um ácido carboxílico alifático linear ou ramificado, que tem pelo menos dois átomos de carbono e que é saturado ou insaturado. Os exemplos não limitativos de ácidos gordos são ácido mirístico, ácido palmítico e ácido esteárico.

Aqui, o termo "diácido gordo" cobre um ácido dicarboxilico alifático, linear ou ramificado que tem pelo menos dois átomos de carbono e que é saturado ou insaturado. Os exemplos não limitativos de diácidos gordos são ácido succinico, ácido hexanodioico, ácido octanodioico, ácido decanodioico, ácido dodecanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido hexadecanodioico, ácido heptadecanodioico, ácido octadecanodioico e ácido eicosanodioico.

Aqui, a nomenclatura das insulinas é feita de acordo com os seguintes princípios: Os nomes são dados como mutações e modificações (acilações) relativamente à insulina humana. Para a nomenclatura da unidade acilo, a nomenclatura é feita de acordo com a nomenclatura IUPAC e noutros casos como nomenclatura de péptidos. Por exemplo, a nomenclatura da unidade acilo:

pode ser, por exemplo, "octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG", ou "17-carboxi-heptadecanoil-YGlu-0EG-0EG", em que OEG é a notação abreviada para o aminoácido NH2 (CH2) 20 (CH2) 2och2co2h, YGlu é a notação abreviada para o aminoácido ácido gama-glutâmico.

Outras notações abreviadas para aminoácidos são, por exemplo:

PEG3 é NH2 ( (CH2) 20) 4CH2CH2C02H PEG7 é NH2 ( (CH2)20)8CH2CH2C02H

Por exemplo, a insulina do exemplo 9 (com a sequência/estrutura dada abaixo) é denominada "insulina humana A14E, B25H, B29K(NsOctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30" para indicar que o aminoácido na posição A14, Y na insulina humana, foi mutado para E, o aminoácido na posição B25, F na insulina humana, foi mutado para Η, o aminoácido na posição B29, K como na insulina humana, foi modificado por acilação no azoto épsilon no resíduo de lisina de B29, indicado i\f, pelo resíduo octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG, e o aminoácido na posição B30, T na insulina humana, foi suprimido. Os asteriscos na fórmula abaixo indicam que o resíduo em questão é diferente (isto é, mutado) em comparação com a insulina humana. Ao longo deste pedido são dados tanto as fórmulas como os nomes das insulinas preferidas da invenção

Aqui, o termo "estabilidade química" e "alta estabilidade química", significa que quimicamente, as insulinas da invenção são suficientemente estáveis na formulação desejada. Isto é, que os produtos de degradação química só se formam em quantidades que não comprometem o período de conservação do produto farmacológico final. Os produtos de degradação química incluem produtos de desamidação, formação de iso-aspartato, formação de dímeros, produtos de racemização, produtos resultantes de processos de desidratação etcétera. A estabilidade química pode ser medida através de análises por HPLC de amostras ou formulações envelhecidas.

Aqui, o termo "alta estabilidade física" cobre uma tendência para que a fibrilação seja inferior a 50% daquela da insulina humana. A fibrilação pode ser descrita pelo período de atraso antes que se inicie a formação de fibrilha em determinadas condições.

Um polipéptido com afinidade para o recetor de insulina e para o recetor de IGF-1 é um polipéptido que é capaz de interagir com um recetor de insulina e um recetor de IGF-1 humano num ensaio de ligação adequado. Tais ensaios de recetores são bem conhecidos no campo e são adicionalmente descritos nos exemplos. A presente insulina acilada não se ligará ao recetor de IGF-1 ou terá uma afinidade extremamente baixa para o referido recetor. De forma mais precisa, as insulinas aciladas desta invenção terão uma afinidade para o recetor de IGF-1 essencialmente da mesma ordem de grandeza ou menor que aquela da insulina humana O termo "farmaceuticamente aceitável" como aqui utilizado significa adequado para aplicações farmacêuticas normais, isto é, que não dá origem a eventos adversos graves nos doentes etc.

Os termos tratamento e tratar como aqui utilizados significam a gestão e prestação de cuidados de um doente para combater uma doença, distúrbio ou condição. O termo destina-se a incluir o atraso na progressão da doença, distúrbio ou condição, a mitigação ou alívio de sintomas e complicações, e/ou a cura ou eliminação da doença, distúrbio ou condição. 0 doente a ser tratado é preferencialmente um mamífero, em particular um ser humano. 0 termo tratamento de uma doença como aqui utilizado significa a gestão e prestação de cuidados a um doente que desenvolveu a doença, condição ou distúrbio. 0 objetivo do tratamento é combater a doença, condição ou distúrbio. 0 tratamento inclui a administração dos compostos ativos para eliminar ou controlar a doença, condição ou distúrbio bem como para aliviar os sintomas ou complicações associadas à doença, condição ou distúrbio. 0 termo prevenção de uma doença como aqui utilizado é definido como a gestão e prestação de cuidados a um indivíduo em risco de desenvolver a doença antes do início da doença clinica. 0 objetivo da prevenção é combater o desenvolvimento da doença, condição ou distúrbio, e inclui a administração dos compostos ativos para prevenir ou retardar o inicio dos sintomas ou complicações e para prevenir ou retardar o desenvolvimento de doenças, condições ou distúrbios relacionados. 0 termo quantidade eficaz como aqui utilizado significa uma dose que é suficiente para que o tratamento do doente seja eficaz em comparação com um doente sem tratamento. POT é o gene da triose-fosfato-isomerase de Schizosaccharomyces pombe, e TPI1 é o gene da triose-fosfato-isomerase de S. cerevisiae.

Por um lider entende-se uma sequência de aminoácidos que consiste em um pré-péptido (o péptido sinal) e um pró-péptido. 0 termo péptido sinal é entendido como significando um pré-péptido que está presente como uma sequência N-terminal na forma precursora de uma proteína. A função do péptido sinal é permitir que a proteína heteróloga facilite a translocação para o retículo endoplasmático. 0 péptido sinal é normalmente dissociado no decurso deste processo. 0 péptido sinal pode ser heterólogo ou homólogo ao organismo de levedura que produz a proteína. Um número de péptidos sinal que pode ser utilizado com a construção de ADN inclui o péptido sinal da protease aspártica 3 de levedura (YAP3) ou qualquer análogo funcional (Egel-Mitani et al. (1990) YEAST 6:127-137 e US 5,726, 038) e o sinal do fator α do gene de MFal (Thorner (1981) em The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern et al., eds., pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY e US 4,870,00.

Aqui, o termo "pró-péptido" cobre uma sequência polipeptídica cuja função é permitir que o polipéptido expressado seja direcionado do retículo endoplasmático para o aparelho de Golgi e posteriormente para uma vesícula secretora para secreção para o meio de cultura (isto é, exportação do polipéptido através da parede celular ou pelo menos através da membrana celular para o espaço periplasmático da célula de levedura). O pró-péptido pode ser o pró-péptido do fator α de levedura, vide US 4,546,082 e 4,870,008. Alternativamente, o pró-péptido pode ser um pró-péptido sintético, ou seja um pró-péptido que não se encontra na natureza. Os pró-péptidos sintéticos adequados são aqueles divulgados na US 5,395,922; 5,795,746; 5,162,498 e WO 98/32867. O pró-péptido conterá preferencialmente um sítio de processamento por endopeptidases na extremidade C-terminal, tal como uma sequência Lys-Arg ou qualquer análogo funcional da mesma. A menos que se indique explicitamente, os aminoácidos aqui mencionados são L-aminoácidos. Além disso, as extremidades esquerda e direita de uma sequência de aminoácidos de um péptido são, respetivamente, as extremidades N- e exterminais, salvo indicação em contrário.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Determinou-se que as insulinas que são estabilizadas contra a degradação proteolítica (por mutações especificas) e aciladas na lisina B29 são eficazes e prolongadas e possuem alto potencial como insulinas prolongadas que podem ser administradas por via pulmonar ou oral. A acilação confere ligação à albumina sérica e, consequentemente, protraimento. Além disso, as insulinas aciladas da invenção apresentam redução substancial da afinidade para o recetor de insulina, em comparação com as insulinas aciladas semelhantes que não são estabilizadas contra a degradação proteolítica. Esta redução na afinidade para o recetor de insulina das insulinas ligadas a albumina da invenção contribui para o protraimento da insulina acilada em circulação, uma vez que a insulina é internalizada e degradada após ativação do recetor. Por conseguinte, a depuração das insulinas da invenção é reduzida. A redução da afinidade para o recetor de insulina provavelmente não origina uma perda de potência, por exemplo, como medida no clamp euglicémico hiperinsulinémico como se descreve aqui. A combinação da alta afinidade de ligação à albumina e da baixa afinidade para o recetor de insulina é, assim, benéfica para se obter uma longa duração de ação das insulinas (insulinas basais). Além disso, após administração oral, estas insulinas aciladas têm um grau mais elevado de biodisponibilidade do que as insulinas aciladas conhecidas semelhantes, que não são estabilizadas contra a degradação proteolítica. Consequentemente, estes análogos de insulina acilados são valiosos para administração oral. De forma semelhante, após administração pulmonar, estas insulinas estabilizadas contra proteases aciladas apresentam potência e/ou biodisponibilidade aparente mais alta do que as insulinas aciladas conhecidas semelhantes, que não são estabilizadas contra a degradação proteolítica. Além disso, estas insulinas estabilizadas contra proteases aciladas apresentam perfis tempo-ação prolongados quando administrados por via pulmonar a mamíferos. Consequentemente, estes análogos de insulina acilados são valiosos para administração pulmonar.

As insulinas supramencionadas que são estabilizadas contra a degradação proteolítica são aqui designadas insulinas estabilizadas contra proteases. A molécula de insulina estabilizada contra proteases tem um número limitado de resíduos de aminoácidos naturais substituídos por outros resíduos de aminoácidos relativamente à insulina humana como se explica na parte detalhada da descrição.

Numa forma de realização, esta divulgação refere-se a uma insulina acilada, em que o análogo de insulina estabilizado contra proteases desvia-se da insulina humana em uma ou mais das seguintes supressões ou substituições: Q na posição A18, A, G ou Q na posição A21, G ou Q na posição Bl ou nenhum residuo de aminoácido na posição Bl, Q, S ou T na posição B3 ou nenhum resíduo de aminoácido na posição B3, Q na posição B13, nenhum resíduo de aminoácido na posição B27, D, E ou R na posição B28 e nenhum aminoácido na posição B30.

Ainda num outro aspeto, esta divulgação refere-se a preparações farmacêuticas que compreendem a insulina acilada desta invenção e adjuvantes e aditivos adequados tais como um ou mais agentes adequados para estabilização, conservação ou isotonicidade, por exemplo, iões de zinco, fenol, cresol, um parabeno, cloreto de sódio, glicerol ou manitol. 0 teor de zinco das presentes formulações pode situar-se entre 0 e cerca de 6 átomos de zinco por 6 moléculas de insulina. 0 valor de pH da preparação farmacêutica pode ser entre cerca de 4 e cerca de 8,5, entre cerca de 4 e cerca de 5 ou entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5.

Numa outra forma de realização, esta divulgação refere-se à utilização da insulina acilada como um fármaco para a redução dos níveis de glicose no sangue em mamíferos, em particularmente para o tratamento de diabetes.

Num outro aspeto, esta divulgação refere-se à utilização da insulina acilada para a preparação de uma preparação farmacêutica para a redução do nível de glicose no sangue em mamíferos, em particular para o tratamento de diabetes.

Numa outra forma de realização, esta divulgação refere-se a um método para reduzir o nível de glicose no sangue em mamíferos por administração de uma dose terapeuticamente ativa de uma insulina acilada desta invenção a um doente que necessita desse tratamento.

Num outro aspeto, as insulinas aciladas são administradas em associação com uma ou mais substâncias ativas adicionais em quaisquer proporções adequadas. Esses outros agentes ativos podem ser selecionados de insulina humana, análogos de insulina de ação rápida, agentes antidiabéticos, agentes anti-hiperlipidémicos, agentes antiobesidade, agentes anti- hipertensores e agentes para o tratamento de complicações que resultam de ou estão associadas à diabetes.

Numa forma de realização, os dois componentes ativos são administrados como uma preparação farmacêutica mista. Noutra forma de realização, os dois componentes são administrados em separado quer simultânea ou sequencialmente.

Numa forma de realização, as insulinas aciladas desta invenção podem ser administradas em conjunto com insulina humana ou análogos de insulina humana de ação rápida. Tal análogo de insulina de ação rápida pode ser um em que o resíduo de aminoácido na posição B28 é Asp, Lys, Leu, Vai, ou Ala e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro, insulina humana des(B28-B30), insulina humana des(B27) ou insulina humana des(B30), e um análogo em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Glu ou Asp. A insulina acilada desta invenção e a insulina humana ou análogo de insulina humana de ação rápida podem ser misturados num proporção de cerca de 90% da insulina acilada para cerca de 10% da insulina humana ou análogo de insulina humana de ação rápida; preferencialmente de cerca de 70% da insulina acilada para cerca de 30% da insulina humana ou análogo de insulina humana de ação rápida, e ainda mais preferencialmente de cerca de 50% da insulina acilada para cerca de 50% da insulina humana ou análogo de insulina humana de ação rápida (em que % é a percentagem em peso).

As insulinas aciladas desta invenção podem ser também utilizadas em tratamento de associação em conjunto com um agente antidiabético.

Os agentes antidiabéticos incluirão insulina, GLP-l(l-37) (péptido semelhante a glucagina 1) descrito em WO 98/08871, WO 99/43706, US 5424286, WO 00/09666, WO 2006/097537, PCT/EP2008/061755 e PCT/EP2008/061830, GLP-2, exendina-4(1-39) , fragmentos insulinotrópicos dos mesmos, análogos insulinotrópicos dos mesmos e derivados insulinotrópicos dos mesmos. Os fragmentos insulinotrópicos de GLP-l(l-37) são péptidos insulinotrópicos para os quais a sequência completa pode ser encontrada na sequência de GLP-1 (1-37) e onde foi suprimido pelo menos um terminal aminoácido.

As insulinas aciladas desta invenção podem ser também utilizadas em tratamento de associação em conjunto com um antidiabético oral tal como uma tiazolidinadiona, metformina e outra preparação farmacêutica para a diabetes tipo 2 para tratamento oral.

Além disso, a insulina acilada desta invenção pode ser administrada em associação com um ou mais agentes antiobesidade ou agentes de regulação do apetite.

Numa forma de realização esta divulgação refere-se a uma preparação farmacêutica pulmonar que compreende a insulina acilada desta invenção e adjuvantes e aditivos adequados tais como um ou mais agentes adequados para estabilização, conservação ou isotonicidade, por exemplo, iões de zinco, fenol, cresol, um parabeno, cloreto de sódio, glicerol, propilenoglicol ou manitol.

Deve ser entendido que qualquer associação adequada das insulinas aciladas com dieta e/ou exercício físico, um ou mais dos compostos supramencionados e opcionalmente uma ou mais outras substâncias ativas é considerada como estando no âmbito desta invenção.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

As propriedades de estabilidade e solubilidade da insulina são aspetos subjacentes importantes para a terapia de insulina corrente. Esta invenção é dirigida a estes aspetos ao proporcionar análogos de insulina acilados estáveis em que a acilação diminui a flexibilidade molecular e reduz, concomitantemente, a propensão para a fibrilação e limita ou modifica a zona de precipitação do pH.

As insulinas aciladas desta invenção destinam-se particularmente à administração pulmonar ou oral devido à sua biodisponibilidade relativamente alta em comparação com, por exemplo, a insulina humana e a insulina humana acilada. Além disso, as insulinas aciladas terão uma atividade de insulina prolongada.

Como mencionado acima, as insulinas que são estabilizadas contra a degradação proteolítica são aqui designadas insulinas estabilizadas contra proteases. As insulinas aciladas desta invenção são as referidas insulinas estabilizadas contra proteases que foram aciladas como se descreve aqui.

As referidas insulinas estabilizadas contra proteases são derivadas de compostos de insulina que são aqui designados como insulinas parentais ou insulinas não estabilizadas contra proteases.

Numa forma de realização uma insulina parental é selecionada do grupo que consiste em a) insulina humana; b) um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B28 é Pro, Asp, Lys, Leu, Vai, ou Ala e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro e opcionalmente o resíduo de aminoácido na posição B30 está suprimido; c) um análogo de insulina que é insulina humana des (B28-B30) , insulina humana des(B27) ou insulina humana des(B30); d) um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Glu ou Asp; e) um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição A21 é Gly e em que o análogo de insulina é adicionalmente prolongado na extremidade C-terminal com dois resíduos de arginina; f) um derivado de insulina em que o resíduo de aminoácido na posição B30 está substituído por um éster metílico de treonina; e g) um derivado de insulina em que à posição Νε da lisina na posição B29 da insulina humana des (B30) está ligada uma cadeia de tetradecanoílo. Cada um destes grupos é uma forma de realização específica.

Noutra forma de realização, uma insulina parental é selecionada do grupo que consiste em insulina humana; insulina humana desB30; insulina humana AspB28; insulina humana AspB28, DesB30; insulina humana LysB3, GluB29; insulina humana LysB28, ProB29; insulina humana GlyA21, ArgB31, ArgB32; e insulina humana desB30, ArgB31, ArgB32.

Mais especificamente, a insulina estabilizada contra proteases é uma molécula de insulina que tem duas ou mais mutações da cadeia A e/ou B relativamente à insulina parental. Surpreendentemente, verificou-se que ao substituir dois ou mais aminoácidos hidrófobos dentro ou muito próximos de dois ou mais sítios de proteases numa insulina com aminoácidos hidrófilos, se obtém um análogo de insulina (isto é, uma insulina estabilizada contra proteases) que é proteoliticamente mais estável em comparação com a insulina parental. Num aspeto lato, uma insulina estabilizada contra proteases é um análogo de insulina em que pelo menos dois aminoácidos hidrófobos foram substituídos por aminoácidos hidrófilos relativamente à insulina parental, em que as substituições são dentro ou muito próximas de dois ou mais sítios de dissociação por proteases da insulina parental e em que tal análogo de insulina compreende opcionalmente ainda uma ou mais mutações adicionais.

Noutra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é um análogo de insulina em que • o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp e/ou o aminoácido na posição A14 é Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e • o aminoácido na posição B24 é His e/ou o aminoácido na posição B25 é His e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Gly ou Arg e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly ou Asp; e o qual compreende opcionalmente ainda uma ou mais mutações adicionais.

Noutra forma de realização uma insulina estabilizada contra proteases é um análogo que compreende as mutações B25H ou B25N em combinação com mutações em B27, opcionalmente em combinação com outras mutações.

Noutra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é um análogo que compreende as mutações B25H ou B25N em combinação com mutações em B27, opcionalmente em combinação com outras mutações. As mutações na posição B27 podem ser, por exemplo, Glu ou Asp. Estes análogos de insulina acilados estabilizados contra proteases que compreendem ambas as mutações em B25 e B27 têm propriedades vantajosas.

Noutra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é um análogo de insulina que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia A de fórmula 1: X3aA(-2)'X33A(-i)"X33Ao"Gly-ll6-Val-GIU-Gln-CyS-CyS-XaaA8-S6r-ll6-CyS-Xa3Ai2'Xa3Ai3-X33Ai4- X3aAi5-Leu-Glu-X3aAi8-Tyr-Cys-XaaA2i Fórmula (1) (SEQ ID No:l) e uma sequência de aminoácidos da cadeia B de fórmula 2:

XaaB(-2rXaaB(.i)-Xaa8o-XaaB1-XaaB2-X3aB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB1o-Leu-Val-Glu-

Ala-Leu-XaaBi6-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-

XaaB3o-XaaB3i-XaaB32 Fórmula (2) (SEQ ID No:2) em que

XaaA(-2> está ausente ou é Gly;

XaaA(-i> está ausente ou é Pro;

XaaA0 está ausente ou é Pro;

XaaA8 é independentemente selecionado de Thr e His;

XaaAi2 é independentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; XaaAi3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn,

Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaAi4 é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn,

Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaAi5 é independentemente selecionado de Gin, Asp e Glu; XaaAis é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; XaaA2i é independentemente selecionado de Asn e Gin;

XaaB(-2) está ausente ou é Gly;

XaaB(-i) está ausente ou é Pro;

XaaBo está ausente ou é Pro;

XaaBi está ausente ou é independentemente selecionado de Phe e Glu;

XaaB2 está ausente ou é Vai;

XaaB3 está ausente ou é independentemente selecionado de Asn e Gin;

XaaB4 é independentemente selecionado de Gin e Glu;

XaaBio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu;

XaaBi6 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu;

XaaB24 é independentemente selecionado de Phe e His;

XaaB25 é independentemente selecionado de Asn, Phe e His; XaaB26 está ausente ou é independentemente selecionado de

Tyr, His, Thr, Gly e Asp;

XaaB27 está ausente ou é independentemente selecionado de

Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaB28 está ausente ou é independentemente selecionado de

Pro, His, Gly e Asp;

XaaB29 está ausente ou é independentemente selecionado de

Lys, Arg e Gin; e, preferencialmente, XaaB29 está ausente ou é independentemente selecionado de Lys e Gin;

XaaB30 está ausente ou é Thr;

XaaB3i está ausente ou é Leu;

XaaB32 está ausente ou é Glu; o C-terminal pode estar opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácidos da cadeia A e a sequência de aminoácidos da cadeia B estão conectadas por pontes dissulfureto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ponte dissulfureto.

Noutra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é um análogo de insulina que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia A de fórmula 3:

Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-lle-Cys-XaaAi2-XaaAi3-XaaA14-XaaAi5-Leu-Glu-

XaaA18-Tyr-Cys-XaaA2i Fórmula (3) (SEQ ID No:3) e uma sequência de aminoácidos da cadeia B de fórmula 4:

XaaBi-Val-XaaB3-XaaBd-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaBio-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaBls-Leu-Val-

Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB3o Fórmula (4) (SEQ ID No:4) em que

XaaA8 é independentemente selecionado de Thr e His;

Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaAi4 é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp,

Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaAi5 é independentemente selecionado de Gin, Asp e Glu;

XaaAis é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin;

XaaA2i é independentemente selecionado de Asn, e Gin;

XaaBi é independentemente selecionado de Phe e Glu;

XaaB3 é independentemente selecionado de Asn e Gin;

XaaB4 é independentemente selecionado de Gin e Glu;

XaaBio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu;

XaaBi6 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin,

His, Arg, e Glu;

XaaB24 é independentemente selecionado de Phe e His;

XaaB26 está ausente ou é independentemente selecionado de

Tyr, His, Thr, Gly e Asp;

XaaB27 está ausente ou é independentemente selecionado de

Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaB28 está ausente ou é independentemente selecionado de

Pro, His, Gly e Asp;

XaaB29 está ausente ou é independentemente selecionado de Lys, Arg e Gin; e, preferencialmente, XaaB29 está ausente ou é independentemente selecionado de Lys e Gin;

XaaB30 está ausente ou é Thr; o C-terminal pode estar opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácidos da cadeia A e a sequência de aminoácidos da cadeia B estão conectadas por pontes dissulfureto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ponte dissulfureto.

Noutra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é um análogo de insulina em que

XaaA8 é independentemente selecionado de Thr e His;

XaaAi2 é independentemente selecionado de Ser e Glu;

XaaAi3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn,

Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu;

XaaAi4 é independentemente selecionado de Asp, His, e Glu; XaaAi5 é independentemente selecionado de Gin e Glu;

XaaAis é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin;

XaaA2i é independentemente selecionado de Asn, e Gin;

XaaBi é independentemente selecionado de Phe e Glu;

XaaB3 é independentemente selecionado de Asn e Gin;

XaaB4 é independentemente selecionado de Gin e Glu;

XaaBio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu;

XaaBi6 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin,

His, Arg, e Glu;

XaaB24 é independentemente selecionado de Phe e His;

XaaB25 é independentemente selecionado de Phe, Asn e His;

XaaB26 é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Gly e Asp;

XaaB27 é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, e Glu;

XaaB28 é independentemente selecionado de Pro, Gly e Asp; XaaB29 é independentemente selecionado de Lys e Gin;

Outras formas de realização de insulinas estabilizadas contra proteases são mencionadas abaixo.

Uma "protease" ou um "enzima protease" é uma enzima digestiva que degrada proteínas e péptidos e que se encontra em vários tecidos do corpo humano tais como por exemplo o estômago (pepsina) , o lúmen intestinal (quimotripsina, tripsina, elastase, carboxipeptidases,

etc.) ou superfícies da mucosa do aparelho GI (aminopeptidases, carboxipeptidases, enteropeptidases, dipeptidilpeptidases, endopeptidases, etc.), o fígado (enzima de degradação de insulina, catepsina D etc), e noutros tecidos.

Um análogo de insulina estável proteoliticamente (também designado como uma insulina estabilizada contra proteases) deve ser aqui entendido como um análogo de insulina, o qual é sujeito a uma degradação mais lenta por uma ou mais proteases relativamente à insulina humana. Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é sujeita a degradação mais lenta por uma ou mais proteases relativamente à insulina parental. Numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é estabilizada contra a degradação por uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em: pepsina (tal como, por exemplo, as isoformas pepsina A, pepsina B, pepsina C e/ou pepsina F) , quimotripsina (tal como, por exemplo, as isoformas quimotripsina A, quimotripsina B e/ou quimotripsina C) , tripsina, Enzima de Degradação de Insulina (IDE), elastase (tal como, por exemplo, as isoformas da elastase pancreática I e/ou II), carboxipeptidase (por exemplo, as isoformas carboxipeptidase A, carboxipeptidase A2 e/ou carboxipeptidase B) , aminopeptidase, catepsina D e outras enzimas presentes em extratos intestinais derivados de ratazana, porco ou ser humano.

Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é estabilizada contra a degradação por uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em: quimotripsina, tripsina, Enzima de Degradação de Insulina (IDE), elastase, carboxipeptidases, aminopeptidases e catepsina D. Numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é estabilizada contra a degradação por uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em: quimotripsina, carboxipeptidases e IDE. Ainda numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é estabilizada contra a degradação por uma ou mais enzimas selecionadas de: quimotripsina e carboxipeptidases. 0 Th pode ser determinado como se descreve nos exemplos como uma medição da estabilidade proteolítica de uma insulina estabilizada contra proteases com respeito a enzimas proteases tais como quimotripsina, pepsina e/ou carboxipeptidase A. Numa forma de realização, o 1¾ é aumentado relativamente à insulina humana. Numa outra forma de realização, o 1½ é aumentado relativamente à insulina parental. Ainda numa outra forma de realização, o 1¾ é aumentado pelo menos 2 vezes relativamente à insulina parental. Ainda numa outra forma de realização, o 1½ é aumentado pelo menos 3 vezes relativamente à insulina parental. Ainda numa outra forma de realização, o 1½ é aumentado pelo menos 4 vezes relativamente à insulina parental. Ainda numa outra forma de realização, o Th é aumentado pelo menos 5 vezes relativamente à insulina parental. Ainda numa outra forma de realização, o 1½ é aumentado pelo menos 10 vezes relativamente à insulina parental.

Uma maneira alternativa de medir a estabilidade proteolitica é medir a estabilidade relativa face a um comparador, por exemplo, insulina humana. A estabilidade relativa é defina como Th/i^ (comparador), em que Th e Th (comparador) são as semividas do análogo e do comparador, respetivamente, no ensaio de degradação. Na secção de exemplos, é proporcionada a estabilidade relativa de insulinas selecionadas da invenção face a uma mistura de enzimas extraída do duodeno de ratazanas (relativamente à insulina humana bem como relativamente a uma insulina resistente a proteases sem acilação).

Os sítios de dissociação por proteases (aqui também mencionados como sítios de proteases) devem ser entendidos como resíduos de aminoácidos que são reconhecidos por proteases e/ou resíduos de aminoácidos cuja ligação peptídica é dissociada por proteases. Os sítios de dissociação por proteases podem ser determinados estabelecendo os "pontos quentes" para dissociação através de análises por HPLC, MS ou LC-MS e/ou por previsão com base na especificidade enzimática da enzima protease para a qual se pretende determinar o sítio de dissociação por proteases. Um especialista na técnica saberá como determinar sítios de dissociação por proteases, por exemplo, com base nas especificidades das enzimas como, por exemplo, descrito em Handbook of Proteolytical Enzymes, 2nd ed., Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woesner, J.F. editors, Elsevier Academic Press 2004. Por exemplo, prevê-se que a quimotripsina dissocie ligações peptídicas C-terminais relativamente a resíduos aromáticos (Trp, Tyr, Phe ou Leu), que não sejam seguidos de Pro. De forma semelhante, prevê-se que a tripsina dissocie ligações peptídicas C-terminais relativamente aos resíduos básicos Lys ou Arg, que não sejam seguidos de Pro, prevê-se que a elastase dissocie resíduos C-terminais relativamente a Ala, Vai, Gly ou Ser e a carboxipeptidase A removerá qualquer aminoácido C-terminal, exceto Arg, Lys ou Pro. Prevê-se que a enzima de degradação de insulina (IDE) dissocie as seguintes posições da insulina humana B9-10, BlO-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14 e A14-15. O termo substituição de (um) aminoácido "dentro ou muito próximo" de um sítio de dissociação por proteases é aqui utilizado para indicar a substituição de um aminoácido dentro ou muito próximo de uma posição da insulina parental que se determinou que é um sítio de dissociação por proteases. Numa forma de realização, dois ou mais aminoácidos hidrófobos dentro ou muito próximos de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos, em que os referidos aminoácidos hidrófobos são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Numa outra forma de realização, dois ou mais aminoácidos hidrófobos within dois ou mais sítios de proteases on uma insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Ainda numa outra forma de realização, dois ou mais aminoácidos hidrófobos situados próximos de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Ainda numa forma de realização adicional, dois ou mais aminoácidos hidrófobos situados a dois aminoácidos de distância de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Ainda numa outra forma de realização, dois ou mais aminoácidos hidrófobos situados a três aminoácidos de distância de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Ainda numa forma de realização adicional, dois ou mais aminoácidos hidrófobos situados até quatro aminoácidos de distância de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Ainda numa outra forma de realização dois ou mais aminoácidos hidrófobos situados a um, dois ou três aminoácidos de distância ou dentro de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Ainda numa forma de realização adicional, dois ou mais aminoácidos hidrófobos situados a um ou dois aminoácidos de distância ou dentro de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos. Ainda numa outra forma de realização, dois ou mais aminoácidos hidrófobos situados próximos ou dentro de dois ou mais sítios de proteases numa insulina são substituídos por aminoácidos hidrófilos.

Uma insulina estabilizada contra proteases pode ter uma carga líquida que é diferente da carga líquida da insulina parental. Numa forma de realização, a carga líquida de uma insulina estabilizada contra proteases é mais positiva do que a carga líquida da insulina parental. Numa forma de realização, a carga líquida de uma insulina estabilizada contra proteases é mais negativa do que a carga líquida da insulina parental. Numa forma de realização, a carga liquida positiva média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre 0,5 e 5 como medida numa solução aquosa. Numa forma de realização, a carga liquida positiva média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre 1 e 5. Numa forma de realização, a carga liquida positiva média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre 1 e 4. Numa forma de realização, a carga liquida positiva média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre 1 e 3. Numa forma de realização, a carga liquida positiva média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre 2 e 3. Numa forma de realização, a carga liquida negativa média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre -0,5 e -5 como medida numa solução aquosa. Numa forma de realização, a carga liquida negativa média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre -1 e -5. Numa forma de realização, a carga liquida negativa média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre -1 e -4. Numa forma de realização, a carga liquida negativa média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre -1 e -3. Numa forma de realização, a carga liquida negativa média de uma insulina estabilizada contra proteases é entre -2 e -3.

Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases pode ter solubilidade aumentada relativamente à insulina humana. Numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 3-9. Ainda numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 4-8,5. Ainda numa forma de realização adicional, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 4-8. Ainda numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 4,5-8. Numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 5-8. Ainda numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 5,5-8. Numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 6-8.

Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina humana a pH 2-4.

Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases pode ter solubilidade aumentada relativamente à insulina parental. Numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 3-9. Ainda numa outra forma de realização uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 4-8,5. Ainda numa forma de realização adicional, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 4-8. Ainda numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 4,5-8. Ainda numa forma de realização adicional, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 5-8. Ainda numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 5,5-8. Numa outra forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 6-8.

Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental a pH 2-4.

Por "solubilidade aumentada a um dado pH" é entendido que se dissolve uma maior concentração de uma insulina estabilizada contra proteases numa solução aquosa ou tampão ao pH da solução relativamente à insulina parental. Os métodos para determinar se a insulina contida numa solução está dissolvida são conhecidos na técnica.

Numa forma de realização, a solução pode ser submetida a centrifugação durante 20 minutos a 30 000 g e, em seguida, a concentração de insulina no sobrenadante pode ser determinada por RP-HPLC. Se esta concentração é igual dentro do erro experimental à concentração de insulina originalmente utilizada para preparar a composição, então a insulina é totalmente solúvel na composição. Noutra forma de realização, a solubilidade da insulina numa composição pode ser simplesmente determinada examinando a olho o recipiente no qual a composição está contida. A insulina é solúvel se a solução é transparente ao olho e não existem partículas suspensas ou precipitadas nas paredes lateriais/fundo do recipiente.

Uma insulina estabilizada contra proteases pode ter potência e/ou biodisponibilidade aparente aumentada relativamente à insulina parental quando comparada após medição.

Os ensaios padrão para medir a potência de insulinas in vitro são conhecidos do especialista na técnica e incluem inter alia (1) ensaios de radiorrecetores de insulina, nos quais a potência relativa de uma insulina é definida como a razão de insulina para análogo de insulina necessária para deslocar 50% da 125I-insulina ligada especificamente aos recetores de insulina presentes nas membranas celulares, por exemplo, uma fração de membrana plasmática de fígado de ratazana; (2) ensaios de lipogénese, realizados, por exemplo, com adipócitos de ratazana, nos quais a potência relativa da insulina é definida como a razão de insulina para análogo de insulina necessária para conseguir 50% da conversão máxima de [3-3H]glicose em material extraível com orgânicos (isto é, lípidos); (3) ensaios de oxidação de glicose em células adiposas isoladas, nos quais a potência relativa do análogo de insulina é definida como a razão de insulina para análogo de insulina para conseguir 50% da conversão máxima de glicose-1-[14C] em [14C02] ; (4) radioimunoensaios de insulina, os quais podem determinar a imunogenicidade de análogos de insulina medindo a eficácia com que a insulina ou um análogo de insulina compete com a 125I-insulina na ligação a anticorpos anti-insulina específicos; e (5) outros ensaios que medem a ligação de insulina ou um análogo de insulina a anticorpos em amostras de plasma de sangue animal, tais como ensaios ELISA que têm anticorpos contra insulina específicos. A potência in vivo aparente aumentada pode ser estimada/visualizada por comparação dos perfis de glicose no sangue vs. tempo da insulina em questão com uma insulina semelhante sem mutações estabilizadoras contra as proteases administradas em doses semelhantes. A insulina da invenção terá um maior efeito de diminuição da glicose no sangue relativamente ao comparador.

Os ensaios padrão para medir a biodisponibilidade de insulina são conhecidos do especialista na técnica e incluem inter alia a medição das áreas sob a curva (AUC) relativas para a concentração da insulina em questão administrada por via pulmonar ou por via oral e intravenosa (i.v.) na mesma espécie. A quantificação das concentrações de insulina em amostras de sangue (plasma) pode ser feita utilizando, por exemplo, ensaios de anticorpos (ELISA) ou por espetrometria de massa. A administração pulmonar pode ser realizada por vários meios. Por exemplo, as insulinas podem ser administradas a ratazanas por instilação gota a gota, ou a porcos por insuflação de pó seco. A insulina estabilizada contra proteases pode ser opcionalmente analisada para sítios de proteases adicionais que possam ser sujeitos a substituições adicionais de um ou mais aminoácidos hidrófobos por aminoácidos hidrófilos. Uma insulina estabilizada contra proteases pode ser um análogo de insulina que tem pelo menos dois ácidos hidrófilos em sítios de proteases em comparação com a insulina parental, a primeira insulina modificada, e a qual tem pelo menos mais uma substituição de aminoácido num novo sítio de protease da primeira insulina modificada em que pelo menos um aminoácido hidrófobo foi substituído por pelo menos um aminoácido hidrófilo.

Por uma questão de conveniência, proporciona-se a seguir os nomes de aminoácidos naturais codificáveis com os códigos de três letras & códigos de uma letra correntes entre parêntesis: Glicina (Gly & G) , prolina (Pro & P) , alanina (Ala & A), valina (Vai & V), leucina (Leu & L), isoleucina (lie & I), metionina (Met & M), cisteína (Cys & C) , fenilalanina (Phe & F), tirosina (Tyr & Y), triptofano (Trp & W), histidina (His & H), lisina (Lys & K), arginina (Arg & R) , glutamina (Gin & Q) , asparagina (Asn & N) , ácido glutâmico (Glu & E), ácido aspártico (Asp & D), serina (Ser & S) e treonina (Thr & T). Se, devido a erros de datilografia, existirem desvios dos códigos comummente utilizados, aplicam-se os códigos comummente utilizados. Os aminoácidos presentes nas insulinas desta invenção são, preferencialmente, aminoácidos que podem ser codificados por um ácido nucleico. Numa forma de realização, a insulina ou um análogo de insulina está substituído com Gly, Glu, Asp, His, Gin, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg e/ou Pro, e/ou é adicionado Gly, Glu, Asp, His, Gin, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg e/ou Pro à insulina ou um análogo de insulina. Numa forma de realização a insulina ou um análogo de insulina está substituído com Glu, Asp, His, Gin, Asn, Lys e/ou Arg, e/ou é adicionado Glu, Asp, His, Gin, Asn, Lys e/ou Arg à insulina ou um análogo de insulina.

Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é selecionada do grupo que consiste nos seguintes compostos: insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14H, B25H, desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B28D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, Bl E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, BlE, B25H, desB30; insulina humana A8H, A14E, BlE, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, BlE, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, desB30; insulina humana A14E, BlE, B27E, desB30; insulina humana A14E, B27E, desB30; insulina humana A14E, B28D, desB30; insulina humana A14E, B28E, desB30; insulina humana A14E, Bl E, B28E, desB30; insulina humana A14E, BlE, B27E, B28E, desB30; insulina humana A14E, BlE, B25H, B28E, desB30; insulina humana A14E, BlE, B25H, B27E, B28E, desB30; insulina humana A14D, B25H, desB30; insulina humana B25N, B27E, desB30; insulina humana A8H, B25N, B27E, desB30; insulina humana A14E, B27E, B28E, desB30; insulina humana A14E, B25H, B28E, desB30; insulina humana B25H, B27E, desB30; insulina humana Bl E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, Bl E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A8H, B25H, B27E, desB30; insulina humana B25N, B27D, desB30; insulina humana A8H, B25N, B27D, desB30; insulina humana B25H, B27D, desB309; insulina humana A8H, B25H, B27D, desB30; insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A(-1)P, A(0)P, A14E, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B30T, B31 L, B32E; insulina humana A14E, B25H; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, BlOP, B25H, desB30; insulina humana A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B4E, B25H, desB30; insulina humana A14H, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14H, B10E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B24H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, ΒΙΕ, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, BlE, B25H, desB30; insulina humana A(-2)G, A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A (-2) G, A (-1) P, A ( 0 ) P, A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana A14E, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; A14E, B25H, B27H, insulina humana desB30; insulina humana A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A12E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A15E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13E, B25H, desB30; insulina humana A12E, B25H, desB30; insulina humana A15E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26D, B27E, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27N, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27D, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27Q, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27P, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27S, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27T, desB30; insulina humana A13R, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13D, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13Q, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13G, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13K, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13P, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13S, A14E, B25H, desB30; insulina humana A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16D, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14R, B25H, desB30; insulina humana A14N, B25H, desB30; insulina humana A14D, B25H, desB30; insulina humana A14Q, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14G, B25H, desB30; insulina humana A14H, B25H, desB30; insulina humana A8H, BlOD, B25H; e insulina humana A8H, A14E, B10E, B25H, desB30 e esta forma de realização pode compreender, opcionalmente, insulina humana A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana B25H, desB30; e insulina humana B25N, desB30.

Numa forma de realização preferida, uma insulina estabilizada contra proteases é selecionada do grupo que consiste nos seguintes compostos: insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana B25H, desB30 e insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30.

Numa forma de realização preferida, uma insulina estabilizada contra proteases é selecionada de qualquer um dos grupos acima que, além disso, contêm a mutação desB27.

Numa forma de realização preferida, uma insulina estabilizada contra proteases é selecionada do grupo que consiste nos seguintes compostos: insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, B29R, desB30 e insulina humana B25H, desB27, desB30.

Numa forma de realização, uma insulina estabilizada contra proteases é selecionada de qualquer um dos grupos acima que, além disso, contêm as seguintes mutações na posição A21 e/ou B3 para melhorar a estabilidade química: A21G, desA21, B3Q ou B3G.

Numa forma de realização preferida, uma insulina estabilizada contra proteases é selecionada das seguintes insulinas estabilizadas contra proteases: insulina humana A14E, A21G, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana A21G, B25H, desB30 e insulina humana A21G, B25N, desB30, e, preferencialmente, é selecionada das seguintes insulinas estabilizadas contra proteases: insulina humana A14E, A21G, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B16E, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana A21G, B25H, desB30 e insulina humana A21G, B25N, desB30.

Numa forma de realização preferida, uma insulina estabilizada contra proteases é acilada na posição B29, na posição de azoto épsilon de B29K.

Numa forma de realização preferida, uma insulina estabilizada contra proteases é acilada na posição Al, na posição de azoto alfa de Al.

Numa forma de realização preferida, uma insulina estabilizada contra proteases é acilada na posição Al, na posição de azoto alfa de Al, e a insulina estabilizada contra proteases compreende a mutação B29R.

As insulinas estabilizadas contra proteases são produzidas expressando uma sequência de ADN que codifica a insulina em questão numa célula hospedeira adequada por uma técnica bem conhecida como divulgada, por exemplo, na patente US N.° 6,500,645. A insulina estabilizada contra proteases é expressa diretamente ou como uma molécula precursora que tem uma extensão N-terminal na cadeia B. Esta extensão N-terminal pode ter a função de aumentar o rendimento do produto diretamente expressado e pode ter até 15 resíduos de aminoácidos de comprimento. A extensão N-terminal é dissociada in vitro após isolamento a partir do caldo de culturas e terá, por conseguinte, um sítio de dissociação próximo de Bl. As extensões N-terminais do tipo adequado nesta invenção são divulgadas na Patente U.S. N.° 5,395,922, e Patente Europeia N.° 765,395A. A sequência polinucleotídica que codifica a insulina estabilizada contra proteases pode ser preparada sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosforamidite descrito por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3: 801-805. De acordo com o método de fosforamidite, oligonucleótidos são sintetizados, por exemplo, num sintetizador de ADN automático, purificados, transformados em cadeia dupla e ligados para formar a construção de ADN sintética. Uma maneira efetivamente preferida de preparação da construção de ADN é por reação em cadeia da polimerase (PCR).

As sequências polinucleotídicas podem ser também de origem mista genómica, de ADNc e sintética. Por exemplo, uma sequência genómica ou de ADNc que codifica um péptido líder pode ser ligada a uma sequência genómica ou de ADNc que codifica o cadeias A e B, após o que a sequência de ADN pode ser modificada num sítio por inserção de oligonucleótidos sintéticos que codificam a sequência de aminoácidos desejada para recombinação homóloga de acordo com procedimentos bem conhecidos ou preferencialmente por geração da sequência desejada por PCR utilizando oligonucleótidos adequados. O método recombinante fará tipicamente uso de um vetor que é capaz de replicar-se no microrganismo ou célula hospedeira selecionada e que tem uma sequência polinucleotidica que codifica a insulina estabilizada contra proteases. 0 vetor recombinante pode ser um vetor de replicação autónoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossómica, cuja replicação é independente da replicação cromossómica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossómico, um minicromossoma, ou um cromossoma artificial. 0 vetor pode conter qualquer meio for assegurar autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossoma(s) no (s) qual/quais foi integrado. Além disso, pode utilizar-se um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que em conjunto contenham o ADN total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposão. 0 vetor pode ser plasmídeos lineares ou circulares fechados e conterão preferencialmente um elemento(s) que permite a integração estável do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autónoma do vetor na célula independente do genoma. 0 vetor de expressão recombinante é capaz de se replicar em levedura. Os exemplos de sequências que permitem que o vetor se replique em levedura são os genes de replicação 2 pm do plasmídeo de levedura REP 1-3 e a origem de replicação. 0 vetor pode conter um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou virai, resistência a metais pesados, protrofia a auxotrófos, e semelhantes. Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes os dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tais como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores selecionáveis para utilização numa célula hospedeira fúngica filamentosa incluem amdS (acetamidase), argB (ornitina-carbamoiltransferase) , pirG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilase) e trpC (antranilato-sintase. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPl e URA3. Um marcador selecionável muito adequado para levedura é o gene TPI de Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene 40:125-130).

No vetor, a sequência polinucleotidica é operacionalmente ligada a uma sequência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que exiba atividade de transcrição na célula hospedeira de eleição incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipéptidos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição numa célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do operam lac de E. coli, o gene de agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, o gene de levansacarase (sacB) de Bacillus subtilis, o gene de alfa-amilase (amilo) de Bacillus llchenlformls, o gene da amilase maltogénica (amyM) de Bacillus estearothermophilus, o gene de alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, e o gene de penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis. Os exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição numa célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes para a amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger. Num hospedeiro de levedura, os promotores úteis são os promotores Mal, TPI, ADH ou PGK de Saccharomyces cerevisiae.

Tipicamente, a sequência polinucleotídica que codifica a insulina estabilizada contra proteases será também conectada operacionalmente a uma sequência de terminação adequada. Na levedura uma sequência de terminação adequada é a sequência de terminação TPI (Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434).

Os procedimentos utilizados para liqar a sequência polinucleotídica que codifica a insulina estabilizada contra proteases, o promotor e a sequência de terminação, respetivamente, e para inseri-los num vetor adequado que contém a informação necessária para replicação no hospedeiro selecionado, são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Entender-se-á que o vetor pode ser construído preparando primeiro uma construção de ADN que contém a sequência de ADN completa que codifica as insulinas desta invenção, e inserindo posteriormente este fragmento num vetor de expressão adequado, ou inserindo sequencialmente fragmentos de ADN que contêm informação genética para os elementos individuais (tal como o péptido sinal, pró-péptido, péptido de ligação, cadeias A e B) seguido de ligação. 0 vetor que compreende a sequência polinucleotídica que codifica a insulina estabilizada contra proteases é introduzido numa célula hospedeira de tal forma que o vetor é mantido como um integrante cromossómico ou como um vetor extracromossómico autorreplicante. 0 termo "célula hospedeira" abrange qualquer descendência de uma célula-mãe que não seja idêntica à célula-mãe devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A célula hospedeira pode ser um microrganismo unicelular, por exemplo, um procariota, ou um microrganismo não unicelular, por exemplo, um eucariota. As células unicelulares úteis são células bacterianas tais como bactérias gram-positivas incluindo, mas não se limitando a, uma célula de Bacillus, célula de Streptomyces, ou bactérias gram-negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. As células eucariotas podem ser células de mamífero, inseto, vegetais ou fúngicas. Numa forma de realização, a célula hospedeira é uma célula de levedura. 0 organismo de levedura pode ser qualquer organismo de levedura adequado que, em cultura, produza grandes quantidades da insulina de cadeia simples da invenção. Os exemplos de organismos de levedura adequados são estirpes selecionadas das espécies de levedura Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula Polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. , e Geotrichum fermentans. A transformação das células de levedura pode ser, por exemplo, efetuada por formação de protoplastos, seguida de transformação de uma maneira conhecida per se. 0 meio utilizado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar organismos de levedura. A insulina segregada, uma proporção significativa da qual estará presente no meio numa forma corretamente processada, pode ser recuperada a partir do meio por procedimentos convencionais incluindo separação das células de levedura do meio por centrifugação, filtração ou retenção do precursor de insulina por uma matriz de troca iónica ou por uma matriz de absorção de fase inversa, precipitação dos componentes proteicos do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amónio, seguido de purificação por uma variedade de procedimentos cromatográficos, por exemplo, cromatografia de troca iónica, cromatografia de afinidade, ou semelhantes.

Preferencialmente, as insulinas aciladas desta invenção são monossubstituidas possuindo apenas um grupo de acilação ligado a um resíduo de aminoácido de lisina na molécula de insulina estabilizada contra proteases.

Numa forma de realização, a unidade acilo ligada à insulina estabilizada contra proteases tem a fórmula geral:

Acy-AAln-AA2m-AA3p- (I), em que n é 0 ou um número inteiro na gama desde 1 a 3; m é 0 ou um número inteiro na gama desde 1 a 10; p é 0 ou um número inteiro na gama desde 1 a 10; Acy é um ácido gordo ou um diácido gordo que compreende desde cerca de 8 a cerca de 24 átomos de carbono; AAl é um resíduo de aminoácido linear ou cíclico neutro; AA2 é um resíduo de aminoácido ácido; AA3 é um resíduo de aminoácido que contém alquilenoglicol neutro; a ordem pela qual AAl, AA2 e AA3 surgem na fórmula pode ser trocada independentemente; AA2 pode ocorrer várias vezes ao longo da fórmula (por exemplo, Acy-AA2-AA32-AA2-) ; AA2 pode ocorrer independentemente ( = sendo diferente) várias vezes ao longo da fórmula (por exemplo, Acy-AA2-AA32-AA2-) ; as conexões entre Acy, AAl, AA2 e/ou AA3 são ligações amida (péptido) que, formalmente, podem ser obtidas por remoção de um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo (água) de cada um de Acy, AAl, AA2 e AA3; e a fixação à insulina estabilizada contra proteases pode ser a partir da extremidade C-terminal de um resíduo AAl, AA2, ou AA3 na unidade acilo da fórmula (I) ou a partir de uma da(s) cadeia (s) lateral (ais) de um resíduo AA2 presente na unidade de fórmula (I).

Noutra forma de realização, a unidade acilo ligada à insulina estabilizada contra proteases tem a fórmula geral Acy-AAln-AA2m-AA3p- (I), em que AAl é selecionado de Gly, D-ou L-Ala, pAla, ácido 4-aminobutírico, ácido 5-aminovalérico, ácido 6-amino-hexanoico, D- ou L-Glu-a-amida, D- ou L-Glu-y-amida, D- ou L-Asp-a-amida, D- ou L-Asp-p-amida, ou um grupo de uma das fórmulas:

a partir do qual foi removido um átomo de hidrogénio e/ou um grupo hidroxilo e em que q é 0, 1, 2, 3 ou 4 e, nesta forma de realização, AAl pode ser, alternativamente, ácido 7-amino-heptanoico ou ácido 8-aminooctanoico.

Noutra forma de realização, a unidade acilo ligada à insulina estabilizada contra proteases tem a fórmula geral Acy-AAln-AA2m-AA3p- (I), em que AAl é como definido acima e AA2 é selecionado de L- ou D-Glu, L- ou D-Asp, L- ou D-homoGlu ou qualquer um dos seguintes:

a partir do qual foi removido um átomo de hidrogénio e/ou um grupo hidroxilo e em que as setas indicam o ponto de fixação ao grupo amino de AAl, AA2, AA3, ou ao grupo amino da insulina estabilizada contra proteases.

Num aspeto, o resíduo de aminoácido cíclico neutro designado AAl é um aminoácido que contém um anel carbocíclico de 6 membros saturado, que contém opcionalmente um heteroátomo de azoto, e preferencialmente o anel é um anel de ciclo-hexano ou um anel de piperidina. Preferencialmente, o peso molecular deste aminoácido cíclico neutro situa-se na gama desde cerca de 100 a cerca de 200 Da. O resíduo de aminoácido ácido designado AA2 é um aminoácido com um peso molecular de até cerca de 200 Da que compreende dois grupos ácido carboxílico e um grupo amino primário ou secundário. Alternativamente, o resíduo de aminoácido ácido designado AA2 é um aminoácido com um peso molecular de até cerca de 250 Da que compreende um grupo ácido carboxílico e um grupo sulfonamida primário ou secundário. 0 resíduo de aminoácido que contém alquilenoglicol neutro designado AA3 é uma unidade de alquilenoglicol, opcionalmente uma unidade de oligo- ou polialquilenoglicol que contém uma funcionalidade de ácido carboxílico numa extremidade e uma funcionalidade de grupo amino na outra extremidade.

Aqui, o termo unidade de alquilenoglicol cobre unidades de monoalquilenoglicol bem como unidades de oligo-alquilenoglicol. Os mono- e oligoalquilenoglicóis compreendem cadeias à base de mono- e oligoetilenoglicol, à base de mono- e oligopropilenoglicol e à base de mono- e oligobutilenoglicol, isto é, cadeias que se baseiam na unidade de repetição -CH2CH20-, -CH2CH2CH20- ou -CH2CH2CH2CH20-. A unidade de alquilenoglicol é monodispersa (com comprimento / peso molecular bem definidos). As unidades de monoalquilenoglicol compreendem -0CH2CH20-, -0CH2CH2CH20- ou -0CH2CH2CH2CH20- que contêm diferentes grupos em cada extremidade.

Como aqui mencionado, a ordem pela qual AAl, AA2 e AA3 surgem na unidade acilo com a fórmula (I) (Acy-AAln-AA2m-AA3p-) pode ser trocada independentemente. Por conseguinte, a fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p- também cobre unidades como, por exemplo, a fórmula Acy-AA2m-AAln-AA3p-, a fórmula Acy-AA2-AA3n-AA2- e a fórmula Acy-AA3p-AA2m-AAln-, em que Acy, AAl, AA2, AA3, n, m e p são como aqui definidos.

Como aqui mencionado, as conexões entre as unidades Acy, AAl, AA2 e/ou AA3 são formalmente obtidas através da formação de ligações amida (ligações peptídicas) (-CONH-) por remoção de água dos compostos parentais a partir dos quais são formalmente construídas. Isto significa que para se obter a fórmula completa para a unidade acilo com a fórmula (I) (Acy-AAln-AA2m-AA3p-, em que Acy, AAl, AA2, AA3, n, m e p são como aqui definidos) , tem-se que formalmente pegar nos compostos dados pelos termos Acy, AAl, AA2 e AA3 e remover um hidrogénio e/ou hidroxilo dos mesmos e, formalmente, ligar as unidades estruturais assim obtidas nas extremidades livres assim obtidas.

Os exemplos específicos, não limitativos das unidades acilo da fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p- que podem estar presentes nos análogos de insulina acilados desta invenção são os seguintes:

Qualquer um dos exemplos específicos não limitativos anteriores de unidades acilo da fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p-pode estar ligado a um grupo amino épsilon de um resíduo de lisina presente em qualquer um dos exemplos específicos não limitativos anteriores de análogos de insulina dando, desse modo, outros exemplos específicos de análogos de insulina acilados desta invenção.

Qualquer um dos exemplos específicos não limitativos anteriores de unidades acilo da fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p-pode estar ligado a um grupo amino alfa de um resíduo Al presente em qualquer um dos exemplos específicos não limitativos anteriores de análogos de insulina dando, desse modo, outros exemplos específicos de análogos de insulina acilados desta invenção.

As insulinas estabilizadas contra proteases podem ser convertidas nas insulinas estabilizadas contra proteases aciladas desta invenção por introdução do grupo desejado da fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p- no resíduo de lisina ou numa posição N-terminal do análogo de insulina. 0 grupo desejado da fórmula Acy-AAln-AA2m-AA3p- pode ser introduzido por qualquer método conveniente e muitos métodos são divulgados na técnica anterior para tais reações. Mais pormenores surgem nos exemplos aqui.

Numa forma de realização, a presente invenção não se refere aos compostos descritos na EP 07114387.9, isto é, as insulinas aciladas em que uma unidade acilo está ligada à insulina parental e em que a referida unidade acilo compreende unidades de repetição de aminoácidos que contêm alquileno glicol e em que há apenas um resíduo de lisina (K & Lys) na insulina parental.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As insulinas aciladas desta invenção podem ser administradas por via subcutânea, nasal, oral ou pulmonar.

Para administração subcutânea, as insulinas aciladas desta invenção são formulados de forma análoga à formulação de insulinas conhecidas. Além disso, para administração subcutânea, as insulinas aciladas desta invenção são administradas de forma análoga à administração de insulinas conhecidas e, em geral, os médicos estão familiarizados com este procedimento.

As insulinas aciladas desta invenção podem ser administradas por inalação numa dose eficaz para aumentar os níveis de insulina circulante e/ou para diminuir os níveis de glicose circulante. Tal administração pode ser eficaz para tratar distúrbios tais como diabetes ou hiperglicemia. A obtenção de doses eficazes de insulina requer a administração de uma dose inalada de mais do que cerca de 0,5 yg/kg a cerca de 50 yg/kg de insulinas aciladas desta invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada por um médico bem informado, que terá em consideração fatores que incluem o nível de insulina, níveis de glicose no sangue, a condição física do doente, o estado pulmonar do doente, ou semelhantes.

As insulinas aciladas desta invenção podem ser administradas por inalação para se conseguir absorção lenta e/ou depuração sistémica reduzida das mesmas. Os diferentes dispositivos de inalação proporcionam tipicamente farmacocinética semelhante quando são comparados tamanhos de partícula semelhantes e níveis de deposição no pulmão semelhantes.

As insulinas aciladas desta invenção podem ser administradas por qualquer uma de uma variedade de dispositivos de inalação conhecidos na técnica para a administração de um agente terapêutico por inalação. Estes dispositivos incluem inaladores doseadores, nebulizadores, geradores de pó seco, pulverizadores, e semelhantes. Preferencialmente, as insulinas aciladas desta são administradas por um inalador de pó seco ou um pulverizador. Existem várias características desejáveis para um dispositivo de inalação para administração das insulinas aciladas desta invenção. Por exemplo, a administração pelo dispositivo de inalação é vantajosamente fidedigna, reprodutível e exata. 0 dispositivo de inalação deve administrar partículas pequenas ou aerossoles, por exemplo, com menos de cerca de 10 ym, por exemplo cerca de 1-5 ym, para boa respirabilidade. Alguns exemplos específicos de dispositivos de inalação comercialmente disponíveis adequados para a prática desta invenção são Turbohaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inalador Spiros™ (Dura), dispositivos comercializados pela Inhale Therapeutics, AERx™ (Aradigm), o nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt) , o nebulizador Acorn II® (Marquest Medicai Products) , o inalador doseador Ventolin® (Glaxo), o inalador de pó Spinhaler® (Fisons), ou semelhantes.

Como os especialistas na técnica reconhecerão, a formulação de insulinas aciladas desta invenção, a quantidade de formulação administrada e a duração de administração de uma dose única dependem do tipo de dispositivo de inalação utilizado. Para alguns sistemas de administração de aerossol, tais como nebulizadores, a frequência de administração e o intervalo de tempo durante o qual o sistema é ativado dependerão principalmente da concentração de insulinas aciladas no aerossol. Por exemplo, pode utilizar-se períodos de administração mais curtos a concentrações de insulinas aciladas mais altas na solução nebulizadora. Os dispositivos tais como os inaladores doseadores podem produzir concentrações de aerossol mais altas e podem ser acionados durante períodos mais curtos para administrar a quantidade desejada das insulinas aciladas. Os dispositivos tais como os inaladores de pó administram o agente ativo até que uma dada carga de agente seja expelida do dispositivo. Neste tipo de inalador, a quantidade de insulinas aciladas desta invenção numa dada quantidade do pó determina a dose administrada numa única administração. 0 tamanho de partícula das insulinas aciladas desta invenção na formulação administrada pelo dispositivo de inalação é critico relativamente à capacidade da insulina para chegar até aos pulmões e, preferencialmente, até às vias aéreas inferiores ou alvéolos. Preferencialmente, as insulinas aciladas desta invenção são formuladas de tal forma que pelo menos cerca de 10% das insulinas aciladas administradas são depositados no pulmão, preferencialmente cerca de 10 a cerca de 20%, ou mais. Sabe-se que a eficiência máxima de deposição pulmonar para humanos que respirem pela boca é obtida com tamanhos de partícula de cerca de 2 ym a cerca de 3 ym. Quando os tamanhos de partícula são acima de cerca de 5 ym, a deposição pulmonar diminui substancialmente. Tamanhos de partículas inferiores a cerca de 1 ym originam uma diminuição da deposição pulmonar, e torna-se difícil administrar partículas com massa suficiente para serem terapeuticamente eficazes. Assim, as partículas das insulinas aciladas administradas por inalação têm um tamanho de partícula preferencialmente inferior a cerca de 10 ym, mais preferencialmente na gama de cerca de 1 ym a cerca de 5 ym. A formulação das insulinas aciladas é selecionada para produzir o tamanho de partícula desejado no dispositivo de inalação escolhido.

Vantajosamente para administração como um pó seco, uma insulina acilada desta invenção é preparada numa forma em partículas com um tamanho de partícula inferior a cerca de 10 ym, preferencialmente cerca de 1 a cerca de 5 ym. O tamanho de partícula preferido é eficaz para administração nos alvéolos do pulmão do doente. Preferencialmente, o pó seco é em grande parte constituído por partículas produzidas de tal forma que uma maioria das partículas tenha um tamanho na gama desejada. Vantajosamente, pelo menos cerca de 50% do pó seco é constituído por partículas que têm um diâmetro inferior a cerca de 10 ym. Tais formulações podem ser conseguidas através de secagem por pulverização, moagem ou condensação de ponto crítico de uma solução que contém a insulina acilada desta invenção e outros ingredientes desejados. Outros métodos também adequados para gerar partículas úteis na presente invenção são conhecidos na técnica.

As partículas são geralmente separadas de uma formulação em pó seco num recipiente e, em seguida, transportadas para o pulmão de um doente via uma corrente de ar transportadora.

Tipicamente, nos inaladores de pó seco correntes, a força para desagregar o sólido é proporcionada exclusivamente pela inalação do doente. Noutro tipo de inalador, o fluxo de ar gerado pela inalação do doente ativa um motor impulsor que desaglomera as partículas.

As formulações de insulinas aciladas desta invenção para administração a partir de um inalador de pó seco incluem tipicamente um pó seco finamente dividido que contém o derivado, mas o pó também pode incluir um agente de volume, veículo, excipiente, outro aditivo, ou semelhantes. Os aditivos podem ser incluídos numa formulação em pó seco de insulina acilada, por exemplo, para diluir o pó consoante necessário para administração a partir do inalador de pó particular, para facilitar o processamento da formulação, para proporcionar propriedades de pó vantajosas à formulação, para facilitar a dispersão do pó a partir do dispositivo de inalação, para estabilizar a formulação (por exemplo, antioxidantes ou tampões), para proporcionar sabor à formulação, ou semelhantes. Vantajosamente, o aditivo não afeta desfavoravelmente as vias aéreas do doente. A insulina acilada pode ser misturada com um aditivo a um nível molecular ou a formulação sólida pode incluir partículas da insulina acilada misturadas com ou revestidas sobre partículas do aditivo. Os aditivos típicos incluem mono-, di- e polissacáridos; açúcar-álcoois e outros polióis, tais como, por exemplo, lactose, glicose, rafinose, melezitose, lactitol, maltitol, trealose, sacarose, manitol, amido, ou combinações dos mesmos; tensioativos, tais como sorbitóis, difosfatidilcolina, ou lecitina; ou semelhantes. Tipicamente um aditivo, tal como um agente de volume, está presente numa quantidade eficaz para uma finalidade descrita acima, frequentemente de cerca de 50% a cerca de 90% em peso da formulação. Agentes adicionais conhecidos na técnica para a formulação de uma proteína tal como uma proteína análoga de insulina podem ser também incluídos na formulação.

