KR20080064171A - 속효성 인슐린의 비강내 투여 - Google Patents

Abstract

환자의 비강내로 인슐린을 송달하기 위한 약제들을 위한 약제학적 조성물들, 제형들, 그리고 이들의 사용들이 설명되는데, 이들은 인간 인슐린의 수용성 혼합물, 가용화제, 그리고 표면 활성제를 포함하고, 상기 인간 인슐린은 속효성 인슐린일 수 있다.

인슐린, 비강내 송달, 당뇨병, 고지혈증

Description

속효성 인슐린의 비강내 투여{INTRANASAL ADMINISTRATION OF RAPID ACTING INSULIN}

인슐린은 중요한 혈당-조절 폴리펩티드 호르몬이다. 인슐린은 췌장에 의하여 분비되는 자연 발생 호르몬이다. 인슐린은 혈액으로부터 혈당을 제거하고 사용하는 인체의 세포들에 의하여 요구된다. 혈당은 세포들로 하여금 세포 기능들을 수행하는데 필요한 에너지를 생성하도록 한다. 탄수화물 항상성(homeostasis)에서 주요 작용체인 것 외에도, 인슐린은 지방대사에 효과들을 가진다. 인슐린은 축적된 지방을 배출하는 간의 능력을 변화시킬 수 있다.

1922년에 연구자들은 젊은 당뇨병 환자에게 인슐린을 함유하는 췌장의 활성 추출물을 최초로 제공하였고, FDA는 1939년에 인슐린을 최초로 승인하였다. 현재, 치료를 위하여 사용되는 인슐린은 재조합된 (인간) 기술뿐만 아니라 소와 돼지의 췌장으로부터 송달된다. 최초의 재조합 인간 인슐린은 1982년에 FDA에 의하여 승인되었다.

인슐린은 당뇨병의 일부 형태들에서 의료용으로 사용된다. 당뇨병을 가진 환자들은 혈액으로부터 혈당을 흡수하여 사용하지 못하는 능력을 가지고, 그 결과, 혈액 내에서 혈당 레벨은 상승한다. 제1형 당뇨병에서, 췌장은 충분한 인슐린을 생성할 수 없다. 그러므로, 인슐린 치료가 필요하다. 제2형 당뇨병에서, 환자들은 인 슐린을 생성하지만, 인체 내의 세포들은 그 인슐린에 정상적으로 반응하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 인슐린은 제2형 당뇨병에서 인슐린에 대한 세포 저항을 극복하기 위하여 사용될 수도 있다. 인슐린은 세포들에 의한 혈당의 흡수를 증가시키고 혈액 내에서 혈당의 농도를 감소시키므로써, 혈관, 눈, 신장, 그리고 신경에 대한 손상을 포함하는 당뇨병의 장기간 합병증들을 방지하거나 감소시킨다. 인슐린은 보통 피하주사로 투여된다. 복부의 피하섬유가 선호되는데, 이는 이 위치에서 인슐린의 흡수가 다른 위치들에서의 피하 섬유들보다 더 일관적이기 때문이다.

인슐린이 최초로 발견되어 당뇨병을 가진 사람들을 위하여 이용가능하게 되었을 때에는, 단시간 작용 인슐린의 한 종류만이 있었다. 이는 하루에 여러번의 주사를 필요로 하였다. 시간이 감에 따라, 더 오래 지속되고, 주사 횟수를 줄이지만, 식사 시점에 더 많은 주의를 요구하는 새로운 인슐린들이 개발되었다. 지금은 이용가능한 인슐린의 다른 유형들이 있다. 이는 환자의 생활방식에 근거하여, 투여 횟수와 투여 시점에서 더 많은 유연성을 제공하고, 표적 혈액의 혈당 레벨들을 더 쉽게 유지하도록 한다. 전형적으로, 인슐린은 피하 주사에 의하여 송달된다. 펌프 송달, 그리고 더 최근에는 폐 송달과 같은 다른 선택들이 이용가능하다.

재조합 DNA 기술로 제조되는 몇몇 인슐린 유사체들이 임상사용을 위하여 이용가능하다. 이들 시약들 중, 인슐린 아스파트(insulin aspart)(NovoLog^TM; Novo Nordisk Pharmaceuticals)는 B28 위치에서 프로라인(proline) 대신 아스파트산(aspartic acid)의 치환을 제외하고는 일반 인간 인슐린과 동일하다. 이러한 하 나의 치환은 대체는 헥사머들(hexamers)을 형성하는 분자의 경향을 감소시킨다. 그러므로, 인슐린 아스파트는 피하주사후 더 빨리 흡수되고 단시간 작용 인슐린보다 작용의 개시가 더 빠르고 작용의 지속이 더 짧은 특성들을 가진다.

인슐린 혼합물들은 특히 제2형 당뇨병을 가진 사람을 위하여 사용된다. 인슐린 혼합물들은 다른 유형의 인슐린들로 한번의 조합투여로 치료를 할 수 있다.

주사가능한 인슐린은 세 가지 다른 형태-바이알(vial), 약물이 충진된 주사기, 그리고 카트리지로 제공된다. 카트리지는 주사를 간단하게 하는 펜과 같은 장치에서 사용된다. 인간 재조합 인슐린, 인슐린 리스프로(lispro), 인슐린 아스파트, 그리고 인슐린 글라진(glargine)은 일반적으로 사용되는 인슐린들이다. 소 인슐린과 돼지 인슐린은 자주 사용되지 않는다. 일반적인 인간 인슐린(Novolin R, Humulin R)은 바이알, 카트리지, 그리고 미리 채워진 주사기로 이용가능하다.

NPH 인간 인슐린(Novolin N, Humulin N)은 바이알, 카트리지, 그리고 미리 채워진 주사기로 이용가능하다. 70% NPH 인간 인슐린과 30% 일반적인 인간 인슐린(Novolin 70/30, Humulin 70/30)의 혼합물이 바이알, 카트리지, 그리고 미리 채워진 주사기로 이용가능하다.

50% NPH 인간 인슐린과 50% 일반적인 인간 인슐린(Humulin 50/50)의 혼합물은 바이알로 이용가능하다. 렌테(Lente) 인간 인슐린(Novolin L, Humulin L)은 바이알로 이용가능하다. 울트라렌테(Ultralente) 인간 인슐린(Humulin U)은 바이알로 이용가능하다. 인슐린 리스프로(lispro)(Humalog)는 바이알과 카트리지로 이용가능하다. 인슐린 아스파트(Novolog)는 바이알과 카트리지로 이용가능하다. 인슐린 글 라진(Lantus)은 바이알과 카트리지로 이용가능하다.

인슐린의 단량체 형태들은 인슐린 유사체들을 포함하고 빠르게 작용하는 것으로 알려져 있는데, 예를 들어, 인슐린 글루리신(glulisine)(LysB3, GluB29), HMR-1153(LysB3, IleB28), HMR-1423(GlyA21, HisB31, HisB32), 인슐린 아스파트(AspB28) 또는 (AsPB10), 리스프로(LysB28, ProB29)가 있다. 위의 모든 예에서, 상기 유사체들의 학명은 인슐린의 A 또는 B 사슬 위의 특정 위치들, 즉 상기 사슬의 N-말단으로부터 세어진 특정 위치들에서 아미노산 치환의 설명에 근거하고, 여기서 서열의 나머지는 천연 인간 인슐린의 그것이다.

천연 인간 인슐린의 아미노산 서열을 갖는 인슐린을 포함하는, 빠르게 작용하는 인슐린의 건조 분말 제형이 폐 송달을 위하여 설명되었다(미국특허번호 6,737,045). 빠르게 작용하는 인슐린들을 포함하는 또 다른 약제학적 제형들, 즉, 60분 이내에 고점 혈청 레벨과 90분 이내에 혈당 저점을 제공할 수 있는 약제학적 제형들을 개발할 필요가 있다.

인슐린 주사받는 사람을 위하여 이용가능한 몇몇 선택들이 있다. 인슐린은 수동으로 주사되거나, 인슐린 펌프라고 하는 소형의 전자 주입 장치의 도움으로 체내에 주입될 수 있다. 바람직하게는 주사기들은 가장 일반적이고 비용 효율적인 선택이고, 서로 혼합된 인슐린의 두 가지 유형들을 택하는 환자들을 위하여 유용하다. 주사기들에 대한 대안은 인슐린 펜인데, 이는 인슐린으로 미리 채워져서 사용되고, 일회용(일회용 인슐린 카트리지로)이거나 재사용가능할 수도 있다. 이러한 인슐린 펜 장치는 캡이 씌워진 미세 바늘과 타단에 플런저를 가진 큰 펜과 공통점 이 있다. 사용자는 다이얼을 이용하여 양을 조절할 수 있다. 인슐린 펜들은 또한 70/30 (NPH와 일반 인슐린)과 같이, 가장 자주 처방되는 인슐린 유형들의 혼합물들에서 이용될 수 있다. 일부 사람들은 주사기 보다는 펜을 더 선호하는데, 이는 펜이 가지고 다니면서 사용하기 편리하기 때문이다.

인슐린 제트 인젝터(insulin jet injector)로 알려진 또 다른 장치는 피부를 통하여 인슐린의 미세 분사액을 보내는 고압의 에어 분사를 이용하므로써 동작한다. 이 장치는 주사를 무서워하는 환자들을 위하여 좋은 선택일 수 있다. 그러나, 제트 인젝터들은 상당한 경제적인 투자를 요구하고 보험이 항상 적용되는 것은 아니다.

인슐린 펌프는 일부 사람들을 위하여 제1형 당뇨병을 조절하기 위한 더 효과적인 방법일 수 있는데, 이는 인슐린 펌프가 췌장의 인슐린 생성을 더 가깝게 모방하기 때문이다. 인슐린 펌프는 "기초 주입량(basal rate)"으로 알려진, 작고, 일정한 인슐린의 량을 하루 내내 환자에게 투여하는 부착된 주입 세트(또는 튜브)를 가진 컴팩트한 전자 장치이다. 복용전에, 펌프 사용자는 빠르게 작용하는 인슐린의 "일회 투여량(bolus)"을 송달하도록 펌프를 프로그램하여, 식사후 혈당 레벨의 동반적인 상승을 만회한다. 사용자는 필요할 때마다 하루 내내 펌프 흐름을 수동으로 조절할 수 있다.

혈당조절 펩티드들은 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 임신성 당뇨병 또는 인슐린 비의존성 당뇨병(NIDDM)의 치료, 비만의 치료 그리고 고지혈증의 치료에서 치료 잠재성을 가지는 것으로 알려져 있는 펩티드들의 한 류이다. 미국특허번호 6,506,724; 미국특허출원공개번호 20030036504A1; 유럽특허번호 EP1083924B1; 국제특허출원공개번호 WO98/30231A1; 그리고 국제특허출원공개번호 WO00/73331A2를 참고하라. 인슐린과 인슐린 유사체들 외에도, 혈당조절 펩티드들은 글루카곤-유사 펩티드, GLP, 예를 들어, GLP-1, 엑센딘(exendins), 특히 엑세나티드(exenatide)로 알려진 exendin-4, 그리고 아밀린 펩티드 그리고 프람린티드(pramlintide)와 같은 아밀린 유사체들(amylin analogs)을 포함한다. 지금까지, 이들 펩티드들은 주사로 인간들에게 투여되었다.

그러므로, 혈당조절 펩티드들, 특히 빠르게 작용하는 인슐린들을 주사 이외의 다른 투여를 위한 약제학적 제형들을 개발할 필요가 있다.

도 1은 PDF 단독을 Tween 제형들을 가진 PDF와 비교하는 토끼 연구 1에 대한 PK 결과들이다.

도 2는 PDF의 IN투여를 NovoLogdml SQ 투여에 대한 Tween 제형들과 비교하는 토끼 연구 2에 대한 PK 결과들이다.

도 3은 IN 대조, IN PDF, IN PDF를 Tween, IV 그리고 SC 제형들과 비교하는 토끼 연구 1, %혈당(로그 선형 스케일)에 대한 PD 결과들이다.

도 4는 연구 2와 연구 1 데이터을 비교하는 PD 결과들이다. , 초기(선형 그래프)부터 %혈당

도 5는 임상전 연구에서 투여된 그룹들에 대한 PD 데이터이다. 초기(선형 그래프)부터 % 혈당.

도 6은 IN PDF를 Tween(DDPC를 갖거나 갖지 않은), SC PDF, 그리고 SC 대조 제형들을 비교하는 임상전 연구 4에서 투여된 그룹들에 대한 PK 데이터이다.

도 7은 IN PDF를 0.25 젤라틴 또는 PG(DDPC를 갖거나 갖지 않은)를 함유하는 Tween과 비교하는 임상시험전 연구 4에서 투여된 그룹들에 대한 PK 데이터이다.

도 8은 IN PDF를 0.25 젤라틴 또는 PG(DDPC를 갖거나 갖지 않은), TDMhypotonic, TDMIsotonic, 구강 PDF(PG 및/또는 DDPC를 갖거나 갖지 않은), 그리고 SC 대조를 포함하는 Tween과 비교하는 임상시험전 연구 4에서 투여된 그룹들에 대한 PK 데이터이다.

도 9는 점성도 증진제 제형들(젤라틴, HPMC, MC, Carbomer, 그리고 CMC)을 갖고서 투여된 모든 그룹들에 대한 초기 PD 데이터로부터의 % 혈당이다.

도 10은 점성도 증진제 제형들(젤라틴, HPMC, MC, Carbomer, 그리고 CMC)을 갖고서 투여된 모든 그룹들에 대한 PK 데이터이다.

본 발명의 보다 나은 이해를 제공하기 위하여, 다음의 정의들이 제공된다:

인슐린과 인슐린 유사체들

본 발명은 주로 60분 이내에 고점 혈청 레벨과 90분 이내에 혈당 저점을 제공할 수 있는 빠르게 작용하는 인슐린들의 비강내 투여에 집중한다. 본 발명에 따르면, 혈당-조절 펩티드들은 또한 자유 염기들, 펩티드들의 칼륨염 또는 나트륨염과 같은, 산 첨가 염들 또는 금속염들, 그리고 아미드화, 글리코실화, 아실화, 황산화, 인산화, 아세틸화, 고리화 및 기타 잘 알려진 공유 변형 방법들과 같은 그러 한 방법들에 의하여 변형되었던 펩티드들을 포함한다.

여기에서 사용된 "인간 인슐린"이란 용어는 재조합 인간 인슐린을 포함한다.

약제학적으로 타당한 염들은 무기산 염들, 유기 아민염들, 유기산 염들, 알카리 토금속염들 및 이들의 혼합물들을 포함한다. 약제학적으로 타당한 염들의 적합한 예들은 할로겐화합물(hallide), 글루코사민(glucosamine), 알킬 글루코사민, 황산염, 염화수소산염, 탄산염, 브롬화수소산염, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 트리에탄올아민, 디에탄올아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린(picoline), 디시클로헥실아민(dicyclohexylamine), 인산염, 황산염, 술폰산염, 벤조에이트(benzoate), 아세트산염(acetate), 살리실산염(salicylate), 유산염(lactate), 타테이트(tartate), 시트르산염(citrate), 메실레이트(mesylate), 글루콘산염(gluconate), 토실레이트(tosylate), 말레인산염(maleate), 푸마르산염, 스테아린산염(stearate) 그리고 이들의 혼합물들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

이처럼, 본 발명에 따르면, 상기에서 설명된 펩티드들, 그리고 이들의 혼합물들은 경점막 송달, 특히 비강내 송달을 위하여 적합한 약제학적 제형들로 결합된다.

펩티드 유사체들 및 모방약

본 발명에서의 사용을 위한 생물학적 활성 펩티드들의 정의에 포함되는 것들은 천연 또는 합성의, 치료적으로 또는 예방적으로 활성의, 펩티드들(둘 이상의 공유결합된 아미노산들로 구성되는), 단백질들, 펩티드 또는 단백질 절편들, 펩티드 또는 단백질 유사체들, 그리고 활성 펩티드들 또는 단백질들의 화학저긍로 변경된 유도체들 또는 염들이다. 혈당-조절 펩티드들의 매우 다양하고 유용한 유사체들 및 모방약들은 본 발명에서의 사용을 위하여 심사숙고되고, 알려진 방법들에 따라서 생산되어 생물학적 활성을 위하여 시험될 수 있다. 종종, 본 발명에서의 사용을 위한 혈당-조절 펩티드들의 펩티드들 또는 단백질들 또는 기타 생물학적으로 활성인 펩티드들 또는 단백질들은 천연 발생 또는 선천적(예를 들어, 정상적, 천연발생 변종, 또는 대립형질변종) 펩티드 또는 단백질 서열 내에서 아미노산들의 부분적 치환, 부가, 또는 제거에 의하여 쉽게 얻어질 수 있는 돌연변이 단백질들이다. 추가적으로, 천연 펩티드들 또는 단백질들의 생물학적으로 활성인 절편들이 포함된다. 그러한 변종 유도체들과 절편들은 실질적으로 천연 펩티드 또는 단백질들의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 있다. 탄수화물 사슬들을 갖는 펩티드들 또는 단백질들의 경우, 이들 탄수화물 종들에서의 변경들에 의하여 표시된 생물학적으로 활성인 변형들이 또는 본 발명 내에 포함된다.

여기에서 사용된 "보존성 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"이란 용어는 유사한 부사슬들을 갖는 아미노산 잔류기들의 일반적인 상호교환성을 말한다. 예를 들어, 지방족의 부사슬들을 갖는 아미노산들의 일반적으로 상호교환가능한 기는 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 그리고 이소류신(isoleucine)이고; 지방족-하이드록실 부사슬들을 갖는 아미노산들의 기는 세린(serine)과 트레오닌(threonine)이고; 아미드-함유 부사슬들을 갖는 아미노산들의 기는 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 그리고 트립토 판(tryptophan)이고; 염기성의 부사슬들을 갖는 아미노산들의 기는 리신(lysine), 알기닌(arginine), 그리고 히스티딘(histidine)이고; 그리고 황-함유 부사슬들을 갖는 아미노산들의 기는 시스테인(cysteine)과 메티오닌(methionine)이다. 보존성 치환의 예들은 다른 것을 위한 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 비극성의(소수성의) 잔류기의 치환을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 알기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 그리고 트레오닌과 세린 사이와 같은 극성(친수성의) 잔류기의 치환을 고려한다. 추가적으로, 다른 것을 위한 리신, 알기닌 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔류기의 치환 또는 다른 것을 위한 아스파트산 또는 글루탐산과 같은 산성 잔류기의 치환이 또한 고려된다. 예시적인 보존성 아미노산들 치환 기들은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-알기닌, 알라닌-발린, 그리고 아스파라긴-글루타민이다. 선택된 생물학적 활성을 판단하기 위하여, 펩티드 또는 단백질 유사체를 대응하는 천연 펩티드 또는 단백질과 선택적으로 정렬하고, 적절한 시험들, 예를 들어, 부착 단백질 또는 수용체 결합율 시험들을 이용하므로써, 본 발명의 방법들과 조성물들에서의 사용을 위한 구동가능한 펩티드와 단백질 유사체들을 쉽게 식별할 수 있다. 구동가능한 펩티드 및 단백질 유사체들은 대응하는 천연 펩티드 또는 단백질까지 올려진 항체들과 전형적이고 구체적으로는 면역반응성이다.

점막송달 증강제들

"점막송달 증강제들(mucosal delivery enhancing agents)"은, 물, 염들, 및/또는 일반적인 완충제들 그리고 혈당-조절 펩티드(조절 제형)를 포함하는 제형에 첨가될 때, 최대혈액, 혈청, 또는 뇌척수액 농도(Cmax)에 의하여 혹은 농도대 시간의 플로트에서 곡선하의 면적, AUC에 의하여 측정되는 점막에서의 혈당-조절 펩티드의 수송의 효과적인 증가를 생성하는 제형을 생성하는 화학물질들 및 기타 부형제들로서 정의된다. 점막은 비강의, 경구의, 장의, 구강의, 기관지 폐의, 질의, 그리고 직장의 점막표면들을 포함하고, 사실상 외부와 소통하는 모든 신체 캐비티들 또는 통로들을 접촉하는 모든 점액-분비막들을 포함한다. 점막 송달 증강제들은 때때로 "캐리어들(carriers)"로 불리운다.

"내독소가 없는 제형(endotoxin-free formulation)"은 혈당 조절 펩티드와 하나 이상의 점막 송달 증강제들을 함유하고 있고 실질적으로는 내독소가 없고 그리고/또는 발열성의 물질들이 없는 제형을 의미한다. 내독소들은 미생물 내부에 제한되고 미생물들이 분해되거나 죽을 때에만 배출되는 독소들을 포함한다. 발열성의 물질들은 열을 야기하고, 박테리아와 기타 미생물들의 외막으로부터 열적으로 안정한 물질들(당단백질)을 포함한다. 이들 양 물질들은 인간에게 투여될 때 열, 저혈압 그리고 쇼크를 야기할 수 있다. 내독소가 없는 제형들의 생산은 특별한 장치, 전문가들을 필요로 하고, 내독소가 있는 제형의 제조보다 훨씬 더 값비쌀 수 있다. 설치류들에게 내독소를 주입하는 것과 동시에 GLP 또는 아밀린(amylin)의 정맥 주사는 저혈압을 방지하고 심지어는 내독소만의 투여와 관련된 사망을 방지(미국특허번호 4,838,343)하는 것으로 나타났었기 때문에, 이들 및 여타 혈당-조절 펩티드 치료제들의 내독소가 없는 제형들을 생산하는 것은 비주사적 투여를 위하여 필요한 것으로 예상되지 않을 것이다.

비주입식 투여

"비주입식 투여(non-infused administration)"는 동맥 또는 정맥으로의 직접 주입, 즉 (전형적으로는 유체를) 어떤 곳으로 가도록 힘을 가하거나 구동하는 방법, 특히 바늘, 주사기 또는 다른 침투적인 방법에 의하여 신체 부위로 유입시키는 방법을 포함하지 않는 임의의 송달 방법을 의미한다. 비주입식 투여는 피하주사, 근육내 주사, 복강내 주사 그리고 점막까지 송달하는 비주사방법들을 포함한다.

송달 방법들과 조성물들

포유류의 대상에게 혈당-조절 펩티드를 점막 투여하기 위한 개선된 방법들 및 조성물들은 혈당-조절 펩티드 투여 계획들을 최적화한다. 본 발명은 하나 이상의 점막 송달 증강제들로 제형화된 혈당-조절 펩티드의 점막 송달을 제공하는데, 여기서 혈당-조절 펩티드 투여량 방출은 실질적으로 정상화되고 그리고/또는 약 0.1 내지 2.0 시간; 0.4 내지 1.5 시간; 0.7 내지 1.5 시간; 또는 0.8 내지 1.0 시간까지의 혈당-조절 펩티드 방출 범위들의 효과적인 송달 기간 동안 유지되고, 점막 투여 다음에 이루어진다. 이루어진 혈당-조절 펩티드의 지속된 방출은 본 발명의 방법들과 조성물들을 이용하는 외인성의 혈당-조절 펩티드의 반복 투여에 의하여 손쉽게 될 수 있다. 포유류의 대상들에게 혈당-조절 펩티드들 점막 투여하기 위한 개선된 조성물들과 방법들은 혈당-조절 펩티드 투여 계획들을 최적화한다. 본 발명은 하나 이상의 점막송달 증강제들과 임의의 지속 방출 증강제 또는 증강제들과 조합하여 혈당-조절 펩티드를 포함하는 제형의 개선된 점막의(예를 들어, 비강의) 송달을 제공한다. 본 발명의 점막 송달 증강제들은 송달의 효과적인 증가, 예 를 들어, 점막으로 투여된 혈당-조절 펩티드의 치료학적 활동을 향상시키는 최대 혈장 농도(Cmax)의 증가를 낳는다. 혈장과 CNS에서 혈당-조절 펩티드의 치료학적 활동에 영향을 미치는 두 번째 인자는 체류 시간(RT)이다. 비강내 송달 증강제들과 조합된 지속되는 방출 증강제들은 Cmax를 증가시키고 혈당 조절 펩티드의 체류 시간(RT)을 증가시킨다. 고분자 송달체들과 기타 시약들 그리고 지속되는 방출-증강 제형들, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 생성하는 본 발명의 방법들이 여기에서 개시된다.

본 발명은 당뇨병, 고혈당증, 고지혈증, 개인의 포만을 유도하는 병, 개인의 체중 손실을 촉진하는 병, 비만, 결장암, 전립선암, 또는 포유류의 대상에서 다른 암을 포함하는 질병들 및 병적상태들과 관련된 징후들의 치료를 위한 개선된 혈당-조절 펩티드 송달 방법과 투약형태를 제공한다.

본 발명의 점막 송달 제형들과 방법들 내에서, 혈당-조절 펩티드는 종종 점막 송달을 위하여 적합한 운반체 또는 운송체와 결합되거나 병용투여된다. 여기에서 사용된 "운반체(carrier)"란 용어는 약제학적으로 타당한 고체 또는 액체 충진제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 물을 함유한 액체 운반체는 산성화제, 알카리화제, 항균성의 보존제, 항산화제, 완충제, 킬레이트화제(chelating agents), 착화제, 가용화제, 습윤제(humectants), 용매, 부유 및/또는 점성-증강제, 강직성제(tonicity agents), 습윤제(wetting agents) 또는 기타 생물학적으로 양립가능한 물질들과 같은 약제학적으로 타당한 첨가제들을 함유할 수 있다. 위의 범주들에 의하여 나열된 성분들의 표는 U.S. Pharmacopeia National Formulary, 1857-1859, 1990에서 발견될 수 있다. 약제학적으로 타당한 운반체들로서 작용할 수 있는 물질들의 일부 예들은 약제학적 제형들에서 사용되는 다른 비독성의 양립가능한 물질들과 그들의 혼합물들뿐만 아니라, 유당, 포도당 그리고 자당과 같은 당들; 옥수수 전분과 감자 전분과 같은 전분들; 셀룰로오스 및 소듐 카복실메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 그리고 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체들; 분말로 된 트래거캔스(tragacanth); 엿기름; 젤라틴; 운모; 코코아 버터와 좌제 왁스들과 같은 첨가제; 땅콩 기름, 목화씨 기름, 잇꽃 기름, 참깨 기름, 올리브 기름, 옥수수 기름 그리고 콩기름과 같은 기름들; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜들; 글리세린, 소비톨, 만니톨 그리고 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올들(polyols); 에틸 올레이트와 에틸 라우레이트(ethyl laurate)와 같은 에스테르들; 우뭇가사리; 수산화 마그네슘과 수산화 알루미늄과 같은 완충제들; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장 염수(isotonic saline); 링거액, 에틸알콜 및 인산염 완충제들이다.

이처럼, 습윤제들(humectants)의 일부 예들은 프로필렌 글리콜, 글리세린, 글리세릴 트리아세테이트, 폴리욜, 고분자 폴리욜, 젖산, 요소, 그리고 이들의 혼합물들을 포함한다.

완충제와 완충제 염의 일부 예들은 글루타민산염, 아세트산염, 글리신, 히스티딘, 알기닌, 리신, 메티오닌, 유산염, 포름산염(formate), 글리콜산염(glycolate), 그리고 이들의 혼합물들을 포함한다.

착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 착향 및 방향제, 보존제 그리고 항산화제 들뿐만 아니라 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate) 그리고 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)와 같은 습윤제들(wetting agents), 에멀션화제들 그리고 윤활제들이 또한 제조자의 바람에 따라 조성물들 내에 존재할 수 있다. 약제학적으로 타당한 항산화제들의 예들은 아스코브르산, 시스테인 염산염, 중아황산 나트륨(sodium bisulfite), 메타중아황산 나트륨(sodium metabisulfite), 아황산 나트륨(sodium sulfite) 등과 같은 수용성 항산화제들; 아스코빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸레이티드 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 레시틴(lecithin), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 알파-토코페롤(alpha-tocopherol) 등과 같은 유용성 항산화제들; 그리고 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소비톨, 주석산, 인산, 그리고 이들의 혼합물들과 같은 금속-킬레이트제들을 포함한다. 단약 투여 형태를 생성하는 운반체 물질들과 결합될 수 있는 활성 성분들의 양은 특별한 투여 모드에 따라서 변화할 것이다.

본 발명의 점막 송달 조성물들과 방법들에서, 다양한 송달 증강제들이 채용되는데, 이들은 점막 표면 내로 혹은 점막 표면에 걸쳐서 혈당-조절 펩티드의 송달을 향상시킨다. 이 점에서, 점막 상피에 걸친 혈당-조절 펩티드의 송달은 "세포자체를 통과하거나(transcellularly)" 혹은 "세포 사이를 통과하여(paracellularly)" 일어날 수 있다. 이들 경로들이 혈당-조절 펩티드의 전체 흐름과 생물학적 이용도에 기여하는 정도는 점막의 환경, 활성제의 물리-화학적 성질들, 그리고 점막 상피의 성질들에 의존한다. 세포간 수송은 수동적인 확산만을 포함하는 반면에, 세포 자체 수송은 수동적, 손쉽게 되거나 능동적인 방법들에 의하여 일어날 수 있다. 일반적으로, 친수성의, 수동적으로 전송되는, 극성 용질들은 세포간 경로를 통하여 확산하지만, 친유성의 용질들은 세포를 통한 경로를 이용한다. 다양한, 수동적으로 그리고 능동적으로 흡수되는 용질들에 대한 흡수(예를 들어, 투수성 계수 또는 생리적 시험에 의하여 반영될 때)는 본 발명에서 임의의 선택된 혈당-조절 펩티드에 대하여, 세포간 송달 성분과 세포자체를 통한 송달 성분 양자의 관점에서 쉽게 평가될 수 있다. 수동적으로 흡수되는 약물들의 경우, 약물 수송에 대한 세포간 및 세포 자체를 통한 경로들의 상대적인 기여는 pKa, 분할 계수, 분자 반경 및 약물의 전하, 약물이 송달되는 루미날(luminal) 환경의 pH, 그리고 흡수 표면적에 의존한다. 세포간 경로는 비강 점막 상피의 접근가능한 표면적이 상대적으로 작은 부분을 나타낸다. 일반적 용어들에서, 세포막들은 세포간 공간들이 차지하는 면적보다 천배 더 큰 점막 표면적을 차지하는 것으로 보고되었다. 이처럼, 접근가능한 면적이 작을수록, 그리고 거대분자 침투에 대항하는 크기 및 전하를 기본으로 하는 식별은 세포간 경로가 약물 수송을 위한 세포자체 송달보다 일반적으로 덜 바람직한 경로일 것이라는 것을 제시할 것이다. 놀랍게도, 본 발명의 방법들과 조성물들은 세포간 경로를 경유하여 점막 상피내로 그리고 점막 상피에 걸쳐서 생물학적 치료학(biotherapeutics)의 상당히 향상된 송달을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 방법들과 조성물들은 대안적으로나 혹은 단일 방법 또는 조성물 내에서 세포간 경로와 세포자체를 통한 경로 양자를 목표로 한다.

여기에서 사용된 "점막송달 증강제들"은 혈당-조절 펩티드 또는 기타 생물학 적으로 활성인 화합물(들)의 방출 또는 고용도(예를 들어, 제형 운송체로부터의), 확산율, 침투 용량 및 타이밍, 흡수, 체류시간, 안정성, 효과적인 반감기, 최대 또는 유지되는 농도 레벨들, 청소율(clearance) 및 기타 원하는 점막 송달 특성들(예를 들어, 송달의 자리에서 혹은 혈류 또는 중앙신경계와 같이 활성도의 선택된 목표 자리에서 측정될 때)을 향상시키는 시약들을 포함한다. 이처럼, 점막 송달의 향상은 다양한 메커니즘들 중 하나, 예를 들어, 혈당 조절 펩티드의 확산, 존속 또는 안정성을 증가시키는, 막 유동성을 증가시키는, 세포내 또는 세포간 침투를 조절하는 칼슘 및 기타 이온들의 유효성 또는 작용을 조절하는, 점막 성분들(예를 들어, 지질)의 용해도를 높이는, 점막 조직에서 비단백질과 단백질 설포하이드릴(sulfhydryl) 레벨들을 변화시키는, 점막 표면에 걸쳐서 물의 유속을 증가시키는, 상피세포의 접합 생리를 조절하는, 점막 상피 위의 점막의 점성을 감소시키는, 점액섬모 청소능율들을 감소시키는 메커니즘들, 그리고 기타 메커니즘들 중 하나에 의하여 발생할 수 있다.

여기에서 사용된 "혈당 조절 펩티드의 점막적으로 효과적인 양(mucosally effective amount of glucose-regulating peptide)"은 다양한 송달 또는 이송 경로들을 포함할 수 있는 대상에서 약물 활성을 위한 목표 자리로의 혈당 조절 펩티드의 효과적인 점막 송달을 고려한다. 예를 들어, 제공된 활성 시약은 점막의 세포들간 청소를 통하여 그의 길을 발견하여 인접한 혈관벽에 도달할 수 있지만, 다른 경로에 의해서는, 상기 시약은 세포들 내에서의 활동을 위하여 점막 세포들 내로 수동적 또는 능동적인 방법 중 어느 하나로 흡수되거나 전신 순환과 같은 제2 목표 지점에 도달하도록 세포들로부터 방출되거나 이송될 수 있다. 본 발명의 방법들과 조성물들은 하나 이상의 그러한 대안적인 경로들을 따라서 활성 시약들의 위치변환을 촉진할 수도 있고, 혹은 점막 조직 또는 가까운 쪽의 혈관 조직에 직접 작용하여 활성 시약(들)의 흡수 또는 침투를 촉진할 수도 있다. 이 내용에서 흡수 또는 침투의 촉진은 이들 기구들에 한정되지 않는다.

여기에서 사용된 "혈장내 혈당 조절 펩티드의 최대 농도(Cmax)", "혈장내 혈당 조절 펩티드의 농도 대 시간 곡선(AUC) 하의 면적", 혈장내 혈당 조절 펩티드의 최대 혈장 농도(tmax)에 대한 시간"은 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려진 약물동력학 변수들이다. Laursen 등, Eur . J. Endocrinology 135:309-315, 1996. "농도 대 시간 곡선"은 혈당 조절 펩티드를 비강내, 근육내, 피하내, 또는 기타 비경구적인 투여 경로 중 하나로 대상에게 1회 투여량을 투여한 후 시간에 대하여 대상의 혈청에서의 혈당 조절 펩티드의 농도를 측정한다. "Cmax"는 대상에게 혈당 조절 펩티드의 1회 투여 다음에 오는 대상의 혈청 내에서의 혈당 조절 펩티드의 최대 농도이다. "tmax"는 대상에게 혈당 조절 펩티드의 1회 투여량을 투여한 다음 대상의 혈청내에서 혈당 조절 펩티드의 최대 농도에 도달하는 시간이다.

여기에서 사용된 "혈장내 혈당 조절 펩티드의 농도 대 시간 곡선하의 면적(AUC)"은 선형의 마름모꼴 규칙에 따라서 잔류 면적들의 부가로 계산된다. 두 가지 투여량 사이에서 23%의 감소 또는 30%의 증가가 90%의 확율(타입 II 에러 β=10%)로 검출될 것이다. "송달율" 또는 "흡수율"은 최대 농도(Cmax)에 도달하는 시간(tmax)의 비교로 추정된다. Cmax와 tmax 양자는 비변수적 방법들을 이용하여 분 석된다. 근육내의, 피하의, 정맥의 그리고 비강내의 혈당 조절 펩티드 투여들의 약물동력학의 비교는 변이의 분석(ANOVA)에 의하여 수행되었다. 공정하고 현명한 비교들을 위하여, Bonferroni-Holmes 순차 절차가 중요성을 평가하기 위하여 사용된다. 세 가지 비강 투여량들 사이의 투여-반응 관계는 회귀분석으로 추정된다. P<0.05는 상당한 것으로 간주된다. 결과들은 평균값들 +/-SEM으로서 제공된다.

흡수 증진의 기구는 본 발명의 다른 점막 송달 증강제들로 변화하지만, 본 명세서에서 유용한 시약들은 점막 조직에 영향을 미치고, 특별한 혈당 조절 펩티드 또는 기타 활성 또는 송달 증강제의 생리화학적 특징들에 따라서 선택될 것이다. 본 명세서에서, 점막 섬유들의 침투 또는 투과성을 증진은 송달 증강제들은 종종 wjakar의 보호적인 투과성 장벽의 일부 변경으로 귀결될 것이다. 본 발명에서 가치있는 그러한 송달 증강제들을 위하여, 일반적으로 점막의 투과율에서의 어떤 상당한 변화들이 약물 송달의 원하는 지속에 적합한 시간 프레임 내에서 가역적이어야 한다는 것이 바람직하다. 더욱이, 실질적이고, 누적의 독성이 없어야 하고, 장기간 사용으로 점막의 장벽 성질들에서 유도되는 어던 영구적인 해로운 변화들이 없어야 한다.

본 발명의 어떤 측면들에서, 본 발명의 혈당 조절 펩티드와 병용투여 또는 조합의 제형을 위한 흡수 증진제들은 작은 친수성 분자들로부터 선택되는데, 상기 작은 친수성 분자들은 디메틸 설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 그리고 2-파이로리돈들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 대안적으로, 긴사슬의 양친매성의(amphipathic) 분자들, 예를 들어, 디아실메틸 설폭 사이드, 아존(azone), 소듐 라우릴설페이트, 올레산, 그리고 담즙염들이 혈당 조절 펩티드의 점막 침투를 향상시키기 위하여 채용될 수도 있다. 추가적인 측면들에서, 계면활성제들(예: 폴리소베이트)이 혈당 조절 펩티드의 비강내 송달을 향상시키기 위한 부가 화합물들, 처리제들 또는 제형 첨가물들로서 채용될 수도 있다. DMSO, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 에탄올과 같은 시약들은, 송달환경(예: 치료적인 제형으로 사전투여 또는 결합에 의하여)에서 충분히 높은 농도들로 존재하면, 점막에 수용성 상으로 들어가서 그것의 가용화 성질들을 변경시켜서 운반체로부터 점막으로의 혈당 조절 펩티드의 분할을 향상시킬 수 있다.

이처럼, 가용화제들의 일부 예들은 시클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린, 설포부틸에테르-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 그리고 이들의 혼합물들을 포함한다.

본 발명의 병용투여 및 처리 방법들 그리고 조합적인 제형들과 유용한 추가적인 점막 송달 증강제들은 혼합 미셀들(mixed micelles); 에나민(enamines); 일산화질소 증여자들(예: S-니트로소-N-아세틸-DL-페니실아민, NOR1, NOR4-바람직하게는 카복시-PITO 또는 도클로페낙 소듐(doclofenac sodium)과 동시 투여됨); 소듐 살리실레이트(sodium salicylate); 아세토아세트산의 글리세롤 에스테르들(예: 글리세릴-1,3-디아세토아세테이트 또는 1,2-이소프로필리덴글리세린-3-아세토아세테이트); 그리고 점막 송달을 위하여 생리적으로 병립할 수 있는 다른 방출-확산 또는 상피내의 또는 상피관통의 침투 증강제들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 다른 흡수 증진제들은 혈당 조절 펩티드의 점막 송달, 안정성, 활성도 또는 상피관통 침투를 향상시키는 다양한 운반체들, 염기들 그리고 부형제들로부터 선택된다. 이들은 그중에서도 특히 시클로덱스트린 및 β-시클로덱스트린 유도체들(예: 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린과 헵타키스(2,6-디-O-메틸-β-시클로덱스트린))을 포함한다. 이들 화합물들은 선택적으로는 하나 이상의 활성 성분들과 결합되고 더 선택적으로는 유성의 염기로 제형화되어, 본 발명의 점막 제형들에서 생물학적 이용도를 향상시킨다. 점막 송달을 위하여 적합한 또 다른 추가적인 흡수-증진제들은 중쇄지방산들을 포함하고, 이들 중쇄지방산들은 모노- 그리고 디글리세라이드들(예: 소듐 카프레이트-코코넛 오일의 추출물들, Capmul), 그리고 트리글리세라이드(예: 아밀로덱스트린, Estaram 299, Miglyol 810)을 포함한다.

