KR20100017667A

KR20100017667A - 안정한 비-수성의 약학 조성물

Info

Publication number: KR20100017667A
Application number: KR1020097025474A
Authority: KR
Inventors: 시몬 비에르가르드 옌슨; 스벤드 하베룬드; 플로리안 안데르스 푀거
Original assignee: 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2010-02-16
Also published as: RU2472492C2; US20140349924A1; US20100190706A1; AU2008257505B2; JP2010529004A; JP5628026B2; US20100144592A1; EP2497462A1; CN101677944A; BRPI0812354A2; JP2010529956A; AU2008257505A1; RU2009146883A; EP2164459A1; EP2164458A1; WO2008145732A1; CA2716159A1; WO2008145730A1; JP5675347B2; EP2514407A1

Abstract

본 발명은 10-100개의 아미노산을 포함하는 탈수된 활성 폴리펩티드 및 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매를 포함하는, 저장 안정성 비-수성 약학 조성물, 그리고 당뇨병 및 고혈당증을 치료하는 방법에서 그것의 사용에 관한 것이다.

양성자성 용매, 비-수성, 당뇨병, 고혈당증

Description

안정한 비-수성의 약학 조성물{STABLE NON-AQUEOUS PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS}

본 발명은 비-수성의 약학 조성물, 그리고 당뇨병 및 고혈당증을 치료하는 방법에서 그것의 사용에 관한 것이다.

폴리펩티드는 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸아세트아미드 및 디메틸포름아미드와 같은 일정한 비양성자성 용매를 제외하고 대부분의 비-수성 용매에서 전형적으로 낮은 용해도를 가진다. 그러나, 이들 비양성자성 용매의 독성은 그것들이 약학적 조제물에서 어떤 상당한 정도로 사용되는 것을 부적합하게 한다.

Klibanov et al (J. T. Chin, S. L. Wheeler, and A. M. Klibanov. Communication to the editor: On protein solubility in organic solvents. BIOTECHNOL.BIOENG. 44 (1):140-145, 1994)은 양성자성이고, 매우 친수성이며 극성인 용매가 10 ㎎/㎖ 이상의 리소자임(pH 6.0의 수용액으로부터 동결건조된 것)을 용해한다는 것을 기술한다. 개개 용매(1,5 펜탄디올)에서의 용해도는, 리소자임을 펜탄디올에서 용해에 앞서 pH 값이 리소자임의 등전점 이하로 이동한 수용액으로부터 냉동 건조했을 때 현저하게 증가하였다. 리소자임의 용매 특성과 용해도 사이의 강한 상관관계는 확인되지 않았다.

WO 00/42993는 흡입에 의해 환자의 폐에 전달되기 위해 에어로졸화될 수 있는 낮은 독성의 유기 용매에 거대분자를 용해 또는 분산시킨, 거대분자의 전달을 위한 조제물을 기술한다.

많은 유기 극성 양성자성 용매는 폴리펩티드의 부분적인 풀림 때문에 폴리펩티드를 불안정하게 하는 경향이 있는데, 이것은 종종 중요하게는 더 높은 입체구조적 유연성 때문에 응집 및 화학적 분해 과정을 높인다. 에탄올과 같은 어떤 유기 극성 양성자성 용매는 심지어 폴리펩티드에 대한 변성제로서 작용한다. 더 나아가, 유기 극성 양성자성 용매는 종종 알데히드 및 케톤과 같은 매우 반응성인 불순물을 소량 함유하는데, 이것은 폴리펩티드의 안정성을 위태롭게 한다. 따라서, 적절한 저장 수명 안정성을 가지는 폴리펩티드의 비-수용액을 조제하는 것은 어렵다.

비-수성의 폴리펩티드 용액은, 극성 비-수성 용매가 폴리펩티드로 하여금 히드로플루오로알칸에서 가용화 되게 하기 위한 공용매로서 작용하는 용액 압축 정량 흡입기(pMDI)로 추가로 가공 처리될 수 있기 때문에, 그것들이 폐 투여를 위해 유리하게 사용될 수 있다.

비-수성 폴리펩티드 용액은 또한 세제, 및 오일과 같은 비-극성 소수성 용매를 첨가함으로써 경구 투여를 위한 마이크로에멀젼으로 가공 처리될 수 있다. 마이크로에멀젼은 단백질 가수분해에 대해 폴리펩티드를 보호하며 위장관으로부터 폴리펩티드의 전신 흡수를 향상시킨다. 더 나아가서, 폴리펩티드의 가수분해는 더 낮은 물 활성 때문에 비-수성 조제물에서 최소화되는 것으로 예상된다.

다양한 처리 및 부형제의 첨가는 종종 그것의 용해도 및 그것의 안정성을 개 선시키기 위해 치료적 펩티드의 비-수성의 약학 조성물에 적용되어야 한다.

펩티드의 액체 비경구 조제물의 저장 수명은 적어도 1년, 바람직하게는 더 장기간이어야 한다. 생성물이 수송되고 주변 온도에서 매일 진탕될 수도 있는 사용기간은 바람직하게는 몇 주이어야 한다.

따라서, 개선된 안정성을 가지는 치료적 펩티드의 비-수성 약학 조성물에 대한 필요가 있다.

도 1. 물에서 복원된 인슐린 아스파르트의 pH(목표 pH)의 함수로서 주변 온도에서 프로필렌 글리콜 중의 인슐린 아스파르트의 용해도 사이의 관계.

도 2. 주변 온도에서 다양한 반-극성(semi-polar) 양성자성 용매 중의 인슐린 아스파르트의 용해도(목표 pH : 7.5).

도 3. 37℃에서 생리적 배양 배지(pH 7.4) 중에서 2시간의 배양 후 새로 절개한 래트 장기낭(근위부 공장)을 통해 10%(v/v) 프로필렌 글리콜(PG)의 존재 또는 부재하에서 침투된 인간 인슐린.

도 4. MALDI 분석은 2개의 완충제 대조군 샘플(S3 및 S6)의 각각에서 그리고 2개의 프로필렌 글리콜 함유 샘플(SPG5 및 SPG6)에서 침투된 미-분해된 인슐린 아스파르트(피크 ~5828) 및 그것의 분해 산물(피크 ~5218)을 나타낸다. 프로필렌 글리콜(PG)의 존재하에서 더 많은 미-분해된 인슐린이 장 점막을 통과하여 침투하는 것을 확인할 수 있다.

도 5. 프로필렌 글리콜이 있거나 또는 없는 인슐린 A14GluB25HisdesB30 인간 인슐린(8 mM)의 경구 투여 후 혈중 글루코오스(mmol/l)의 감소. 1.2 ㎖/kg의 투약 부피를 위관 영양법을 사용함으로써 SPRD 래트에게 투여하였다.

도 6. 0.2 mM 인슐린 아스파르트, pH 7.4의 FUV CD(실선), 100 % 프로필렌 글리콜(PG) 중의 0.2 mM 인슐린 아스파르트의 FUV CD(점선), 100% 프로필렌 글리콜(PG)로부터 희석 후 2% PG 중의 0.2 mM 인슐린 아스파르트의 FUV CD(파선).

도 7. 0.2 mM 인슐린 아스파르트, pH 7.4의 NUV CD(실선), 100 % 프로필렌 글리콜(PG) 중의 0.2 mM 인슐린 아스파르트의 NUV CD(점선), 100% 프로필렌 글리콜(PG)로부터 희석 후 2% 프로필렌 글리콜(PG) 중의 0.2 mM 인슐린 아스파르트의 NUV CD(파선).

도 8. 4주까지 동안 25 및 40℃에서 배양 후, 프로필렌 글리콜 또는 0.1 M 트리스 완충제, pH 7.5중 하나에서 가용화된 인슐린 아스파르트(IA)의 순도. 인슐린 아스파르트 분말의 목표 pH는 7.5이었다. 순도는 역상 크로마토그래피로 결정하였다.

도 9. 4주까지 동안 25 및 40℃에서 배양 후 프로필렌 글리콜 또는 0.1 M TRIS 완충제, pH 7.5 중 하나에서 가용화된 인슐린 아스파르트(IA)의 고분자량 단백질 (HMWP)의 형성. 인슐린 아스파르트 분말의 목표 pH는 7.5이었다. HMWP의 양은 크기 배제 크로마토그래피로 결정하였다.

도 10. 4주까지 동안 40℃에서 배양 후, 프로필렌 글리콜 또는 0.1 M TRIS 완충제, pH 7.5에서 가용화된 인슐린 아스파르트(IA)의 티오플라빈 T 양성 미소섬유의 형성. 인슐린 아스파르트 분말의 목표 pH는 7.5이었다.

발명의 개요

본 발명의 한 양태에서, 탈수된 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매를 포함하며, 폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수된, 약학적 비-수성 조성물이 제공된다.

본 발명의 한 양태에서, 탈수된 폴리펩티드 및 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매를 포함하며, 폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수되고, 상기 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있는 약학적 비-수성 조성물이 제공된다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 고체 상태(탈수)에서 인슐린 펩티드와 같은 폴리펩티드가 저장-안정성 약학적 조제물의 조제를 가능하게 하는 탈수 전에, 수용액에서 상기 폴리펩티드의 pH를 최적화함으로써 비-수성 반-극성 양성자성 용매에서 매우 높은 정도로 가용화될 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 경구, 폐 및 비강 사용을 위한 이러한 약학 조성물은 높은 화학적 및/또는 물리적 안정성을 나타낸다. 반-극성 양성자성 유기 용매로서 프로필렌 글리콜을 사용하는 경구 약학 조성물과 같은 본 발명에 따르는 조성물은 또한 상당히 개선된 생체이용성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 탈수된 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매를 포함하며, 폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수되었고, 단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아닌 약학적 비-수성 조성물이 제공된다.

본 발명의 추가 양태에서,

a) 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 및

b) 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매를 포함하며,

폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수되었고, 상기 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있는, 약학적 비-수성 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 추가 양태에서,

a) 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 및

b) 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매를 포함하며,

폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수되었고, 상기 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있으며, 단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아닌, 약학적 비-수성 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 양태에서,

a) 10-100개의 아미노산을 포함하는 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 및

b) 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매의 혼합물을 포함하며,

폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수된, 약학적 비-수성 조성물이 제공된다. 바람직한 구체예에서, 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서,

b) 적어도 하나의 반-극성 유기 용매의 혼합물을 포함하며,

폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수된, 약학적 비-수성 조성물이 제공된다. 바람직한 구체예에서, 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있으며, 단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "비-수성"은 10% w/w 미만의 물을 포함하는 조성물을 말한다. 더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따르는 조성물은 8% w/w 미만의 물을 포함하고, 더 바람직한 구체예에서 5% w/w 미만의 물을 포함하며, 더 바람직한 구체예에서 3% w/w 미만의 물을 포함하고, 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 2% w/w 미만의 물을 포함한다.

폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용되는 용어 "탈수된"은 수용액으로부터 건조된 폴리펩티드를 말한다. 본원에 사용되는 용어 "목표 pH"는 탈수된 폴리펩티드가 대략 40 ㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 순수한 물에서 다시 수화될 때 확인되는 수성 pH를 말한다. 목표 pH는 폴리펩티드가 건조에 의해 회수된 수성 폴리펩티드 용액의 pH와 전형적으로 동일할 것이다. 그러나, 폴리펩티드 용액이 휘발성 산 또는 염기를 함유한다면, 폴리펩티드 용액의 pH는 목표 pH와 동일하지 않을 것이다. 폴리펩티드의 pH 이력은 반-극성 양성자 유기 용매에서 가용화될 수 있는 폴리펩티드의 양에 대한 결정자일 것으로 확인되었다.

본 발명에 따라서, 폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수되었다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 목표 pH는 폴리펩티드의 등전점 보다 1 pH 단위 이상 위이다. 본 발명의 다른 양태에서, 목표 pH는 폴리펩티드의 등전점 보다 1 pH 단위 이상 아래이다. 바람직한 양태에서, 목표 pH는 폴리펩티드의 pI 보다 1.5 pH 단위 이상 위 또는 아래이다. 훨씬 더 바람직한 양태에서, 목표 pH는 폴리펩티드의 pI 보다 2.0 pH 단위 이상 또는 이하이다. 더 이상의 양태에서, 목표 pH는 폴리펩티드의 pI 보다 2.5 pH 단위 이상 또는 이하이다. 또한 추가의 양태에서, 목표 pH는 폴리펩티드의 pI 이상이다.

"휘발성 염기"는 가열 및/또는 감압시 어느 정도 증발하게될 염기, 예를 들어, 실온에서 65 Pa 이상의 증기압을 가지는 염기 또는 실온에서 65 Pa 이상의 증기압을 가지는 염기를 포함하는 수성의 공비 혼합물을 의미한다. 휘발성 염기의 예는 수산화암모늄, 수산화테트라알킬암모늄, 2차 아민, 3차 아민, 아릴 아민, 지방족 아민 또는 탄화수소암모늄 또는 그것의 조합이 있다. 예를 들어, 휘발성 염기는 중탄산염, 탄산염, 암모니아, 히드라진 또는 저급 지방족 아민, 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민과 같은 유기 염기 및 그것의 염일 수 있다. 또한, 휘발성 염기는 수산화암모늄, 에틸 아민 또는 메틸 아민 또는 그것의 조합일 수 있다.

"휘발성 산"은 가열 및/또는 감압시 어느 정도 증발하게될 산, 예를 들어, 실온에서 65 Pa 이상의 증기압을 가지는 산 또는 실온에서 65 Pa 이상의 증기압을 가지는 산을 포함하는 수성의 공비 혼합물을 의미한다. 휘발성 산의 예는, 탄산, 포름산, 아세트산, 프로피온산 및 부티르산이다.

본원에서 언급되는 "비 휘발성 염기"는 가열시 증발하지 않는 또는 단지 부분적으로 증발하는 염기, 예를 들어, 실온에서 65 Pa 이하의 증기압을 가지는 염기를 의미한다. 비 휘발성 염기는 알칼리 금속염, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 염, 알칼리 토금속 수산화물 및 아미노산 또는 그것의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 비-휘발성 염기의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 및 산화칼슘이다.