Uma suspensão de pulverização que inclua as insulinas aciladas desta invenção pode ser produzida forçando uma suspensão ou solução da insulina acilada através de um bico sob pressão. 0 tamanho e configuração do bico, a pressão aplicada e a velocidade de alimentação do líquido podem ser escolhidos para se conseguir o resultado e tamanho de partícula desejados. Uma eletropulverização pode ser produzida, por exemplo, por um campo elétrico em conexão com uma alimentação a um capilar ou bico. Vantajosamente, as partículas de conjugado de insulina administradas por um pulverizador têm um tamanho de partícula inferior a cerca de 10 ym, preferencialmente na gama de cerca de 1 ym a cerca de 5 ym.

As formulações de insulinas aciladas desta invenção adequadas para utilização com um pulverizador incluirão tipicamente as insulinas aciladas numa solução aquosa a uma concentração de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg da insulina acilada por mL de solução. Dependendo da insulina acilada escolhida e de outros fatores conhecidos do conselheiro médico, o limite superior pode ser mais baixo, por exemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 120, 100 ou 50 mg da insulina acilada por mL de solução. A formulação pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente isotonizante, um conservante, um tensioativo e, preferencialmente, zinco. A formulação pode incluir também um excipiente ou agente para estabilização da insulina acilada, tal como um tampão, um agente de redução, uma proteína a granel ou um hidrato de carbono. As proteínas a granel úteis na formulação de conjugados de insulina incluem albumina, protamina ou semelhantes. Os hidratos de carbono típicos úteis na formulação da insulina acilada incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose, ou semelhantes. A formulação de insulinas aciladas pode incluir também um tensioativo, o qual pode reduzir ou prevenir a agregação induzida na superfície do conjugado de insulina provocada pela atomização da solução ao formar um aerossol. Pode utilizar-se vários tensioativos convencionais, tais como ésteres de ácidos gordos e álcoois de polioxietileno, e ésteres de ácidos gordos de polioxietileno sorbitol. As quantidades variarão geralmente entre cerca de 0,001 e cerca de 4% em peso da formulação.

As composições farmacêuticas que contêm uma insulina acilada desta invenção podem ser também administradas por via parentérica a doentes que necessitem de um tal tratamento. A administração parentérica pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta. Alternativamente, a administração parentérica pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão.

As composições injetáveis das insulinas aciladas desta invenção podem ser preparadas utilizando as técnicas convencionais da indústria farmacêutica que incluem dissolução e mistura dos ingredientes, consoante apropriado, para dar o produto final desejado. Assim, de acordo com um procedimento, uma insulina acilada é dissolvida numa quantidade de água que é um pouco menor do que o volume final da composição a ser preparada. Zinco, um agente isotónico, um conservante e/ou um tampão é/são adicionados, consoante necessário, e o valor de pH da solução é ajustado - se for necessário - utilizando um ácido, por exemplo, ácido clorídrico, ou uma base, por exemplo, hidróxido de sódio aquoso, consoante necessário. Finalmente, o volume da solução é ajustado com água para dar a concentração desejada dos ingredientes.

Numa outra forma de realização, o tampão é selecionado do grupo que consiste em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato dissódico, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)amino-metano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas dos mesmos. Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realização alternativa desta invenção.

Numa outra forma de realização a formulação compreende ainda um conservante farmaceuticamente aceitável que pode ser selecionado do grupo que consiste em fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tiomerosal, bronopol, ácido benzoico, imidureia, cloro-hexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloreto de benzetónio, clorfenesina (3-(4-clorofenoxi)-1,2-propanodiol) ou misturas dos mesmos. Numa outra forma de realização, o conservante está presente numa concentração desde cerca de 0,1 mg/mL a 2 0 mg/mL. Numa outra forma de realização, o conservante está presente numa concentração desde cerca de 0,1 mg/mL a 5 mg/mL. Numa outra forma de realização, o conservante está presente numa concentração desde cerca de 5 mg/mL a 10 mg/mL. Numa outra forma de realização, o conservante está presente numa concentração desde cerca de 10 mg/mL a 20 mg/mL. Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma de realização alternativa. A utilização de um conservante em composições farmacêuticas é bem conhecida do especialista. Por conveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Numa outra forma de realização, a formulação compreende ainda um agente isotónico que pode ser selecionado do grupo que consiste em um sal (por exemplo, cloreto de sódio) , um açúcar ou açúcar-álcool, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano ou treonina), um alditol (por exemplo glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol ou 1,3-butanodiol), polietileno glicol (por exemplo, PEG400) ou misturas dos mesmos. Pode utilizar-se qualquer açúcar tal como mono-, di- ou polissacáridos, ou glucanos solúveis em água, incluindo por exemplo frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, solúvel amido, hidroxietilamido e carboximetilcelulose de sódio. Numa forma de realização, o aditivo de açúcar é sacarose. 0 açúcar-álcool é definido como um hidrocarboneto C4-C8 que tem pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Numa forma de realização, o aditivo de açúcar-álcool é manitol. Os açúcares ou açúcar-álcoois mencionados acima podem ser utilizados individualmente ou em combinação. Não há um limite fixo à quantidade utilizada, desde que o açúcar ou açúcar-álcool seja solúvel na preparação líquida e não afete desfavoravelmente os efeitos estabilizadores conseguidos utilizando os métodos desta divulgação. Numa forma de realização, a concentração de açúcar ou açúcar-álcool é entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 150 mg/mL. Numa outra forma de realização, o agente isotónico está presente numa concentração desde cerca de 1 mg/mL a 50 mg/mL. Numa outra forma de realização, o agente isotónico está presente numa concentração desde cerca de 1 mg/mL a 7 mg/mL. Numa outra forma de realização, o agente isotónico está presente numa concentração desde cerca de 8 mg/mL a 24 mg/mL. Numa outra forma de realização, o agente isotónico está presente numa concentração desde cerca de 25 mg/mL a 50 mg/mL. Cada um destes agentes isotónicos específicos constitiu uma forma de realização alternativa. A utilização de um agente isotónico em composições farmacêuticas é bem conhecida do especialista. Por conveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Os agentes isotónicos típicos são cloreto de sódio, manitol, dimetilsulfona e glicerol e os conservantes típicos são fenol, m-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo e álcool benzílico.

Os exemplos de tampões adequados são acetato de sódio, glicilglicina, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanossulfónico) e fosfato de sódio.

Uma composição para administração nasal de uma insulina acilada desta invenção pode ser, por exemplo, preparada como descrito na Patente Europeia N.° 272,097.

As preparações orais que contêm uma insulina acilada estabilizada contra proteases desta invenção podem ser preparadas de uma maneira conhecida per se. Uma maneira de preparar as preparações que contêm uma insulina acilada estabilizada contra proteases desta invenção, as quais podem ser convenientemente administradas por via oral é utilizando um procedimento que é análogo ao processo descrito em WO 2008/145728.

Outra maneira de preparar preparações orais que contêm uma insulina acilada estabilizada contra proteases desta invenção consiste em preparar composições farmacêuticas líquidas ou semissólidas livres de água que compreendem uma insulina acilada estabilizada contra proteases desta invenção (a) , pelo menos um solvente orgânico polar (b) para a insulina acilada estabilizada contra proteases, pelo menos um componente lipófilo (c), e opcionalmente um tensioativo (d) e/ou pelo menos um componente hidrófilo sólido (e) . Esta poderia estar na forma de uma solução oleosa. Alternativamente, o pelo menos um componente hidrófilo sólido (d) é pelo menos um polímero hidrófilo sólido. Alternativamente, a composição farmacêutica que compreende pelo menos um componente hidrófilo sólido é isento de tensioativo, em que o referido tensioativo tem um valor de HLB que é pelo menos 8, isto é, não há um tensioativo, que tenha um valor de HLB que é de pelo menos 8, presente na composição.

Por exemplo, uma composição farmacêutica que contém uma insulina acilada estabilizada contra proteases pode ser uma solução oleosa livre de água e/ou uma composição farmacêutica SEDDS ou SMEDDS.

Alternativamente, a referida composição farmacêutica é um sistema de administração de fármacos autoemulsionante (aqui designado SEDDS).

Julga-se que a alta solubilidade de uma insulina acilada estabilizada contra proteases no solvente orgânico polar da composição farmacêutica, que resulta na quantidade total relativamente baixa de solvente orgânico polar necessária na referida composição farmacêutica, possa melhorar a compatibilidade da composição farmacêutica com os materiais da cápsula. A composição farmacêutica pode conter um veiculo que compreende um componente lipófilo, um tensioativo e um solvente orgânico polar e opcionalmente um componente hidrófilo sólido (e) . Se estiver presente um componente hidrófilo sólido, pelo menos um dos componentes selecionados do grupo que consiste num componente lipófilo e um tensioativo é liquido ou semissólido. Se estiver presente um componente hidrófilo liquido (e), tanto o componente lipófilo como o tensioativo podem ser sólidos. Por exemplo, o tensioativo é liquido ou semissólido. Num aspeto, está presente um componente hidrófilo sólido.

Como aqui utilizado, o termo "veiculo" refere-se ao veiculo farmaceuticamente aceitável que transporta o polipéptido hidrossolúvel terapeuticamente ativo através da membrana biológica ou dentro de um fluido biológico. 0 veiculo compreende um componente lipófilo e um solvente orgânico polar, e opcionalmente um componente hidrófilo sólido e/ou um tensioativo. 0 veiculo é capaz de produzir espontaneamente uma emulsão ou estruturas coloidais, quando posto em contacto, disperso ou diluído, com um meio aquoso, por exemplo, água, fluidos que contêm água, ou meios in vivo em mamíferos, tais como os sucos gástricos do trato gastrointestinal. As estruturas coloidais podem ser partículas sólidas ou líquidas que incluem domínios, gotículas, micelas, micelas mistas, vesículas e nanopartícuias.

Por exemplo, quando a composição farmacêutica é posta em contacto com um meio aquoso, forma-se espontaneamente uma emulsão, tal como uma microemulsão. Em particular, forma-se uma emulsão ou microemulsão no aparelho digestivo de um mamífero quando o sistema de administração é ingerido por via oral. Além dos componentes supramencionados, o pré-concentrado espontaneamente dispersível pode conter também opcionalmente outros excipientes, tais como tampões, reguladores de pH, estabilizantes e outros adjuvantes reconhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria como sendo apropriados para uma tal utilização farmacêutica. 0 termo "livre de água" como aqui utilizado refere-se a uma composição à qual não é adicionada água durante a preparação da composição farmacêutica. A insulina acilada estabilizada contra proteases e/ou um ou mais dos excipientes na composição farmacêutica podem ter pequenas quantidades de água associada aos mesmos antes de se preparar uma composição farmacêutica. Por exemplo, uma composição farmacêutica livre de água compreende menos de 10% p/p de água, por exemplo, menos de 5% p/p de água, por exemplo, menos de 4% p/p de água, por exemplo, menos de 3% p/p de água, por exemplo, menos de 2% p/p de água, por exemplo, menos de 1% p/p de água.

Como aqui utilizado, o termo "pré-concentrado de microemulsão" significa uma composição, que forma espontaneamente uma microemulsão, por exemplo, uma microemulsão de óleo em água, num meio aquoso, por exemplo, em água ou nos fluidos gastrointestinais após aplicação oral. A composição autoemulsiona-se após diluição num meio aquoso, por exemplo, numa diluição de 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 ou mais.

Devido à alta solubilidade da insulina acilada estabilizada contra proteases, a quantidade total de solvente orgânico polar no SEDDS pode ser mantida baixa o que por um lado melhora a compatibilidade da formulação com os materiais da cápsula e por outro lado dá mais espaço de planeamento para a composição. A composição farmacêutica compreende um componente lipófilo e um componente polar orgânico. Os componentes do sistema de administração de fármacos podem estar presentes em quaisquer quantidades relativas. Por exemplo, o sistema de administração de fármacos pode compreender até 40% do componente orgânico polar em peso da composição do veiculo, por exemplo, menos de 30%, 20%, 15% ou 10%. Noutro aspeto, o sistema de administração de fármacos compreende desde 5% a 40% em peso de solvente orgânico polar da composição total do veiculo. Ainda num outro aspeto, o sistema de administração de fármacos compreende desde 10% a 30 % em peso de solvente orgânico polar da composição total do veiculo. A composição farmacêutica pode estar na forma de uma composição que não está em pó, isto é, numa forma semissólida ou liquida.

Como aqui utilizado, o termo "liquido" significa um componente ou composição que está num estado liquido à temperatura ambiente ("TA"), e que tem um ponto de fusão, por exemplo, abaixo de 20 °C. Como aqui utilizado, temperatura ambiente (TA) significa aproximadamente 20-25 °C.

Como aqui utilizado, o termo "semissólido" refere-se a um componente ou composição que não é liquido à temperatura ambiente, por exemplo, que tem um ponto de fusão entre a temperatura ambiente e cerca de 40 °C. Um semissólido pode ter as qualidades e/ou atributos tanto do estado sólido como do liquido da matéria. Como aqui utilizado, o termo "solidificar" significa tornar-se sólido ou semissólido.

Os exemplos de composições semissólidas ou liquidas são composições farmacêuticas na forma de, por exemplo, óleos, soluções, SMEDDS líquidos ou semissólidos e SEDDS líquidos ou semissólidos. "SMEDDS" (é uma abreviatura para sistemas de administração de fármacos automicroemulsionantes) são aqui definidos como misturas isotrópicas de um componente hidrófilo, um tensioativo, opcionalmente um cotensioativo e um fármaco que formam rapidamente uma microemulsão de óleo em água quando expostas a meios aquosos sob condições de agitação suave ou de motilidade digestiva que se encontraria no aparelho GI. "SEDDS" (é uma abreviatura para sistemas de administração de fármacos autoemulsionantes) são aqui definidos como misturas de um componente hidrófilo, um tensioativo, opcionalmente um cotensioativo e um fármaco que formam espontaneamente uma emulsão fina de óleo em água quando expostas a meios aquosos sob condições de agitação suave ou de motilidade digestiva que se encontraria no aparelho GI.

Como aqui utilizado, o termo "microemulsão" refere-se a uma dispersão coloidal transparente ou translúcida, ligeiramente opaca, opalescente, não opaca ou substancialmente não opaca que se forma espontaneamente ou de forma substancialmente espontânea quando os seus componentes são postos em contacto com um meio aquoso.

Como aqui utilizado, o termo "emulsão" refere-se a uma dispersão coloidal ligeiramente opaca, opalescente ou opaca que se forma espontaneamente ou de forma substancialmente espontânea quando os seus componentes são postos em contacto com um meio aquoso.

Uma microemulsão é termodinamicamente estável e contém partículas ou domínios homogeneamente dispersos, por exemplo de um estado sólido ou líquido (por exemplo, partículas ou gotículas lipídicas líquidas), de um diâmetro médio inferior a cerca de 500 nm, por exemplo, inferior a cerca de 400 nm ou inferior a 300 nm, inferior a 200 nm, inferior a 100 nm, e superior a cerca de 2-4 nm como medido por técnicas de dispersão de luz padrão, por exemplo, utilizando um MALVERN ZETASIZER Nano ZS. O termo "tamanho de domínio" como aqui utilizado refere-se a unidades de dispersão repetitivas e podem ser medidas, por exemplo, por raios X de ângulo pequeno. Num aspeto, o tamanho de domínio é menor do que 400 nm, noutro aspeto, menor do que 300 nm e ainda noutro aspeto, menor do que 200 nm.

Como aqui utilizado, o termo "espontaneamente dispersível" quando se reporta a um pré-concentrado refere-se a uma composição que é capaz de produzir estruturas coloidais tais como microemulsões, emulsões e outros sistemas coloidais, quando diluída com um meio aquoso quando os componentes da composição são postos em contacto com um meio aquoso, por exemplo, por simples agitação manual durante um curto intervalo de tempo, por exemplo durante dez segundos. Num aspeto, um concentrado espontaneamente dispersível é um SEDDS ou SMEDDS.

Como aqui utilizado, o termo "componente lipófilo" refere-se a uma substância, material ou ingrediente que é mais compatível com o óleo do que com a água. Um material com propriedades lipófilas é insolúvel ou quase insolúvel em água, mas é facilmente solúvel em óleo ou outros solventes apoiares. O termo "componente lipófilo" pode compreender uma ou mais substâncias lipófilas. A fase lipófila do pré-concentrado espontaneamente dispersível pode ser constituída por múltiplos componentes lipófilos e formar o aspeto de óleo, por exemplo, numa emulsão ou microemulsão de óleo em água. À temperatura ambiente, o componente lipófilo e a fase lipófila do pré-concentrado espontaneamente dispersível podem ser sólidos, semissólidos ou líquidos. Por exemplo, um componente lipófilo sólido pode existir como uma pasta, forma granular, pó ou flocos. Se o componente lipófilo compreender mais do que um excipiente, o componente lipófilo pode ser uma mistura de líquidos, sólidos ou ambos.

Num aspeto, o componente lipófilo está presente na composição farmacêutica numa quantidade de pelo menos 20% p/p. Num outro aspeto, o componente lipófilo está presente numa quantidade de pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% p/p. Por exemplo, o componente lipófilo pode estar presente desde cerca de 5% a cerca de 90% em peso da composição, por exemplo, desde cerca de 15% a cerca de 60%, por exemplo, desde cerca de 20% a cerca de 40%. Os exemplos de componentes lipófilos sólidos, isto é, componente lipófilos que são sólidos ou semissólidos à temperatura ambiente, incluem, mas não se limitam aos seguintes: 1. misturas de mono-, di- e triglicéridos, tais como coco-glicéridos hidrogenados (ponto de fusão (p.f.) de cerca de 33,5 °C a cerca de 37 °C], comercialmente disponíveis como WITEPSOL HI5 de Sasol Germany (Witten, Alemanha); Exemplos de triglicéridos de ácidos gordos, por exemplo, triglicéridos de ácidos gordos C10-C22 incluem óleos naturais e hidrogenados, tais como óleos vegetais; 2. ésteres, tais como estearato de propileno glicol (PG) , comercialmente disponível como MONOSTEOL (p.f. de cerca de 33 °C a cerca de 36 °C) de Gattefosse Corp. (Paramus, NJ) ; palmito estearato de dietileno glicol, comercialmente disponível como HYDRINE (p.f. de cerca de 44,5 °C a cerca de 48,5 °C) de Gattefosse Corp.; 3. glicéridos saturados poliglicosilados, tais como ésteres de PEG-6 de óleo de palma/palmiste hidrogenado (p.f. de cerca de 30,5 °C a cerca de 38 °C), comercialmente disponíveis como LABRAFIL M2130 CS de Gattefosse Corp. ou Gelucire 33/01; 4. álcoois gordos, tais como álcool miristílico (p.f. de cerca de 39 °C) , comercialmente disponível como LANETTE 14 de Cognis Corp. (Cincinnati, OH); ésteres de ácidos gordos com álcoois gordos, por exemplo, palmitato de cetilo (p.f. de cerca de 50 °C); monolaurato de isosorbida, por exemplo, comercialmente disponível sob o nome comercial ARLAMOL ISML de Uniqema (New Castle, Delaware), por exemplo com um ponto de fusão de cerca de 43 °C; 5. éter de PEG-álcool gordo, incluindo éter cetílico de polioxietileno (2), por exemplo comercialmente disponível como BRIJ 52 de Uniqema, com um ponto de fusão de cerca de 33 °C, ou éter estearílico de polioxietileno (2), por exemplo comercialmente disponível como BRIJ 72 de Uniqema com um ponto de fusão de cerca de 43 °C; 6. ésteres de sorbitano, por exemplo ésteres de sorbitano de ácidos gordos, por exemplo monopalmitato de sorbitano ou monoestearato de sorbitano, por exemplo, comercialmente disponíveis como SPAN 40 ou SPAN 60 de Uniqema e com pontos de fusão de cerca de 43 °C a 48 °C ou cerca de 53 °C a 57 °C e 41 °C a 54 °C, respetivamente; e 7. ésteres de mono-C6-C14-ácidos gordos de glicerilo. Estes são obtidos esterifiçando glicerol com óleo vegetal, seguido de destilação molecular. Os monoglicéridos incluem, mas não se limitam a, monoglicéridos tanto simétricos (isto é, β-monoglicéridos) bem como assimétricos (a-monoglicéridos). Incluem também glicéridos uniformes (nos quais o constituinte ácido gordo é constituído principalmente por um único ácido gordo) bem como glicéridos mistos (isto é, em que o ácido gordo constituinte é constituído por vários ácidos gordos) . O constituinte de ácido gordo pode incluir ácidos gordos saturados e insaturados com um comprimento da cadeia de, por exemplo, C8-C14. São particularmente adequados o monolaurato de glicerilo por exemplo comercialmente disponível como IMWITOR 312 de Sasol North America (Houston, TX), (p.f. de cerca de 56 °C - 60 °C); monodicocoato de glicerilo, comercialmente disponível como IMWITOR 928 de Sasol (p.f. de cerca de 33 °C - 37 °C) ; citrato de monoglicerilo, comercialmente disponível como IMWITOR 370, (p.f. de cerca de 59 a cerca de 63 °C) ; ou monoestearato de glicerilo, por exemplo, comercialmente disponível como IMWITOR 900 de Sasol (p.f. de cerca de 56 °C - 61 °C); ou monoestearato de glicerol autoemulsionante, por exemplo, comercialmente disponível como IMWITOR 960 de Sasol (p.f. de cerca de 56 °C -61 °C).

Os exemplos de componentes lipófilos líquidos, isto é, componentes lipófilos que são líquidos à temperatura ambiente incluem, mas não se limitam aos seguintes: 1. misturas de mono-, di- e triglicéridos, tais como mono- e diglicéridos de cadeia média, caprilato/caprato de glicerilo, comercialmente disponível como CAPMUL MCM de Abitec Corp. (Columbus, OH); 2. mono- ou di-ésteres de ácidos gordos e glicerilo, por exemplo de ácidos gordos C6-C18, por exemplo C6-C16 por exemplo C8-C10, por exemplo C8, ou seus derivados acetilados, por exemplo MYVACET 9-45 ou 9-08 de Eastman Chemicals (Kingsport, TN) ou IMWITOR 308 ou 312 de Sasol; 3. mono- ou di-ésteres de ácidos gordos e propileno glicol, por exemplo de ácidos gordos C8-C20, por exemplo C8-C12, por exemplo LAUROGLYCOL 90, SEFSOL 218, ou CAPRYOL 90 ou CAPMUL PG-8 (mesmo que caprilato de propileno glicol) de Abitec Corp.; 4. óleos, tais como óleo de açafrão-bastardo, óleo de sésamo, óleo de amêndoa, óleo de amendoim, óleo de palma, óleo de gérmen de trigo, óleo de milho, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de semente de algodão, óleo de soja, azeite e óleo mineral; 5. ácidos ou álcoois gordos, por exemplo saturados ou mono-ou di-insaturados C8-C20, por exemplo ácido oleico, álcool oleílico, ácido linoleico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido caproico, tetradecanol, dodecanol, decanol; 6. triglicéridos de ácidos gordos de cadeia média, por exemplo C8-C12, por exemplo MIGLYOL 812, ou triglicéridos de ácidos gordos de cadeia longa, por exemplo óleos vegetais; 7. óleos vegetais etoxilados transesterifiçados, por exemplo comercialmente disponível como LABRAFIL M2125 CS de Gattefosse Corp; 8. compostos esterifiçados de ácidos gordos e álcoois primários, por exemplo ácidos gordos C8-C20 e álcoois C2-C3, por exemplo linoleato de etilo, por exemplo comercialmente disponível como NIKKOL VF-E de Nikko Chemicals (Tokyo, Japão), butirato de etilo, ácido etil caprilato oleico, oleato de etilo, miristato de isopropilo e caprilato de etilo; 9. óleos essenciais, ou qualquer um de uma classe de óleos voláteis que dão às plantas os seus odores característicos, tais como óleo de hortelã-verde, óleo de cravinho, óleo de limão e óleo de hortelã-pimenta; 10. frações ou constituintes de óleos essenciais, tais como mentol, carvacrol e timol; 11. óleos sintéticos, tais como triacetina, tributirina; 12. citrato de trietilo, citrato de acetiltrietilo, citrato de tributilo, citrato de acetiltributilo; 13. ésteres de poliglicerol de ácidos gordos, por exemplo dimonooleato de glicerilo, por exemplo DGMO-C, DGMO-90, DGDO de Nikko Chemicals; e 14. ésteres de sorbitano, por exemplo ésteres de sorbitano de ácidos gordos, por exemplo monolaurato de sorbitano, por exemplo comercialmente disponível como SPAN 20 de Uniqema. 15. Fosfolípidos, por exemplo Alquil-O-Fosfolípidos, Ácido Diacil Fosfatídicos, Diacil Fosfatidil Colinas, Diacil Fosfatidil Etanolaminas, Diacil Fosfatidil Gliceróis, Ácidos Di-O-Alquil Fosfatídicos, L-alfa-Lisofosfatidilcolinas (LPC), L-alfa-Lisofosfatidiletanolaminas (LPE), L-alfa-Lisofosfatidilglicerol (LPG), L-alfa-Lisofosfatidilinositóis (LPI), Ácidos L-alfa-Fosfatídicos (PA), L-alfa-Fosfatidilcolinas (PC), L-alfa-Fosfatidiletanolaminas (PE), L-alfa-Fosfatidilgliceróis (PG) , Cardiolipina (CL), L-alfa-Fosfatidilinositóis (PI), L-alfa-Fosfatidilserinas (PS), Liso-Fosfatidilcolinas, Liso-Fosfatidilgliceróis, sn-Glicerofosforilcolinas comercialmente disponíveis de LARODAN, ou fosfolípidos de soja (Lipoid S100) comercialmente disponíveis de Lipoid GmbH.

Por exemplo, o componente lipófilo é um ou mais selecionados do grupo que consiste em mono-, di- e triglicéridos. Num aspeto, o componente lipófilo é um ou mais selecionados do grupo que consiste em mono- e diglicéridos. Ainda num outro aspeto, o componente lipófilo é Capmul MCM ou Capmul PG-8. Ainda num aspeto adicional, o componente lipófilo é Capmul PG-8. 0 termo "solvente orgânico polar" refere-se num aspeto aqui a um "solvente orgânico prótico polar" que é um solvente que contém carbono miscível com água, hidrófilo que contém uma ligação 0-H ou N-H, ou misturas dos mesmos. A polaridade reflete-se na constante dielétrica ou no momento dipolar de um solvente. A polaridade de um solvente determina que tipo de compostos é capaz de dissolver e com que outros solventes ou compostos líquidos é miscível. Tipicamente, os solventes orgânicos polares dissolvem melhor os compostos polares e os solventes apoiares dissolvem melhor os compostos apoiares: " semelhantes dissolvem semelhantes". Os compostos fortemente polares como sais inorgânicos (por exemplo cloreto de sódio) dissolvem-se apenas em solventes muito polares.

Os solventes orgânicos polares podem ser selecionados de solventes nos quais a insulina estabilizada contra proteases acilada exibe melhor solubilidade nos referidos solventes orgânicos polares do que noutros solventes.

Consequentemente, a insulina estabilizada contra proteases acilada pode ser dissolvida em alto grau num solvente orgânico polar farmaceuticamente aceitável livre de água tal como propileno glicol, glicerol e PEG200. Por exemplo, pelo menos 20% (p/p) da insulina estabilizada contra proteases acilada dissolve-se num solvente orgânico polar farmaceuticamente aceitável livre de água, isto é, quando se adiciona 20% p/p da insulina estabilizada contra proteases acilada ao solvente orgânico polar, obtém-se uma solução transparente. Noutro aspeto, pelo menos 25%, 30%, 40% ou 50% (p/p) da insulina estabilizada contra proteases acilada dissolve-se num solvente orgânico polar farmaceuticamente aceitável livre de água. O solvente orgânico polar pode referir-se então a um solvente que contém carbono miscivel com água, hidrófilo que contém uma ligação O-H ou N-H, ou misturas dos mesmos. A polaridade reflete-se na constante dielétrica ou no momento dipolar de um solvente. A polaridade de um solvente determina que tipo de compostos é capaz de dissolver e com que outros solventes ou compostos líquidos é miscivel. Tipicamente, os solventes polares dissolvem melhor compostos polares e os solventes apoiares dissolvem melhor os compostos apoiares: "semelhantes dissolvem semelhantes". Os compostos fortemente polares como os sais inorgânicos (por exemplo cloreto de sódio) dissolvem-se apenas em solventes muito polares.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é um solvente que tem uma constante dielétrica superior a 20, preferencialmente na gama de 20-50. Na Tabela 1 são listados exemplos de diferentes solventes orgânicos polares em conjunto com a água como uma referência.

Tabela 1. Constante dielétricas (permissividade estática) de solventes orgânicos polares selecionados e água como uma referência (Handbook of Chemistry and Physics, CMC Press, as constante dielétricas são medidas em campos elétricos estáticos ou a frequências relativamente baixas, onde não ocorre relaxamento)

No presente contexto, 1,2-propanodiol e propileno glicol são utilizados indistintamente. No presente contexto, propanotriol e glicerol são utilizados indistintamente. No presente contexto, etanodiol e etileno glicol são utilizados indistintamente.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em polióis. 0 termo "poliol" como aqui utilizado refere-se a compostos químicos que contêm múltiplos grupos hidroxilo.

Num aspeto, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em dióis e trióis. 0 termo "diol" como aqui utilizado refere-se a compostos químicos que contêm dois grupos hidroxilo. 0 termo "triol" como aqui utilizado refere-se a compostos químicos que contêm três grupos hidroxilo.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em glicerol (propanotriol), etanodiol (etileno glicol), 1,3-propanodiol, metanol, 1,4-butanodiol, 1,3-butanodiol, propileno glicol (1,2-propanodiol), etanol e isopropanol, ou misturas dos mesmos. Numa alternativa, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em propileno glicol e glicerol. 0 glicerol é biocompatível mesmo a doses elevadas e tem uma alta capacidade solvente para a insulina estabilizada contra proteases acilada. Alternativamente, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em propileno glicol e etileno glicol. Estes solventes orgânicos polares têm uma baixa viscosidade, são biocompatíveis a doses moderadas e têm capacidade de solvente orgânico polar muito alta para a insulina estabilizada contra proteases acilada. 0 solvente orgânico polar deve ser preferencialmente de alta pureza com um baixo teor de, por exemplo, aldeídos, cetonas e outras impurezas redutoras a fim de minimizar a deterioração química do polipéptido solubilizado devido por exemplo à reação de Maillard. Pode adicionar-se moléculas armadilha como glicilglicina e etilenodiamina às formulações que compreendem solvente(s) orgânico(s) polar(es) tais como polióis para reduzir a deterioração do polipéptido, ao mesmo tempo que se pode adicionar antioxidantes para reduzir a velocidade de formação impurezas redutoras adicionais.

Num aspeto, o solvente orgânico polar está presente na composição farmacêutica numa quantidade de 1-50% p/p, por exemplo, 5-40% p/p, por exemplo, 5-30% p/p. Alternativamente, o solvente orgânico polar está presente numa quantidade de 10-30% p/p, por exemplo, 10-25% p/p, por exemplo, numa quantidade de cerca de 20% p/p ou cerca de 15% p/p.