본 발명의 점막 치료 및 예방 조성물들은 점막 생물학적 장벽들에 걸쳐서 혈당 조절 펩티드의 흡수, 확산, 또는 침투를 쉽게 하는 임의의 적합한 침투 증진제로 보충될 수도 있다. 침투 촉진제는 약제학적으로 타당한 임의의 촉진제일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 더 상세한 측면들에서, 소듐 살리실레이트 및 살리실산 유도체들(아세틸 살리실레이트, 콜린 살리실레이트, 살리실아미드 등); 아미노산들 및 이들의 염들(예: 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 프롤린, 히드록시프롤린 등과 같은 모노아미노카복실산들; 세린과 같은 히드록시아미노산들; 아스파트산, 글루탐산과 등과 같은 산성 아미노산들; 그리고 리신 등과 같은 염기성 아미노산들-그들의 알카리 금속 또는 알카리 토금속 염들을 포함); 그리고 N-아세틸아미노 산들(N-아세틸알라닌, N-아세틸페닐알라닌, N-아세틸세린, N-아세틸글리신, N-아세틸리신, N-아세틸글루탐산, N-아세틸프롤린, N-아세틸히드록시프롤린 등) 및 그들의 염들 (알카리 금속 염들 및 알카리 토금속 염들)로부터 선택되는 하나 이상의 침투 촉진제들을 결합한 조성물들이 제공된다. 또한 본 발명의 방법들과 조성물들 내의 침투 촉진제로서 제공되는 것들은 일반적으로 에멀션화제들(예: 소듐 올레일 포스페이트(sodium oleyl phosphate), 소듐 라우릴 포스페이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 미리스틸 설페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에스테르 등), 카프로산, 젖산, 사과산 및 구연산 그리고 이들의 알카리 금속 염들, 피롤리돈카복실산들, 알킬피롤리돈카복실산 에스테르들, N-알킬피롤리돈들, 프롤린 아실 에스테르들 등이다.

본 발명의 다양한 측면들에서, 투여와 선택된 목표 자리들 사이의 점막 장벽들을 넘어서 본 발명의 혈당 조절 펩티드와 여타 치료제들의 송달을 허용하는 개선된 비강 점막 송달 제형들과 방법들이 제공된다. 어떤 제형들은 구체적으로는 선택된 목표 세포, 조직 또는 기관, 또는 심지어는 특별한 질병 상태를 위하여 채용된다. 다른 측면들에서, 제형들과 방법들은 특히 정의된 세포내 또는 세포간 통로를 따라서 경로화된 혈당 조절 펩티드의 효율적이고, 선택적인 엔도사이토시스(endocytosis) 또는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 제공한다. 전형적으로, 혈당 조절 펩티드는 운반체 또는 다른 운송체 내에서 효과적인 농도 레벨들로 효율적으로 부가되어, 송달되고 안정된 형태로, 예를 들어, 비강 점막에 그리고/또는 세포내 부분들과 막들을 통하여 약물 작용을 위한 먼 목표 자리(예: 혈류 또는 정의된 조직, 기고나, 도는 세포외 부분)까지 통과하는 동안 유지된다. 혈당 조절 펩티드는 운송체 내에 제공되거나 그렇지 않으면 (예를 들어, 전구약물의 형태로) 변 형될 수도 있고, 여기서 혈당 조절 펩티드의 방출 또는 활성화는 생리학적 자극(예를 들어, pH 변화, 리소좀 효소 등)에 의하여 발생된다. 종종, 혈당 조절 펩티드는 활성화를 위한 표적 위치에 도달할 때까지 약리학적으로 비활성이다. 대부분의 경우들에서, 혈당 조절 펩티드와 기타 제형 성분들은 비독성이고 비면역성이다. 본 명세서에서, 운반체들과 다른 제형 성분들은 일반적으로 생리적 상태 하에서 빨리 퇴화되거나 방출되는 그들의 능력 때문에 선택된다. 동시에, 제형들은 효과적인 저장을 위하여 투약 형태에서 화학적으로 그리고 물리적으로 안정하다. 다양한 첨가제들, 희석제들, 염기들 그리고 운송체들이 본 발명에서 제공되는데, 이들은 단백질 안정성을 향상시키기 위하여 물 함량을 효과적으로 조절한다. 이러한 의미에서 반응집제들로서 효과적인 이들 시약들과 운반체 물질들은, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 디에틸아미노에틸 덱스트란, 그리고 카복시메틸 셀룰로오스와 같은 다양한 기능성들의 고분자들을 포함하고, 이들 고분자들은 안정성을 상당히 증가시키고 그것과 혼합되거나 거기에 연결된 펩티드들 및 단백질들의 고상 응집을 감소시킨다. 일부 예들에서, 단백질들의 활성도 또는 물리적 안정성 또한 펩티드 또는 단백질 전구약물들의 수용액들에게 첨가되는 다양한 첨가제들에 의하여 향상될 수 있다. 예를 들어, (당들을 포함하는) 폴리올들, 아미노산들, 콜라겐 및 젤라틴과 같은 단백질들, 그리고 다양한 염들과 같은 첨가제들이 사용될 수 있다.

어떤 첨가제들, 특히 당과 다른 폴리올들 또한 건조, 예를 들어, 동결건조 단백질들에 대한 상당한 물리적 안정성을 부여한다. 이들 첨가제들은 본 발명에서 냉동건조 동안뿐만 아니라 건조 상태에서의 저장 동안에도 응집에 저항하는 단백질 들을 보호하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 수크로스와 피콜(Ficoll) 70(수크로스 단위들을 가진 고분자)은 다양한 조건들 하에서 고상 배양 동안에 펩티드 또는 단백질 응집에 대항하는 상당한 정도의 보호를 보여준다. 이들 첨가제들은 고분자 소지들 내에 끼워진 고상 단백질들의 안정성을 향상시킬 수도 있다.

또 다른 추가적인 첨가제들, 예를 들어, 수크로스는 본 발명의 어떤 지속 방출 제형들에서 발생할 수 있는 고온 다습 분위기들에서 고상 응집에 대항하는 단백질들을 안정화한다. 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질들은 또한 본 명세서에서 불안정한 단백질들의 변성과 응집을 감소시키는 안정화제 또는 팽창제로서 작용한다. 이들 첨가제들은 본 발명의 고분자 용융 공정들과 조성물들에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 미소입자들은 위에서 설명된 다양한 안정화 첨가제들을 함유하는 용액을 단순히 냉동건조시키거나 분사 건조하므로써 제조될 수 있다. 그리하여 응집되지 않은 펩티드들과 단백질들의 서방형 방출이 연장된 시간 주기에 대하여 얻어질 수 있다.

특정 제형 첨가제들뿐만 아니라 다양한 추가적인 조제 성분들과 방법들이 여기에서 제공되는데, 이들은 응집경향이 있는 펩티드들과 단백질들의 점막 송달을 위한 제형들을 생성하고, 여기서 펩티드 또는 단백질은 가용화제를 이용하여 실질적으로 순수하고, 응집되지 않은 형태로 안정화된다. 성분들과 첨가제들의 범위는 이들 방법들과 제형들에서의 사용을 위하여 고려된다. 이들 가용화제들의 예들은 시클로덱스트린(CDs)으로서, 이는 폴리펩티드들의 소수성 부사슬들을 선택적으로 결합한다. 이들 CD들은 응집을 상당히 억제하는 식으로 단백질들의 소수성 패 치(patch)들에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 억제는 상기 CD와 관련 단백질 양자에 대하여 선택적이다. 그러한 선택적인 단백질 응집의 억제는 본 발명의 비강내 송달 방법들 및 조성물들에서 추가적인 장점들을 제공한다. 이러한 관계에 있어서, 사용을 위한 추가적인 시약들은 구체적으로 펩티드들과 단백질의 응집을 차단하는 링커(linker)들에 의하여 조절되는 가변적인 기하학적 구조를 갖는 CD 2량체들, 3량체들 그리고 4량체들을 포함한다. 본 발명에서 결합을 위한 또 다른 가용화제들 및 가용화 방법들은 단백질-단백질 상호작용들을 선택적으로 차단하기 위하여 펩티드들과 펩티드 모방약들의 사용을 포함한다. 일측면에서, CD 다량체들에 대하여 보고된 소수성 부사슬들의 특정 결합은 유사하게 단백질 응집을 차단하는 펩티드들과 펩티드 모방약들의 사용을 통하여 단백질들까지 연장된다. 넓은 범위의 적합 방법들과 반응집제들이 본 발명의 조성물들과 절차들 내에서 결합을 위하여 이용가능하다.

전하 변형 그리고 pH 조절제들 및 조절방법들

소수성 점막 장벽들을 통한 송달의 향상을 위한 생물학적 활성제들(혈당 조절 펩티드, 여타 활성 펩티드들 및 단백질들, 그리고 거대분자 및 소분자 약물들을 포함)의 수송 특성들을 개선하기 위하여, 본 발명은 또한 선택된 생물학적 활성제들 또는 여기에서 설명된 송달 증강제들의 전하 변형(charge modification)을 위한 기술들 및 시약들을 제공한다. 이러한 점에서, 거대분자들의 상대적 투과성들은 일반적으로 그들의 분할 계수들에 관련된다. 분자의 pKa와 점막 표면에서 pH에 의존하는 분자들의 이온화 정도 또한 분자들의 투과성에 영향을 미친다. 점막 송달을 위한, 본 발명의 혈당 조절 펩티드 및 유사체들을 포함하는, 생물학적 활성제들의 투과 및 분할은, 예를 들어, 대전된 기능성 기들의 변경에 의하여, 활성제가 송달되는 운송체 또는 송달용액의 pH를 변경하는 것에 의하여, 혹은 활성제를 갖는 전하- 또는 pH-변경 시약의 병용투여에 의하여 달성되는, 활성제 또는 투과제의 전하 변경 또는 전하 분산에 의하여 쉬워질 수 있다.

이들 일반적인 가르침들과 일치하게, 본 발명의 방법들과 조성물들에서, 혈당 조절 펩티드와 다른 생물학적 활성 펩티드들 및 단백질들을 포함하는, 대전된 거대분자 종들의 점막 송달은 활성제가 실질적으로 이온화되지 않은, 혹은 중성의, 전기적 전하 상태에 있는 점막 표면까지 송달될 때 실질적으로 개선된다.

본 발명에서의 사용을 위한, 점막 제형들의 혈당 조절 펩티드 및 기타 생물학적 활성 펩티드 및 단백질 성분들은 펩티드 또는 단백질의 양의 전하 밀도에서의 증가를 낳기 위하여 전하가 변경될 것이다. 이들 변경들은 또한 펩티드 및 단백질 접합체들, 운반체들 그리고 여기에서 개시된 다른 송달 형태들의 양이온화까지 연장된다. 양이온화는 본 발명에서 단백질들과 거대분자들의 생체분포 및 전송 성질들을 변경하는 편리한 수단을 제공한다. 양이온화는 활성제의 생물학적 활동을 실질적으로 보존하고 잠재적으로는 조직 손상 및 독성을 포함하는 부작용들을 제한하는 식으로 이루어진다.

"완충제(buffer)"는 일반적으로 용액의 pH를 거의 일정한 값으로 유지하기 위하여 사용된다. 완충제는 심지어는 소량의 강산 또는 강염기가 상기 용액에 첨가될 때에도 수소와 수산화물 이온들의 농도의 큰 변화를 방지하거나 중화하므로써 용액의 pH를 유지한다. 완충제는 일반적으로 약산과 그의 적당한 염(또는 약염기와 그의 적당한 염)으로 구성된다. 약산을 위한 적당한 염은 약산에 존재하는 것과 동일한 음이온을 함유한다(Lagowski, Macmillan Encyclopedia of Chemistry, Vol.1, Simon & Schuster, New York, 1997 at p.273-4을 참고). Hendeson-Hasselbach 방정식, pH=pKa+log₁₀[A]/[HA]는 완충제를 설명하기 위하여 사용되고, 약산 해리, HA↔H⁺ + A^-를 위한 표준 방정식에 근거를 두고 있다. 일반적으로 사용되는 완충제 원들의 예들은 아세테이트, 타트레이트(tartrate), 시트레이트(citrate), 포스페이트(phosphate), 락테이트(lactate), 글리신, 리신, 알기닌, 히스티딘, 글루타메이트(glutamate), 메티오닌(methionine), 포메이트(formate), 그리고 글리코레이트(glycolate)를 포함한다.

"완충제 용량(buffer capacity)"은 상당한 pH 변화가 발생하기 전에 완충 용액에 첨가될 수 있는 산 또는 염기의 양을 의미한다. pH가 약산의 pK-1과 pK+1의 범위 내에 놓이면, 완충제 용량은 고려할만 하지만, 이 범위 밖이라면 가치없는 값으로 된다. 그러므로, 주어진 시스템만이 약산(또는 약염기)의 pK의 어느쪽에 대하여 1 pH 단위의 범위에서 유용한 완충 작용을 가진다(Dawson, Data for Biochemical Research, Third Edition, Oxford Science Publications, 1986, p.419). 일반적으로, 적합한 농도들은 용액의 pH가 약산(또는 약염기)의 pKa에 근접하도록 선택된다(Lide, CRC Handbook of Chemistry and Physics, 86th Edition, Taylor & Francis Group, 2005-2006, p.2-41). 또한, 강산들과 강염기들의 용액들 은 완충 용액들로서 정상적으로 분류되지 않고, 그들은 2.4 내지 11.6 사이의 pH 값들 사이의 완충제 용량을 나타내지 않는다.

퇴행성 효소 억제제들 및 억제방법들

경점막의 조제약에 포함될 수 있는 또 다른 부형제는 퇴행성 효소 억제제이다. 본 발명의 제형들 및 방법들에서 유용한 예시적인 점막점착성 고분자-효소 억제제 복합체들은 카복시메틸셀룰로오스-펩스타틴(항펩신 활성도를 갖는); 폴리(아크릴산)-Bowman-Birk 억제제(항키모트립신(anti-chymotrypsin)); 폴리(아크릴산)-키모스타틴(항키모트립신); 폴리(아크릴산)-엘라스타티널(항-엘라스타아제); 키토산-안티페인(항트립신); 폴리(아크릴산)-바시트라신(항아미노펩티다아제 N); 키토산-EDTA(항아미노펩티다아제 N, 항카복시펩티다아제 A); 키토산-EDTA-안티페인(항트립신, 항키모트립신, 항엘라스타아제)를 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 아래에서 더 상세히 설명되듯이, 본 발명의 어떤 실시예들은 선택적으로 새로운 키토산 유도체 또는 화학적으로 변형된 형태의 키토산을 결합할 것이다. 본 발명에서의 사용을 위한 그러한 한 가지 신규한 유도체는 β-[1→4]-2-구아니디노-2-디옥시-D-글루코스 고분자(폴리-GuD)로 표시된다.

생물학적 활성제(들)을 보호하는 효소의 활성을 저해하는 저해제는 본 발명의 조성물들과 방법들에서 유용하게 채용될 수 있다. 생물학적으로 활성인 단백질들 및 펩티드들의 보호를 위한 유용한 효소 저해제들은, 예를 들어, 대두 트립신 저해제, 엑센딘(exendin) 트립신 저해제, 키모트립신 저해제 그리고 감자(감자(solanum tuberosum L.)) 줄기로부터 분리된 트립신 및 키모트립신 저해제를 포 함한다. 저해제들의 조합 또는 혼합물들이 채용될 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 단백질 가수분해 효소들의 추가적인 저해제들은 오보뮤코이드(ovomucoid)-효소, 가벡세이트 메실레이트(gabaxate mesylate), 알파-안티트립신, 아프로티닌(aprotinin), 아마스타틴(amastatin), 베스타틴(bestatin), 푸로마이신(puromycin), 바시트라신(bacitracin), 류펩신(leupepsin), 알파2-마크로글로불린, 펩스타틴(pepstatin), 그리고 계란 흰자 또는 대두 트립신 저해제를 포함한다. 이들 및 다른 저해제들은 단독으로 혹은 조합하여 사용될 수 있다. 상기 저해제(들)는 비강 점막과 접촉하는 1회 투약형태의 표면에 코팅된 운반체, 예를 들어, 소수성 고분자에 결합될 수 있고, 혹은 생물학적 활성제와 조합하거나 분리되어 투여되는(예를 들어, 사전-투여되는) 제형으로 표면의 표면상 내에 결합된다.

저해제, 예를 들어, 본 발명의 조성물들 내에 선택적으로 결합되는 단백질 가수분해 효소 저해제의 양은 (a) 특정 저해제의 성질들, (b) (히드로겔 형성 단량체들과 공중합을 위하여 필요한 에틸렌의 불포화를 유도하도록 반응될 수 있는) 분자에 존재하는 기능성 기들의 숫자, 그리고 (c) 저해제 분자 내에 존재하는, 글리코사이드들과 같은 렉틴(lectin) 기들의 숫자에 따라서 가변될 것이다. 상기 양은 또한 투여받고자 하는 특정 치료제에도 의존할 수 있다. 일반적으로 말해서, 효소 저해제의 유용한 양은 제형(즉, 별도의 프로테아제 저해제 제형 또는 저해제 및 생물학적 활성제와 조합된 제형)의 약 0.1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 종종 약 0.2 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 그리고 더 일반적으로는 약 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml이다.

트립신 저해제의 경우, 적합한 저해제들은, 예를 들어, 아프로티 닌(aprotinin), BBI, 대두 트립신 저해제, 닭 오보뮤코이드(chicken ovomucoid), 닭 오보저해제(chicken ovoinhibitor), 인간 엑센딘 트립신 저해제, 카모스탯 메실레이트(camostat mesilate), 플라보노이드 저해제들(flavonoid inhibitors), 안티페인(antipain), 류펩틴, p-아미노벤자미딘, AEBSF, TLCK(tosyllysine chloromethylketone), APMSF, DFP, PMSF, 그리고 폴리(아크릴레이트) 유도체들로부터 선택될 수 있다. 키모트립신 저해의 경우, 적합한 저해제들은, 예를 들어, 아프로티닌, BBI, 대두 트립신 저해제, 키모스타틴, 벤질옥시카보닐-프로-Phe-CHO, FK-448, 닭 오보저해제, 당 비페닐보론산들 복합체들, DFP, PMSF, β-페닐프로피오네이트, 그리고 폴리(아크릴레이트) 유도체들로부터 선택될 수 있다. 엘라스타아제 억제의 경우, 적합한 억제제들은, 예를 들어, 엘라스타티널(elastatinal), 메톡시숙시닐-Ala-Ala-Pro-Val-클로로메틸케톤(MPCMK), BBI, 대두 트립신 저해제, 닭 오보저해제, DFP, 그리고 PMSF로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서의 사용을 위한 추가적인 효소 저해제들은 그들의 효력과 독성의 정도가 변화하는 광범위한 비단백질 저해제들로부터 선택된다. 아래에서 추가적인 더 상세히 설명되듯이, 기질들 또는 다른 송달 운반체들에 대한 이들 보조제들의 부동화, 또는 화학적으로 변형된 유사체들의 개발은 만나게 되는 독소 효과들을 감소시키거나 심지어는 제거하도록 쉽게 충족될 수 있다. 이러한 광범위한 후보자 그룹 중에서, 본 발명에서의 사용을 위한 효소 저해제들은 세린 프로테아제(serin proteases)(예를 들어, 트립신과 키모트립신)의 효력있고, 비가역적인 저해제들인 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP)와 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF)와 같 은 유기인산 저해제들이다. 이들 화합물들에 의한 아세틸콜린스테라제(acetylcholinesterase)의 추가적인 저해는 조절되지 않은 송달 환경들에서 이들을 매우 독성이 높게 만든다. 또 다른 후보 억제제, 4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드(AEBSF)는 DFP 및 PMSF에 상당하는 억제 활성을 가지지만, 눈에 띄는 독성은 덜하다. (4-아미노페닐)-메탄술포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(APMSF)는 트립신의 또 다른 효능있는 저해제이지만, 조절되지 않은 환경들에서는 독성이 있다. 이들 저해제들과 대비하여, 4-(4-이소프로필피페라디노카보닐)페닐 1,2,3,4-테트라하이드로-1-나프토에이트 메탄술포네이트(FK-448)는 효능있고 특정한 키모트립신의 저해제를 대표하는, 저독성 물질이다. 또한, 이러한 저해제 후보들의 비단백질 그룹의 대표들이자, 낮은 독성 위험을 나타내는 것으로는 카모스탯(carmostat) 메실레이트(N,N'-디메틸 카바모일메틸-p-(p'-구아니디노-벤조일옥시)페닐아세테이트 메탄-술포네이트)이다.

본 발명의 방법들과 조성물들에서의 사용을 위한 효소 억제제의 또 다른 유형은 아미노산들 및 특정 치료 화합물들의 효소의 분해와 간섭하는 변형 아미노산들이다. 이러한 관계에 있어서의 사용을 위하여, 아미노산들 및 변형 아미노산들은 실질적으로 비독성이고 저비용으로 생산될 수 있다. 그러나, 그들의 낮은 분자 사이즈와 좋은 용해도로 인하여, 그들은 쉽게 희석되어 점막 환경들에 흡수된다. 그럼에도 불구하고, 적절한 조건들 하에서, 아미노산들은 프로테아제 효소들의 가역적이고, 경쟁적인 저해제들로서 작용할 수 있다. 어떤 변형 아미노산들은 훨씬 더 강한 억제 활동을 보일 수 있다. 이러한 관계에 있어서 바람직한 변형 아미노산은 "천이-상태(transition-state)" 저해제로서 알려진다. 이들 화합물들의 강한 저해 활동은 천이-상태 기하형태에서 기질에 대한 그들의 구조적인 유사성에 기인하는 반면, 이들 화합물들은 일반적으로 기질 그 자체보다 효소의 활성 자리에 대한 훨씬 더 높은 친화도를 가지도록 선택된다. 천이-상태 저해제들은 가역적이고, 경쟁적인 저해제들이다. 이러한 유형의 저해제의 예들은 보로-류신(boro-leucine), 보로-발린(boro-valine) 그리고 보로-알라닌과 같은 α-아미노붕산 유도체들이다. 이들 유도체들에서 붕소 원자는 아미노펩티다아제들에 의한 그들의 가수분해 동안 펩티드들의 천이상태를 닮은 것으로 여겨지는 4면체의 보로네이트 이온을 형성할 수 있다. 이들 아미노산 유도체들은 효능있고 가역적인 아미노펩티다아제들의 저해제들이고, 보로-류신은 베스타딘보다 효소억제가 100배 이상 효과적이고 푸로마이신보다 1000배 이상 효과적인 것으로 보고된다. 강한 프로테아제 억제 활동이 보고되었던 또 다른 변형 아미노산은 아미노펩티다아제 N의 효소 활동을 저해하는 N-아세틸시스테인이다. 이러한 보조제는 또한 점액 확산 장벽의 효과들을 감소시키기 위하여 본 발명의 방법들과 조성물들에서 채용될 수 있는 점액용해 성질들을 보여준다.

본 발명의 병용투여 방법들 및 조합적인 제형들에서의 사용을 위한 또 다른 유용한 효소 저해제들은 펩티드들과 변형 펩티드 효소 저해제들로부터 선택될 수 있다. 이러한 류의 저해제들의 중요한 대표는 Bacillus licheniformis로부터 얻어진 고리형 도데카펩티드, 바시트라신이다. 이들 유형의 펩티드들 외에도, 디펩티드들과 트리펩티드들은 일부 프로테아제에 대하여 약하고, 비특정의 억제 활동을 보 인다. 아미노산들로 유추하여, 그들의 저해 활동은 화학적 변형들에 의하여 개선될 수 있다. 예를 들어, 포스핀산 디펩티드 유사체들은 또한 아미노펩티다아제들에 대하여 강한 저해 활동을갖는 "천이-상태" 저해제들이다. 보도에 따르면, 그들은 비강으로 투여된 류신 엔케팔린(leucine enkephalin)을 안정화하기 위하여 사용되었다. 천이 상태 유사체의 또 다른 예는 매우 효능있는 펩신의 억제제인 변형 펜타펩티드 펩스타틴이다. 몇몇 합성 유사체들의 저해 활동을 시험하는 것에 의한 펩스타틴의 구조적인 분석은 저해 활동에 대하여 책임있는 분자의 주요한 구조-기능 특징들을 보여주었다. 또 다른 특별한 유형의 변형 펩티드는 그들의 구조에서 말단에 위치된 알데히드 기능을 갖는 저해제들을 포함한다. 예를 들어, 키모트립신의 알려진 첫번째와 두번째의 특이성을 수행하는 서열 벤질옥시카보닐-Pro-Phe-CHO는 이러한 목표 프로테이나제의 효능있고 가역적인 저해제인 것으로 밝혀졌다. 말단에 위치된 알데히드 기능을 갖는 또 다른 저해제들, 예를 들어, 안티페인, 류펩틴, 키모스타틴 그리고 엘라스타티널의 화학적 구조들은 포스포아미돈, 베스타틴, 푸로마이신 그리고 아마스타틴과 같은 다른 알려지고, 가역적인 변형 펩티드 저해제들의 구조들처럼 이 기술에서 알려진다.

그들의 상당히 높은 분자량으로 인하여, 폴리펩티드 프로테아제 저해제들은 약물-운반체 기질에서의 집중된 송달에 대하여 더 작은 질량의 화합물들보다 더 많은 비난을 받을 수 있다. 본 발명의 제형들 및 방법들에서 프로테아제 저해를 위한 추가적인 시약들은 착화제들(complexing agents)의 사용을 포함한다. 이들 착화제들은 비강내 환경에게서(또는 예방적 또는 치료적 조성) 많은 프로테아제들을 위한 상호인자들인 2가 양이온들을 빼앗으므로써 효소 저해를 중재한다. 예를 들어, 적절한 농도로 병용투여되거나 조합적으로 제형화된 보조제들로서의 착화제들, EDTA와 DTPA는 선택된 프로테아제들을 저해하기에 충분할 것이고, 그리하여 본 발명에 따르는 생물학적 활성제들의 비강내 송달을 향상시킨다. 이런 류의 저해제들의 또 다른 대표적인 것들로는 EGTA, 1,10-페난트롤린(phenanthroline)과 하이드록시키놀린이다. 아울러, 킬레이트 2가 양이온들에 대한 그들의 성향으로 인하여, 이들 및 다른 착화제들은 직접적인 흡수촉진제들로서 본 발명에서 유용하다.

본 명세서의 다른 곳에서 더 상세히 주목되듯이, 본 발명의 병용투여, 멀티-프로세싱 및/또는 조합적인 제형 방법들 및 조성물들에서 효소 저해제들로서 다양한 고분자들, 특히 점막점착성 고분자들을 사용하는 것도 고려된다. 예를 들어, 폴리(아크릴산)과 폴리카보필과 같은 폴리(아크릴레이트) 유도체들은 트립신, 키모트립신을 포함하는, 다양한 프로테아제들의 활동에 영향을 줄 수 있다. 이들 고분자들의 저해 효과는 Ca^{2 +}와 Zn^{2 +}와 같은 2가 양이온들의 착물화를 기본으로 할 수 있다. 이들 고분자들은 위에서 설명된 것처럼 추가적인 효소 저해제들을 위한 콘쥬게이트(conjugate) 파트너들 또는 운반체들로서 작용할 수 있다는 것이 또한 고려된다. 예를 들어, 키토산-EDTA 콘쥬게이트가 개발되었는데 아연-의존성 프로테아제들의 효소 활동에 대한 강한 저해 효과를 보여주어서 본 발명에서 유용하다. 이러한 관계에 있어서 다른 효소 저해제들의 공유결합에 뒤따르는 고분자들의 점막점착성 성질들은 실질적으로 제대로 발휘되지 못하는 것으로 예상되지는 않고, 본 발명에 서 생물학적 활성제들을 위한 운송체로서 그러한 고분자들의 일반적 유용성도 감소하는 것으로 기대되지 않는다. 이와 반대로, 운송체와 점착성 기구에 의하여 제공되는 점막 표면 간 감소된 거리는 활성제의 전신순화전 대사를 감소시킬 것이고, 반면에 공유적으로 결합된 효소 저해제들은 독성 및 그에 의하여 야기되는 다른 부작용들뿐만 아니라 저해제들의 원치않는 희석 효과들을 감소시키면서 약물 송달의 자리에 집중적으로 남게 된다. 이와 같이, 병용투여된 효소 저해제의 효과적인 양은 희석 효과들의 배제로 인하여 감소될 수 있다.

본 발명의 점막 제형들 및 방법들에서 유용한, 예시적인 점막점착성 고분자-효소 저해제 착물들은 카복시메틸셀룰로오스-펩스타틴(항펩신 활동을 갖는); 폴리(아크릴산)-Bowman-Birk 저해제(항키모트립신); 폴리(아크릴산)-키모스타틴(항키모트립신); 폴리(아크릴산)-엘라스타티널(항엘라스타아제); 카복시메틸셀룰로오스-엘라스타티널(항엘라스타아제); 폴리카보필-엘라스타티널(항엘라스타아제); 키토산-안티페인(항트립신); 폴리(아크릴산)-바시트라신(항아미노펩티다아제 N); 키토산-EDTA(항아미노펩티다아제 N, 항카복시펩티다아제 A); 키토산-EDTA-안티페인(항트립신, 항키모트립신, 항엘라스타아제)을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

점액용해 및 점액제거제들 및 방법들

비강내 투여를 통한 생물학적 치료제들의 효과적인 송달은 점액층의 당단백질들과의 결합으로 인한 약물 손실 외에도 비강 점막의 보호적인 점액 라이닝을 넘는 감소된 전송율을 고려해야만 한다. 정상적인 점액은 물, 전해질, 뮤신, 거대분자들, 그리고 탈피 상피 세포들로 구성되는 점탄성의, 겔과 같은 물질이다. 점액은 주로 아래에 놓인 점막 조직들을 위한 세포보호 및 윤활 커버링으로서 작용한다. 점액은 비강 상피 그리고 다른 점막 상피들에 위치된 불규칙하게 분포되는 분비 세포들에 의해서 분비된다. 점액의 구조적 단위는 뮤신(mucin)이다. 비록 다른 거대분자들이 이러한 성질들에 기여할 수도 있겠지만, 이러한 당단백질은 주로 점액의 점탄성 성질에 책임이 있다. 기도 점액에서, 그러한 거대분자들은 숙주방어기전에도 중요한 역할을 하는 국소적으로 생산된 분비물들 IgA, IgM, IgE, 리소짐(lysozyme), 그리고 브론코트랜스포린(bronchotransferrin)을 포함한다.

본 발명의 병용투여 방법들은 비강내로 투여된 생물학적 치료제들의 흡수를 쉽게 하기 위하여 비강내 점막 표면들로부터 점액을 분해하거나, 얇게 또는 제거하도록 기능하는 효과적인 점액용해 또는 점액 제거제들이다. 이들 방법들에서, 점액용해 또는 점액제거제는 생물학적 활성제의 비강내 송달을 향상시키기 위한 보조 화합물로서 병용투여된다. 대안적으로, 점액용해 또는 점액 제거제의 효과적인 양은 본 발명의 다중처리 방법에서 처리제로서 결합되거나, 본 발명의 조합 제형에서 첨가제로서 결합되어, 비강내 점액의 장벽 효과를 감소시키므로써 생물학적 치료 화합물들의 비강내 송달을 향상시키는 개선된 제형을 제공한다.

다양한 점액 용해 또는 점액 제거제들이 본 발명에서의 결합을 위하여 이용가능하다. 그들의 작용 기전에 기반하여, 점액용해 및 점액 제거제들은 종종 다음의 그룹들: 뮤신 당단백질들의 단백질 코어(core)를 쪼개는 프로테아제들(예: 프로나제, 파페인(papain)); 점액단백질 이황화물 연결들을 쪼개는 설피드릴(sulfhydryl) 화합물들; 그리고 점액 내의 비공유결합들을 끊는 세정제들(예: Triton X-100, Tween 20)으로 분류된다. 이러한 관계에 있어서 추가적인 화합물들은 담즘 염들 및 계면활성제들, 예를 들어, 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 소듐 타우로디옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate), 소듐 글리코콜레이트, 그리고 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

점액의 구조적 붕괴를 야기하는 데 있어서 담즘 염들의 효용성은 디옥시콜레이트>타우로콜레이트>글리코콜레이트의 순서이다. 본 발명의 방법들에 따라서 비강내 송달을 향상시키기 위하여 점액 점성도 또는 점착성을 감소시키는 다른 효과적인 시약들은 예를 들어, 단쇄 지방산들, 그리고 N-아실콜라겐 펩티드들, 담즙 염들, 그리고 사포닌들과 같이 킬레이트화에 의하여 동작하는 점액용해제들을 포함하지만 이들에 한정되지는 않는다(후자는 점액층 구조를 유지하는데 있어서 중요한 역할을 하는 킬레이트화 Ca^{2 +} 및/또는 Mg^{2 +}에 의하여 부분적으로 기능한다).

본 발명의 방법들과 조성물들에서의 사용을 위한 추가적인 점액용해제들은 N-아세틸-L-시스테인(ACS), 기관지폐 점액이 점성도와 점착성 양자를 감소시키고 마취쥐들(7.5 내지 12.2%)에서 인간성장호르몬의 비강의 생물학적 이용율를 서서히 증가시키는 것으로 보고된 효력있는 점액용해제를 포함한다. 비강내 점액의 극성 점성도 및/또는 탄성도를 감소시키기 위하여, 이들 및 기타 점액용해 또는 점액제거제들은 비강점막과, 전형적으로는 약 0.2 내지 20 mM의 농도범위로, 생물학적 활성제의 투여와 병용적으로, 비강 점막과 접촉된다.

또 다른 점액용해 또는 점액 제거제들은 점액 당단백질에서 글리코시드 결합들을 쪼갤 수 있는 글리코시다제 효소들의 범위로부터 선택될 수 있다. 점액 효과가 제한될 수도 있지만, α-아밀라아제와 β-아밀라아제는 이런 종류의 효소들의 대표적인 것들이다. 대비적으로, 세균성 글리코시다제들은 이들 미생물들로 하여금 그들의 숙주들의 점액을 투과하도록 한다.

펩티드 및 단백질 치료술을 포함하여, 본 발명에서 대부분의 생물학적 활성제들을 갖고서 조합적인 사용을 위하여, 비이온화 세정제들은 일반적으로 점액용해 또는 점액제거제들로서도 유용하다. 이들 약제들은 전형적으로 치료용 폴리펩티드들의 활동을 변경하거나 실질적으로 손상시키지는 않을 것이다.

섬모대전제들 및 방법들( Ciliostatic Agents and Methods )

점액섬모 청소에 의한 어떤 점막 조직들(예: 비강 점막 조직들)의 자기 청소능이 보호기능(예를 들어, 먼지, 알레르겐(allergens) 및 세균들을 제거하기 위한)으로서 필요하기 때문에, 이 기능은 점막의 약물치료에 의하여 실질적으로 손상되지 말아야 한다는 사실이 일반적으로 고려되었다. 호흡기에서 점액섬모 수송은 감염들에 대항하는 특히 중요한 방어기전이다. 이 기능을 성취하기 위하여, 비강과 기도에서 섬모 운동은 흡입된 입자들과 미생물들을 제거하기 위하여 점액층을 점막을 따라 움직인다.

점막으로(예를 들어, 비강내로) 투여된 혈당조절펩티드, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 지속시간을 증가시키기 위하여 본 발명의 방법들과 조성물들은 섬모대전제들을 사용한다. 특히, 본 발명의 방법들과 조성물들에서 이들 약제들의 송달은 어떤 측면들에서는 점막 세포들의 섬모 활동을 가역적으로 저해하고, 점막으로 투여된 활성제(들)지속시간의 일시적, 가역적 증가를 제공하도록 기능하는 하나 이상의 섬모대전제들의 병용투여 또는 조합 제형에 의하여 상당히 향상된다. 본 발명의 이들 측면들에서의 사용을 위하여, 앞서 말한 그들의 활동이 특정이거나 간접적인 섬모대전 인자들은 혈당조절펩티드, 유사체들 및 모방양들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 송달을 받아들일 수 없는 부작용들 없이 향상시키는 점막의 투여 자리에서 점액섬모 청소능의 일시적인(예를 들어, 가역적인) 감소 또는 중단을 낳도록, 모두가 (농도, 지속도 및 송달 모드에 따라서) 적절한 양들로 섬모대전제들로서의 성공적인 채용을 위한 후보들이다.

더 상세한 측면들에서, 특정 섬모대전 인자는 하나 이상의 혈당조절펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고/또는 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들과 결합된 제형 또는 병용 투여 프로토콜로 채용된다. 문헌에서 분리되고 특징화된 다양한 세균성의 섬모대전 인자들은 본 발명의 실시예들에 채용될 수 있다. 세균성 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터의 섬모대전 인자들은 페나진 유도체, pyo 화합물(2-알킬-4-하이드록시퀴놀린), 그리고 람노리피드(rhamnolipid)(헤모리신(hemolysin)으로도 알려진)를 포함한다. 상기 pyo 화합물은 50 ㎍/ml의 농도에서 그리고 분명한 초미세구조의 장애들 없이 섬모정체(ciliostasis)를 생성하였다. 상기 페나진 유도체는 비록 실질적으로 400 ㎍/ml의 더 큰 농도에서 섬모의 운동성을 저해하였지만, 일부 막 붕괴를 야기하였다. 람노리피드에 대한 기관절 편(tracheal explants)들의 제한된 노출은 섬모정체로 귀결되었는데, 이는 변경된 섬모 막들과 연관된다. 람노리피드에 대한 더욱 광범위한 노출은 축사(axonemes)들로부터 다이네인 아암들(dynein arms)의 제거와 연관된다.

표면 활성제들 및 방법들

본 발명의 더욱 상세한 측면들에서, 하나 이상의 막 침투증강제들은 혈당조절펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 점막 송달을 향상시키기 위하여 본 발명의 점막 송달방법 또는 제형에 채용될 수 있다. 이러한 관계에 있어서 막 침투 증강제들은 (i) 계면활성제; (ii) 담즙염; (iii) 인지질 첨가제, 혼합된 미셜(micelle), 리포좀, 또는 운반체; (iv) 알콜; (v) 에나민(enamine); (vi) NO 도너 화합물; (vii) 장쇄 양친매성 분자;(viii) 작은 소수성 침투 증강제; (ix) 소듐 또는 살리실산 유도체; (x) 아세토아세트산의 글리세롤 에스테르; (xi) 시클로덱스트린 또는 베타-시클로덱스트린 유도체; (xii) 중쇄지방산; (xiii) 킬레이트화제; (xiv) 아미노산 또는 그의 염; (xv) N-아세틸아미노산 또는 그의 염; (xvi) 선택된 막 성분에 분해되는 효소; (xvii) 지방산 합성 저해제; (xiii) 콜레스테롤 합성 저해제; 또는 (xix) (i)-(xvii)에서 언급된 막침투 증강제들의 임의 조합으로부터 선택된다.

어떤 표면 활성제들은 본 발명의 점막 송달 제형들 및 방법들에서 점막 흡수 증강제들로서 쉽게 결합된다. 병용 투여되거나 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들과 조합하여 제형화될 수 있는 이들 약제들은 알려진 계면활성제들의 넓은 집단으로부터 선택될 수 도 있다.