본원에서 언급되는 "비 휘발성 산"은 가열시 증발하지 않는 또는 단지 부분적으로 증발하는 산, 예를 들어, 실온에서 65 Pa 이하의 증기압을 가지는 산을 의미한다. 비-휘발성 산의 예는 염산, 인산 및 황산이다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드의 pI"는 폴리펩티드의 등전점을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "등전점"은 펩티드와 같은 거대분자의 전체적인 순전하가 0인 pH 값을 의미한다. 펩티드에서, 몇몇의 하전된 기가 있을 수 있고, 등전점에서 모든 이들 전하의 합은 0이다. 등전점 이상의 pH에서 펩티드의 전체적인 순전하는 음일 것이지만, 등전점 이하의 pH 값에서 펩티드의 전체적인 순전하는 양일 것이다.

단백질의 pI는 등전점전기분획영동법(electrofocusing)과 같은 전기영동 기술에 의해 실험적으로 결정될 수 있다:

pH 기울기는 폴리아크릴아미드 겔과 같은 항대류성(anticonvective) 배지에서 정해진다. 단백질이 시스템에 도입될 때, 그것은 겔을 가로질러 인가된 전기장의 영향하에서 이동할 것이다. 양으로 하전된 단백질은 음극으로 이동할 것이다. 결국, 이동하는 단백질은 그것의 순 전기 전하가 0이고 집중되어있다고 하는 pH 기울기에서의 지점에 도달한다. 이것이 단백질의 등전 pH(pI)이다. 단백질은 그 후 겔에서 고정되고 염색된다. 단백질의 pI는 그 후 기지의 pI 값을 가지는 마커 분자에 대하여 겔에서 단백질의 위치의 비교에 의해 결정될 수 있다.

주어진 pH 값에서 단백질의 순전하는 통상적인 방법에 의해 당업자에 의하여 이론적으로 추정될 수 있다. 본질적으로, 단백질의 순전하는 단백질에서 하전된 아미노산들: 아스파르테이트(β-카르복실기), 글루타메이트(δ-카르복실기), 시스테인(티올기), 티로신 (페놀기), 히스티딘(이미다졸 측쇄), 리신(ε-암모늄기) 및 아르기닌(구아니디늄 기)의 부분(fractional) 전하의 합과 동일하다. 추가적으로, 또한 단백질 말단기(α-NH₂ 및 α-COOH)의 전하를 고려해야만 한다. 이온화 가능한 기의 부분 전하는 고유의 pKa 값으로부터 계산될 수 있다.

폴리펩티드의 건조, 즉, 탈수는, 예를 들어, 분무-, 냉동-, 진공, 개방- 및 접촉 건조와 같은 어떤 통상적인 건조 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 폴리펩티드 용액은 약 10% 이하의 물 함량을 얻기 위해 분무 건조된다. 물 함량은 실험 부분에서 언급되는 바와 같이 건조 시험시 계산되고/손실로써 측정되는(중량측정) 약 8%이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하일 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 폴리펩티드는 분무 건조된다. 본 발명의 추가 양태에서, 폴리펩티드는 냉동-건조된다.

본 발명의 한 양태에서, 유기 용매에서 선택된 목표 pH에서 탈수에 의한 폴리펩티드의 사전처리에 의해 획득되는 용해도는 적어도 20 ㎎/㎖이다. 추가 양태에서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 30 ㎎/㎖이다. 또한 추가의 양태에서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 40 ㎎/㎖이다. 또한 추가의 양태에서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 50 ㎎/㎖이다. 또한 추가의 양태에서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 60 ㎎/㎖이다. 또한 추가의 양태에서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 70 ㎎/㎖이다. 또한 추가의 양태에서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 80 ㎎/㎖이다. 또한 추가의 양태에서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 100 ㎎/㎖이다.

본원에서 사용되는 용어 "반-극성 양성자성 유기 용매"는 O-H 또는 N-H를 함유하는 친수성의, 물과 혼화성인 탄소-함유 용매 또는 그것의 혼합물을 말한다. 극성은 용매의 유전상수 또는 쌍극자 모멘트에서 반영된다. 용매의 극성은 어떤 종류의 혼합물이 용해될 수 있고 어떤 다른 용매 또는 액체 화합물과 혼화성인가를 결정한다. 전형적으로, 극성 용매는 극성 화합물을 가장 잘 용해하고 비-극성 용매는 비-극성 화합물을 가장 잘 용해한다: "같은 종류가 같은 종류를 용해한다". 무기염(예를 들어, 염화 나트륨)과 같은 강하게 극성인 화합물은 단지 매우 극성인 용매에서 용해한다.

반-극성 용매는 본원에서 20-50의 범위에서 유전상수를 가지는 용매로서 정의되는 한편, 반면 극성 및 비-극성 용매는 각각 50 이상 및 20 이하의 유전상수에 의해 정의된다. 반-극성 양성자성 용매의 예는 물을 기준으로 하여 표 1에 열거한다.

본 내용에서, 1,2-프로판디올과 프로필렌 글리콜은 서로 바꾸어서 사용된다. 본 내용에서 프로판디올과 글리세롤은 서로 바꾸어서 사용된다. 본 내용에서, 에탄디올과 에틸렌 글리콜은 서로 바꾸어서 사용된다.

본 발명의 한 양태에서, 용매는 폴리올로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본원에 사용되는 용어 "폴리올"은 다수의 히드록실 기를 함유하는 화합물을 말한다.

본 발명의 추가 양태에서, 용매는 디올 및 트리올로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본원에 사용되는 용어 "디올"은 2개의 히드록실 기를 함유하는 화합물을 말한다. 본원에 사용되는 용어 "트리올"은 3개의 히드록실 기를 함유하는 화합물을 말한다.

본 발명의 추가 양태에서, 용매는 글리세롤(프로판디올), 에탄디올(에틸렌 글리콜), 1,3-프로판디올, 메탄올, 1,4-부탄디올, 1,3-부탄디올, 프로필렌 글리콜(1,2-프로판디올), 에탄올 및 이소프로판올, 또는 그것의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 추가 양태에서, 용매는 프로필렌 글리콜 및 글리세롤로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 용매는 글리세롤이다. 이 용매는 높은 투약량에서조차도 생체적합성이고 인슐린 펩티드 화합물에 대해 높은 용매능(solvent capacity)을 가진다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 용매는 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이들 용매는 낮은 점성도를 가지며, 적당한 용량에서 생체적합성이고, 인슐린 펩티드에 대해 매우 높은 용매능을 가진다.

용매는 바람직하게는, 예를 들어, 메일라드(Maillard) 반응으로 인한 가용화된 폴리펩티드의 화학적 분해를 최소화하기 위하여, 예를 들어, 알데히드, 케톤 및 다른 환원성 불순물의 낮은 함량을 가지는 높은 순도이어야 한다. 글리실글리신 및 에틸렌디아민과 같은 스캐빈저 분자는 폴리펩티드의 분해를 감소시키기 위해 폴리올과 같은 반-극성 양성자성 유기 용매(들)을 포함하는 조제물에 첨가될 수 있는 반면, 항산화제는 추가의 환원성 불순물의 형성 속도를 감소시키기 위해 첨가될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 유기 용매는 적어도 20% w/w의 양으로 약학 조성물에서 존재한다. 본 발명의 추가 양태에서, 유기 용매는 적어도 30% w/w의 양으로 존재한다. 본 발명의 추가 양태에서, 유기 용매는 적어도 40% w/w의 양으로 존재한다. 본 발명의 추가 양태에서, 유기 용매는 적어도 50% w/w의 양으로 존재한다. 본 발명의 추가 양태에서, 유기 용매는 적어도 80% w/w의 양으로 존재한다.

약학 조성물의 저장-안정성을 증가시키기 위하여, 목표 pH가 유리하게는 약 6.0 내지 약 9.0으로 조절되는 것이 확인되었다. 본 발명의 한 양태에서, 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0, 예로써, 약 6.2 내지 약 8.4, 약 6.4 내지 약 8.7, 약 6.5 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 8.5, 또는 약 7.2 내지 약 8.3이다. 한 양태에서, 목표 pH는 약 7.4 이상, 약 7.6 이상, 약 7.8 이상, 약 8.0 이상, 약 8.2 이상, 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상이다. 증가된 저장 안정성은 상기 기술한 바와 같이 탈수된 후 폴리펩티드가 미소섬유화되는 경향이 줄어들기 때문인 것으로 믿어진다.

본원에 사용되는 용어 "저장-안정성 약학 조성물"은 치료 단백질과 관련하여 규제 기관이 요구하는 기간 동안 적어도 안정한 약학 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 저장-안정성 약학 조성물은 적어도 1년 동안 5℃에서 안정하다. 저장-안정성은 물리적 안정성뿐 아니라 화학적 안정성도 포함한다. 화학적 불안정성은 가수분해와 같은 공유결합의 분해, 라세미화, 산화 또는 가교결합을 수반한다. 조제물의 화학적 안정성은 역상 (RP-HPLC) 및 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 평가된다. 본 발명의 한 양태에서, 저장-수명 동안 펩티드 관련 불순물의 형성은 전체 펩티드 함량의 10% 미만이다. 본 발명의 추가 양태에서, 저장-수명 동안 펩티드 관련 불순물의 형성은 5% 미만이다. RP-HPLC 분석은 전형적으로 물-아세토니트릴 또는 물-에탄올 혼합물에서 수행된다. 한 구체예에서, RP-HPLC 단계에서 용매는 Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, NaCl, KCl과 같은 염, 및 인산염 및 시트르산염 및 말레산과 같은 완충제 시스템을 포함할 것이다. 용매에서 염의 필요로 되는 농도는 약 0.1 M 내지 약 1 M, 바람직하게는 0.2 M 내지 0.5 M, 가장 바람직하게는 0.3 내지 0.4 M일 수 있다. 염 농도의 증가는 적당한 시간 안에 컬럼으로부터 용리를 달성하기 위해 유기 용매 농도의 증가를 필요로 한다.

물리적 불안정성은, 고차원의 구조의 손실, 응집화, 미소섬유화, 침전 또는 표면에 흡착을 포함하는 본래의 구조에 대한 입체구조적인 변화를 포함한다. 예를 들어, 인슐린 펩티드 및 아밀린 화합물은 미소섬유화 때문에 불안정하게 되기 쉬운 것으로 알려져 있다. 조제물의 물리적 안정성은, 다양한 시간 기간 동안 다른 온도에서 조제물의 저장 후, 예를 들어, 육안 검사, 탁도 및 티오플라빈 T 분석의 통상적인 수단에 의해 평가될 수 있다.

입체구조적 안정성은, 예를 들어, Hudson and Andersen, Peptide Science, vol 76 (4), pp. 298-308 (2004)에 의해 기술되는 바와 같이 원편광 이색성 분광 측정법 및 NMR에 의해 평가될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 활성인 폴리펩티드" 또는 "치료적 폴리펩티드"는 주어진 질병 및 그것의 합병증의 임상적 징후를 치료, 완화 또는 부분적으로 저지할 수 있는 폴리펩티드를 말한다.

본 발명의 추가 양태에서, 본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 활성인 폴리펩티드" 또는 "치료적 폴리펩티드"는 치료적 사용을 위해 개발되는, 또는 치료적 사용을 위해 개발된 폴리펩티드를 의미한다.

이것을 달성하기에 적합한 양은 "치료적으로 유효한 양"으로서 정의된다. 각 목적에 대해 유효한 양은 질병 또는 상해의 중증도 및 피험자의 체중 및 일반적 상태에 따를 것이다. 적절한 투약량을 결정하는 것은 값의 매트릭스를 구성하고 매트릭스 내 다른 지점들을 시험하는 것에 의한 일상적인 실험을 사용하여 달성될 수 있으며, 이것은 모두 훈련된 의사 또는 수의사의 통상의 기술 내에 있음이 이해될 것이다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5개의 구성성분 아미노산으로 구성되는 화합물을 의미하는 것으로 본원에서 서로 바꾸어서 사용된다. 구성성분 아미노산은 유전코드에 의해 코딩되는 아미노산의 군으로부터 될 수도 있고, 그것들은 합성 아미노산 뿐만 아니라 유전코드에 의해 코딩되지 않는 천연 아미노산일 수도 있다. 유전코드에 의해 코딩되지 않는 천연 아미노산은 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민이다. 합성 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉, D-알라닌 및 D-류신, Aib (α-아미노이소부티르산), Abu (α-아미노부티르산), Tle (tert-부틸글리신), β-알라닌, 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산과 같은 유전 코드에 의해 코딩되는 아미노산의 D-이성질체를 포함한다.

폴리펩티드 및 펩티드의 생성은 당업계에 잘 알려져 있다. 폴리펩티드 또는 펩티드는, 예로써, 전통적인 펩티드 합성, 예를 들면, t-Boc 또는 Fmoc 화학을 사용하는 고체상 펩티드 합성 또는 기타 잘 확립된 기술, 예를 들면, Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999 참조에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩티드 또는 펩티드는 또한 펩티드의 발현을 허용하게 하는 조건하에서 적당한 영양 배지에서 (폴리)펩티드를 코딩하고 (폴리)펩티드를 발현시킬 수 있는 DNA 서열을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 (폴리)펩티드에 대해, 재조합 세포는 비-천연 아미노산이, 예를 들어, rRNA 돌연변이의 사용에 의해 (폴리)펩티드 안으로 포함되도록 변형되어야 한다.

본원에서 사용되는 용어 "약학 조성물"은 계면활성제, 완충제, 보존제 및 등장성 조절제와 같은 약학적 부형제와 함께 치료적으로 활성인 폴리펩티드를 포함하는 생성물을 의미하며, 상기 약학 조성물은 사람에게 상기 약학 조성물의 투여에 의해 질병 또는 질환의 심한 증세를 치료하고, 예방하고 또는 감소시키는 것에 유용하다. 따라서 약학 조성물은 또한 약학 조제물로서 당업계에 알려져 있다. 복원시킬 약학 조성물의 pH는 실온에서 처방된 복원 액체에서 복원에 의해 생성된 복원된 조성물에서 측정되는 pH 값인 것으로 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"은 통상의 약학적 용도, 즉, 환자 등에서 심각한 부작용을 일으키지 않도록 제공하기에 적합함을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "완충제"는 화학 반응 때문에 일어나게 되는 시간에 걸친 조성물의 pH의 변화하는 경향을 감소시키는 약학 조성물에서의 화합물을 말한다. 완충제는 인산나트륨, TRIS, 글리신 및 시트르산나트륨과 같은 화학물질을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "보존제"는 미생물 활성(성장 및 대사)을 방해하거나 또는 지연시키는 약학 조성물에 첨가되는 화합물을 말한다. 약학적으로 허용가능한 보존제의 예는 페놀, m-크레솔 및 페놀과 m-크레솔의 혼합물이다.