Por exemplo, o solvente polar orgânico polar é propileno glicol e está presente na composição farmacêutica numa quantidade de 1-50% p/p, por exemplo, 5-40% p/p, por exemplo, 10-30% p/p, por exemplo, 10-25% p/p, por exemplo, 10-20% p/p, por exemplo, cerca de 20% p/p ou cerca de 15% p/p.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em glicerol, propileno glicol e misturas dos mesmos.

Pode adicionar-se um componente hidrófilo sólido à composição farmacêutica para tornar ou ajudar a tornar a composição farmacêutica sólida ou semissólida à temperatura ambiente. O componente hidrófilo pode compreender mais do que um excipiente. Se o componente hidrófilo compreende mais do que um excipiente, o componente hidrófilo pode ser uma mistura de líquidos, sólidos ou ambos.

Quando está presente um componente hidrófilo sólido, a composição farmacêutica pode compreender desde cerca de 1% a cerca de 25% em peso de componente hidrófilo sólido, por exemplo, desde cerca de 2% a cerca de 20%, por exemplo, desde cerca de 3% a cerca de 15%, por exemplo desde cerca de 4% a cerca de 10%.

Um exemplo de um componente hidrófilo é PEG que é o polímero de óxido de etileno que está geralmente conforme com a fórmula H(OCH2CH2) nOH em que n correlaciona com o peso molecular médio do polímero.

Os tipos de PEG úteis na preparação de composições farmacêuticas podem ser classificados pelo seu estado de matéria, isto é, se a substância existe numa forma sólida ou líquida à temperatura e pressão ambiente. Como aqui utilizado, "PEG sólido" refere-se a um PEG que tem um peso molecular de tal forma que a substância está num estado sólido à temperatura e pressão ambiente. Por exemplo, um PEG que tem um peso molecular que varia entre 1 000 e 10 000 é um PEG sólido. Tais PEGs incluem, mas não se limitam a PEG 1000, PEG 1550, PEG 2000, PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ou PEG 8000. Os PEGs sólidos particularmente úteis são aqueles que têm um peso molecular entre 1 450 e 8 000. Especialmente úteis como um PEG sólido são PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, seus derivados e misturas dos mesmos. PEGs de vários pesos moleculares estão comercialmente disponíveis como a série CARBOWAX SENTRY de Dow Chemicals (Danbury, CT). Além do mais, os PEGs sólidos têm uma estrutura cristalina, ou matriz polimérica, de poli(óxido de etileno) ("PEO") que tem uma estrutura idêntica ao PEG, exceto para o comprimento da cadeia e os grupos terminais também são adequados. Vários graus de PEO estão comercialmente disponíveis como POLYOX de Dow Chemicals. O PEO, por exemplo, tem um peso molecular que varia desde cerca de 100 000 a 7 000 000. O componente hidrófilo pode compreender PEG, PEO, e quaisquer combinações dos anteriores.

Os componentes hidrófilos podem incluir opcionalmente um alcanol inferior, por exemplo, etanol. Embora a utilização de etanol não seja essencial, ela pode melhorar a solubilidade do polipéptido no veiculo, melhorar a caracteristicas de conservação e/ou reduzir o risco de precipitação do fármaco.

Num aspeto ilustrativo alternativo, o componente hidrófilo do veiculo consiste num único componente hidrófilo, por exemplo, um PEG sólido, por exemplo, PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000 e PEG 8000. Neste aspeto ilustrativo, a fase hidrófila do componente de microemulsão consiste numa única substância hidrófila. Por exemplo, se o veiculo compreendia PEG 3350, o veiculo não conteria outras substâncias hidrófilas, por exemplo, alcanóis inferiores (em que alquilo inferior é Ci-C4) , tais como etanol; ou água.

Ainda noutro aspeto ilustrativo alternativo, o componente hidrófilo do veiculo consiste numa mistura de PEGs sólidos. Por exemplo, o componente hidrófilo compreende PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, seus derivados e quaisquer combinações e misturas dos mesmos.

Num aspeto, o veiculo compreende um ou mais tensioativos, isto é, opcionalmente uma mistura de tensioativos; ou agentes tensioativos, que reduzem a tensão interfacial. O tensioativo é, por exemplo, não iónico, iónico ou anfotérico. Os tensioativos podem ser misturas complexas que contêm produtos secundários ou produtos de partida por reagir envolvidos na sua preparação, por exemplo, os tensioativos preparados por polioxietilação podem conter outro produto secundário, por exemplo, PEG. 0 tensioativo ou os tensioativos têm um valor de equilíbrio hidrófilo-lipófilo (HLB) que é de pelo menos 8. Por exemplo, o tensioativo pode ter um valor de HLB médio de 8-30, por exemplo, 12-30, 12-20 ou 13-15. Os tensioativos podem ser de natureza liquida, semissólida ou sólida. O termo "tensioativo" como aqui utilizado refere-se a qualquer substância, em particular um detergente que pode adsorver-se nas superfícies e interfaces, como líquido para ar, líquido para líquido, líquido para recipiente ou líquido para qualquer sólido. O tensioativo pode ser selecionado de um detergente, tal como óleo de rícino etoxilado, glicéridos poliglicosilados, monoglicéridos acetilados, ésteres de sorbitano de ácidos gordos, polissorbato, tal como polissorbato-20, poloxâmeros, tais como poloxâmero 188 e poloxâmero 407, ésteres de polioxietileno sorbitano de ácidos gordos, derivados de polioxietileno tais como derivados alquilados e alcoxilados (tweens, por exemplo Tween-20, ou Tween-80), monoglicéridos ou seus derivados etoxilados, diglicéridos ou seus derivados de polioxietileno, glicerol, ácido eólico ou seus derivados, lecitinas, álcoois e fosfolípidos, glicerofosfolípidos (lecitinas, cefalinas, fosfatidilserina), gliceroglicolípidos (galactopiranosídeos), esfingofosfolípidos (esfingomielina) e esfingoglicolípidos (ceramidas, gangliosídeos), DSS (docusato sódico, registo CAS n.° [577-11-7]), docusato cálcico, registo CAS n.° [128-49-4]), docusato potássico, registo CAS n.° [7491-09-0]), SDS (dodecilsulfato de sódio ou laurilsulfato de sódio), ácido dipalmitoilfosfatídico, caprilato de sódio, ácidos biliares e seus sais e conjugados com glicina ou taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-hexadecil-N,N-dimetil-3- ammonio-l-propanossulfonato, tensioativos monovalentes aniónicos (alquilarilsulfonatos) , palmitoílo lisofosfatidil-L-serina, lisofosfolípidos (por exemplo ésteres de l-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina ou treonina), derivados de alquilo, alcoxilo (éster de alquilo), alcoxilo (éter de alquilo) de lisofosfatidil- e fosfatidilcolinas, por exemplo, derivados de lauroílo e miristoílo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo cabeça polar, isto é colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, e os DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP carregados positivamente, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina, tensioativos zwitteriónicos (por exemplo N-alquil-N,N-dimetilammonio-l-propano-sulfonatos, 3-colamido-l-propildimetilamónio-l-propanossulfonato, dodecilfosfocolina, miristoil lisofosfatidilcolina, lisolecitina de ovo de galinha), tensioativos catiónicos (bases de amónio quaternário) (por exemplo brometo de cetil-trimetilamónio, cloreto de cetilpiridínio), tensioativos não iónicos (por exemplo, alquilglicosídeos como dodecil-3-D-glucopiranosídeo, dodecil^-D-maltósido, tetradecil-p-D-glucopiranosídeo, decil-p-D-maltósido, dodecil-p-D-maltósido, tetradecil-p-D-maltósido, hexadecil-β-D-maltósido, decil-p-D-maltotriósido, dodecil-p-D- maltotriósido, tetradecilo β-D-maltotriósido, hexadecil-β-D-maltotriósido, n-dodecil-sacarose, n-decil-sacarose, álcoois gordos etoxilatos (por exemplo, éteres de alquilo de polioxietileno como éter mono-tridecílico de octaetileno glicol, éter mono-dodecílico de octaetileno glicol, éter mono-tetradecílico de octaetileno glicol), copolímeros de bloco como copolímeros de bloco de poli(óxido de etilo)/poli(óxido de propileno) (Pluronics/Tetronics, Triton X-100) tensioativos de alcanoatos de sorbitano etoxilados (por exemplo, Tween-40, Tween-80, Brij-35), derivados de ácido fusídico (por exemplo, tauro-di- hidrofusidato de sódio etc.), ácidos gordos de cadeia longa e seus sais C8-C20 (por exemplo, ácido oleico e ácido caprilico), acilcarnitinas e derivados, derivados N-acilados de lisina, arginina ou histidina, ou derivados acilados na cadeia lateral de lisina ou arginina, derivados N-acilados de dipéptidos que compreendem qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado N-acilado de um tripéptido que compreende qualquer combinação de um aminoácido neutra e dois aminoácidos carregados, ou o tensioativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imidazolina, ou misturas dos mesmos.

Os exemplos de tensioativos sólidos incluem, mas não se limitam a, 1. produtos de reação de um óleo de rícino natural ou hidrogenado e óxido de etileno. 0 óleo de rícino natural ou hidrogenado pode ser feito reagir com óxido de etileno numa proporção molar desde cerca de 1:35 a cerca de 1:60, com remoção opcional do componente PEG dos produtos. Vários tensioativos deste tipo estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a série CREMOPHOR de BASF Corp. (Mt. Olive, NJ) , tal como o CREMOPHOR RH 40 que é óleo de rícino hidrogenado com PEG40 que tem um valor de saponificação de cerca de 50 a 60, um valor de ácido inferior a cerca de um, um teor de água, isto é, Fischer, inferior a cerca de 2%, um nD60 de cerca de 1,453-1,457, e um HLB de cerca de 14-16; 2. ésteres de ácidos gordos de polioxietileno que incluem ésteres de ácido esteárico de polioxietileno, tal como a série MYRJ de Uniqema por exemplo, MYRJ 53 que tem um p.f. de cerca de 47 °C. Os compostos particulares na série MYRJ são, por exemplo, MYRJ 53 que tem um p.f. de cerca de 47 °C e PEG-40-estearato disponível como MYRJ 52; 3. derivados de sorbitano que incluem a série TWEEN de Uniqema, por exemplo, TWEEN 60; 4. copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno e copolimeros de bloco ou poloxâmeros, por exemplo, Pluronic F127, Pluronic F68 de BASF; 5. éteres de alquilo de polioxietileno, por exemplo, tais como éteres de polioxietileno glicol de álcoois Ci2-Ci8, por exemplo, éter polioxil 10 ou 20-cetílico ou éter polioxil 23-laurílico, ou éter 20-oleílico, ou éter polioxil 10-, 20 ou 100-estearílico, como conhecidos e comercialmente disponíveis como a série BRIJ de Uniqema. Os produtos particularmente úteis da série BRIJ são BRIJ 58; BRIJ 76; BRIJ 78; BRIJ 35, isto é, éter polioxil 23 laurílico; e BRIJ 98, isto é, éter polioxil 20 oleilico. Estes produtos têm um p.f. entre cerca de 32 °C a cerca de 43 °C; 6. ésteres de ácido succinico de tocoferil PEG solúveis em água disponíveis de Eastman Chemical Co. com um p.f. de cerca de 36 °C, por exemplo, TPGS, por exemplo, vitamina E TPGS. 7. éteres de PEG esterol que têm, por exemplo, desde 5-35 unidades [CH2-CH-0], por exemplo, 20-30 unidades, por exemplo, SOLULAN C24 (Choleth-24 e Cetheth-24) de Chemron (Paso Robles, CA) ; produtos semelhantes que podem ser também utilizados são aqueles que são conhecidos e comercialmente disponíveis como NIKKOL BPS-30 (30 fitoesterol polietoxilado) e NIKKOL BPSH-25 (25 fitoestanol polietoxilado) de Nikko Chemicals; 8. ésteres de poliglicerol de ácidos gordos, por exemplo, que têm uma gama de unidades de glicerol desde 4-10, ou 4, 6 ou 10 unidades de glicerol. Por exemplo, são particularmente adequados o deca-/hexa-/tetramonoestearato de glicerilo, por exemplo, DECAGLYN, HEXAGLYN e TETRAGLYN de Nikko Chemicals; 9. éter ou éster de alquileno poliol, por exemplo, glicéridos de lauroil macrogol-32 e/ou glicéridos de estearoil macrogol-32 que são GELUCIRE 44/14 e GELUCIRE 50/13, respetivamente; 10. monoésteres de polioxietileno de um hidroxi-ácido gordo Cio a C22 saturado, tal como C18 substituído por exemplo; por exemplo éster de PEG de ácido 12-hidroxi-esteárico, por exemplo de PEG com cerca de, por exemplo, 600-900 por exemplo 660 Daltons de MM, por exemplo SOLUTOL HS 15 de BASF (Ludwigshafen, 20 Alemanha). De acordo com um panfleto técnico da BASF o MEF 151 E (1986), SOLUTOL HS 15 compreende cerca de 70% de 12-hidroxiestearato polietoxilado em peso e cerca de 30% em peso do componente de polietileno glicol não esterifiçado. Tem um valor de hidrogenação de 90 a 110, um valor de saponificação de 53 a 63, um número de ácido máximo 1, e um teor de água máximo de 0,5% em peso; 11. éteres de alquilo de polioxietileno-polioxipropileno, por exemplo éteres de polioxietileno-polioxipropileno de álcoois C12 a C18, por exemplo éter 4-cetílico de polioxietileno-20-polioxipropileno que está comercialmente disponível como NIKKOL PBC 34 de Nikko Chemicals; 12. diestearatos polietoxilados, por exemplo comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais ATLAS G 1821 de Uniqema e NIKKOCDS-6000P de Nikko Chemicals; e 13. lecitinas, por exemplo, fosfolípidos de soja, por exemplo comercialmente disponíveis como LIPOIDE S75 de Lipoide GmbH (Ludwigshafen, Alemanha) ou fosfolípido de ovo, comercialmente disponível como PHOSPHOLIPON 90 de Nattermann Phospholipid (Cologne, Alemanha).

Os exemplos de tensioativos líquidos incluem, mas não se limitam a, derivados de sorbitano tais como TWEEN 20, TWEEN 40 e TWEEN 80, SYNPERONIC L44, e éter polioxil 10-oleílico, todos disponíveis de Uniqema, e tensioativos que contêm polioxietileno por exemplo glicéridos caprílicos/cápricos de PEG-8 (por exemplo, Labrasol disponível de Gattefosse). A composição pode compreender desde cerca de 0% a cerca de 95% em peso de tensioativo, por exemplo desde cerca de 5% a cerca de 80% em peso, por exemplo, cerca de 10% a cerca de 70% em peso, por exemplo, desde cerca de 20% a cerca de 60% em peso, por exemplo, desde cerca de 30% a cerca de 50%.

Num aspeto, o tensioativo é copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno e copolímeros de bloco ou poloxâmeros, por exemplo, Pluronic F127, Pluronic F68 de BASF.

Num aspeto, o tensioativo é um poloxâmero. Num outro aspeto, o tensioativo é selecionado do grupo que consiste em poloxâmero 188, poloxâmero 407 e misturas de poloxâmero 407 e poloxâmero 188.

Num aspeto, o tensioativo é um tensioativo que contém polioxietileno por exemplo, glicéridos caprilicos/cápricos de PEG-8 (por exemplo, Labrasol disponível de Gattefosse).

Num aspeto, o tensioativo é um polioxilglicérido de lauroilo (por exemplo Gelucire 44/14 disponível de Gattefosse).

Num aspeto, o tensioativo é Cremophor RH40 de BASF.

Em certos aspetos, a composição farmacêutica pode compreender excipientes adicionais comummente encontrados em composições farmacêuticas, e os exemplos de tais excipientes incluem, mas não se limitam a, antioxidantes, agentes antimicrobianos, inibidores de enzimas, estabilizantes, conservantes, aromas, edulcorantes e outros componentes como descritos em Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et ai., Eds., 4th Edition, Pharmaceutical Press (2003).

Estes excipientes adicionais podem estar numa quantidade desde cerca de 0,05-5% em peso da composição farmacêutica total. Os antioxidantes, agentes antimicrobianos, inibidores de enzimas, estabilizantes ou conservantes proporcionam tipicamente até cerca de 0,05-1% em peso da composição farmacêutica total. Os edulcorantes ou aromatizantes proporcionam tipicamente até cerca de 2,5% ou 5% em peso da composição farmacêutica total.

Os exemplos de antioxidantes incluem, mas não se limitam a, ácido ascórbico e seu derivados, tocoferol e seu derivados, butil-hidroxianisole e butil-hidroxitolueno.

Num aspeto, a composição compreende um tampão. O termo "tampão" como aqui utilizado refere-se a um composto químico numa composição farmacêutica que reduz a tendência para o pH da composição mudar ao longo do tempo como ocorreria de outro modo devido a reações químicas. Os tampões incluem produtos químicos tais como fosfato de sódio, TRIS, glicina e citrato de sódio. O termo "conservante" como aqui utilizado refere-se a um composto químico que é adicionado a uma composição farmacêutica para prevenir ou retardar a atividade microbiana (crescimento e metabolismo) . Os exemplos de conservantes farmaceuticamente aceitáveis são fenol, m-cresol e uma mistura de fenol e m-cresol. O termo "estabilizante" como aqui utilizado refere-se a produtos químicos adicionados a composições farmacêuticas que contêm péptidos para estabilizar o péptido, isto é, para aumentar o período de conservação e/ou o tempo de utilização de tais composições. Os exemplos de estabilizantes utilizados em formulações farmacêuticas são L-glicina, L-histidina, arginina, glicilglicina, etilenodiamina, citrato, EDTA, zinco, cloreto de sódio, polietileno glicol, carboximetilcelulose, e tensioativos e antioxidantes como alfa-tocoferol e ácido L-ascórbico.

Num outro aspeto, um processo de preparação de uma composição farmacêutica que contém uma insulina estabilizada contra proteases acilada, compreende os passos de colocar o fármaco e um veiculo que compreende um solvente orgânico polar, um componente lipófilo e opcionalmente um tensioativo e/ou um componente hidrófilo em mistura intima. Por exemplo, a insulina estabilizada contra proteases acilada e o veiculo podem ser liquefeitos, por exemplo, aquecendo de cerca de 20 °C a cerca de 80 °C, e, em seguida, solidificados por arrefecimento até à temperatura ambiente. O veiculo pode ser preparado separadamente antes de colocar um veiculo que compreende um solvente orgânico polar, um componente lipófilo e opcionalmente um tensioativo e/ou um componente hidrófilo em mistura intima com o péptido de insulina derivatizado. Alternativamente, um, dois ou mais dos componentes do veiculo podem ser misturado em conjunto com o polipéptido. A insulina estabilizada contra proteases acilada pode ser dissolvida no solvente orgânico polar e ser, em seguida, misturada com o componente lipidico e opcionalmente com um tensioativo.

Alternativamente, um processo de preparação de uma composição farmacêutica tal como SEDDS ou SMEDDS (que pode ser introduzida numa cápsula, por exemplo cápsula revestida entericamente, cápsula mole, cápsula mole entérica) que contém uma insulina estabilizada contra proteases acilada, compreende os seguintes passos: (a) dissolver o péptido de insulina derivatizado no solvente orgânico polar e (b) misturar com o componente lipófilo, tensioativo e opcionalmente componente hidrófilo.

Por exemplo, um processo de preparação da composição farmacêutica é realizado a temperatura baixa (por exemplo temperatura ambiente ou abaixo da temperatura ambiente).

Quando se prepara a composição farmacêutica, a insulina estabilizada contra proteases acilada pode ser, por exemplo, dissolvida no solvente orgânico polar utilizando o seguinte método: a) proporcionar uma solução aquosa da insulina estabilizada contra proteases acilada, que compreenda opcionalmente excipientes, b) ajustar o valor de pH a um valor de pH alvo que é 1 unidade, alternativamente 2 unidades e alternativamente 2,5 unidades de pH acima ou abaixo do pi da insulina estabilizada contra proteases acilada, c) remover a água (desidratação) da insulina estabilizada contra proteases acilada por tecnologias de secagem convencionais tais como secagem por congelação e secagem por pulverização, e d) misturar e dissolver a insulina estabilizada contra proteases acilada no referido solvente não aquoso polar, por exemplo, por agitação, revolução ou outros métodos de mistura, e) opcionalmente filtrar ou centrifugar a solução não aquosa da insulina estabilizada contra proteases acilada para remover sais inorgânicos não dissolvidos, f) opcionalmente remover quantidades residuais de água, por exemplo, por adição de dessecantes sólidos ou secagem em vácuo.

Por exemplo, a insulina estabilizada contra proteases acilada é dissolvida no solvente orgânico polar pelo seguinte método: a) proporcionar uma solução aquosa de uma insulina estabilizada contra proteases acilada, que contém opcionalmente estabilizantes tais como zinco e glicilglicina, b) ajustar o valor de pH a 1 unidade, alternativamente 2 unidades e alternativamente 2,5 unidades de pH acima ou abaixo do pi do polipéptido, por exemplo, adicionando uma base ou um ácido não volátil, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio, à solução, c) remover a água (desidratação) da insulina estabilizada contra proteases acilada por tecnologias de secagem convencionais tais como secagem por congelação e secagem por pulverização, d) misturar e dissolver a insulina estabilizada contra proteases acilada no referido solvente não aquoso polar, por exemplo, por agitação, revolução ou outros métodos de mistura, e) opcionalmente filtrar ou centrifugar a solução não aquosa da insulina estabilizada contra proteases acilada para remover sais inorgânicos não dissolvidos, f) opcionalmente remover quantidades residuais de água, por exemplo, por adição de dessecantes sólidos ou secagem em vácuo.

Por "base volátil" entende-se uma base, que em certa medida se evaporará ao aquecer e/ou a pressão reduzida, por exemplo, bases que têm uma pressão de vapor superior a 65 Pa à temperatura ambiente ou uma mistura azeotrópica aquosa que inclua uma base que tem uma pressão de vapor superior a 65 Pa à temperatura ambiente. Os exemplos de bases voláteis são hidróxidos de amónio, hidróxidos de tetraalquilamónio, aminas secundárias, aminas terciárias, arilaminas, aminas alifáticas ou bicarbonato de amónio ou uma combinação. Por exemplo, a base volátil pode ser bicarbonato, carbonato, amónia, hidrazina ou uma base orgânica tal como uma amina alifática inferior, por exemplo, trimetilamina, trietilamina, dietanolaminas, trietanolamina e seus sais. Além disso, a base volátil pode ser hidróxido de amónio, etilamina ou metilamina ou uma combinação das mesmas.

Por "ácido volátil" entende-se um ácido, que em certa medida se evaporará ao aquecer e/ou a pressão reduzida, por exemplo, ácidos que têm uma pressão de vapor superior a 65 Pa à temperatura ambiente ou uma mistura azeotrópica aquosa que inclua um ácido que tem uma pressão de vapor superior a 65 Pa à temperatura ambiente. Os exemplos de ácidos voláteis são ácido carbónico, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico e ácido butirico.

Uma "base não volátil" como aqui mencionada significa uma base, que não se evapora ou apenas se evapora parcialmente ao aquecer, por exemplo, bases com uma pressão de vapor inferior a 65 Pa à temperatura ambiente. A base não volátil pode ser selecionada do grupo que consiste em sais de metais alcalinos, hidróxidos de metais alcalinos, sais de metais alcalinoterrosos, hidróxidos de metais alcalinoterrosos e aminoácidos ou uma combinação dos mesmos. Os exemplos de bases não voláteis são hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio e óxido de cálcio.

Um "ácido não volátil" como aqui mencionado significa um ácido, que não se evapora ou apenas se evapora parcialmente ao aquecer, por exemplo, bases com uma pressão de vapor inferior a 65 Pa à temperatura ambiente. Os exemplos de ácidos não voláteis são ácido clorídrico, ácido fosfórico e ácido sulfúrico. A insulina estabilizada contra proteases acilada pode estar presente numa quantidade de até cerca de 40%, tal como até cerca de 20% em peso da composição, ou desde cerca de 0,01%, tal como desde cerca de 0,1%, alternativamente, desde cerca de 0,01% a cerca de 20%, alternativamente, desde cerca de 1% a 20% ou desde cerca de 1% a 10% em peso da composição. No entanto, pretende-se que a escolha de um nível particular de polipéptido seja feita de acordo com fatores bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas, incluindo a solubilidade do polipéptido no solvente orgânico polar, ou componente hidrófilo ou tensioativo opcional utilizado, ou uma mistura dos mesmos, o modo de administração e o tamanho e condição do doente.

Por exemplo, a formulação farmacêutica compreende uma insulina estabilizada contra proteases acilada numa concentração desde 0,1 % p/p a 30 % p/p.

Cada dose unitária conterá adequadamente desde 0,1 mg a 300 mg de polipéptido de insulina estabilizada contra proteases acilada, por exemplo, cerca de 0,1 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 2 5 mg, 5 0 mg, 100 mg, 200 mg, 2 50 mg, 300 mg, por exemplo, entre 5 mg e 300 mg da insulina estabilizada contra proteases acilada. Por exemplo, cada dose unitária contém entre 10 mg e 300 mg, por exemplo 10 mg e 100 mg ou entre 20 mg e 300 mg, por exemplo, entre 20 mg e 100 mg da insulina estabilizada contra proteases acilada. Tais formas de dose unitária são adequadas para administração 1-5 vezes por dia, dependendo da finalidade particular da terapia. A insulina estabilizada contra proteases acilada é otimizada em pH antes da dissolução no solvente orgânico polar para melhorar a solubilidade no solvente orgânico polar.

Quando se utiliza o termo "otimizado em pH, " pretende-se referir aqui que a insulina estabilizada contra proteases acilada foi desidratada a um pH alvo que está pelo menos a 1 unidade de pH do pi da insulina estabilizada contra proteases acilada em solução aquosa. Assim, o pH alvo é mais de 1 unidade de pH acima do ponto isoelétrico da insulina estabilizada contra proteases acilada. Alternativamente, o pH alvo é mais de 1 unidade de pH abaixo do ponto isoelétrico da insulina estabilizada contra proteases acilada. Consequentemente, o pH alvo poderia ser mais do que 1,5 unidades de pH acima ou abaixo do pi, por exemplo, 2,0 unidades de pH ou mais acima ou abaixo do pi, por exemplo, 2,5 unidades de pH ou mais acima ou abaixo do pi da insulina estabilizada contra proteases acilada. O termo "desidratada" como aqui utilizado em conexão com uma insulina estabilizada contra proteases acilada refere-se a uma insulina estabilizada contra proteases acilada derivatizada que foi seca a partir de uma solução aquosa. O termo "pH alvo" como aqui utilizado refere-se ao pH aquoso que se estabelecerá quando a insulina estabilizada contra proteases acilada desidratada é reidratada em água pura a uma concentração de aproximadamente 40 mg/mL ou mais. O pH alvo será tipicamente idêntico ao pH da solução aquosa da insulina estabilizada contra proteases acilada a partir da qual a insulina estabilizada contra proteases acilada foi recuperada por secagem. No entanto, o pH da solução de insulina estabilizada contra proteases acilada não será idêntico ao pH alvo, se a solução contiver ácidos ou bases voláteis. Verificou-se que a história de pH da insulina estabilizada contra proteases acilada será determinante para a quantidade da insulina estabilizada contra proteases acilada que pode ser solubilizada no solvente orgânico polar. 0 termo "o pi do polipéptido" como aqui utilizado refere-se ao ponto isoelétrico de um polipéptido. 0 termo "ponto isoelétrico" como aqui utilizado significa o valor de pH ao qual a carga liquida total de uma macromolécula tal como um péptido é zero. Nos péptidos pode haver vários grupos carregados, e no ponto isoelétrico a soma de todas essas cargas é zero. A um pH acima do ponto isoelétrico a carga liquida total do péptido será negativa, enquanto a valores de pH abaixo do ponto isoelétrico a carga liquida total do péptido será positiva. 0 pi de uma proteina pode ser determinado experimentalmente por técnicas de eletroforese tais como eletrofocagem: É estabelecido um gradiente de pH num meio anticonvectivo, tal como um gel de poliacrilamida. Quando uma proteina é introduzida no sistema, ela migrará sob a influência de um campo elétrico aplicado através do gel. As proteínas carregadas positivamente migrarão para o cátodo. Eventualmente, a proteína em migração atinge um ponto no gradiente de pH onde a sua carga elétrica líquida é zero e é referida como estando focada. Este é o pH isoelétrico (pi) da proteína. A proteína é em seguida fixa sobre o gel e revelada. 0 pi da proteína pode ser em seguida determinado por comparação da posição da proteína sobre o gel relativamente a moléculas marcadoras com valores de pi conhecidos. A carga líquida de uma proteína a um dado valor de pH pode ser estimada teoricamente por uma pessoa especialista na técnica por métodos convencionais. Em essência, a carga líquida de proteína é o equivalente à soma das cargas fracionadas dos aminoácidos carregados na proteína: aspartato (grupo β-carboxilo), glutamato (grupo δ-carboxilo), cisteína (grupo tiol), tirosina (grupo fenol), histidina (cadeias laterais de imidazole), lisina (grupo ε-amónio) e arginina (grupo guanidínio). Além disso, deve também ter-se em consideração a carga dos grupos terminais da proteína (a-NH2 e α-COOH). A carga fracionada dos grupos ionizáveis pode ser calculada a partir dos valores de pKa intrínsecos. A secagem, isto é, a desidratação da insulina estabilizada contra proteases acilada pode ser realizada por qualquer método de secagem convencional tal como, por exemplo, por secagem por pulverização, congelação, vácuo, ao ar e contacto. Por exemplo, a solução de insulina estabilizada contra proteases acilada é seca por pulverização para se obter um teor de água inferior a cerca de 10%, por exemplo, inferior a cerca de 8%, inferior a cerca de 6%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 4%, inferior a cerca de 3%, inferior a cerca de 2% ou inferior a cerca de 1% calculada no/medida pelo teste de perda por secagem (gravimétrico) como especificado na parte experimental.

Por exemplo, a insulina estabilizada contra proteases acilada é seca por pulverização ou seca por congelação.

As composições que contêm insulinas estabilizadas contra proteases aciladas desta invenção podem ser utilizadas no tratamento de estados que são sensíveis a insulina. Assim, podem ser utilizadas no tratamento de diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 e hiperglicemia, por exemplo, como por vezes se observa em pessoas com lesões graves e pessoas que sofreram uma cirurgia importante. 0 nível de dose ótima para qualquer doente dependerá de uma variedade de fatores incluindo a eficácia do derivado de insulina específico utilizado, a idade, peso corporal, atividade física, e dieta do doente, de uma possível combinação com outros fármacos e da gravidade do estado a ser tratado. Recomenda-se que a dose diária da insulina acilada desta invenção seja determinada para cada doente individual pelos especialistas na técnica de uma maneira semelhante à de composições de insulina conhecidas.