계면활성제들은 일반적으로 세 가지 종류: (1) 비이온성 폴리옥시에틸렌 에스테르들; (2) 소듐 글리코콜레이트(SGC) 및디옥시콜레이트(DOC)와 같은 담즙산염들; 그리고 (3) 소듐 타우로디하이드로푸시데이트(STDHF)와 같은 푸시드산의 유도체들로 분류된다. 이들 다양한 표면 활성제들의 종류들의 작용 기전은 전형적으로 생물학적 활성제의 가용화를 포함한다. 종종 응집체들을 형성하는 단백질들과 펩티드들의 경우, 이들 흡수 촉진제들의 표면 활성 성질들은 계면활성제가 코팅된 단량체들과 같은 더 작은 단위들이 더 쉽게 용액으로 유지되도록 단백질들과 상호작용을 허용한다. 다른 표면 활성제들의 예들은 L-α-포스파티딜콜린 디데카노일(Phosphatidylcholine Didecanoyl)(DDPC), 폴리소베이트 80 및 폴리소베이트 20이다. 추측컨대, 이들 단량체들은 응집체들보다 더 이송가능한 단위들이다. 제2 잠재적 기전은 점막 환경에서 프로테아제들에 의한 단백질 가수분해로부터 펩티드 또는 단백질의 보호이다. 보도에 따르면 담즙산염들 및 일부 푸시드산 유도체들 양자는 단백질 흡수를 향상시키는데 요구되는 농도들보다 작거나 같은 농도에서 비강의 균질현탁액들에 의하여 단백질의 가수분해를 억제한다. 이러한 프로테아제 저해작용은 특히 짧은 생물학적 반감기들을 갖는 펩티드들에 대하여 중요할 수 있다.

이처럼, 표면 활성제들의 일부 예들은 비이온성 폴리옥시에틸렌 에테르, 푸시드산 및 그의 유도체, 소듐 타우로디하이드로푸시데이트, L-α-포스파티딜콜린 디데카노일, 폴리소베이트 80, 폴리소베이트 20, 폴리에틸렌 글리콜, 세틸 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 라놀린 알코올, 소비탄 모노올레이트, 그리고 이들의 혼합물들을 포함한다.

점성도 증강제들

점성도 증강제들 또는 서방형제제들은 투약 제형 및 흡수로부터 약물의 방출율에 영향을 미칠 수 있다. 약제학적으로 타당한 점성도 증강제들로서 작용할 수 있는 물질들의 일부 예들은 젤라틴; 메틸셀룰로오스(MC); 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC); 캅고시메틸셀룰로오스(CMC); 셀룰로오스; 녹말; 헤타 녹말; 폴록사머들(poloxamers); 플루오닉스(pluonics); 소듐 CMC; 소비톨; 아카시아; 포비돈; 카보머(carbomer); 폴리카보필; 키토산; 키토산 마이크로스피어; 알기네이트 마이크로스피어; 키토산 글루타메이트; 암버라이트 레진(amberlite resin); 히알우로난(hyaluronan); 에틸 셀룰로오스; 말토덱스트린 DE; 드럼건조식 옥수수 전분(DDWM); 붕해가능한 전분 마이크로스피어(DSM); 디옥시클리코콜레이트(GDC); 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC); 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC); 미소결정질 셀룰로오스(MCC); 폴리메타아크릴산 및 폴리에틸렌 글리콜; 술포부틸에테르 B 시클로덱스트린; 교차결합된 엘덱소머 전분 바이스피어(cross-linked eldexomer starch bisphere); 소듐타우로디하이드로푸시데이트(STDHF); N-트리메틸 키토산 클로라이드(TMC); 붕해된 전분 마이크로스피어들; 암버라이트 레진; 키토산 나노파티클들; 스프레이 건조된 크로스포비돈(crospovidone); 스프레이 건조된 덱스트란 마이크로스피어들; 스프레이 건조된 미소결정 셀룰로오스; 그리고 교차결합된 엘덱소머 전분 마이크로스피어들이다. Ugwoke 등, Adv . Drug Deliv . Rev . 29:1656-57, 1998에 있는 다른 점성도 증강제들은 참조로서 결합된다.

지방산의 붕해 효소들 및 저해제들 그리고 콜레스테롤 합성

본 발명의 관련된 측면들에서, 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들 그리고 모방양들, 그리고 점막 투여를 위한 다른 생물학적 활성제들은 제형화되거나 붕해 효소들, 또는 신진대사 자극제 또는 지방산, 스테롤들 또는 다른 선택된 상피 장벽 성분들의 합성 저해제로부터 선택된 침투 증강제와 병용투여된다(미국특허번호 6,190,894). 예를 들어, 포스포리파아제(phospholipase), 하이아루로니다아제(hyaluronidase), 그리고 콘드로이티나아제(chondroitinase)는 점막 장벽에 대한 비가역적 손상을 야기하지 않고서 혈당 조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약, 그리고 다른 생물학적 호라성제의 점막 침투를 증강시키기 위하여 채용될 수 있다. 일실시예에서, 콘드로이티나아제는 여기에서 제공되는 방법 또는 조성물에서 점막의 침투능 장벽의 당단백질 또는 당지질 성분들을 변경하여 혈당 조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 점막 흡수를 향상시키기 위하여 채용된다.

점막 장벽 성분들의 합성 저해제들에 대하여, 유리 지방산들은 20-25 중량%의 상피 지질들을 차지한다는 사실이 주목된다. 유리지방산들의 생합성에서 2가지 속도제한효소들은 아세틸 CoA 카복실라아제와 지방산 신세타아제이다. 일련의 단계들을 통하여, 유리지방산들은 신진대사에 의하여 인지질들로 변화된다. 이처럼, 본 발명의 방법들과 조성물들에서의 사용을 위한 유리지방산 합성 및 신진대사의 저해제들은 5-테트라데실록시-2-푸란카복실산(TOFA)와 같은 아세틸 CoA 카복실라아제의 저해제들; 지방산 신세타아제의 저해제들; 고미신 A, 2-(p-아밀신아밀)아미노-4-클 로로벤조산, 브로모페나실 브로마이드, 모드알라이드(monoalide), 7,7-디메틸-5,8-아이코사디엔산(7,7-dimethyl-5,8-eicosadienoic acid), 니세고린(nicergoline), t세파란틴(cepharanthine), 니카디핀(nicardipine), 쿼세틴(quercetin), 디부티릴-시클릭 AMP, R-24571, N-올레일에탄올아민, N-(7-니트로-2,1,3-벤족사디아졸-4-일)포스포스티딜 세린, 시클로스포린 A, 디부카인, 프레닐아민을 포함하는 국소마취제들, 올-트랜 및 13-시스-레티노산과 같은 레티노이드들, W-7, 트리플루오페라진, R-24571 (calmidazolium), 1-헥사도실-3-트리플루오로에틸 글리세로-sn-2-포스포멘톨 (MJ33)과 같은 포스포리파아제 A의 저해제들; 니카디핀(nicardipine), 베라파밀(verapamil), 딜티아젬(diltiazem), 니페디핀(nifedipine), 및 니모디핀(nimodipine)을 포함하는 칼슘 경로 차단제들; 퀴나크린, 메파크린, 클로로퀸, 그리고 하이드록시클로로퀸을 포함하는 말라리아 예방약들; 프로파나롤 및 라베타롤을 포함하는 베타 차단제들; 칼모두린 길항제들; EGTA; 티머졸(thimersol); 덱타메타손(dexamethasone) 및 프레드니솔론(prednisolone)을 포함하는 글루코코르티코스테로이드들; 그리고 인도메타신과 나프록센을 포함하는 비스테로이드성 항염증제들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

유리 스테롤들, 주로 콜레스테롤은 상피 지질들의 20-25 중량%를 차지한다. 콜레스테롤의 생합성에서 속도제한효소는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴(HMG) CoA 리덕타아제(reductase)이다. 본 발명의 방법들 및 조성물들에서의 사용을 위한 콜레스테롤 합성 저해제들은 콜레스테롤 올레이트, 콜레스테롤 설페이트 및 포스페이트와 같은 다른 HMG CoA 리덕타아제 저해제들, 그리고 25-OH- 그리고 26-OH-콜레스 테롤과 같은 산소결합된 스테롤들뿐만 아니라 심바스타틴(simvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 플ㄹ루인도스타틴(플루바스타틴), 프라바스타틴, 메바스타틴과 같은 (HMG) CoA 리덕타아제의 경쟁적인 저해제들; 스쿠알렌 신세타아제의 저해제들; 스쿠알렌 에폭시다아제의 저해제들; 22,25-디아자콜레스테롤, 20,25-디아자콜레스테놀, AY9944, 및 트리파라놀과 같은 DELTA7 또는 DELTA24 리덕타아제의 저해제들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

지방산 합성 저해제들 또는 스테롤 합성 저해제들 각각은 하나 이상의 혈당 조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들과 병용투여되거나 조합하여 제형화되어 상기 활성제(들)의 향상된 상피 침투를 달성할 수 있다. 점막 송달을 위한 치료 제형 또는 보조제형에서 스테롤 저해제를 위한 효과적인 농도 범위는 일반적으로 총중량에 대하여 약 0.0001 중량%부터 약 20중량%까지이고, 더욱 전형적으로는, 약 0.01 중량%부터 약 5 중량%까지이다.

산화질소 공여체 제제들 및 방법들

본 발명의 다른 관련 측면들에서, 산화질소 공여체(NO donor)는 하나 이상의 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 점막 송달을 향상시키기 위한 막침투 증강제로서 선택된다. 다양한 NO 공여체들이 이 기술에서 알려져 있고 본 발명의 방법들과 제형들에서 효과적인 농도들에서 유용하다. 예시적인 NO 공여체들은 니트로글리세린, 니트로프루시드, NOC5[3-(2-하이드록실-2-니트로소하이드라지노)-에탄아민], SNAP[S-니트로소 -N-아세틸-DL-페니실아민], NORI 그리고 NOR4를 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명의 방법들 및 조성물들에서, 선택된 NO 공여체의 효과적인 양은 점막 상피내로 또는 점막 상피를 통하여, 하나 이상의 혈당 조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들과 병용투여되거나 조합하여 제형화된다.

상피 결합 구조 및/또는 생리작용을 조절하기 위한 작용제들

본 발명은 여기에서 개시된 점막 송달 증강제들과 조합하여 점막 송달을 위한 약제학적 제제로 제형화된 하나 이상의 혈당조절펩티드들, 단백질들, 유사체들 또는 모방약들, 그리고/또는 다른 생물학적 활성제들을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

투과제(permeabilizing agent)는 전형적으로는 대상의 점막 상피면에서 상피의 접합 구조 및/또는 생리기능을 조절하므로써 점막 상피의 세포간 수송을 가역적으로 증진시킨다. 이러한 효과는 전형적으로는 이웃하는 상피 세포들의 상피막 점착 단백질들간 동형 또는 이형 결합의 삼투제에 의한 저해를 포함한다. 이러한 동형 또는 이형 결합의 봉쇄를 위한 표적 단백질들은 다양한 관련 접합 점막성 분자들(JAMs), 옥클루딘(occludins) 또는 클라우딘(claudins)으로부터 선택될 수 있다. 이것의 예들은 항체들, 항체들, 이들 단백질들의 세포외 영역들에 결합되는 항체 절편들 또는 단쇄 항체들이다.

또 다른 추가적인 상세한 실시예들에서, 본 발명은 점막 상피의 세포간 전송을 향상시키기 위한 침투가능 펩티드들 및 펩티드 유사체들 그리고 모방약들을 제 공한다. 대상 펩티드들과 펩티드 유사체들 그리고 모방약들은 포유동물 대상에게서 상피 접합 구조 및/또는 생리기능을 조절하므로써 본 발명의 조성물들 및 방법들에서 전형적으로 작용한다. 어떤 실시예들에서, 펩티드들, 펩티드 유사체들, 그리고 모방약들은 접합 점막 분자(JAM), 오클루딘, 또는 클라우딘으로부터 선택된 상피막 점막 단백질의 동종 및/또는 이종 결합을 효과적으로 저해한다.

광범위하게 연구되었던 그러한 작용제 한 가지는 "zonula occludens toxin"(ZOT)로서 알려진 Vibrio cholerae로부터 유래된 세균성 독소이다. 이 독소는 장점막 침투능의 증가를 조정하고 감염된 대상들에서 설사를 포함하는 질병 징후들을 야기한다. 파사노(Fasano) 등, Proc . Nat . Acad . Sci ., U.S.A. 8:5242-5246, 1991. 토끼 회장 점막(rabbit ileal mucosa)에 대하여 시험될 때, ZOT는 세포간 단단한 결합들의 구조를 변화시키므로써 장의 투과성을 증대시켰다. 더 최근에는, ZOT가 장점막들에서 단단한 결합들을 가역적으로 열 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 미국특허번호 5,908,825.

본 발명의 방법들 및 조성물들에서, ZOT 활성도의 작용제 또는 길항제들로서 기능하는 ZOT의 다양한 유사체들과 모방약들뿐만 아니라 ZOT는 비강점막으로 그리고 비강점막을 가로질러서 세포사이를 통과하는 흡수를 증가시키므로써 생물학적 활성제들의 비강내 송달을 향상시키기 위하여 유용하다. 이러한 관계에 있어서, 전형적으로 ZOT는 접합 단백질 ZO1의 변경된 국소화에 의하여 표시되는 단단한 접합들의 구조적 재조직화를 야기하므로써 작용한다. 본 발명의 이들 측면들에서, ZOT는 실질적인 부작용들 없이 비강점막의 투과성을 가역적으로 증가시키므로써, 활성 제의 흡수를 상당히 증진시키기 위한 효과적인 양으로 생물학적 활성제와 병용투여되거나 조합적으로 제형화된다.

혈관확장제들 및 혈관확장방법들

본 발명의 병용투여 및 조합 제형 방법들 및 조성물들에서 이익적인 유용성을 보여주는 또 다른 부류의 흡수증진제들은 혈관확장 화합물들, 더 구체적으로는 혈관확장제들이다. 본 발명에서 이들 화합물들은 점막하 혈관의 구조 및 생리기능을 조절하여 점막 상피 및/또는 특정 표적 조직들 또는 부분들(예를 들어, 전신순환 또는 중앙신경계) 내로 또는 통하여 혈당조절펩티드, 유사체들 및 모방약들, 그리고 다른 생물학적 활성제들의 수송율을 증가시키도록 기능한다.

본 발명에서의 사용을 위한 혈관확장제들은 전형적으로는 세포질의 칼슘 증가, 산화질소의 증가 또는 미오신 라이트 체인 키나아제(myosin light chain kinase)를 억제하므로써 점막하 혈관 이완을 야기한다. 이들 혈관확장제들은 일반적으로 9개의 부류들; 칼슘 길항제들, 칼륨 채널 오프너들(potassium channel openers), ACE 저해제들, 앤지오텐신-II 수용체 길항제들(antagonists), α-아드레날린 작용의 그리고 이디다졸 수용체 길항제들, β1-아드레날린 작용의 효현제들(agonists), 포스포디에스테라아제 억제제들, 에이코사노이드들(eicosanoids) 및 NO 공여체들로 분류된다.

화학적 차이들에도 불구하고, 칼슘 길항제들의 약물동력학적 성질들은 유사하다. 체순환으로의 흡수는 높고, 그러므로 이들 작용제들은 간에 의한 상당한 1차 통과 신진대사를 겪어서 약물동력학의 개별적인 변화로 귀결된다. 디하이드로피리 딘 타입(암로디핀, 펠로디핀, 이스라디핀, 닐바디핀, 니솔디핀 및 니트렌디핀)의 더 새로운 약물들을 제외하고, 칼슐 길항제들의 반감기는 짧다. 그러므로, 이들 중 많은 것들에 대하여 효과적인 약물 농도를 유지하는 것은 다른 부분에서 설명되듯이 다중 투여, 또는 조절된 방출 제형들에 의한 송달을 요구할 수도 있다. 칼륨 채널 오프너 미녹시딜(minoxidil)로 하는 치료는 잠재적인 부작용들로 인하여 투여 방법과 레벨이 제한될 수도 있다.

ACE 저해제들은 엔지오텐신-I의 앤지오텐신-II로의 변환을 방지하고, 레닌(renin) 생성이 증가될 때 가장 효과적이다. ACE는 효능있는 내인성의 혈관확장제 브래드키닌(bradykinin)을 불활성화하는 키니나아제-II(kininase-II)와 동일하기 때문에, ACE 저해는 브래드키닌 붕해의 감소를 야기한다. ACE 저해제들은 동물 모델들에서 심장 섬유증과 심실 비대증을 방지하고 바꾸어주므로써 심장보호 및 심장회복의 효과들의 추가적인 장점들을 제공한다. 대부분의 ACE 저해제들의 지배적인 제거 통로는 신장 배설을 통한다. 그러므로, 신장장애는 제거능의 감소와 관련되고 25 내지 50%의 투약 감소는 심한 신장장애에 대처능이 있는 환자들에게서 권유된다.

NO 공여체들에 대해서는, 이들 화합물들은 점막 투과성에 대한 그들의 추가적인 효과들 때문에 본 발명에서 특히 유용하다. 위에서 언급된 NO 공여체들 외에도, NO/nucleophiles 또는 NONOates라고 불리우는 구핵원자(nucleophile)들을 갖는 NO의 착물들은 생리적인 pH에서 수용액에서 용해될 때 자발적으로 그리고 효소에 의하지 않고서 NO를 방출한다. 대비적으로, 니트로글리세린과 같은 니트로 혈관확 장제들은 NO 방출을 위한 특정 효소 활동을 요구한다. NONOates는 정의된 화학양론을 갖고서 그리고 디에틸아민/NO에 대하여 <3분부터 디에틸에네트리아민/NO(DETANO)에 대하여 약 20 시간까지의 범위를 갖는 예측가능한 속도로 NO를 방출한다.

본 발명의 어떤 방법들 및 조성물들에서, 선택된 혈관확장제는 대상자의 표적 조직 또는 부분(예를 들어, 간, 간문맥, CNS 조직 또는 유액, 또는 혈장)에 도달하는 활성제(들)의 점막 흡수를 증진시키는 효과적인 양으로 하나 이상의 혈당 조절 펩티드, 유사체들 및 모방약들, 그리고 다른 생물학적 활성제(들)과 병용투여되거나(예를 들어, 전신적으로나 비강내로, 동시에 또는 조합적으로 효과적인 일시적 연합으로) 혹은 조합적으로 제형화된다.

선택적 이송 증강제들 및 증강방법들

본 발명의 조성물들 및 송달 방법들은 선택적으로는 하나 이상의 생물학적 활성제들의 수소을 쉽게 하는 선택적 수송 증강제를 결합한다. 이들 수송 증강제들은 대상체의 표적 조직 또는 부분(예를 들어, 점막 상피, 간, CNS 조직 또는 유액, 또는 혈장)에 도달하는 활성제(들)의 점막 송달을 향상시키기 위하여 점막 수송 장벽들을 가로질러서 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성제(들)의 송달을 병용적으로 향상시키는 하나 이상의 혈당조절 펩티드 단백질들, 여기에서 개시된 유사체들 및 모방약들과 조합 제형이나 병용투여 프로토콜로 채용될 수 있다. 대안적으로, 수송 증강제들은 추가적인 생물학적 활성제의 향상된 송달을 갖거나 갖지 않고서, 하아 이상의 혈당 조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들의 점막 송달을 직 접 향상시키기 위하여 조합적 제형 또는 병용 투여 프로토콜로 채용될 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에서의 사용을 위한 예시적인 선택 수송 증강제들은 글리코시드들, 당함유 분자들, 그리고 구체적으로는 상피 수송 장벽 성분들과 상호작용하는 것으로 알려진, 렉틴 결합제들과 같은 결합제들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 수용체 매개 상호작용들에 의하여 세포면 당 모이어티들에게 결합하는, 다양한 식물과 세균성 렉틴들을 포함하는 특정한 "생점착성(bioadhesive)" 리간드들은 본 발명에서 생물학적 활성제들의 점막의, 예를 들어, 비강의 송달을 향상시키기 위한 운반체들 또는 접합된 수송 매개체들로서 채용될 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 어떤 생점착성 리간드들은 특별히 만들어진 세포의 수송 과정들(세포내 이입(endocytosis), 또는 세포송달작용(transcytosis))에 의하여 점착성 리간드의 선택적 흡수를 유발하는 생물학적 신호들의 상피 표적 세포들로의 전송을 매개할 것이다. 그러므로, 이들 수송 매개체들은 점막 상피들 내로 그리고/또는 점막 상피들을 통하여 하나 이상의 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고 다른 생물학적 활성제(들)의 흡수를 자극하거나 직접 선택하는 "운반체 시스템"으로서 채용될 수 있다. 이들 및 다른 선택적 수송 증강제들은 본 발명에서 거대분자 생물의약제제들(특히 펩티드들, 단백질들, 올리고뉴클레오티드들 및 폴리뉴클레오티드 벡터들)의 점막 송달을 상당히 증진한다. 렉틴류는 배아세포들의 당단백질들 및 당지질들의 표면 상에서 발견되는 특정 당들에 결합되는 식물 단백질들이다. 렉틴류의 농축용액들은 'mucotractive' 효과를 가지고, 다양한 연구들은 점막 표면들을 가로 질러 렉틴류 와 렉틴 콘쥬게이트들(예: 콜로이드성 금 입자들과 접합된 콘카나발린 A)의 빠른 수용체 매개 세포내 이입(RME)을 보여주었다. 추가적인 연구들은 렉틴에 대한 흡수 기전들이 생체내를 표적으로 하는 장의 약물을 위하여 이용될 수 있다는 것을 보고하였다. 이들 연구들의 어떤 부분에서는, 폴리스티렌 나노입자들(500 nm)은 토마토 렉틴에 공유적으로 결합되었고 쥐들에게로의 경구 투여후 개선된 전신 흡수를 이루었다고 보고되었다.

식물 렉틴들 외에도, 미생물 점착 및 침입 인자들은 본 발명의 점막 송달 방법들 및 조성물들에서 점착성의/선택적인 수송 운반체들로서의 사용을 위한 풍부한 후보자원들을 제공한다. 세균의 점착 과정들을 위하여 두 가지 성분들, 즉 세균의 'adhesin'(집착 또는 콜론화 인자)과 숙주 세표 표면 위의 수용체가 필요하다. 점막 감염들을 야기하는 세균들은 스스로 상피표면에 달라붙기 전에 점액층을 침투할 필요가 있다. 비록 다른 세포 표면 성분들이 이 과정에 참여할 수도 있겠지만, 이러한 부착은 보통 세균의 섬모 또는 선모 구조들에 의하여 매개된다. 점착성 세균들은 신호 형질도입 기전들(독소들의 도움을 갖고서 혹은 도움없이)을 통하여 표적 세포 내에서 일련의 생화학적 반응들의 증식 및 착수에 의하여 점막 상피들을 이식한다. 이들 침입성 기전들과 관련하여, 다양한 세균들 및 바이러스들에 의하여 최초로 생성되는 다양한 생물점착성 단백질들(예를 들어, invasin, internalin)이 알려져 있다. 이들은 숙주 종들 및 심지어는 특별한 표적 조직들에 대한 인상적인 선택성을 갖고서 그러한 미생물들의 세포외 부착을 허용한다. 그러한 수용체-리간드 상호작용에 의하여 전송된 신호들은 세포내 이입 또는 세포송달과정에 의하여 상피 세포들 내로, 궁극적으로는 상피세포를 통하여 온전하게 살아있는 미생물들의 수송을 야기한다. 그러한 천연 발생 현상들은 생물학적 활성 화합물들의 점막 상피세포들 내로의 또는 가로질러서 및/또는 약물 작용의 다른 지정된 표적 자리들까지의 향상된 송달을 위하여 여기에서의 가르침들에 따라서 이용된다(예를 들어, adhesin을 갖는 혈당조절펩티드와 같은 생물학적 활성제들을 착물화하므로써).

특정한, 렉틴과 유사한 방법으로 상피표면들에 결합되는 다양한 세균성 및 식물 독소들은 본 발명의 방법들과 조성물들에서도 유용하다. 예를 들어, 디프테리아 독소(DT)는 RME에 의하여 빠르게 숙주 세포들에게 들어간다. 마찬가지로, 대장균의 이열성 독소의 B 아단위는 매우 특정한, 렉틴과 유사방법으로장의 상피 세포들의 브러시 보더(brush border)에 결합된다. 장세포들의 기저측면측까지 이러한 독소와 트랜스사이토시스(transcytosis)의 흡수는 생체내와 생체외에서 보고되었다. 다른 연구들은 대장균에서 디프테리아 독소의 막 내외의 영역을 말토오스 결합 용융 단백질로서 표현하였고 하이-Mw 폴리-L-리신에게 화학적으로 결합하였다. 결과적인 착물은 리포터 유전자의 내재화를 매개하기 위하여 성공적으로 사용된다. 이들 예들 외에도, Staphylococcus aureus는 초항원과 독소 양자로 작용하는 단백질들의 집합(예를 들어, staphylococcal enterotoxin A (SEA), SEB, toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1))을 생성한다. 이들 단백질들과 관련된 연구들은 Caco-2 세포들에서 SEB와 TSST-1의 투여량 의존적이고, 쉬워진 세포송달작용을 보고하였다.

바이러스성 적혈구응집소들은 본 발명의 방법들과 조성물들에서 생물학적 활 성제들의 점막 송달을 쉽게 하는 또 다른 유형의 수송제를 포함한다. 많은 바이러스성 감염들에서 초기 단계는 표면 단백질들(적혈구응집소들)이 점막 세포들에게 결합하는 것이다. 이들 결합 단백질들은 로타바이러스, 바리셀라 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 아데노바이러스, 포테이토 리프롤 바이러스, 그리고 레오바이러스를 포함하는 대부분의 바이러스들에 대하여 구별되었다. 이들 및 다른 예시적인 바이러스성 적혈구응집소들은 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성제(들)의 점막 송달을 병용적으로 향상시키기 위하여, 여기에서 개시된 하나 이상의 혈당 조절 펩티드, 유사체들 및 모방약들과 조합적인 제형(예를 들어, 혼합물 또는 콘쥬게이트 제형)으로 채용되거나 병용 투여 프로토콜로 채용된다. 대안적으로, 바이러스성 적혈구응집소들은 추가적인 생물학적 활성제의 향상된 송달을 갖거나 갖지 않고서, 하나 이상의 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들, 및 모방약들의 점막 송달을 직접 향상시키기 위하여 조합적 제형 또는 병용 투여 프로토콜로 채용될 수 있다.

다양한 내인성의, 선택적인 수송 매개 인자들 또한 본 발명에서의 사용을 위하여 이용될 수 있다. 포유동물 세포들은 정의된 부분들에 대한 특정 기질들과 표적의 내재화를 쉽게 하기 위한 기전의 구분을 개발하였다. 집합적으로, 막 변형들의 이들 과정들은 '엔도사이토시스'라고 명명되고 파고사이토시스(phagocytosis), 피노사이토시스(pinocytosis), 수용체 매개 엔도사이토시스(clathrin-매개 RME), 그리고 포토사이토시스(potocytosis)(non-clathrin-매개 RME)를 포함한다. RME는 이름이 의미하는 것처럼, 다양한 리간드들이 세포 표면 수용체들에게 결합하고 이후에 내재되어 세포 내에서 거래된다. 많은 세포들에서, 엔도사이토시시의 과정은 너무 활발하여 전체 막 표면은 내재화되고 30분 이내에 대체된다. 수용체들의 두 부류들이 세포막에서 그들의 방위를 기준으로 제시되는데, 타입 I의 아미노 말단은 막의 세포외측에 위치되고, 반면에 타입 II 수용체들은 세포내 환경에서 동일한 단백질 꼬리를 가진다.

본 발명의 또 다른 실시예들은 점막 송달된 생물학적 활성제들의 RME의 운반체 또는 흥분제로서 트랜스페린을 이용한다. 트랜스페린, 즉 80 kDA 철분 수송 당단백질은 RME에 의하여 세포들 내로 효율적으로 흡수된다. 트랜스페린 수용체들은 적아구들 및 많은 종류의 종양들 위의 증가된 개체수들에서 대부분의 증식 세포들의 표면 상에서 발견된다. 트랜스페린(Tf)과 트랜스페린 콘쥬게이트들의 트랜스사이토시스는 보도에 따르면 Brefeldin A (BFA), 균류의 대사산물의 존재시에 향상된다. 이처럼, 당조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들을 포함하는 생물학적 활성제들의 수용체 매개 수송을 증진시키기 위하여, 수용체 매개 수송을 자극하는 BFA와 다른 작용제들은 본 발명의 방법들에서 조합적으로 제형화되고(예를 들어, 콘쥬게이트되고) 그리고/또는 병용투여되는 작용제들로서 채용될 수 있다.

고분자 운송체들 및 방법들

본 발명의 어떤 측면들에서, 당조절 펩티드 단백질들, 유사체들, 및 모방약들, 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들, 그리고 위에서 설명된 것과 같은 송달 증진제들은 운반체 또는 염기로서 기능하는 생물양립적인 고분자를 포함하는 점막(예: 비강) 투여 제형과 개별적으로나 조합적으로 결합된다. 그러한 고분자 운반체들은 여러 고분자 형태들 중에서 고분자 분말들, 기질들 또는 미립자 운송체들을 포함한다. 상기 고분자는 식물, 동물, 또는 합성원으로 이루어질 수 있다. 종종, 상기 고분자는 교차결합된다. 추가적으로, 이들 송달 시스템에서, 당조절 펩티드, 유사체 또는 모방약은 고분자에 공유적으로 결합되어 간단한 이스팅(isting)에 의하여 상기 고분자로부터 분리될 수 없게 되는 식으로 기능화될 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 고분자는 효소들의 저해제 또는 생물학적 활성제(들) 및/또는 송달 증진제(들)을 붕해하거나 불활성화할 수 있는 다른 작용제들을 갖고서 화학적으로 변형된다. 어떤 제형들에서, 상기 고분자는 부분적으로 혹은 완전히 물에 녹지 않지만, 물에 부풀수 있는 고분자, 예를 들어, 하이드로겔이다. 본 발명의 이러한 측면에서 유용한 고분자들은 바람직하게는 물에 상호작용하고 그리고/또는 원래 친수성이어서 상당한 양을 물을 흡수하고, 물과 평행상태에 도달하는데 충분한 시간 주기동안 물 또는 수용성 매체들과 접촉하도록 놓여질 때 이들은 종종 하이드로겔들을 형성한다. 더 상세한 실시예들에서, 상기 고분자는 과다한 물과 접촉하게 놓여질 때, 상온에서 물에 노출될 때의 평행상태에서 물 중량의 적어도 두 배를 흡수하는 하이드로겔이다. 미국특허번호 6,004,583.

생물붕해가능한 고분자들을 기본으로 하는 약물 송달 시스템들은, 가수분해 또는 비독성 분자들로의 효소 작용 중 어느 하나에 의하여 그러한 시스템이 고장나기 때문에 수많은 생물치료적 응용들에서 선호된다. 붕해속도는 생물분해가능한 고분자 기질의 조성을 조작하므로써 조절된다. 그러므로, 이들 유형의 시스템들은 생물학적 활성제들의 장기간 방출을 위한 어떤 설정들에서 채용될 수 있다. 폴리(글리콜산) (PGA), 폴리-(락트산) (PLA), 그리고 폴리(D,L-lactic-co-글리콜산) (PLGA)와 같은 생물붕해가능한 고분자들은, 이들 고분자들의 붕해 생성물들이 낮은 독성을 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에, 가능한 약물 송달 운반체들로서 상당한 관심을 받았다. 신체의 정상적인 신진대사 기능동안, 이들 고분자들은 이산화탄소와 물로 붕해된다. 이들 고분자들은 또한 뛰어난 생물양립성을 보여주었다.

선택적 송달 증진제들뿐만 아니라 혈당조절 펩티드, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 생물학적 활동을 연장하기 위하여, 이들 작용제들은 고분자 기질들, 예를 들어, 폴리오르소에스테르(polyorthoesters), 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 또는 폴리에스테르들에게로 결합될 수 있다. 이는 활동을 느리게 하고, 예를 들어, 고분자 소지의 붕해에 의하여 결정되듯이 활성제의 방출을 느리게 한다. 합성 고분자들 내의 생물치료 분자들의 캡슐화는 저장 및 송달동안 이들을 안정화시킬 수도 있지만, 고분자 기반의 방출 기술의 가장 큰 장애는 종종 열, 초음파분해 또는 유기 용매들을 포함하는 제형화 과정들 동안 치료 분자들의 활동 손실이다.

본 발명에서의 사용을 위하여 고려된 흡수촉진 고분자들은, 변경들, 변형들 또는 혼합(blending)이 물 흡수, 하이드로겔 형성, 그리고/또는 유용한 응용을 위한 화학적 안정성과 같은 원하는 성질들에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 이들 물질들의 서로간 혼합 또는 다른 고분자들과의 혼합뿐만 아니라, 다른 천연 발생 또는 합성 고분자들, 검들, 레진들, 그리고 다른 작용제들 외에도, 앞서 언급한 유형의 고분자들의 유도체들 그리고 화학적 또는 물리적으로 변형된 형태들을 포함할 수 있다. 본 발명의 더 상세한 측면들에서, 나일론, 아크릴란(acrylan) 그리고 다 른 정상적인 소수성 합성 고분자들과 같은 고분자들은 수용성 매체에서 수팽윤성이 되고 그리고/또는 안정한 겔들을 형성하는 반응에 의하여 충분히 변형될 수도 있다.

본 발명의 흡수증진 고분자들은 다음의 비닐 단량체들, 즉 아크릴 및 메타크릴산들, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 하이드록시에틸아크릴레이트 또는 메타아크릴레이트, 비닐피롤리돈들의 다양한 조합들에 근거한 호모- 그리고 공중합체들, 그리고 상기에서 언급한 단량체들 및 2-아크릴아미도-2-메틸-프로판술폰산 (AMPS®)과의 폴리비닐알코올 및 그의 공중합체들 및 3량체들, 폴리비닐아세테이트, 그의 공중합체 및 3량체들의 군으로부터 선택된 고분자들을 포함할 수 있다. 에스테르 기들이 직선 또는 분지 사슬 알킬, 1 내지 6개의 탄소들의 알킬 치환기들; N,N-디메틸아미노알킬(메트)아크릴아미드, 디메틸아미노알킬(메트)아크릴레이트, (메트)아크릴옥시알킬트리메틸암모늄 클로라이드, (메트)아크릴옥시알킬디메틸벤질 암모늄 클로라이드와 같은, 스테로이드성의, 황산염들, 인산염들 또는 양이온의 단량체들을 함유할 수 있는 최대 4개에 이르는 방향족 고리들로부터 유도되는 상황에서 아크릴 또는 메타아크릴 아미드 아크릴레이트 또는 메타아키를레이트 에스테르들과 같은 공중합가능한 기능성 단량체들과 상기에서 열거된 단량체들의 공중합체들은 매우 유용한다.

본 발명에서의 사용을 위한 추가적인 흡수 촉진 고분자들은 덱스트란, 덱스트린으로서 분류되는 것들이고, 천연 검들 및 레진들로 분류되는 물질들의 부류로부터, 또는 가공된 콜라겐, 키딘, 키토산, 풀라란, 주글란, 알기네이트 및 "Kelcoloid"(폴리프로필렌 글리콜 변형 알기네이트)와 같은 변형 알기네이트, "Kelocogel"과 같은 젤란 검, "Keltrol"과 같은 잔탄 검, 에스타틴, 알파 하이드록시 부티레이트 및 그의 공중합체, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리락트산 및 글리콜산과 같은 천연 고분자들의 부류로부터 유래된 것들이다.

본 발명에 적용가능한 매우 유용한 부류의 고분자들은 적어도 하나의 활성탄소-탄소올레핀 이중결합, 그리고 적어도 하나의 카복실기, 즉 카복실기에 대해서는 알파-베타 위치에서, 혹은 말단 메틸렌 그룹핑의 일부로서, 단량체 분자내에서 그의 존재 때문에, 중합반응에 쉽게 기능하는 올레핀 이중결합을 포함하는 산으로 쉽게 변환되는 산 또는 기능성 기를 함유하는 올레핀적으로(olefinically) 불포화된 카복실산들이다. 이러한 부류의 올레핀적으로 불포화된 산들은 아크릴산 자체, 알파-시아노 아크릴산, 베타 메틸아크릴산(크로톤산), 알파-페닐 아크릴산, 베타-아크릴옥시 프로피온산, 신남산(cinnamic acid), p-클로로 신남산, 1-카복시-4-페닐 부타디엔-1,3-이타콘산, 시트라콘산, 메사콘산, 글루타콘산, 아코니트산, 말레산, 푸마르산, 그리고 트리카복시 에틸렌에 의하여 대표되는 아크릴산들과 같은 물질들을 포함한다. 여기에서 사용된 것으로서, "카복실산"이란 용어는 폴리카복실산들 및 무수 말레인산과 같은 폴리카복실산 무수물들을 포함하고, 여기서 무수물기는 동일한 카복실산 분자 위에 위치된 두 개의 카복실기들로부터 하나의 물 분자의 제거에 의하여 형성된다.

본 발명에서 흡수 촉진제들로서 유용한 대표적인 아크릴레이트들은 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 프로필 아크릴레이트, 이소프로필 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 이소부틸 아크릴레이트, 메틸 메타아크릴레이트, 메틸 에타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 옥틸 아크릴레이트, 헵틸 아크릴레이트, 옥틸 메타크릴레이트, 이소프로필 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 노닐 아크릴레이트 헥실 아크릴레이트, n-헥실 메타크릴레이트 등을 포함한다. 더 상위의 알킬 아크릴 에스테르들은 데실 아크릴레이트, 이소데실 메타크릴레이트, 라우릴 아크릴레이트, 스테아릴 아크릴레이트, 베헤닐 아크릴레이트 및 멜리실 아크릴레이트 그리고 이들의 메타아크릴레이트 버젼들이다. 둘 또는 셋 이상의 장쇄 아크릴 에스테르들의 혼합물들은 카복실 단량체들 중 하나로 성공적으로 중합될 수 있다. 다른 공단량체(comonomer)들은 알파 올레핀들을 포함하는 올레핀, 비닐 에테르, 비닐 에스테르, 그리고 이들의 혼합물들을 포함한다.

아크릴 니트릴들을 포함하는 다른 비닐리덴 단량체들은 대상의 표적 조직 또는 부분(예를 들어, 간, 간문맥, CNS 조직 또는 유액, 또는 혈장)으로 활성제(들)의 송달을 증진시키는 것을 포함하여, 하나 이상의 혈당 조절 펩티드, 유사체들 및 모방약들, 그리고 다른 생물학적 활성제(들)의 송달과 흡수를 증진시키기 위하여 본 발명의 방법들과 조성물들에서 흡수 증진제로서 사용될 수도 있다. 유용한 알파, 베타-올레핀적으로 불포화된 니트릴들은 바람직하게는 아크릴로니트릴, 메타아크릴로니트릴 등과 같이 3 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 모노올레핀적으로 불포화된 니트릴들이다. 가장 바람직한 것들은 아크릴로니트릴과 메타아크릴로니트릴이다. 모노올레핀적으로 불포화된 아미드들을 포함하는 3 내지 35개의 탄소 원자들을 포함하는 아크릴 아미드들도 사용될 수 있다. 대표적인 아미드들은 아크릴아미드, 메타아크릴아미드, N-t-부틸 아크릴아미드, N-시클로헥실 아크릴아미드, 질소 위의 알킬기가 8 내지 32개의 탄소 원자들을 포함하는 상위 알킬 아미드, 아크릴산 아미드들을 포함하고, 상기 아크릴산 아미드들은 알파, 베타-올레핀적으로 불포화된 카복실산들의 N-알킬올 아미드들(N-alkylol amides)을 포함하고, 상기 N-알킬올 아미드들은 N-메틸올 아크릴아미드, N-프로판올 아크릴아미드, N-메틸올 메타크릴아미드, N-메틸올 말레이미드, N-메틸올 말레암산 에스테르들, N-메틸올-p-비닐 벤자미드 등과 같이 4개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 것들을 포함한다.