본원에 사용되는 용어 "안정제"는 펩티드를 안정시키기 위하여, 즉, 이러한 조성물의 저장 수명 및/또는 사용 시간을 증가시키기 위하여 펩티드 함유 약학 조성물에 첨가되는 화학물질을 말한다. 약학적 조제물에 사용되는 안정제의 예는 L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 글리실글리신, 에틸렌디아민, 시트레이트, EDTA, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 및 계면활성제 및 알파-토코페롤 및 l-아스코르브산과 같은 항산화제가 있다.

본원에서 사용되는 용어 "계면활성제"는 공기에 액체, 액체에 액체, 용기에 액체 또는 어떤 고체에 액체와 같이 표면 및 경계면에 흡착할 수 있는 어떤 물질, 특히 세제를 말한다. 계면활성제는 세제, 예로써, 에톡시화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트, 예로써, 폴리소르베이트-20, 폴록사머, 예로써 폴록사머 188 및 폴록사머 407, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 유도체, 예로써, 알킬화된 및 알콕시화된 유도체 (트윈, 예를 들어, 트윈-20 또는 트윈-80), 모노글리세라이드 또는 그것의 에톡시화된 유도체, 디글리세라이드 또는 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세롤, 콜산 또는 그것의 유도체, 레시틴, 알코올 및 인지질, 글리세로인지질(레시틴, 케팔린, 포스파티딜 세린), 글리세로당지질(갈락토피라노사이드), 스핑고인지질(스핑고미엘린), 및 스핑고당지질(세라마이드, 강글리오사이드), DSS (도쿠세이트 나트륨, CAS 등록 번호 [577-11-7]), 도쿠세이트 칼슘, CAS 등록 번호 [128-49-4]), 도쿠세이트 칼륨, CAS 등록 번호 [7491-09-0]), SDS (도데실 황산 나트륨 또는 라우릴 황산 나트륨), 디팔미토일포스파티드산, 카프릴산나트륨, 담즙산 및 그것의 염 및 글리신 또는 타우린 접합체, 우르소데옥시콜산, 콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨, 타우로콜산나트륨, 글리코콜산나트륨, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, 음이온성(알킬-아릴-술포네이트) 1가 계면활성제, 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린, 리소인지질(예를 들어, 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르), 알킬, 알콕실 (알킬 에스테르), 알콕시(알킬 에테르)-리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 유도체, 예를 들어, 리소포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 극성 머리기의 변형물, 즉, 콜린, 에탄올아민, 포스파티ㄷ드, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨인 및 양으로 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌, 양쪽성이온 계면활성제(예를 들어, N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸-암모니오-1-프로판술포네이트, 도데실포스포콜린, 미리스토일 리소포스파티딜콜린, 계란 리소레시틴), 양이온성 계면활성제(4차 암모늄 염기) (예를 들어, 브롬화 세틸트리메틸암모늄, 염화 세틸피리디늄), 비-이온성 계면활성제(예를 들어, 도데실 β-D-글루코피라노사이드와 같은 알킬 글루코사이드, 도데실 β-D-말토사이드, 테트라데실 β-D-글루코피라노사이드, 데실 β-D-말토사이드, 도데실 β-D-말토사이드, 테트라데실 β-D-말토사이드, 헥사데실 β-D-말토사이드, 데실 β-D-말토트리오사이드, 도데실 β-D-말토트리오사이드, 테트라데실 β-D-말토트리오사이드, 헥사데실 β-D-말토트리오사이드, n-도데실-수크로오스, n-데실-수크로오스, 지방 알코올 에톡실레이트(예를 들어, 옥타에틸렌 글리콜 모노 트리데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노 도데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노 테트라데실 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르), 폴리에틸렌옥시드/폴리프로필렌옥시드 차단 공중합체와 같은 차단 공중합체(Pluronics/Tetronics, Triton X-IOO) 에톡시화 소르비탄 알카노에이트 계면활성제(예를 들어, Tween-40, Tween-80, Brij-35), 푸시딘산 유도체(예를 들어, 나트륨 타우로-디히드로푸시데이트 등), 장쇄 지방산 및 그것의 염 C6-C12 (예를 들어, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 N^α-아실화된 유도체, 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화된 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 어떤 조합을 포함하는 N^α-아실화된 유도체 및 중성 또는 산성 아미노산, 중성 아미노산 및 2가지의 하전된 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 트리펩티드의 N^α-아실화된 유도체로부터 선택되고, 또는 계면활성제는 이미다졸 유도체, 또는 그것의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "질병의 치료"는 질병, 질환 또는 장애가 발생한 환자의 관리 및 케어를 의미한다. 치료의 목적은 질병, 질환 또는 장애와 싸우는 것이다. 치료는 질병, 질환 또는 장애를 제거하거나 또는 제어할 뿐 아니라 질병, 질환 또는 장애와 관련된 증상 또는 합병증을 완화하기 위한 활성 화합물의 투여, 및 질병, 질환 또는 장애의 예방을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "질병의 예방"은 질병의 임상적 개시 전에 질병이 발생할 위험에서 개인의 관리 및 케어로서 정의된다. 예방의 목적은 질병, 질환 또는 장애가 생기는 것과 싸우는 것이며, 증상 또는 합병증의 개시를 예방 또는 지연시키고 관련된 질병, 질환 또는 장애가 생기는 것을 예방 또는 지연시키기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.

펩티드에 관하여 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는, 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되었고, 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드로부터 결실되었고, 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드에 첨가된 변형된 펩티드를 의미한다. 아미노산 잔기의 이러한 첨가 또는 결실은 펩티드의 N-말단 및/또는 펩티드의 C-말단에서 일어날 수 있다. 한 구체예에서, 유사체는 본래의 펩티드에 비하여 6개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 구체예에서, 유사체는 본래의 펩티드에 비하여 5개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 구체예에서, 유사체는 본래의 펩티드에 비하여 4개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 구체예에서, 유사체는 본래의 펩티드에 비하여 3개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 구체예에서, 유사체는 본래의 펩티드에 비하여 2개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 구체예에서, 유사체는 본래의 펩티드에 비하여 단지 1개의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 첨가된 및/또는 교환된 아미노산 잔기는 코딩될 수 있는 아미노산 잔기 또는 다른 자연적으로 생기는 잔기 또는 순수하게 합성인 아미노산 잔기 중 하나일 수 있다.

모 펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 화학적으로 변형된 모 단백질 또는 그것의 유사체를 의미하며, 적어도 하나의 치환체는 모 단백질 또는 그것의 유사체, 즉, 공유적으로 변형된 모 단백질에서 존재하지 않는다. 전형적인 변형은 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르, 페길화 등이 있다.

본원에서 사용되는 용어 "GLP-1 화합물"은 GLP-1(7-37) (SEQ ID NO. 1), 그것의 인슐린친화성 유사체 및 그것의 인슐린친화성 유도체를 의미한다.

펩티드 또는 화합물과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "인슐린친화성"은 증가된 혈장 글루코오스 수준에 반응하여 인슐린의 분비를 자극하는 능력을 의미한다. 인슐린친화성 펩티드 및 화합물은 GLP-1 수용체의 작용제이다. 화합물의 인슐린친화성 특성은 당업계에 공지된 시험관내 또는 생체내 분석에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "엑센딘-4 화합물"은 엑센딘-4(1-39) (SEQ ID NO. 2), 그것의 인슐린친화성 부분, 그것의 인슐린친화성 유사체 및 그것의 인슐린친화성 유도체로서 정의된다.

본원에서 사용되는 "인슐린 펩티드"는 CysA7과 CysB7 사이 및 CysA20과 CysB19사이의 이황화 다리, 및 CysA6과 CysA11 사이에 내부 이황화 다리를 가지는 인간 인슐린, 돼지 인슐린, 소 인슐린 또는 그것의 인슐린 유사체 또는 유도체를 의미한다.

본원에서 사용되는 인슐린 유사체는, 천연 인슐린에서 생기는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 결실 및/또는 치환함으로써 및/또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 첨가함으로써, 자연적으로 생기는 인슐린의 구조, 예를 들어, 인간 인슐린의 것으로부터 형식적으로 유도될 수 있는 분자 구조를 가지는 폴리펩티드이다.

한 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비하여 8개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 한 양태에서, 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비하여 7개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 한 양태에서, 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비하여 6개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비하여 5개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비하여 4개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비하여 3개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다. 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비하여 2개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가)을 포함한다.

인슐린 유사체는, 예를 들어, 작용의 빠른 개시, 연장된 작용 및/또는 프로테아제에 대한 안정성이 획득되는 것일 수 있다.

한 양태에서, 인슐린 유사체는 작용의 빠른 개시가 획득되는 것, 즉, 인슐린 유사체의 작용의 개시가 투여 후 4시간, 또 다르게는 3시간, 2시간, 1시간 또는 ¹/₂시간 이내인 것일 수 있다. 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 연장된 작용이 획득되는, 즉 인슐린 유사체의 작용이 투여 후 4시간, 또 다르게는, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 계속되는 것이다.

인슐린 유사체는 B 사슬의 위치 28가 천연 Pro 잔기로부터 Asp, Lys, Leu, Val, Ala 또는 Ile 중 하나로 변형될 수 있는 것일 수 있다. 다른 양태에서, 인슐린의 위치 B29에서 Lys은 Pro 또는 Glu로 변형된다. 한 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는, 인슐린의 위치 B28의 아미노산 잔기가 Pro, Asp, Lys, Leu, Val, 또는 Ala이고, 위치 B29의 아미노산 잔기가 Lys 또는 Pro이고, 선택적으로 위치 B30에서 아미노산 잔기는 결실되는 것이다. 또한 위치 A21에서 Asn은 Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val으로, 특히 Gly, Ala, Ser, 또는 Thr으로, 바람직하게는 Gly으로 변형될 수 있다. 게다가, 위치 B3에서 Asn은 Lys, Thr, Ser, Gln, Glu 또는 Asp로 변형될 수 있다. 인슐린 유사체의 추가 예는 des(B30) 인간 인슐린; des(B30) 인간 인슐린 유사체; PheB1이 결실된 인슐린 유사체; A-사슬 및/또는 B-사슬이 N-말단 확장을 가지는 인슐린 유사체 및 A-사슬 및/또는 B-사슬이 C-말단 확장을 가지는 인슐린 유사체가 있다. 따라서 하나 또는 두 개의 Arg가 위치 B1에 첨가될 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 des(B28-B30) 인간 인슐린, des(B27) 인간 인슐린 또는 des(B30) 인간 인슐린이다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 위치 B3에서 아미노산 잔기가 Lys이고 위치 B29에서 아미노산 잔기가 Glu 또는 Asp인 인슐린 유사체이다.

다른 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 des(B28-B30) 인간 인슐린, des(B27) 인간 인슐린 또는 des(B30) 인간 인슐린이다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 위치 B3에서 아미노산 잔기가 Lys이고 위치 B29에서 아미노산 잔기가 Glu 또는 Asp인 인슐린 유사체이다.

본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 단백질 가수분해에 안정한, 즉, 프로테아제에 의한 분해에 대해 보호된 인슐린 유사체일 수 있다. 단백질 가수분해에 안정한 인슐린 유사체의 비-제한적 예는, 예를 들어, WO 2008/034881 (Novo Nordisk)에서 기술된다.

한 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 단백질가수분해에 안정한 인슐린 유사체이다.

본원에서 사용되는 "단백질 가수분해에 안정한 인슐린 유사체"는 인간 인슐린에 비하여 하나 이상의 돌연변이, 즉 하나 이상의 치환, 첨가, 삽입 및/또는 결실을 포함하고, 인간 인슐린에 비하여 하나 이상의 프로테아제에 의해 더 느린 분해를 받는 인슐린 유사체를 의미한다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따르는 인슐린 유사체는 펩신 (예를 들어, 이소형 펩신 A, 펩신 B, 펩신 C 및/또는 펩신 F), 키모트립신 (예를 들어, 이소형 키모트립신 A, 키모트립신 B 및/또는 키모트립신 C), 트립신, 인슐린-분해 효소(IDE), 엘라스타아제 (예를 들어, 이소형 췌장 엘라스타아제 I 및/또는 II), 카르복시펩티다아제 (예를 들어, 이소형 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 A2 및/또는 카르복시펩티다아제 B), 아미노펩티다아제, 카텝신 D 및 래트, 돼지 또는 인간으로부터 유래된 장 추출물에 존재하는 기타 효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소에 의한 분해에 대하여 안정화되어 있다.

본 발명의 한 양태에서, 단백질 가수분해에 안정한 인슐린 유사체는 위치 A14의 아미노산이 Glu 또는 His이고, 위치 B25의 아미노산은 His이며, 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하는 인슐린 유사체;

● 위치 A8의 아미노산은 His이고 및/또는 위치 A12의 아미노산은 Glu 또는 Asp이고 및/또는 위치 A13의 아미노산은 His, Asn, Glu 또는 Asp이고 및/또는 위치 A14의 아미노산은 Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly 또는 His이고 및/또는 위치 A15의 아미노산은 Glu 또는 Asp이고;

● 위치 B1의 아미노산은 Glu이고 및/또는 위치 B16의 아미노산은 Glu 또는 His이고 또는 위치 B25의 아미노산은 His이고 및/또는 위치 B26의 아미노산은 His, Gly, Asp 또는 Thr이고 및/또는 B27의 아미노산은 His, Glu, Lys, Gly 또는 Arg이고 및/또는 위치 B28의 아미노산은 His, Gly 또는 Asp이고;

그리고 선택적으로 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 포함하는 인슐린 유사체; 또는

위치 A14의 아미노산이 Lys, Glu, Arg, Asp, Pro 및 His으로 구성되는 군으로부터 선택되고; 인슐린 유사체의 B-사슬은 모 인슐린에 비하여 적어도 2개의 돌연변이를 포함하며, 2개 이상의 돌연변이는 위치 B27, B28, B29 및 B30의 아미노산의 결실 형태, 또는 위치 B30의 아미노산의 결실과 위치 B25에서 His으로, B26에서 Gly 또는 Glu으로, B27에서 Gly 또는 Lys으로 그리고 B28에서 Asp, His, Gly, Lys 또는 Glu으로의 아미노산 치환으로부터 선택되는 아미노산의 치환의 조합의 형태인 인슐린 유사체이다.