CARACTERÍSTICAS PREFERIDAS DESTA INVENÇÃO

As características desta invenção são como se segue: 1. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada em que a insulina estabilizada contra proteases consiste, formalmente, numa insulina não estabilizada contra proteases (insulina parental) em que pelo menos um aminoácido hidrófobo foi substituído por aminoácidos hidrófilos, e em que a referida substituição é dentro ou muito próximo de um ou mais sítios de dissociação por proteases da insulina não estabilizada contra proteases (insulina parental) e em que essa insulina estabilizada contra proteases compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais com a condição de que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a unidade acilo está ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na insulina estabilizada contra proteases. 2. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada em que a insulina estabilizada contra proteases consiste, formalmente, numa insulina não estabilizada contra proteases (insulina parental) em que pelo menos dois aminoácidos hidrófobos foram substituídos por aminoácidos hidrófilos, e em que as referidas substituições são dentro ou muito próximas de dois ou mais sítios de dissociação por proteases da insulina não estabilizada contra proteases (insulina parental) e em que essa insulina estabilizada contra proteases compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais com a condição de que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a unidade acilo está ligada ao resíduo de lisina na insulina estabilizada contra proteases. 3. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada em que a insulina estabilizada contra proteases consiste, formalmente, numa insulina não estabilizada contra proteases (insulina parental) em que pelo menos dois aminoácidos hidrófobos foram substituídos por aminoácidos hidrófilos, e em que as referidas substituições são dentro ou muito próximas de dois ou mais sítios de dissociação por proteases da insulina não estabilizada contra proteases (insulina parental) e em que essa insulina estabilizada contra proteases compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais com a condição de que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a unidade acilo está ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na insulina estabilizada contra proteases. 4. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores em que a insulina estabilizada contra proteases tem solubilidade aumentada relativamente à insulina parental acilada. 5. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a cadeia B da insulina compreende pelo menos uma mutação relativamente à insulina parental. 6. Uma insulina acilada de acordo com a cláusula anterior até à extensão possível, em que a cadeia B da insulina compreende um, dois ou três, mas não mais mutações relativamente à insulina parental. 7. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a cadeia A da insulina estabilizada contra proteases é idêntica à cadeia A de insulina humana. 8. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a cadeia A da insulina compreende pelo menos uma mutação e a cadeia B da insulina compreende pelo menos uma mutação relativamente à insulina parental. 9. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a cadeia A da insulina compreende pelo menos duas mutações e a cadeia B da insulina compreende pelo menos uma mutação relativamente à insulina parental. 10. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a insulina compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácidos num sítio de protease de uma primeira insulina estabilizada contra proteases modificada, em que a referida pelo menos uma substituição de aminoácidos é de tal forma que pelo menos um aminoácido hidrófobo foi substituído por pelo menos um aminoácido hidrófilo. 11. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly ou Arg; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu ou Asp; e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais. 12. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição B16 é Tyr, His ou Glu; e/ou o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly, Lys, Arg ou deleted; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu, Asp, ou está ausente (suprimido); e/ou o aminoácido na posição B29 é Lys, Arg, ou está ausente (suprimido) ; e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais e, preferencialmente, insulinas estabilizadas contra proteases aciladas em que o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição Β26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly ou Arg; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu, ou Asp; e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais. 13. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o aminoácido na posição A14 é

Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B25 é His ou Asn e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais. 14. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o aminoácido na posição A14 é

Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B25 é His ou Asn e o aminoácido na posição B30 está suprimido. 15. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o aminoácido na posição A14 é

Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B16 é His ou Glu, o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 está suprimido. 16. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o aminoácido na posição A14 é

Glu, Asp ou His e o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 está suprimido. 17. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o aminoácido na posição A14 é Glu ou Asp e o aminoácido na posição B28 é Glu ou Asp, e, opcionalmente, não há « resíduo de aminoácido na posição B30 . 18. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas de um grupo que consiste em: A8His, Al8Gln, A2lGln, A21Gly, BlGlu, BlGln, B3Gln, BlOPro, Bl4Thr, B16GÍU, Bl7Ser, B26Asp, B27Glu, B27Asp, B28Asp, B28Glu e desB30. 19. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a mutação adicional é desB30. 20. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que A14 é Glu. 21. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que B25 é Asn. 22. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que B25 é His. 23. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que B25 é Asn e B27 é Glu ou Asp. 24. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que B25 é Asn e B27 é Glu. 25. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, que exibe estabilidade aumentada contra uma ou mais enzimas proteases relativamente à proteína parental. 26. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, que exibe estabilidade aumentada contra duas ou mais enzimas proteases relativamente à proteína parental. 27. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a insulina parental é selecionada de um grupo que consiste em a) insulina humana; b) um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B28 é Pro, Asp, Lys, Leu, Vai ou Ala e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro e opcionalmente o resíduo de aminoácido na posição B30 está suprimido; c) insulina humana des(B26-B30), insulina humana des (B27-B30), insulina humana des(B28-B30), insulina humana des (B29-B30), insulina humana des(B27) ou insulina humana des(B30); d) um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Glu ou Asp; e) um análogo de insulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição A21 é Gly e em que o análogo de insulina é adicionalmente prolongado na extremidade C-terminal com dois resíduos de Arg; f) um derivado de insulina em que o resíduo de aminoácido na posição B30 está substituído com um éster metílico de treonina; e g) um derivado de insulina em que à posição Νε da lisina na posição B29 da insulina humana des(B30) está ligada uma cadeia de tetradecanoílo. 28. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas para aumentar estabilidade química da insulina. 29. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com a cláusula anterior até à extensão possível, em que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas de um grupo que consiste em Al8Gln, A21Gln, A21Gly e B3Gln. 30. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia A de fórmula 1, isto é, : XaaA(-2) -XaaA(_ i) -XaaAo_Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8_Ser-Ile-Cys-XaaAi2_ XaaAi3-XaaAi4XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8-Tyr-Cys-XaaA2i (SEQ ID No;l) , e uma sequência de aminoácidos da cadeia B de fórmula 2, istO é, · XaaB(-2)—XaaB(-i)—XaaBo — XaaBi — XaaB2 — XaaB3 — XaaB4 — HÍS — LeU — Cys-Gly-Ser-XaaBio_Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaBi6_Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24_XaaB25_XaaB2 6_XaaB27XaaB28_XaaB29_XaaB3o_ XaaB3i-XaaB32 (SEQ ID No:2), em que XaaA(-2) está ausente ou é

Gly; XaaA(-D está ausente ou é Pro; XaaA0 está ausente ou é

Pro; XaaA8 é independentemente selecionado de Thr e His; XaaAi2 é independentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; XaaAi3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAi4 é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin,

His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAi5 é independentemente selecionado de Gin, Asp e Glu; XaaAi8 é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; XaaA2i é independentemente selecionado de Asn e Gin; XaaB(-2) está ausente ou é Gly; XaaB(-i) está ausente ou é Pro; XaaB0 está ausente ou é Pro; XaaBi está ausente ou é independentemente selecionado de Phe e Glu; XaaB2 está ausente ou é Vai; XaaB3 está ausente ou é independentemente selecionado de Asn e Gin; XaaB4 é independentemente selecionado de Gin e Glu; XaaBio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; XaaBi6 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; XaaB24 é independentemente selecionado de Phe e His; XaaB25 é independentemente selecionado de Phe, Asn e His; XaaB26 está ausente ou é independentemente selecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; XaaB27 está ausente ou é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaB28 está ausente ou é independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; XaaB29 está ausente ou é independentemente selecionado de Lys e Gin; XaaB30 está ausente ou é Thr; XaaB3i está ausente ou é Leu; XaaB32 está ausente ou é Glu; o C-terminal pode estar opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácidos da cadeia A e a sequência de aminoácidos da cadeia B estão conectadas por pontes dissulfureto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ponte dissulfureto; em que opcionalmente a sequência de aminoácidos da cadeia A N-terminal está conectada à sequência de aminoácidos da cadeia B C-terminal por uma sequência de aminoácidos que compreende 3-7 aminoácidos para formar uma molécula de insulina de cadeia simples, em que opcionalmente a extremidade N-terminal da cadeia B está prolongada com 1-10 aminoácidos; em que se XaaA8 é Thr e XaaAi2 é Ser e XaaA43 é Leu e XaaA44 é Tyr então XaaAi5 é Glu ou Asp; e em que se XaaB24 é Phe e XaaB25 é Phe e XaaB26 é Tyr e XaaB27 é Thr e XaaB28 é Pro então XaaB29 Gin. 31. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia A de fórmula 3, isto é,: Gly-Ife-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaAi2-XaaAi3-XaaAi4-XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8_Tyr-Cys-XaaA2i (SEQ ID No: 3), e uma sequência de aminoácidos da cadeia B de fórmula 4, isto é, : XaaBi-Val-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaBio_Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaBi6-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24_His-XaaB2 6_

XaaB2 7—XaaB2 8—XaaB29—XaaB3o (SEQ ID No; 4) , em que XaaAs é independentemente selecionado de Thr e His; XaaAi2 é independentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; XaaAi3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin,

His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAi4 é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin,

His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAis é independentemente selecionado de Gin, Asp e Glu; XaaAis é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; XaaA2i é independentemente selecionado de Asn, e Gin; XaaBi é independentemente selecionado de Phe e Glu; XaaB3 é independentemente selecionado de Asn e Gin; XaaB4 é independentemente selecionado de Gin e Glu; XaaBi0 é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; XaaBi6 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; XaaB24 é independentemente selecionado de Phe e His; XaaB25 é independentemente selecionado de Phe, Asn e His; XaaB26 está ausente ou é independentemente selecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; XaaB27 está ausente ou é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His,

Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaB28 está ausente ou é independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; XaaB29 está ausente ou é independentemente selecionado de Lys e Gin; XaaB30 está ausente ou é Thr; o C-terminal pode estar opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácidos da cadeia A e a sequência de aminoácidos da cadeia B estão conectadas por pontes dissulfureto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ponte dissulfureto. 32. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com a cláusula anterior até à extensão possível, em que XaaA8 é independentemente selecionado de Thr e His; XaaAi2 é independentemente selecionado de Ser e Glu; XaaAi3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaM4 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, His, e Glu; XaaAi5 é independentemente selecionado de Gin e Glu; XaaAi8 é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; XaaA2i é independentemente selecionado de Asn, e Gin; XaaBi é independentemente selecionado de Phe e Glu; XaaB3 é independentemente selecionado de Asn e Gin; XaaB4 é independentemente selecionado de Gin e Glu; XaaBi0 é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; XaaBi6 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; XaaB24 é independentemente selecionado de Phe e His; XaaB25 é independentemente selecionado de Phe, Asn e His; XaaB26 é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Gly e Asp; XaaB27 é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, e Glu; XaaB28 é independentemente selecionado de Pro, Gly e Asp; XaaB29 é independentemente selecionado de Lys e Gin; XaaB30 está ausente ou é Thr; o C-terminal pode estar opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácidos da cadeia A e a sequência de aminoácidos da cadeia B estão conectadas por pontes dissulfureto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ponte dissulfureto. 33. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada em que, na insulina estabilizada contra proteases, o aminoácido na posição A14 é Glu ou His (isto é, E ou H, de acordo com o código de uma letra), o aminoácido na posição B25 é His e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais, e em que a unidade acilo está ligada ao grupo amino ε no resíduo de lisina na posição B29. 34. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada em que, na insulina estabilizada contra proteases, o aminoácido na posição B25 é His ou Asn, o aminoácido na posição B27 é Glu ou Asp, e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais das seguintes mutações adicionais: A8H, A14E/D, BlE/D, B28E/D, e desB30 e em que a unidade acilo está ligada ao grupo amino ε no resíduo de lisina na posição B29. 35. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada em que, na insulina estabilizada contra proteases, o aminoácido na posição A14 é Tyr, Glu ou His (isto é, Y, E ou H, de acordo com o código de uma letra), o aminoácido na posição B25 é Asn, o aminoácido na posição B27 é Glu ou Asp e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais, e em que a unidade acilo está ligada ao grupo amino ε no resíduo de lisina na posição B29. 36. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a insulina estabilizada contra proteases compreende a mutação A14E. 37. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que, na insulina estabilizada contra proteases, além da mutação na posição B25, há apenas a mutação na posição A14 mencionada na cláusula anterior. 38. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a insulina estabilizada contra proteases compreende a mutação A14H. 39. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o análogo de insulina estabilizado contra proteases compreende a mutação desB30. 40. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a uma ou mais mutações adicionais na insulina estabilizada contra proteases são selecionadas de um grupo que consiste em: A(-1)P, A(0)P, A8H, A21G, B(-1)P, B(0)P, BlE, B1Q, B16E, B26D, B27E, B28D, desB30, B31L e B32E. 41. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com a cláusula anterior até à extensão possível, em que a insulina estabilizada contra proteases, além das mutações nas posições A14 e B25, tem apenas uma das mutações mencionadas nas cláusulas anteriores. 42. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores exceto a última (isto é, exceto a cláusula 41) até à extensão possível, em que a insulina estabilizada contra proteases, além das mutações nas posições A14 e B25, tem exatamente duas das mutações mencionadas na cláusula anterior exceto duas (isto é, mencionadas na cláusula 40). 43. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores exceto as duas últimas (isto é, exceto as cláusulas 41 e 42) até à extensão possível, em que a insulina estabilizada contra proteases, além das mutações nas posições A14 e B25, tem exatamente três das mutações mencionadas na cláusula anterior exceto duas (isto é, mencionadas na cláusula 40). 44. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores exceto as duas últimas (isto é, exceto as cláusulas 41 e 42) até à extensão possível, em que, além das mutações nas posições A14 e B25, a única mutação adicional é a desB30. 45. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que o resíduo de aminoácido C-terminal na cadeia A da insulina estabilizada contra proteases é o resíduo de aminoácido A21. 46. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a insulina estabilizada contra proteases é selecionada do grupo que consiste em insulina humana A8H, B25N, B27E, desB30; A14E, A18 L, insulina humana B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana A14E, B28D, desB30; insulina humana A14E, B28E, desB30; insulina humana B25N, B27E, desB30; insulina humana B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B16H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB30; A14E, insulina humana desB30 e insulina humana A21G, B25H, desB30. 47. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que a unidade acilo ligada À insulina estabilizada contra proteases tem a fórmula geral Acy-AAln-AA2m-AA3p- (I), em que Acy, AAl, AA2, AA3, n, m e p são como definidos acima. 48. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com a cláusula anterior até à extensão possível, em que Acy é um ácido gordo, preferencialmente ácido mirístico ou ácido esteárico, mais preferencialmente ácido mirístico. 49. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores exceto a última, em que Acy é um diácido gordo, preferencialmente um diácido gordo (α,ω), mais preferencialmente ácido heptadecanodioico, ácido hexadecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido nonadecanodioico, ácido docosanodioico, ácido eicosanodioico. 50. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores exceto a última, em que Acy é um ácido ω-(tetrazol-5-il)-gordo, preferencialmente ácido 15-(lH-tetrazol-5-il)penta-decanoico, ácido 16-(lH-tetrazol-5-il)hexadecanoico, ácido 17-(lH-tetrazol-5-il)heptadecanoico, ácido 18-(lH-tetrazol-5-il)octadecanoico ou ácido 19-(lH-tetrazol-5-il)nonadecanoico. 51. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que AAl é ácido tranexâmico ou glicina. 52. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que AAl é ácido tranexâmico. 53. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que n é 0 ou 1. 54. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que n é 0. 55. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que n é 1. 56. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que AA2 é yGIu, aGlu, βΑερ, aAsp, γ-D-Glu, a-D-Glu, β-D-Asp, a-D-Asp, ou um aminoácido da seguinte fórmula:

em que as setas indicam o ponto de fixação ao grupo amino de AAl, AA2, AA3 ou ao grupo amino ε do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N-terminal da insulina estabilizada contra proteases 57. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que AA2 é yGIu, βΑερ, γ-D-Glu, β-D-Asp, ou um aminoácido da seguinte fórmula:

em que a seta indica o ponto de fixação ao grupo amino de AAl, AA2, AA3 ou ao grupo amino ε do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N-terminal da insulina estabilizada contra proteases. 58. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que AA2 é yGlu, γ-D-Glu, ou um aminoácido da seguinte fórmula:

em que a seta indica o ponto de fixação ao grupo amino de AAl, AA2, AA3 ou ao grupo amino ε do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N-terminal da insulina estabilizada contra proteases 59. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que m é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. 60. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que m é 0, 1, 2, 3 ou 4. 61. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que m é 4. 62. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que m é 3. 63. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que m é 2. 64. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que m é 1. 65. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que m é 0. 66. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que AA3 é selecionado de qualquer um dos seguintes:

e

em que rél, 2, 3, 5, 7, 11, 23 ou 27. 67. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada, de acordo com a cláusula anterior, em que rél, 3, 5 ou 7. 68. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada, de acordo com a cláusula anterior, em que rél. 69. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada, de acordo com a cláusula anterior exceto uma, em que r é 3. 70. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada, de acordo com a cláusula anterior exceto duas, em que r é 5. 71. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada, de acordo com a cláusula anterior exceto três, em que rél. 72. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores até à extensão possível, em que p é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 73. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores em que p é 0, 1, 2, 3 ou 4. 74. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores em que p é 0, 1 ou 2 . 75. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores em que p é 0 ou 2 . 76. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores em que p é 0 . 77. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores em que p é 1. 78. Uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores em que p é 2 . 79. Um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores, o qual é qualquer um dos compostos especificamente mencionados nesta descrição tal como nos exemplos específicos, especialmente qualquer um dos exemplos 1 et seq. abaixo. 80. Um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores, o qual é qualquer um dos exemplos específicos das unidades acilo mencionadas especificamente nesta descrição ligadas a qualquer uma das insulinas estabilizadas contra proteases mencionadas especificamente nesta descrição. 81. A utilização de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de diabetes. 82. A utilização de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores para a preparação de uma composição farmacêutica que pode ser administrada por via pulmonar para o tratamento de diabetes. 83. A utilização de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores para a preparação de uma composição farmacêutica que pode ser administrada por via pulmonar para o tratamento de diabetes e que dá um efeito de ação prolongada. 84. A utilização de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores para a preparação de uma composição farmacêutica em pó que pode ser administrada por via pulmonar para o tratamento de diabetes. 85. A utilização de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores para a preparação de uma composição farmacêutica liquida que pode ser administrada por via pulmonar para o tratamento de diabetes. 86. A utilização de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores para a preparação de uma composição farmacêutica que pode ser administrada por via oral para o tratamento de diabetes. 87. Um método de tratamento de diabetes, em que o método compreende a administração a um indivíduo que necessita do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores. 88. Uma composição que contém insulina humana bem como uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores. 89. Uma composição que contém insulina Aspart bem como uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores. 90. Uma composição que contém insulina Lispro bem como uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores. 91. Uma composição que contém insulina Glulisine bem como uma insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores. 92. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada contra proteases de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores relacionadas com análogos de insulina e um veículo farmaceuticamente aceitável. 93. Um método para o tratamento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância reduzida à glicose, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dislipidemia num indivíduo que compreende administrar a um indivíduo uma insulina estabilizada contra proteases de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores relacionadas com análogos de insulina ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores. 94. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina estabilizada contra proteases de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores relacionadas com análogos de insulina para a preparação de uma formulação farmacêutica para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância reduzida à glicose, diabetes tipo 1, obesidade, sindrome X ou dislipidemia. 95. Um método de tratamento de diabetes, em que o método compreende a administração a um indivíduo que necessita do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto anteriores. A combinação de uma ou mais das cláusulas aqui descritas, também opcionalmente com uma ou mais das reivindicações abaixo, resulta em cláusulas adicionais e a presente divulgação refere-se a todas as combinações possíveis das referidas cláusulas e reivindicações.

Todos os títulos e subtítulos são aqui utilizados apenas por conveniência e não devem ser interpretados como limitando de maneira alguma a invenção. A utilização de qualquer um e todos exemplos, ou a linguagem ilustrativa (por exemplo, "tal como") aqui proporcionada, destina-se apenas a iluminar melhor a invenção e não impõe uma limitação ao âmbito da invenção a menos que reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem na descrição deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção. A citação de documentos de patentes é aqui feita apenas por conveniência e não reflete qualquer ponto de vista sobre a validade, patenteabilidade e/ou aplicabilidade de tais documentos de patentes. A menção aqui de referências não é nenhuma admissão de que constituem técnica anterior.

Aqui, a palavra "compreende" é para ser interpretada como significando amplamente "inclui", "contém" ou "abrange" (orientações C 4.13 do EPO).

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são proporcionados a título de ilustração, não de limitação.

As abreviaturas aqui utilizadas são as seguintes: PAla é beta-alanilo, Aoc é ácido 8-aminooctanoico, tBu é terc-butilo, DCM é diclorometano, DIC é diisopropilcarbodiimida, DIPEA = DIEA é Λ/',Λ/'-disopropiletilamina, DMF é N,N-dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfóxido, AcOEt é acetato de etilo, Fmoc é 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, yGlu é gama L-glutamilo, HC1 é ácido clorídrico, HOBt é 1- hidroxibenzotriazole, NMP é IF-metilpirrolidona, MeCN é acetonitrilo, OEG é [2-(2-aminoetoxi)etoxi]etilcarbonilo, Su é succinimidil-l-ilo = 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo, OSu é succinimidil-l-iloxilo = 2,5-dioxo-pirrolidin-l-iloxilo, RPC é cromatografia de fase inversa, TA é temperatura ambiente, TFA é ácido trifluoroacético, THF é tetra-hidrofurano, TNBS é ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico, TRIS é tris(hidroximetil)aminometano e TSTU é tetrafluoroborato de 0- (IV-succinimidil)-1, 1,3,3- tetrametilurónio.

Os seguintes exemplos e procedimentos gerais referem-se a compostos intermediários e produtos finais identificados na descrição e nos esquemas de síntese. A preparação dos compostos é descrita em pormenor utilizando os exemplos que se seguem, mas as reações químicas descritas são divulgadas em termos da sua aplicabilidade geral à preparação de compostos. Ocasionalmente, a reação pode não se aplicável como descrita a cada composto incluído dentro do âmbito descrito da divulgação, sendo os compostos em que isto ocorre facilmente reconhecidos pelos especialistas na técnica. Nestes casos, as reações podem ser realizadas com sucesso por modificações convencionais conhecidas dos especialistas na técnica, isto é, por proteção apropriada de grupos interferentes, mudando para outros reagentes convencionais, ou por modificação de rotina de condições reacionais. Alternativamente, outras reações aqui divulgadas ou, de outro modo, convencionais serão aplicáveis à preparação dos compostos correspondentes. Em todos os métodos preparativos, todos os materiais de partida são conhecidos ou podem ser facilmente preparados a partir de materiais de partida conhecidos. Todas as temperaturas são estabelecidas em graus Celsius e salvo indicação em contrário, todas as partes e percentagens são em peso quando se referem a rendimentos e todas as partes são em volume quando se referem a solventes e eluentes.

Os compostos podem ser purificados utilizando um ou mais dos seguintes procedimentos que são típicos na técnica. Estes procedimentos podem - se necessário - ser modificados no que diz respeito a gradientes, pH, sais, concentrações, caudal, colunas e assim sucessivamente. Dependendo de fatores tais como o perfil de impurezas, a solubilidade das insulinas em questão, etcétera, estas modificações podem ser facilmente reconhecidas e feitas por um especialista na técnica.

Após HPLC ácida ou dessalinização, os compostos são isolados por liofilização das frações puras. Após HPLC neutro ou cromatografia de troca aniónica, os compostos são dessalinizados, precipitados a pH isoelétrico ou purificados por HPLC ácida.

Procedimentos de purificação típicos: 0 sistema de HPLC é um sistema Gilson que consiste no seguinte: Manuseador de Líquidos Modelo 215, Bomba Modelo 322-H2 e um Detetor UV Modelo 155. A deteção é tipicamente a 210 nm e 280 nm. O sistema de FPLC Âkta Purifier (Amersham Biosciences) consiste no seguinte: Bomba Modelo P-900, detetor UV Modelo UV-900, detetor de pH e condutividade Modelo pH/C-900, Coletor de Frações Modelo Frac-950. A deteção UV é tipicamente a 214 nm, 254 nm e 276 nm. HPLC Ácida:

Coluna: Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4 Caudal: 8 mL/min

Tampão A: 0,1 % de TFA em acetonitrilo

Tampão B: 0,1 % TFA em água.

Gradiente: 0,0 - 5,0 min: 10% A

5.00 - 30,0 min: 10% A a 90% A

30.0 - 35,0 min: 90% A

35.0 - 40,0 min: 100% A HPLC Neutra:

Coluna: Phenomenex, Júpiter, C4 5ym 250 x 10,00 mm, 300 A Caudal: 6 mL/min

Tampão A: TRIS 5 mM, (NH4)2S04 7,5 mM, pH = 7,3, 20%

de CH3CN

Tampão B: 60% de CH3CN, 40% de água

Gradiente: 0-5 min:10% B

5-35 min: 10- 60% B

35 - 39 min: 60% B

39 - 40 min: 70% B

40 - 43,5 min: 70% B

Cromatografia de troca aniónica:

Coluna: RessourceQ, 1 mL Caudal: 6 mL/min

Tampão A: 0,0 9% NH4HC03 0,25% NH40Ac, 42,5% etanol pH 8,4 Tampão B: 0,09% NH4HC03, 2,5% NH40Ac, 42,5% etanol pH 8,4 Gradiente: 100% A a 100% B durante 30 volumes de coluna

Dessalinização:

Coluna: HiPrep 26/10

Caudal: 10 mL/min, 6 volumes de coluna Tampão: NH4HC03 10 mM

Procedimento geral para a síntese em fase sólida de reagentes de acilação da fórmula geral (II): (II) : Acy-AAln-AA2m-AA3p-Act. em que Acy, AAl, AA2, AA3, n, m, e p são como definidos acima e Act é o grupo de saida de um éster ativo, tal como U-hidroxissuccinimida (OSu) , ou 1-hidroxibenzotriazole, e em que os ácidos carboxilicos nas unidades Acy e AA2 da unidade acilo estão protegidos como ésteres terc-butílicos.

Os compostos da fórmula geral (II) de acordo com a invenção podem ser sintetizados em suporte sólido utilizando procedimentos bem conhecidos dos especialistas na técnica de síntese de péptidos em fase sólida. Este procedimento compreende a fixação de um aminoácido protegido com Fmoc a uma resina de cloreto de 2-clorotritilo de poliestireno. Por exemplo, a fixação pode ser realizada utilizando o aminoácido N-protegido livre na presença de uma amina terciária, como trietilamina ou N,N-diisopropiletilamina (ver referências abaixo). A extremidade C-terminal (que é ligada à resina) deste aminoácido está na extremidade da sequência sintética a ser acoplada às insulinas parentais da invenção. Após fixação do Fmoc-aminoácido à resina, o grupo Fmoc é desprotegido utilizando, por exemplo, aminas secundárias, como piperidina ou dietilamina, seguido de acoplamento de outro (ou o mesmo) aminoácido protegido com Fmoc e desproteção. A sequência sintética é terminada pelo acoplamento de diácidos gordos (α, ω) protegidos com mono-terc-butilo, como os ésteres mono-terc-butilicos de ácido hexadecanodioico, heptadecanodioico, octadecanodioico ou eicosanodioico. A dissociação dos compostos da resina é realizada utilizando ácido diluído como 0,5-5% de TFA/DCM (ácido trifluoroacético em diclorometano) , ácido acético (por exemplo, 10% em DCM, ou AcOH/triflouroetanol/DCM 1:1:8), ou hecafluoroisopropanol em DCM (ver, por exemplo, "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Dõr-wald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 ou "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, e referências citadas nos mesmos). Isto assegura que os ésteres terc-butílicos presentes nos compostos como grupos de proteção de ácido carboxílico não sejam desprotegidos. Finalmente, o grupo carboxilo C-terminal (libertado da resina) é ativado, por exemplo, como o éster de IV-hidroxissuccinimida (OSu) e utilizado diretamente ou após purificação como reagente de acoplamento na fixação às insulinas parentais da invenção. Este procedimento é ilustrado no exemplo 9.

Alternativamente, os reagentes de acilação da fórmula geral (II) acima podem ser preparados por síntese em fase de solução como se descreve abaixo.

Os diácidos gordos protegidos como mono-terc-butilos, tais como ésteres mono-terc-butílicos do ácido hexadecanodioico, heptadecanodioico, octadecanodioico ou eicosanodioico são ativados, por exemplo, como ésteres de OSu como se descreve abaixo ou como qualquer outro éster ativado conhecido dos especialistas na técnica, tais como ésteres de HOBt- ou HOAt. Este éster ativo é acoplado com um dos aminoácidos AAl, AA2 protegido com mono-terc-butilo, ou AA3 num solvente adequado tal como THF, DMF, NMP (ou uma mistura de solventes) na presença de uma base adequada, tal como DIPEA ou trietilamina. 0 intermediário é isolado, por exemplo, por procedimentos extrativos ou por procedimentos cromatográficos. 0 intermediário resultante é novamente submetido a ativação (como descrito acima) e a acoplamento com um dos aminoácidos AAl, AA2 protegido com mono-terc-butilo, ou AA3 como descrito acima. Este procedimento é repetido até que se obtenha o intermediário Acy-AAln-AA2m-AA3P-0H protegido desejado. Este é, por sua vez, ativado para proporcionar os reagentes de acilação da fórmula geral (II) Acy-AAln-AA2m-AA3p-Act. Este procedimento é ilustrado no exemplo 21.

Os reagentes de acilação preparados por qualquer um dos métodos anteriores podem ser desprotegidos (terc-butilo) após ativação como ésteres de OSu. Isto pode ser feito por tratamento com TFA do reagente de acilação protegido com terc-butilo ativado com OSu. Após acilação de qualquer insulina estabilizada contra proteases, obtém-se a insulina estabilizada contra proteases acilada desprotegida resultante da invenção. Isto é ilustrado, por exemplo, no exemplo 16 abaixo.

Se os reagentes preparados por qualquer um dos métodos acima não estão desprotegidos (terc-butilo) após ativação como ésteres de OSu, a acilação de qualquer insulina estabilizada contra proteases proporciona a insulina estabilizada contra proteases acilada protegida com terc-butilo correspondente da invenção. A fim de se obter a insulina estabilizada contra proteases acilada desprotegida da invenção, a insulina protegida é desprotegida. Isto pode ser feito por tratamento com TFA para proporcionar a insulina estabilizada contra proteases acilada desprotegida da invenção. Isto é ilustrado, por exemplo, nos exemplos 1 e 2 abaixo.

Se é desejada a acilação de um resíduo de lisina (na posição épsilon) de uma insulina, a acilação é realizada a pH alcalino (por exemplo, a pH 10, 10,5 ou 11). Isto é, por exemplo, ilustrado nos exemplos 1 e 2 abaixo.

Se é desejada a acilação da posição N-terminal (Al) da cadeia A de uma insulina, a acilação é realizada a pH neutro (por exemplo, a pH 7, 7,5, 8 ou 8,5) . Isto é, por exemplo, ilustrado nos exemplos 38 e 44 abaixo.

Procedimento Geral (A) para a preparação de insulinas estabilizadas contra proteases aciladas desta invenção O procedimento geral (A) é ilustrado no primeiro exemplo.

Exemplo 1, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (íf-Hexadecanodioilo), desB30

A insulina humana A14E, B25H, desB30 (500 mg) foi dissolvida em Na2C03 aquoso 100 mM (5 mL) e o pH ajustado a 10,5 com NaOH 1 N. O éster N-hidroxissuccinimídico e éster terc-butílico do ácido hexadecanodioico foi dissolvido em acetonitrilo (10% P/V) e adicionado à solução de insulina e aquecido ligeiramente sob água corrente quente, para evitar precipitação e deixado à temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura foi liofilizada. O sólido foi dissolvido em ácido trifluoroacético a 95% gelado (que continha 5% de água) e mantido sobre gelo durante 30 minutos. A mistura foi concentrada in vacuo e novamente evaporada de diclorometano. O resíduo foi dissolvido em água, e o pH foi ajustado a neutro (6-7) e a mistura foi liofilizada. A insulina resultante foi purificada com várias corridas por cromatografia de troca iónica sobre uma coluna Source 15Q 21 mL, eluindo com um gradiente de acetato de amónio 15 a 300 mM em Tris 15 mM, 50% v/v de etanol, pH 7,5 (ácido acético). A dessalinização final das frações puras foi realizada numa coluna RPC de 3 mL eluindo isocraticamente com 0,1% v/v de TFA, 50% v/v de etanol. A insulina pura resultante foi liofilizada. LC-MS (eletropulverização): m/z = 1483,2 (M+4)/4.

