BR112021011156A2 - Conjugados de insulina - Google Patents

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Ulrich Werner
Nils Rackelmann
Laurent Bialy
Stefan GUESSREGEN
Martin Will
Thomas Boehme
Ana Villar Garea
Marcus Hermann Korn
Melissa BESENIUS
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Abstract

conjugados de insulina. a presente invenção refere-se a um conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (i) e um ingrediente farmacêutico ativo tal como um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição b16 que é substituída com um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição b25 que é substituída com um aminoácido hidrofóbico. a presente invenção refere-se ainda a uma sulfonamida de fórmula (a). além disso, a presente invenção refere-se a um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CONJUGADOS DE INSULINA”.
[001] A presente invenção refere-se a conjugados compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo tal como um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. São providos aqui ainda sulfonamidas de fórmula (A) e análogos de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que os análogos de insulina compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituído por um aminoácido hidrofóbico.
ANTECEDENTES
[002] Em todo o mundo, mais de 400 milhões de pessoas sofrem de diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2. O diabetes tipo 1 é tratado com substituição de insulina. Em contraste com o diabetes tipo 1, basicamente não há deficiência de insulina em diabetes tipo 2, mas em um grande número de casos, especialmente no estágio avançado, pacientes com diabetes tipo 2 são tratados com insulina.
[003] Em uma pessoa saudável, a liberação de insulina pelo pâncreas está estritamente associada à concentração de glicose no sangue. Níveis elevados de glicose no sangue, tal como ocorre após refeições, são rapidamente compensados por um aumento correspondente em secreção de insulina. No estado de jejum, o nível de insulina no plasma cai para um valor basal que é adequado para garantir um suprimento contínuo de glicose aos órgãos e tecidos sensíveis à insulina e manter a produção de glicose hepática baixa de um dia para o outro. Frequentemente, a substituição da secreção endógena de insulina através de administração exógena, principalmente subcutânea, de insulina, não atinge a qualidade da regulação fisiológica da glicose no sangue descrita acima. Desvios da glicose no sangue para cima ou para baixo podem ocorrer, que em suas formas mais graves podem ser um risco de vida. Deve-se deduzir disso que uma terapia melhorada para diabetes tem como objetivo principal manter a glicose no sangue o mais próximo possível da faixa fisiológica.
[004] A insulina humana é um polipeptídeo de 51 aminoácidos, que são divididos em 2 cadeias de aminoácidos: a cadeia A possuindo 21 aminoácidos e a cadeia B possuindo 30 aminoácidos. As cadeias são conectadas umas às outras por meio de 2 pontes dissulfeto. Uma terceira ponte dissulfeto existe entre as cisteínas nas posições 6 e 11 da cadeia A. Alguns produtos em uso corrente para o tratamento de diabetes mellitus contêm análogos da insulina, isto é, variantes da insulina cuja sequência difere daquela da insulina humana por uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia A e/ou na cadeia B.
[005] Como muitos outros hormônios peptídicos, a insulina humana tem meia-vida curta in vivo. Deste modo, ela é administrada com frequência, o que está associado a desconforto para o paciente. Portanto, são desejados análogos de insulina que tenham uma meia- vida in vivo aumentada e, portanto, uma duração de ação prolongada.
[006] Atualmente existem diferentes abordagens para estender a meia-vida de insulinas.
[007] Uma abordagem é baseada no desenvolvimento de uma formulação solúvel em pH baixo, mas de solubilidade reduzida em relação à insulina nativa em pH fisiológico. O ponto isoelétrico do análogo da insulina é aumentado através da adição de duas argininas ao terminal C da cadeia B. A adição de duas argininas em combinação com uma substituição de glicina em A21 (insulina glargina) provê uma insulina com duração de ação prolongada. O análogo da insulina precipita na presença de zinco quando da injeção em sítios subcutâneos e solubiliza lentamente, resultando em uma presença sustentada de insulina glargina.
[008] O WO 2016/006963 divulga análogos de insulina possuindo uma taxa de eliminação reduzida mediada por receptor de insulina, comparado com insulina humana.