또한 추가 양태에서, 본 발명의 인슐린은 인간 인슐린; DesB30 인간 인슐린; AspB28 인간 인슐린; AspB28, DesB30 인간 인슐린; LysB3,GluB29 인간 인슐린; LysB28, ProB29 인간 인슐린; GluA14, HisB25 인간 인슐린; HisA14, HisB25 인간 인슐린; GluA14, HisB25, DesB30 인간 인슐린; HisA14, HisB25, DesB30 인간 인슐린; GluA14, HisB25, desB27, desB28, desB29, desB30 인간 인슐린; GluA14, HisB25, GluB27, desB30 인간 인슐린; GluA14, HisB16, HisB25, desB30 인간 인슐린; HisA14, HisB16, HisB25, desB30 인간 인슐린; HisA8, GluA14, HisB25, GluB27, desB30 인간 인슐린; HisA8, GluA14, GluB1, GluB16, HisB25, GluB27, desB30 인간 인슐린; 및 HisA8, GluA14, GluB16, HisB25, desB30 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

"desB30 인슐린", "desB30 인간 인슐린"은 B30 아미노산 잔기가 없는 인슐린 또는 그것의 유사체를 의미한다.

"모 인슐린"은 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린과 같은 자연적으로 생기는 인슐린을 의미한다. 또 다르게는, 모 인슐린은 인슐린 유사체일 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 인슐린 펩티드이다.

본 발명의 한 양태에서, 인슐린 펩티드는 인간 인슐린 또는 인간 인슐린의 유사체, 인간 인슐린의 유도체 또는 인간 인슐린 유사체의 유도체이다.

본 발명의 한 양태에서, 인슐린 펩티드는 인간 인슐린이다.

본 발명의 한 양태에서, 인슐린 펩티드는 인슐린 유도체이다. 본 발명의 추가 양태에서, 인슐린 유도체는 B29-N^ε-미리스토일-des(B30) 인간 인슐린, B29-N^ε-팔미토일-des(B30) 인간 인슐린, B29-N^ε-미리스토일 인간 인슐린, B29-N^ε-팔미토일 인간 인슐린, B28-N^ε-미리스토일 Lys^B28 Pro^B29 인간 인슐린, B28-N^ε-팔미토일 Lys^B28 Pro^B29 인간 인슐린, B30-N^ε-미리스토일-Thr^B29Lys^B30 인간 인슐린, B30-N^ε-팔미토일-Thr^B29Lys^B30 인간 인슐린, B29-N^ε-(N-팔미토일-γ-글루타밀)-des(B30) 인간 인슐린, B29-N^ε-(N-리토콜릴-γ-글루타밀)-des(B30) 인간 인슐린, B29-N^ε-(ω-카르복시헵타데카노일)-des(B30) 인간 인슐린 및 B29-N^ε-(ω-카르복시헵타데카노일) 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 양태에서, 인슐린 유도체는 B29-N^ε-미리스토일-des(B30) 인간 인슐린이다.

본 발명의 추가 양태에서, 인슐린 펩티드는 산-안정화된 인슐린이다.

산-안정화된 인슐린은 하기 아미노산 잔기 치환 중 하나를 가지는 인간 인슐린의 유사체로부터 선택될 수 있다:

A21G

A21G, B28K, B29P

A21G, B28D

A21G, B28E

A21G, B3K, B29E

A21G, desB27

A21G, B9E

A21G, B9D

A21G, B1OE.

본 발명의 추가 양태에서, 인슐린 펩티드는 인슐린 유사체이다. 인슐린 유사체는 위치 B28이 Asp, Lys, Leu, Val 또는 Ala이고 위치 B29는 Lys 또는 Pro인 유사체; 및 des(B28-B30), des(B27) 또는 des(B30) 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 위치 B28은 Asp 또는 Lys이고, 위치 B29는 Lys 또는 Pro인 인간 인슐린의 유사체이다.

본 발명의 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 des(B30) 인간 인슐린이다.

본 발명의 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 위치 B28이 Asp인 인간 인슐린의 유사체이다.

본 발명의 다른 양태에서, 인슐린 유사체는 위치 B3은 Lys이고 위치 B29는 Glu 또는 Asp인 유사체이다.

본 발명의 다른 양태에서, 인슐린 유사체 및 유도체는 EP 0 792 290 (Novo Nordisk A/S), EP 0 214 826 및 EP 0 705 275 (Novo Nordisk A/S), US 5,504,188 (Eli Lilly), EP 0 368 187 (Aventis), 미국 특허 5,750,497 및 6,011,007, EP 375437 및 EP 383472에서 개시된 것들 중에서 선택되고, 이러한 인슐린은, 제한되는 것은 아니지만, 인슐린 글루리신(또한 Apidra®로서 알려짐, 위치 B3에서 아미노산 아스파라긴은 리신으로 치환되고, 위치 B29에서 리신은 글루탐산으로 치환되는 인간 인슐린과는 다르다), Lys^B28 Pro^B29 인간 인슐린(Humalog®), 및 Asp^B28 인간 인슐린 (인슐린 아스파르트(Novolog®))을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 상기 인간 인슐린 유사체는 Asp^B28-인간 인슐린이다. 본 발명의 다른 양태에서, 상기 인간 인슐린 유사체는 Lys^B28, Pro^B29-인간 인슐린이다. 본 발명의 다른 양태에서, 상기 인간 인슐린 유사체는 Lys^B3,Glu^B29-인간 인슐린 (인슐린 글루리신)이다. 본 발명의 다른 양태에서, 상기 인간 인슐린 유사체는 des(B30) 인간 인슐린이다.

또한 전구체 또는 중간체의 유도체는 본 발명에 의해 포함된다. 이러한 유도체의 예는 연결 펩티드에 의해 연결되는 인간 인슐린 또는 그것의 유사체 또는 유도체의 B- 및 A-사슬을 포함하는 단일-사슬 인슐린이다.

본 발명에 따르는 인슐린 유도체는 자연적으로 생기는 인슐린 또는, 예를 들어, 인슐린 백본의 하나 이상의 위치에 측쇄를 도입함으로써 또는 인슐린 내 아미노산 잔기의 기를 산화 또는 환원시킴으로써 또는 유리 카르복실산기를 에스테르기 또는 아미드기로 변환시킴으로써 화학적으로 변형된 인슐린 유사체이다. 다른 유도체는, 예로써, 인간 인슐린 또는 desB30 인간 인슐린의 B29 위치의 유리 아미노기 또는 히드록시기를 아실화 함으로써 획득된다. 아실화된 폴리펩티드의 비-제한적 예는, 예를 들어, 본원에 참고로써 포함된 WO 95/07931에서 찾을 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 100 kDa 미만, 50 kDa 미만, 또는 10 kDa 미만의 몰 중량을 가진다.

본 발명의 다른 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 100 kDa 미만, 50 kDa 미만, 또는 10 kDa 미만의 몰 중량을 가지며, 단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아니다.

본 발명의 다른 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 100개 미만의 아미노산, 또는 90개 미만의 아미노산, 또는 60개 미만의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산 또는 적어도 20개의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 추가 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 10-100개의 아미노산, 추가 양태에서 15-90개의 아미노산, 추가 양태에서 20-80개의 아미노산, 추가 양태에서 20-70개의 아미노산, 추가 양태에서 25-70개의 아미노산, 또한 추가 양태에서 25-65개의 아미노산, 또한 추가 양태에서 25-60개의 아미노산 또는 25-55개의 아미노산을 포함한다. 또한 추가 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 30-70개의 아미노산, 30-65개의 아미노산, 30-60개의 아미노산 또는 30-55개의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 100개 미만의 아미노산, 또는 90개 미만의 아미노산, 또는 60개 미만의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 또는 적어도 20개의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 추가 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 10-100개의 아미노산, 추가 양태에서 15-90개의 아미노산, 추가 양태에서 20-80개의 아미노산, 추가 양태에서 20-70개의 아미노산, 추가 양태에서 25-70개의 아미노산, 또한 추가 양태에서 25-65개의 아미노산, 또한 추가 양태에서 25-60개의 아미노산 또는 25-55개의 아미노산을 포함한다. 또한 추가 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 30-70개의 아미노산, 30-65개의 아미노산, 30-60개의 아미노산 또는 30-55개의 아미노산을 포함하며, 단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아니다.

본 발명의 한 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 수용성인 폴리펩티드이다. 다른 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 25℃에서 ㎖ 용액 당 적어도 100 ㎍ 폴리펩디드의 농도로 수용성이다. 또 다른 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 등전점으로부터 적어도 2 pH 단위에 있는 pH 값에서 수용성이다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 등전점 보다 2 pH 단위 이상 위의 pH 값에서 수용성이다. 본 발명의 다른 양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 등전점 보다 2 pH 단위 이상 아래의 pH 값에서 수용성이다. 추가 양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 pI 보다 2.5 pH 단위 이상 위 또는 아래의 pH 값에서 수용성이다. 또한 추가 양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 pI 보다 3.0 pH 단위 이상 위 또는 아래의 pH 값에서 수용성이다. 추가 양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 pI 보다 3.5 pH 단위 이상 위 또는 아래의 pH 값에서 수용성이다.

본 발명의 한 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 어떤 상기 양태 중 어떤 것에 따라 수용성인 폴리펩티드이며, 단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아니다.

"수용성"은 큰 농도의 폴리펩티드, 예로써, ㎖ 용액 당 100 ㎍ 폴리펩티드가 25℃에서 수용액 또는 완충 용액에서 용해되는 것을 의미한다. 용액에 함유된 폴리펩티드가 용해되는지 여부를 결정하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있다.

한 구체예에서, 용액은 30,000 g에서 20분 동안 원심분리될 수 있고, 그 후 상청액에서 폴리펩티드 농도는 RP-HPLC에 의해 결정될 수 있다. 이 농도가 조성물을 만들기 위해 원래 사용된 폴리펩티드 농도와 실험적 오차 내에서 동일하다면, 폴리펩티드는 본 발명의 조성물에 완전히 용해성이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 폴리펩티드의 용해도는 조성물이 함유되는 용기를 육안으로 조사함으로써 간단히 결정될 수 있다. 육안으로 용액이 맑고 미립자 물질이 용기의 측면/바닥에 현탁되거나 또는 침전되지 않는다면, 폴리펩티드는 용해성이다.

예를 들어, 시클로스포린이 수용성이 아니라는 것은 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 양태에서, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 단일 사슬 인슐린(예로써, WO 2005/054291에 기술됨), 인슐린 모방체(예로써, WO 2006/018450에 기술됨), MC4 수용체에 결합하는 폴리펩티드, 인간 성장 호르몬 또는 그것의 유사체, 인자 VII 또는 그것의 유사체, 부갑상선 호르몬 또는 그것의 유사체, 인간 여포자극호르몬 또는 그것의 유사체, 성장인자, 예로써, 혈소판-유도 성장인자(PDGF), 오베스타틴, 전환성장인자 α (TGF-α), 전환성장인자 β (TGF-β), 상피 성장인자 (EGF), 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 소마토메딘, 예를 들면 인슐린 성장인자 I(IGF-I), 인슐린 성장인자 II(IGF-II), 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO) 또는 안지오포이에틴, 인터페론, 프로-유포키나아제, 유로키나아제, 조직 플라즈미노겐 활성화제(t-PA), 플라스미노겐 활성화제 억제제 1, 플라스미노겐 활성화제 억제제 2, 폰 빌리브란트 인자, 시토킨, 예를 들어, 인터류킨 (IL) 1, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-20 또는 IL-21과 같은 인터류킨, GM-CSF와 같은 콜로니 자극 인자(CFS), 줄기 세포 인자, TNF-α, 림포톡신-α, 림포톡신-β, CD40L, 또는 CD30L와 같은 종양괴사인자, 프로테아제 억제제, 예를 들어, 아프로티닌, 과산화이온 불균등화효소, 아스파라기나아제, 아르기나아제, 아르기닌 디아미나아제, 아데노신 디아미나아제, 리보뉴클레아제, 카탈라아제, 우리카아제, 빌리루빈 옥시다아제, 트립신, 파파인, 알칼린 포스파타아제, β-글루코로니다아제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 배트록소빈과 같은 효소, 오피오이드, 예를 들어, 엔돌핀, 엔케팔린 또는 비-천연 오피오이드, 호르몬 또는 신경 펩티드, 예를 들어, 칼시토닌, 글루카곤, 가스트린, 부신피질자극호르몬(ACTH), 콜레시스토키닌, 황체형성 호르몬, 성선자극호르몬 방출 호르몬, 융모성 생식선 자극호르몬, 부신피질자극호르몬 방출 인자, 바소프레신, 옥시토신, 항이뇨 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬, 릴랙신, 프로락틴, 펩티드 YY, 신경 펩티드 Y, 췌장폴리펩티드, 렙틴, CART (코카인 및 암페타민 조절 전사체), CART 관련 펩티드, 페릴리핀, α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone) 또는 ACTH와 같은 멜라노코르틴 수용체에서 작용하는 펩티드 호르몬, 멜라닌-농축 호르몬, 나트륨 이뇨펩티드, 아드레노메둘린, 엔도셀린, 세크레틴, 아밀린, 혈관활성 장 펩티드(VIP), 뇌하수체 아데닐 사이클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP), 봄베신, 봄베신-유사 펩티드, 티모신, 헤파린-결합 단백질, 가용성 CD4, 시상하부성 방출 인자, 멜라노토닌 및 그것의 유사체로 구성되는 군으로부터 선택된다.

입체구조적 안정성 단백질 기재 약물은 생물학적 활성을 유지하고 변성 및 미소섬유화에 기인하는 구조의 비가역적 손실을 최소화하는데 중요하다. 특히 거대 폴리펩티드 및 단백질은 복잡한 재접힘 모양에 기인하는 입체구조적 변화에 대하여 불안정하다. 또한, 인슐린 및 아밀린과 같은 미소섬유화의 이력이 알려진 폴리펩티드는 3차 구조(즉, 주조구상 상태의 형성)의 불안정화에 대해 특히 민감하다

각 목적을 위한 효과적인 양은 질병 또는 상해의 중증도 및 피험자의 체중 및 일반적 상태에 따를 것이다.