또 다른 유용한 흡수 촉진 물질들은 2 내지 18개의 탄소원자들, 더 바람직하게는 2 내지 8개의 탄소원자들을 포함하는 알파-올레핀들; 4 내지 10개의 탄소원자들을 포함하는 디엔(dienes); 비닐 아세테이트와 같은 비닐 에스테르 및 알킬 에스테르; 스티렌, 메틸 스티렌 및 클로로-스티렌과 같은 비닐 방향제; 비닐 메틸 에테르 및 메틸 비닐 케톤과 같은 비닐 및 알킬 에테르 그리고 케톤; 알파-시아노메틸 아크릴레이트, 그리고 알파-, 베타-, 그리고 감마-시아노프로필 아크릴레이트와 같은 시아노알킬 아크릴레이트; 메톡시 에틸 아크릴레이트와 같은 알콕시아크릴레이트; 클로로에틸 아크릴레이트와 같은 할로아크릴레이트; 비닐 할라이드 및 비닐 클로라이드, 비닐리덴 클로라이드 등; 디비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 메틸렌-비스-아크릴아미드, 알릴펜타에리스리톨(allylpentaerythritol) 등과 같은 디비닐, 디아크릴레이트 및 다른 다기능성 단량체들; 그리고 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 공지된 비스(베타-클로로에틸) 비닐 포스포네이트 등이다. 단량체를 함유하는 카복시가 마이너 성분이 고 다른 비닐리덴 단량체들이 주요 성분으로 존재하는 공중합체들은 여기에서 개시된 방법들에 따라서 쉽게 제조된다.

하이드로겔들이 본 발명에서 흡수 촉진제들로서 채용될 때, 이들은 물과 상호작용하고 수팽윤성인 아크릴 및 메타아크릴산들, 아크릴아미드, 메타아크릴아미드, 하이드록시에틸아크릴레이트(HEA) 또는 메타아크릴레이트(HEMA), 긔ㄹ고 비닐피롤리돈들의 군으로부터 선택된 합성 공중합체들로 구성될 수 있다. 펩티드 또는 단백질들의 송달을 위하여 특히 유용한 고분자들의 특정 예들은 다음 유형들의 고분자들이다: (메트)아크릴아미드 및 0.1 내지 99 wt% (메트)아크릴산; (메트)아크릴아미드 및 0.1 내지 75 wt% (메트)아크릴옥시에틸 트리메틸암모늄 클로라이드; (메트)아크릴아미드 및 0.1 내지 75 wt% (메트)아크릴아미드; 아크릴산 및 0.1-75 wt% 알킬(메트)아크릴레이트; (메트)아크릴아미드 및 0.1-75 wt% AMPS.RTM.(Lubrizol Corp.의 상표); (메트)아크릴아미드 및 0 내지 30 wt% 알킬(메트)아크릴아미드 그리고 0.1-75 wt% AMPS.RTM.; (메트)아크릴아미드 및 0.1-99 wt% HEMA; (메트)아크릴아미드 및 0.1 내지 75 wt% HEMA 그리고 0.1 내지 99 wt% (메트)아크릴산; (메트)아크릴산 그리고 0.1-99 wt% HEMA; 50 mole% 비닐 에테르 및 50 mole% 무수 말레인산; (메트)아크릴아미드 및 0.1 내지 75 wt% (메트)아크릴옥시알킬 디메틸 벤질암모늄 클로라이드; (메트)아크릴아미드 그리고 0.1 내지 99 wt% 비닐 피롤리돈; (메트)아크릴아미드 및 50 wt% 비닐 피롤리돈 그리고 0.1-99.9 wt% (메트)아크릴산; (메트)아크릴산 및 0.1 내지 75 wt% AMPS.RTM. 그리고 0.1-75 wt% 알킬(메트)아크릴아미드. 위의 예들에서, 알킬은 C1 내지 C30, 바람직하게는 C1 내지 C22, 선형 및 분지형의 그리고 C4 내지 C16의 고리형을 의미하고, 여기서 (메트)가 사용되는 경우, 메틸기를 갖거나 갖지 않는 단량체들이 포함된다는 것을 의미한다. 다른 매우 유용한 하이드로겔 고분자들은 팽윤성이지만, 폴리(비닐 피롤리돈) 전분, 카복시메틸 셀룰로오스 그리고 폴리비닐 알코올의 불용성 형태이다.

본 발명에서 유용한 추가적인 고분자 하이드로겔 물질들은 (폴리)하이드록시알킬 (메트)아크릴레이트; 음이온 및 양이온의 하이드로겔들; 폴리(전해질) 착물들; 낮은 아세테이트 잔기를 갖는 폴리(비닐 알코올들); 교차결합된 우뭇가사리와 교차결합된 카복시메틸 셀룰로오스의 팽윤성 혼합물; 드물게 교차결합되는 우뭇가사리와 혼합된 메틸 셀룰로오스를 포함하는 팽윤성 조성물; 스티렌, 에티렌, 프로필렌, 또는 이소부티렌과 함께 무수 말레인산의 미소 분리된 공중합체의 분산에 의하여 생성된 수팽윤성 공중합체; N-비닐 락탐들의 수팽윤성 고분자; 카복시메틸 셀룰로오스의 팽윤성 나트륨 염들 등을 포함한다.

본 발명의 생물학적 활성제들의 점막 송달을 위한 친수성 하이드로겔을 형성하는데 유용한 고분자들을 흡수하여 보존하는 다른 겔화가능한 유체는 펙틴; 우뭇가사리, 아카시아, 카라야, 트라가캔스(tragacenth), 알긴 및 구아르(guar) 및그들의 교차결합된 형태들; 아크릴산 고분자들, 공중합체들 그리고 염 유도체들, 폴리아크릴아미드; 수팽윤성 인딘 무수 말레인산 고분자들; 전분 그라프트 공중합체들; 최초 중량의 약 2 내지 400 배의 흡수율을 갖는 아크릴레이트 타입 고분자들 및 공중합체들; 폴리글루캔의 디에스테르들; 교차결합된 폴리(비닐 알코올) 및 폴리(N-비닐-2-피롤리돈)의 혼합물; 폴리옥시부틸렌-폴리에틸렌 블럭 공중합체 겔들; 캐럽 검(carob gum); 폴리에스테르 겔; 폴리 우레아 겔; 폴리에테르 겔; 폴리아미드 겔; 폴리이미드 겔; 폴리펩티드 겔; 폴리아미노산 겔; 폴리셀룰로오스 겔; 교차결합된 인딘-무수 말레인산 아크릴레이트 고분자들; 그리고 폴리사카라이드들을 포함한다.

본 발명에서의 사용을 위한 합성 하이드로겔 고분자들은 여러 단량체들의 무한 조합에 의하여 여러 비율로 만들어질 수 있다. 하이드로겔은 교차결합되고 일반적으로 유체를 섭취하여 흡수하고 확대된 평행상태까지 팽창하는 능력을 가진다. 전형적으로 하이드로겔은 비강 점막 표면까지의 송달시 팽창하여 그의 수분 중량의 약 2-5, 5-10, 10-50, 50-100 배 이상의 물을 흡수한다. 제공된 하이드로겔에 대한 최적의 팽윤도는 고분자에 의하여 송달되거나 고분자 내에 포획되거나 캡슐화되는 활성제의 분자량, 크기, 용해도 및 확산 특성들, 그리고 각 개별 고분자와 관련된 특정 공간 및 협력 사슬 운동과 같은 인자들에 따라서 다른 생물학적 활성제들에 대하여 결정될 것이다.

본 발명에서 유용한 친수성 고분자들은 수용성이지만 수팽윤성이다. 그러한 수팽윤된 고분자들은 전형적으로는 하이드로겔 또는 겔이라고 언급된다. 그러한 겔들은 교차결합의 공정에 의한 수용성 고분자로부터 그리고 적합한 교차결합제에 의한 고분자로부터 편리하게 생산될 수 있다. 그러나, 안정한 하이드로겔들은 이 기술에서 공지된 방법들에 따라서, pH, 온도 및/또는 이온 농도와 같은 정의된 조건들 하에서 특정 고분자들로부터 형성될 수도 있다. 전형적으로, 상기 고분자들은 교차결합, 즉 좋은 친수성 성질들을 가지고, 개선된 물리적 보전성(동일 또는 유사형의 비교차결합된 고분자들에 비하여)을 가지고 겔망 내에 관심있는 생물학적 활 성제와 사이토킨 또는 효소 저해제와 같이, 상기 활성제와 병용투여를 위한 추가적인 화합물들을 보존하는 개선된 능력을 보이지만, 적절한 위치와 시간에서 상기 활성제(들)을 방출하는 능력을 보존하는 정도로 교차결합된다.

일반적으로 본 발명에서의 사용을 위한 하이드로겔 고분자들은 공중합체를 형성하는 단량체들의 중량에 대하여, 교차 결합제의 약 0.01 내지 25 중량%의 양으로, 더 바람직하게는, 0.1 내지 20 중량% 그리고 더욱 빈번하게는 0.1 내지 15 중량%의 양으로 2기능성 교차결합을 갖고서 교차결합된다. 교차결합제의 또 다른 유용한 양은 0.1 내지 10 중량%이다. 트리, 테트라 또는 그 이상의 다기능성 교차결합제들도 채용될 수 있다. 그러한 시약들이 이용될 때, 등가의 교차결합 밀도, 즉, 교차결합 정도, 또는 효과적으로 생물학적 활성제(들)을 함유하기에 충분한 망 성질들을 달성하기 위하여 더 작은 양들이 필요할 수도 있다.

교차결합들은 고분자가 유체들을 함유하는 물의 존재하에서 팽창하는 능력을 가지는 공유, 이온 또는 수소 결합들일 수 있다. 그러한 교차결합제들과 교차결합 반응들은 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려져 있고 많은 경우들에 있어서 고분자 시스템에 의존한다. 그러므로, 교차결합망은 불포화된 단량체들의 유리 라디컬 공중합반응에 의하여 형성될 수 있다. 고분자 하이드로겔들은 알코올들, 산들, 아민들과 같은 고분자들에서 발견되는 기능성 그룹들을 글리옥살(glyoxal), 포름알데히드 또는 글루타알데히드, 비스 무수물 등과 같은 그러한 그룹들과 반응시켜서 교차결합 수행 고분자들에 의하여 형성될 수도 있다.

상기 고분자들은 또한 어떤 폴리엔, 예를 들어, 데카디엔 또는 트리비닐 시 클로헥산; N,N-메틸렌-비스(아크릴아미드)와 같은 아크릴아미드; 트리메틸올 프로판 트리아크릴레이트와 같은 다기능성 아크릴레이트들; 또는 예를 들어, 디비닐 벤젠, 디비닐 나프탈렌, 알릴 아크릴레이트 등을 포함하는, 적어도 2 말단 CH₂<그룹들을 함유하는 다기능성 비닐리덴 단량체와 교차결합될 수 있다. 어떤 실시예들에서, 상기 공중합체들을 제조하는데 사용하기 위한 교차결합 단량체들은 올레핀 이중결합이 존재하여 말단 메틸렌 그룹핑(예를 들어, 적어도 2개의 탄소 원자들과 적어도 2개의 하이드록실 기들을 포함하는 폴리하이드릭 알코올의 에테르화에 의하여 만들어지는)에 부착되는 알케닐 기들을 선택적을 가질 수 있는, 분자당 하나 이상의 에테르 그룹핑을 가지는 폴리알케닐 폴리에테르들이다. 이러한 부류의 화합물들은 알킬 클로라이드 또는 알릴 브로마이드와 같은 알케닐 할라이드를 하나 이상의 폴리하이드릭 알코올들의 강알카리성 수용액과 반응시켜서 생성될 수 있다. 생성물은 에테르 기들의 수가 변화하는 폴리에테르들의 착혼합물일 수 있다. 폴리에테르 교차결합제의 효율은 분자 위의 잠재적으로 중합가능한 기들의 수에 따라서 증가한다. 전형적으로, 분자당 둘 이상의 알케닐 에테르 그루핑들을 평균적으로 함유하는 폴리에테르들이 사용된다. 다른 교차결합 단량체들은, 예를 들어, 디알릴 에스테르(diallyl esters), 디메탈릴 에테르(dimethallyl ethers), 알릴 또는 메탈릴 아크릴레이트 및 아크릴아미드들, 테트라비닐 실란, 폴리알케닐 메탄, 디아크릴레이트, 그리고 디메타크릴레이트, 디비닐벤젠과 같은 디비닐 화합물들, 폴리알릴 포스페이트, 디알릴옥시 화합물들 및 포스파이트 에스테르들 등을 포함한다. 전형적인 작용제들은 알릴 펜타에리트리톨(allyl pentaervthritol), 알릴 수크로오스, 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 1,6-핵산디올 디아크릴레이트, 트리메틸올프로판 디알릴 에테르, 펜타에리트리톨 트리아크릴레이트, 테트라메틸렌 디메타크릴레이트, 에틸렌 디아크릴레이트, 에틸렌 디메타크릴레이트, 트리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 등이다. 알릴 펜타에리트리톨, 트리메틸올프로판 디알릴에테르 그리고 알릴 수크로오스는 적합한 고분자들을 제공한다. 교차결합제가 존재할 때, 고분자 혼합물들은 카복실산 단량체+다른 단량체들의 총중량에 대하여, 보통 약 0.01 내지 20 중량%, 예를 들어, 1%, 5%, 또는 10% 이상의 교차결합 단량체를 포함한다.

본 발명의 더 상세한 측면들에서, 혈당조절펩티드, 유사체들, 모방약들 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 점막 송달은 활성제를 서방형으로 유지하거나 또는 효소적으로 또는 생리적으로 보호적인 운반체 또는 매체, 예를 들어, 활성제를 붕해 효소들의 작용으로부터 차단하는 하이드로겔에 의하여 향상된다. 어떤 실시예들에서, 상기 활성제는 화학적 수단에 의하여 효소, 저해제들, 사이토킨 등과 같은 추가적인 작용제들이 혼합되거나 결합될 수 있는 운반체 또는 매체에게 결합된다. 대안적으로, 상기 활성제는 운반체 또는 매체, 예를 들어, 고분자 기질에서 충분한 물리적인 덫을 통하여 고정될 수 있다.

본 발명에서 유용한 하이드로겔과 같은 고분자들은 함께 제형화된 활성제들의 비강내 생물학적 이용도을 향상시키기 위한 고분자에게 화학적으로 결합되는 글리코시드와 같은 기능성 연결 작용제들을 결합할 수 있다. 그러한 글리코시드들의 예들은 글루코시드, 프락토시드, 갈락토시드, 아라비티오시드, 만노시드 및 그들의 알킬 치환 유도체들 그리고 아르부틴(arbutin), 프로리진(phlorizin), 아미그다린(amygdalin), 디지토닌(digitonin), 사포닌 및 인디캔(indican)과 같ㅇ느 천연 글리코시드들이다. 전형적인 글리코시드가 고분자에 결합될 수 있는 몇 가지 방법들이 있다. 예를 들어, 글리코시드 또는 달느 유사 카보하이드레이트의 하이드록실 기들의 수소는 하이드로겔 고분자로부터 알킬기에 의하여 치환되어 에테르를 형성할 수 있다. 또한, 글리코시드들의 하이드록실 기들은 고분자 하이드로겔의 카복실 기들을 에스테르화하도록 반응하여 고분자 에스테르를 인 시튜로 형성할 수 있다. 또 다른 접근법은 말레산의 공중합체 위의 cholest-5-en-3beta-ol로 아세토브로모글루코스의 농축을 채용하는 것이다. N-치환된 폴리아크릴아미드들은 활성화된 고분자들과 오메가-아미노알킬글리코시드들의 반응에 의하여 합성될 수 있다: (1) (카보하이드레이트 스페이서)(n)-폴리아크릴아미드, 슈도폴리사카라이드; (2) (카보하이드레이트 스페이서)(n)-포스파티딜에탄올아민(m)-폴리아크릴아미드, 네오글리코리피드, 포스파티딜에탄올아민의 유도체; 그리고 (3) (카보하이드레이트-스페이서)(n)-바이오틴(m)-폴리아크릴아미드. 이들 바이오타이니레이트된(biotinylated) 유도체들은 생물학적 활성제(들), 예를 들어, 고분자-캡슐화된 혈당조절펩티드의 흡수를 쉽게 하기 위하여 점막 표면의 렉틴들에 부착될 수 있다.

본 발명의 보다 상세한 측면들에서, 선택적으로는 프로테아제 저해제(들), 사이토킨(들), 추가적인 세포간 접합 생리학의 추가적 조절제(들) 등과 같은 제2활성제들을 포함하는, 하나 이상의 혈당조절 펩티드, 유사체들, 및 모방약들, 그리고/또는 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들은 변형되어 고분자 운잔체 또는 소 지에 결합된다. 예를 들어, 이는 펩티드 또는 단백질 활성제 및 다른 선택적 작용제(들)를 교차결합된 고분자 망에 화학적으로 결합하므로써 달성될 수 있다. 또한 글리코시드 함유 분자와 같은 상호작용성제(interactive agent)와는 별도로 고분자를 화학적으로 변형하는 것이 가능하다. 어떤 측면들에서, 생물학적 활성제(들), 그리고 선택적인 제2활성제(들)는 기능화될 수 있는데, 즉, 적절한 반응성 기가 구별되거나 상기 활성제(들)에게 화학적으로 첨가된다. 가장 빈번하게는, 에틸렌 중합가능한 기가 첨가되고, 이후 기능화된 활성제는 용액 중합(보통 물에서), 에멀션, 현탁액 또는 분산 중합과 같은 표준 중합 방법을 이용하여 단량체들과 교차결합제로 공중합된다. 종종, 기능화제는 활성제(들) 위의 몇몇 자리들이 기능화되는 것을 보증하기 위하여 기능성 기들 또는 중합가능 기들의 충분히 높은 농도를 갖고서 제공된다. 예를 들어, 16개의 아민 자리들을 포함하는 폴리펩티드에서, 일반적으로 적어도 2, 4, 5, 7 그리고 8 또는 그 이상의 자리들을 기능화하는 것이 바람직하다.

기능화후, 기능화된 활성제(들)는 관심있는 고분자가 형성되는 시약들을 포함하는 단량체들 및 교차결합제와 혼합된다. 이후, 이 매체에서 중합이 유도되어 결합된 활성제(들)을 함유하는 고분자를 생성한다. 이후 상기 고분자는 물 또는 다른 적당한 용매들과 아이쉬(ished)되고 그렇지 않으면 반응하지 않은 불순물들을 제거하도록 정제되고, 필요하면, 교반, 메시를 통한 가압, 초음파분해(ultrasonication)와 같은 물리적 수단 또는 다른 적합한 수단에 의하여 원하는 입자 크기로 연마되거나 쪼개어진다. 이후, 용매, 보통 물은 활성제(들)을 변성시 키거나 붕해시키지 않는 그러한 방법으로 제거된다. 하나의 바람직한 방법은 동결건조이지만, 다른 방법들이 이용가능하고 사용될 수도 있다(예를 들어, 진공 건조, 에어 건조, 스프레이 건조 등).

본 발명에서 중합가능한 기들을 펩티드들, 단백질들 및 다른 활성제들 내에 도입하기 위하여, 이용가능한 아미노, 하이드록실, 티올 및 다른 반응성 기들을 불포화기들을 포함하는 전자친화물질들(electrophiles)과 반응시키는 것이 가능하다. 예를 들어, N-하이드록시 숙시니미딜 기들을 함유하는 불포화 단량체들, p-니트로페닐 카보네이트, 트리클로로페닐 카보네이트와 같은 활성 카보네이트들, 트레실레이트, 옥시카보닐이미다졸, 에폭시드(epoxide), 이소시아네이트 및 알데히드 그리고 불포화 카복시메틸 아지드 및 불포화 오르소피리딜-디설파이드는 이러한 카테고리의 시약들에 속한다. 불포화 시약들의 예들은 알릴 글리시딜 에테르, 알릴 클로라이드, 알릴 브로마이드, 알릴 아이오다이드, 아크릴로일 클로라이드, 알릴 이소시아네이트, 알릴술포닐 클로라이드, 무수말레인산(maleic anhydride) 그리고 알릴 에테르 등이다.

알데히드를 제외한, 모든 리신 활성 유도체들은, 일반적으로 국부적 환경이 이들 기들의 친핵성을 향상시키면, 히스티딘의 이미다졸 기들, 티로신의 하이드록실 기들 그리고 시스타인의 티올 기들과 같은 다른 아미노산들과 반응할 수 있다. 알데히드 함유 기능화 시약들은 리신에 대하여 특이성이 있다. 리신, 시스타인, 티로신으로부터 이용가능한 기들과 이러한 타입의 반응들은 문헌에서 광범위하게 문서화되었고 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려진다.

아민기들을 함유하는 생물학적 활성제들의 경우, 그러한 기들을 아크릴로일 클로라이드와 같은 아실로일 클로라이드(acyloyl chloride)와 반응시키고 중합가능한 아크릴 기를 반응된 작용제 위로 도입하는 것은 편리하다. 이후, 아크릴아미드 및 아크릴산의 공중합체의 교차결합동안과 같은 고분자의 제조동안, 아크릴 기들을 통하여, 기능화된 활성제는 고분자에 부착되어 거기에 결합된다.

본 발명의 추가적인 측면들에서, 펩티드, 단백질, 뉴클레오시드, 그리고 생체내 생활성인 다른 분자들을 포함하는 생물학적 활성제들은 하나 이상의 활성제(들)을 친수성 모이어티, 예를 들어, 선형 폴리알킬렌 글리콜, 친유성 모이어티 양자의 필수 부분으로서 결합하는 고분자에 공유결합하므로써 공액-안정화된다 (미국특허번호 5,681,811을 보라). 일측면에서, 생물학적 활성제는 (i) 선형 폴리알킬렌 글리콜 모이어티, 그리고 (ii) 친유성 모이어티를 포함하는 고분자에 공유적으로 결합되는데, 여기서 활성제, 선형 폴리알킬렌 글리콜 모이어티, 그리고 친유성 모이어티는 활성 치료제가 효소 붕해에 대하여 향상된 생체내 저항성을 가지도록 서로 관련하여 정합적으로 배열된다(즉, 거기에 결합된 고분자가 결여된 비공액 형태에서 유사 조건하의 그의 안정성에 상대적인). 또 다른 측면에서, 공액-안정화된 제형은 (i) 선형 폴리알킬렌 글리콜 모이어티, 그리고 (ii) 친유성 모이어티를 포함하는 폴리소베이트 착물과와 공유결합된 생물학적 활성제를 포함하는 3차원 조직을 가지는데, 여기서 활성제, 선형 폴리알킬렌 글리콜 모이어티 그리고 친유성 모이어티는 (a) 상기 친유성 모이어티가 3차원 조직에서 외면적으로 이용가능하고, 그리고 (b) 상기 조성물에서 상기 활성제가 효소 붕해에 대하여 향상된 생체내 저 항을 가지도록 서로 관련하여 정합적으로 배열된다.

또 다른 추가적인 관련 측면에서, 다중리간드 공액 착물이 제공되는데, 이는 트리글리세라이드 백본의 탄소 원자에 결합된 폴리알킬렌 글리콜 스페이서 그룹을 통하여 트리글리세라이드 백본 모이어티와 공유결합되는 생물학적 활성제, 그리고 상기 트리글리세라이드 백본 모이어티의 탄소 원자에 직접 공유결합되거나 또는 폴리알킬렌 글리콜 스페이서 모이어티를 통하여 공유결합된 적어도 하나의 지방산 모이어티를 포함한다(미국특허번호 5,681,811을 보라). 그러한 다중리간드 공액 치료제 착물에서, 트리글리세라이드 생활성 모이어티의 알파' 및 베타 탄소 원자들은 폴리알킬렌 글리콜 스페이서 모이어티들을 통하여 거기에 직접 공유결합되거나 간접 공유결합되는 것에 의하여 부착된 지방산 모이어티들을 가질 수 있다. 대안적으로, 지방산 모이어티는 트리글리세라이드 백본 모이어티의 알파 및 알파' 탄소들에게 직접적으로 혹은 폴리알킬렌 글리콜 스페이서 모이어티를 통하여 공유적으로 부착될 수 있는데, 이때 생물활성 치료제는 트리글리세라이드 백본 모이어티의 감마-탄소에 공유결합되는데, 거기에 직접 공유결합되거나 폴리알킬렌 스페이서 모이어티를 통하여 거기에 간접결합된다. 본 발명의 범주내에서 트리글리세라이드 백본 모이어티를 포함하는 다중리간드 공액 치료제 착물에 대하여 다양한 구조적, 조성적 그리고 조직적 형태들이 가능하다는 것이 인식될 것이다. 또한, 그러한 다중리간드 공액 치료제 착물에서, 생물학적 활성제(들)는 유리하게는 알킬 스페이서 기들을 통하여, 혹은 대안적으로는 다른 타당한 스페이서 기들을 통하여 트리글리세라이드 변형 백본 모이어티와 공유 결합될 수 있다. 그러한 관계에서 사용된 것처 럼, 스페이서 기의 타당성은 입체의, 조성의, 그리고 최종 사용 응용 특정의 타당성을 말한다.

본 발명의 또 다른 추가적인 측면들에서, 공액-안정화된 착물이 제공되는데, 이 착물은 폴리소베이트 모이어티를 포함하는 폴리소베이트 착물을 포함하고, 상기 폴리소베이트 모이어티는 그의 알파, 알파' 그리고 베타 탄소 원자들에 공유결합된 기능성 기들을 갖는 트리글리세라이드 백본을 포함하고, 상기 기능성 기들은 (i) 지방산 기; 그리고 (ii) 거기에 공유결합된, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 기의 적절한 기능성에 결합된 생물학적 활성제 또는 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함한다. 그러한 공유결합은 폴리에틸렌 글리콜 기의 하이드록시 말단 기능성에 대하여 직접적이거나 대안적으로는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 기의 하이드록시 말단을 말단 카복시 기능성 스페이서 기와 반응적으로 캡핑하므로써 상기 공유 결합이 간접적일 수 있고, 그 결과 결과적으로 캡핑된 폴리에틸렌 글리콜 기는 상기 생물학적 활성제 또는 모이어티가 공유결합될 수 있는 말단 카복시 기능성을 가진다.

본 발명의 또 다른 추가적인 측면들에서, 안정하고, 수용액적으로 용해가능하고, 공액-안정화된 착물이 제공되는데, 이 착물은 생리적으로 양립가능한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 변형 글리코리피드 모이어티에 공유결합되는 하나 이상의 혈당 조절 펩티드 단백질들, 유사체들, 모방약들, 그리고/또는 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제(들)을 포함한다. 그러한 착물에서, 생리학적 활성제(들)는 그의 유리 아미노산 기에서 불안정한 공유결합에 의하여 생리적으로 양립가능한 PEG 병 형 글리코리피드 모이어티에게 공유결합될 수 있고, 여기서 상기 불안정한 공유결합은 생화학적 가수분해 및/또는 단백질 가수분해에 의하여 생체내에서 분할가능하다. 생리적으로 양립가능한 PEG 변형 글리코리피드 모이어티는 유리하게는 폴리소베이트 고분자, 예를 들어, 모노팔미테이트(monopalmitate), 디팔미테이트, 모노라우레이트(monolaurate), 디라우레이트, 트리라우레이트, 모노올레이트(monooleate), 디올레이트, 트리올레이트, 모노스테아레이트(monostearate), 디스테아레이트, 그리고 트리스테아레이트로 구성되는 군으로부터 선택된 지방산 에스테르 기들을 포함하는 폴리소베이트 고분자를 포함할 수 있다. 그러한 착물에서, 생리적으로 양립가능한 PEG 변형 글리코리피드 모이어티는 적합하게는 지방산들의 폴리에틸렌 글리콜 에테르들, 그리고 지방산들의 폴리에틸렌 글리콜 에스테르들로 구성되는 군으로부터 선택된 고분자를 포함하고, 여기서 상기 지방산들은, 예를 들어, 라우르산(lauric acid), 팔미트산, 올레산, 그리고 스테아르산으로 구성되는 군으로부터 선택된 지방산을 포함한다.

물질의 저장 및 제조

본 발명의 어떤 측면들에서는, 조합 제형들 및/또는 병용투여 방법들은 여기에서 대전된 유리에 부착될 수 있는 효과적인 양의 펩티드들 및 단백질들을 결합하여 용기내에서 효과적인 농도를 감소시킨다. 실란처리된 용기들, 예를 들어, 실란처리된 유리 용기들은 폴리펩티드 또는 단백질의 흡수를 감소시키는 최종 생성물을 유리 용기에 저장하기 위하여 사용된다.

본 발명의 또 다른 추가적인 측면들에서, 포유류 환자의 치료를 위한 키 트(kit)는 포유류 대상에게 점막 송달을 위하여 제형화된 하나 이상의 혈당조절 펩티드 화합물(들)의 안정한 약제학적 조성물을 포함하고, 여기서 상기 조성물은 비만, 암, 영양실조, 또는 받아들일 수 없는 부작용들 없이 상기 환자에게서 암에 관련된 이스팅(isting) 중 하나 이상의 징후들을 완화하는데 효과적이다. 상기 키트는 하나 이상의 혈당조절 펩티드 화합물들을 담는 약제학적 시약병을 더 포함한다. 상기 약제학적 시약병은 의약등급의 고분자, 유리 또는 다른 적합한 물질로 구성된다. 상기 약제학적 시약병은, 예를 들어, 실란처리된 바이알이다. 상기 키트는 환자의 비강 점막 표면까지 조성물의 송달을 위한 개구를 더 포함한다. 상기 송달 개구는 의약등급의 고분자, 유리 또는 다른 적합한 물질로 구성된다. 상기 송달 개구는, 예를 들어, 실란처리된 유리이다.

실란처리 기술은 저압에서 질란화 과정으로 실란처리될 표면들을 위한 특별한 청소 기술을 결합한다. 실란은 기상(gas phase)으로 존재하고 실란처리될 표면들의 높아진 온도에서 생성된다. 이 방법은 단층의 특징들을 가진, 안정하고, 균질하고 기능성의 실란층들을 가진 재생가능한 표면들을 제공한다. 실란처리된 표면들은 폴리펩티드들 또는 본 발명의 점막 송달 증진제들의 유리에 대한 결합을 방지한다.

이 과정은 본 발명의 혈당조절 펩티드 조성물들을 갖고 있기 위한 실란처리된 의약적 시약병들을 준비하는데 유용하다. 유리 트레이들은 사용전 이중희석된 물(ddH₂O)로 린스하므로써 청소된다. 상기 실란 트레이는 이후 95% EtOH로 린스되 고, 아세톤 트레이는 아세톤으로 린스된다. 의약적 시약병들은 아세톤에서 10분 동안 초음파처리된다. 아세톤 초음파처리후, 시약병들은 ddH₂O 트레이에서 적어도 2회 세척된다. 시약병들은 0.1M NaOH에서 10분 동안 초음파처리된다.상기 시약병들이 NaOH에서 초음파처리되는 동안, 실란 용액이 후드 아래에 만들어진다. (실란 용액: 955 에탄올 800 mL; 빙상졀정의 아세트산 96 L; 글리시독시프로필트리메톡시 실란 25 mL). NaOH 초음파처리후, 시약병들은 ddH₂O 트레이에서 적어도 2회 세척된다. 상기 시약병들은 실란 용액에서 3 내지 5분 동안 초음파처리된다. 상기 시약병들은 100% EtOH 트레이에서 이쉬된다(ished). 상기 시약병들은 사전정제된 N2 가스로 건조되어 사용전 100 ℃ 오븐에서 적어도 2시간 동안 저장된다.

비강 스프레이 제품 제조 방법은 혈당조절 펩티드 없이 ~85% 물 + 비강 스프레이 제형의 성분들을 포함하는 비강 스프레이용 희석제의 제조를 포함할 수 있다. 이후 상기 희석제의 pH가 측정되어 필요하면 수산화나트륨 또는 염산으로 pH 4.0±0.3까지 조절된다. 비강 스프레이는 스크류 캡 병에 대한 상기 희석제의 최종 목표 체적의 ~85%의 비방부처리의 송달에 의하여 제조된다. 혈당 조절 펩티드의 적정량이 첨가되어 완전히 용해될 때까지 혼합된다. pH가 측정되고 필요하면 수산화나트륨 또는 염산으로 pH 7.0±0.3까지 조절된다. 최종 목표 체적에 도달하도록 충분한 양의 희석제가 첨가된다. 스크류-캡 병들은 충진되고 캡들이 씌워진다. 상기한 제조방법의 설명은 약물 제품의 최초 임상 배치들(batches)을 제조하기 위하여 사용된 방법을 나타낸다. 이 방법은 제조방법을 최적화하기 위한 개발 공정동안 변형될 수도 있다.

현재 유통되는 주사용 혈당조절 펩티드는 FDA 규정들에 따라서 무균의 제조 조건들을 요구한다. 주사 또는 주입용 인슐린을 포함하는, 비경구 투여는 무균의 제조 공정을 요구한다. 무균 약물 제조를 위하여 현재의 Good Manufacturing Practices (GMP)는 설계 및 건축 특징들에 대한 표준들(21 CFR §211.42(2005년 4월)); 성분들, 약물 제품 용기들, 그리고 클로저들(closures)의 시험 및 승인 또는 부결을 위한 표준들 (§211.84); 미생물 오염의 조절을 위한 표준들 (§211.113); 그리고 다른 특별한 시험 요구들 (§211.167)을 포함한다. 본 발명의 비강내 제품과 같은 비경구의(비무균의) 제품들은 이들 특별 무균 제조 조건들을 요구하지 않는다. 쉽게 이해될 수 있듯이, 무균 제조 공정을 위한 요구들은 비무균 제품 제조 공정에서 요구되는 것들보다 실질적으로 더 높고 따라서 비용이 더 높다. 이들 비용들은 설비들을 위한 훨씬 더 많은 자본 비용들, 그리고 더 많은 제조 비용, 추가적인 방들과 통풍을 포함하는 무균 제조를 위한 잉여 설비들; 더 많은 맨파워를 포함하는 무균 제조와 관련된 잉여 비용들; 광범위한 양 조절 및 질 보장; 그리고 행정적 지원을 포함한다. 그 결과, 본 발명의 그것과 같은, 비강내 혈당조절 펩티드 제품의 제조 비용들은 비경구적으로 투여되는 혈당조절 펩티드 제품의 제조 비용들보다 훨씬 적다. 본 발명은 혈당 조절 펩티드를 위한 비무균 제조 공정의 필요성을 만족시킨다.

무균 용액들은 적합한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 요구처럼 위에서 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 결합하고 뒤따라서 여과 무균화를 수행하므로 써 제조될 수 있다. 일반적으로, 상기 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 위에서 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분들을 함유하는 무균의 운반매체에 결합하므로써 분산액들이 준비된다. 무균 분말들의 경우, 조제 방법들은 진공 건조 및 활성 성분+이전 무균-여과된 그의 용액으로부터 임의의 추가적인 요구 성분의 분말을 생성하는 동결건조를 포함한다. 미생물들의 작용 방지는 다양한 항세균성 및 항진균성 작용제들, 예를 들어, 파라벤(parabens), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살(thimerosal) 등에 의하여 달성될 수 있다.

본 발명에 따르는 점막 투여는, 충분한 안정장치들이 투여와 부작용들을 제어하고 감지하는 곳에 있으면, 환자들에 의한 치료의 효과적인 자기투여를 허용한다. 점막 투여는 또한 주사들과 같이, 고통스럽고 환자를 감염 가능성에 노출하며 약물 생물학적 이용율 문제들을 제공할 수 있는 다른 투여 형태들의 어떤 단점들을 극복한다.

생체 점착제 운송체들 및 방법들

본 발명의 어떤 측면들에서, 하나 이상의 생물학적 활성제(들)의 점막 송달을 향상시키기 위하여, 여기에 있는 조합 제형들 및/또는 병용 투여방법들은 효과적인 양의 비독성 생체 점착제를 보조화합물 또는 운반체로서 결합한다. 이러한 관계에 있어서 생체 점착제들은 목표로 한 점막의 하나 이상의 성분들 또는 표면들에게로의 일반적 또는 특정 점막을 보여준다. 점막 상피 내로 또는 점막 상피를 통하여 심지어는 큰 분자들(예를 들어, 펩티드 및 단백질)의 침투를 확실하게 하기 위하여, 생체 점착제는 점막 내에서 또는 점막에 걸쳐서 생물학적 활성제의 원하는 농도 기울기를 유지한다. 전형적으로, 본 발명의 방법들 및 조성물들에서 생체 접착제의 채용은 점막 상피 내로의 또는 점막 상피를 통하여 펩티드들과 단백질들의 2 내지 5배, 종종 5 내지 10배의 침투성의 증가를 이룬다. 이러한 상피침투의 증가는 종종, 예를 들어, 비강 상피의 바닥부까지 또는 인접한 세포외 부분들 또는 혈장 또는 CNS 조직 또는 유체내로 큰 거대분자들의 효과적인 경점막 송달을 허용한다.

이러한 향상된 송달은 생체활성 펩티드, 단백질 그리고 다른 거대분자 치료종들의 매우 개선된 송달 효율을 제공한다. 이 결과들은 부분적으로는 화합물의 친수성에 의존할 것이고, 그리하여 물에 불용성인 화합물들에 비하여 친수성 종들에서 더 많은 침투가 달성될 것이다. 이들 효과들 외에도, 점막 표면에서 약물 저항성을 향상시키는 생체 점착제들의 채용은 연장된 약물 송달에 대한 저장 기전을 이끌수 있고, 그리하여 화합물들은 점막 조직을 거쳐서 침투하는 것뿐만 아니라 상기 표면에서 물질이 고갈되면 점막 표면쪽으로 후진확산한다.

다양한 적합 생체 점착제들이 경구 투여를 위한 기술, 즉 본 발명의 신규한 방법들 및 조성물에서의 사용을 발견하는 미국특허번호 3,972,995; 4,259,314; 4,680,323; 4,740,365; 4,573,996; 4,292,299; 4,715,369; 4,876,092; 4,855,142; 4,250,163; 4,226,848; 4,948,580; 그리고 미국재발행특허번호 33,093에 개시된다. 본 발명의 방법들 및 조성물들에서 점막의, 예를 들어, 비강의 송달 플랫폼으로서 다양한 생체점착성 고분자들의 잠재성은 내부에서 활성제의 결합에 뒤따르는 점막 표면들과 상호작용하는 그들의 능력뿐만 아니라 혈당조절 펩티드를 보존하고 방출 하는 그들의 능력을 판단하므로써 쉽게 접근될 수 있다. 아울러, 공지된 방법들은 점막 투여 자리에서 조직과 함께 선택된 고분자들의 생체양립성을 판단하기 위하여 적용될 것이다. 표적 점막이 점액(즉, 점액용해 또는 점액 청소 치료의 부재시)으로 덮여 있을 때, 그 표적 점막은 아래에 놓인 점막 상피에 대한 연결 링크로서 기능할 수 있다. 그러므로, "여기에서 사용된 "생체점착성(bioadhesive)"이란 용어는 본 발명에서 생물학적 활성제들의 점막 송달을 향상시키는데 유용한 점막점착성 화합물들을 커버한다. 그러나, 점액 겔층에 대한 접착을 통하여 변형된 점막 조직에 대한 점착성 접촉은 점액층과 하부의 조직 사이, 특히 빠른 점액 청소가 일어나는 비강 표면들에서 불완전한 또는 일시적인 부착에 의하여 제한될 수 있다. 이런 점에서, 뮤신 당단백질들은 연속적으로 분비되고, 세포들 또는 선들(glands)로부터 그들의 방출 직후, 점탄성의 겔을 형성한다. 그러나, 점착성 겔 층의 강측 표면(luminal surface)은 기계적 및/또는 효소의 그리고/또는 섬모의 작용에 의하여 침식된다. 그러한 작용들이 더욱 분명하거나 더 긴 점착 시간들이 바람직한 곳에서, 본 발명의 병용투여 방법들과 조합 제형 방법들은 여기서 위에서 개시된 것처럼 점액용해의 그리고/또는 섬모대전 방법들 또는 섬모대전제들을 더 결합할 수 있다.