[009] O WO 2018/056764 divulga análogos de insulina possuindo uma taxa de eliminação reduzida mediada por receptor de insulina, comparado com insulina humana.
[010] O WO 2008/034881 divulga análogos de insulina estabilizados por protease.
[011] Em uma outra abordagem, um grupo de ácido graxo de cadeia longa é conjugado ao grupo amino epsilon de LysB29 de insulina. A presença desse grupo permite a ligação da insulina à albumina do soro através de ligação reversível, não covalente. Como consequência, este análogo de insulina tem um perfil de ação no tempo significativamente prolongado em relação à insulina humana (vide, por exemplo, Mayer e outros, Inc. Biopolymers (Pept Sci) 88: 687-713, 2007; ou WO 2009/115469).
SUMÁRIO
[012] São providos aqui análogos de insulina de ação prolongada. Os análogos de insulina de ação prolongada providos têm uma afinidade de ligação muito baixa (portanto, uma taxa de eliminação mais baixa) enquanto ainda mantendo transdução de sinal alta. Os análogos da insulina são descritos na seção A abaixo.
[013] São providas aqui porções de ligação de albumina do soro (aqui também referidas como "ligantes de albumina" ou "ligantes") que, quando acopladas a um peptídeo, tal como um análogo de insulina provido acima, levam a propriedades farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas melhoradas do peptídeo, por exemplo, uma meia- vida farmacocinética prolongada no sangue e/ou plasma sanguíneo e/ou um perfil de ação prolongado, isto é, uma redução prolongada do nível de glicose no sangue. Os ligantes de albumina providos são sulfonamidas de fórmula (A)
O 2 R H H x
N N OR 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (A)
[014] As porções de ligação de albumina do soro são descritas na seção B abaixo.
[015] Também são providos aqui conjugados compreendendo um ingrediente farmacêutico ativo, tal como um análogo de insulina definido na seção A, e um ligante de insulina, tal como uma sulfonamida de fórmula (A) definida na seção B. Os conjugados são descritos na seção C abaixo.
DESCRIÇÃO DETALHADA Seção A: análogos de insulina
[016] A fim de aumentar a duração de ação de um medicamento, a meia-vida desempenha um papel importante. A meia-vida (t1/2) é proporcional ao volume de distribuição dividido pela eliminação. No caso de insulina humana, a eliminação é principalmente impulsionada pela ligação a receptor de insulina, internalização e subsequente degradação.
[017] Consequentemente, existe uma necessidade de análogos de insulina que tenham uma atividade de ligação a receptor de insulina reduzida e, portanto, uma taxa de eliminação mediada por receptor reduzida, mas que tenham uma atividade de transdução de sinal que permita diminuir suficientemente o nível de glicose no sangue in vivo.
[018] Surpreendentemente, foi mostrado no contexto dos estudos subjacentes à presente invenção que uma substituição na posição B16 e/ou B25 de insulina humana por um aminoácido hidrofóbico (tais como leucina, isoleucina, valina, alanina e triptofano) resultou em uma diminuição de atividade de ligação a receptor de insulina (comparado com a atividade de ligação a receptor de insulina da insulina de origem, vide Exemplos). Os efeitos mais fortes sobre atividade de ligação a receptor de insulina foram observados para substituições com aminoácidos de cadeia ramificada (leucina, isoleucina e valina). Curiosamente, análogos de insulina com tais substituições nestas posições (tal como na posição B25) mostraram um aumento de até 6 vezes em transdução de sinal do que o esperado com base em suas afinidades de ligação da isoforma B do receptor de insulina (IR-B) (vide Exemplos). Ainda, alguns análogos de insulina testados mostraram estabilidade proteolítica melhorada contra α-quimiotripsina, catepsina D e enzima degradante de insulina (vide Exemplos).