Calculada: 1483,5

Exemplo 2, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (NEOctadecanodioil-YGlu), desB30

A insulina humana A14E, B25H, desB30 (2 g) foi dissolvida em Na2C03 aquoso 100 mM (10 mL) , e foi adicionado DMSO (4 mL) . O pH foi ajustado a 10,5 com NaOH 1 N.

Octadecanodioil-L-Glu(OSu)-OtBu de terc-butilo (preparado como descrito em WO 2005/012347). Foi adicionado mais Na2C03 aquoso 100 mM (20 mL) , seguido de THF (20 mL) . Após 1,5 h foram adicionadas algumas gotas de metilamina e a mistura foi subsequentemente acidificada com ácido acético. A mistura foi purificada por HPLC preparativa e liofilizada para proporcionar a insulina em epígrafe como éster di-terc-butílico. Este foi dissolvido em diclorometano e ácido trifluoroacético 1:1 (50 mL). A mistura foi deixada durante 2 horas e concentrada in vacuo. Após adição de um pouco de água e acetonitrilo, a mistura foi purificada por HPLC preparativa. As frações puras foram liofilizadas. Isto proporcionou 313 mg da insulina em epígrafe. MALDI-TOF MS: m/z = 6089 (M+l). Calculada: 6089.

Exemplo 3, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K (íf-Eicosanodioil-YGlu), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de ácido eicosanodioico via éster mono-terc-butílico do ácido eicosanodioico e icosanodioil-L-Glu(OSu)-OtBu de terc-butilo. MALDI-TOF MS: m/z = 6120 (M+l). Calculada: 6117.

Exemplo 4, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (N^-Carboxi-S- octadecanodioilaminobenzoílo), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de éster mono- (2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 5-(17-terc-butoxicarbonil-hepta- decanoilamino)isoftálico (preparado como descrito em WO 2006/082204). LC-MS: 1531 (M+4), Mm 6124 (desconvolucionado). Calculada: 1531 (M+4), 6122.

Exemplo 5, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(í^-N-octadecanodioil-N-(2-carboxietil)glicilo), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de octadecanodioil-N-(2-(terc- butoxicarbonil)etil)-Gly-OSu de terc-butilo (preparado como descrito em WO 2005/012347). LC-MS (eletropulverização): m/z: 1522,52 (M+4). Calculada.: 1523.

Exemplo 6, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(N* (N-Octadecanodioil-N- carboximetil)-beta-alanilo), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de octadecanodioil-N-(terc- butoxicarbonilmetil)-pAla-OSu de terc-butilo (preparado como descrito em WO 2005/012347). MALDI-TOF MS: m/z = 6088 (M+l). Calculada: 6089.

Exemplo 7, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (NM-([4-({19-

Carboxinonadecanoilamino}metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de éster éster 1-terc-butilico 5-(2,5-di-oxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-({4-[ (19-terc- butoxicarbonil-nonadecanoilamino)metil]ciclo-hexanocarbonil}amino)pentanodioico LC-MS (eletropulverização): m/z: 6260. Calculada.: 6255.

Preparação de éster éster 1-terc-butilico 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-({4-[ (19-terc- butοχicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo-hexanocarbonil}amino)-pentanodioico: 1. Ativação com OSu do ácido terc-butil-eicosanodioico [0303] Ácido terc-butil-eicosanodioico (5,0 g) foi dissolvido em THF (50 mL) e DMF (30 mL) . Foram adicionados TSTU (4,53 g) e DIPEA (2,65 mL) . A mistura foi agitada durante 3 dias e, em seguida, concentrada in vacuo. O resíduo sólido foi recristalizado de acetonitrilo para dar éster terc-butílico éster N-hidroxi-succinimídico do ácido icosanodioico como um branco composto cristalino (5,52 g, 89%) . LC-MS (eletropulverização): m/z: 440 [M-56 (= terc-Bu)] 2. Acoplamento de ácido tranexâmico A uma solução de éster terc-butílico éster N- hidroxissuccinimídico do ácido icosanodioico (5,52 g) em THF (100 mL) foi adicionado ácido tranexâmico (1,75 g). Foi obtido um precipitado. As tentativas para se obter uma solução adicionando DMF (75 mL) , água (25 mL) e DMSO (50 mL) e algumas gotas de DIPEA não foram bem-sucedidas. A suspensão foi agitada de um dia para o outro. A mistura foi concentrada in vacuo. Ao resíduo sólido foi adicionado THF e o precipitado foi filtrado. O filtrado foi concentrado e o resíduo sólido foi recristalizado em acetonitrilo para dar ácido 4-[ (19-terc-butoxicarbonilnonadecanoil- amino)metil]ciclo-hexanocarboxílico como um composto cristalino branco (5,56 g, 93%) LC-MS (eletropulverização): m/z: 538 (M+l). 3. Ativação com OSu de ácido 4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo-hexanocarboxílico A uma solução de ácido 4-[(19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo-hexanocarboxílico (5,56 g) em THF (100 mL) foi adicionada uma solução de TSTU (3,42 g) em acetonitrilo (25 mL) . A mistura foi concentrada in vacuo depois de agitar de um dia para o outro. O resíduo sólido foi recristalizado de acetonitrilo para dar éster 2,5-di-oxopirrolidin-l-ílico do ácido 4-[ (19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)- metil]ciclo-hexanocarboxílico (5,76 g, 88%). LC-MS (eletropulverização): m/z: 635 (M+l). 4. Acoplamento de H-Glu-OtBu e ativação com OSu. A uma solução de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ílico do ácido 4- [ (19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo-hexanocarboxí lico em THF (150 mL) foi adicionada uma solução de H-Glu-OtBu (1,84 g) em água (25 mL) e algumas gotas de DIPEA. A mistura foi agitada de um dia para o outro e em seguida concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em THF quente (60 °C) e filtrado. Ao filtrado frio foi adicionado THF até 150 mL e foi adicionado TSTU (2,98 g) dissolvido em acetonitrilo (25 mL). A mistura foi concentrada depois de agitar durante 20 min. O resíduo foi recristalizado de acetonitrilo para dar um sólido branco, éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-({4-[ (19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)-metil]ciclo-hexanocarbonil}amino)pentanodioico (6,8 g, 92%) . LC-MS (eletropulverização): m/z: 820 (M+l).

Exemplo 8, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(ífHeptadecanodioil-YGlu), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de heptadecanodioico ácido via éster mono-terc-butilico do ácido heptadecanodioico e heptadecanodioil-L-Glu(OSu)-OtBu de terc-butilo (preparado como descrito em WO 2006/082204). LC-MS (eletropulverização) : m/z: 1519 (M+4). Calculada.: 1519.

Exemplo 9, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(NsOctadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30

0 efeito oral deste composto em ratazanas Wistar macho em jejum de um dia para o outro é dado na Figura 2a e Figura 2b abaixo.

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de éster terc-butílico do ácido 17—((S)—1— terc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-l-iloxicarbonilmetoxi)etoxi]etilcarbamoil}metoxi)etoxi]etil-carbamoilIpropilcarbamoil)heptadecanoico (nome alternativo: octa-decanodioil-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBU) de terc-butilo LC-MS (eletropulverização) : m/z: 1596 (M+4) . Calculada.: 1596. A unidade estrutural para a preparação desta insulina foi preparada como se descreve a seguir:

Resina de partida: Resina de 2-clorotritilo, 1,60 mmol/g 1,0 g de resina foi expandido durante 30 min em DCM (10 mL). 1. Acilação com ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico:

Foi dissolvido 0,39 g (0,63 eq, 1,0 mmol) de ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (Fmoc-OEG-OH) em DCM (15 mL) e foi adicionado à resina. Foi adicionada N,N- diisopropiletilamina (DIEA) (0,44 mL, 2,5 mmol) gota a gota. A mistura reacional foi agitada em vórtice durante 30 min. e, em seguida, foi adicionado metanol (2 mL) e a mistura foi agitada em vórtice durante mais 15 min. A resina foi filtrada e lavada com NMP (2x8 mL) e DCM (8x8 mL).

Foi adicionada 20% de piperidina/NMP (8 mL), deixada em repouso 10 min., repetida mais uma vez. Filtrada e lavada com NMP (2x8 mL) , DCM (3x8 mL) e NMP (5x8 mL) . Um teste de TNBS positivo deu resinas de cor vermelha. 2. Acilação com ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico:

Foi dissolvido 0,78 g (2 eq, 2,0 mmol) de ácido Fmoc-8-amino-3, 6-dioxaoctanoico em NMP/DCM 1:1 (10 mL) . Foi adicionado 0,28 g (2,2eq, 2,4 mmol) de HOSu, seguido de adição de 0,37 mL (2,2 eq, 2,4 mmol) de DIC. A mistura reacional foi deixada em repouso durante 1 hora e foi em seguida adicionada à resina e finalmente foi adicionado 0,407 mL (2,2 eq) de DIEA. A mistura foi agitada em vórtice durante 16 horas, filtrada e lavada com NMP (2x8 mL) , DCM (3x8 mL) e NMP (5x8 mL) . Um teste de TNBS positivo deu resinas incolores.

Foi adicionada 20% de piperidina/NMP (10 mL) , deixada em repouso 10 min., repetida uma vez. Filtrada e lavada com NMP (2x8 mL), DCM (3x8 mL) e NMP (5x8 mL). Um teste de TNBS positivo deu resinas de cor vermelha.

Acilação com Fmoc-Glu-OtBu:

Foi dissolvido 0,86 g (2 eq, 2,0 mmol) de Fmoc-Glu-OtBu em NMP/DCM 1:1 (10 mL) . Foi adicionado 0,32 g (2,2 eq, 2,4 mmol) de HOBT, seguido de adição de 0,37 mL (2,2 eq, 2,4 mmol) de DIC. A mistura reacional foi deixada em repouso durante 20 min e foi em seguida transferida para a resina e finalmente foi adicionado 0,407 mL (2,2 eq) de DIEA. A mistura foi agitada em vórtice durante 16 horas, filtrada e lavada com NMP (2x8 mL) , DCM (3x8 mL) e NMP (5x8 mL) . Um teste de TNBS positivo deu resinas incolores.

Acilação com éster mono-terc-butilico do ácido octadecanodioico:

Foi dissolvido 0,75 g (2 eq, 2,0 mmol) de éster mono-terc-butilico do ácido octadecanodioico em NMP/DCM 1:1 (10 mL).

Foi adicionado 0,32 g (2,2eq, 2,4 mmol) de HOBT, seguido de adição de 0,37 mL (2,2 eq, 2,4 mmol) de DIC. A mistura reacional foi deixada em repouso durante 20 min e foi em seguida transferida para a resina e finalmente foi adicionado 0,41 mL (2,2 eq) de DIEA. A mistura foi agitada em vórtice durante 16 horas, filtrada e lavada com NMP (2x8 mL), DCM (3x8 mL) e NMP (5x8 mL).

Dissociação com TFA:

Foram adicionados 8 mL de 5% de TFA/DCM à resina e a mistura reacional foi agitada em vórtice durante 2 horas, filtrada e o filtrado foi recolhido. Foi adicionado mais 5% de TFA/DCM (8 mL) à resina, e a mistura foi agitada em vórtice durante 10 min, filtrada e a resina foi lavada com DCM (2x10 mL) . Os filtrados e lavagens combinados foram ajustados a pH básico utilizando cerca de 800 uL de DIEA. A mistura foi evaporada in vacuo proporcionando um óleo (3,5 g). Foi adicionado éter dietilico (30 mL) e o óleo que não se dissolveu foi separado por decantação e evaporado in vacuo. Isto proporcionou 1,1 g de éster terc-butílico do ácido 17 —{ (S)-l-terc-butoxi-carbonil-3-[2-(2-{ [2 — (2 — carboximetoxietoxi)etilcarbamoil]metoxijetoxi)etilcarbamoil ]propil-carbamoil}heptadecanoico (nome alternativo: octadecanodioil-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU de terc-butilo) como um óleo. LC-MS (SciexlOO API): m/z = 846,6 (M+l)+.

Ativação com OSu: 0 octadecanodioil-Glu(OEG-OEG-OH)-OtBU de terc-butilo anterior (0,63 g) foi dissolvido em THF (35 mL) . Foi adicionada DIEA (0,255 mL, 2 eq.), seguida de TSTU (0,45 g, 2 eq.) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi partilhada entre acetato de etilo (250 mL) e NaHS04 aquoso (3 x 100 mL) . A fase orgânica foi seca (MgS04) e concentrada in vacuo para proporcionar 0, 65 g de éster terc-butílico do ácido 17-( (S)-l-terc-butoxicarbonil-3-{2—[2—({2—[2—(2,5 — dioxopirrolidin-l-iloxicarbonilmetoxi)-etoxi]etilcarbamoil) metoxi)etoxiletilcarbamoil)propilcarbamoil)-heptadecanoico (nome alternativo: octadecanodioil-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBu de terc-butilo) como um óleo. LC-MS: m/z = 943,4 (M+l).

Exemplo 10, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, B25H, B29K(Í^Miristilo), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de l-tetradecanoil-pirrolidina-2,5-diona. MALDI-TOF MS: m/z = 5873,6. Calculada: 5872,9.

Exemplo 11, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu- yGlu), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de éster 5-terc-butilico éster l-(2,5-di-oxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-[4-terc- butoxicarbonil-4-(19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)butirilamino]pentanodioico. MALDI-TOF MS: m/z = 6242,5. Calculada: 6245,2.

Preparação de éster 5-terc-butílico éster 1-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-[4-terc- butoxicarbonil-4-(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)-butiril-amino]pentanodioico. 1. Éster 1-terc-butílico do ácido (S)-2-[4-terc- butoxicarbonil-4-(19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)butirilamino]-pentanodioico A uma solução de éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-(19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)pentanodioico (preparado de forma semelhante à descrita em WO 2005/012347) (4, 1 g) em THF (100 mL) foi adicionada uma solução de H-Glu-OtBu (1,47 g) em água (20 mL). O pH foi ajustado a 8 com DIPEA. A mistura foi concentrada depois de agitar durante 1,5 h. O resíduo foi recristalizado de DCM para dar o composto em epígrafe como um sólido branco (2,81 g, 61%). LC-MS: m/z = 769 (M+l). Éster 5-terc-butílico éster 1-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-[4-terc-butoxicarbonil-4-(19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)butirilamino]pentanodioico A uma solução de éster 1-terc-butílico do ácido (S)—2— [4 — terc-butoxicarbonil-4-(19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)butiril-amino]pentanodioico (2,81 g) em acetonitrilo (80 mL) foi adicionada uma solução de TSTU (1,32 g) em acetonitrilo (20 mL). O pH foi ajustado a 8 com DIPEA. Depois de agitar durante 1,5 h a mistura foi concentrada. 0 resíduo foi recristalizado de acetonitrilo para dar o composto em epígrafe (1,7 g, 54%). LC-MS: m/z = 866,4 (M+l).

Exemplo 12, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (Νε4-([4-({19-

Carboxinonadecanoilamino}metil)trans-ciclo-hexano-carbonil]-yGlu-YGlu), desB30

Esta insulina foi preparada de forma semelhante à descrita acima partindo de éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-[4-terc-butoxicarbonil-4 - ({4 - [ (19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)-metil]-ciclo-hexanocarbonil}amino)butirilamino]-pentanodioico LC-MS (eletropulverização): m/z: 6386 (M+l). Calculada.: 6384.

Preparação de éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-[4-terc-butoxicarbonil-4-({4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]-ciclo-hexanocarbonil}amino)butirilamino]pentanodioico. 1. Éster 1-terc-butílico do ácido 2-[ 4-terc-butoxicarbonil-4 - ({4 - [ (19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]-ciclo-hexanocarbonil}amino)butirilamino]pentanodioico A uma solução de éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-({4-[ (19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo-hexanocarbonil } -amino) pentanodioico (5,0 g) em THF (100 mL) foi adicionada uma solução de H-Glu-OtBu (1,36 g) em água (25 mL) . Depois de agitar de um dia para o outro a mistura foi concentrada in vacuo. O resíduo foi precipitado de água e filtrado e seco in vacuo para dar o composto em epígrafe (4,63 g, 84%) . LC-MS: m/z = 740 (M-3x56, loss of 3xt-Bu). Éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-[ 4-terc-butoxicarbonil-4-({4-[ (19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo-hexanocarbonil }amino)butirilamino]pentanodioico A uma solução de éster 1-terc-butílico do ácido 2-[4-terc-butoxicarbonil-4-({4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]-ciclo-hexanocarbonil } amino) butirilamino ] pentanodioico (4,6 g) em THF (150 mL) foi adicionada TSTU (1,68 g). Foi adicionada DIPEA (0,97 mL). Depois de agitar de um dia para o outro a mistura foi concentrada in vacuo. O resíduo foi cristalizado de acetonitrilo para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido (4,4 g, 87%) LC-MS: m/z = 837 (M-3x56, perda de 3xt-Bu).

Exemplo 13, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (NeOctadecanodioil-YGlu- yGlu), desB30

0 efeito oral deste composto em ratazanas Wistar macho em jejum de um dia para o outro é dado na Figura 7 abaixo. LC-MS: m/z = 1555 (M+4)/4.

Exemplo 14, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28D, B29K (ífoctadecanodioil-YGlu), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6118

Exemplo 15, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífoctadecanodioil-YGlu- PEG7), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6510

Exemplo 16, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífeicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

0 efeito oral deste composto em ratazanas Wistar macho em jejum de um dia para o outro é dado na Figura 3 abaixo. MALDI-TOF MS: m/z = 6407 O reagente de acilação intermediário para este exemplo foi preparado como se descreve a seguir:

Passo 1: Éster terc-butílico do ácido 19—{(S)—1-terc-butoxicarbonil-3-[2-(2 — { [2-(2-carboximetoxi-etoxi)-etilcarbamoil]-metoxi}-etoxi)-etilcarbamoil]-propilcarbamoil}-nonadecanoico

A uma solução de éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido 2-(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)pentanodioico (2,50 g, (preparado de forma semelhante à descrita em WO 2005/012347) e ácido [2- (2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilamino)etoxi)etoxi]acético (1,47 g, nome alternativo: dímero de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, IRIS Biotech GmbH, N.° Cat. PEG1221) em etanol (40 mL) foi adicionada DIPEA (1,26 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e em seguida concentrada in vacuo. Ao resíduo foi adicionado HC1 0,1 N aquoso (150 mL) e acetato de etilo (200 mL). As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas (sulfato de magnésio) e concentradas in vacuo para dar um óleo, que cristalizou em repouso. Rendimento 96% (3,1 g) . LC-MS (eletropulverização) : m/z = 874,49.

Passo 2: Éster terc-butílico do ácido 19-( (S)-1-terc-butoxicarbonil-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-l-iloxicarbonilmetoxi)- etoxi]etilcarbamoil}metoxi)etoxi]etilcarbamoil}propilcarbam oil)nonadecanoico:

A uma solução de éster terc-butílico do ácido 19 — { (S)—1 — terc-butoxicarbonil-3-[2-(2 — { [2- (2-carboximetoxietoxi)etilcarbamoil]-

metoxijetoxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil}nonadecanoico (3,1 g) em acetonitrilo (50 mL) foi adicionada TSTU (1,39 g) e DIPEA (0,91 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e em seguida concentrada in vacuo. Ao resíduo foi adicionado HC1 0,1 N aquoso (100 mL) e acetato de etilo (200 mL) . As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (50 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram

lavadas com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas (sulfato de magnésio) e concentradas in vacuo para dar um óleo. Rendimento 99% (3,4 g) . LC-MS (eletropulverização): m/z: 971,8.

Passo 3: Ácido 19-( (S)-l-carboxi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5- dioxopirrolidin-l-iloxicarbonilmetoxi) etoxi]etil-carbamoil}metoxi)etoxi]etilcarbamoil}propilcarbamoil)-nonadecanoico:

Éster terc-butílico do ácido 19-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3 —{2 — [2 - ({2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-l- iloxicarbonilmetoxi)etoxi]etil-carbamoil}metoxi)etoxi]-etilcarbamoilIpropilcarbamoil)nonadecanoico (3,4 g) foi agitado em TFA (75 mL) durante 45 min e, em seguida, concentrado in vacuo. 0 resíduo foi concentrado 3 vezes com tolueno para dar um sólido. 0 resíduo foi cristalizado em 2-propanol e filtrado para dar um composto cristalino branco. Rendimento 80% (2,4 g) . LC-MS (eletropulverização) : m/z: 859,44. O reagente de acilação semelhante com o fragmento de ácido octadecanodioico (por exemplo, utilizado no exemplo 26 e outros exemplos) pode ser preparado de forma semelhante.

Exemplo 17, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífeicosanodioil-YGlu-(3- (2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}etoxi)-propionil-YGlu), desB30

ES-MS: m/z 1626(M+4)

Exemplo 18, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6348

Exemplo 19, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (Í^Hexadecanodioil-YGlu), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6062

Exemplo 20, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífheptadecanodioil-^Glu- OEG-OEG), desB30

ES-MS: m/z 1592(M+4)

Exemplo 21, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, 829K (ífoctadecanodioil-^Glu- ^Glu-^Glu-^Glu), desB30

ES-MS: m/z 1620(M+4) O reagente de acilação intermediário octadecanodioil-YGlu-YG1u-yG1u-yG1u-OSu (com ésteres terc-butílicos como grupos de proteção nos ácidos carboxilicos remanescentes) foi preparado como se descreve a seguir: Éster terc-butilico éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilico do ácido octadecanodioico

Éster mono-terc-butilico do ácido octadecanodioico (4,2 g, 0,011 mol) foi dissolvido em THF (20 mL) , foi adicionado TSTU (4 g, 0,013 mol) em acetonitrilo (20 mL) e o pH da solução foi ajustado a 8 com adição gota a gota de DIPEA. A mistura foi agitada à TA durante 4 h, em seguida acidificada com HC1 (2M) até pH 3 e evaporada in vacuo. 0 óleo residual foi subsequentemente partilhado entre acetato de etilo e HC1 (0,1 M) . A camada orgânica foi seca (MgS04) , filtrada e evaporada até a secura in vacuo. Isto proporcionou 5,2 g de éster terc-butílico éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ílico do ácido octadecanodioico como um óleo, o qual podia ser utilizado no passo seguinte sem mais purificação. LC-MS (eletropulverização): m/z = 468 (M+l) e 412 (M+l-tBu) . Éster_1-terc-butilico_do_ácido_(S) -2- (17-terc- butoxicarbonil-heptadecanoilamino)-pentanodioico.

Éster terc-butílico éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ílico do ácido octadecanodioico (7 g, 0,015 mol) foi dissolvido em THF (80 mL) e adicionado a uma solução de H-Glu-01Bu (3,7 g, 0,0165 mol) em Na2C03 (0,1 M, 40 mL). A mistura foi agitada à TA de um dia para o outro, em seguida acidificada com HC1 (2M) até pH 3 e evaporada in vacuo. O resíduo foi partilhado entre acetato de etilo e HC1 (0,1 M) . A camada orgânica foi seca (MgS04) , filtrada e evaporada até à secura in vacuo. A adição de acetonitrilo (30 mL) provocou a formação de um precipitado branco, que foi isolado por filtração e seco para proporcionar 3,75 g de éster 1-terc-butílico do ácido (S)-2-(17-terc-butoxarbonil-

heptadecanoilamino)pentanodioico. LC-MS (eletropulverização): m/z =556(M+l).

Ao evaporar o filtrado de acetonitrilo foi isolado mais 2,6 g de produto. Éster 1-terc-butilico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ilico) do_ácido_(S) -2- (17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)pentanodioico

Éster 1-terc-butilico do ácido (S)-2-(17-terc-butoxarbonil-heptadecanoilamino)pentanodioico (3 g, 0,005 mol) foi dissolvido em THF (100 mL) e adicionado a uma solução de TSTU (1,78 g, 0,006 mol) em acetonitrilo (30 mL). O pH foi ajustado a 8 por adição gota a gota de DIPEA. A mistura foi agitada à TA durante 1 h, em seguida acidificada com HC1 (2M) até pH 3 e evaporada in vacuo. O óleo residual foi subsequentemente partilhado entre acetato de etilo e HC1 (0,1 M) . A camada orgânica foi seca (MgS04) filtrada e evaporada in vacuo até à secura. Isto proporcionou um sólido branco (2,75 g) de éster 1-terc-butilico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino)-pentanodioico. LCMS (eletropulverização): m/z = 653 (M+l). Éster 1-terc-butilico do ácido (S) -2-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-fcerc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino)butirilamino]-pentanodioico

Éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxo-pirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)pentanodioico (0,5 g, 0,766 mmol) foi dissolvido em acetonitrilo (20 mL) Esta solução foi adicionada a uma solução de H-Glu-OtBu (0,171 g, 0,84 mmol) em água (30 mL) , o pH foi ajustado a 10 com DIPEA. A mistura foi agitada à TA durante 15 min, em seguida acidificada até pH 7 com HC1 (2M) e evaporada in vacuo. O resíduo foi partilhado entre acetato de etilo e HC1 (0,1 M) . A camada orgânica foi seca (MgS04) , filtrada e evaporada in vacuo até à secura. Isto proporcionou éster 1-terc-butílico do ácido (S)-2-[ (S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino) butirilamino] pentanodioico como um óleo. LC-MS (eletropulverização): m/z = 741 (M+l). Éster 5-terc-butílico éster 1-(2,5-dioxopirrolidin-l-ilico) do_ácido_(S) -2- [ (S) - 4-terc-butoxicarbonil-4 - {11 -terc- butoxicarbonil-heptadecanoilamino)butirilamino]-pentanodioico

Éster 1-terc-butílico do ácido (S)-2-[ (S)-4-terc-Butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino) butirilamino] -pentanodioico (8 g, 10,79 mmol) foi dissolvido em acetonitrilo (40 mL) e foi adicionada uma solução de TSTU (3,89 g, 12,95 mmol) em acetonitrilo (40 mL). O pH foi ajustado a 8 por adição gota a gota de DIPEA. A mistura foi agitada à TA durante 1 h, em seguida acidificada com HC1 (2M) até pH 3 e evaporada in vacuo. Isto proporcionou um óleo, que foi subsequentemente partilhado entre acetato de etilo e HC1 (0,1 M) . A camada orgânica foi seca (MgS04) filtrada e evaporada até à secura in vacuo. Isto proporcionou 8,2 g de éster 5-terc-butilico éster 1-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)—2 — [ (S) — 4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino) -butirilamino] pentanodioico como um sólido. Éster 1-terc-butilico do ácido (S)-2-{(S)-4-terc-butoxicarbonil-4- [(S)-4-tery-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)butirilamino]butirilamino}pentanodioico

Éster 5-terc-butílico éster 1-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-[(S)-4-terc-Butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino)butirilamino]-pentanodioico (4 g, 4,77 mmol) foi dissolvido em acetonitrilo (30 mL) e adicionado a uma solução de H-Glu-OtBu (1,07 g, 5,25 mmol) em Na2C03 (0,1 M, 20 mL) . A mistura foi agitada à TA durante 1 h, em seguida neutralizada com HC1 (2M) até pH 7 e evaporada in vacuo. O óleo residual foi subsequentemente partilhado entre acetato de etilo e HC1 (0,1 M) . A camada orgânica foi seca (MgS04) , filtrada e evaporada até à secura in vacuo. O resíduo (4 g) foi dissolvido em acetonitrilo e tratado com carvão ativo. Após filtração e evaporação até à secura, seguida de secagem de um dia para o outro in vacuo, foi obtido 2,8 g de éster 1-terc-butílico do ácido (S) -2-{ (S)-terc-Butoxicarbonil-4-[ (S) -4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarboni1-heptadecanoilamino)butirilaminolbutiril-aminoIpentanodioico como um sólido cristalino. LC-MS (eletropulverização): m/z = 927 (M+l). Éster 1-terc-butilico do ácido (S)-2-((S)-4-terc- butoxicarbonil-4-{(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)butirilamino]butirilamino}butirilamino)-pentanodioico

Éster 1-terc-butílico do ácido (S)-2-{ (S)-4-terc-

Butoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoil- amino)butirilamino]butirilamino}pentanodioico (2,8 g, 3,02 mmol) foi ativado com TSTU (1,0 g, 3,325 mmol) utilizando o mesmo método como descrito acima, dando éster 1-terc-butílico éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ílico) do ácido (S)-2-{(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino)-butirilamino]butirilamino}-pentanodioico em bruto. LC-MS (eletropulverização): m/z = 1024 (M+l).

Foi dissolvido 1,3 g deste composto em acetonitrilo (40 mL) e adicionado a uma solução de H-Glu-0'Bu (0,28 g, 1,39 mmol) em água (30 mL), o pH foi ajustado a 9,3 com DIPEA. A mistura foi agitada à TA durante 2 h, em seguida neutralizada até pH 7 com HC1 (2M) e em seguida evaporada in vacuo até quase à secura. 0 resíduo foi tratado com água dando um precipitado branco, que foi filtrado. Após secagem in vacuo de um dia para o outro, foi isolado 1,1 g de éster 1-terc-butílico do ácido (S)-2-((S)-4-terc-butoxicarbonil-4-{(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarboni1-heptadecanoilamino)butirilamino-butirilamino}butiril-amino)pentanodioico, contendo quantidades mais pequenas de material de partida. LC-MS (eletropulverização): m/z = 1111,9 (M+l). Éster 1-terc-butilico-éster 5-(2,5-dioxopirrolidin-l-ilico) do ácido (S)-2-((Sl-4-terc-butoxicarbonil-4-{(S)-4-terc-butoxicarbonil-4- [(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-fcerc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)butirilamino]butirilamino}butirilamino)-pentanodioico

Éster 1-terc-butílico do ácido (S)-2-((S)-4-terc-butoxicarbonil-4- { (S)-4-terc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)butirilamino]butirilamino}butirilamino)-pentanodioico (0,1 g, 0,09 mmol) foi ativado com TSTU (29,8 mg, 0,099 mmol) em solução de acetonitrilo à TA durante 1 h utilizando o mesmo método de ativação e processamento como descrito acima. Isto proporcionou 100 mg de produto ativado em bruto que podia ser utilizado tal qual para acilação da insulina sem mais purificação. LC-MS (eletropulverização): m/z = 1208 (M+l).