본 발명의 한 양태에서, 약학 조제물은 0.1 % w/w 내지 50 % w/w의 농도로 치료적으로 활성인 폴리펩티드를 포함한다.

각 목적을 위해 효과적인 양은 질병 또는 상해의 중증도 및 피험자의 체중 및 일반적 상태에 따를 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "약"은 플러스 또는 마이너스 10%와 같이 언급된 수치의 합리적인 전후를 의미한다.

본 발명은 추가로 하기 단계:

a) 선택적으로 부형제를 포함하는 치료적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액을 제공하는 단계,

b) 폴리펩티드의 pI의 1 단위, 바람직하게는 2 단위 및 더 바람직하게는 2.5 pH 단위 이상 또는 이하의 목표 pH 값으로 pH 값을 조절하는 단계,

c) 냉동- 및 분무 건조와 같은 통상적인 건조 기술에 의해 폴리펩티드에서 물을 제거(탈수)하는 단계, 및

d) 예를 들어, 교반, 텀블링 또는 다른 혼합 방법에 의해 반-극성 양성자성 비-수성 용매에 폴리펩티드를 혼합하고 용해하는 단계,

e) 선택적으로 비-수성 폴리펩티드 용액의 여과 또는 원심분리로 미용해된 무기염을 제거하는 단계,

f) 선택적으로 예를 들어, 고체 건조제를 첨가하거나 또는 진공 건조에 의해 남은 양의 물을 제거하는 단계,

g) 선택적으로 용액 압축 정량 흡입기를 위해 히드록시플루오로알칸 추진제와 같은 추가 부형제 및 공용매를 첨가하거나 또는 경구 투약 형태를 위한 세제, 폴리머, 지질 및 공용매를 첨가하는 단계에 의한 약학적 용액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 하기 단계:

e) 선택적으로 비-수성 폴리펩티드의 여과 또는 원심분리로 미용해된 무기염을 제거하는 단계,

g) 선택적으로 용액 압축 정량 흡입기를 위해 히드록시플루오로알칸 추진제와 같은 추가 부형제 및 공용매를 첨가하거나 또는 경구 투약 형태를 위해 세제, 폴리머, 지질 및 공용매를 첨가하는 단계에 의한 약학적 용액의 제조 방법을 제공하며,

단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아니다.

본 발명은 추가로 하기 단계:

a) 아연 및 글리실글리신과 같은 안정화제를 선택적으로 함유하는, 치료적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액을 제공하는 단계,

b) 예를 들어, 염산 또는 수산화나트륨과 같은 비-휘발성 염기 또는 산을 용액에 첨가하는 것에 의해, 폴리펩티드의 pI의 1 단위, 바람직하게는 2 단위 및 더 바람직하게는 2.5 pH 단위 이상 또는 이하로 pH 값을 조절하는 단계,

c) 냉동- 및 분무 건조와 같은 통상적인 건조 기술에 의해 폴리펩티드에서 물을 제거(탈수)하는 단계,

d) 예를 들어, 교반, 텀블링 또는 다른 혼합 방법에 의해 반-극성 양성자성 비-수성 용매 중의 폴리펩티드를 혼합하고 용해하는 단계,

g) 선택적으로 용액 압축 정량 흡입기를 위해 히드록시플루오로알칸 추진제와 같은 추가 부형제 및 공용매를 첨가하거나 또는 경구 투약 형태를 위해 세제, 폴리머, 지질 및 공용매를 첨가하는 단계에 의한 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 하기 단계:

a) 아연 및 글리실글리신과 같은 안정화제를 선택적으로 함유하는 치료적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액을 제공하는 단계,

g) 선택적으로 용액 압축 정량 흡입기를 위해 히드록시플루오로알칸 추진제와 같은 추가 부형제 및 공용매를 첨가하거나 또는 경구 투약 형태를 위해 세제, 폴리머, 지질 및 공용매를 첨가하는 단계에 의한 약학 조성물의 제조 방법을 제공하며,

본 발명의 한 양태에서, 폴리펩티드는 수용액에 첨가된다. 수용액은 순수한 물일 수 있고 또는 그것은 부형제 또는 알칼리 용액을 함유할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 폴리펩티드 용액의 pH는 비-휘발성 염기를 포함하는 알칼리 용액으로 조절된다. 비 휘발성 염기는 알칼리 금속염, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 염, 알칼리 토금속 수산화물 및 아미노산 또는 이것의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 산화칼슘 또는 이것의 어떤 조합으로 조절될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 폴리펩티드 용액의 pH는 염산, 인산 및 황산으로부터 선택되는 비-휘발성 산으로 조절된다.

본 발명의 한 양태에서, 폴리펩티드 비-수용액은 글리실글리신을 포함한다. 글리실글리신은, 예를 들어, 글리세르알데히드와 같은 용매에서 환원성 불순물에 대한 스캐빈저로서 작용할 수 있다. 한 양태에서 글리실글리신은, 예를 들어, 약 4 mM 내지 약 200 mM의 용액 중의 글리실글리신의 농도로 인슐린을 포함하는 프로필렌 글리콜 용액에 첨가된다.

본 발명의 한 양태에서, 폴리펩티드 비-수용액은 Tween 80 및 올레산을 포함한다. Tween 80 및 올레산이 비-수성의 폴리펩티드 용액에 첨가될 때, 폴리펩티드 용액은 경구 투여 후 수성 액체로 희석 시 마이크로에멀젼을 형성한다. 마이크로에멀젼은 흡수 향상제로서 작용할 수 있으며, 더 나아가 더욱 재현가능한 흡수 동태(kinetics)를 초래한다. 용액 중의 Tween 80의 농도는, 예를 들어, 약 30 내지 70 % w/w일 것이고, 올레산의 농도는 10 내지 30 % w/w일 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고혈당증을 야기하는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 가지는 본 발명에 따르는 약학 조성물에 관한 것이며, 이 조성물은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고혈당증을 야기하는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따르는 약학 조성물의 치료적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고혈당증을 야기하는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 치료를 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따르는 약학 조성물의 치료적으로 유효한 양을, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 약학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고혈당증을 야기하는 다른 상태의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 치료를 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 한 양태에서, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고혈당증을 야기하는 다른 상태의 치료에서 사용을 위한 본 발명에 따르는 약학 조성물의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 한 양태에서, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 및 고혈당증을 야기하는 다른 상태의 치료에서 사용을 위한 약학 조성물의 제조 방법이 제공된다.

약학 조성물

본 발명에 따르는 조성물은, 예를 들어, 피하, 경구, 비강 또는 폐로 투여될 수 있다.

피하 투여에 있어서, 본 발명에 따르는 조성물은 공지된 치료적으로 활성인 폴리펩티드의 조제물과 유사하게 조제된다. 더 나아가서, 피하 투여를 위해, 본 발명에 따르는 조성물은 공지된 치료적으로 활성인 폴리펩티드의 투여와 유사하게 투여되며, 일반적으로 의사들은 이 과정에 익숙하다.

본 발명의 한 양태에서, 치료적으로 활성인 펩티드가 인슐린 펩티드인 경우, 본 발명에 따르는 조성물은 순환 인슐린 펩티드 수준을 증가시키고 및/또는 순환 글루코오스 수준을 저하시키기 위해 용량 효과적 방식으로 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여는 당뇨병 또는 고혈당증과 같은 장애를 치료하는데 효과적일 수 있다. 예를 들어, 인슐린의 효과적인 용량의 달성은 약 0.5 ㎍/㎏ 이상 내지 약 50 ㎍/㎏의 인슐린을 포함하는 본 발명에 따르는 조성물의 흡입 용량의 투여를 필요로 한다. 치료적으로 유효한 양은 지식이 있는 의사에 의해, 인슐린 수준, 혈중 글루코오스 수준, 환자의 신체적 상태, 환자의 폐 상태 등을 포함하는 인자들을 고려하여 결정될 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물은 인슐린과 같은 치료적으로 활성인 폴리펩티드의 신속한 흡수를 달성하기 위해 흡입에 의해 전달될 수 있다. 흡입에 의한 투여는 인슐린의 피하 투여에 필적하는 약동학을 초래할 수 있다. 치료적 폴리펩티드가 인슐린 펩티드인 경우 본 발명에 따르는 조성물의 흡입은 순환 인슐린의 수준의 급속한 상승 다음에 혈중 글루코오스 수준의 급속한 하락을 가져온다. 유사한 입자 크기와 유사한 폐 부착 수준을 비교할 때, 상이한 흡입 장치들은 전형적으로 유사한 약동학을 제공한다.

본 발명에 따라서, 조성물은 흡입에 의해 인슐린 펩티드와 같은 치료적 약제의 투여를 위한 당업계에 공지된 다양한 흡입 장치 중 어떤 것에 의해서도 전달될 수 있다. 이들 장치는, 정량 흡입기, 네뷸라이저, 건조 분말 생성기, 분무기 등을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 조성물은 압축 정량 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본 발명에 따르는 조성물을 투여하기 위한 흡입 장치의 몇 가지 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 신뢰성있고, 재현성있고 정확한 것이 유리하다. 흡입 장치는 양호한 호흡가능성을 위해 약 10 ㎛ 미만, 예를 들어 약 1-5 ㎛의 작은 입자들을 전달해야만 한다. 본 발명의 실시에 적당한 상업적으로 이용가능한 흡입 장치의 어떤 구체적인 예들은 Turbohaler™ (Astra), Rotahaler^® (Glaxo), Diskus^® (Glaxo), Spiros™ 흡입기 (Dura), Nektar에 의해 판매되는 장치, 3M 약물 전달 시스템 및 Bespak, AERx™ (Aradigm), Ultravent^® 네뷸라이저 (Mallinckrodt), Acorn II^® 네뷸라이저 (Marquest Medical Products), Ventolin^® 정량 흡입기(Glaxo), Spinhaler^® 분말 흡입기 (Fisons) 등이다.

압축 정량 흡입기(pMDIs)는 약학 제품을 흡입에 의해 기도에 투여하기 위한 잘 알려진 장치이다. pMDIs는 액화된 추진제에 용해된 약물(용액 조제물) 또는 액화된 추진제에 현탁된 미소화된 입자들(현탁 조제물)과 같은 제품으로 전형적으로 채워지는 압력 저항성 에어로졸 캐니스터(canister)를 포함하는데, 이 용기는 정량 밸브를 구비한다. 용액 조제물은 활성 성분, 및 추진제 비히클에 완전히 용해되는 부형제, 또는 에탄올과 같은 적당한 공용매와 그것의 혼합물로 균질화되는 이점을 제공한다. 용액 조제물은 또한 현탁액 조제물과 관련된 물리적 안정성 문제를 방지하며, 따라서 더욱 일관된 균일한 1회 투약량 투여를 보장한다.

히드로플루오로알칸 및 특히 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 (HFA 227) 및 그것의 혼합물은 비-CFC 추진제에 대한 가장 우수한 후보자가 되는 것으로 확인되었다. 정량 밸브의 작동은 적은 부분의 분무 제품이 방출되게 하여 이로써 액화된 추진제의 압력이 용해된 또는 미소화된 약물 입자들을 용기에서 끌어내 환자에게 운반하게 된다. 밸브 작동기는 에어로졸 분무가 환자의 인두 중앙부 안으로 향하도록 사용된다. 캐니스터는 WO 03/078538에서 기술되는 바와 같은 부틸 고무 개스킷을 갖춘 63 마이크로리터 측량 챔버를 가지는 정량 밸브가 구비된, 비활성 유기 코팅으로 코팅된 내부 표면을 가지는 알루미늄 또는 스테인레스강으로 구성될 수 있다.

당업자가 인식하게 되는 바와 같이, 본 발명의 조제물, 전달된 조제물의 양, 및 1회 용량 투여의 지속 기간은 사용된 흡입 장치의 유형에 따른다. 네뷸라이저와 같은 어떤 에어로졸 전달 시스템에 대해서는, 투여 빈도 및 시스템을 가동하는 시간 길이는 주로 에어로졸 중의 치료적 폴리펩티드의 농도에 의존할 것이다.

예를 들어, 네뷸라이저 용액 중의 치료적 폴리펩티드 농도가 더 높을 때 더 짧은 기간의 투여가 사용될 수 있다. 정량 흡입기와 같은 장치는 더 높은 에어로졸 농도를 만들 수 있으며, 원하는 양의 폴리펩티드를 전달하기 위해 더 짧은 기간 동안 작동될 수 있다. 분말 흡입기와 같은 장치는 주어진 약제의 충전물이 장치로부터 배출될 때까지 활성제를 전달한다. 이런 유형의 흡입기에서 주어진 양의 분말 중 본 발명에 따르는 조성물의 양은 1회분 투여에서 전달되는 용량을 결정한다.

흡입 장치에 의해 전달되는 조제물에서 인슐린과 같은 폴리펩티드의 입자 크기는, 예를 들어, 폐, 및 하부 기도 또는 폐포에 도달하는 인슐린의 능력과 관련하여 중요하다. 본 발명의 조성물에서 폴리펩티드는 전달되는 폴리펩티드의 적어도 약 10%, 예를 들어 약 10 내지 약 20% 또는 그 이상이 폐에 부착되도록 조제될 수 있다. 입으로 호흡하는 인간에 대해 폐 부착의 최대 효능은 약 2㎛ 내지 약 3㎛의 입자 크기에 의해 얻어진다고 알려져 있다. 입자 크기가 약 5㎛ 이상일 때, 폐 부착은 실질적으로 감소한다. 약 1㎛ 이하의 입자 크기는 폐 부착이 감소되는 원인이 되며, 이는 치료적으로 효과적인 충분한 질량의 입자들을 전달하는 것을 어렵게 한다. 따라서, 흡입에 의해 전달되는 폴리펩티드의 입자는 약 10㎛ 미만, 예를 들어, 약 1㎛ 내지 약 5 ㎛의 범위의 입자 크기를 가진다. 폴리펩티드의 조제물은 선택된 흡입 장치에서 원하는 입자 크기를 제공하도록 선택된다.