[019] Desta forma, são providos aqui análogos de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que os análogos de insulina compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
[020] A expressão "análogo de insulina" tal como aqui usado se refere a um peptídeo que tem uma estrutura molecular que formalmente pode ser derivada da estrutura de uma insulina de ocorrência natural (aqui também dita como "insulina de origem", por exemplo, insulina humana) através de deleção e/ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido que ocorre na insulina de ocorrência natural e/ou adicionando pelo menos um resíduo de aminoácido. O resíduo de aminoácido adicionado e/ou trocado pode ser ou resíduos de aminoácido codificáveis ou outros resíduos de ocorrência natural ou resíduos de aminoácido puramente sintéticos. O análogo conforme dito aqui é capaz de reduzir os níveis de glicose no sangue in vivo, tal como em um sujeito humano.
[021] Em algumas modalidades, o análogo de insulina provido aqui compreende duas cadeias peptídicas, uma cadeia A e uma cadeia B. Tipicamente, as duas cadeias são conectadas por pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína. Por exemplo, em algumas modalidades, os análogos de insulina providos aqui compreendem três pontes dissulfeto: uma ponte dissulfeto entre as cisteínas nas posições A6 e A11, uma ponte dissulfeto entre a cisteína na posição A7 da cadeia A e a cisteína na posição B7 da cadeia B, e uma entre a cisteína na posição A20 da cadeia A e a cisteína na posição B19 da cadeia B. Deste modo, os análogos de insulina providos aqui podem compreender resíduos de cisteína nas posições A6, A7, A11, A20, B7 e B19.
[022] Em algumas modalidades providas aqui, o análogo de insulina é uma insulina de cadeia única. Uma insulina de cadeia única é uma cadeia polipeptídica única em que a cadeia B da insulina está ligada contiguamente com a cadeia A da insulina por meio de um peptídeo de conexão não clivado.
[023] Mutações de insulina, isto é, mutações de uma insulina de origem, são indicadas aqui através de referência à cadeia, isto é, ou à cadeia A ou à cadeia B do análogo, à posição do resíduo de aminoácido mutado na cadeia A ou B (tais como A14, B16 e B25) e ao código de três letras para o aminoácido substituindo o aminoácido nativo na insulina de origem. O termo "desB30" se refere a um análogo sem o aminoácido B30 da insulina de origem (isto é, o aminoácido na posição B30 está ausente). Por exemplo, a insulina humana Glu(A14)Ile(B16)desB30 é um análogo da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição 14 da cadeia A (A14) da insulina humana é substituído por ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na posição 16 da cadeia B (B16) é substituído por isoleucina e o aminoácido na posição 30 da cadeia B é deletado (isto é, está ausente).
[024] Os análogos de insulina providos aqui compreendem pelo menos uma mutação (substituição, deleção ou adição de um aminoácido) em relação à insulina de origem. O termo "pelo menos um", conforme usado aqui, significa um ou mais de um, tal como "pelo menos dois", "pelo menos três", "pelo menos quatro", "pelo menos cinco", etc. Em algumas modalidades, os análogos de insulina providos aqui compreendem pelo menos uma mutação na cadeia B e pelo menos uma mutação na cadeia A. Em uma modalidade adicional, os análogos de insulina providos aqui compreendem pelo menos duas mutações na cadeia B e pelo menos uma mutação na cadeia A. Por exemplo, o análogo de insulina pode compreender uma substituição na posição B16, uma deleção na posição B30 e uma substituição na posição A14. Alternativamente, o análogo de insulina pode compreender uma substituição na posição B25, uma deleção na posição B30 e uma substituição na posição A14. Ainda, o análogo de insulina pode compreender uma substituição na posição B16, uma substituição na posição B25, uma deleção na posição B30 e uma substituição na posição A14.
[025] Os análogos de insulina providos aqui podem compreender mutações em adição às mutações acima. Em algumas modalidades, o número de mutações não excede um certo número. Em algumas modalidades, os análogos de insulina compreendem menos de doze mutações (isto é, deleções, substituições, adições) em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de dez mutações em relação à insulina de origem. Em outra modalidade, o análogo compreende menos de oito mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de sete mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de seis mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de cinco mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de quatro mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de três mutações em relação à insulina de origem.