Exemplo 22, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífEicosanodioil-YGlu-YGlu-yGlu), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6373

Exemplo 23, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B27E, B29K(Í^Octadecanodioil- ^Glu-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6407

Exemplo 24, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NeOctadecanodioil-^Glu-OEG-OEG), desB30

O efeito oral deste composto em ratazanas Wistar macho em jejum de um dia para o outro é dado na Figura 6 abaixo. MALDI-TOF MS: m/z = 6188

Exemplo 25, Procedimento geral (A) ;

Insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (^Octadecanodioyt- ^Glu-OEG-OEG), desB30

0 efeito oral deste composto em ratazanas Wistar macho em jejum de um dia para o outro é dado na Figura 4 abaixo. MALDI-TOF MS: m/z = 6352

Exemplo 26, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B16E, B25H, B29K (Í^Octadecanodioil- ^Glu-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6345

Exemplo 27, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, B16H, B25H, B29K (ífHexadecanodioil- yGlu), desB30

0 efeito oral deste composto em ratazanas Wistar macho em jejum de um dia para o outro é dado na Figura 5 abaixo. MALDI-TOF MS: mlz = 6041

Exemplo 28, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (Í^Eicosanodioil-^Glu-OEG-^Glu), desB30

ES-MS: m/z = 1598 (M+4)

Exemplo 29, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B16E, B25H, B29K (ífHexadecanodioil- ^Glu), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6028

Exemplo 30, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (íTOctadecanodioil- ^Glu-^Glu-^Glu), desB30

ES-MS: m/z = 1581 (M+4)

Exemplo 31, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (ífHexadecanodioil-^Glu), desB30

ES-MS: m/z = 1484 (M+4)

Exemplo 32, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (Í^Octadecanodioil- ^Glu-^Glu), desB30

ES-MS: m/z = 1548 (M+4)

Exemplo 33, Procedimento geral (A): A14E, B16H, B25H, B29K(N(eps)Eicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), insulina humana desB30 [0386]

ES-MS: m/z = 1596 (M+4)

Exemplo 34, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífOctadecanodioil-OEG- ^Glu-^Glu), desB30

ES-MS: m/z = 1592 (M+4)

Exemplo 35, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, AI 8 L, B25H, B29K (Í^Eicosanodioil-^Glu-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6405

Exemplo 36, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A18 L, B25H, B29K (Í^Octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6377

Exemplo 37, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B27E, B29K (Í^Eicosanodioil- ^Glu-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6433

Exemplo 38, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (N“Octadecanodioil-^Glu-OEG-OEG), A14E, B25H, B29R, desB30

Insulina A14E, B25H, B29R, desB30 (500 mg, 88 ymol) foi dissolvida em NaHC03 0,1 M, pH 8 (5 mL). ω-carboxi- heptadecanoil-Y-L-glutamil-OEG-OEG-OSu (65 mg, 88 ymol) foi dissolvido em THF/MeCN 1:1 (5 mL) e adicionado à solução de insulina. Após 30 minutos, a reação foi desativada por adição de metilamina aquosa 2 M (0,5 mL) . O solvente foi evaporado in vacuo e o sólido foi redissolvido na quantidade mínima de água/MeCN. O pico do produto principal foi isolado através da utilização de RP-HPLC sobre uma coluna C18, tampão A: 0,1 % de TFA em água, tampão B: 0,1 % de TFA em MeCN, gradiente 30-55 % de tampão B ao longo de 45 min. As frações de produto foram parcialmente evaporadas in vacuo e secas por congelação para proporcionar 59 mg de produto (10 %). Análise por LC-MS: M4+= 1602,7, calculada 1602,6. Dois passos de análise de sequência de aminoácidos padrão mostraram F-V, confirmando a acilação em Al.

Exemplo 39, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B1F (N“Octadecanodioil-^Glu-OEG-OEG) , B25H, B29R, desB30

Este composto foi isolado como um produto secundário a partir do exemplo acima (exemplo 38). Análise por LCMS: M4+ = 1602,5, calculada 1602,6. Dois passos de análise de sequência de aminoácidos padrão mostraram G-I, confirmando a acilação em Bl.

Exemplo 40, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A1G (N“Hexadecanodioil-^Glu), A14E, B25H, B29R, desB30

ES-MS: m/z = 1523 (M+4)

Este composto foi preparado de forma semelhante à acilação de Al descrita acima (exemplo 38), utilizando ω)-carboxipentadecanoil-Y-L-glutamil (OSu) como reagente de acilação. 0 produto exibiu LCMS: M4+= 1523,2, calculada 1523,0. Dois passos de análise de sequência de aminoácidos padrão mostraram F-V, confirmando a acilação em Al.

Exemplo 41, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(NeOctadecanodioil-^Glu-

Abu-Abu-Abu-Abu), desB30

ES-MS: m/z = 1286 (M+5) O reagente de acilação para este exemplo foi preparado por analogia com o reagente preparado no exemplo 9, começando com a fixação de ácido 4-aminobutírico protegido com Fmoc à resina de 2-clorotritilo, seguida de desproteção e fixação sequencial de mais 3 unidades de ácido 4-aminobutírico protegido com Fmoc, e como descrito no exemplo 9, Fmoc-Glu-OtBu e éster mono-terc-butílico do ácido octadecanodioico.

Exemplo 42, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (N“Eicosanodioilo), desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 5987

Exemplo 43, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (N“4-(16-(lH-Tetrazol-5- il)hexadecanoilsulfamoil]butanoilo), desB30

ES-MS: m/z = 1530 (M+4)

Preparação do reagente de acilação intermediário:

Ácido 4-[16-(lH-tetrazol-5- il)hexadecanoilsulfamoil]butanoico (500 mg, preparado como descrito em WO 2006/005667) foi dissolvido em etanol (20 mL), e foram adicionados TSTU (381 mg) e DIPEA (542 yL) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi concentrada in vacuo, e o resíduo foi agitado com HC1 0,25M. O sólido foi isolado por filtração, lavado com água e seco in vacuo para proporcionar 580 mg (91%) do reagente de acilação.

Reação de acilação:

Insulina humana A14E, B25H, desB30 (500 mg) foi dissolvida em carbonato de sódio aquoso 0,1 M (10 mL) e etanol (4 mL). O pH foi ajustado a 10,8 com NaOH 1 N. O reagente de acilação anterior (101 mg) dissolvido em THF (2 mL) e etanol (2 mL) foi adicionado em duas porções com 10 minutos intervalo. A mistura resultante foi agitada lentamente durante 1 hora e diluída com água (50 mL) . A insulina

resultante foi precipitada por adição de HC1 1 N até pH 5,5. O precipitado foi isolado por centrifugação e purificado por HPLC. As frações puras foram agrupadas e liofilizadas.

Exemplo 44, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A1G (N“Octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), A14E, A21G, B25H, desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6321

Exemplo 45, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K (Í^Eicosanodioil-OEG), desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6130

Exemplo 46, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B27K (ífOctadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB28, desB29, desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6181

Exemplo 47, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K(Ne(5-

Eicosanodioilaminoisoftálico ácido)), desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6150

Exemplo 48, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(Í^Octadecanodioilo) , desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 5959

Exemplo 49, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B29K (Í^Octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

ES-MS: m/z = 1598 (M+4)

Exemplo 50, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (ífEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6216

Exemplo 51, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu- OEG), desB30

^OH ES-MS: m/z = 1559 (M+4)

Exemplo 52, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K(Í^Eicosanodioil-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6278

Exemplo 53, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(ífEicosanodioil-Aoc) , desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6126

Exemplo 54, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NeEicosanodioil-YGlu-YGlu), desB30

ES-MS: m/z = 6055 (desconvolucionado)

Exemplo 55, Procedimento geral (A) :

Insulina humana Ά14Ε, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NeEicosanodioil-YGlu-YGlu), desB30

ES-MS: m/z = 6220 (desconvolucionado)

Exemplo 56, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífOctadecanodioil-OEG), desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6101

Exemplo 57, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K(Í^Octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

MALDI-TOF-MS: m/z = 6277

Exemplo 58, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B16H, B29K(ífOctadecanodioil- yGlu), desB30

ES-MS: m/z = 1516 (M+4)

Exemplo 59, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G(N“Octadecanodioilo) , A14E, B25H, B29R, desB30

ES-MS: m/z = 1498 (M+4)

Exemplo 60, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (ífEicosanodioil- yGlu), desB30

ES-MS: m/z = 1523 (M+4)

Exemplo 61, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B27K (Í^Eicosanodioil-YGlu), desB28, desB29, desB30

MALDI-TOF MS: m/z = 6208

Exemplo 62, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ífOctadecanodioil-YGlu- YGlu-yGlu), desB30

ES-MS: m/z = 1587 (M+4)

As insulinas aciladas da invenção nos exemplos que se seguem podem ser preparadas de forma semelhante:

Exemplo 63, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 64, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NeEicosanodioil-YGlu) , desB30

Exemplo 65, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NEOctadecanodioilo) , desB30

Exemplo 66, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NeEicosanodioílo) , desB30

Exemplo 67, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (Í^Docosanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 68, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K(ífDocosanodioilYGlu-YGlu) , desB30

Exemplo 69, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K (íflcosanodioil-YGlu-OEG- OEG-yGlu), desB30

Exemplo 70, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu- 0EG-0EG-yG1u), desB30

Exemplo 71, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(Ne(N-Icosanodioil-.N- carboximetil)-|JAla) , desB30

Exemplo 72, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ΛΤ-3-[2-(2-(2-[2-(17-

Carboxi-heptadecanoilamino)etoxi]etoxi)etoxi)-etoxi]propionil-yGlu), desB30

Exemplo 73, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (ΛΤ-3-[2-(2-(2-[2-(19-

Carboxinonadecanoilamino)etoxi]etoxi)etoxi)-etoxi]propionil-yGlu), desB30

Exemplo 74, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K(Í^Octadecanodioil-YGlu-(3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}etoxi)-propionilo), desB30

Exemplo 75, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B25H, B29K(ífOctadecanodioilryGlu-(3-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}etoxi)-propionil-yGlu), desB30

Exemplo 76, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(ífIcosanodioil-YGlu-(3-(2-(2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi)etoxi)-propionilo), desB30

Exemplo 77, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (íf4-([4-( {17-

Carboxinonadecanoilamino}metil)trans-ciclo-hexano-carbonil]-yGlu), desB30

Exemplo 78, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(Ne4-([4-({17-Carboxi- heptadecanoilamino}metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu-yGlu), desB30

Exemplo 79, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28D, B29K (ífhexadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 80, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B28D, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 81, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, B28D, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30

Exemplo 82, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28D, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu-OEG- OEG), desB30

Exemplo 83, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 84, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28E, B29K (ífOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 85, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28E, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 86, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28E, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30

Exemplo 87, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28E, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu-OEG- OEG), desB30

Exemplo 88, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B28E, B29K (Í^Hexadecanodioil-yGlu), desB30

Exemplo 89, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Í^Octadecanodioil-yGlu), desB30

Exemplo 90, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B28E, B29K (ífEicosanodioil-yGlu), desB30

Exemplo 91, Procedimento geral (A) :

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B28E, B29K (Í^Hexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 92, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Í^Octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 93, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K(Í^Eicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 94, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 95, Procedimento geral (A) :

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 96, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K(NeEicosanodioil-YGlu) , desB30

Exemplo 97, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 98, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 99, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (ífEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 100, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 101, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 102, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K(NeEicosanodioil-YGlu) , desB30

Exemplo 103, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 104, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 105, Procedimento geral (A) :

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (ífEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 106, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Í^Hexadecandiail-YGlu), desB30

Exemplo 107, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 108, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K(NeEicosanodioil-YGlu) , desB30

Exemplo 109, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 110, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K(ΛΤ-

Octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 111, Procedimento geral (A):

Insulina humana Ά14Ε, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (ífEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 112, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28D, B29K(NeHexadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30

Exemplo 113, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B28E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30

Exemplo 114, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25N, B27E, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu-OEG- OEG), desB30

Exemplo 115, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25N, B27E, B29K(NeOctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 116, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25N, B27E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 117, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25N, B27E, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu) , desB30

Exemplo 118, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25N, B27E, B29K (Í^Octadecanodioil-YGlu) , desB30

Exemplo 119, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25N, B27E, B29K (ífHexadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 120, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Í^Eicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 121, Procedimento geral (A):

Insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Í^Octadecanodioil- YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 122, Procedimento geral (A):

Insulina humana N* B25N, B27E, B29K(ífHexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 123, Procedimento geral (A):

Insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Í^Eicosanodioil- yGlu), desB30

Exemplo 124, Procedimento geral (A):

Insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (í^Octadecanodioil- yGlu, desB30

Exemplo 125, Procedimento geral (A) :

Insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Í^Hexadecanodioil- yGlu), desB30

Exemplo 126, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(Ne(N-Icosanodioil-.N- carboximetil)-pAla-OEG-OEG), desB30

Exemplo 127, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(N* (N-Octadecanodioil-N- carboximetil)-|JAla-OEG-OEG), desB30

Exemplo 128, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K(N* (N-Hexadecanodioil-N- carboximetil)-pAla-OEG-OEG), desB30

Exemplo 129, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B29K (i\/eoctadecanodioil-YGlu-2- [ (3-{2-[2- (3- aminopropoxi)etoxi]etoxi}propilcarbamoil)metoxi]acetilo), desB30

0 ácido [(3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propil-carbamoil)metoxi]acético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e feito reagir com ω- (terc-butil-carboxi-heptadecanoil-Y-L-glutamil(OSu) -OtBu. O produto pode ser ativado utilizando TSTU e acoplado com

insulina humana A14E, B25H, desB30 em Na2C03 0, 1 Ma pH 10.5 para proporcionar o produto.

Exemplo 130, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B2 9K (Aheicosanodioil-YGlu^- [(3-{2-(2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propil-carbamoil)metoxi]acetilo), desB30

O ácido [(3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propil-carbamoil)metoxi]acético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e feito reagir com ω-

(terc-butil-carboxi-nonadecanoil-Y-L-glutamil(OSu)-OtBu. O produto pode ser ativado utilizando TSTU e acoplado com insulina humana A14E, B25H, desB30 em Na2C03 0, 1 M a pH 10.5 para proporcionar o produto.

Exemplo 131, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (AhOctadecanodioil-YG1u-2-[(3—{2—[2—(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propil-carbamoil)metoxilacetilo), desB30

0 ácido [(3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propil-carbamoil)metoxi]acético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e feito reagir com ω- (terc-butil-carboxi-heptadecanoil-Y-L-glutamil(OSu) -OtBu. O produto pode ser ativado utilizando TSTU e acoplado com insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30 em Na2C03 0,1 M a pH 10,5 para proporcionar o produto.

Exemplo 132, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (AbEicosanodioil- yGlu-2-[ (3-{2-[2- (3- aminopropoxi)etoxi]etoxi}propilcarbamoil)metoxilacetilo), desB30

O ácido [(3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propil-carbamoil)metoxi]acético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e feito reagir com ω- (terc-butil-carboxi-nonadecanoil-Y-L-glutamil(OSu)-OtBu. O produto pode ser ativado utilizando TSTU e acoplado com insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30 en Na2C03 0,1 M a pH 10,5 para proporcionar o produto.

Exemplo 133, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (AhOctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 134, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (AfEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 135, Procedimento geral (A) :

Insulina humana B25H, B29K (AfOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 136, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (AfEicosanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 137, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (ihOctadecanodioílo), desB30

Exemplo 138, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (AfEicosanodioílo), desB30

Exemplo 139, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (ihOctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 140, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (AhEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 141, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (AfOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 142, Procedimento geral (A):

Insulina humana B25H, B29K (AfEicosanodioil-yGlu), desB30

Exemplo 143, Procedimento geral (A):

Insulina humana A21G, B25H, B29K (AfOctadecanodioílo), desB30

Exemplo 144, Procedimento geral (A):

Insulina humana A21G, B25H, B29K (AfEicosanodioílo) , desB30

Exemplo 145, Procedimento geral (A):

Insulina humana A21G, B25H, B2 9K (l/Octadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30

Exemplo 146, Procedimento geral (A):

Insulina humana A21G, B25H, B2 9K (i\hEicosanodioil-YGlu-OEG- OEG), desB30

Exemplo 147, Procedimento geral (A):

Insulina humana A21G, B25H, B29K (l/EOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 148, Procedimento geral (A):

Insulina humana A21G, B25H, B29K (AhEicosanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 149, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (AfOctadecanodioílo), desB30

Exemplo 150, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (AfEicosanodioílo), desB30

Exemplo 151, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (ihOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 152, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (AfEicosanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 153, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (ihEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 154, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B29K (AfOctadecanodioílo), desB30

Exemplo 155, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B29K (Aficosanodioílo) , desB30

Exemplo 156, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B2 9K (i\hOctadecanodioil-YGlu) , desB30

Exemplo 157, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (AfEicosanodioil- YGlu), desB30

Exemplo 158, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B2 9K (i\hOctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30

Exemplo 159, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B2 9K (AhEicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 160, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (ihOctadecanodioil- YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 161, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (Ahicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30

Exemplo 162, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (l/Eicosanodioil- YGlu), desB30

Exemplo 163, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (AfEicosanodioílo), desB30

Exemplo 164, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (i\fOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 165, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (AfOctadecanodioílo), desB30

Exemplo 166, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (AhOctadecanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 167, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (AhOctadecanodioílo), desB30

Exemplo 168, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (AhEicosanodioil-YGlu), desB30

Exemplo 169, Procedimento geral (A):

Insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (AfEicosanodioílo), desB30

Exemplo 170, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (AfOctadecanodioil-YGlu) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30

Exemplo 171, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (i^Eicosanodioil-YGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30

Exemplo 172, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (IVhDctadecanodioil-YGlu) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30

Exemplo 173, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (i^Eicosanodioil-YGlu) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30

Exemplo 174, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (IVhDctadecanodioílo) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30

Exemplo 175, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (AfEicosanodioílo) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30

Exemplo 176, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (lAOctadecanodioílo), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30

Exemplo 177, Procedimento geral (A):

Insulina humana A1G (lAEicosanodioílo), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30

Exemplo 178, Afinidade para o recetor de insulina de derivados de insulina selecionados da invenção: A afinidade dos análogos de insulina acilados desta invenção para o recetor de insulina humano é determinada por um ensaio de captura de anticorpo em placa de microtitulação, ensaio SPA (Ensaio de Proximidade de Cintilação). Esférulas de ligação de anticorpo SPA-PVT e reagente anti-rato (Amersham Biosciences, N.° Cat. PRNQ0017) são misturados com 25 mL de tampão de ligação (HEPES 100 mM pH 7,8; cloreto de sódio 100 mM, MgS04 10 mM, 0,025% de Tween-20) . A mistura reagente para um único Packard Optiplate (Packard N.° 6005190) é constituída por 2,4 pL de um recetor de insulina humana recombinante purificado diluído a 1:5000 (com ou sem exão 11), uma quantidade de uma solução-mãe de Al4Tyr [125I]-insulina humana correspondente a 5000 cpm por 100 pL de mistura reagente, 12 pL de uma diluição a 1:1000 de anticorpo F12, 3 mL de esférulas SPA e tampão de ligação até um total de 12 mL. Em seguida, é adicionada um total de 100 pL de mistura reagente a cada poço no Packard Optiplate e é feita uma série de diluições do derivado de insulina no Optiplate a partir de amostras apropriadas. As amostras são em seguida incubadas durante 16 horas enquanto se agitam suavemente. As fases são em seguida separadas por centrifugação durante 1 min e as placas contadas num

Topcounter. Os dados de ligação foram ajustados utilizando o algoritmo de regressão não linear no GraphPad Prism 2.01 (Software GraphPad, San Diego, CA) e as afinidades são expressas relativamente (em percentagem (%)) à afinidade da insulina humana. É também utilizado um ensaio relacionado em que a ligação tampão também contém 4,5% de HSA para imitar as condições fisiológicas

Afinidade para o recetor de insulina de insulinas selecionadas da invenção:

Exemplo 179, Hidrofobicidade dos derivados de insulina da invenção: A hidrofobicidade de um derivado de insulina é determinada por HPLC de fase inversa realizada sob condições isocráticas. 0 tempo de eluição do derivado de insulina é comparado com o da insulina humana (aqui designada Hl) ou outro derivado com uma hidrofobicidade conhecida nas mesmas condições. A hidrofobicidade, k'rel, é calculada como: k ' relderiv = ( (tderiv-to) / (tref-to) ) *k'relref. Utilizando Hl como referência: k'relref = k'relHi = 1. 0 tempo morto do sistema de HPLC é determinado injetando 5 pL de NaN03 0, 1 mM. Condições de ensaio:

Coluna: Lichrosorb RP-C18, 5pm, 4 x 250 mm

Tampão A: fosfato de sódio 0,1 M pH 7,3, 10% vol de CH3CN

Tampão B: 50% vol de CH3CN

Volume de injeção: 5 pL

Tempo de corrida: máximo 60 minutos

Depois de correr um gradiente inicial é escolhido o nivel isocrático para correr o derivado e a referência (por exemplo, Hl), e os tempos de eluição do derivado e da referência sob condições isocráticas são utilizados na equação acima para calcular k'relderiv·

Exemplo 180, Administração pulmonar de derivados de insulina a ratazanas:

Protocolo: A substância de ensaio será administrada por via pulmonar pelo método de instilação de gota. Em resumo, ratazanas Wistar macho (aproximadamente 250 g) são anestesiadas com aproximadamente 60 mL de fentanil/desidrodenzperidol/ dormicum administrados como uma dose inicial sc a 6,6 mL/kg e seguida de 3 doses de manutenção de 3,3 mL/kg sc com um intervalo de 30 min. Dez minutos após a indução de anestesia são obtidas amostras basais da veia da cauda (t = -20 min) seguidas de uma amostra basal imediatamente antes da administração da substância de ensaio (t=0) . Ao t=0, a substância de ensaio é administrada por via intratraqueal num pulmão. Uma cânula especial com extremidade arredondada é montada numa seringa que contém 200 uL de ar e substância de ensaio (1 mL/kg). Através do orifício, a cânula é introduzida na traqueia e é encaminhada para um dos brônquios principais - imediatamente depois da bifurcatura. Durante a inserção, o pescoço é palpado a partir do exterior para assegurar o posicionamento intratraqueal. O conteúdo da seringa é injetado, seguido de uma pausa de 2 segundos. Depois disso, a cânula é lentamente retirada. As ratazanas são mantidas anestesiadas durante o teste (amostras de sangue durante até 4 ou 8 h) e são sacrificadas após a experiência.

As Figuras 8 e 9 mostram os efeitos de diminuição de glicose no sangue e as concentrações de insulina no plasma, respetivamente, da instilação de gota intratraqueal de uma insulina da invenção (exemplo 9) , em comparação com uma insulina semelhante, mas não resistente a proteases da técnica anterior (exemplo 183).

Exemplo 181, Administração pulmonar de derivados de insulina a miniporcos:

Protocolo:

Os porcos foram munidos de cateteres venosos centrais para injeções intravenosas e amostragem de sangue. Os porcos são mantidos em jejum antes da experiência pulmonar, isto é, no dia anterior à administração, os restos da comida da tarde são retirados aproximadamente uma hora após a alimentação e no dia de administração, os porcos não são alimentados. A permeabilidade dos cateteres é verificada antes da experiência com soro fisiológico adicionado com 10 IU/mL de heparina.

Após administração pulmonar, uma solução de glicose deve estar pronta para injeção i.v. para prevenir hipoglicemia, isto é, 4-5 seringas (20 mL) são enchidas com glicose a 20% estéril, prontas para utilização. O diagnóstico de hipoglicemia baseia-se em sintomas clínicos e medições da glicose no sangue num glicosímetro (Glucocard X-meter). O tratamento consiste na injeção i.v. lenta de 50-100 mL de glicose a 20% (10-20 g glicose). A glicose é administrada em frações ao longo de 5-10 minutos até ao efeito.

Os porcos são mantidos em jejum durante a primeira parte da experiência (até às 24 h) , mas com livre acesso a água. Após a amostra de sangue de 16 h, os cateteres são fechados com 5000 IU/mL de heparina, colocados nas bolsas e os porcos são libertados. Após a amostra de sangue de 24 h, os porcos são alimentados com ração dupla de alimento e maçãs. Os porcos não são mantidos em jejum desde as 24 h até às 48 h.

Composto e administração pulmonar Pó para administração pulmonar

Os pós de insulina são pesados para 8 câmaras de pó separadas do dispositivo de pó seco (PennCentury™ Modelo DP-4, dispositivo porcino feito à medida) no dia anterior à experiência. Todas as câmaras são mantidas protegidas da luz e humidade mantendo-as num material dessecante num recipiente revestido com folha de alumínio num laboratório com temperatura e humidade controlados até à administração.

Com base no peso mais recente do animal individual, o dispositivo de administração foi pré-carregado com 25 nmol/kg uma vez que era esperada alguma retenção de pó.

Dose de carga = (Peso de pó + (peso do dispositivo e pó -peso do dispositivo))/2

Anestesia 0 porco é sedado através de uma injeção i.v. de Domitor® Vet (medetomideina 1 mg/mL), 0,15 mL/10 kg = 0,4 mL/porco.

Imediatamente após, é injetado lentamente i.v. Rapinovet Vet. inj . (propofol 10 mg/mL) até que se obtenha uma profundidade de anestesia suficiente. Em geral, são suficientes 2-3 mL/10 kg, mas pode ser necessário suplementar com 1-2 mL numa certa altura até que seja possível a intubação. É injetada Atropina (1 mg/mL) i.m. a 0,5 mL/porco e deixada atuar no mínimo 5 minutos antes da intubação.

Para a intubação o porco é colocado em posição ventral com a frente ligeiramente elevada, são pulverizados anestésicos locais Xilocaine® kutanspray (lidocaína 10 mg/dose) na epiglote, e os porcos são intubados utilizando um laringoscópio e um tubo descartável com 8,0 mm (ID) de tamanho. As duas partes do tubo são pressionadas firmemente j untas.

Posição do dispositivo durante administração pulmonar A posição do dispositivo PennCentury™ durante a

administração deve ser imediatamente exterior à extremidade do tubo endotraqueal e isto deve ser medido no dispositivo antes da intubação (não esquecer a peça conectora em L quando se faz esta medição). Durante a administração a ponta do dispositivo PennCentury™ deve ser posicionada na traqueia imediatamente abaixo do brônquio que vai para o lobus cranialis dexter, o que é confirmado com o broncoscópio.

Respiração artificial A frequência de respiração é fixada a 10/min e a profundidade de respiração a 250 mL/respiração. 0 respirador é montado com um saco para "bebés" para otimizar a sincronização de administração. 0 aparelho de anestesia é conectado a um filtro que está ligado ao tubo endotraqueal por meio de uma peça em L. 0 dispositivo PennCentury™ é introduzido através da peça em L, a qual permitirá controlar a profundidade e frequência de respiração durante a administração. Técnica de administração 0 dispositivo PennCentury™ deve ser colocado como se descreve acima. Os porcos são administrados (um de cada vez) com o dispositivo PennCentury™ por administração manual durante inalação utilizando a bomba de ar PennCentury ajustável (Modelo AP-1). A cada porco são dadas 8 pulverizações de ar (bomba de ar ajustada para 4 mL) durante 8 inalações consecutivas forçadas pelo respirador para assegurar que é dada a dose completa. São dadas pancadas leves na câmara entre pulverizações para evitar que o pó se prenda ao dispositivo. É utilizado um novo tubo de administração para cada porco. A sincronização em relação à inalação é muito importante, e as pulverizações de ar devem ser feitas no imediatamente no inicio da inalação (tendo como objetivo começar na inalação de 50 mL).

Para neutralizar o efeito do Domitor, será injetado Antisedan® Vet inj . (atipamezol 5 mg/mL) como uma injeção intramuscular (0,4 mL/porco) imediatamente após administração e os porcos serão levados de novo para os seus currais e deixados acordar da anestesia.

Análise de retenção A dose emitida deve ser o conteúdo total da câmara e após administração o dispositivo é novamente pesado com qualquer pó residual, e o pó retido é extraído com 9 mL de tampão de extração com HC1 0,01 N médico em 0,05 % (p/v) Tween 80 e enviado para análise.

Colheita de sangue

Após a administração, serão colhidas amostras de sangue a partir de um cateter venoso central aos seguintes pontos no tempo: -10, 0, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 240 (4 h) , 300 (5 h), 360 (6 h), 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 24 h, 32 h e 48 h.

As amostras são colhidas com uma válvula de paragem de 3 vias; o sangue em excesso é injetado de novo no animal. O tamanho de amostra é: 0,8 mL de sangue colhido num tubo revestido com EDTA. Após cada amostra de sangue o cateter é enxaguado com 5 mL de NaCl a 0,9 % estéril com 10 IU/mL de heparina. O tubo é inclinado ligeiramente um mínimo de 8 vezes para assegurar mistura suficiente do sangue e anticoagulante (EDTA) e após um minuto é colocado sobre gelo húmido. Os tubos são centrifugados durante 10 min a 3000 rpm e 4 °C dentro de 1 hora após colheita. As amostras são armazenadas sobre gelo húmido até pipetagem.

Fecho dos cateteres após a experiência

Um único tratamento intravenoso com Ampicilina (10 mg/kg = 0,1 mL/kg de uma solução a 100 mg/mL) dissolvida em soro fisiológico estéril (1 g de Ampicilina em 10 mL = 100 mg/mL) é dado através do cateter que foi utilizado para colheita de sangue. Ambos os cateteres são enxaguados com 4-5 mL de NaCl a 0,9 % estéril adicionado com heparina a uma concentração de 10 IU/mL. Os cateteres são fechados com uma nova válvula (luer-lock) com membrana de injeção em látex. São injetados 4-5 mL de NaCl a 0,9% estéril através da membrana. Finalmente, são injetados 0,8 mL de heparina, 5000 IU/mL, através do cateter como um tampão. É requerida técnica assética para evitar crescimento bacteriano no cateter com risco aumentado de coagulação.

Análise de amostras de sangue São pipetados 10 pL de plasma para 500 pL de solução tampão EBIO para medição da concentração de glicose no plasma no autoanalisador Biosen.

Amostras de plasma são também analisadas para insulina exógena através de imunoensaios para calcular os parâmetros PK.

Administração pulmonar da insulina do exemplo 9 a miniporcos de acordo com o protocolo anterior:

As Figuras 10 e 11 mostram o perfil farmacocinético da insulina do exemplo 9 em comparação com a mesma insulina mas sem as mutações A14E e B25H de estabilização contra proteases (insulina da técnica anterior). Os dados são da mesma experiência, a Figura 10 é mostrada com os dados dos primeiros 250 minutos, e a Figura 11 é mostrada com o curso de tempo de 24 horas (1440 minutos).

Os dados farmacocinéticos para a insulina do exemplo 9 em comparação com a mesma insulina mas sem as mutações A14E e B25H de estabilização contra proteases (insulina da técnica anterior). Os dados são da mesma experiência, semivida (1½) e biodisponibilidade (Fit) relativamente à administração intravenosa:

Exemplo 182, Degradação de análogos de insulina utilizando enzimas de lúmen de duodeno: A degradação de análogos de insulina utilizando enzimas de lúmen de duodeno (preparadas por filtração do conteúdo de lúmen de duodeno) de ratazanas SPD. O ensaio é realizado por um robô numa placa de 96 poços (2 mL) com 16 poços disponíveis para análogos de insulina e padrões. Os análogos de insulina ~15 μΜ são incubados com enzimas de duodeno em Hepes 100 mM, pH=7,4 a 37 °C, são recolhidas amostras após 1, 15, 30, 60, 120 e 240 min e a reação desativada por adição de TFA. Os análogos de insulina intactos em cada ponto são determinados por RP-HPLC. O meio tempo de degradação é determinado por ajuste exponencial dos dados e normalizado para o meio tempo determinado para as insulinas de referência, insulina humana A14E, B25H, desB30 ou insulina humana em cada ensaio. A quantidade de enzimas adicionada para a degradação é de tal forma que o meio tempo para a degradação da insulina de referência é entre 60 min e 180 min. O resultado é dado como o meio tempo de degradação para o análogo de insulina no duodeno de ratazana dividido pelo meio tempo de degradação da insulina de referência da mesma experiência (velocidade de degradação relativa).