전형적으로, 본 발명에서의 사용을 위한 점막점착성 고분자들은 착물에 의하지만, 불특정의 기전들에 의하여 습한 점막 조직 표면들에게 달라붙는 천연 또는 합성 거대분자들이다. 이들 점막 점착성 고분자들 외에도, 본 발명은 또한 수용체 변형을 포함하는 특정의 상호작용들에 의하여 점액에게라기 보다는 세포 표면에 직 접 달라붙는 생체점착제들을 결합하는 방법들과 조성물들을 제공한다. 이러한 특정 방법에서 기능하는 생체점착제들의 한 예는 렉틴들로서 알려진 화합물들의 군이다. 이들은 구체적으로 당분자들을 인식하여 당분자들에 결합하는 능력을 가진 당단백질로서, 비강내 상피세포막들의 일부를 형성하고 "렉틴 수용체들"로서 고려될 수 있다.

본 발명의 어떤 측면들에서, 생물학적 활성제들의 비강내 송달을 향상시키기 위한 생체점착성 물질들은 친수성, 예를 들어, 수용성 또는 수팽윤성의 고분자의 기질, 또는 습한 점액분비 표면에 달라붙을 수 있는 고분자들의 혼합물을 포함한다. 이들 점착제들은 연고들, 하이드로겔(위쪽을 보라) 박막들, 그리고 다른 응용 형태들로서 제형화될 수 있다. 종종, 이들 점착제들은 그와 함께 혼합된 생물학적 활성제를 가지고 상기 활성제의 느린 방출 또는 국부적 송달을 유효하게 한다. 일부는 추가적인 성분들을 갖고서 제형화되어 비강점막을 통한 활성제의 침투, 예를 들어, 개인의 순환계로의 침투를 쉽게 한다.

다양한 고분자들, 즉 천연 고분자들 및 합성 고분자들 양자는 생리적 조건들 하에서 점액 및/또는 점막 상피 표면들에게로의 상당한 결합을 보여준다. 이러한 상호작용의 강도는 기계적인 필 또는 쉬어 테스트(peel or shear tests)에 의하여 쉽게 측정될 수 있다. 습한 점막 표면에 적용될 때, 많은 건조한 물질들은 적어도 가볍게 자발적으로 달라붙는다. 그러한 초기 접촉후, 일부 친수성 물질들은 흡수, 팽윤, 또는 모세관 힘들에 의하여 물을 끌어들이기 시작하고, 이 물이 하부의 기질 또는 고분자 조직 계면으로부터 흡수되면, 점착은 생물학적 활성제들의 점막 흡수 를 향상시키는 목표를 달성하기에 충분할 수 있다. 그러한 '수화에 의한 점착'은 아주 강하지만, 이러한 기전을 채용하기에 적합한 제형들은 투여량이 수화된 점액으로 변형될 때 계속되는 팽윤을 설명해야만 한다. 이는 본 발명에서 유용한 많은 하이드로콜로이드들, 특히 먼저 수화된 상태에서 적용될 때 일반적으로 비점착성인 일부 셀룰로오스-유도체들에 대하여 계획된다. 그럼에도 불구하고, 점막 투여를 위한 생체점착성 약물 송달 시스템들은 그러한 물질들이 건조 고분자 분말, 미소구의 형태 또는 막-타입의 송달 형태로 적용될 때 본 발명에서 효과적이다.

다른 고분자들은 잉여량의 물이 존재할 때 건조 상태뿐만 아니라 충분히 수화된 상태로 적용될 때 점막 표면들에 달라붙는다. 그러므로, 점막점착제의 선택은 조직에 대한 접촉이 형성되어 유지되는 물리-화학적 뿐만 아니라 생리학적 조건들의 정당한 고려들을 요구한다. 특히, 점막의 의도된 자리에 보통 존재하는 물의 양 또는 수분, 그리고 지배적인 pH는 다른 고분자들의 점막점착성 결합 강도에 크게 영향을 미치는 것으로 알려진다.

몇몇 고분자 생체점착성 약물 송달 시스템들이 만들어져서 지난 20년간 연구되었지만, 항상 성공을 거두지는 못했다. 그러나, 그러한 다양한 운반체들은 치과의, 정형외과의, 안과의, 그리고 외과의 사용들을 포함하는 임상적 응용들에서 현재 사용된다. 예를 들어, 아크릴을 기본으로 하는 하이드로겔들은 생체점착성 장치들에서 광범위하게 사용되었다. 아크릴을 기본으로 하는 하이드로겔들은 그들의 유연성과 부분적으로 팽윤된 상태에서의 비마모적 특징들로 인하여 생체점착에 잘 맞아떨어지는데, 이는 접촉하는 조직들에 대한 손상을 야기하는 마모를 감소시킨다. 더욱이, 팽윤상태에서 그들의 높은 침투성은 반응되지 않은 단량체, 교차결합되지 않은 고분자 사슬들, 그리고 저해제가 중합후 기질로부터 세척되도록 하는데, 이는 본 발명에서의 사용을 위한 생체점착성 물질들의 선택에 대하여 중요한 특징이다. 아크릴을 기본으로 하는 고분자 장치들은 매우 높은 점착성 결합 강도를 보여준다. 펩티드 및 단백질 약물들의 조절된 점막 송달을 위하여, 본 발명의 방법들 및 조성물들은 선택적으로 운반체들, 예를 들어, 부분적으로는 단백질가수분해로부터 생물학적 활성제를 차단하도록 기능하는 고분자 송달 매개체들의 사용을 포함하고, 동시에 비강 점막으로 또는 비강점막을 통하여 펩티드 또는 단백질의 향상된 침투를 제공한다. 이러한 관계에 있어서, 생체점착성 고분자들은 구강의 약물 송달을 향상시키기 위한 상당한 잠재성을 보여주었다. 어떤 예로서, 점막점착성 폴리(아크릴산) 유도체 폴리카보필의 1%(w/v) 살린 분산과 함께 쥐들에게 십이지장 내로 투여된 9-데스글리신아미드(desglycinamide), 8-알긴 바소프레신 (DGAVP)의 생체이용율은 이러한 고분자 없는 펩티드 약물의 수용액에 비하여 3-5배 증가된다.

폴리(아크릴산)-타입의 점막점착성 고분자들은 일부 장 프로테아제들의 효능있는 저해제들이다. 효소저해의 기전은 트립신 및 키모트립신과 같은 메탈로-프로티나제들의 필수적 공동인자들인, 칼슘 또는 아연과 같은 2가 양이온들에 대한 이 부류의 고분자들의 강한 친화도에 의하여 설명된다. 폴리(아크릴산)에 의하여 프로테아제들에게서 그들의 공동인자들을 빼앗는 것은 효소 활동의 손실에 의하여 수행되었던 효소 단백질들의 비가역적인 구조 변화들을 유도하는 것으로 보고된다. 동시에, 다른 점막점착성 고분자들(예를 들어, 일부 셀룰로오스 유도체들 및 키토산) 은 어떤 조건들 하에서는 단백질 가수분해 효소들을 저해하지 않을 수도 있다. 상대적으로 작은 분자들인, 본 발명에서의 사용을 위하여 고려된 다른 효소 저해제들(예: 아프로티닌, 베스타틴)과 대비하여, 저해성 고분자들의 경비강 흡수는 이들 분자들의 크기에 비추어 최소일 것 같고, 그것에 의하여 가능한 부작용들을 제거한다. 이처럼, 특히 폴리(아크릴산)-타입의 점막점착성 고분자들은 특히 안전성에 대한 관심들이 고려될 때, 펩티드 및 단백질 약물들의 조절된 송달을 향상시키는 흡수-촉진 점착제 및 효소 보호제 양자로서 작용할 수 있다.

효소붕해에 대한 보호 외에도, 본 발명에서의 사용을 위한 생체점착제들 및 다른 고분자 또는 비고분자성 흡수 촉진제들은 생물학적 활성제들에 대한 점막 침투성을 직접 증가시킬 수 있다. 비강 상피 장벽을 지나서 펩티드 및 단백질들과 같이 크고 친수성인 분자들의 수송을 쉽게 하기 위하여, 점막점착성 고분자들 및 다른 작용제들은 송달 시스템의 더 길어진 점막 이전의(premucosal) 체류 시간에 의하여 설명되는 것 이상의 향상된 침투 효과들을 얻도록 요구되었다. 보도에 따르면, 약물 혈중농도의 시간 과정은 생체점착성 미소구들이 비강점막을 거쳐서 인슐린 침투성의 급작한, 그러나 일시적인 증가를 야기하였다는 것을 제시하였다. 본 발명에서의 사용을 위한 다른 점막점착성 고분자들, 예를 들어, 키토산은, 보도에 따르면, 상기 고분자들이 수용성 용액 또는 겔에 적용될 때조차도 어떤 점막 상피들의 침투성을 향상시킨다. 상피의 침투성에 직접 영향을 미치는 것으로 보고된 또 다른 점막점착성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid)과 그의 에스테르 유도체들이다. 본 발명의 병용투여 그리고/또는 조합 제형방법들 및 방법들에서 특히 유용 한 생체점착제는 키토산이고, 그의 유사체들과 유도체들 또한 유용하다. 키토산은 그의 낮은 독성 그리고 좋은 생체양립성의 선호할만한 성질들 때문에, 약제학적 및 의학적 응용들을 위하여 널리 사용되는, 비독성의, 생체양립적이고, 생체분해가능한 고분자이다. 키토산은 알카리와의 N-탈아세틸화 반응에 의하여 키틴(chitin)으로부터 제조되는 천연 폴리아미노사카라이드이다. 본 발명의 방법들 및 조성물들에서 사용되는, 키토산은 응용의 점막 자리에서 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 체류를 증가시킨다. 이러한 투여 모드는 또한 환자의 순응도와 만족도를 개선할 수 있다. 여기에서 추가로 제공되는, 본 발명의 방법들 및 조성물들은 선택적으로는 신규한 키토산 유도체 또는 화학적으로 변형된 형태의 키토산을 포함한다. 본 발명에서의 사용을 위한 그러한 하나의 새로운 유도체는 β-[1→4]-2-구아니디노-2-데옥시-D-글루코오스 고분자 (폴리-GuD)로 표시된다. 키토산은 키틴의 N-탈아세틸화된 생성물이고, 구강 및 비강내 제형들을 위한 미소구들을 제조하기 위하여 광범위하게 사용되었던 천연발생 고분자이다. 본 발명의 일측면에서, o-methylisourea는 키토산 아민을 그의 구아니디늄 모이어티(guanidinium moiety)로 변환하기 위하여 사용된다. 구아니디늄 화합물은, 예를 들어, pH 8.0 이상에서 키토산과 o-methylisourea의 등노르말(equinormal) 용액들 사이의 반응에 의하여 제조된다.

본 발명에서의 사용을 위한 생체점착제들로서 분류되는 추가적인 화합물들은 전형적으로는 생체점착성 화합물의 상보적 구조들과 점막 상피 표면의 성분 사이의 "수용체-리간드 상호작용들"로 분류되는 특정 상호작용들을 중재하므로써 작용한 다. 많은 자연적인 예들은, 렉틴-당 상호작용들로 예시된 것처럼, 이러한 형태의 특정 결합 생체점착을 예시한다. 렉틴들은 폴리사카라이드들 또는 글리코콘쥬게이트들에 결합되는 비면역 기원의 (당)단백질들이다.

몇몇 식물 렉틴들이 가능한 약제학적 흡수 촉진제들로서 조사되었다. 하나의 식물 렉틴, Phaseolus vulgaris hemagglutinin (PHA)는 쥐들에게로의 공급후 10% 초과의 높은 구강 생체이용율을 보여준다. 토마토(Lycopersicon esculeutum) 렉틴(TL)은 다양한 투여 모드들에 대하여 안정한 것으로 나타난다.

요약하면, 앞서 언급한 생체점착제들은 본 발명의 조합적 제형들과 병용 투여방법들에서 유용한데, 이들은 선택적으로 효과적인 양과 형태의 생체점착제를 결합하여 지속성을 연장하거나 그렇지않으면, 하나 이상의 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들, 모방약들 그리고 다른 생물학적 활성제들의 점막 흡수를 증가시킨다. 생체점착제들은 보조화합물들 또는 첨가제들로서 본 발명의 조합제형에 병용투여될 수 있다. 어떤 실시예들에서, 생체점착제는 '약제학적 접착제'로서 작용하는 반면, 다른 실시예들에서, 상기 생체점착제의 보조 송달 또는 조합 제형은, 일부 경우들에서는 상피 세포 "수용체들"과 특정 수용체-리간드 상호작용들을 촉진하므로써, 다른 경우들에서는 상피 투과율을 증가시켜 송달 표적 자리(예: 간, 혈장, 또는 춘 조직 또는 유체)에서 측정된 약물 농도 기울기를 상당히 증가시키므로써 비강 점막과 생물학적 활성제의 접촉을 강화하도록 기능한다. 본 발명에서의 사용을 위한 또 다른 추가적인 생체점착제들은 병용송달되거나 생체점착제와의 조합제형으로 송달되는, 점막으로 투여된 생체치료제들의 안정성을 향상시키는 효소(예: 프로테아제) 저해제들로서 작용한다.

리포좀들 및 미셀라 송달 매개체들( Liposomes and Micellar Vehicles )

본 발명의 병용투여방법들 및 조합 제형들은 효과적인 지질 또는 지방산 기본의 운반체들, 처리제들, 또는 운송체들을 결합하여, 혈당조절펩티드 단백질들, 유사체들, 모방약들, 그리고 다른 생물학적 활성제들의 점막 송달을 위한 개선된 제형들을 제공한다. 예를 들어, 다양한 제형들과 방법들이 점막 송달을 위하여 제공되는데, 점막 송달시 화학적 및 물리적 안정성을 향상시키고 (예를 들어, 단백질 가수분해, 화학적 변경 및/또는 변성에 의하여) 생물학적 활성제의 반감기를 증가시키기 위하여, 이들은 리포좀, 혼합된 미셀라 운반체, 또는 에멀션에 의하여 서로 섞이거나 캡슐화되거나, 혹은 리포좀, 혼합된 미셀라 운반체, 또는 에멀션과 병용투여되는, 펩티드 또는 단백질과 같은 하나 이상의 활성제들을 포함한다.

본 발명의 어떤 측면들에서, 생물학적 활성제들을 위한 특수화된 송달 시스템들은 리포좀으로서 알려진 작은 지질 액포들을 포함한다. 이들 리포좀들은 전형적으로는 천연의, 생체붕해가능한, 비독성의, 그리고 비면역성의 지질 분자들로부터 만들어지고, 펩티드들 및 단백질들을 포함하는 약물 분자들을 그들의 막들 내로 또는 막들 위로 효율적으로 포획하거나 결합할 수 있다. 본 발명에서 펩티드 및 단백질 송달 시스템으로서 리포좀들의 유인성은 캡슐화된 단백질들이 액포들 내에 그들의 바람직한 수용성 환경에서 남아있다는 사실에 의하여 증가되고, 반면에 리포좀의 막은 단백질 가수분해와 다른 탈안정화 인자들에 대항하여 그들을 보호한다. 비록 모든 알려진 모든 리포좀 제조 방법들이 그들의 독특한 물리적 및 화학적 성 질들로 인하여 펩티드들 및 단백질들의 캡슐화에 적합하지는 않지만, 몇몇 방법들은 실질적인 탈활성화없이 이들 거대분자들의 캡슐화를 허용한다.

본 발명에서의 사용을 위한 리포좀 제조를 위한 다양한 방법들이 이용가능하다. 미국특허번호 4,235,871; 4,501,728; 그리고 4,837,028. 리포좀 송달의 사용을 위하여, 생물학적 활성제는 전형적으로는 리포좀 또는 지질 액포 내에 포획되고, 혹은 액포의 외측에 결합된다.

리포좀들처럼, 점막 흡수를 위한 증가된 활성도를 가진 불포화된 장쇄 지방산들은 2층-유사 구조들(소위 "우파좀(ufasomes)")을 가진 폐쇄형 액포들을 형성할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 본 발명에서 점막의, 예를 들어, 비강내의 송달을 위한 생물학적 활성 펩티드들 및 단백질들을 포획하기 위하여 올레산을 이용하여 형성될 수 있다.

본 발명에서의 사용을 위한 다른 송달 시스템들은 천연 고분자 피브린 내에 캡슐화와 같은 매체들 양자의 유리한 성질들을 결합하기 위하여 고분자들과 리포좀들의 사용을 결합한다. 아울러, 이러한 송달 시스템으로부터 생체치료적 화합물들의 방출은 공유 교차결합의 사용과 피브린 고분자에 대한 반피브린분해제(antifibrinolytic agents)들의 첨가를 통하여 조절가능하다.

본 발명에서의 사용을 위하여 더욱 단순화된 송달 시스템들은, 지질 운반체 그리고 단백질들 및 다중음이온 핵산들(polyanionic nucleic acids)과 같이 대전된 생물학적 활성제들 사이의 정전상호작용을 제공하도록 효과적으로 채용될 수 있는, 운송체들 또는 운반체들로서 양이온 지질들의 사용을 포함한다. 이는 약물 투여 및 /또는 전신부분들로의 후속의 송달에 적합한 형태로 약물들의 효율적인 패킹(packing)을 허용한다.

본 발명에서의 사용을 위한 추가적인 운송체들은 지방산들을 갖는 계면활성제 혼합 미셀들뿐만 아니라 장쇄 및 중쇄 지방산들을 포함한다. 에스테르의 형태로 가장 자연스럽게 발생하는 지질들은 점막 표면들을 통하는 그들 자신의 수송에 대하여 가장 중요한 암시들을 가진다. 유리 지방산들 및 부착된 극성 기들을 갖는 그들의 모노글리세라이드들은 침투 증진제들로서 장의 장벽에 대하여 작용하는 혼합 미셀들의 형태로 보여졌다. 유리 지방산들(12 내지 20개의 탄소원자들까지 변화하는 사슬 길이를 갖는 카복실산들) 및 그들의 극성 유도체들의 기능을 변경하는 장벽의 이러한 발견은 점막 흡수 증강제들로서 이들 작용제들의 응용에 대한 광범위한 연구를 자극하였다.

본 발명의 방법들에서의 사용을 위하여, 장쇄 지방산들, 특히 융합 지질들(올레산, 리놀레산, 리놀레산, 모노올레인 등과 같은 불포화지방산들 및 모노글리세라이드들)은 혈당조절 펩티드, 유사체들 및 모방약들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들의 점막 송달을 증진시키는 유용한 운반체들을 제공한다. 중쇄 지방산들 (C6 내지 C12)과 모노글리세라이드들 또한 장의 약물 흡수에서 향상된 활성도를 가지는 것으로 나타났고 본 발명의 점막 송달 제형들 및 방법들에서 사용을 위하여 적합하게 될 수 있다. 아울러, 중쇄 및 장쇄 지방산들의 나트륨 염들은 본 발명에서 생물학적 활성제들의 점막 송달을 위하여 효과적인 운송체이고 흡수증진제들이다. 이처럼, 지방산들은 나트륨염들의 가용성 형태들로 혹은 비독성 계면활성제들, 예를 들어, 폴리옥시에틸레이티드 하이드로지네이티드 카스터 오일(polyoxyethylated hydrogenated castor oil), 소듐 타우로콜레이트 등의 첨가에 의하여 채용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 다른 지방산 및 혼합된 미셀라 조제약품들은, 선택적으로는 글리코콜레이트 및 타우로콜레이트와 같은 담즙염들과 결합되는, Na 카프릴레이트 (C8), Na 카프레이트 (C10), Na 라우레이트 (C12) 또는 Na 올레이트 (C18)를 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

페기레이션( Pegylation )

본 발명의 추가적인 방법들 및 조성물들은 고분자 물질들, 예를 들어, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 글리코펩티드, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리아미노산들의 공유결합에 의한 생물학적 활성 펩티드 및 단백질의 화학적 변형을 포함한다. 결과적인 콘쥬게이트 펩티드들과 단백질들은 점막 투여를 위한 그들의 생물학적 활성도들과 용해도를 보유한다. 대안적인 실시예들에서, 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들과 모방약들, 그리고 다른 생물학적 활성 펩티드들과 단백질들은 폴리알킬렌 옥사이드 고분자들, 특히 폴리에틸렌 글리콜들 (PEG)에게 콘쥬게이트된다. 미국특허번호 4,179,337.

본 발명에서의 사용을 위한 아민-반응성 PEG 고분자들은 2000, 5000, 10000, 12000, 그리고 20000의 분자량을 갖는 SC-PEG; U-PEG-10000; NHS-PEG-3400-biotin; T-PEG-5000; T-PEG-12000; 그리고 TPC-PEG-5000을 포함한다. 생물학적 활성 펩티드들과 단백질들의 PEGlation은 카복실 자리들(예를 들어, 카복실 말단 외에 아스파트 산 또는 글루탐산 기들)의 변형에 의하여 달성될 수 있다. 산성 조건들 하에서 카보디이미드-활성화된(carbodiimide-activated) 단백질 카복실 기들의 선택적 변형에서 PEG-히드라지드(hydrazide)의 유용성이 설명되었다. 대안적으로, 생물학적 활성 펩티드들과 단백질들의 2기능성 PEG 변형이 채용될 수 있다. 일부 과정들에서, 리신, 아스파트산 및 글루탐산을 포함하는 대전된 아미노산 잔류기들은 단백질 표면들에서 용매 접근가능한 두드러진 경향을 가진다.

활성제들의 다른 안정화 변형들

PEGlation 외에도, 본 발명에서의 사용을 위한 펩티드들 및 단백질들과 같은 생물학적 활성제들은 다른 알려진 보호 화합물 또는 안정화 화합물에게로의 콘쥬게이션을 통하여 활성제를 차단, 예를 들어, 하나 이상의 면역글로불린 사슬들과 같이 하나 이상의 운반체 단백질들에 링크된 활성 펩티드, 단백질, 유사체 또는 모방제를 이용하여 융합 단백질을 생성하므로써 순환 반감기를 높이도록 변형될 수 있다.

제형 및 투여

본 발명의 점막 송달 제형들은 전형적으로는 하나 이상의 약제학적으로 타당한 운반체들 그리고, 선택적으로는 다른 치료적 성분들에게 결합된, 혈당조절 펩티드, 유사체 및 모방제들을 포함한다. 운반체(들)는 제형의 다른 성분들과 양립적이고 대상에게서 타당하지 않은 해로운 효과를 이끌어내지 않아야 한다는 점에서 "약제학적으로 타당"하여야 한다. 그러한 운반체들은 여기 위에서 설명되거나 그렇지 않으면 약리학의 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 제형은 투여될 생물학적 활성제가 양립할 수 없는 것으로 알려진 효소들 또 는 산화제들과 같은 물질들을 포함하지 말아야 한다. 이런 제형들은 약학의 기술에서 잘 알려진 방법들 중 하나로 제조된다.

본 발명의 조성물들 및 방법들에서, 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체와 모방제들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들은 구강의, 직장의, 질의, 비강내의, 폐내의, 또는 피부에 바르는 송달에 의하거나, 혹은 눈, 귀, 피부 또는 다른 점막 표면들로의 국소적 송달에 의하는 것을 포함하는 다양한 점막 투여 모드들에 의하여 대상 환자들에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체와 모방제들, 그리고 여기에서 개시된 다른 생물학적 활성제들은 근육내의, 피하내의, 정맥내의, 관절내의, 복강내의, 또는 비경구적 경로들에 의하는 것들을 포함하는 비점막 경로들에 의하여 병용 또는 보조적으로 투여될 수 있다. 다른 대안적 실시예들에서, 생물학적 활성제(들)은, 예를 들어, 적합한 액체 또는 고체 운반체에 생물학적 활성제를 함유하는 ex vivo 조직 또는 기관 치료 제형의 성분으로서, 포유동물 대상으로부터 기원하는 세포들, 조직들 또는 기관들에게로의 직접 노출에 의하여 ex vivo 투여될 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물들은 비강 스프레이 또는 폐 스프레이로서 수용액으로 투여될 수 있고 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 공지된 다양한 방법들에 의하여 분배될 수 있다. 비강 스프레이로서 액체들을 분배하기 위한 바람직한 시스템들이 미국특허번호 4,511,069에 개시되어 있다. 제형들은 다중투여 용기들, 예를 들어, 미국특허번호 4,511,069에서 개시된 밀봉 디스펜싱 시스템에 제공될 수도 있다. 추가적인 에어로졸 송달 형태들은 약제학적 용매, 예를 들어, 물, 에탄 올, 또는 이들의 혼합물에 용해되거나 현탁된 생물학적 활성제를 송달하는, 예를 들어, 압축 공기-, 제트(jet)-, 초음파의-, 그리고 압전성 분무기들을 포함할 수 있다. 본 발명의 에어로졸 제형은 크기가 1 내지 700 마이크론 범위인 직경을 가지는 작은 방울들을 가질 수 있다.

본 발명의 조성물들 및 제형들은 50 내지 350 mOsm/L, 또는 50 내지 300 mOsm/L의 물삼투압 농도를 가질 수 있다. 토니시파이어(tonicifier)는 제형의 물삼투압농도, 삼투질농도, 또는 긴장성을 조절하기 위하여 사용될 수도 있다.

본 발명의 비강 및 폐 스프레이 용액들은 선택적으로 비이온성 계면활성제(예: 폴리소베이트-80)와 같은 표면 활성제, 그리고 하나 이상의 완층제들로 제형화된, 상기 약물 또는 송달될 약물을 포함한다. 본 발명의 일부 실시예들에서, 상기 비강 스프레이 용액은 추진제(propellant)를 더 포함한다. 비강 스프레이 용액의 pH는 선택적으로는 약 pH 3.0과 9 사이, 바람직하게는, 7.0±0.5이다. 이들 조성물들에서의 사용을 위한 적합한 완충제들은 위에서 설명된 것들이나 그렇지 않으면 이 기술에서 알려진 것들이다. 방부제, 계면활성제, 분산제, 또는 가스들을 포함하는 다른 성분들이 화학적 안정성을 향상시키기 위하여 첨가될 수 있다. 적합한 방부제들은 페놀, 메틸, 메틸 파라벤, m-크레졸, 티오머살(thiomersal), 클로로부탄올, 벤질알코늄 클로라이드, 소듐 벤조에이트 등을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 적합한 계면활성제들은 올레산, 소비탄 트리올레이트(sorbitan trioleate), 폴리소베이트, 레시틴, 포스포티딜 콜린(phosphotidyl cholines), 그리고 다양한 장쇄 디클리세라이드와 인지질들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않 는다. 적합한 분산제들은 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid) 등을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 적합한 가스들은 질소, 헬륨, 클로로플루오로카본(CFCs), 하이드로플루오로카본(HFCs), 이산화탄소, 공기 등을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.

선택적 실시예들에서, 점막 제형들은 비강내 전들을 위하여 적절한 입자 크기 범위로 건조하고, 보통은 냉동건조된 적절한 입자 크기의 형태로 생물학적 활성제를 포함하는 건조 분말 제형들로서 투여된다. 비강 또는 폐 통로들에서의 증착을 위하여 적합한 최소 입자 크기는 종종 약 0.5 μ 질량중위등가공기역학직경(mass median equivalent aerodynamic diameter, MMEAD), 일반적으로는 약 1 μ MMEAD, 그리고 더욱 전형적으로는 약 2 μ MMEAD이다. 비강통로에서 증착을 위하여 적합한 최대 입자 크기는 종종 약 10 μ MMEAD, 일반적으로는 약 8 μ MMEAD, 그리고 더욱 전형적으로는 약 4 μ MMEAD이다. 이들 크기 범위 내에서 비강내적으로 호흡가능한 분말들은 제트 밀링(jet milling), 스프레이 드라잉, 용매 석출, 초임계유체 응축 등과 같은 다양한 종래의 기술들에 의하여 생산될 수 있다. 적절한 MMEAD의 이들 건조 분말들은, 폐 또는 비강 흡입시, 환자의 호흡에 의존하여 분말을 에어로졸화된 양으로 분산시키는 종래의 건조 분말 흡입기(DPI)를 통하여 환자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 건조 분말은 분말을 에어로졸화된 양으로 분산하기 위하여 외부 동력원을 이용하는 공기보조장치들, 예를 들어, 피스톤 펌프를 통하여 투여될 수도 있다. 단일 에어로졸화된 양("puff")을 생성하기 위하여, 건조분말장치들은 전형적으로는 약 1 mg에서 20 mg 범위의 분말 덩어리를 요구한다. 요구되거나 원하여진 생물학적 활성제의 양이 이 양보다 적으면, 분말로 된 활성제는 전형적으로는 약제학적 건조 벌킹(bulking) 분말과 결합되어 요구되는 총 분말 덩어리를 제공할 것이다. 바람직한 건조 벌킹 분말들은 수크로오스, 락토오스, 덱스트로스, 만니톨, 글리신, 트레하로스, 인간 혈청 알부민(HSA), 그리고 전분을 포함한다. 다른 적합한 건조 벌킹 분말들은 셀로바이오스(cellobiose), 덱스트란(dextrans), 말토트리오스(maltotriose), 펙틴, 소듐 시트레이트, 소듐 아스코베이트 등을 포함한다.

본 발명에서 점막 송달을 위한 조성물들을 제형화하기 위하여, 생물학적 활성제는 활성제(들)의 분산을 위한 염기 또는 운반체뿐만 아니라 약제학적으로 타당한 다양한 첨가제들과 결합될 수 있다. 바람직한 첨가제들은 알기닌, 수산화나트륨, 글리신, 염산, 시트르산, 아세트산 등과 같은 pH 조절제들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 아울러, 국소 마취제(예: 벤질 알코올), 등장화제(isotonizing agents)(예: 염화나트륨, 만니톨, 소비톨), 흡수저해제(예: Tween 80), 용해도 증강제(예: 시클로덱스트린 및 그의 유도체), 안정화제(예: 혈청 알부민), 그리고 환원제(예: 글루타티온)이 포함될 수 있다. 점막 송달을 위한 조성물이 액체이면, 단일체로서 취해진 0.9% (w/v) 생리적 식염수의 삼투성을 참조하여 측정된, 제형의 삼투성은 전형적으로는 실질적이고, 비가역적인 조직 손상이 투여자리에서 비강 점막에서 야기되지 않을 값으로 조절된다. 일반적으로, 상기 용액의 삼투성은 약 1/3 내지 3, 더욱 전형적으로는 1/2 내지 2, 그리고 가장 빈번하게는 3/4 내지 1.7의 값으로 조절된다. 생리학적 활성제는 상기 활성제를 분산시키는 용량을 가진 친수성 화합물과 임의의 바람직한 첨가제들을 포함할 수 있는, 염기 또 는 운송체에 분산될 수도 있다. 상기 염기는 폴리카복실산 또는 그의 염들의 공중합체, 다른 단량체들(예: 메틸 (메트)아클리레이트, 아크릴산 등)을 갖는 카복시 무수물들(예: 말레 무수물), 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 친수성 비닐 고분자들, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체들, 그리고 키토산, 콜라겐, 알긴산 나트륨, 젤라틴, 히알루론산(hyaluronic acid), 및 그들의 비독성 금속염들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 종종, 생붕해가능한 고분자, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리(락트산-글리콜산)공중합체, 폴리하이드록시부티르산, 폴리(하이드록시부티르산-글리콜산)공중합체 그리고 이들의 혼합물들이 염기 또는 운반체로서 사용된다. 대안적으로나 혹은 추가적으로, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 수크로오스 지방산 에스테르 등과 같은 합성 지방산 에스테르들이 운반체로서 채용될 수 있다. 친수성 고분자들과 다른 운반체들은 단독으로 혹은 조합하여 사용될 수 있고, 부분적 결정화, 이온결합, 교차결합 등에 의하여 증진된 구조적 완전함이 상기 운반체에게 분배될 수 있다. 상기 운반체는 비강점막으로의 직접 송달을 위하여 유체 또는 점성용액, 겔, 페이스트, 분말, 미소구 그리고 필름을 포함하는 다양한 형태로 제공될 수 있다. 이러한 점에 있어서, 선택된 운반체의 사용은 생물학적 활성제의 흡수 촉진으로 귀결될 수 있다.

생물학적 활성제는 다양한 방법에 따라서 염기 또는 운반체에 결합될 수 있고, 활성제의 방출은 확산, 운반체의 분해, 또는 물 채널들의 관련 제형에 의하여 이루어질 수 있다. 일부 상황들에서는, 활성제가 적합한 분말, 예를 들어, 이소부 틸 2-시아노아크릴레이트로부터 제조되어 비강점막에 적용되는 생체양립형 분산 매체에 분산되는 마이크로캡슐(미소구) 또는 나노캡슐(나노구)에 분산되는데, 이는 서방형 송달 및 연장된 시간에 대한 생물학적 활성도를 생성한다.

본 발명에서 약제학적 작용제들의 점막 송달을 더욱 증진시키기 위하여, 활성제를 포함하는 제형들은 염기 또는 부형제로서 친수성의 저분자량 화합물을 함유할 수도 있다. 그러한 친수성 저분자량 화합물들은 생리적으로 활성인 펩티드 또는 단백질과 같은 수용성 활성제가 상기 염기를 통하여 상기 활성제가 흡수되는 체표면까지 확산할 수 있는 통로 매체를 제공한다. 상기 친수성의 저분자량 화합물은 선택적으로는 점막 또는 투여 분위기로부터 수분을 흡수하여 수용성 활성 펩티드를 용해한다. 상기 친수성 저분자량 화합물의 분자량은 일반적으로 1000미만이고, 바람직하게는 3000미만이다. 예시적인 친수성 저분자량 화합물은 올리고-, 디-와 같은 폴리올 화합물들, 그리고 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 소비톨(sorbitol), 락토오스(lactose), L-아라비노스(L-arabinose), D-에리트로스(D-erythrose), D-리보스(D-ribose), D-크실로스(D-xylose), D-만노스(D-mannose), 트레하로스(trehalose), D-갈락토스(D-galactose), 락투로스(lactulose), 셀로비오스(cellobiose), 젠티비오스(gentibiose), 글리세린(glycerin) 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 단당류들을 포함한다. 본 발명에서 운반체로서 유용한 친수성 저분자량 화합물들의 다른 예들은 N-메틸피롤리돈, 그리고 알코올들(예: 올리고 비닐 알코올, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)을 포함한다. 이들 친수성 저분자량 화합물들은 단독으로 또는 서로 조합하여 또는 비강내 제형의 다른 활성 또는 불활성 성분들과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물들은 대안적으로는 약제학적으로 타당한 운반체들로서, pH 조절 및 완충제들, 삼투성 조절제들, 습윤제들 등과 같이 생리학적 조건들을 근접시키는데 요구되는 물질들, 예를 들어, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate), 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있다. 고체 조성물들을 위하여, 종래의 비독성의 약제학적으로 타당한 운반체들이 사용될 수 있는데, 이들은, 예를 들어, 약제수준의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탤컴(talcum), 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 생물학적 활성제를 투여하기 위한 치료 조성물들은 또한 용액, 마이크로에멀션, 또는 활성성분들의 고농도에 적합한 다른 규칙적인 구조로 제형화될 수 있다. 상기 운반체는 용매 또는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적당한 혼합물들을 포함하는 분산매일 수 있다. 용액들을 위한 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의하여, 분산가능한 제형들의 경우 원하는 입자 사이즈의 유지에 의하여, 그리고 계면활성제들의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 등장화제들, 예를 들어, 당들, 만니톨, 소비톨과 같은 폴리알코올들, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 생물학적 활성제의 연장 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염들 및 젤라틴을 포함하므로써 일어날 수 있다.

본 발명의 어떤 실시예들에서, 생물학적 활성제는 시간-방출 제형, 예를 들어, 서방형 고분자를 포함하는 조성물로 투여된다. 상기 활성제는 빠른 방출에 대항하여, 예를 들어, 고분자, 마이크로캡슐화된 송달 시스템 또는 생체점착성 겔과 같은 조절된 방출 운송체(vehicle)를 보호하려는 운반체들(carriers)과 함께 제조될 수 있다. 본 발명의 다양한 조성물들에서, 활성제의 연장된 송달은 흡수를 지연시키는 작용제들, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 하이드로겔들 및 젤라틴을 조성물 내에 포함하므로써 일어날 수 있다. 생물학적 활성제의 조절된 방출 제형들이 요구될 때, 본 발명에 따라서 사용을 위하여 적합한 방출제어 결합제(binder)들은 상기 활성제에 대하여 불활성이고 상기 생물학적 활성제를 결합할 수 있는 임의의 생체 양립가능한 방출제어 물질을 포함한다. 그러한 수많은 물질들은 이 기술에서 알려져 있다. 유용한 방출제어형 결합제들은 그들의 비강내 송달 뒤에 오는 생물학적 조건들(예를 들어, 비강 점막 표면에서, 또는 경점막 송달 뒤에 오는 체액의 존재하에서) 하에서 느리게 대사되는 물질들이다. 적절한 결합제들은 생체 양립가능한 고분자들 및 서방형 제형들에서 이 기술에서 앞서 사용된 공중합체들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 그러한 생체 양립가능한 화합물들은 비독성이고 주위의 조직들에 대하여 불활성이고, 비강 자극, 면역반응, 염증 등과 같은 상당한 부작용들을 일으키지 않는다. 이들 화합물들은 생체 양립가능하고 신체로부터 쉽게 제거되는 신진대사 생성물들로 신진대사된다. 이러한 관계에 있어서 사용을 위한 예시적인 고분자 물질들은 가수분해 가능한 에스테르 연결들을 갖는 공중합 및 동종중합(homopolymeric) 폴리에스테르들로부터 유래된 고분자 기 질들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 수많은 이들 고분자 물질들은 생붕해가능하고 독성을 갖지 않거나 낮은 독성을 갖는 붕해 생성물로 이끌리는 것으로 알려져 있다. 예시적인 고분자들은 폴리글리콜산(PGA)과 폴리락트산(PLA), 폴리(DL-락트산-코-글리콜산)(DL PLGA), 폴리(D-락트산-글리콜산)(D PLGA)와 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(L PLGA)를 포함한다. 다른 적합한 생붕해가능한(biodegradable 또는 bioerodable) 고분자들은 폴리(엡실론-카프로락톤), 폴리(엡실론-아프로락톤-CO-락트산), 폴리(베타-하이드록시 부티르산), 폴리(알킬-2-시아노아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)와 같은 하이드로겔, 폴리아미드, 폴리(아미노산)(즉, L-류신, 글루탐산, L-아스파트산 등), 폴리(에스테르 우레아), 폴리(2-하이드록시에틸 DL-아스파트아미드), 폴리아세탈 고분자들, 폴리오르소에스테르들, 폴리카보네이트, 폴리말레아미드, 폴리사카라이드 그리고 이들의 공중합체들을 포함한다. 그러한 제형들을 제조하기 위한 많은 방법들은 일반적으로 이 기술에 통상의 지식을 가진 자들에게 알려져 있다. 다른 유용한 제형들은 방출제어형 조성물들, 예를 들어, 마이크로캡슐들, 미국특허번호 4,652,441과 4,917,893, 마이크로캡슐들과 다른 제형들을 만드는데 유용한 락트산-글리콜산 공중합체들, 미국특허번호 4,677,191과 4,728,721, 그리고 수용성 펩티드를 위한 서방형 조성물들, 미국특허번호 4,675,189를 포함한다.