[026] A expressão "insulina de origem" tal como aqui usado se refere à insulina de ocorrência natural, isto é, a uma insulina do tipo selvagem, não mutada. Em algumas modalidades, a insulina de origem é insulina animal, tal como insulina de mamífero. Por exemplo, a insulina de origem pode ser insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
[027] Em algumas modalidades, a insulina de origem é insulina humana. A sequência de insulina humana é bem conhecida na técnica e mostrada na Tabela 4 na seção de Exemplos. A insulina humana compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 1 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 2 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT).
[028] Em uma outra modalidade, a insulina de origem é insulina bovina. A sequência de insulina bovina é bem conhecida na técnica. A insulina bovina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 81 (GIVEQCCASVCSLYQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 82
(FVNQHLCGSHLVEALYLVC-GERGFFYTPKA).
[029] Em uma outra modalidade, a insulina de origem é insulina suína. A sequência de insulina suína é bem conhecida na técnica. A insulina suína compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 83 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 84 (FVNQHLCGSHLVEALYLVC GERGFFYTPKA).
[030] As insulinas humana, bovina e suína compreendem três pontes dissulfeto: uma ponte dissulfeto entre as cisteínas nas posições A6 e A11, uma ponte dissulfeto entre a cisteína na posição A7 da cadeia A e a cisteína na posição B7 da cadeia B e uma entre a cisteína na posição A20 da cadeia A e a cisteína na posição B19 da cadeia B.
[031] Os análogos de insulina providos aqui têm uma afinidade de ligação com receptor de insulina que é reduzida comparado com a afinidade de ligação com receptor de insulina da insulina de origem correspondente, por exemplo, de insulina humana.
[032] O receptor de insulina pode ser qualquer receptor de insulina de mamífero, tal como um receptor de insulina bovina, suína ou humana. Em algumas modalidades, o receptor de insulina é um receptor de insulina humana, por exemplo, isoforma A do receptor de insulina humana ou isoforma B do receptor de insulina humana (que foi usada na seção de Exemplos).
[033] Vantajosamente, os análogos de insulina humana providos aqui têm uma afinidade de ligação significativamente reduzida com o receptor de insulina humana comparado com a afinidade de ligação de insulina humana com o receptor de insulina humana (vide Exemplos). Portanto, os análogos de insulina têm uma taxa de eliminação muito baixa, isto é, uma taxa de eliminação mediada por receptor de insulina muito baixa.
[034] Em algumas modalidades, os análogos de insulina têm, isto é, exibem, menos de 20% da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem. Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos aqui têm menos de 10% da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem. Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos aqui têm menos de 5% da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com a insulina de origem, tal como menos de 3% da afinidade de ligação comparado com a insulina de origem. Por exemplo, os análogos de insulina providos aqui podem ter entre 0,1% a 10%, tal como entre 0,3% a 5%, da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem. Além disso, os análogos de insulina providos aqui podem ter entre 0,5% a 3%, tal como entre 0,5% a 2%, da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem.
[035] Métodos para determinar a afinidade de ligação de um análogo de insulina com um receptor de insulina são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade de ligação com receptor de insulina pode ser determinada através de um ensaio de proximidade de cintilação que se baseia na avaliação de ligação competitiva entre insulina de origem marcada com [125I], tal como insulina humana marcada com [125I], e o análogo de insulina (não marcado) ao receptor de insulina. O receptor de insulina pode estar presente na membrana de uma célula, por exemplo, de célula CHO (Ovário de Hamster Chinês), que superexpressa um receptor de insulina recombinante. Em uma modalidade, a afinidade de ligação com receptor de insulina é determinada como descrito na seção de Exemplos.
[036] Ligação de uma insulina de ocorrência natural ou de um análogo da insulina ao receptor de insulina ativa a via de sinalização da insulina. O receptor de insulina tem atividade tirosina cinase. Ligação da insulina ao seu receptor induz uma mudança conformacional que estimula a autofosforilação do receptor em resíduos de tirosina. A autofosforilação do receptor de insulina estimula a atividade da tirosina cinase do receptor em relação aos substratos intracelulares envolvidos na transdução do sinal. A autofosforilação do receptor de insulina por um análogo de insulina é, portanto, considerada uma medida para transdução de sinal causada pelo dito análogo.