Farmacocinética em ratazana: PK intravenosa em ratazanas:

Ratazanas anestesiadas são administradas por via intravenosa (i.v.) com análogos de insulina a várias doses e as concentrações plasmáticas dos compostos utilizados são medidas utilizando imunoensaios ou espetrometria de massa em intervalos especificado durante 4 horas ou mais após a dose. Os parâmetros farmacocinéticos são subsequentemente calculados utilizando WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA). São utilizadas ratazanas Wistar macho sem jejum (Taconic) com aproximadamente 200 grama de peso. O peso corporal é medido e as ratazanas são subsequentemente anestesiadas com Hypnorm/Dormicum (cada composto é diluído separadamente a 1:1 em água estéril e em seguida misturados; preparado de fresco no dia da experiência) . A anestesia é iniciada por 2 mL/kg de uma mistura de Hypnorm/Doricum sc, seguida de duas doses de manutenção de 1 mL/kg sc em intervalos de 30 min e duas doses de manutenção de 1 mL/kg sc em intervalos de 45 min. Se for necessário para manter as ratazanas ligeiramente anestesiadas por todo o tempo são fornecidas dose(s) adicional(ais) de 1-2 mL/kg sc. A pesagem e a anestesia inicial são realizadas na sala de alojamento das ratazanas para evitar stressar os animais ao deslocá-los de uma sala para outra. PK perorai em ratazanas:

Sonda esofágica:

Ratazanas conscientes são administradas p.o. com análogos de insulina. As concentrações plasmáticas dos compostos utilizados bem como as alterações na glicose no sangue são medidas em intervalos especificados durante 4-6 horas após administração. Os parâmetros farmacocinéticos são subsequentemente calculados utilizando WinNonLin

Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA)

Ratazanas Sprague-Dawley macho (Taconic), com 250-300 g de peso são colocadas em jejum durante ~18 h e administradas p.o. com composto de ensaio ou veículo. A composição da formulação utilizada para administração por sonda oral é a seguinte (% em peso): 45% de Propileno glicol (Merck) 33% de Capmul MCM CIO (Abitec) 11% de Poloxâmero 407 (BASF) 11% de Polietileno glicol 3350 Ultra (Fluka) A quantidade de insulina adicionada é subtraída igualmente de Capmul MCM CIO, Poloxâmero 407 e PEG 3350 e não de propileno glicol para manter a quantidade de propileno glicol independente da carga de fármaco constante a 45%. A insulina neutra (seca por congelação a partir de pH 7,4) é dissolvida em propileno glicol à TA sob agitação ligeira. Dependendo da insulina e da quantidade de insulina pode demorar poucas horas para dissolver-se em propileno glicol. A solução resultante deve ser transparente. Os outros aditivos, Capmul, poloxâmero e PEG3350 são misturados e fundidos em conjunto a 58 °C e também devem resultar numa solução ligeiramente amarelada, transparente. Em seguida, a solução de insulina em propileno glicol é aquecida até 35 °C e os aditivos fundidos são adicionados em porções sob agitação magnética. A mistura resultante deve ser transparente e homogénea a 35 °C e origina um semissólido após conservação no frigorífico. Após preparação a composição de SEDDS é arrefecida até 5 °C para solidificar. Amostras de sangue para a determinação das concentrações de glicose em sangue inteiro são recolhidas em tubos capilares de 10 pL heparinizados por punção dos vasos capilares na ponta da cauda. As concentrações de glicose no sangue são medidas após diluição em 500 pL de tampão de análise pelo método de glicose-oxidase que utiliza um autoanalisador Biosen (EKF Diagnostic Gmbh, Alemanha). São feitos perfis de concentração média de glicose no sangue (média ± EPM) para cada composto. São recolhidas amostras para determinação da concentração de insulina no plasma. Amostras de 100 yL de sangue são colhidas para tubos contendo EDTA. As amostras são mantidas sobre gelo até serem centrifugadas (7000 rpm, 4 °C, 5 min), o plasma é pipetado para tubos Micronic e, em seguida, congelado a 20 °C até ensaio. As concentrações plasmáticas dos análogos de insulina são medidas no Departamento de Ensaio e Tecnologia utilizando um imunoensaio que é considerado apropriado ou validado para o análogo particular. São colhidas amostras de sangue a t=-10 (apenas para glicose no sangue), a t=-l (imediatamente antes da administração) e em intervalos especificado durante 4-6 horas após administração.

Injeção intraintestinal:

Ratazanas anestesiadas são administradas por via intraintestinal (no jejuno) com análogos de insulina. As concentrações plasmáticas dos compostos utilizados bem como as alterações na glicose no sangue são medidas em intervalos especificados durante 4 horas ou mais após administração. Os parâmetros farmacocinéticos são subsequentemente calculados utilizando WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA).

Ratazanas Sprague-Dawley macho (Taconic), com 250-300 g de peso, mantidas em jejum durante ~18 h são anestesiadas utilizando Hypnorm-Dormicum s.c. (0,079 mg/mL de citrato de fentanilo, 2,5 mg/mL de fluanisona e 1,25 mg/mL de midazolam) a 2 mL/kg como uma dose inicial (ao ponto no tempo -60 min antes da administração da substância de ensaio) , 1 mL/kg após 20 min, seguida de 1 mL/kg a cada 40 min.

As insulinas a serem testadas no modelo de injeção intraintestinal são formuladas como se formula para o modelo de sonda esofágica acima. A ratazana anestesiada é colocada num cobertor hemotérmico estabilizado a 37 °C. Um cateter de polietileno de 20 cm montado numa seringa de 1 mL é enchido com formulação de insulina ou veiculo. É feita uma incisão de linha média de 4-5 cm na parede abdominal. O cateter é inserido suavemente no jejuno médio ~50 cm do cego por penetração da parede intestinal. Se houver conteúdo intestinal, o sitio de aplicação é deslocado ± 10 cm. A ponta do cateter é colocada aproximadamente 2 cm dentro do lúmen do segmento intestinal e fixada sem a utilização de ligaduras. Os intestinos são cuidadosamente recolocados na cavidade abdominal e a parede abdominal e pele são fechadas com autogrampos em cada camada. No tempo 0, as ratazanas são administradas através do cateter com 0,4 mL/kg de composto de ensaio ou veiculo.

Amostras de sangue para a determinação das concentrações de glicose em sangue inteiro são colhidas para tubos capilares de 10 pL heparinizados por punção dos vasos capilares na ponta da cauda. As concentrações de glicose no sangue são medidas após diluição em 500 pL de tampão de análise pelo método de glicose-oxidase que utiliza um autoanalisador Biosen (EKF Diagnostic Gmbh, Alemanha) . São feitos os perfis de concentração média de glicose no sangue (média ± EPM) para cada composto. São colhidas amostras para determinação da concentração de insulina no plasma. Amostras de 100 pL de sangue são colhidas para tubos gelados contendo EDTA. As amostras são mantidas sobre gelo até serem centrifugadas (7000 rpm, 4 °C, 5 min), o plasma é pipetado para tubos Micronic e, em seguida, congelado a 20 °C até ensaio. As concentrações plasmáticas dos análogos de insulina são medidas num imunoensaio que é considerado apropriado ou validado para o análogo particular. São colhidas amostras de sangue a t=-10 (apenas para a glicose no sangue) , a t=-l (imediatamente antes da administração) e em intervalos especificados durante 4 horas ou mais após administração.

Farmacodinâmica em ratazanas:

Os perfis de glicose no sangue vs. tempo após administração oral (como se descreve acima) de insulinas aciladas selecionadas da invenção são mostradas a seguir:

Exemplo 183 0 efeito oral em ratazanas Wistar macho em jejum de um dia para o outro numa insulina da técnica anterior, isto é:

A insulina humana B2 9K (í/Octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30 é dada na Figura 1 abaixo.

Exemplo 184

Potência dos análogos de insulina acilados desta invenção relativamente à insulina humana

Ratazanas Sprague Dawley macho com 238-383 g de peso no dia da experiência são utilizadas para a experiência clamp. As ratazanas têm livre acesso a alimentos sob condições ambientais controladas e são mantidas em jejum de um dia para o outro (desde as 3 pm) antes da experiência clamp.

Protocolo Experimental:

As ratazanas são aclimatadas nas instalações para animais durante pelo menos 1 semana antes do procedimento cirúrgico. Aproximadamente 1 semana antes da experiência clamp, cateteres Tygon são inseridos sob anestesia com halotano na veia jugular (para infusão) e a artéria carótida (para colheita de sangue) e exteriorizados e fixados na parte posterior do pescoço. As ratazanas são administradas com Estreptocilina vet. (Boehringer Ingelheim; 0,15 mL/ratazana, i.m.) após cirrurgia e colocadas numa unidade de cuidados animais (25 °C) durante o período de recuperação. A fim de obter analgesia, é administrada Anorfina (0,06 mg/ratazana, s.c.) durante a anestesia e é administrado Rimadil (1,5 mg/kg, s.c.) após recuperação completa da anestesia (2-3 h) e novamente uma vez por dia durante 2 dias. Às 7 am no dia da experiência, ratazanas mantidas em jejum de um dia para o outro (desde as 3 pm do dia anterior) são pesadas e ligadas às seringas de amostragem e sistema de infusão (bombas Harvard 22 Basic, Harvard, e seringa de vidro hipodérmica Perfectum, Aldrich) e em seguida em gaiolas de clamp individuais onde descassam cerca de 45 min antes de se iniciar a experiência. As ratazanas podem mover-se livremente no seu leito habitual durante toda a experiência e têm livre acesso a água potável. Após um período basal de 30 min durante o qual os níveis plasmáticos de glicose foram medidos em intervalos de 10 min, o derivado de insulina a ser testado e a insulina humana (um nível de dose por ratazana, n = 6-7 por nível de dose) são infundidos (i.v.) a uma velocidade constante durante 300 min. Opcionalmente, é administrada uma infusão de bólus inicial do derivado de insulina a ser testado para se alcançar níveis de estado estacionário imediatos no plasma. A dose da infusão de bólus inicial pode ser calculada com base em dados de depuração obtidos a partir da farmacocinética de bólus i.v. por um especialista em farmacocinética. Os níveis plasmáticos de glicose são medidos em intervalos de 10 min ao longo da experiência e a infusão de glicose aquosa a 20% é ajustada em conformidade para manter euglicemia. As amostras de eritrócitos ressuspensos de cada ratazana são agrupadas e retornadas em aproximadamente is mL do volume através do cateter da carótida.

Em cada dia de experiência, amostras das soluções dos derivados de insulina individuais a serem testados e da solução de insulina humana são colhidas antes e no final das experiências clamp e as concentrações dos péptidos são confirmadas por HPLC. As concentrações plasmáticas de insulina e C-péptido de ratazana, bem como do derivado de insulina a ser testado e insulina humana são medidas em pontos no tempo relevantes antes e no final dos estudos. As ratazanas são mortas no final da experiência utilizando uma sobredose de pentobarbital.

LISTAS DE SEQUÊNCIAS

As SEQ ID N.° 5-11 são as sequências para as cadeias A presentes nos compostos desta invenção que se mostram nos exemplos específicos anteriores e as SEQ ID N.° 12-29 são as sequências para as cadeias B presentes nos compostos que se mostram nos exemplos específicos anteriores.

LISTAS DE SEQUÊNCIAS

<110> NOVO NORDISK A/S <120> Análogos de insulina acilados estabilizados contra proteases <130> 7777.504-WO < 16Ο> 29 <17Ο> Patentln versão 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Cadeia A de Insulina Modificada <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1) . . (1) <223> Xaa está ausente ou é Gly <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (2)..(2) <223> Xaa está ausente ou é Pro <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (3) . . (3) <223> Xaa está ausente ou é Pro <22 0> <221> MISC_PEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa é Thr ou His <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (15)..(15) <223> Xaa é Ser, Asp ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (16)..(16) <223» Xaa is Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser ou Glu <22 0> <221> MISC_FBATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (18)..(18) <223> Xaa é Gin, Asp ou Glu <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (21)..(21) <223> Xaa é Asn, Lys ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(24) <223> Xaa é Asn ou Gin <4 0 0> 1

Xaa Xaa Xaa Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Xaa Xaa 1 5 10 15

Xaa Xaa Leu Glu Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Cadeia B de Insulina Modificada <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1)..(1) <223> Xaa está ausente ou é Gly <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (2)..(2) <223> Xaa está ausente ou é Pro <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (3) . . (3) <223> Xaa está ausente ou é Pro <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (4)..(4) <223> Xaa está ausente ou é Phe ou Glu <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (5) . . (5) <223> Xaa está ausente ou é Vai <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (6)..(6) <223> Xaa está ausente, ou é Asn ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (7)..(7) <223> Xaa é Gin ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (13)..(13) <223> Xaa é His, Asp, Pro ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (19)..(19) <223> Xaa é Tyr, Asp, Gin, His, Arg ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (27)..(27) <223> Xaa é Phe ou His <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (28)..(28) <223> Xaa é Phe, Asn ou His <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (29) . . (29) <223> Xaa está ausente, ou é Tyr, His, Thr, Gly ou Asp <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (30)..(30) <223> Xaa is absent, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (31)..(31) <223> Xaa está ausente, ou é Pro, His, Gly ou Asp <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (32)..(32) <223> Xaa está ausente, ou é Lys, Arg ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (33)..(33) <223> Xaa está ausente ou é Thr <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (34)..(34) <223> Xaa está ausente ou é Leu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (35)..(35) <223> Xaa está ausente ou é Glu <400> 2 xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Vai Glu 15 10 15

Ala Leu xaa Leu vai Cys Gly Glu Arg Gly xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 20 2S 30

Xaa Xaa xaa 35 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Cadeia A de insulina modificada <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (8) . . (8) <223> Xaa é Thr ou His <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (12)..(12) <223> Xaa é Ser, Asp ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (13)..(13) <223» Xaa ia Leu, Thr, A9n, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (14)..(14) <223> Xaa é Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly. Arg, Pro, Ser ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (15)..(15) <223> Xaa é Gin, Asp ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (18)..(18) <223> Xaa é Asn, Lys ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (21)..(21) <223> Xaa é Asn ou Gin <400> 3

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 s 10 is

Glu Xaa Tyr Cys xaa 20 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Cadeia B de insulina modificada <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1)..(1) <223> Xaa é Phe ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (3) . . (3) <223> Xaa é Asn ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (4)..(4) <223> Xaa é Gin ou Glu <22 0> <221> MISC_FEATURB <222> (10)..(10) <223> Xaa é His, Asp, Pro ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (16)..(16) <223> Xaa é Tyr, Asp, Gin, His, Arg ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(24) <223> Xaa é Phe ou His <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (26) . . (26) <223> Xaa está ausente, ou é Tyr, His, Thr, Gly ou Asp <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (27)..(27) <223> Xaa está ausente, ou é Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (28)..(28) <223> Xaa está ausente, ou é Pro, His, Gly ou Asp <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (29) . . (29) <223> Xaa está ausente, ou é Lys, Arg ou Gin <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (30)..(30) <223> Xaa está ausente ou é Thr <400> 4

Xaa Vai Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Vai Glu Ala Leu Xaa 1 5 10 IS

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Xaa His Xaa Xaa xaa xaa Xaa 20 25 30

<210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia A <400> 5

Gly Ile Vai Glu Gin Cys cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn 20

<210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia A <400> 6

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Gly 20

<210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia A <400> 7

Gly Ile vai Glu Gin Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn 20

<210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia Α <4Ο0> 8

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cy9 Thr Ser ile Cys Ser Leu Glu Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn 20

<210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia A <400> 9

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gin Leu 15 10 15

Glu Leu Tyr Cys Asn 20

<210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia A <4 Ο 0> 10

Gly lie val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Glu Gin Leu 15 10 is

Glu Asn Tyr Cys Gly 20

<210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia A <4 0 0> 11

Gly lie Val Glu Gin Cys cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Gly 20

<210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <4 0 0> 12

Glu Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys 20 25

<210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <4 0 0> 13

Glu Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Glu Glu Lys 20 25

<210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <4 0 0> 14

Glu Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Glu Lys 20 25 <210> 15 <211> 29

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <4 0 0> 15

Glu Vai A9n Gin His Leu Cys Gly Ser Hi9 Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Glu Glu Lys 20 25

<210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <4 0 0> 16

Phe Vai Asn Gin Hi9 Leu cys Gly Ser His Leu vai Glu Ala Leu His 15 10 15

Leu Vai Cy9 Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys 20 25

<210> 17 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> cadeia B <4 Ο 0> 17

Phe vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Glu 15 io 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys 20 25

<210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <4 0 0> 18

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 1.5

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys 20 25

<210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <4 0 0> 19

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Glu Pro Lys 20 25

<210> 20 <211> 28 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia Β <400> 20

Phe Vai Asn Gin Hls Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Pro Lys 20 25

<210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <400> 21

Phe Vai Asn Gin Hia Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu vai cye Gly Glu Arg Gly phe His Gly Gly Gly Arg 20 25

<210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia Β <4Ο0> 22

Phe vai Asn Gin Hls Leu Cys Gly ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Vai cys Gly Glu Arg Gly Phe His Gly Gly Gly Lys 20 25

<210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <400> 23

Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Lys 20 25

<210> 24 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <400> 24

Phe val A9n Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cya Gly Glu Arg Gly Phe Asn Tyr Glu Pro Lys 20 25

<210> 25 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <400> 25

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Arg 20 25

<210> 26 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <400> 26

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys 20 25 <210> 27

<211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia Β <4Ο0> 27

Phe vai Asn Gin His Leu cys Cly Ser His Leu vai Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr His Arg 20 25

<210> 28 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia B <400> 28

Phe Val Asn Gin Hi9 Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys 20 25

<210> 29 <211> 29 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> cadeia B <4Ο0> 29

Phe vai Asn Gin Hls Leu Cys Gly Ser His Leu vai Glu Ala Leu Tyr 1 5 io is

Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Insulina estabilizada contra proteases acilada em que a insulina estabilizada contra proteases consiste, formalmente, numa insulina não estabilizada contra proteases em que pelo menos dois aminoácidos hidrófobos foram substituídos por aminoácidos hidrófilos, e em que as referidas substituições estão localizadas a um, dois ou três aminoácidos de distância ou dentro de dois ou mais sítios de dissociação por proteases que são selecionados das posições B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14 e A14-15 da insulina não estabilizada contra proteases e em que tal insulina estabilizada contra proteases compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais com a condição de que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a unidade acilo está ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na insulina estabilizada contra proteases e tem a fórmula geral Acy-AAln-AA2m-AA3p- (I), em que n é 0 ou um número inteiro na gama desde 1 a 3; m é um número inteiro na gama desde 1 a 10; p é 0 ou um número inteiro na gama desde 1 a 10; Acy é um ácido gordo ou um diácido gordo que compreende desde cerca de 8 a cerca de 24 átomos de carbono; AAl é um resíduo de aminoácido linear ou cíclico neutro; AA2 é um resíduo de aminoácido ácido; AA3 é um resíduo de aminoácido que contém alquilenoglicol neutro; a ordem pela qual AAl, AA2 e AA3 surgem na fórmula pode ser trocada independentemente; AA2 pode ocorrer várias vezes ao longo da fórmula as conexões entre Acy, AAl, AA2 e/ou AA3 são ligações amida que, formalmente, podem ser obtidas pela remoção de um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo de cada um de Acy, AAl, AA2 e AA3; e a fixação à insulina estabilizada contra proteases pode ser a partir da extremidade C-terminal de um resíduo AAl, AA2, ou AA3 na unidade acilo da fórmula (I) ou de uma da(s) cadeia (s) lateral (ais) de um resíduo AA2 presente na unidade de fórmula (I)
2. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com a reivindicação 1, em que a unidade acilo está ligada ao resíduo de lisina na insulina estabilizada contra proteases
3. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a unidade acilo está ligada ao grupo amino do resíduo IV-terminal da cadeia A na insulina estabilizada contra proteases
4. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores exceto a última, em que Acy é um diácido gordo, preferencialmente um diácido gordo (α,ω), mais preferencialmente ácido heptadecanodioico, ácido hexadecanodioico ácido, octadecanodioico ácido, nonadecanodioico, ácido docosanodioico, ácido eicosanodioico
5. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que AA2 é yglu, aGlu, βΑερ, aAsp, γ-D-Glu, a-D-Glu, β-D-Asp, a-D-Asp, ou um aminoácido da seguinte fórmula:

em que as setas indicam o ponto de fixação ao grupo amino de AAl, AA2, AA3 ou ao grupo amino ε do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N-terminal da insulina estabilizada contra proteases.
6. Insulina estabilizada contra proteases acilada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que AA3 é selecionado de qualquer um dos seguintes:

e

em que rél, 2, 3, 5, 7, 11, 23 ou 27
7. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly ou Arg; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu ou Asp; e que compreende ainda opcionalmente uma ou mais mutações adicionais
8. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o aminoácido na posição A14 é Glu, Asp ou His e o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 está suprimido
9. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas de um grupo que consiste em: A8His, Al8Gln, A2lGln, A21Gly, BlGlu, BlGln, B3Gln, BlOPro, Bl4Thr, BlôGlu, Bl7Ser, B26Asp, B27Glu, B27Asp, B28Asp, B28Glu, e desB30
10. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a mutação adicional é desB30
11. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que A14 é Glu
12. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que B25 é His
13. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o resíduo de aminoácido C-terminal na cadeia A da insulina estabilizada contra proteases é o resíduo de aminoácido A21
14. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia A de fórmula 1, isto é, : XaaA(-2)-XaaA(-n-XaaAo-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8_Ser-Ile-Cys-XaaAi2XaaAi3XaaAi4-XaaAi5-Leu-Glu-XaaAi8-Tyr-Cys-XaaA2i (SEQ ID No:l), e uma sequência de aminoácidos da cadeia B de fórmula 2, isto é, . XaaB(-2)—XaaB(-i)—XaaBo—Xa.aBi—XaaB2—Xa.aB3—XaaB4 — His — Leu-Cys-Gly-Ser-XaaBio_Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaBi6_Leu-Val —Cys —Gly—Glu—Arg—Gly—XaaB24—XaaB2 5—XaaB26—XaaB27XaaB28 — XaaB29—XaaB3o—XaaB3i—XaaB3 2 (SEQ ID No; 2) , em que XaaA(-2) está ausente ou é Gly; XaaA(-i> está ausente ou é Pro; XaaAo está ausente ou é Pro; XaaAs é independentemente selecionado de Thr e His; XaaAi2 é independentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; XaaAi3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAi4 é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaAis é independentemente selecionado de Gin, Asp e Glu; XaaAis é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; XaaA2i é independentemente selecionado de Asn e Gin; XaaB(-2) está ausente ou é Gly; XaaB(-i) está ausente ou é Pro; XaaBo está ausente ou é Pro; XaaBi está ausente ou é independentemente selecionado de Phe e Glu; XaaB2 está ausente ou é Vai; XaaB3 está ausente ou é independentemente selecionado de Asn e Gin; XaaB4 é independentemente selecionado de Gin e Glu; XaaBio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; XaaBi6 é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; XaaB24 é independentemente selecionado de Phe e His; XaaB25 é independentemente selecionado de Phe, Asn e His; XaaB26 está ausente ou é independentemente selecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; XaaB27 está ausente ou é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; XaaB28 está ausente ou é independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; XaaB29 está ausente ou é independentemente selecionado de Lys e Gin; XaaB30 está ausente ou é Thr; XaaB3i está ausente ou é Leu; XaaB32 está ausente ou é Glu; o C-terminal pode estar opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácidos da cadeia A e a sequência de aminoácidos da cadeia B estão conectadas por pontes dissulfureto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ponte dissulfureto; em que opcionalmente a sequência de aminoácidos da cadeia A N-terminal está conectada à sequência de aminoácidos da cadeia B C-terminal por uma sequência de aminoácidos compreendendo 3-7 aminoácidos para formar uma molécula de insulina de cadeia simples, em que opcionalmente a extremidade N-terminal da cadeia B está prolongada com 1-10 aminoácidos; em que se XaaA8 é Thr e XaaAi2 é Ser e XaaM3 é Leu e XaaA44 é Tyr então XaaAi5 é Glu ou Asp; e em que se XaaB24 é Phe e XaaB25 é Phe e XaaB26 é Tyr e XaaB27 é Thr e XaaB28 é Pro então XaaB29 Gin
15. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer das possíveis reivindicações anteriores em que a insulina estabilizada contra proteases é selecionada do grupo que consiste em insulina humana A8H, B25N, B27E, desB30; insulina humana A14E, A18L, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, BlE, B25H, B27E, B28E, desB30; insulina humana A14E, BlE, B25H, B28E, desB30; insulina humana A14E, BlE, B27E, B28E, desB30; insulina humana A14E, BlE, B28E, desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana A14E, B28D, desB30; insulina humana A14E, B28E, desB30; insulina humana B25N, B27E, desB30; insulina humana A14E, A21G, B16H, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana B25H, desB30; insulina humana A21G, B25H, desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB30 e insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, desB30,e em que uma unidade acilo está ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na referida insulina estabilizada contra proteases
16. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com a reivindicação anterior que é selecionada do grupo que consiste em insulina humana A14E, B25H, B29K (Eh-hexadecanodioílo) , desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Eheicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Ne3-carboxi-5- octadecanodioilaminobenzoílo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Ne-N-octadecanodioil-N-(2- carboxietil)glicilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε (N-octadecanodioil-N-carboximetil)-beta-alanilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B2 9K(Νε4-([4-({19-carboxi- nonadecanoilaminolmetil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (NEheptadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K(Nemiristilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Eheicosanodioil-YGlu-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Νε4-([4-({19- carboxinonadecanoilamino}metil)trans-ciclo-hexanocarbonil ]-yG1u-yG1u), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B28D, B29K (Ehoctadecanodioil- YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-PEG7), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Eheicosanodioil-YGlu-(3- (2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}etoxi)propionil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Nehexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B2 9K (Ehoctadecanodioil-YGlu-YGlu-YGlu- YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Neeicosanodioil-YGlu-YGlu-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu- OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, B29K (N^octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu) , desB30; insulina humana A14E, B16E, B25H, B29K(hhhexa-decanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, A18 L, B25H, B29K- (Neeicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, A18 L, B25H, B29K (hhocta-decanodioil- YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, B27E, B29K (Neeicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A1G (Neoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana A14E, B1F (N'octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG) , B25H, B29R, desB30; insulina humana A1G (NEhexadecanodioil-YGlu), A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-Abu-Abu-Abu-Abu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (N“eicosanodioílo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B2 9K (N“4-[16-(1H- tetrazol-5-il)hexadecanoilsulfamoil]butanoilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K- (N"eicosanodioil- YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (hhocta-decanodioilo) , desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Eheicosanodioilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Neeicosanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Ehdocosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (thdocosanodioil-YGlu-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε (N-icosanodioil-N-carboximetil)-pAla), desB30; insulina humana A14E, B2 5H, Β2 9Κ(Νε3- [2 - (2-{2-[2 - (17-carboxi- heptadecanoilamino)etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]propionil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε3- [2 - (2 —{2 — [2 - (19-carboxinonadecanoilamino)etoxi] }-etoxi)-etoxi]propionil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K(Neoctadecanodioyi-YGlu-(3-(2-{2-[2- (2-aminoetoxi)etoxi]etoxiletoxi)propionilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Neoctadecanodioil- YGlu-(3-(2-{2-[2- (2- aminoetoxi)etoxi]etoxi}etoxi)propionil-YGlu) , desB3 0; insulina humana A14E, B25H, B29K (hhicosanodioil-YGlu- (3-(2 —{2 —[2-(2-aminoetoxi)- etoxi]etoxi}etoxi)propionilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Νε4-([4-({17-carboxi- nonadecanoilamino}metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]- YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε-( [4 - ({17-carboxi-heptadecanoilamino}metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yG1u-yG1u), desB30; insulina humana A14E, B28D, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B28D, B29K (Eheicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B28D, Β29Κ(Νε octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B28D, B29K (N"eicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B28E, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu) , desB30; insulina humana A14E, B28E, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B28E, B29K (hheicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B28E, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B28E, B29K (hheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (hhoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Eheicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (hheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (N"eicosanodioil-YGlu) , desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (Nehexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, BlE, B27E, B28E, B29K (N"eicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, BlE, B25H, B28E, B29K-(Nehexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana Α14Ε, ΒΙΕ, Β25Η, Β28Ε, Β29Κ (Neoctadecan-dioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, B2 9K (NEhexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, B2 9K (Neoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (Neeicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Nehexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (N'octadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K(Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (N£hexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Eheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B28D, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30; insulina humana A14E, B28E, B29K (Nehexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25N, B27E, B29K (Eheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25N, B27E, B29K(hhocta-decanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25N, B27E, B29K (Nehexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25N, B27E, B29K (Neeicosanodioil-YGlu) , desB30; insulina humana B25N, B27E, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu) , desB30; insulina humana B25N, B27E, B29K (Ehhexadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Neeicosano-dioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Nehexadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A8H, B25N, B27E, B29K (NEhexadecanodioil-YGlu) , desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε (N-icosanodioil-N-carboximetil)^Ala-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε (N-octa-decanodioil-N- carboximetil)-pAla-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε (N-hexadecanodioil-N- carboximetil)-pAla-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Ehoctadecanodioil-YGlu-2-[ (3-{2-[2- (3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propilcarbamoil)-metoxi]acetilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (hbeicosanodioil-YGlu-2-[ (3 —{2 — [2 - (3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propilcarbamoil)metoxi]acetil o), desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-2-[ (3 —{2 —[2 - (3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propil- carbamoil)metoxi]acetilo) , desB30; insulina humana A14E, B16H, B25H, B29K(Eheicosanodioil-YGlu-2-[ (3-(2- [2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi)propilcarbamoil)-metoxi]acetilo), desB30; insulina humana B25H, B29K (hboctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30; insulina humana B25H, B29K (hheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25H, B29K (hboctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana B25H, B29K (Neeicosanodioil-YGlu) , desB30; insulina humana B25H, B29K (hboctadecanodioilo), desB30; insulina humana B25H, B29K (hbeicosanodioilo) , desB30; insulina humana B25H, B29K (hboctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25H, B29K-(theicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25H, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu) . desB30; insulina humana B25H, B29K (Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana B25H, B29K- (hboctadecanodioilo), desB30; insulina humana B25H, B29K (Eheicosanodioilo), desB30; insulina humana B25H, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG) , desB30; insulina humana B25H, B29K-(Neeicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana B25H, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana B25H, B29K (Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B29K (hhoctadecanodioilo), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B29K-(Eheicosanodioilo), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B29K (Neoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, desB27, B29K (Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B29K (hhoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A1G (N“octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), insulina humana A14E, A21G, B25H, desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (iheicosanodioil-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K (ihoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, Β29Κ(Νε (ácido 5-eicosanodioilaminoisoftálico)), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (ihoctadecanodioilo), desB30; insulina humana A14E, B29K (Afoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (iheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Afoctadecanodioil-YGlu-OEG), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (i\heicosanodioil-OEG-OEG) , desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (N£eicosanodioil-Aoc), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (iheicosanodioil-YGlu-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, Β29Κ (Afeicosanodioil-YGlu-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (i/octadecanodioil-OEG) , desB30; insulina humana A1G (A/“octadecanodioílo) , A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana A14E, B25H, B27K (iheicosanodioil-YGlu), desB28, desB29, desB30; insulina humana A14E, B25H, B29K (Ehoctadecanodioil-YG1u-yG1u-yG1u), desB30; insulina humana A21G, B25H, B29K (ihoctadecanodioilo) , desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, desB27, B29K (iheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (ihoctadecanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (Eheicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K-(Neeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (Eheicosanodioilo), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (ihoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, A21G, B25H, B29K (Ahoctadecanodioilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (ihoctadecanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (ihoctadecanodioilo), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Afeicosanodioil-YGlu), desB30; insulina humana A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Eheicosanodioilo), desB30; insulina humana A1G (Afoctadecanodioil-YGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A1G (N“eicosanodioil-YGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A1G (AJ“octadecanodioil-YGlu) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana A1G (N“eicosanodioil-YGlu) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana A1G (N“octadecanodioilo), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A1G (N“eicosanodioilo) , A14E, Β25Η, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana A1G (ifbctadecanodioilo) , A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 e insulina humana A1G (N“eicosanodioílo), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30
17. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização como medicamento
18. Insulina estabilizada contra proteases acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância reduzida à glicose ou diabetes tipo 1.
19. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina estabilizada contra proteases de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para a preparação de uma formulação farmacêutica para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância reduzida à glicose ou diabetes tipo 1