비강 및 폐송달을 위하여, 스프레이로서 치료액들의 조절된 에어로졸 디스펜싱을 위한 시스템들은 잘 알려져 있다. 일 실시예에서, 활성제의 정량들이 특별하게 구성된 기계 펌프 밸브에 의하여 송달된다. 미국특허번호 4,511,069.

투여량

예방 및 치료 목적을 위하여, 여기에서 개시된 생물학적 활성제(들)은 연장된 시간 주기에 대하여 연속적인 송달(예를 들어, 연속적인 피부에 바르는, 점막의, 또는 정맥내의 송달)을 통하여, 단일 알약 송달로, 혹은 반복된 투여 프로토콜(예를 들어, 시간마다, 날마다, 주마다 반복되는 투여 프로토콜에 의하여)로 대상에게 투여될 수 있다. 이러한 관계에 있어서, 혈당 조절 펩티드의 치료적으로 효과적인 투여량은, 임상적으로 상당한 결과들을 낳아서 위에서 주장된 표적 질환 또는 병적상태와 관련한 하나 이상의 징후들 또는 탐지가능한 병적상태들을 경감시키는, 연장된 예방 또는 치료 계획에서 반복되는 1회 투여량들을 포함한다. 이러한 관계에 있어서 효과적인 투여량들의 결정은 전형적으로는 인간 임상 시험들에 앞서 수행되는 동물 모델 연구들에 기본을 두고 대상에게서 표적 질병 징후들 또는 병적상태들의 발생 또는 심각성을 크게 감소시키는 효과적인 투여량들 및 투여 프로토콜들을 결정하므로써 지침이 마련된다. 이러한 점에서 적합한 모델들은, 예를 들어, 쥐(murine, rat), 돼지(porcine), 고양이(feline), 인간을 제외한 영장류, 그리고 이 기술에서 알려진 다른 타당한 동물 모델 대상들을 포함한다. 대안적으로, 효과적인 투여량들은 시험관내 모델들(예를 들어, 면역성 및 병리조직학적 평가들)을 이용하여 결정될 수 있다. 그러한 모델들에서, 생물학적 활성제의 치료적으로 효과적인 양(예를 들어, 원하는 반응을 이끌어내기 위하여 비강내로 효과적인, 피부에 발라서 효과적인, 정맥주사로 효과적인, 또는 근육내주사로 효과적인 양들)을 투여하기 위한 적정 농도 및 1회 투여량을 결정하기 위하여 전형적으로는 보통의 계산들 또는 조절들만이 요구된다.

대안적인 실시예에서, 본 발명은 혈당조절 펩티드의 비강내 송달을 위한 조성물들 및 방법들을 제공하는데, 여기서 혈당 조절 펩티드 화합물(들)은 연장된 투여 기간 동안 혈당조절 펩티드 화합물(들)의 치료적으로 효과적인 상승 또는 하강된 맥박수를 유지하기 위한 날마다 혹은 주마다의 일정동안 대상에게 혈당조절 펩티드의 다수의 투여들을 포함하는 비강내의 효과적인 투여량 계획을 통하여 반복적으로 투여된다. 상기 조성물들 및 방법들은 8시간 내지 24시간 연장 투여 기간 동안에 혈당조절 펩티드의 치료적으로 효과적인 상승 및 하강 맥박수를 유지하기 위하여 매일 1회와 6회 사이에서 비강의 제형으로 환자에 의하여 자기투여되는 혈당조절 펩티드 화합물(들)을 제공한다.

키트들 ( Kits )

본 발명은 또한 상기에서 설명된 약제학적 조성물들, 활성 성분들, 그리고/또는 포유류 대상들에게서 질병들과 다른 병적상태들의 방지 및 치료에서의 사용을 위하여 이들을 투여하기 위한 수단을 포함하는 키트들, 패키지들 그리고 다중용기 단위들을 포함한다. 간략하게, 이들 키트들은 여기에서 개시되어 점막 송달을 위한 약제학적 제조로 제형화된 점막송달 증진제들과 조합하여 하나 이상의 혈당조절 펩티드 단백질들, 유사체들 또는 모방약들, 그리고/또는 다른 생물학적 활성제들을 포함하는 용기 또는 제형을 포함한다.

본 발명의 비강내 제형들은 임의의 스프레이 병 또는 주사기를 이용하여, 혹은 점안법에 의하여 투여될 수 있다. 비강의 스프레이 병의 예는 분출당 0.1 mL의 양을 송달하고 36.05 mm의 디스프루베(disprube) 길이를 갖는 "Nasal Spray Pump w/ Safety Clip," Pfeiffer SAP # 60548이다. 이 병은 미국 NJ 프린스톤의 Pfeiffer로부터 구입될 수 있다.

혈당조절펩티드의 에어로졸 비강 투여

우리는 GRP들이 비강 스프레이 또는 에어로졸을 이용하여 비강내로 투여될 수 있다는 사실을 발견하였다. 이는 놀라운 것인데, 왜냐하면 많은 단백질들과 펩티드들이 스프레이 또는 에어로졸을 생산할 시에 액츄에이터에 의하여 발생된 기계적인 힘들로 인하여 변형되거나 변성되는 것으로 나타났기 때문이다.

1. 에어로졸-압력으로 패키지로 만들어지고 적절한 밸브 시스템의 활성화시에 방출되는 치료학적 활성 성분들을 함유하는 제품.

2. 정량 에어로졸(metered aerosol)-매 활성화시 스프레이의 균일양의 송달을 허용하는 정량 밸브들로 구성되는 가압된 투여량 형태.

3. 분말 에어로졸-압력으로 패키지로 만들어지고 분말의 형태로 되어 적절한 밸브 시스템의 활성화시 방출되는 치료적 활성 성분들을 함유하는 제품.

4. 스프레이 에어로졸-제품을 습식 스프레이로서 밀어내는데 필요한 힘을 제공하는 추진제로서 압축된 가스를 이용하는 에어로졸 제품으로서, 일반적으로 수용성 용매들 내의 치료제들의 용액들에 적용가능하다.

5. 스프레이-공기 또는 스팀의 제트에 의하여 미세하게 분리되는 액체. 비강 스프레이 약물 제품들은 가압되지 않은 디스펜서들에서 용액들 또는 부형제들의 혼합물들에 용해되거나 현탁된 치료적으로 활성 성분들을 포함한다.

6. 정량 스프레이-매 활성하시 스프레이의 특정량의 디스펜싱을 허용하는 밸브들로 구성되는 가압되지 않은 투여 형태.

7. 현탁액 스프레이-액체 운송체에 코스 방울(course droplets)의 형태로 또는 미세하게 분리된 고체들로서 분산된 고체 입자들을 포함하는 액체 제제.

약물 송달 장치("DDD")로서 정량 비강 스프레이 펌프들에 의하여 방출되는 에어로졸 스프레이의 유동 특징. 스프레이 특징은 연구 및 개발, 품질보증 및 새롭고 현존하는 비강 스프레이 펌프들을 위한 안정성 시험 과정들의 식품의약국("FDA") 승인을 위하여 필요한 조정 서브미션의 필수부분이다.

스프레이의 기하학적 형태의 완전한 특징은 비강 스프레이 펌프들의 전체 성능의 가장 좋은 지시계인 것으로 나타났다. 특히, 스프레이가 분사될 때 스프레이의 발산각(깃털의 기하적형태)의 측정들; 스프레이의 횡단면의 타원도, 균일성 및 입자/방울 분포(스프레이 패턴); 그리고 개발한 스프레이의 시간 전개는 비강 스프레이 펌프의 특징에서 가장 대표적인 성능 분량들인 것으로 나타났다. 품질보증과 안정성 시험 동안에, 깃털의 기하학적 형태와 스프레이 패턴 측정들은 비강 스프레이 펌프들에 대하여 승인된 데이터 임계치들과의 일치 및 적합을 증명하기 위한 주요 식별자들이다.

정의

깃털 높이-액츄에이터 팁으로부터, 선형적 흐름의 붕괴때문에 깃털각이 비선형이 되는 지점의 측정. 디지털 이미지들의 시각적 조사들에 근거하여, 그리고 스프레이 패턴의 가장 먼 측정점과 일치하는 폭에 대한 측정점을 확립하기 위하여, 30 mm 높이가 이 연구를 위하여 정의된다.

장축-베이스 단위들 (mm)로 COMw를 교차하는 적합 스프레이 패턴 내에 그려질 수 있는 가장 큰 코드.

단축-베이스 단위들 (mm)로 COMw를 교차하는 적합 스프레이 패턴 내에 그려질 수 있는 가장 작은 코드.

타원율-단축에 대한 장축의 비율, 바람직하게는 1.0과 1.5 사이, 가장 바람직하게는 1.0과 1.3 사이.

D₁₀-시편의 총 액체 부피의 10%가 더 작은 직경(μm)의 방울들로 구성되는 방울의 직경.

D₅₀-시편의 총 액체 부피의 50%가 더 작은 직경(μm)의 방울들로 구성되는 방울의 직경.

D₉₀-시편의 총 액체 부피의 90%가 더 작은 직경(μm)의 방울들로 구성되는 방울의 직경.

스팬(span)-분포 폭의 측정, 값이 작을수록 분포가 더 좁다. 스팬은 다음과 같이 계산된다:

%RSD-상대표준편차%, 시리즈의 평균으로 나누어지고 100으로 곱하여진 표준편차, 또한 %CV로서 알려진다.

부피-매 활성화마다 송달 장치로부터 방출된 액체 또는 분말의 부피, 바람직하게는 0.01 mL와 약 2.5 mL 사이이고 가장 바람직하게는 0.02 mL와 0.25 mL 사이.

여기에서 언급된 모든 간행물들, 참증들, 특허들, 특허 공개 및 특허출원들 각각은 전체가 참조로서 구체적으로 결합된다.

본 발명이 어떤 실시예들과 관련하여 설명되었고 많은 상세한 내용들이 예시의 목적들을 위하여 주장되었지만, 본 발명이 추가적인 실시예들을 포함하고 여기에서 설명된 상세한 내용들의 일부가 본 발명을 벗어나지 않고서 상당히 변화될 수도 있다는 것은 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 분명할 것이다. 본 발명은 그러한 추가적인 실시예들, 변형들 그리고 등가물들을 포함한다. 특히, 본 발명은 다양한 예시적인 성분들과 예들의 특징들, 용어들 또는 요소들의 조합을 포함한다.

본 발명을 설명하는데 있어서, 그리고 청구항들에서 "a", "an", "the"의 용어들의 사용은 단수형태와 복수의 형태를 포함하는 것으로 될 것이다. "포함하는(comprising)", "가지는(having)", "포함하는(including)"의 용어들은 예를 들어, "포함하지만 한정되지는 않는"을 의미하는 오픈-엔디드(open-ended) 용어들로서 해석될 것이다. 값들이 여기에서 개별적으로 언급되었다면, 그 범위 내에 있는 값들이 일부가 명시적으로 언급되었던 그렇지 않았던, 여기에서 값들의 범위의 언급은 개별적으로는 그 범위에 해당하는 각각 별개의 값을 말한다. 여기에서 채용된 특정 값들은 예시적인 것으로서 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해될 것이다.

여기에서 주어진 예들, 그리고 여기에서 사용된 예시적인 언어는 단지 예시의 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다.

예들

예 1

인슐린 아스파트 제형들

표 1은 경상피 저항 평가(transepithelial resistance assay, TER), 세포 생육능력 평가(MTT), 유산염 디하이드로게나제(dehydrogenase) 세포 사멸 평가(LDH), 그리고 조직 침투 평가를 위한 시험관내 EpiAirway Model System을 이용하여 시험된 12개의 인슐린 아스파트 제형들을 설명한다. 결과들은 상당한 세포 독성이 없는 상태에서 어느 제형이 가장 큰 정도의 조직 침투 및 TER 감소를 달성하였는지를 판단하기 위하여 사용되었다.

인슐린 아스파트는 위치 B28에서 프롤린을 위한 아스파트산의 하나의 치환을 제외하고 일반적 인간 인슐린과 일치하는 인슐린 유사체이다. NovoLog(NovoLog^TM; Novo Nordisk Pharmaceuticals)는 무균의, 수용성의, 깨끗한, 그리고 무색의 용액으로서, 인슐린 아스파트(B28 asp 보통의 인간 인슐린 유사체) 100 Units/mL, 글리세린 16 mg/mL, 페놀 1.50 mg/mL, 메타크레졸 1.72 mg/mL, 아연 19.6 ㎍/mL, 디소듐 하이드로젠 포스페이트 디하이드레이트(desodium hydrogen phosphate dihydrate) 1.25 mg/mL, 그리고 염화나트륨 0.58 mg/mL를 함유한다. NovoLog는 7.2-7.6의 pH를 가진다. 새로운 인슐린 아스파트 제형들이 발생되었다. 0.5 mL의 총부피가 각 제형을 위하여 제조되었다. 상기 제형들은 가변적인 농도의 인슐린 아스파트, NovoLog 희석제, 그리고 부형제들 메틸-β-시클로덱스트린(M-β-CD), L-α-포스파티딜콜린 디데카노일(DDPC), 그리고 디소듐 에데테이트(disodium edetate, EDTA)를 단독으로한 조합하여 함유하였다. 부형제들 없는 조절들도 본 연구에 포함되었다. 원하는 pH가 달성될 때까지 2N HCl 또는 NaOH의 작은 양이 필요시 제형들에 첨가되었다. 상기 제형들을 조제하기 위하여 사용된 시약들은 표 2에 도시된다.

하기 표 1은 시험관내 연구들을 위한 인슐린 아스파트 제형들에 관한 것이고, 하기 표 2는 인슐린 아스파트 제형들 시약들에 관한 것이다.

시편	인슐린 아스파트(U/mL)	Me-β-CD/ DDPC/EDTA (mg/mL)	제형에 남아있는 NovoLog 희석제의 %	pH
1	5	45/1/1	5% of NovoLog Diluent	7
2	5	45/1/1	5% of NovoLog Diluent	4
3	5	0	5% of NovoLog Diluent	7
4	5	0	5% of NovoLog Diluent	4
5	5	45/1/1	100% of NovoLog Diluent	7
6	5	45/1/1	100% of NovoLog Diluent	4
7	5	0	100% of NovoLog Diluent	7
8	5	0	100% of NovoLog Diluent	4
9	20	45/1/1	20% of NovoLog Diluent	4
10	20	45/1/1	20% of NovoLog Diluent	3
11	5	0/0/10	5% of NovoLog Diluent	4
12	5	45/2/10	5% of NovoLog Diluent	4

시약	등급	판매자	Cat#	Nastech Lot#/ 판매자 Lot#
NovoLog	n/a	Novo Nordisk	n/a	PW51706
Methy1-β-Cyclodextrin	Pharma	Wacker	6007005	71P018
L-α-Phosphatidycholine didecanoyl	GMP	NOF	MC-1010	0412101
Edetate Disodium	USP	Spectrum	ED150	TF0419
Sterile Water For Irrigation	USP	Spectrum/Braun	S1944	J5C225
2N Hydrochloric Acid	Research	JT Baker	5616-02	B18512
2N Sodium Hydroxide	Research	JT Baker	5633-02	B06503

예 2

비강 점막 송달-투과 운동학 및 세포독성

다음의 방법들은 일반적으로 본 발명의 제형들 및 방법들에서 인슐린 아스파트와의 조합 제형 또는 병용 투여를 위하여 여기에서 개시된 다양한 점막 송달 증진제들의 효능과 특징들을 판단하는 것뿐만 아니라 인슐린에 대한 비강 점막 송달 변수들, 운동학들 그리고 부작용들을 평가하는데 유용하다. 하나의 예시적 프로토콜에서, 침투 운동학들과 타당하지 않은 세포독성의 부족은 인슐린 아스파트로 예시된 생물학적 활성치료제와 조합하여 위에서 개시된 것처럼 비강내 송달 증진제에 대하여 나타내어진다.

세포배양

EpiAirway 시스템은 호흡기를 라이닝하는 가중층 상피(pseudostratified epithelium)의 모델로서 MatTek사(Ashland, MA)에 의하여 개발되었다. 상피 세포들은 다공성막-바닥에 있는 세포 배양 인서트들 위의 공기-액체 계면에서 성장하는데, 이는 고분극화된 형태학으로의 세포들의 차별화로 귀결된다. 첨부 표면(apical surface)은 미세융모의 초미세구조를 갖는 섬모를 가지고 상피는 점액을 생성한다(뮤신의 존재는 이뮤노블로팅(immunoblotting)에 의하여 확인되었다). 상기 인서트들은 0.6 cm²의 표면적을 제공하는, 0.875 cm의 직경을 가진다. 세포들은 선적전 대략 3주 동안 공장에서 인서트들 위로 배양된다.

EpiAirway^TM 배양막들은 실험이 시작되기 전날에 받았다. 이들 막들은 페놀 레드-프리 및 하이드로코티존-free Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에 선적되었다. 각 조직 인서트는 0.9 ml의 혈청이 없는 DMEM을 함유하는 6-웰 플레이트의 한 웰에 놓아두었다. 이후 상기 막들은 37℃/5% CO2에서 24시간동안 배양되어 조직들을 평형상태로 만들었다. 인서트들은 매 회복일 동안 공급되었다. DMEM을 기본으로 하는 배지는 혈청이 없지만 상피성장인자와 다른 인자들로 보충되었다. 상기 배지는 비강내 송달을 위하여 고려된 임의 시토킨(cytokine) 또는 성장인자의 내인성 레벨들에 대하여 시험되었고, 인슐린을 제외하고 현재까지 연구된 모든 시토킨들과 인자들은 없었다. 그들의 스탠드들(stands)에 대한 유닛들의 바닥들에 대한 접촉을 제공하기 위한 체적은 충분하였지만, 상피의 첨부표면은 공기와의 직접 접촉하도록 허용되었다. 무균의 트위저들(tweezers)이이 단계와 액체 함유 웰들로 유닛들의 송달을 포함하는 모든 후속 단계들에서 사용되어 유닛들의 바닥들과 배지 사이에서 공기가 확실하게 포획되지 않도록 하였다.

EpiAirway^TM 모델 시스템은 TER, 세포 생존능력(MTT), 세포독성(LDH) 그리고 침투에 대한 각 NovoLog 함유 제형의 효과를 평가하기 위하여 사용되었다. 이들 평가들은 아래에서 상세히 설명된다. 모든 실험들에서, 연구될 비강 점막 송달 제형은 각 유닛의 첨부표면에 100 μL의 체적으로 적용되었는데, 이는 전체 첨부표면을 덮기에 충분하였다. 첨부표면에 적용된 농도에서 시험 제형의 적절한 체적(일반적으로 단지 100 μL가 필요하다)은 ELISA 또는 다른 지정된 평가에 의하여 활성 물질의 농도의 후속 판단을 위하여 제쳐두었다.

경상피 전기저항( TER )

TER 측정은 전극 리드들을 가진 World Precision Instruments사의 Epithelial Voltohmeter에 연결된 조직 저항 측정 챔버(Tissue Resistance Measurement Chamber)를 이용하여 수행되었다. 먼저, 실험이 시작된 날에 각 인서트에 대하여 백그라운드 TER을 읽었다. TER을 읽은 후, 1 mL 신선한 배지를 6-웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 놓아두었다. 인서트들은 종이 타월 위에서 수분을 없애고 백그라운드 TER 측정들과 관련되는 수의 인서트들을 유지하면서 신선한 배지들을 가진 새로운 웰들에 인서트들을 놓아두었다. 100 μL의 실험제형을 각 인서트에 첨가하였다. 100 rpm과 37℃에서 1시간 동안 쉐이킹 인큐베이터에 인서트들을 놓아 두었다.

전극들과 조직 배양 블랭크 인서트는 눈금측정을 검사하기에 앞서 전원을 끈 상태로 적어도 20분 동안 평행상태도 만들어졌다. Endohm 조직 챔버에서 1.5 mL 배지와 블랭크 Millicel-CM 인서트에서 300 μL 배지로 백그라운드 저항을 측정하였다. 상부 전극을 배지 내에 가라앉히지만 인서트 막의 상부표면과 접촉하지 않도록 조정하였다. 블랭크 인서트의 백그라운드 저항은 5-20 오옴이었다. 각 TER 측정을 위하여, 300 μL 배지를 인서트에 첨가하였고 이후 Endohm 챔버에 두기 전에 상온에서 20분간 배양하여 TER을 읽었다. 저항은 (측정 저항 - 블랭크)×0.6 cm²로 표시하였다. 모든 TER 값들을 조직의 표면적 함수로서 보고하였다.

TER은 다음과 같이 계산한다:

TER = (R_I - R_b)×A

여기서 R_I는 막을 가진 인서트의 저항이고 R_b 는 블랭크 인서트의 저항이며, A는 막의 면적(0.6 cm²)이다. 대조값(대조 = 약 1000 ohms-cm²; 100까지 노멀라이즈된)에 상대적인 TER 값의 감소는 세포막 저항의 감소와 점막 상피세포 침투의 증가를 가리킨다. 1시간 배양이 완료되기 전, 조직 인서트를 인큐베이터로부터 제거하였다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 200 μL 신선한 배지를 놓아두었고 조직 인서트들을 24-웰 플레이트로 옮겼다. 200 μL의 신선한 배지를 각 조직 인서트에 조심스럽게 첨가하였다. 각 인서트에 대하여 TER을 다시 측정하였다.

조직 배양 인서트들을 6-웰 플레이트로부터 24-웰 플레이트로 옮긴 후, 기본배지를 3부분으로 분할하여 에펜도르프(eppendorf)에 저장하였다. 사용시까지 세 개의 모든 분할 배지를 -80℃에 놓아두었다.

유산 디하이드로지나제 ( LDH ) 평가

Promega사의 CytoTox 96 Cytotoxicity 평가 키트를 이용하여 세포들로부터 LDH의 방출을 측정하므로써 세포 사멸량을 평가하였다. 연구에서는 각 조직 배양 인서트에 대하여 세 개 한벌의 시편들을 사용되었다. 96-웰 플레이트의 트리플리케이트(triplicate)에 50 μL의 수확된 배지(4 ℃에서 저장된)를 로딩하였다. 세포가 없는 신선한 배지를 블랭크로서 사용하였다. 각 웰에 50 μL의 기질 용액(키트에 따라서 만들어진, Substrate Mix의 신선한 병에 첨가된 12 mL 평가 완충제)을 첨가하였고, 상기 플레이트들을 상온의 어두운 곳에서 30 분동안 배양하였다. 배양후, 각 웰에 50 μL의 정지액(stop solution)을 첨가하였고 KCJr 소프트웨어를 이용하여 490 nm에서 μQuant 광학 밀도 플레이트 리더로 플레이트를 읽었다.

MTT 평가

미토콘드리아의 환원효소 활성도를 시험하는 MTT 평가(MTT-100, MatTek 키트)에 의하여 각 조직 배양 인서트의 세포 생존능력을 시험하였다. 이 키트는 포르마잔(formazan) 염료에 대한 테트라졸륨(tetrazolium) 염의 흡수와 변형을 측정한다. MTT 농축액은 2 mL MTT:8 mL 배지의 비율로 배지로 완화 및 희석되었다. 희석된 MTT 농축액은 피펫(300 μL)을 이용하여 24-웰로 옮겼다. 조직 인서트들을 조심스럽게 건조시켜 플레이트 웰에 두었고 어두운 곳에서 37 ℃로 세 시간 동안 배양하였다. 배양후, 각 인서트를 플레이트로부터 제거하였고 조심스럽게 블로트하여(blot), 24-웰 추출 플레이트에 놓아두었다. 이후 세포 배양 인서트들을 웰마다 2.0 mL의 추출 용액에 침지시켰다(완전히 시편을 덮도록). 추출물의 증발을 감소시키기 위하여 추출 플레이트를 덮어서 밀봉하였다. 상온의 어두운 곳에서 밤새 배양후, 액체가 공급된 웰에 그 액체를 도로 부어넣었고, 인서트를 버렸다. 추출 블랭크와 함께, 각 웰로부터 추출 용액(50 μL)을 세 개씩 한조로 피펫으로 96-웰 마이크로티터(microtiter)에 옮겨놓았고, 150 μL의 신선한 추출 용액을 첨가하여 희석하였다. 시편들의 광밀도를 KCJr 소프트웨어를 이용하여 μQuant 광학 밀도 플레이트 리더로 550 nm에서 측정하였다.

TER 결과

실험 제형들을 위한 37 ℃에서 1시간의 배양 전후에 TER 측정들(ohms×cm²)을 대조군과 비교하였다. 결과들은 #7과 #8을 제외하고 증진제들을 함유한 제형들이 1시간 배양후 상당한 TER 감소를 가진다는 것을 보여준다.

MTT 결과

거의 모든 제형들은 대조군들에 비하여 상당히 좋은 세포 생존능력을 보여주었다. 대부분의 제형들에 대한 %MTT는 80% 이상이었다(#1, #6, 그리고 #12는 제외)

LDH 결과

시험한 대부분의 제형들은 매우 낮은 세포독소를 나타내는 매우 작은 LDH를 보여주었다.

요약

TER, MTT 그리고 LDH 평가들의 결과들은 #2, #6, #9, #10 그리고 #11 제형들 모두 독성의 증가없이 TER의 상당한 감소를 보인다는 것을 나타낸다.

예 3

인슐린 아스파트 침투성

ELISA는 인서트의 첨두를 거쳐서 기저측부까지 침투한 인슐린 또는 인슐린 유사체의 양을 평가하기 위하여 사용되었다. 인슐린은 MaTtek 배지에 존재하고, 배지 시편에 존재하는 평균 농도를 다른 모든 시편들로부터 차감하므로써 원천 데이터가 교정되었다.

이소-인슐린 ELISA 키트들을 Alpco Diagnostics로부터 구매하였다(Windham, NH, Cat #08-10-1128-01). 키트와 함께 제공된 평가 완충제로 시편들을 희석하였다. 테플론 코팅된 커버들을 가진 투명한 실란처리된 병들에 희석액을 조심스럽게 거꾸로 하여 혼합하였다. 시편들의 광학 밀도를 450 nm(프로토콜에 지시된 것처럼)에서 μQuant 광학 밀도 플레이트 리더와 KCJr 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.

로딩 체적은 인서트마다 100 μL였고, 침투 샘플링 시간은 60분이었다. 대조군들뿐만 아니라 각 제형을 n=3 인서트들을 이용하여 시험하였다. 이 연구를 위한 대조군들은 MatTek 기본 배지와 90% Triton X-100을 포함하였다. 각 조직 인서트를 0.95 mL의 MatTek 기본 배지를 포함하는 개별적인 웰에 놓아두었다. 인서트들의 첨두표면들 위에, 100 μL의 시험 제형이 연구 디자인에 따라서 적용되었고 시편들을 37 ℃에서 1시간 동안 쉐이커(~100 rpm)에 놓아두었다. 배양 기간의 말미에, 50 μL의 ~20,000 KIUnits의 아프로티닌(aprotinin)을 아래에 있는 각 배양 배지 샘플에 첨가하고 ELISA 분석을 위하여 2-8℃에서 저장하였다.

표 3은 ELISA에 의하여 평가된 기저측면 시편들로부터의 침투성 결과들을 보여준다. 평균은 실험 시편들로부터 단독 시편으로 배지에 존재하는 인슐린의 평균 양을 차감하므로써 교정되었다. 하기 표 3은 인슐린 아스파트 제형들을 시험한 % 침투 결과에 관한 것이다.

시편#	μU/mL						%
	인서트 a	인서트 b	인서트 c	평균	교정평균＊	StDev	침투율	StDev
1	143346	121821	149478	138215	76124	14525	15.2	2.9
2	109255	130398	130532	123395	61304	12246	12.3	2.4
3	56179	68222	73138	65846	3755	8726	0.8	1.7
4	49425	65647	75448	63507	1415	13143	0.3	2.6
5	60867	61155	60857	60960	-1132	169	-0.2	0.0
6	51795	62832	65177	59935	-2157	7146	-0.4	1.4
7	38615	58850	69527	55664	-6428	15700	-1.3	3.1
8	50687	67669	63726	60694	-1398	8888	-0.3	1.8
9	248232	204930	281721	244961	182870	38500	9.1	1.9
10	246821	288253	265140	266738	204647	20762	10.2	1.0
11	113468	171342	171056	151955	89864	33331	18.0	6.7
12	190538	148489	169822	169616	107525	21025	21.5	4.2
Media		51745	72438	62092	0	14632	0.0	2.9

이들 침투율 결과들은 비강내 제형들을 경유하여 인슐린 아스파트를 송달하기 위하여 침투 증진제들이 채용될 수 있다는 것을 보여준다. 많아야 ~1-2 %를 얻는 증진제들 없는 제형들에 비하여, 증진제를 포함하는 모든 제형들은 적어도 9%(~9-21%) 침투율을 가졌다. 침투율에서 가장 큰 증가를 가진 시편들은 #1, #2, #9, #10, #11, 그리고 #121를 포함하였다. TER, MTT, 그리고 LDH 결과들과 함께 수행될 때, 시편 #2 (5 U/mL 인슐린 아스파트, 45 mg/mL Me-β-CD, 1 mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 20% NovoLog 희석제, pH 4); #10(20 U/mL 인슐린 아스파트, 45 mg/mL Me-β-CD, 1 mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 20% NovoLog 희석제, pH 3); 그리고 #11(5 U/mL 인슐린 아스파트, 0 mg/mL Me-β-CD, 0 mg/mL DDPC, 10 mg/mL EDTA, 5% NovoLog 희석제, pH 4)는 가장 작은 세포 독성과 함께 침투율에서 가장 큰 증가를 가진다.

예 4

인슐린 침투능에 대한 NPG 와 PN159 효과

시험관내 실험들은 인슐린의 침투능에 대한 작은 분자와 펩티드를 기본으로 하는 증진제들 양자의 효과를 평가하였다. 7가지 다른 처리들이 첨두측에 적용된 0.1 U 인슐린과 함께 37 ℃에서 1시간 동안 EpiAirway 96 웰 플레이트들에게 적용되었다. 표준 곡선과 높고 낮은 대조들은 예상과 같았고 측면기저 배지에서 인슐린 스파이크(spike)는 거의 100% 회복을 보여주었다. 치료들은 PHS + 인슐린 0.1 U; 25 μM PN159 +인슐린 0.1 U; 50 μM PN159 +인슐린 0.1 U; PDF +인슐린 0.1 U; PBS + 인슐린 0.1 U +NPG 150 mM; 25 uM PN159 + 인슐린 0.1 U + NPG 150 mM; 그리고 PDF +인슐린 0.1 U + NPG 150 mM을 포함하였다.

본 연구에서 사용된 인슐린은 시그마 재조합 (효모 유래의) 인간 인슐린으로서 천연 서열을 가진다. 이 재조합 인간 인슐린은 프로-인슐린(pro-insulin)으로부터 유래되고 화학적, 물리적, 그리고 생물학적으로 인간 췌장 인슐린과 동일하다. PBS는 인산염 완충된 염수이다. PDF는 45 mg/mL 메틸-β-시클로덱스트린, 1 mg/mL 에틸렌디아민 테트라아세테이트, 1 mg/mL 디데카노일포스파티들 콜린(didecanoylphophatidle choline), 그리고 10 mM 아세테이트, pH 5.5로 구성되는 혼합물이다. 단량체 안정화제(NPG)는 N-피바로일 글루코사민(pivaloyl glucosamine)이다. PN159는 동시계류중인 미국특허출원번호 11/233,239에서 설명된 펩티드이다. 표 4에서 다음과 같은 결과들을 볼 수 있다.

하기 표 4는 PDF, PN159, 그리고 NPG 제형들로 행한 침투능 결과들에 관한 것이다.

	평균 % 침투능	SD	증가배수(Fold Enhancement)
PBS	0.254	0.028	1.00
PN159 25μM	0.807	0.289	3.173
PN159 50μM	2.504	0.814	9.849
PDF	3.110	2.007	12.235
NPG	0.256	0.045	1.009
PN159 25μM/NPG	1.839	1.080	7.233
PDF/NPG	7.673	0.817	30.184

PN159는 인슐린의 침투능을 증가시켰다: 25 μM PN159는 0.8% 침투율을 나타내었고, 반면에 50 μM PN159는 침투능을 2.5%까지 증가시켰다. NPG와 조합하여, 25 μM PN159는 1.8% 침투능을 보였다. 결과들은 PDF 단독은 3% 침투능을 제공하였는데, 이는 PBS 단독보다 약 12배 더 크다는 것을 보여주었다. PDF가 NPG와 조합될 때, 침투능은 7.6 %로 증가되었고, PBS에 대하여 30배 증가하였다.

추가적인 연구가 PN159를 함유하는 제형들을 포함하여, 표 5에 표시된 제형들의 TER, LDH, MTT, 침투능을 시험하기 위하여 수행되었다. 모든 제형들은 EpiAirway 모델에서 n=3 인서트들로 시험되었다. 레귤러(regular) 인슐린은 약 28 U/mg(즉, 200 U/mL =~7.14 mg/mL)이었다.

하기 표 5는 제형들에 관한 것이다.

#	보통 인슐린 (U/mL)	Me-β- CD (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	PN159 (μM)	Arg Buffer (μM)	NaCI (mg/mL)	MP (mg/mL)	PP (mg/mL)	PG (mg/mL)	pH
1	200	45	1	10	0	10	0	0.33	0.17	10	7.3
2	1000	45	1	10	0	10	0	0.33	0.17	10	7.3
3	1200	45	1	10	0	10	0	0.33	0.17	10	7.3
4	400	45	1	10	0	10	0	0.33	0.17	10	7.3
5	400	0	0	0	25+	10	4	0	0	0	7.3
6	400	0	0	0	50+	10	4	0	0	0	7.3
7	400	45	0	10	50+	10	4	0	0	0	7.3
8	400	0	0	0	0	10	7	0	0	0	7.3
9	PBS Control
10	9% Triton X 100 Control

약어들: Arg=알기니, Me-β-CD=메틸-베타-시클로덱스트린, EDTA=디소듐 에데테이트, NaCl=염화나트륨, MP=메틸파라벤 소듐, PP=프로필파라벤 소듐, PG=프로필렌 글리콜

실험 제형들에 대한 37 ℃에서 1시간의 배양 전후에 TER 측정(ohms×cm²)의 결과들이 대조군과 비교되었다. 결과들은 증진제들을 포함하는 제형들이 1시간 배양후 상당한 TER 감소를 가진다는 것을 보여준다. 제형들 #5, #6, 그리고 #8은 세포 생존능력을 가지고 있었고, #7을 제외한 모든 제형들은 PBS 제형과 유사한, 최소 세포 독성을 가졌다는 것을 보여주었다. 침투 결과들이 표 6에 표시되었다.

#	Avg%perm	STDEV
1	4.47	0.70
2	1.99	0.12
3	2.40	0.25
4	2.17	0.13
5	1.42	0.34
6	1.48	0.17
7	4.66	1.68
8	0.00	0.00

제형들 #1, (4.47%) 그리고 #7(4.66%)은 가장 높은 침투능 백분율을 가졌다. 이들 데이터는 PN159의 첨가가 시험관내 PDF(Me-β-CD, DDPC, 그리고 EDTA)에 대하여 인슐린의 침투를 상당히 증가시키지 못했다는 것을 보여준다.

예 5

인슐린 침투능에 대한 선택적 완충제들의 효과

PDF 제형(Me-β-CD, DDPC, 그리고 EDTA)과 조합하여 선택적 완충제들을 비교하는 침투능 연구를 수행하였다. 이들 침투능 데이터는 60분 배양후 50 μL 로딩 체적을 이용하여 ELISA(LINCO Research사, 카탈로그 #EZHI-14K로부터) 생성되었다. 표 7에 있는 MTT와 LDH 평가들에 의하여 측정된 모든 제형들은 양호한 세포 생존능력과 낮은 세포독성을 가졌다.

하기 표 7은 선택적 완충제들을 이용한 침투능 결과에 관한 것이다.

#	인슐린 농도 (U/mL)	Me-β-CD /DDPC/ EDTA (mg/mL)	Cremophor EL 농도 (mg/mL)	Tween 80 농도 (mg/mL)	인산염 완충제 농도 (mM)	아세트산염 완충제 농도 (mM)	알기닌 완충제 농도 (mM)	염화나트륨 농도 (mg/mL)	pH	%Pern	StDev
1	280	45/1/1	0	0	0	10	0	4	3	9.25	1.06
2	280	45/1/1	0	0	0	10	0	4	4	10.88	3.29
3	280	22.5/.5/.5	0	0		10	0	4	3	11.76	1.14
4	280	45/1/1	0	0	10	0	0	4	7	28.3	9.54
5	280	45/1/1	0	0	0	10	0	4	3.5	12.82	2.29
6	280	45/1/1	5	0	0	10	0	4	3.5	12.28	4.6
7	280	45/1/1	10	0	0	10	0	4	3.5	11.99	2.16
8	280	45/1/1	0	1	0	10	0	4	3.5	11.32	2.73
9	280	45/1/1	0	10	0	10	0	4	3.5	7.61	1.15
10	840	45/1/1	0	0	10	0	0	4	7	12.82	1.57
11	840	45/1/1	5	0	10	0	0	4	7	13.86	5.72
12	280	45/1/1	0	0	10	0	0	4	7	7.14	4.5
13	840	45/1/1	0	10	10	0	0	4	7	5.45	3.12
14	280	45/1/1	0	0	0	0	10	4	7	5.1	2.2
15	840	45/1/1	0	0	0	0	10	4	7	3.72	2.69
16	280	0/0/0	0	0	0	10	0	7	3.5	0.00003	0.00002

알기닌 완충제는 3% 내지 6%에서 인슐린의 침투능 백분율을 갖는 평범한 완충제이다. 아세트산염 완충제 제형은 7% 내지 12%의 침투능%를 달성하였다. 인산염 완충제 제형들에 대한 침투능 %는 5% 내지 28%였다. 가장 높은 침투능 %인 28%는 10 mM 인산염 완충제, 45 mg/mL Me-β-CD, 1 mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 280 U/mL 인슐린, pH 7(#4)으로 달성되었다.

예 6

최적의 비강내 인슐린 제형을 위한 시험관내 차단 연구들

변화하는 성분 농도들과 pH 범위들에서 280 U/mL와 840 U/mL에 대한 예비 시험관내 스크린(screen)이 수행되었다. 기본 1×PDF 제형은 45 mg/mL Me-β-Cd, 1 mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 10 mM 아세트산염, 10 mM 포스파타제(phosphatase), 그리고 220 mOsm/kg NaCl을 포함하였다. 시험관내 연구 1 제형 성분들이 표 4에 표시되어 있다.

하기 표 8은 시험관내 연구 1 제형 성분들에 관한 것이다.

성분	농도(mg/mL)
레귤러	10 (280 U/mL)		30 (840 U/mL)
Me-β-CD	45		90
DDPC	0.5	1		2
EDTA	0.5	1		2
아세트산염	0.6 (10 mM)
포스파타제	1.4 (10 mM)
NaCI	Qs to~200 mOsm/kg H2O
pH	3	4		7

첫 번째 시험관내 실험을 위한 시간 코스는 30, 60, 그리고 120분 배양들을 포함하였다. 배양들은 PBS에서 Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺(인슐린은 표준 MatTek 배지에 존재한다)로 수행되었다. 평가 조건들은 37 ℃에서 100 rpm 회전과 50 μL의 시험된 제형의 응용을 포함하였다. 모든 제형들에서 상당한 TER 감소가 관찰되었다. MTT 평가로 높은 독성이 관찰되었고, LDH 평가로 낮은 세포 생존능력이 관찰되었다.