[037] Os análogos da insulina na Tabela 4 da seção de Exemplos foram submetidos a ensaios de autofosforilação. Curiosamente, análogos dea insulina com substituições alifáticas nas posições B16 e B25 causaram autofosforilação do receptor de insulina maior do que o esperado com base em suas afinidades de ligação com receptor de insulina. Desse modo, os análogos de insulina providos aqui têm uma baixa atividade de ligação e, consequentemente, uma taxa de eliminação mediada por receptor menor, mas são, no entanto, capazes de causar uma transdução de sinal relativamente alta. Portanto, os análogos de insulina providos aqui poderiam ser usados como insulinas de ação prolongada. Em algumas modalidades, o análogo de insulina provido aqui é capaz de induzir 1 a 10%, tal como 2 a 8%, de autofosforilação de receptor de insulina em relação à insulina de origem (tal como insulina humana). Além disso, em algumas modalidades, os análogos de insulina providos aqui são capazes de induzir 3 a 7%, como 5 a 7%, da autofosforilação do receptor de insulina em relação à insulina de origem (tal como insulina humana). A autofosforilação do receptor de insulina em relação a uma insulina de origem pode ser determinada como descrito na seção de Exemplos.
[038] Os análogos de insulina providos aqui foram submetidos a ensaios de estabilidade de protease. Como mostrado na Tabela 6, análogos de insulina providos aqui tinham estabilidade maior em relação a pelo menos algumas das proteases testadas comparado com insulina humana. Estabilidade proteolítica melhorada foi observada contra α-quimiotripsina, catepsina D e enzima degradante de insulina (IDE). Desta maneira, análogos de insulina providos aqui são, tipicamente, análogos de insulina proteoliticamente estáveis. Então, eles são degradados mais lentamente pelas proteases em relação à insulina de origem. Em algumas modalidades, o análogo de insulina provido aqui é estabilizado contra degradação por α- quimiotripsina, catepsina D e enzima degradante de insulina (IDE) comparado com insulina de origem.
[039] Como mostrado acima, o análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação comparado com a insulina de origem.
[040] Em algumas modalidades, os análogos de insulina providos aqui compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. Assim, o aminoácido na posição B16 (tirosina em insulinas humana, bovina e suína) é substituído por um aminoácido hidrofóbico.
[041] Em outra modalidade, análogos de insulina providos aqui compreendem uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. Então, o aminoácido na posição B25 (fenilalanina em insulinas humana, bovina e suína) é substituído por um aminoácido hidrofóbico.
[042] Em outra modalidade, análogos de insulina providos aqui compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
[043] O aminoácido hidrofóbico pode ser qualquer aminoácido hidrofóbico. Por exemplo, o aminoácido hidrofóbico pode ser um aminoácido alifático tal como um aminoácido de cadeia ramificada.
[044] Em algumas modalidades dos análogos de insulina providos aqui, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 é isoleucina, valina, leucina, alanina, triptofano, metionina, prolina, glicina, fenilalanina ou tirosina (ou com um derivado dos aminoácidos mencionados acima).
[045] Várias insulinas de origem tais como insulina humana, bovina e suína compreendem tirosina na posição B16 e fenilalanina na posição B25. Assim, o aminoácido na posição B16 da insulina de origem pode ser substituído por isoleucina, valina, leucina, alanina, triptofano, metionina, prolina, glicina ou fenilalanina (ou por um derivado dos aminoácidos mencionados acima). Ainda, o aminoácido na posição B25 da insulina de origem pode ser substituído por isoleucina, valina, leucina, alanina, triptofano, metionina, prolina, glicina ou tirosina (ou com um derivado dos aminoácidos mencionados acima).
[046] Derivados dos aminoácidos mencionados acima são conhecidos na técnica.