폴리펩티드 용액은 호흡 및 폐 투여에 적당한 약학적 담체 또는 부형제와 선택적으로 조합될 수 있다. 이러한 담체는 환자에게 전달될 액체 중의 인슐린과 같은 치료적 폴리펩티드 농도를 감소시키는 것이 요망될 때 단순히 벌크화제로서 작용할 수도 있지만, 또한 조성물의 안정성을 향상시키기 위해 작용할 수도 있다.

적당한 재료는 탄수화물, 예를 들면, (a) 프럭토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노오스, 소르보오스 등과 같은 단당류; 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 2-히드록시프로필-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린; 및 라피노오스, 말토덱스트린, 덱스트란 등과 같은 다당류; (b) 글리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 리신, 히스티딘, 아르기닌 등과 같은 아미노산; (c) 나트륨 시트레이트, 나트륨 아스코르베이트, 마그네슘 글루코네이트, 나트륨 글루코네이트, 트로메타민 히드로클로라이드 등과 같은 유기산 및 염기로부터 제조되는 유기염; (d) 아스파탐, 인간혈청알부민, 젤라틴 등과 같은 펩티드 및 단백질; (e) 만니톨, 자일리톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 바람직한 담체의 군은 락토오스, 트레할로오스, 라피노오스, 말토덱스트린, 글리신, 나트륨 시트레이트, 트로메타민 히드로클로라이드, 인간혈청 알부민, 및 만니톨을 포함한다.

이러한 담체 물질은, 분무 건조를 위해 제조된 폴리펩티드 용액에 담체 물질을 첨가함으로써, 분무 건조와 같은 탈수 전에 인슐린 펩티드와 같은 치료적 폴리펩티드와 조합될 수 있다. 그런 방법으로, 담체 물질은 단백질 입자와 동시에 그리고 단백질 입자의 부분으로서 형성될 것이다.

전형적으로, 담체가 폴리펩티드와 함께 분무 건조에 의해 형성될 때, 폴리펩티드는 5 내지 95%, 바람직하게는 20% 내지 80% 범위의 중량 백분율에서 각각 개개의 입자에 존재할 것이다. 나머지 입자는 주로 담체 물질일 것이지만(전형적으로 5중량% 내지 95중량%이고, 통상적으로 20중량% 내지 80중량% 임), 또한 완충제(들)을 포함하고, 상기 기술한 바와 같은 다른 성분들을 포함할 수도 있다.

비-수성 인슐린 조제물은 또한 다른 활성 성분들과 조합될 수 있다. 예를 들어, 당뇨병의 치료를 개선하기 위해 인슐린 조제물에서 소량의 아밀린 또는 활성 아밀린 유사체를 조합하는 것이 바람직할 수도 있다. 아밀린은 정상적인(비-당뇨병) 개체에서 췌장 0-세포로부터 인슐린과 함께 분비되는 호르몬이다. 아밀린은 생체 내 인슐린 활성을 조절하는 것으로 믿어지며, 인슐린과 함께 아밀린의 동시 투여는 혈중 글루코오스 조절을 개선시킬 수 있다는 것이 제안되었다. 본 발명의 조성물에서 아밀린과 인슐린의 조합은 이러한 동시 투여를 달성하는데 특히 편리한 제품을 제공할 것이다. 아밀린은 0.1중량% 내지 10중량% (1회분 용량 중에서 인슐린의 총 중량을 기준으로 함), 바람직하게는 0.5중량% 내지 2.5중량%로 인슐린과 조합될 수 있다. 아밀린은 캘리포니아 샌디에고의 Amylin Corporation과 같은 상업적 공급업자로부터 이용가능하고, 본 발명의 조성물에 용이하게 조제될 수 있다. 예를 들어, 아밀린은 인슐린, 및 선택적으로 담체와 함께 수용액 또는 다른 적당한 용액에 용해될 수 있고, 용액을 분무건조하여 분말 제품을 만든다.

분무-건조된 폴리펩티드를 포함하는 분무는 압력하에서 폴리펩티드의 현탁액 또는 용액을 노즐을 통해 내보냄으로써 만들어질 수 있다. 노즐 크기 및 형상, 인가 압력, 및 액체 공급 속도는 원하는 방출량 및 입자 크기를 달성하도록 선택될 수 있다. 전기분무는, 예를 들어, 모세관 또는 노즐 공급과 관련하여 전기장에 의해 만들어질 수 있다.

유리하게는, 예를 들어, 분무기에 의해 전달되는 인슐린의 입자는 약 10㎛ 미만, 예를 들어, 약 1㎛ 내지 약 5㎛의 범위에서 입자 크기를 가진다.

폴리올에서와 같이 반-극성의 양성자성 유기 용매에 용해된 분무-건조와 같이 탈수된 폴리펩티드를 함유하는 본 발명에 따르는 약학 조성물은 또한 이러한 치료를 필요로 하는 환자들에게 비경구적으로 투여될 수도 있다.

비경구적 투여는 주사기, 선택적으로 펜형 주사기에 의해, 피하, 근육내 또는 정맥 주사로써 수행될 수 있다. 또 다르게는, 비경구 투여는 인퓨전 펌프에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 제제는 인슐린 펌프와 같은 펌프와 연결하여 사용될 수 있다. 인슐린 펌프는 미리 채워져 있으며 1회용이고, 또는 인슐린 제제는 제거가능한 저장소로부터 제공될 수 있다. 인슐린 펌프는 피부장착되거나, 이식되거나 또는 휴대될 수 있으며, 펌프의 저장 구획으로부터 환자로의 인슐린 제제의 경로는 다소 굽어있을 수도 있다. 인슐린 펌프의 비-제한적 예는 US 5,957,895, US 5,858,001, US 4,468,221, US 4,468,221, US 5,957,895, US 5,858,001, US 6,074, US 5,858,001, US 5,527,288, 및 US 6,074,369에 개시되어 있다.

분무-건조와 같이 탈수된 폴리펩티드의 본 발명에 따르는 주사가능한 조성물은 적절한 경우 폴리올과 같은 반-극성 양성자성 유기 용매에서 성분들은 용해하고 혼합하는 것을 수반하는 약학적 산업의 통상적인 기술을 사용하여 제조되어 원하는 최종 생성물을 제공할 수 있다.

일반적으로, 주사는 생물학적으로 활성인 단백질을 체순환에 투여하는 전형적인 방식이다. 주사 맞은 자는 주사에 의해 불편함 또는 통증을 경험할 수 있다. 이러 이유 및 다른 이유들 때문에, 투여의 방식으로서 주사를 사용하는 환자의 순응성과 관련한 문제가 있을 수 있다. 주사에 대한 한 가지 대안은 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 경구 투여이다. 인슐린의 경우에, 경구 전달은 편리성과 순응성 문제 이상의 이점을 가질 수 있다. 위장관에서 흡수되는 인슐린은 췌장에 의해 분비되는 인슐린의 생리 기능을 모방하는데, 두 가지 다 문맥으로 방출되고 간으로 직접적으로 이송되기 때문이다. 문맥 순환 안으로의 흡수는 인슐린 분비를 조절하는 말초-문맥 인슐린 기울기를 유지한다. 간을 통하는 그것의 1차 통과에서, 인슐린의 대략 60%가 유지되고 대사되고, 이에 의해서 말초 고인슐린혈증의 발병률, 당뇨병 관련 전신 합병증의 요인을 감소시킨다. 인슐린 치료제 및 다른 경구적 당뇨병 약제 무섭고 흔한 합병증은 저혈당증이다.

그러나, 위장관에서의 광대한 단백질 가수분해 및 낮은 상피 침투성 때문에 폴리펩티드의 경구적 생체이용성은 극히 낮다. 예를 들어, 효소 분해 연구는 본래의 인슐린이 트립신 및 α-키모트립신의 존재하에서 광범위하게 분해됨을 보여주었다. 따라서, 핫 스팟(hot spot)의 페길화 및 돌연변이와 같은 단백질 공학에 의한 단백질 가수분해에 대한 폴리펩티드의 안정화는 경구적 생체이용성을 개선시키기 위해 흔히 사용되는 전략이다. 단백질 가수분해를 감소시키기 위한 다른 전략은 나노입자, 마이크로입자, 마이크로에멀젼, 마이크로에멀젼 예비-농축물, 리포솜 등에 폴리펩티드를 포함시키는 것이다. 약물은 위 및 위장관에서 적대적 환경으로부터 보호될 뿐 아니라, 이들 입자는 페이어스 패치(Peyers patch)를 통해 장 경로로부터 체순환으로 흡수될 수도 있다.

한 구체예에서, 약학적 비-수성 조성물은 마이크로에멀젼 예비-농축물이다. 이것은 수성 매질, 예를 들어, 물 또는 위장액으로 희석시, 예를 들어, 수중유(o/w) 마이크로에멀젼으로 자발적으로 자체 에멀젼화하는 조성물이다. 마이크로에멀젼은 더 낮은 nm 범위, 예를 들어, 20-400 nm에서 에멀젼화된 상의 평균 도메인 크기를 가지는 열역학적으로 안정한 시스템인 것으로 이해된다.

일반적으로, 마이크로에멀젼 예비-농축물은 하나 이상의 친수성 성분, 하나 이상의 친유성 성분, 하나 이상의 비-이온성 계면활성제 및/또는 공동계면활성제 및 활성 성분, 예를 들어 예비-농축물 혼합물에 완전히 용해된 치료적 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 게다가, 마이크로에멀젼 예비-농축물은, 적당한 경우, 통상적인 보조제 및 첨가제를 포함할 수 있다. 이들 자체(마이크로)-에멀젼화 예비-농축물은 마이크로에멀젼이 위장관에서 형성된다는 예상하에 섭취될 수 있다. 마이크로에멀젼 예비-농축물은 장용 코팅 연질 젤라틴 캡슐에 캡슐화되어 투여될 수 있다. 다수의 마이크로에멀젼은 경구 투여 후 몇 가지 치료적 화합물의 생체이용성을 향상시키는 것으로 보고되었다.

마이크로에멀젼 예비-농축물의 조성물의 예는:

a) 폴리올과 같은 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜 및/또는 글리세롤)

b) 글리세롤 및/또는 프로필렌 글리콜과 같은 하나 이상의 친수성 성분

b) 오일과 같은 하나 이상의 친유성 성분(예를 들어, 모노-디글리세라이드 및/또는 트리글리세라이드)

c) 폴록사머 및/또는 폴리소르베이트와 같은 하나 이상의 비-이온성 계면활성제

d) 에탄올과 같은 하나 이상의 공동 계면활성제

e) 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드(예를 들어, 인슐린)

f) 항산화제 및/또는 안정화제와 같은 하나 이상의 첨가제이다.

폴리올과 같은 반-극성 양성자성 유기 용매에 용해된 분무-건조와 같이 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드를 함유하는 본 발명에 따르는 약학 조성물은 또한 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 에어로졸화된 분무의 형태로 구강에 또는 혀 밑으로 투여될 수 있다. Generex Biotechnology Corporation에 의해 개발된 Oral-lyn™ 조제물은 압축 정량 흡입기(pMDI)를 통해 투여되는 구강 에어로졸 조제물의 예이다. HFA 134a 및 227과 같은 히드로플루오로알칸(HFA)은 전형적으로 추진제로서 사용된다. 한 구체예에서, 본 발명에 따르는 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 pI보다 1 단위 이상 아래 또는 위의 pH 값에서 전형적으로 물에 매우 용해성이다. 물은 HFA 추진제와 극도로 불량하게 혼화성이기 때문에, 단백질에 대해 프로필렌 글리콜 및 에탄올과 같은 용매를 사용하는 것이 유리하다. 상기 용매는 HFA 추진제와 혼화성일 수 있다. 용매형 정량 흡입기는 일반적으로 현탁형 pMDI에 비하여 바람직한데, 이것은 입자의 크림화 또는 침강 때문에 용량 균일성에서 더 높은 변화를 가지는 경향이 있다. 용액형 pMDI는 치료적으로 활성인 폴리펩티드에 더하여 안정제 및 침투 향상제와 같은 다른 첨가제와 함께 조제 될 수 있다.

가압된 시스템 대신에, 치료적으로 활성인 폴리펩티드는 또 다르게는 니트로글리세린의 혀 밑 투여를 위해 Coro Nitro Pump Spray®와 같은 펌핑가능한 약제로서 구강으로 또는 혀 밑으로 투여될 수 있다.

폐 부착을 피하기 위해 경구 분무 에어로졸은 바람직하게는 10㎛ 이상의 방울 직경을 가져야 한다.

점막점착 약물 전달 시스템은 비-침입성 단백질/펩티드 전달에서 큰 관심을 얻었다. 그것들은 점막 조직에서 전달 시스템의 체류 시간을 증가시킬 수 있다. 수 개의 생체점착성 전달 시스템은, 예를 들어, 경구 투여 후 단백질 및 펩티드의 생체이용성을 향상시키는 것으로 보고되었다.

바람직한 구체예에서, 비-수성 용매 없는 생체 점착성 조성물은 활성 단백질 또는 펩티드, 적어도 하나의 생체점착성 폴리머, 및 폴리올(들)과 같은 하나 이상의 반-극성 양성자성 유기 용매를 포함한다. 게다가, 조성물은, 적당한 경우, 통상적인 보조제 및 첨가제를 포함할 수 있다. 생체점착성 폴리머는, 예를 들어, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드) 블록 공중합체(예로써, 폴록사머), 폴리비닐피롤리돈(예로써, 포비돈 또는 PVP), 폴리아크릴산, 폴리카르보필(예로써, 카르보폴 또는 카르보머), 키토산, 모든 종류의 티올화된 폴리머(예로써, 티오머), 셀룰로오스, 아르기네이트, 히드록시에틸셀룰로오스 또는 다른 생체점착성 폴리머일 수 있다.

조성물은 액체, 반-고체 또는 고체 투약 형태일 수 있다.

이들 신규 조성물은, 예를 들어, 통상적인 생체점착성 히드로겔과 비교하여, 이들 조제물에서 필요로 되는 수성 매질이 회피될 수 있고 그것의 증가된 저장 안정성뿐 아니라 증가된 생체 이용성(폴리올에 의해 유발)이 달성될 것이라는 이점을 가진다.