280 U/mL 인슐린 농도에 대한 침투 데이터가 30분과 60분에서 수행되었고, 1×PDF, pH3; 2×PDF, pH3; 1×PDF, pH4; 그리고 0.5×PDF, pH3을 비교하였다. 1×PDF, pH3; 1×PDF, pH4; 그리고 0.5×PDF, pH3으로는 60분에서 약 10% 침투가 달성되었다. 2×PDF, pH3;은 2% 침투를 이루었다. 증진제가 없는 대조군은 1% 미만의 침투를 보여주었다.

280 U/mL 인슐린과 840 U/mL 인슐린 농도들에 대한 침투 데이터는 2×PDF, pH3 제형에서 30분과 60분으로 비교되었다. 아마도 높은 인슐린 농도에서 석출에 의하여 야기되는 높은 변화능으로 인하여, 침투에서 상당한 차이는 관찰되지 않았다.

1×PDF, pH3에서 30분과 60분으로 수행된 280 U/mL 인슐린 농도에 대한 침투 데이터는 1×PDF, pH7과 비교되었다. 결과들은 pH7에서의 제형이 pH3에서의 제형보다 침투가 더 좋다는 것을 보여주었다. 1×PDF, pH3에 대한 침투 백분율은 10%였고, 1×PDF, pH7에 대한 침투는 35%였다.

시험관내 연구 1의 요약

(Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺로) PBS에서 30, 60, 그리고 120분 배양들로 한 침투 연구들은 높은 세포 독성과 낮은 세포 생존능력으로 결론이 났다. 1× 그리고 0.5×PDF는 2×PDF보다 더 좋은 침투 결과를 낳았다. PDF는 10 mg/mL(즉, 280 U/mL)을 가용성으로 할 수 있었지만, 30 mg/mL(즉, 840 U/mL)를 가용성으로 하지 못하였다. 침투 백분율은 pH3보다 pH7에서 더 높았다.

두 번째 연구는 기본 제형으로서 1×PDF(45 mg/mL Me-β-CD, 1 mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 10 mM 아세트산염, 10 mM 포스파타제, 그리고 220 mOsm/kg NaCl)를 이용하여 수행되었다. 시험관내 연구 2 제형 성분들을 표 9에 나타내었다.

성분	농도(mg/mL)
레귤러	10 (280 U/mL)		30 (840 U/mL)
Me-β-CD	45
DDPC	1
EDTA	1
폴리소베이트 80 (Tween 80)	0	1		10
크레모포 EL(CEL)	0	5		10
아세트산염	0.6 (10 mM)
포스파타제	1.4 (10 mM)
NaCI	Qs to~200 mOsm/kg H2O
pH	3.5		7

두 번째 시험관내 실험을 위한 시간 코스는 60분 배양을 포함하였다. 배양은 PBS에서 Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺로 수행되었다. 평가 조건들은 37 ℃에서 100 rpm 회전과 50 μL의 시험된 제형의 응용을 포함하였다. 모든 제형들에서 상당한 TER 감소가 관찰되었다. 가용화제들(solubolizers) 없이도, MTT 평가로 높은 독성이 관찰되었고, LDH 평가로 낮은 세포 생존능력이 관찰되었다.

280 U/mL 인슐린 농도에 대한 침투 데이터가 60분에서 수행되었고, 1×PDF, pH3.5; 1×PDF, pH7; 1×PDF+0.5%CEL, pH3.5; 1×PDF+1% CEL, pH3.5; 1×PDF+0.1% Tween 80, pH3.5; 그리고 1×PDF+1% Tween 80, pH3.5을 비교하였다. pH3.5에서 모든 제형들에서 적어도 10% 침투가 달성되었다. pH3.5와 비교하여 pH7의 제형들에서 침투는 증가되었다.

280 U/mL 인슐린과 840 U/mL 인슐린 농도들에 대한 침투 데이터는 1×PDF, pH7; 1×PDF+0.5% CEL, pH3.5; 1×PDF+0.5% CEL, pH7; 1×PDF+1% CEL, pH3.5; 1×PDF+0.1% Tween 80, pH3.5; 그리고 1×PDF+1% Tween 80, pH3.5 제형들에서 60분으로 비교되었다. 가용하제들이 존재할 때 인서트의 표면 상에서 840 U/mL 인슐린 제형들이 가시적으로 용해가능하다. pH 3.5에서의 제형들보다 더 높은 침투능을 갖는 pH 7에서의 제형들을 제외하고는, 모든 제형들은 유사한 침투능을 가진다.

시험관내 연구 2의 요약

고농도의 인슐린 제형들(840 U/mL)은 추가적인 표면 활성제(즉, Tween 또는 크레모포(Cremophor))의 존재시 성공적으로 안정화되었다(그리고 가용화되었다). 심지어는 60분 배양에서, 시험관내 모든 제형들에 대하여 증가된 세포독성과 감소된 세포 생존능력이 관찰되었다.

세 번째 연구는 pH 7에서 280 U/mL과 840 U/mL 1×PDF 인슐린 제형들을 이용하여 세 가지 다른 표면 활성제들(Tween 80, Tween 20, 그리고 플루로닉 F68)의 침투에 대한 시험관내 효과들을 판단하기 위하여 수행되었다. 시험관내 연구 3 제형 성분들을 표 10에 나타내었다.

성분	농도(mg/mL)
레귤러	10 (280 U/mL)		30 (840 U/mL)
Me-β-CD	45
DDPC	0		1
EDTA	1		10
Tween 80	0	1		10
Tween 20	0	1		10
Pluronic F68	0	0.1		1
알기닌	2.1 (10 mM)
NaCI	Qs to~200 mOsm/kg H2O
pH	7

세 번째 시험관내 실험을 위한 시간 코스는 60분 배양을 포함하였다. 배양은 PBS에서 Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺로 수행되었다. 평가 조건들은 37 ℃에서 100 rpm 회전과 50 μL의 시험된 제형의 응용을 포함하였다. 모든 제형들에서 상당한 TER 감소가 관찰되었다. MTT 평가로 높은 독성이 관찰되었고, LDH 평가로 낮은 세포 생존능력이 관찰되었다.

280 U/mL 인슐린 농도에 대한 침투 데이터가 60분에서 수행되었고, 1×PDF+1% Tween 80, pH7; 1×PDF+0.01% 플루로닉 F68, pH7; 그리고 1×PDF+0.1% 플루로닉 F68, pH7 제형들을 비교하였다. 결과들은 플루로닉(Pluronic) F68은 침투를 높이기 위하여 인슐린을 충분히 가용화하지 못한다는 것을 보여주었다.

1×PDF 제형(인슐린 농도 280 U/mL과 840 U/mL)에서 인슐린 침투에 대한 Tween 80과 Tween 20의 효과들을 시험하였다. 1×PDF+1% Tween 80, pH7; 1×PDF+0.1% Tween 80, pH7; 1×PDF(no DDPC)+1% Tween 80, pH7; 1×PDF(no DDPC)+0.1% Tween 80, pH7; 1×PDF+1% Tween 20, pH7; 1×PDF+0.1% Tween 20, pH7; 그리고 1×PDF+1% Tween80, pH7(Hypotonic) 제형들에서 침투 백분율 데이터를 60분에서 비교하였다. 결과들은 1% Tween(Tween 80과 Tween20 둘다)이 0.1% Tween보다 더 큰 침투를 제공한다는 것을 보여주었다. Tween 20에 대한 침투 결과들은 Tween80과 동일하였다. DDPC의 제거는 이들 제형들에서 침투%에 대하여 어떤 효과도 갖지 못하였다.

pH7의 1×PDF 제형들에서 280 U/mL 인슐린에 대한 침투시 효과를 위하여 Tween 80의 증가량들(0.01%, 0.1%, 0.5% 그리고 1%)을 시험하였다. 제형에서 Tween 80의 양은 침투 %에 효과를 미쳤다. 침투는 Tween 80의 농도 증가와 함께 증가되었다. 침투에 대한 Tween 농도의 효과의 추가적인 분석은 1%, 2%, 그리고 5% Tween 80으로 1×PDF 제형들에서 평가되었다. 아울러, 2×PDF 제형들로 한 침투는 1%와 2% Tween 80으로 시험되었다. 결과들은 1× 또는 2×PDF 중 어느 하나에서 Tween 80 농도가 1% 이상이면, 시험관내 침투의 추가적인 증가는 없었다는 것을 보여주었다.

침투에 대한 Me-β-CD 제거 효과를 0.1% Tween과 1% Tween 제형들( 1mg/mL과 10 mg/mL EDTA를 포함하는)로 시험하였다. 제형으로부터 Me-β-CD의 제거는 침투의 극적인 감소를 이루었다. 이러한 결과들은 280 U/mL과 840 U/mL 제형들 양쪽에서 관찰되었다.

시험관내 연구 3의 요약

Tween 80과 Tween 20 두 가지는 1×PDF 제형들과 조합하여 사용될 때 시험관내 침투에서 좋은 결과를 얻었다. 플루로닉 F68은 침투를 향상시키지 못했다. Tween 80 EH는 20 단독은 시험관내 인슐린의 침투 증가를 달성하는데 충분치 않았다. 상기 제형으로부터 Me-β-CD의 제거는 인슐린 침투에서 상당한 감소로 이어졌다. Tween을 1%까지 증가시키는 것은 침투 증가로 이어졌지만, 1% 이상에서는 추가적인 이익이 관찰되지 않았다. 1% Tween 제형은 일부 시장에 나와 있는 Tween 함유 비강 제품들보다 더 낮다.

예 7

인슐린 제형 안정성 데이터

5 ℃, 25 ℃, 40 ℃, 그리고 50 ℃에서 28일에 이르는 동안 1×PDF(45 mg/mL Me-β-CD, 1mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 10 mM 아세트산염, 10 mM 포스파타제, 그리고 220 mOsm/kg NaCl) 인슐린 스프레이 제형들에 대하여 사용상 안정성 연구를 수행하였다. 펩티드 회복 %를 평가하기 위하여 HPLC가 사용되었다. 이 연구에서 평가된 제형 변수들을 표 11에 나타내었다.

하기 표 11은 예비 인슐린 안정성 연구 제형 변수들에 관한 것이다.

성분	농도(mg/mL)
레귤러	10 (280 U/mL)		30 (840 U/mL)
Me-β-CD	0		45
DDPC	0		1
EDTA	0		1
Tween 80	0	1		10
알기닌	2.1 (10 mM)
NaCI	Qs to~200 mOsm/kg H2O
pH	3.5		7

1×PDF 인슐린 스프레이 제형은 염과 완충제만을 갖는 인슐린에 비하여 더 안정하게 있었다. Tween의 존재는 1×PDF 제형들의 안정성에 영향을 미치지 못하였다. pH 7.0에서 제형들은 pH 3.5에서의 제형들보다 훨씬 더 좋은 안정성을 유지하였다. 1×PDF에 저장된 인슐린의 안정성은 5 ℃, 25 ℃, 40 ℃, 그리고 50 ℃에서 28일째부터 매우 좋았고, 280 U/mL과 840 U/mL 인슐린 농도들에 대하여 약 100% 라벨 클레임 회복(label claim recovery)을 관찰하였다.

1×PDF 인슐린 스프레이 제형들의 안정성을 평가하기 위하여 추가적인 사용상 평가들(단위 투여량과 8-일)을 수행하였다. "단위 투여량(unit dose)"은 프리이밍(priming)과 1 액츄에이션후 인슐린 스프레이의 안정성에 접근하기 위하여 사용되었다. 8일간 사용 연구를 위한 조건들은 8일, 5 ℃와 30 ℃ 저장에서 세 번 매일 액츄에이션을 포함하였다. 이 연구는 펩티드 함량을 평가하였다. 사용중인 펩티드 함량 연구들의 결과들은 PDF 인슐린 스프레이 제형들이 단위 투여량과 8일 사용시에 대하여 좋은 안정성을 나타낸다는 것을 보여주었다. 30 ℃의 저장 온도에서 안정성은 이 연구에서는 5 ℃ 저장온도만큼 안정한 것으로 나타난다.

예 8

토끼들에서 비강내로 투여된 인슐린 약동력학 결과들

240분에 이르는 특정 시점들에서 인슐린 처치된 뉴질랜드 흰색 토끼들에 대한 약동력학(PK; 즉, 인슐린 측정들) 값들을 측정하였다. 네 가지 비강내(IN) 그룹들, 하나의 피하의(SC) 그룹, 그리고 하나의 정맥내(IV) 그룹이 생체이용율 데이터를 생성하는 본 연구에 포함되었다. 각 그룹은 5마리의 수컷 토끼들을 포함하였다. 모든 데이터 계산들은 투여량 표준으로 하고 PK 데이터는 베이스라인 수정되었다. PK 연구 1에 대한 치료 및 투여량의 상세한 내용들을 표 12에 나타내었다.

Route/ Group ID	인슐린 투여량 레벨 (IU/kg)	Me-β-CD (mg/mL)	DDPC (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween 80 (mg/mL)	Arg Buffer (mM)	NaCI (mg/mL)	pH
IN/1X PDF(1)	3	45	1	1	0	10	4	7
IN/1X PDF-Tween(2)	3	45	1	1	10	10	4	7
IN/1X PDF-Tween(3)	6	45	1	1	10	10	4	7
IN-Control(4)	3	0	0	0	0	10	7	7
SC(5)	0.6	0	0	0	0	10	9	7
IV-Infusion(6)	0.3	0	0	0	0	10	9	7

PK 연구의 결과들은 표 13과 도 1에 나타나있다. 인슐린의 IN 투여는 보통의 SC 인슐린보다 더 빠른 Tmax로 귀결되었다. 1% Tween (투여량 6 IU/kg)을 가진 IN/1×PDF, #3는 비강내 제형들 중 가장 높은 피크를 보여주었다. 인슐린의 생체이용율(BA) 백분율은 1% Tween 제형들을 가진 IN/×PDF, #2와 #3에 대하여 ~3-5%였다 (SC에 상대적인). SC에 대한 절대 % BA는 30%였고 IN은 1%였다. AUC에 대하여, IN에 대한 %CV는 50%였지만 SC는 20%였다.

하기 표 13은 토끼에서 PK 연구 1 결과들을 나타내었다.

제형 (Group)	단위 투여량(IU/kg)	Tmax(min)	Cmax(uIU/mL)	AUClast (min*uIU/mL)
IN/1X PDF(1)	3	16.00	11.02	411.20
IN/1X PDF-Tween(2)	3	11.67	35.38	543.44
IN/1X PDF-Tween(3)	6	18.00	81.00	2118.50
IN-Control(4)	3	240.00	2.32	164.00
SC-Regular(5)	0.6	30.00	128.28	7744.40
IV-Infusion(6) Formulation (Group)	0.3	10.00	1352.30	12701.90

비강내 PDF + Tween 제형들을 NovoLog 속효성 제형 (16 mg/mL 글리세린, 1.5 mg/mL 페널, 1.72 mg/mL m-크레졸, 19.6 ㎍/mL 아연, 1.25 mg/mL 디소듐하이드로젠 포스페이트 디하이드레이트, 그리고 0.58 mg/mL NaCl, pH 7.2-7.6으로 구성되는 NovoLog 희석제)과 비교하기 위하여 두 번째 PK 연구를 수행하였다. PK 연구 2의 변수들을 표 14에 나타낸다.

하기 표 14는 PK(그리고 PD) 연구 2에 대한 제형 변수들을 나타낸다.

제형 (Group)	인슐린 단위 투여량 (IU/kg)	Me-β-CD (mg/mL)	DDPC (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween 80(mg/mL)	Arg Buffer (mM)	NaCI (mg/mL)	pH
IN/1X PDF 1%Tween	6	45	1	1	10	10	4	7
IN/1X PDF (no DDPC)	6	45	0	1	10	10	4	7
IN/1X PDF 2%Tween	6	45	1	1	20	10	4	7
IN/1X PDF 5%Tween	6	45	1	1	50	10	4	7
IN/2X PDF 1%Tween	6	90	2	2	10	10	4	7
IN/2X PDF 2%Tween	6	90	2	2	20	10	4	7
SC-PDF	0.6	45	1	1	10	10	4	7
SC NovoLog	0.6 IU/kg (3 U/mL) NovoLog in NovoLog Dilutent							7.4

표 15에 보이는 것은 차감된 PK 베이스라인을 갖는 연구 2에 대한 SC-Novolog 결과들에 상대적인 T_max, %C_max, AUC_last, AUC_inf, 그리고 %BA이다; 또한 포함되는 것들은 IN/1×PDF 1% Tween(#3)과 SC-보통(#5) 제형들에 대한 연구 1 결과들이다. PK 연구 2 결과들은 도 2에 나타난다. 연구 2에 대한 PK 곡선은, IN/1×PDF가 속효성 PK 프로파일로 귀결되는 것을 보여주는, 연구 1에서 보이는 곡선과 유사하다. 인슐린의 두 번째 피크는 일부 IN 처치된 동물들에서 관찰되었다.

하기 표 15는 토끼에서 PK 연구 2 결과들을 나타낸다.

제형 (Group)	Tmax(min)	%Cmax(uIU/mL)	AUClast (min*uIU/mL)	AUCinf (min*uIU/mL)	%BA
IN/1X PDF 1%Tween	30	73.84	1766.20	3445.22	2.2
IN/1X PDF 1%Tween*	18	81.00	2397.00	4192.93	2.9
IN/1X PDF (no DDPC)	19	56.32	1549.00	2868.44	1.9
IN/1X PDF 2%Tween	27	97.65	4106.48	2436.22	5.0
IN/1X PDF 5%Tween	24	65.30	1412.40	2253.16	1.7
IN/2X PDF 1%Tween	15	79.24	2744.00	4173.69	3.4
IN/2X PDF 2%Tween	22.5	73.28	2283.34	7819.15	2.8
SC-Regular*	30	128.28	7750.15	8982.12	95.0
SC-PDF	29	141.60	5830.50	8821.04	71.4
SC NovoLog	23	168.84	8160.70	12338.64

* PK 연구 1로부터의 결과들

PK 연구 2로부터의 결과들은 시험된 비강내 제형들 중에서 IN/1×PDF 2% Tween이 가장 높은 % BA, C_max 그리고 AUC_last를 가진다는 것을 보여준다. % BA, C_max 그리고 AUC_last는 DDPC가 제거되었을 때 감소되었다. 연구2에 대한 IN/1×PDF 1% Tween 결과들은 연구 1로부터의 결과들과 일치하였다. SC-보통의, SC-Novolog, 그리고 SC-PDF 인슐린은 유사한 생체이용율을 보였다. %BA에 대하여, 비강내 제형들은 약 2-5% 생체이용율을 보였다. IN/1×PDF 2% Tween은 5%에서 가장 높은 생체이용율을 보여주었다.

예 9

토끼들에서 비강내 투여된 인슐린 약동학 데이터

240분에 이르는 특정 시점들에서 인슐린 처치된 뉴질랜드 흰색 토끼들에 대한 약동학(PD; 즉, 혈당 측정) 값들을 측정하였다. 혈당측정계(One-Touch Ultra)로 매시점에서 두 번 혈당을 측정하였다. PD 연구 1(위에 있는 예 8, 표 12에 시험 그룹들이 나타나있다)의 결과들은 표 16과 도 3에 나타나있다. 모든 데이터 계산들은 단위투여량으로 표준화되었고, % BA는 시험 대상의 명목 평가값들에 근거하였다.

하기 표 16은 PD 연구 1 결과들을 나타낸다.

제형 (Group)	단위투여량 (IU/kg)	Tmax(min)	Cmax(%)	AUC(%혈당*min)	%BA 혈당
IN/1X PDF(1)	3	15	93.5	420.79	1.3
IN/1X PDF-Tween(2)	3	30	64.5	2777.92	8.3
IN/1X PDF-Tween(3)	6	45	43.6	5205.66	7.8
IN-Control(4)	3	15	87	197.15	0.6
SC-Regular(5)	0.6	120	41.4	6706.55	100.0
IV-Infusion(6)	0.3	25	49.6	3179.51	94.8

연구 1에서, IN/PDF-Tween (#2와 #3), SC(#5), 그리고 IV(#6) 인슐린 제형들에 대한 %C_min은 약 40%였다. IN/PDF-Tween (30-45분)에 대한 T_min은 SC(120분)에 대한 T_min보다 더 빨랐다. (SC에 대하여 상대적인) 1% Tween을 가진 IN PDF에 대한 % BA 혈당은 ~8%였다.

비강내 PDF 제형들을 NovoLog 속효성 제형(16 mg/mL 글리세린, 1.5 mg/mL 펜페놀, 1.72 mg/mL m-크레졸, 19.6 ㎍/mL 아연, 1.25 mg/mL 디소듐 하이드로젠 ㅍ포포스페이트 디하이드레이트, 그리고 0.58 mg/mL NaCl, pH 7.2-7.6)으로 구성되는 희석)과 비교하기 위하여 두 번째 PD 연구를 수행하였다. PD 연구 2의 변수들은 예 8, 표 14에 나타나 있다. PD 연구 2의 C_min과 T_min 결과들은 표 17에 나타내었다.

제형 (Group)	Tmax(min)	%Cmax
IN/1X PDF 1%Tween	45	65.9
IN/1X PDF 1%Tween*	45	43.6
IN/1X PDF (no DDPC)	45	66.9
IN/1X PDF 2%Tween	45	57.1
IN/1X PDF 5%Tween	30	71
IN/2X PDF 1%Tween	30	50.3
IN/2X PDF 2%Tween	45	71.6
SC-Regular*	41.4	120
SC-PDF	49.5	30
SCNovoLog	34.8	120

* PD 연구 1로부터의 결과들

도 4에서, 연구 2에 대한 PD 결과들은 연구 1에 대한 결과들과 비교된다. IN/1×PDF 5% Tween, IN/2× PDF 1% Tween, SC NovoLog에 대한 Tmin은 약 30분이었다. SC-Regular*에 대한 Tmin은 약 40분이었다. 다른 제형에 대한 Tmin은 약 45분이었다. PD 연구 2의 결과들은 2×PDF 1% Tween이 모든 비강내 제형들이 PD에 대하여 가장 큰 효과를 가진다는 것을 보여주었다. 제형에서 DDPC의 존재는 PD 결과들에 영향을 미치지 못하였다.

비강내 자극은 없었으며 IN 투여에 대해서 토끼들은 조용하였다. 설명된 PD 데이터는 속효성 프로파일을 위하여 인슐린을 송달하는 비강내 제형들을 지원한다. 가장 좋은 수행 제제들은 가용화제와 표면활성제를 함유하였다. 추가적인 생체내 투여를 위한 IN 인슐린의 설명은 표 18에 나타나 있다.

하기 표 18은 생체내 연구들을 위한 제형들을 나타낸다.

제형 번호	094-1-0	094-1-250	094-1-500	094-1-1000
Insulin(U/mL)	0	250	500	1000
Me-β-CD(mg/mL)	45	45	45	45
DDPC(mg/mL)	1	1	1	1
EDTA(mg/mL)	1	1	1	1
Tween 80(mg/mL)	10	10	10	10
Arginine(mM)	10	10	10	10
Sodium Chloride(mg/mL)	4	4	4	4
Propylparaben Sodium(mg/mL)	0.17	0.17	0.17	0.17
Methylparaben Sodium(mg/mL)	0.33	0.33	0.33	0.33
Propylene Glycol(mg/mL)	1	1	1	1
pH	7	7	7	7

예 10

임상전 연구 3: 토끼들에게 인슐린을 정맥, 피하, 및 비강내 투여한 후의 PK 및 PD 결과들

표 19는 연구 3의 투약 그룹들을 보여준다. 하기 약어들이 사용되었다: PDF = 45 mg/mL Me-β-CD, 1 mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 10 mM 아르기닌 pH 7.0 및 220 mOsm/kg을 달성하기 위해 NaCl 첨가; 2XPDF = 90 mg/mL Me-β-CD, 2 mg/mL DDPC, 2 mg/mL EDTA (기타 성분들은 PDF의 경우와 동일하다); 보존제(Pre), 이 경우에는, 10 mg/mL 프로필렌 글리콜, 0.33 mg/mL 메틸 파라벤, 및 0.17 mg/mL 프로필 파라벤의 조합. 다양한 제형들에 Polysorabte 80 (Tween)을 표시된 바와 같이 1% 또는 2% (10 또는 20 mg/mL) 첨가하였다. 두 개의 SC 그룹들을, 하나는 증강제 없이 레귤러 인슐린과 함께, 그리고 다른 하나는 PDF를 포함하여 레귤러 인슐린과 함께 투약하였다.

제형	단위투여량(IU/kg)
1XPDF 1% Tween	6
1XPDF 1% Tween(-DDPC)	6
1XPDF 2% Tween	6
1XPDF 2% Tween(-DDPC)	6
1XPDF 1% Tween(-Pre)	6
1XPDF 1% Tween(-PreDDPC)	6
SC-RegularPDF	0.6
SC-Regular Saline	0.6

임상전 연구 3에서 투여한 그룹들의 PD 데이터를 표 20 및 도 5에 나타내었다.

제형	단위투여량(IU/kg)	Tmin	%Cmin
1XPDF 1% Tween	6	30	49.8
1XPDF 1% Tween(-DDPC)	6	30	54.6
1XPDF 2% Tween	6	30	49.5
1XPDF 2% Tween(-DDPC)	6	30	48.4
1XPDF 1% Tween(-Pre)	6	30	55.6
1XPDF 1% Tween(-PreDDPC)	6	30	57.3
SC-Regular PDF	0.6	45	36.4
SC-Regular Saline	0.6	60	38.4

모든 비강 내 그룹들은 거의 동일한 PD 효과(T_min 및 %C_min)를 보여주었다. PDF를 포함하여 그리고 PDF를 포함하지 않고 피하로 전해진 레귤러 인슐린은 유사한 PD 효과(및 예상된 바와 같이 더 느린 T_min 및 더 큰 %C_min)를 가졌다. 데이터에 따르면, PDF 제형(SC의 경우 45 분; 비강 내의 경우 30 분)의 레귤러 인슐린이 대조군 제형(SC의 경우 60 분)보다 착수(T_min으로 표시된)가 더욱 빠르다는 것을 알 수 있다. 데이터는, 비강 내 PDF 제형들의 레귤러 인슐린이 속효성(rapid-acting) 인슐린 프로파일과 일치한다는 것을 보여준다.

임상전 연구 3에서 투여한 그룹들의 PK 데이터를 도 6, 표 21, 표 22 및 표 23에 나타내었다.

하기 표 21은 임상전 연구 3에서 투여한 그룹들의 PK 변수들을 나타낸다.

제형	Group#	Tmax(min)	Cmax(uIU/mL)	AUClast(min*uIU/mL)
1XPDF 1% Tween	1	29.0	108.4	2504.2
1XPDF 1% Tween(-DDPC)	2	16.3	95.7	2284.8
1XPDF 2% Tween	3	36.3	88.1	2122.7
1XPDF 2% Tween(-DDPC)	4	12.0	138.5	3387.4
1XPDF 1% Tween(-Pre)	5	29.0	79.0	1174.5
1XPDF 1% Tween(-PreDDPC)	6	13.0	94.7	2453.3
SC-Regular PDF	7	19.0	129.7	5014.3
SC-Regular Saline	8	17.0	144.2	5885.5

하기 표 22는 임상전 연구 3에서 투여한 그룹들의 PK 데이터(생물학적 이용도)를 나타낸다.

제형	Group#	%F
1XPDF 1% Tween	1	4.3
1XPDF 1% Tween(-DDPC)	2	3.9
1XPDF 2% Tween	3	3.6
1XPDF 2% Tween(-DDPC)	4	5.8
1XPDF 1% Tween(-Pre)	5	2.0
1XPDF 1% Tween(-PreDDPC)	6	4.2
SC-Regular PDF	7	85.2
SC-Regular Saline	8	NA

하기 표 23은 임상전 연구 3에서 투여한 그룹들의 PK 변수들의 %CV를 나타낸다.

제형	Group#	Tmax(min)	Cmax(uIU/mL)	AUClast(min*uIU/mL)
1XPDF 1% Tween	1	56.4	84.2	84.7
1XPDF 1% Tween(-DDPC)	2	58.2	90.8	124.5
1XPDF 2% Tween	3	75.9	81.4	105.9
1XPDF 2% Tween(-DDPC)	4	22.8	87.9	105.2
1XPDF 1% Tween(-Pre)	5	97.8	54.4	95.8
1XPDF 1% Tween(-PreDDPC)	6	34.4	68.2	72.7
SC-Regular PDF	7	57.1	58.3	64.2
SC-Regular Saline	8	73.8	28.7	62.5

다양한 PK 변수들의 %CV는 다양한 그룹들에 대하여 유사하였다. Tween 제형의 PDF는 SC 레귤러 인슐린 대조군 대비 %F(SC 대조군 대비 생물학적 이용도)가 대략 2% 내지 6%였고, T_max는 12분 내지 36 분 범위였다. 가장 높은 % 생물학적 이용도를 가지는 IN 제형은 DDPC 없는 1XPDF/2% Tween 이었다(5.8%). 이러한 PD 데이터는, 생물학적 이용도를 향상시키는 데 있어 DDPC가 PDF 제형에 필수적인 것은 아니라는 것을 보여준다.

예 11

임상전 시험 4: 토끼들에게 인슐린을 경구 및 비강 내 투여한 후의 PK 및 PD 결과들

표 24는 연구 4의 투여 그룹들을 보여준다. 하기 약어들이 사용되었다: PDF = 45 mg/mL Me-β-CD, 1 mg/mL DDPC, 1 mg/mL EDTA, 10 mM 아르기닌 pH 7.0 및 220 mOsm/kg을 달성하기 위해 NaCl 첨가; 2XPDF = 90 mg/mL Me-β-CD, 2 mg/mL DDPC, 2 mg/mL EDTA (기타 성분들은 PDF의 경우와 동일하다); TDM = 2.5 mg/mL 테트라아데실말토시드. 다양한 제형들에 Polysorabte 80 (Tween)을 표시된 바와 같이 1% (10 mg/mL) 첨가하였다. 프로필렌 글리콜(PG)을 다양한 제형들에 1% 또는 2.5%(10 또는 25 mg/ml) 첨가하였다. 0.2 %의 젤라틴의 효과를 IN 제형들에서 시험하였다. 세 가지의 경구 그룹들을, 하나는 증강제들 없이 레귤러 인슐린과 함께(#8), 하나는 PDF를 포함하여 레귤러 인슐린과 함께(#9), 그리고 하나는 DDPC 없이 PDF를 포함하여 레귤러 인슐린과 함께 투여하였다(#7).

하기 표 24는 임상전 연구 3에서 투여한 그룹들의 설명이다.

Group#	제형	Route	Dose Level(IU/kg)
1	1XPDF 1% Tween(-PG)	IN	6
2	1XPDF 1% Tween(2.5%PG)	IN	6
3	TDMhypotonic	IN	6
4	TDMIsotonic	IN	6
5	1XPDF 1% Tween(1%PG)	IN	6
6	1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	IN	6
7	1XPDF Oral(-DDPC+PG)	Oral	6
8	1XPDF Oral(-DDPC-PG-Tween)	Oral	6
9	1XPDF Oral(+DDPC+PG)	Oral	6

임상전 연구 4에서 투여한 그룹들의 PD 데이터를 도 7에 나타내었다. PD 데이터는 모든 비강 제형들 간에 유사했지만, SC 투여는 비강의 경우에 대비하여 확대된 PD 효과를 가졌다. 경구 투여 그룹들에 대해서는 아무런 PD 효과도 관찰되지 않았다. PDF를 포함하고 그리고 PDF를 포함하지 않고 피하로 전해진 레귤러 인슐린은 유사한 PD 효과(및 예상된 바와 같이 더 느린 T_min 및 더 큰 %C_min)를 가졌다. 데이터에 따르면, PDF 제형의 레귤러 인슐린이 착수(T_min으로 표시된)가 더욱 빠르다는 것을 알 수 있다.

임상전 연구 4에서 투여한 그룹들의 PK 데이터를 도 8, 표 25, 표 26 및 표 27에 나타내었다.

하기 표 25는 임상전 연구 4에서 투여한 그룹들의 PK 변수들에 관한 것이다.

제형	Tmax(min)	Cmax(uIU/mL)	AUClast(min*uIU/mL)	AUCinf(min*uIU/mL)
1XPDF 1% Tween(-PG)	59	125.06	5001.45	2565.5917
1XPDF 1% Tween(2.5%PG)	18	95.2	3178	5192.0496
TDMhypotonic	33	206.58	3971	9828.6486
TDMIsotonic	23	179.52	5663	9788.9524
1XPDF 1% Tween(1%PG)	34	108	6218	62759.0604
1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	13	373.6	8755.5	9067.4665
1XPDF Oral(-DDPC+PG)	5	24.56	111.9	N/A
1XPDF Oral(-DDPC-PG-Tween)	5	6.6	16.5	N/A
1XPDF Oral(+DDPC+PG)	5	3.08	64	408.0042
SC Regular Insulin	17	144.2	5885.5	3358.285

임상전 연구 4에서 투여한 그룹들의 PK 데이터(생물학적 이용도)를 나타낸다.

제형	AUClast(min*uIU/mL)	%F
1XPDF 1% Tween(-PG)	5001.45	8.5
1XPDF 1% Tween(2.5%PG)	3178	5.4
TDMhypotonic	3971	6.7
TDMIsotonic	5663	9.6
1XPDF 1% Tween(1%PG)	6218	10.6
1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	8755.5	14.9
1XPDF Oral(-DDPC+PG)	111.9	0.2
1XPDF ORal(-DDPC-PG-Tween)	16.5	0.0
1XPDF Oral(+DDPC+PG)	64	0.1
SC Regular Insulin	5885.5

임상전 연구 4에서 투여한 그룹들의 PK 변수들의 %CV를 나타낸다.

제형	Tmax(min)	Cmax(μIU/mL)	AUClast(min*μIU/mL)
1XPDF 1% Tween(-PG)	67.4	59.9	111.1
1XPDF 1% Tween(2.5%PG)	87.0	75.4	77.1
TDMhypotonic	59.3	41.3	56.6
TDMIsotonic	42.4	73.4	91.4
1XPDF 1% Tween(1%PG)	142.0	51.7	95.9
1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	34.4	21.3	35.3
1XPDF Oral(-DDPC+PG)	0.0	164.5	190.0
1XPDF Oral(-DDPC-PG-Tween)	0.0	199.2	199.2
1XPDF Oral(+DDPC+PG)	0.0	116.6	178.3
SC Regular Insulin	73.8	28.7	62.5

TDM을 포함하는 그룹들의 경우뿐만 아니라, PG와 함께 또는 PG 없이 PDF를 포함하는 비강 내 그룹들의 경우도 PK 데이터가 유사했으며, %F는 약 5.4% 내지 10.6%이고, T_max는 18 분 내지 59 분 범위였다. 0.2%의 젤라틴을 포함하고 1%의 Tween을 포함하는 1XPDF의 경우, 생물학적 이용도가 약 14.9% 증가하였다. TDM을 포함하는 그룹들은 물론이고, PG와 함께 또는 PG 없이 PDF를 포함하는 비강 내 그룹들의 경우에도, C_max 및 AUC의 %CV는 50% 내지 200%였다. 반면, 0.2%의 젤라틴을 포함하고 1%의 Tween을 포함하는 1XPDF의 경우, C_max와 AUC가 각각 21.3% 및 35.3% 감소하였다. 0.2%의 젤라틴을 포함하고 1%의 Tween을 포함하는 1XPDF 제형의 C_max와 AUC의 %CV는 SC 주입의 경우에 관찰된 것들에 비하여 더 낮다는 점이 주목되었다. 이러한 데이터는, PDF 제형의 레귤러 인슐린이 SC 제형들보다 착수(T_min으로 표시된)가 더욱 빠르고, 결과적으로 상기 인슐린은 속효성 인슐린의 프로파일을 가진다는 것을 보여준다. 젤라틴의 첨가는 PDF 제형들의 PD 및 PK(SC 대조군 대비 14.9% 생물학적 이용도) 효과를 강화시킨다.

예 12

점성 증강제들을 포함하는 제형들의 PK 및 PD 결과들

다양한 점성 증강제들을 포함하는 비강 내 인슐린 제형들을 투여한 토끼들에 대하여 PK 및 PD를 평가하였다. 점성 증강제들은 젤라틴, HPMC, MC, 및 Carbomer를 포함한다. Carbomer는 Carbopol®로 알려진 중합체 군의 총칭이다. 시점은 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 및 240 분으로 선택하였다. Glucometer (One-Touch Ultra)로 각 시점의 혈당을 측정하였다. 원하는 pH를 달성하기 위해 필요한 경우에는 소량의 2N HCl 또는 NaOH를 제형에 첨가하였다. 본 연구에 사용된 인슐린의 농도는 약 28 U/mg이었다. 표 28은 본 연구에서 사용된 제형들을 보여준다.

하기 표 28은 점성 증강제를 포함하는 인슐린 제형들을 나타낸다.

#	Regular Insulin (U/mL)	Me-β-CD (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	Arginine Buffer (mM)	Viscosity Agent (mg/mL)	MP (mg/mL)	PP (mg/mL)	PG (mg/mL)	NaCl (mg/mL)	pH
1	400	45	1	10	10	0	0.33	0.17	10	0	7.3
2	400	45	1	10	10	Gelatin (2mg/mL)	0.33	0.17	10	0	7.3
3	400	45	1	10	10	Gelatin (4mg/mL)	0.33	0.17	10	0	7.3
4	400	45	1	10	10	HPMC (2.5mg/mL)	0.33	0.17	10	0	7.3
5	400	45	1	10	10	MC (2.5mg/mL)	0.33	0.17	10	0	7.3
6	400	45	1	10	10	Carbomer (Carbopol) 974P (2.5mg/mL)	0.33	0.17	10	0	7.3
7	400	45	1	10	10	CMC (1mg/mL)	0.33	0.17	10	0	7.3
8	400	45	1	10	10	CMC (2mg/mL)	0.33	0.17	10	3	7.3

약어들: Me-β-CD = 메틸-베타-사이클로덱스트린

EDTA = 다이소듐 에데테이트

HPMC = 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 (100 cps)

MC = 메틸셀룰로오스 (15 cps)

CMC = 카복시메틸셀룰로오스 소듐 (저점도)

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

PG = 프로필렌 글리콜

NaCl = 소듐 클로라이드

15 mL의 각 제형들을 생산하고 3 cc의 깨끗한 비실란화 유리 비알에 저장하였다. 모든 테스트 인슐린 제형들은 2 ℃ 내지 8 ℃에서 저장되었다. 모든 제형들을 6.0 IU/kg 투여하였다. 표 29는 본 연구에서 사용된 투여 그룹들을 보여준다.

하기 표 29는 점성 증강제 투여 그룹들을 나타낸다.

Group#	제형	DoseIU/kg
1	1XPDF 1% Tween	6.0
2	1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	6.0
3	1XPDF 1% Tween(0.4%Gelatin)	6.0
4	1XPDF 1% Tween(0.25%HPMC)	6.0
5	1XPDF 1% Tween(0.25%MC)	6.0
6	1XPDF 1% Tween(0.25%Carbopol)	6.0
7	1XPDF 1% Tween(0.1%CMC)	6.0
8	1XPDF 1% TW(0.2%Gelatin)	6.0

초기로부터 %혈당에 대한 PD 결과들을 도 9에 도시하였다. 도 9는 테스트된 8 개의 그룹들의 시간에 따른 %혈당의 평균 변화를 도시한다. 그룹 6(1XPDF/l% Tween/(0.25% Carbopol))은 모든 기타 그룹들에 비해 초기로부터 가장 큰 %혈당 감소를 보였다. 도 9에 도시된 바와 같이 8 개의 그룹들의 혈당 골들은 90 분 내에 발생하였다. 그룹 8(강직성제 포함)은 다른 젤라틴 제형들에 비해 초기로부터 가장 큰 %혈당 감소를 보였다. Carbomer (0.25% Carbopol) 및 CMC를 포함하는 제형들은 다른 비-젤라틴 제형들에 비해 초기로부터 가장 큰 %혈당 감소를 보였다.

시점당 평균 데이터의 PK 결과들을 도 10에 도시하였다. 도 10에서, 시간에 따른 인슐린의 평균 농도(μIU/mL)가 테스트한 8 개의 그룹들에 대하여 도시되어 있다. 도 10에 따르면, C_max는 다른 제형들에 비해 그룹 6, 1XPDF/1% Tween/(0.25% Carbopol)이 가장 크다. PK 변수들을 표 30에 요약하였다.

하기 표 30는 토끼들의 점성 증강제 PK 변수들을 나타낸다.

Group#	제형	Tmax(min)	Cmax(μIU/mL)	AUClast(min*μIU/mL)	AUCinf(min*μIU/mL)
1	1XPDF 1% Tween	13.00	243.68	7409.6	7546.2311
2	1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	18.00	119.28	3487.6	3756.8904
3	1XPDF 1% Tween(0.4%Gelatin)	22.00	280.64	6617.8	10094.2851
4	1XPDF 1% Tween(0.25%HPMC)	37.00	212.74	6570.05	8149.3682
5	1XPDF 1% Tween(0.25%MC)	14.00	114.16	3383.2	4536.5694
6	1XPDF 1% Tween(0.25%Carbopol)	15.00	460.48	11583.6	12107.2492
7	1XPDF 1% Tween(0.1%CMC)	24.00	320.2	10482.5	11361.0313
8	1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	29.00	231.48	6497.95	12461.998

%CV 결과들을 표 31에 나타내었다. 하기 표 31은 토끼들의 점성 증강제 %CV 결과들을 나타낸다.

Group#	제형	Tmax	Cmax	AUClast
1	1XPDF 1% Tween	21.1	68.4	73.2
2	1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	37.3	27.5	48.1
3	1XPDF 1% Tween(0.4%Gelatin)	98.5	79.3	69.1
4	1XPDF 1% Tween(0.25%HPMC)	127.3	74.7	84.0
5	1XPDF 1% Tween(0.25%MC)	16.0	48.2	60.7
6	1XPDF 1% Tween(0.25%Carbopol)	0.0	62.0	47.6
7	1XPDF 1% Tween(0.1%CMC)	55.9	76.4	60.0
8	1XPDF 1% TW(0.2%Gelatin)	76.5	95.0	76.1

%F(생물학적 이용도) 결과들을 표 32에 나타내었다. 하기 표 32는 토끼들의 점성 증강제 %F 결과들을 나타낸다.

Group#	제형	DoseIU/kg	AUClast(min*uIU/mL)	%F
1	1XPDF 1% Tween	6.0	7409.6	12.6
2	1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	6.0	3487.6	5.9
3	1XPDF 1% Tween(0.4%Gelatin)	6.0	6617.8	11.2
4	1XPDF 1% Tween(0.25%HPMC)	6.0	6570.05	11.2
5	1XPDF 1% Tween(0.25%MC)	6.0	3383.2	5.7
6	1XPDF 1% Tween(0.25%Carbopol)	6.0	11583.6	19.7
7	1XPDF 1% Tween(0.1%CMC)	6.0	10482.5	17.8
8	1XPDF 1% Tween(0.2%Gelatin)	6.0	6497.95	11.0
	SC Regular Insulin	0.6	5885.5

요약

PK 및 PD 결과들은 테스트한 비강 내 인슐린 제형들이 속효성 인슐린 프로파일들을 가지며, 60 분 내에 피크 혈청 인슐린 레벨들을, 그리고 90 분 내에 혈당 골들을 가진다는 것을 보여준다. PDF 비강 내 인슐린 제형들에 점성 증강제들을 첨가하면 생물학적 이용도가 증가하였다. 젤라틴을 포함하는 제형들에서 증가된 강직성은 생물학적 이용도를 증가시켰다. 젤라틴을 포함하는 제형은 열장 조건들(그룹 #2; 0.2% 젤라틴 NaCl 미포함)에 비해 등장 조건들(Group #8; 0.2% 젤라틴 NaCl 포함) 하에서 향상된 성과를 보여주었다. Carbomer와 CMC를 포함하는 제형들은 비강 내 인슐린 제형들의 PK 및 PD 결과들에 있어서 가장 큰 증가를 보였다. %F로 표시되는 생물학적 이용도는 Carbomer 및 CMC에 대해 각각 19.7% 및 17.8%였다. 점성 증강제들, 예컨대 Carbomer 및 CMC를 인슐린 제형들에 첨가하면 초기로부터 %혈당로 표시되는 PD 효과가 향상되었다.

토끼의 PK 및 PD 데이터는, 제형 증강제(formulation enhancer)들이 존재할 때 비강 상피를 가로지르는 인슐린 침투가 증가한다는 시험관 결과들을 뒷받침한다. 시험관 약물 침투 데이터 및 체내 PK 토끼 데이터는 비강 내 인슐린 제형들의 실질적인 관련성을 보여주었다. 대표적인 비강 내 제형들을 사용하여, AUClast(min*μU/mL)를 X축으로, 그리고 %침투를 Y축으로 한 XY 도표 분석은 R² = 0.8994, y = 0.0007x + 0.4191을 보여주었다.

예 13

AET 연구들 1-8: 항균 효율 테스트( antimicrobial effectiveness testing : AET )

AES 연구 1

메틸파라벤 소듐, 프로필파라벤 소듐, 및 프로필렌 글리콜을 포함하는 인슐린 비강 스프레이 위약의 항균 효율을 측정하기 위해 AES 연구 1을 수행하였다. 또한, AES 연구 1은 증가된 EDTA 단독의 AET를 조사하였다. AET 연구 1에서 평가한 제형들을 표 33에 나타내었다. 약 120 mL의 각 제형들을 생산하고 이중 시험하였다(샘플당 n=2 분석).

하기 표 33은 AET 연구 1에서 평가한 제형들을 나타낸다.

#	Me-β-CD	DDPC	EDTA	Tween80	PP	MP	PP	NaCl	Arginine Buffer	pH
	(mg/mL)								(mM)
1	45	1	1	10	25	0.33	0.17	4	10	7
2	45	1	1	10	50	0.33	0.17	4	10	7
3	45	1	1	10	100	0.33	0.17	4	10	7
4	45	1	10	10	0	0	0	4	10	7
5	45	1	50	10	0	0	0	4	10	7

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

DDPC = L α 포스파티딜콜린 다이데카노일

EDTA = 에데테이트 다이소듐

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

PG = 프로필렌 글리콜

NaCl = 소듐 클로라이드

사용된 AET 방법들은 U.S. Pharmacopeial(USP) 및 European Pharmacopeial (EP) AET의 요건들을 따랐으며 표 34 및 표 35에 각각 서술하였다. 또한 제형들의 pH (per SOP 403), 외관(시각 정보), 및 오스몰(per SOP 4000)을 시험하였다.

USP AET 요건들(USP<51>)을 나타낸다.

Microorganism	Psudomoas aeruginosa		Escherichia coli		Staphylococcus aureus		Candida albicans		Aspergillus niger
Days	14	28	14	28	14	28	14	28	14	28
Log Reduction (Min)	2.0	no inc.	2.0	no inc.	2.0	no inc.	no inc.	no inc.	no inc.	no inc.

하기 표 35는 EP AET 요건들(EP<5.1.3>)을 나타낸다.

Microorganism	Psudomoas aeruginosa			Staphylococcus aureus			Candida albicans		Aspergillus niger
Days	2	7	28	2	7	28	14	28	14	28
Log Reduction (Min)	2.0	3.0	no inc.	2.0	3.0	no inc.	2.0	no inc.	2.0	no inc.

0.33 mg/mL의 메틸파라벤 소듐, 0.17 mg/mL의 프로필파라벤 소듐, 및 적어도 25 mg/mL 프로필렌 글리콜의 조합이 효과적인 방부제 조합이었으며 USP 표준들을 따른다. 이러한 제형들은 모든 USP 요건들을 만족하였으나, (S. aureus 및 A. niger의) EP는 만족시키지 못했다. 증가된 EDTA 단독은 USP 또는 EP 요건들 중 어느 하나에 대해 효과적인 것으로 드러나지 않았다.

AET 연구 2

메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐을 방부제들로 사용했을 때 습윤제(프로필렌 글리콜)가 항균 효율을 향상시키는지를 결정하기 위해 AET 연구 2를 실시하였다. 다른 방부제들, 예컨대 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride: BAK), 벤질 알콜, 및 소듐 벤조에이트도 평가하였다. 500 U/mL 또는 1000 U/mL 레벨의 두 개의 인슐린 그룹들을 시험하였다. AET 연구 2에서 평가한 제형들을 표 36에 열거하였다.

#	Me-β-CD	DDPC	EDTA	Tween80	NaCl	MP	PP	Benzyl Alcohol	BAK	Socium Benzoate	Arginine Buffer	pH
(mg/mL) (mM)
1	45	1	1	10	4	0.33	0.17	0	0	0	10	7
2	45	1	1	10	4	0.33	0.17	5	0	0	10	7
3	45	1	1	10	4	0	0	5	0	0	10	7
4	45	1	1	10	4	0	0	0	2	0	10	7
5	45	1	1	10	4	0	0	0	2	0	10	7
Samples 5 also contains 500 units/mL insulin
6	45	1	1	10	4	0	0	0	2	0	10	7
Samples 6 also contains 1000 units/mL insulin
7	45	1	1	10	4	0	0	0	1	0	10	7
8	45	1	1	10	4	0	0	0	0	1	10	7
9	45	1	1	10	4	0	0	0	0	5	10	7
10	PBS(No Preservative Control)
11	PBS+5mg/mL Sodium Benzoate(Preservative Positive Control)

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

DDPC = L α 포스파티딜콜린 다이데카노일

EDTA = 에데테이트 다이소듐

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

BAK = 벤잘코늄 클로라이드

NaCl = 소듐 클로라이드

AET 연구 2를 위한 방법들은 AET 연구 1에서 설명한 바와 같이 실시하였다. 또한, 양성 대조군(5 mg/mL의 소듐 벤조에이트를 포함하는 PBS)과 음성 대조군(PBS 단독)을 포함하였다. AES 연구 2의 결과들은, 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐이 제형에 포함된 습윤제(예컨대 프로필렌 글리콜) 없이는 효과적인 방부제들이 아니라는 것을 보여주었다. 벤잘코늄 클로라이드는 USP 및 EP 항균 효율 테스트 양자 모두에 대해 우수한 방부제였지만, 인슐린과 양립할 수 없는 것으로 밝혀졌다(즉, 제형 내에 존재할 경우 인슐린의 침전을 야기한다). 벤질 알콜과 소듐 벤조에이트도 중성 pH에서는 효과적인 방부제들이 아니었고, 따라서 인슐린 비강 스프레이 제형들 내에서 사용하기에는 적합하지 않았다.

AES 연구 3

AES 연구 3의 목적은 벤잘코늄 클로라이드(BAK), 벤질 알콜, 및 소듐 벤조에이트와 같은 다른 방부제들을 평가하는 것이었다. 500 U/mL 또는 1000 U/mL 레벨의 인슐린을 가지는 두 개의 그룹들을 시험하였다. AET 연구 3의 제형들을 표 37에 열거하였다.

하기 표 37은 AET 연구 3에서 평가된 제형들을 나타낸다.

#	Me-β-CD (mg/mL)	DDPC (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	Arginine Buffer (mM)	MP (mg/mL)	PP (mg/mL)	Benzyl Alcohol(mg/mL)	BAK (mg/mL)	Sodium Benzoate (mg/mL)	NaCl (mg/mL)	pH
1	45	0	1	10	10	0.33	0.17	5	0	0	4	7
2	45	0	1	10	10	0	0	5	0	0	4	7
3	45	0	1	10	10	0	0	0	2	0	4	7
4	45	0	1	10	10	0	0	0	1.5	0	4	7
5	45	0	1	10	10	0	0	0	1.5	0	4	7
Samples 5 also contains 500 units/mL insulin
6	45	0	1	10	10	0	0	0	1.5	0	4	7
Samples 6 also contains 1000 units/mL insulin
7	45	0	1	10	10	0	0	0	1	0	4	7
Samples 7 also contains 1000 units/mL insulin
8	PBS(No Preservative Control)
9	PBS+5mg/mL Sodium Benzoate(Preservative Positive Control)

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

DDPC = L α 포스파티딜콜린 다이데카노일

EDTA = 에데테이트 다이소듐

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

BAK = 벤잘코늄 클로라이드

NaCl = 소듐 클로라이드

AET 연구 3에서의 분석은 AET 연구 1에서 설명한 바와 같이 실시하였다. AES 연구 3 결과들은 벤잘코늄 클로라이드가 인슐린과 양립할 수는 없지만(침전 유발), 최상의 항균 성능을 유지하였다. 벤질 알콜과 벤질 알콜/메틸파라벤 소듐/프로필파라벤 소듐은 본 연구에서 항균제들로서 효과가 없었다.

AES 연구 4

AES 연구 4의 목적은, 메틸파라벤 소듐 및 프로필파라벤 소듐과 함께 사용할 때 낮은 레벨들의 습윤제(프로필렌 글리콜)로 만족스러운 USP 및 EP AET 결과들을 얻을 수 있는지를 결정하는 것이었다. 또한, 대체 방부제들 m-크레졸 및 벤질 알콜을 평가하였다. AET 연구 4 제형들을 표 38에 열거하였다.

하기 표 38은 AES 연구 4에서 평가된 제형들을 나타낸다.

#	Me-β-CD (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	Arginine (mM)	MP/PP (mg/mL)	PG (mg/mL)	Benzyl Alcohol (mg/mL)	m-Cresol (mg/mL)	pH
1	45	1	10	10	0.33/0.17	1	0	0	7.0
2	45	1	10	10	0	0	2.5	0	7.0
3	45	1	10	10	0	0	5	0	7.0
4	45	1	10	10	0	0	0	1	7.0
5	45	1	10	10	0	0	0	1	7.0
6	Negative Control-PBS Alone
7	Positive Control-PBS with 5mg/mL Sodium Benzoate

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

EDTA = 에데테이트 다이소듐

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

PG = 프로필렌 글리콜

AET 연구 4를 위해 사용되는 방법들은 AET 연구 1에서 설명한 바와 같이 실시하였다. 저농도의 습윤제(즉, 프로필렌 글리콜)과 함께 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐을 포함하는 제형들은 항균 효율을 달성하지 못한다. 프로필렌 글리콜을 포함하는 메틸파라벤 소듐 및 프로필파라벤 소듐의 최적 레벨은 1 내지 25 mg/mL 프로필렌 글리콜 사이였다. 또한, 벤질 알콜과 m-크레졸은 인슐린 비강 스프레이 제형들을 위한 효과적인 방부제들이 아니었다.

AET 연구 5

AET 연구 5의 목적은, 인슐린 스프레이 제형들(위약 및 활성)의 항균 효율 테스트(AET)를 수행하여 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐이 양자 모두 최적 방부제 효율을 위해 필요한지와 하나가 다른 하나보다 더욱 효과적인지를 결정하는 것이었다. 또한, 증가된 레벨들의 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐을 평가하여 제형 내에서 그 함량을 증가시키는 것이 항균 효율을 증가시키는지를 결정하였다. AET 연구 5에서 사용한 제형들을 표 39에 열거하였다.

하기 표 39는 AFT 연구 5에서 평가된 제형들을 나타낸다.

#	Insulin (U/mL)	Me-β-CD (mg/mL)	DDPC (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	Arginine (mM)	MP (mg/mL)	PP (mg/mL)	PG (mg/mL)	NaCl (mg/mL)	pH
1	0	45	1	1	10	10	0.33	0	0	2	7.0
2	0	45	1	1	10	10	0	0.17	0	2	7.0
3	0	45	1	1	10	10	0.33	0	1	2	7.0
4	0	45	1	1	10	10	0	0.17	1	2	7.0
5	0	45	1	1	10	10	0	0	1	2	7.0
6	0	45	1	1	10	10	0.33	0.17	0	2	7.0
7	500	45	1	1	10	10	0.33	0.17	1	2	7.0
8	500	45	1	1	10	10	3.33	1.7	1	2	7.0
9	500	45	1	1	10	10	7	3	1	2	7.0
10	Negative Control-PBS Alone
11	Positive Control-PBS with 5mg/mL Benzalkonium Chloride

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

DDPC = L α 포스파티딜콜린 다이데카노일

EDTA = 에데테이트 다이소듐

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

PG = 프로필렌 글리콜

NaCl = 소듐 클로라이드

AET 연구 5에서 사용된 방법들은 AET 연구 1에서 설명한 바와 같이 수행하였다. AET 연구 5의 결과들은, 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐 레벨들을 0.33 mg/mL의 메틸파라벤 소듐 및 0.17 mg/mL의 프로필파라벤 소듐의 적어도 열배로 증가시키면 항균 효율이 증가한다는 것을 보여주었다. 또한, 0.33 mg/mL의 메틸파라벤 소듐 단독은 0.17 mg/mL의 프로필파라벤 소듐 단독과 동일한 항균 효율을 가지며, 이는 또한 조합과도 동일한 항균 효율을 가진다는 것이 명백하였다.

AET 연구 6

AET 연구 6의 목적은 인슐린 스프레이 제형들(위약)의 항균 효율 테스트(AET)를 수행하여 메틸파라벤 소듐 및 프로필파라벤 소듐과 함께 사용될 필요가 있는 프로필렌 글리콜의 최적 레벨을 결정하는 것이었다. 또한, 증가된 레벨들의 메틸파라벤 소듐 및 프로필파라벤 소듐을 고정 레벨의 프로필렌 글리콜과 함께 평가하여 제형 내에서 그 용량을 증가시키면 항균 효율이 증가하는지를 결정하였다. 마지막으로, 에탄올도 가능한 방부제로서 평가하였다. AET 연구 6에서 평가한 제형들을 표 40에 열거하였다.

하기 표 40은 AET 연구 6에서 평가된 제형들을 나타낸다.

#	Insulin (U/mL)	Me-β-CD (mg/mL)	DDPC (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	Arginine (mM)	EtOH (%)	MP (mg/mL)	PP (mg/mL)	PG (mg/mL)	NaCl (mg/mL)	pH
1	0	45	1	1	10	10	0	0.33	0.17	25	0	7.0
2	0	45	1	1	10	10	0	0	0	25	0	7.0
3	0	45	1	1	10	10	0	0.33	0.17	15	0	7.0
4	0	45	1	1	10	10	0	0.33	0.17	10	0	7.0
5	0	45	1	1	10	10	0	0.33	0.17	5	2	7.0
6	0	45	1	1	10	10	0	0.33	0.17	2.5	3	7.0
7	0	45	1	1	10	10	0	0.33	0.17	1	4	7.0
8	0	45	1	1	10	10	0	0.495	0.255	5	2	7.0
9	0	45	1	1	10	10	0	0.66	0.34	5	2	7.0
10	0	45	1	1	10	10	0	1.65	0.85	5	2	7.0
11	0	45	1	1	10	10	1	0	0	0	0	7.0
12	0	45	1	1	10	10	2	0	0	0	0	7.0
13	Negative Control-PBS Alone
14	Positive Control-PBS with 5mg/mL Benzalkonium Chloride

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

DDPC = L α 포스파티딜콜린 다이데카노일

EDTA = 에데테이트 다이소듐

EtOH = 에탄올

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

PG = 프로필렌 글리콜

NaCl = 소듐 클로라이드

AET 연구 6의 방법들은 AET 연구 1에서 설명한 바와 같이 수행하였다. AET 연구 6의 결과들은, 프로필렌 글리콜의 최적 레벨이 10 mg/mL였다는 것을 보여준다. 10, 15, 20, 및 25 mg/mL의 프로필렌 글리콜을 포함하는 인슐린 비강 스프레이 제형들의 AET 결과들은 매우 유사했지만; 프로필렌 글리콜 레벨이 10 mg/mL 미만이었을 때는 AET 결과들이 덜 성공적이었다. 모든 제형들이 P. auerignosa 요건을 제외하고는 USP AET 요건들을 통과하였다. 이 카테고리에 관해서는, 제형들이 제균성(bacteriostatic)이었다(즉, 미생물 성장의 기미가 전혀 없었다). 모든 제형들이 각 필요한 미생물을 위한 최초의 시점들에 대한 EP 요건들을 만족시키지 못했다. 에탄올 단독(1% 또는 2%)은 메틸파라벤 소듐/프로필파라벤 소듐/프로필렌 글리콜과 유사한 항균 활성을 가지는 것으로 나타났다.

AET 연구 7

AET 연구 7의 목적은 20 mg/mL의 Tween 80을 포함하는 인슐린 스프레이 제형들(위약)의 항균 효율 테스트를 수행하는 것이었다. 한 체내 약물 동태학 연구는, Tween 80 함량을 20 mg/mL로 증가시키면 생물학적 이용도의 증가에 도움이 될 것이라는 것을 증명하였지만, Tween 80 쥐세포들도 방부제들과(특히 파라벤들과) 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한, AET 연구 7은 메틸파라벤 소듐 및 프로필파라벤 소듐과 함께 사용하기 위해 필요한 프로필렌 글리콜의 최적 레벨을 결정하기 위해 수행되었다. 증가된 레벨들의 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐을 고정된 레벨의 프로필렌 글리콜과 함께 평가하여 제형 내의 그 용량을 증가시키면 항균 효율이 증가하는지를 결정하였다. 마지막으로, 에탄올도 가능한 방부제로서 평가하였다. AET 연구 7에서 평가한 제형들을 표 41에 열거하였다.

#	Insulin (U/mL)	Me-β-CD (mg/mL)	DDPC (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	Arginine (mM)	EtOH (%)	MP (mg/mL)	PP (mg/mL)	PG (mg/mL)	NaCl (mg/mL)	pH
1	0	45	1	1	20	10	0	0.33	0.17	25	0	7.0
2	0	45	1	1	20	10	0	0	0	25	0	7.0
3	0	45	1	1	20	10	0	0.33	0.17	15	0	7.0
4	0	45	1	1	20	10	0	0.33	0.17	10	0	7.0
5	0	45	1	1	20	10	0	0.33	0.17	5	2	7.0
6	0	45	1	1	20	10	0	0.33	0.17	2.5	3	7.0
7	0	45	1	1	20	10	0	0.33	0.17	1	4	7.0
8	0	45	1	1	20	10	0	0.495	0.255	5	2	7.0
9	0	45	1	1	20	10	0	0.66	0.34	5	2	7.0
10	0	45	1	1	20	10	0	1.65	0.85	5	2	7.0
11	0	45	1	1	20	10	1	0	0	0	0	7.0
12	0	45	1	1	20	10	2	0	0	0	0	7.0
13	Negative Control-PBS Alone
14	Positive Control-PBS with 5mg/mL Benzalkonium Chloride

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

DDPC = L α 포스파티딜콜린 다이데카노일

EDTA = 에데테이트 다이소듐

EtOH = 에탄올

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

PG = 프로필렌 글리콜

NaCl = 소듐 클로라이드

AET 연구 7을 위한 방법들은 AET 연구 1에서 설명한 바와 같이 수행되었다. AET 연구 7로부터의 결과들은, Tween 80 함량을 10 mg/mL에서 20 mg/mL로 증가시키면, 가장 높은 레벨의 프로필렌 글리콜(즉, 25 mg/mL)을 첨가하더라도 항균 활성이 감소한다는 것을 보여주었다. 20 mg/mL의 Tween 80과 결합하여 사용되었을 때에는 에탄올이 효과적인 방부제(1%에서)가 아니었다.

AES 연구 8

1, 5, 10, 및 25 mg/mL의 프로필렌 글리콜 레벨들을 포함하는 제형들과 함께 인슐린 스프레이 제형들(활성)의 항균 효율 테스트(AET)를 테스트하기 위해 AET 연구 8을 수행하였다. 또한, 인슐린 비강 스프레이의 세 가지 농도들을 시험하였다: 250, 500, 그리고 1000 U/mL. AET 연구 8에서 평가한 제형들을 표 42에 열거하였다.

#	Insulin (U/mL)	Me-β-CD (mg/mL)	DDPC (mg/mL)	EDTA (mg/mL)	Tween80 (mg/mL)	Arginine (mM)	MP (mg/mL)	PP (mg/mL)	PG (mg/mL)	NaCl (mg/mL)	pH
1	250	45	1	1	10	10	0.33	0.17	25	0	7.0
2	500	45	1	1	10	10	0.33	0.17	25	0	7.0
3	1000	45	1	1	10	10	0.33	0.17	25	0	7.0
4	250	45	1	1	10	10	0.33	0.17	1	4	7.0
5	500	45	1	1	10	10	0.33	0.17	1	4	7.0
6	1000	45	1	1	10	10	0.33	0.17	1	3.5	7.0
7	500	45	1	1	10	10	0.33	0.17	10	0	7.0
8	500	45	1	1	10	10	3.33	0.17	5	2	7.0
9	Negative Control-PBS Alone
10	Positive Control-PBS with 5mg/mL Benzalkonium Chloride

약어들: Me-β-CD = 메틸 β 사이클로덱스트린

DDPC = L α 포스파티딜콜린 다이데카노일

EDTA = 에데테이트 다이소듐

MP = 메틸파라벤 소듐

PP = 프로필파라벤 소듐

PG = 프로필렌 글리콜

NaCl = 소듐 클로라이드

분석을 위해 사용한 방법들은 AET 연구 1에서 설명한 바와 같다. AET 연구 8의 결과들은, 제형들에 인슐린을 첨가하면 AET 성능을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 또한, 프로필렌 글리콜 레벨이 높으면(즉, 25 mg/mL 또는 10 mg/mL), 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐을 포함하는 인슐린-포함 제형들은 USP AET 요건들을 통과하였다. 그러나, EP 요건들은 만족하지 못했다.

AET 연구들 1 내지 8 요약

연구들 1-8로부터의 데이터는, AET에 관해서, 메틸파라벤 소듐, 프로필파라벤 소듐, 및 습윤제 프로필렌 글리콜의 조합은 결과적으로, 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐 단독에 비해 방부제 효율을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 또한, 본 연구들을 진행하는 중에 몇 가지 다른 방부제들, 예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 소듐 벤조에이트, 벤질 알콜, 에탄올, 증가된 EDTA, 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride) 및 메타-크레졸도 평가되었지만; 그러나, 최상의 결과들은 메틸파라벤 소듐/프로필파라벤 소듐/프로필렌 글리콜에 의해 달성되었다. 다른 방부제들 각각은 인슐린과 양립할 수 없거나(인슐린 침전을 야기하는 벤잘코늄 클로라이드의 경우처럼) 또는 메틸-β-사이클로덱스트린 및/또는 폴리소베이트(polysorbate) 80과의 상호작용들로 인해 무익하게 되기 쉽다. 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐도 메틸-β-사이클로덱스트린 및/또는 polysorbate 80과 상호작용하는 반면, 습윤제, 프로필렌 글리콜의 첨가는 이 상호작용을 방해하여, 파라벤들이 항균 활성에 더욱 유용해지도록 한다. 0.17 mg/mL의 프로필파라벤 소듐, 0.33 mg/mL의 메틸파라벤 소듐에 첨가된 10 mg/mL의 습윤제는 우수한 항균 활성을 만든다는 것을 결과들이 보여주었다.

본 명세서의 발명의 일 태양은, U.S. Pharmacopeial 및 European Pharmacopieal 항균 테스트(AET)를 위해 처리되면 제균 효과를 제공하는 인슐린 비강 스프레이 제형들 내에서 사용되는 방부제 조합으로 구성된다.

최상의 AET 수행 제형은 물, 용해제(들), 표면 활성제(들), 완충제, 킬레이터(chelator), 강직화제(tonicifier), 및 방부제를 포함하였다. 바람직한 용해제는 Me-β-CD였다. 바람직한 표면 활성제들은 DDPC와 폴리소르베이트(예컨대 Tween 80)의 조합, 또는 폴리소르베이트 단독이었다. 바람직한 킬레이터는 EDTA였다. 바람직한 강직화제는 소듐 클로라이드였다. 바람직한 방부제들은 메틸파라벤 소듐과 프로필파라벤 소듐이었다. 제형은 프로필렌 글리콜과 같은 습윤제도 포함하였으며, 이는 최적 AET 성능을 위해 제공되었다.

예 14

인슐린 제형 안정성

(환자의 사용을 모사하기 위해) 매일 3회(TID)의 에어로졸화와 결합하여 5 ℃/주위 습도(일상적 저장), 25 ℃/60% RH(가속화 저장), 교반을 수반하는 가속화 저장, 및 일상적 또는 가속화 저장에서 비강 내 인슐린 제형들을 위해 안정성을 시험하였다. 3 개월(84일) 간의 저장 후에, HPLC 결과들은 5 ℃/주위 습도(99.2% 인슐린 회복)에서 인슐린 함유량에 아무런 뚜렷한 변화를 보이지 않았으며, 25 ℃/60% RH(96.3% 인슐린 회복)에서 인슐린 함유량의 작은 상실만이 관찰되었다. 250 U/mL, 500 U/mL 또는 1000 U/mL를 포함하는 제형들로 짧은 배양 시간들(11일) 동안 TID 에어로졸화 상에 아무런 뚜렷한 인슐린 상실이 없었다. 가속화된 온도에서 24 시간 동안 100 rpm 교반 후에 아무런 뚜렷한 안정성의 감소가 관찰되지 않은 반면, 판매되는 인슐린 제품은 동일한 조건들 하에서 적어도 20%의 인슐린 함유량의 감소를 보여주었다.

예 15

인간 PD 임상 연구

시판 중인 혈당 조절 약품들, NovoLog 및 Exybera와 비교하여 증강제들을 포함하는 인슐린 제형들의 비강 투여 후의 약동학 (PD) 데이터를 측정하기 위해 인간 연구를 완성하였다. 글루코미터(glucometer)를 사용하여 혈당 레벨들을 측정하였다. 각 치료 그룹의 혈당 감소 퍼센트의 요약을 표 43에 나타내었다. 표 44에서 각 치료 그룹의 혈당 퍼센트에 30%, 20%, 및 10%의 감소가 발생한 것을 볼 수 있다.

하기 표 43은 치료 그룹에 의한 혈당 퍼센트 감소를 나타낸다.

Treatment Group	#of Subjects	Mean(STD)	Median	Range	CV(%)
Nasal Placebo	12	10(6.3)	9	0-25	63.0
NovoLog(SC)	12	44.3(12.36)	44	25-62	27.9
Nasal 25IU	11	17.7(9.53)	20	0-30	54.0
Nasal 50IU	11	22(12.31)	24	0-42	56.0
Nasal 100IU	11	28.5(19.67)	19	11-69	69.0
Exubera 3mg	6	23.8(11.9)	21	13-44	50.0

하기 표 44는 30%, 20%, 그리고 10% 혈당 감소를 가진 인간 대상들의 발생범위를 나타낸다.

		Subjects with Glucose % Reduction
Treatment Group	#of Subjects	GE30% N(%)	GE20% N(%)	GE10% N(%)
Nasal Placebo	12	0(0%)	1(8.3%)	4(33%)
NovoLog(SC)	12	10(83.3%)	12(100%)	12(100%)
Nasal 25IU	11	0(0%)	5(45.5%)	8(72.7%)
Nasal 50IU	11	4(36.4%)	6(54.5%)	9(81.8%)
Nasal 100IU	11	3(27.3%)	4(36.4%)	11(100%)
Exubera 3mg	6	2(33.3%)	4(66.7%)	6(100%)

이러한 최초 PD 연구의 결과들은 인슐린의 비강내 투여가 환자에게서 혈당 퍼센트를 감소시키는데 효과적이라는 것을 보여준다. 50 IU와 100 IU의 비강 투여는 현재 유통중인 혈당 조절 약제인 Exubera와 유사한 혈당 감소를 얻었다.

상기 발명은 이해의 명확성을 위하여 예를 통하여 상세하게 설명되었지만, 어떤 변화들 및 변경들이 개시에 의하여 이해가능하고 한정이 아니라 설명을 위하여 제공되는 첨부된 청구항들의 범위내에서 부당한 실험없이 실행될 수 있다는 것이 통상의 지식을 가진 자들에게 분명할 것이다.

Claims (52)

1. 환자에게 인슐린의 비강내 송달을 위한 약제학적 제형으로서, 단량체 인슐린, 가용화제, 그리고 표면 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 인슐린은 인간 인슐린인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 인슐린은 속효성 인간 인슐린인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
4. 청구항 1에 있어서,

   상기 인슐린은 천연 인간 인슐린, 인간 인슐린(LysB3, GluB29), 인간 인슐린(LysB3, IleB28), 인간 인슐린(GlyA21, HisB31, HisB32), 인간 인슐린(AspB28), 인간 인슐린(AspB10), 인간 인슐린(LysB28, ProB29), 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
5. 청구항 4에 있어서,

   상기 인슐린은 인간 인슐린(AspB28)인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
6. 청구항 1에 있어서,

   상기 가용화제는 시클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린, 술포부틸에테르-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
7. 청구항 6에 있어서,

   상기 가용화제는 메틸-β-시클로덱스트린인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
8. 청구항 1에 있어서,

   상기 표면 활성제는 비이온성 폴리옥시에틸렌 에테르, 푸시드산 및 그의 유도체들, 소듐 타우로디하이드로푸시데이트, L-α-포스파티딜콜린 디데카노일, 폴리소베이트 80, 폴리소베이트 20, 폴리에틸렌 글리콜, 세틸 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 라놀린 알코올, 소비탄 모노올레이트, 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
9. 청구항 8에 있어서,

   상기 표면 활성제는 L-α-포스파티딜콜린 디데카노일인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
10. 청구항 8에 있어서,

    상기 표면 활성제는 폴리소베이트 80인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
11. 청구항 1에 있어서,

    에틸렌 디아민 테트라아세트산, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산, 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 킬레이트화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
12. 청구항 1에 있어서,

    하나 이상의 폴리올들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
13. 청구항 12에 있어서,

    상기 폴리올은 수크로오스, 만니톨, 소비톨, 락토오스, L-아라비노스, D-에리트로스, D-리보오스, D-크실로스, D-만노스, 트레하로스, D-갈락토스, 락투로스, 셀로비오스, 젠티비오스, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
14. 청구항 12에 있어서,

    상기 폴리올들은 락토오스와 소비톨인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
15. 청구항 1에 있어서,

    방부제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
16. 청구항 15에 있어서,

    상기 방부제는 클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 부틸 파라벤, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 벤조에이트, 소르브산, 페놀, 오르소-크레졸, 메타-크레졸, 파라-크레졸, 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
17. 청구항 15에 있어서,

    상기 방부제는 메틸파라벤과 프로필바라벤인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
18. 청구항 1에 있어서,

    크기가 1 내지 700 마이크론 범위에 있는 직경들을 갖는 방울들의 에어로졸을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
19. 청구항 17에 있어서,

    습윤제(humectant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
20. 청구항 19에 있어서,

    상기 습윤제는 프로필렌 글리콜, 글리세린, 글리세릴 트리아세테이트, 폴리올, 고분자 폴리올, 락트산, 요소, 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
21. 청구항 20에 있어서,

    상기 습윤제는 프로필렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
22. 청구항 1에 있어서,

    완충제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
23. 청구항 22에 있어서,

    상기 완충제는 글루타메이트, 아세테이트, 글리신, 히스티딘, 알기닌, 리신, 메티오닌, 락테이트, 포메이트, 글리코레이트, 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
24. 청구항 23에 있어서,

    상기 완충제는 알기닌인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
25. 청구항 22에 있어서,

    상기 완충제는 5 내지 9의 pK_a를 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
26. 청구항 22에 있어서,

    상기 완충제는 6 내지 8의 pK_a를 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
27. 청구항 1에 있어서,

    점성도 증진제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
28. 청구항 27에 있어서,

    상기 점성도 증진제는 젤라틴, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 카보머, 카복시메틸셀룰로오스, 그리고 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
29. 청구항 28에 있어서,

    상기 점성도 증진제는 카보머인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
30. 청구항 28에 있어서,

    상기 점성도 증진제는 카복시메틸셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
31. 청구항 28에 있어서,

    상기 점성도 증진제는 젤라틴인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
32. 청구항 1에 있어서,

    7.0±0.5의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
33. 청구항 1에 있어서,

    토니시파이어(tonicifier)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
34. 청구항 1에 있어서,

    50 내지 350 mOsm/L의 삼투성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
35. 청구항 1에 있어서,

    약 15% 초과의 생체이용율을 특징으로 하는 약제학적 제형.
36. 인간 인슐린, 메틸-β-시클로덱스트린, L-α-포스파티딜콜린 디데카노일, 에데테이트 디소듐, 폴리소베이트 80, 알기닌 완충제, 그리고 카보머의 수용성 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
37. 청구항 36에 있어서,

    상기 인간 인슐린은 속효성 인간 인슐린인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
38. 청구항 36에 있어서,

    상기 인간 인슐린은 인간 인슐린(AspB28)인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형.
39. 당뇨병, 고혈당증, 고지혈증, 개인의 포만을 유도하는 병, 개인의 체중 손실을 촉진하는 병, 비만, 암, 결장암, 전립선암을 포함하는 인간에게서의 질병 또는 병적상태의 표시와 징후들을 치료하기 위한 약물의 제조에서 청구항 1 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 따른 제형의 사용.
40. 당뇨병, 고혈당증, 고지혈증, 개인의 포만을 유도하는 병, 개인의 체중 손실을 촉진하는 병, 비만, 암, 결장암, 전립선암을 포함하는 인간에게서의 질병 또는 병적상태의 표시와 징후들을 치료하기 위한 약물의 제조에서 단량체 인슐린, 가용화제, 그리고 계면 활성제의 수용성 혼합물을 포함하는 약제학적 제형의 사용.
41. 청구항 40에 있어서,

    상기 인슐린은 천연 인간 인슐린, 인간 인슐린(LysB3, GluB29), 인간 인슐린(LysB3, IleB28), 인간 인슐린(GlyA21, HisB31, HisB32), 인간 인슐린(AspB28), 인간 인슐린(AspB10), 인간 인슐린(LysB28, ProB29), 그리고 이들의 혼합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
42. 청구항 40에 있어서,

    상기 인슐린은 인간 인슐린(AspB28)인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
43. 청구항 40에 있어서,

    상기 질병은 당뇨병인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
44. 청구항 40에 있어서,

    상기 질병은 당뇨병이고 상기 약물은 크기가 1 내지 700 마이크론(micron) 범위의 직경들을 갖는 방울들의 에어로졸로서 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
45. 청구항 40에 있어서,

    상기 가용화제는 메틸-β-시클로덱스트린이고, 상기 표면 활성제는 L-α-포스파티딜콜린 디데카노일인 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
46. 청구항 40에 있어서,

    상기 약제학적 제형은 점성도 증진제, 방부제, 완충제, 그리고 토니시파이어를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
47. 청구항 40에 있어서,

    상기 약물은 투여후 적어도 약 6시간 동안 인간에게서 인슐린의 혈중 레벨을 높이는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
48. 제40항에 있어서,

    상기 약물은 인간에게서 약 10% 초과의 혈당 퍼센트를 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
49. 청구항 40에 있어서,

    상기 약물은 크기가 1 내지 700 마이크론 범위의 직경들을 갖는 방울들의 에어로졸로서 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제형의 사용.
50. 인간에게서 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하기 위한 약물의 제조에서 인간 인슐린, 메틸-β-시클로덱스트린, L-α-포스파티딜콜린 디데카노일, 에데테이트 디소듐, 그리고 폴리소베이트 80의 수용성 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학 적 조성물의 사용.
51. 청구항 50에 있어서,

    상기 인간 인슐린은 속효성 인간 인슐린인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 사용.
52. 청구항 50에 있어서,

    상기 인간 인슐린은 인간 인슐린(AspB28)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 사용.

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