생체점착성 조성물의 예:

a) 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드(예를 들어, 인슐린)

b) 폴리올(예를 들어, 프로필렌 글리콜 및/또는 글리세롤)과 같은 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매

c) 생체점착성 폴리머(예를 들어, 포비돈 및/또는 폴록사머)

d) 첨가제

한 구체예에서, 비-수성 조성물은 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 폴리올과 같은 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매 및 하나 이상의 통상적인 침투 향상제를 함유한다. 침투 향상제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 지방산, 팔미토일 카르니틴 클로라이드, 에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), EDTA, 담즙산염, 이온성- 뿐 아니라 비-이온성 계면활성제, 예로써, 인지질 및 알킬글리코사이드, 폴리머, 키토산, 시트르산 및 나트륨 살리실레이트이다. 게다가, 조성물은, 적당한 경우, 통상적인 보조제 및 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 구강 및 경구 투여를 위해, 예를 들어, 정제, 캡슐, 좌약, 액체, 스프레이 또는 에어로졸로부터 선택되는 형태로 투여될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 폴리올과 같은 반-극성 양성자성 유기 용매(들)에 기초한 고체 투약 형태는 적어도 하나의 폴리올 및 실온에서 하나 이상의 고체 부형체, 예를 들어, 폴록사머, PEG 또는 PEG 스테아레이트를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 조성물은 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 적어도 하나의 폴리올과 같은 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매, 및 실온에서 적어도 하나의 고체 비 이온성 부형제, 예를 들어 폴록사머 또는 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 고체 부형제의 혼합물을 함유한다. 고체 폴록사머의 예는 Pluronic F-127, Pluronic F-68이다. 고체 PEG의 예는 PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000이다. 게다가, 고체 조성물은, 적당한 경우, 효율적인 정제화를 보장하기 위하여 결합제, 활택제 및 윤활제와 같은 통상적인 보조제 및 첨가제; 및 정제가 소화관에서 분해되는 것을 보장하기 위한 붕해제를 포함한다.

정제 및 캡슐은 장용 코팅으로 코팅될 수 있는데, 이것은 특정 영역에 대해 적당한 pH-용해성 폴리머를 선택함으로써 정해진 pH의 수성 환경과 접촉시 파열되거나 또는 침투가능하게 되고, 투약 형식의 내용물이 위장관(예를 들어, 소장 및 대장)의 원하는 자리에서 선택적으로 방출되는 것을 가능하게 한다. 적당한 장용 폴리머의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 메타크릴산 공중합체, 셸락, 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 셀룰로오스 아세테이트 말레이트, 셀룰로오스 벤조에이트 프탈레이트, 셀룰로오스 프로피오네이트 프탈레이트, 카르복시메틸에틸셀룰로오스, 에틸히드록시에틸셀룰로오스 프탈레이트, 셸락, 스티렌-아크릴산 공중합체, 메틸 아크릴레이트-아크릴산 공중합체, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 부틸 아크릴레이트-스티렌-아크릴산 공중합체, 메타크릴산-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-에틸 아크릴레이트 공중합체, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산-옥틸 아크릴레이트 공중합체, 비닐 아세테이트-말레산 무수물 공중합체, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 스티렌-말레산 모노에스테르 공중합체, 비닐 메틸 에테르-말레산 무수물 공중합체, 에틸렌-말레산 무수물 공중합체, 비닐 부닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, 아크릴로니트릴-메틸 아크릴레이트-말레산 무수물 공중합체, 부틸 아크릴레이트-스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리비닐 알코올 프탈레이트, 폴리비닐 아세탈 프탈레이트, 폴리비닐 부틸레이트 프탈레이트 및 폴리비닐 아세토아세탈 프탈레이트 또는 그것의 조합을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 투약 형태는 액체를 함유하는 연질 젤라틴 캡슐이다.

본 발명은 또한 하기 구체예와 관련된다:

1. a) 바람직하게는 10-100개의 아미노산을 포함하는 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 및

폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수되었고, 상기 목표 pH는 바람직하게는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있는 약학적 비-수성 조성물.

2. a) 바람직하게는 10-100개의 아미노산을 포함하는 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 및

폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수되었고, 상기 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있고,

단, 폴리펩티드는 인슐린친화성 펩티드, GLP-1(7-37) 또는 그것의 유사체 또는 유도체, 또는 엑센딘 또는 그것의 유사체 또는 유도체가 아닌 약학적 비-수성 조성물.

3. 구체예 1 또는 2에 있어서, 유기 용매는 폴리올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

4. 구체예 3에 있어서, 유기 용매는 디올 및 트리올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

5. 구체예 4에 있어서, 유기 용매는 프로필렌 글리콜 및 글리세롤로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

6. 구체예 5에 있어서, 유기 용매는 프로필렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

7. 구체예 5에 있어서, 유기 용매는 글리세롤인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

8. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 분무 건조되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

9. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 냉동-건조되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 pI와 적어도 1.5 pH 단위가 차이나는 pH에서 탈수되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

11. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 pI와 적어도 2 pH 단위가 차이나는 pH에서 탈수되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

12. 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 pI보다 적어도 2.5 pH 단위 위인 pH에서 탈수되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

13. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매 중에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 20 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

14. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매 중에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 30 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

15. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매 중에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 40 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

16. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매 중에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 50 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

17. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매 중에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 60 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

18. 구체예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 목표 pH는 약 6.5 내지 약 8.5의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

19. 구체예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 목표 pH는 약 7.2 내지 약 8.3의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

20. 구체예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 목표 pH는 약 7.0 내지 약 8.5의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

21. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매는 적어도 20% w/w의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

22. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매는 적어도 30% w/w의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

23. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매는 적어도 40% w/w의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

24. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매는 적어도 50% w/w의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

25. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 유기 용매는 적어도 80% w/w의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

26. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 10% w/w 미만의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

27. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 5% w/w 미만의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

28. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 2% w/w 미만의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

29. 구체예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 당뇨병 또는 고혈당증의 폐, 비경구, 비강 또는 경구 치료를 위한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

30. 구체예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 당뇨병 또는 고혈당증의 폐 치료를 위한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

31. 구체예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 당뇨병 또는 고혈당증의 경구 치료를 위한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

32. 구체예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 수용성인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

33. 구체예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드는 인슐린 펩티드, 아밀린, 아밀린 유사체, 아밀린 유도체, α-MSH, α-MSH 유사체, α-MSH 유도체 및/또는 그것의 어떤 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

34. 구체예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 펩티드는 인슐린 유사체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

35. 구체예 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 인슐린 펩티드는 AspB28 인간 인슐린; LysB28ProB29 인간 인슐린; LysB3GluB29 인간 인슐린 및 A14GluB25HisdesB30 인간 인슐린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 인슐린 유사체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

36. 구체예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 폐 치료, 경구 치료, 비강 치료 또는 구강 치료에 적합한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

37. 구체예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 폐 사용에 적합한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

38. 구체예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 비강 치료에 적합한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

39. 구체예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 경구 사용에 적합한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

40. 구체예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 구강 치료에 적합한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

41. 구체예 1 내지 40 중 어느 하나에 따르는 약학 조성물의 치료적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 당뇨병을 치료하는 방법.

42. 구체예 1 내지 40 중 어느 하나에 따르는 약학 조성물의 치료적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애 및 1형 당뇨병의 치료 또는 예방 방법.

43. 구체예 1 내지 40 중 어느 하나에 따르는 약학 조성물의 치료적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 2형 당뇨병의 질병의 진행을 지연 또는 예방하는 방법.

44. 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애 및 1형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제로서 사용을 위한 구체예 1 내지 40 중 어느 하나에 따르는 약학 조성물.

45. 2형 당뇨병의 질병의 진행을 지연 또는 예방하기 위해 약제로서 사용하기 위한 구체예 1 내지 40 중의 어느 하나에 따르는 약학 조성물.

간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 본원에 그것 전체가 참고로써 포함되며, 참고로써 포함된 각 참고문헌이 개별적이고 구체적으로 나타내는 그것 전체에서 제시되는 것과 동일한 정도로 참고로써 본원에 포함된다(법이 허락하는 최대한의 정도로).

모든 표제 및 부제는 본원에서 단지 편의를 위해 사용되며, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

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본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 정도로 본원에 첨부된 청구항에서 열거되는 주제의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.

일반 과정

티오플라빈 T (ThT) 미소섬유화 분석: 원리 및 실시예

펩티드의 낮은 물리적 안정성은 아밀로이드 미소섬유 형성을 가져올 수 있는데, 이것은 종국적으로 겔 형성을 초래하는 샘플에서 잘 정돈된, 실같은 거대분자 구조로서 관찰된다. 이것은 전통적으로 샘플의 육안 검사에 의해 측정되었다. 그러나, 측정의 종류는 매우 주관적이고 관찰자에 의존한다. 따라서, 소분자 인디케이터 프로브의 사용은 훨씬 더 유리하다. 티오플라빈 T(ThT)는 이러한 프로브이며 미소섬유에 결합할 때 명확한 형광 신호를 가진다[Naiki et al. (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284].

동적(가속화된) ThT 분석

미소섬유 형성을 위한 시간 과정은 하기 수식으로 S자형의 커브로써 설명될 수 있다[Nielsen et al. (2001) Biochemistry 40, 6036-6046], cn.f 도 6:

여기서, F는 시간 t에서 ThT 형광이다. 상수 t₀는 최대 형광의 50%에 도달하는데 필요한 시간이다. 미소섬유 형성을 표시하는 2개의 중요한 변수는 t₀-2τ 및 겉보기 반응속도 상수 k_app = 1/τ에 의해 계산되는 지체 시간이다.

펩티드의 부분적으로 접힌 중간체의 형성은 미소섬유화를 위한 일반적인 개시 메커니즘으로서 제안된다. 이들 중간체들은 추가 중간체가 조립되고 미소섬유화가 진행될 수 있는 주형을 형성하기 위해 핵형성하는 것은 거의 없다. 지체 시간은, 핵의 임계질량이 축적되는 간격에 해당하고 겉보기 반응속도 상수가 미소섬유 자체가 형성되는 속도이다.

샘플 제조

샘플은 각 분석 전에 신선하게 제조하였다. 티오플라빈 T를 1μM의 최종 농도로 H₂O 중의 저장 용액으로부터 샘플에 첨가하였다. 200㎕의 샘플 알리쿼트를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 두었다(Packard OptiPlate™-96, 백색 폴리스티렌). 보통, 각 샘플 중 8개의 복제물(하나의 시험 조건에 해당)을 웰의 한 컬럼에 두었다. 플레이트를 Scotch Pad (Qiagen)로 밀봉하였다.

배양 및 형광 측정

주어진 온도에서 배양, 진탕 및 ThT 형광 방출의 측정을 Fluoroskan Ascent FL 형광 플레이트판독기(Thermo Labsystems)에서 행하였다. 온도를 37℃로 조절하였다. 궤도 진탕을 모든 제공된 데이터에서 1mm의 진폭을 가지는 960 rpm으로 조절하였다. 형광 측정을 444 nm 필터를 통한 여기 및 485 nm 필터를 통한 방출의 측정을 사용하여 행하였다.

각 실행을 10분 동안 분석 온도에서 플레이트를 배양함으로써 시작하였다. 플레이트를 전형적으로 45 시간 동안 20분 마다 측정하였다. 각 측정 사이에, 기술한 바와 같이 플레이트를 진탕하였고 가열하였다.

정적 ThT 분석

샘플 제조 및 형광 측정

비-수성 프로필렌 글리콜에서 인슐린 아스파르트를 함유하는 샘플을 1개월 까지동안 5 및 40℃에서 저장하였다. 측정 전에 샘플을 탈염수를 이용하여 1 ㎎/㎖의 예상 농도(미소섬유화된 본래의 단백질을 포함)로 희석하였다. 형광 측정을 퍼 킨엘머 모델 LS 50 B 형광분광광도계를 사용하여 0.3 cm 여기 광 경로로 세미마이크로 석영 큐벳(Hellma, Germany)에서 수행하였다. 196 ㎕ 희석 샘플에 4 ㎕ ThT 1 mM 저장 용액의 첨가 직후 450 nm에서 여기와 5 nm의 슬릿 폭을 가지는 470 내지 560 nm의 방출 스펙트럼을 기록하였다. 반응 혼합물에서 ThT의 농도는 20 μMol/l였다. 결과를 I 482 nm/[단백질 농도 (mg/ml) × 큐벳 경로 길이 (cm)]로서 기록하였고, 즉, 결과를 1 ㎎/㎖의 단백질 농도와 1 cm 길이의 큐벳 경로 길이로 표준화하였다.

실시예 1

A) 인간 인슐린의 용해 및 7.0으로 목표 pH의 조절

9.5 g의 인간 인슐린을 200 g의 얼음물에서 분산시켰다. 현탁액을 빙욕에 두었고, 초기 pH는 pH 5.12로 측정되었다. 5.8 g의 빙냉한 0.2N 수산화나트륨으로 pH를 7.04로 조절하였다. 용액을 다시 2시간 동안 빙욕에 남겨두었고 그 후 탈염수를 총 240g의 중량으로 첨가하였다.

50 g의 pH 7.50 용액을 추가로 처리하였다. 빙냉한 1 N NH₄OH로 pH를 7.04 로부터 7.50으로 조절하였고, 그 후 밤새 냉장고에 넣어두었다. 다음날 pH는 7.32로 측정되었고, 빙냉한 1 N NH₄OH를 이용하여 pH를 pH 8.06으로 조절하였다. 그 후 물을 60.0 g까지 첨가하였다. 인간 인슐린의 최종 농도는 대략 30 ㎎/㎖이었다.

B) 수성 인슐린 용액의 건조

건조한, 고체 마이크로입자를 0.7 mm 병류식 2-유체 노즐을 구비한 Buechi B-290 미니 분무 건조기(Buechi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)에서 제조하였다. 인간 인슐린 용액은 건조 챔버에서 2 ㎖/분의 액체 공급 속도 및 600-800 리터/시간의 원자화 공기흐름으로 뜨거운 공기 흐름으로 원자화하였다. 건조 공기는 150℃의 입구 온도 및 35 m³/시간의 건조 공기 유속을 가졌다. 출구 온도는 대략 70℃이었다. 고체 마이크로입자를 건조 챔버에 연결한 사이클론에 의해 포착한 후 모아서 건조 상태에서 저장하였다

C) 고체 인슐린 분말의 목표 pH의 확인

다른 농도들이 측정된 pH 값에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 분무 건조한 인간 인슐린을 40 ㎎/㎖, 80 ㎎/㎖ 및 160 ㎎/㎖의 농도로 탈염수에 재용해하였다:

25.3 mg을 633 ㎕ 물에 첨가하였다: pH는 6.95로 측정되었다

43.5 mg을 545 ㎕ 물에 첨가하였다: pH는 6.95로 측정되었다

81.7 mg을 510 ㎕ 물에 첨가하였다: pH는 7.01로 측정되었다

실시예 2

1,2 프로판디올(프로필렌 글리콜)에서 pH 5.4 내지 pH 7.4의 범위에 있는 목표 pH로 인슐린 아스파르트의 가용화.

다른 목표 pH 값을 가지는 다양한 인슐린 아스파르트 용액을 분무 건조 전에 제조하였다.

용액 A, 목표 pH 5.35:

16 g 인슐린 아스파르트를 빙욕에서 150 ㎖ 물 중에 현탁하였다. 다음에, 2.6 ㎖의 빙냉한 농 수성 암모니아(25 % w/w)를 pH가 7.53이 될 때까지 단계적으로 첨가하였고, 맑은 용액을 얻었다. 최종적으로, 물을 첨가하여 40 ㎎/㎖의 인슐린 아스파르트의 최종 농도로 하였다.

용액 B, 목표 pH 6.04:

16 g 인슐린 아스파르트를 빙욕에서 150 ㎖ 물 중에 현탁하였다. 초기에, 2.2 ㎖의 빙냉한 1 N NaOH 그리고 다음에 750 ㎕의 빙냉한 농 수성 암모니아 (25 % w/w)를 pH가 7.52가 될 때까지 단계적으로 첨가하였고, 맑은 용액을 얻었다. 최종적으로, 물을 첨가하여 40 ㎎/㎖의 인슐린 아스파르트의 최종 농도로 하였다.

용액 C, 목표 pH 6.27:

16 g 인슐린 아스파르트를 빙욕에서 150 ㎖ 물 중에 현탁하였다. 초기에, 4.4 ㎖의 빙냉한 1 N NaOH 그리고 다음에 750 ㎕의 빙냉한 농 수성 암모니아 (25 % w/w)를 pH가 7.48이 될 때까지 단계적으로 첨가하였고, 맑은 용액을 얻었다. 최종적으로, 물을 첨가하여 40 ㎎/㎖의 인슐린 아스파르트의 최종 농도로 하였다.

용액 D, 목표 pH 6.66:

16 g 인슐린 아스파르트를 빙욕에서 150 ㎖ 물 중에 현탁하였다. 초기에, 6.6 ㎖의 빙냉한 1 N NaOH 그리고 다음에 370 ㎕의 빙냉한 농 수성 암모니아 (25 % w/w)를 pH가 7.47이 될 때까지 단계적으로 첨가하였고, 맑은 용액을 얻었다. 최종적으로, 물을 첨가하여 40 ㎎/㎖의 인슐린 아스파르트의 최종 농도로 하였다.

용액 E, 목표 pH 7.47:

16 g 인슐린 아스파르트를 빙욕에서 150 ㎖ 물 중에 현탁하였다. 초기에, 9.6 ㎖의 빙냉한 1 N NaOH를 pH가 7.49가 될 때까지 단계적으로 첨가하였고, 맑은 용액을 얻었다.

건조 분말을 0.7 mm 병류식 2-유체 노즐을 구비한 Buechi B-290 미니 분무 건조기(Buechi, Labortechnik AG Flawil, Switzerland)에서 제조하였다. 액체 공급물(용액 A, B, C, D 및 E)을 건조 챔버에서 2 ㎖/분의 액체 공급 속도 및 600-800 리터/시간의 원자화 공기 흐름으로 뜨거운 공기 흐름으로 원자화하였다. 건조 공기는 150℃의 입구 온도 및 35 m³/시간의 건조 공기 유속을 가졌다. 출구 온도는 41 내지 61℃로 다양하였다. 건조 분말을 건조 챔버에 연결한 사이클론에 의해 포착한 후 모아서 건조 상태에서 저장하였다.

건조 마이크로입자의 수분 함량을 PerkinElmer Pyris TGA1 열무게 측정 분석기를 사용하여 최소 3시간 동안 110℃에서 건조시 손실에 의해 결정하였다. 수분 손실에 의해 야기된 중량 변화를 기록하였고 중량 백분율로 표시하였다.

분무 건조된 인슐린의 목표 pH를 대략 40 ㎎/㎖의 농도로 탈염수 중에서 분무 건조된 분말을 용해함으로써 측정하였고 전위차계에 의해 pH를 측정하였다(Radiometer, 덴마크).

분무 건조된 분말의 특징:

다양한 인슐린 아스파르트 분말의 용해도를 스크류-캡 바이알에 고체 분말(전형적으로 200mg의 분말)을 첨가한 후 2 g의 1,2 프로판디올(프로필렌 글리콜)을 첨가하여 측정하였다. 분말 및 1,2 프로판디올(프로필렌 글리콜)을 적어도 48시간 동안 주변 온도에서 15 rpm으로 Swelab 820 믹서(Boule Medical AB)에서 진탕하였다. 1,2 프로판디올(프로필렌 글리콜)이 맑아졌다면 더 많은 분말을 바이알에 첨가하였다. 그 후, 0.5 시간 동안 4000rpm에서 원심분리에 의해, 미용해된 인슐린 아스파르트를 가용화된 인슐린 아스파르트로부터 분리하였다. 상청액 중의 인슐린 아스파르트 농도를 HPLC로 측정하였다. HPLC 분석으로부터 결과를 도 1에 나타낸다.

실시예 3

다양한 유기 반-극성 양성자성 용매 중에서 7.5의 목표 pH로 인슐린 아스파르트의 용해화.

다양한 유기 반-극성 양성자성 용매(에탄디올(에틸렌 글리콜); 1,4 부탄디올; 1,3 부탄디올; 1,3 프로판디올, 프로판디올(글리세롤); 1,2 프로판디올 (프로필렌 글리콜))에서 7.5의 목표 pH를 가지는 인슐린 아스파르트 분말의 용해도를 실시예 2에서 기술한 바와 같이 측정하였다.

용해도 연구로부터의 결과를 도 2에 나타낸다.

실시예 4

래트 장기낭 모델에서 인슐린 아스파르트 10% 프로필렌 글리콜 조제물의 시험관 내 평가

새로 절개한 래트 소장을 빙냉한 식염수로 헹구었다. 그 후 각각 4cm 길이의 장기낭을 만들었다. 간단히, 4 cm 장 조각의 한 끝을 실로 결찰한 후 시험 용액(1 mM)을 함유하는 0.25 ㎖의 인슐린을 장에 채웠고, 그 후 나머지 끝을 동일한 방법으로 결찰하였다. 그 후 채운 장기낭을 2시간 동안 0.5 ㎖ 배양 배지에서 pH 7.4 37℃에서 배양하였다. 2시간 후, 배양 배지를 침투된 인슐린에 대해 HPLC 및 MALDI에 의해 분석하였다. HPLC 분석으로부터의 결과를 도 3에 나타낸다. 10% PG의 존재하에서, 인슐린이 장 점막을 통과하여 더 높은 함량으로 침투하는 것을 관찰할 수 있다. MALDI-MS (매트릭스 지원 레이저 탈착/이온화 질량분석법)을 분해 산물을 분석하기 위해 사용하였다. 산성화된 샘플 용액 및 기준 샘플의 알리쿼트(1㎕)를 PAC384 MALDI 플레이트에 침착시켰고, 30초 후 여과지로 블롯팅하고 0.1% TFA 중의 15 mM 인산암모늄의 5 ㎕로 2회 세척하였다. 샘플을 Autoflex TofTof(Bruker Daltonics, USA)를 사용하여 분석하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. PG는 위장관에서 인슐린의 분해를 감소시키는 것처럼 보인다.

실시예 5

경구 투여 후 래트에서 인슐린 아스파르트 프로필렌 글리콜 조제물의 생체내 평가

스프레그-돌리 래트를 사용하였다. 실험 전 래트를 절식시켰지만 마실 물에 대한 접근은 자유로웠다. 래트를 4개의 코호트(cohort)로 나누었다. 2개의 코호트에서 래트는 물 또는 1,2 프로판디올(프로필렌 글리콜) 중 하나에 용해한 1.2 ㎖/kg의 A14GluB25HisdesB30 인간 인슐린(8 mM)으로 위관 영양을 하였다. 2개의 다른 코호트는 대조군으로서 각각 1.2 ㎖/kg 순수한 물 또는 1,2 프로판디올(프로필렌 글리콜)을 받았다. 240분의 시간 기간에 걸쳐 20분의 간격으로, 혈액 방울을 꼬리 정맥으로부터 수집하였고 글루코오스 수준을 분석하였다. 결과물을 Δ 혈중 글루코오스(mmol/l)로서 표현하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.

실시예 6

프로필렌 글리콜(PG)에서 인슐린 아스파르트의 원편광 이색성 분광 분석

원자외선(Far-UV) 및 근자외선(near-UV) 원편광 이색성 측정을 구조적 안정성을 모니터링 하기 위해 사용하였다. 원자외선 및 근자외선 원편광 이색성 스펙트럼을 Jasco J-715 원편광 이색성 분광 광도계에서 얻었다(Jasco, 도쿄, 일본). 인슐린 샘플을 2.0 nm의 대역폭, 2초의 반응 시간, 0.5 nm의 데이터 피치 및 20 nm/분의 스캐닝 속도를 사용하여 0.5 또는 0.02 cm 셀에서 스캔하였다. 완충제의 스펙트럼을 기록하였고 각 샘플 스펙트럼으로부터 차감하였다.

원자외선 스펙트럼은 펩티드 아미드 발색단을 조사하고 이는 단백질 2차 구조를 추정하기 위해 사용될 수 있는데, 따라서 209 nm 및 222 nm에서 음의 대역은 α-나선 구조를 나타낸다. 100% 물에서와 비교하여 100% PG에서의 아스파르트의 스펙트럼(도 6)에서 강도에서 약간의 변화가 관찰되며, 이는 100% PG 중의 인슐린에서 더 많은 α-나선 구조를 제안한다. 그러나, 이런 차이점은 PG 중의 아스파르트 의 다른 제제와 비교할 때 상당한 것 같지 않았다. 물에서 아스파르트의 스펙트럼과 100% PG의 샘플로부터 2% PG로 희석한 아스파르트의 스펙트럼은 매우 유사하여 α-나선 함유량에서 가능한 미소한 변화가 가역적임을 나타낸다.

250-350 nm 영역에서 CD 스펙트럼은 이황화 다리 국소 환경에 더하여 티로신 측쇄 잔기의 국소 환경을 반영한다. 100% PG에서의 인슐린 아스파르트의 원자외선 스펙트럼(도 7)은 250 nm 및 270 nm에서 증가된 진폭을 가지는 변성 용매, 예를 들어 GuHCl에서의 인슐린에 대해 관찰되는 것과 매우 유사하다.

그러나, 100% PG 중의 인슐린을 2% PG로 물에 희석할 때, 스펙트럼은 순수한 물 중의 인슐린에 대해 관찰된 스펙트럼의 모양을 보유한다. 이것은 측쇄 환경에 대한 PG의 효과에도 불구하고 이들의 구조적 효과가 가역적임을 보여준다.

FUV와 NUC CD 데이터를 둘 다 고려할 때, 데이터는 펩티드 백본의 2차 구조가 100% PG에서 다소 변하지 않음을 나타낸다. 동일한 샘플의 측쇄 환경에서 현저한 변화는 백본 접힘은 원래대로이지만 측쇄 구조가 붕괴된 경우 인슐린이 소위 몰튼 글로불(molten globule) 구조를 취한다는 것을 제안한다. 그러나 구조적 변화는 PG 중의 아스파르트를 물에 희석할 때 가역적이다.

실시예 7

프로필렌 글리콜 용액 대 수용액에서 인슐린 아스파르트의 저장 안정성.

인슐린 아스파르트(IA)의 7.5의 목표 pH를 갖는 탈수 분말을 순수한 프로필렌 글리콜 또는 수성 0.1 M TRIS 완충제, pH 7.5 중 하나에 용해하였다. 용액 중의 인슐린의 농도는 대략 35 ㎎/㎖이었다. 용액을 40주까지 동안 주변 온도 및 40℃에 서 배양하였다. 용해성의 공유성 다이머 및 폴리머 생성물의 함유량을 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하였다. 샘플을 15 부피의 빙초산, 15 부피의 아세토니트릴 및 70 부피의 L-아르기닌의 0.65 g/l 용액을 포함하는 용리액으로 1 ㎖/분의 유속에서 Waters 인슐린 HMWP 컬럼 7.8×300 mm(Waters Corporation, Milford, MA, USA)를 사용하여 실온에서 SEC를 하였다. 검출을 276 nm에서 수행하였다. 탈아미드화 생성물 및 다른 인슐린 관련 물질의 함유량을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 분석하였다. 샘플 내 미소섬유의 양을 정적 ThT 분석에 의해 측정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Stable non-aqueous pharmaceutical compositions <130> 7634.000-EP <160> 2 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 His Ala Glu His Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims

a) 10-100개의 아미노산을 포함하는 탈수된 치료적으로 활성인 폴리펩티드, 및

b) 적어도 하나의 반-극성 양성자성 유기 용매의 혼합물을 포함하며,

폴리펩티드는 수용액에서 폴리펩티드의 pI와 적어도 1 pH 단위가 차이나는 목표 pH에서 탈수된, 약학 비-수성 조성물.
제 1 항에 있어서, 유기 용매는 프로필렌 글리콜 및 글리세롤로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매에서 탈수된 폴리펩티드의 용해도는 적어도 20 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 목표 pH는 약 6.0 내지 약 9.0의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 적어도 20% w/w의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 10% w/w 미만의 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 폐 치료, 경구 치료, 비강 치료 또는 구강 치료에 적합한 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 인슐린 펩티드, 아밀린, 아밀린 유사체, 아밀린 유도체, α-MSH, α-MSH 유사체, α-MSH 유도체 및/또는 그것의 어떤 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 펩티드는 인슐린 유사체인 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능 장애 및 1형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 약제로서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 약학 비-수성 조성물.