[047] Derivados de leucina incluem, mas não estão limitados a, homoleucina e terc-leucina. Portanto, o aminoácido na posição B16 e/ou B25 pode ser substituído por homoleucina ou terc-leucina.
[048] Um derivado de valina é, por exemplo, 3-etil norvalina. Assim, o aminoácido na posição B16 e/ou B25 pode ser substituído por 3-etil norvalina.
[049] Derivados de glicina incluem, mas não estão limitados, a cicloexil-glicina, ciclopropilglicina e trifluoretilglicina.
[050] Derivados de alanina incluem, mas não estão limitados a, beta-t-butilalanina, ciclobutil-alanina, ciclopropil-alanina e homo- cicloexilalanina.
[051] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 é isoleucina, valina, leucina, alanina ou triptofano.
[052] Em algumas modalidades, o aminoácido alifático não é alanina. Portanto, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 pode ser isoleucina, valina, leucina ou triptofano.
[053] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 é isoleucina, valina ou leucina.
[054] Em algumas modalidades, os aminoácidos referidos aqui são L-aminoácidos (tal como L-isoleucina, L-valina ou L-leucina). Desta maneira, os aminoácidos (ou derivados dos mesmos) utilizados para, por exemplo, substituição na posição B16, B25 e/ou A14 são tipicamente L-aminoácidos.
[055] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofóbico é um aminoácido alifático. Portanto, os análogos de insulina providos aqui compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido alifático e uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido alifático (e opcionalmente outras mutações incluindo, mas não limitado a, Des(B30) e Glu(A14)).
[056] Aminoácidos alifáticos são aminoácidos não polares e hidrofóbicos compreendendo um grupo funcional de cadeia lateral alifática. A hidrofobicidade aumenta conforme o número de átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto aumenta. Uma medida para a hidrofobicidade de um alifático é o índice de hidropatia de acordo com a escala de Kyte e Doolittle que, por exemplo, pode ser determinado como divulgado por Kyte J. e outros, Journal of Molecular Biology. 1982 157 (1): 105–32. Em algumas modalidades, o aminoácido alifático é um aminoácido alifático com um índice de hidropatia (de acordo com a escala de Kyte e Doolittle) maior que 2,0, tal como maior que 3,0 ou maior que 3,5.
[057] Aminoácidos alifáticos incluem, mas não estão limitados a, isoleucina, valina, leucina, alanina e glicina. Por exemplo, o aminoácido alifático pode ser um aminoácido selecionado de isoleucina, valina, leucina e glicina, tal como um aminoácido selecionado de isoleucina, valina e leucina.
[058] Isoleucina, valina e leucina são aminoácidos de cadeia ramificada (abreviado BCAA). Então, o aminoácido alifático pode ser um aminoácido de cadeia ramificada. Em algumas modalidades, os análogos de insulina providos aqui compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido de cadeia ramificada e uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido de cadeia ramificada (e opcionalmente mutações incluindo ainda, mas não limitado a, Des (B30) e Glu (A14)).
[059] BCAAs são aminoácidos tais como aminoácidos isoleucina, valina e leucina possuindo cadeias laterais alifáticas que são não lineares, isto é, aminoácidos de cadeia ramificada são aminoácidos possuindo uma cadeia lateral alifática com uma ramificação (um átomo de carbono central ligado a três ou mais átomos de carbono).
[060] O aminoácido de cadeia ramificada pode ser um BCAA proteinogênico, isto é, um aminoácido que é incorporado biossinteticamente em proteínas durante tradução, ou um BCAA não proteinogênico, isto é, um aminoácido que não é codificado naturalmente ou encontrado no código genético de qualquer organismo. Por exemplo, BCAAs proteinogênicos são leucina, isoleucina e valina. Assim, o aminoácido de cadeia ramificada de aminoácido hidrofóbico/alifático pode ser leucina, isoleucina ou valina (ou um derivado da leucina, isoleucina ou valina, tal como um derivado de leucina ou valina como mostrado acima).
[061] Em algumas modalidades, o aminoácido de cadeia ramificada é isoleucina. Em algumas modalidades, o aminoácido de cadeia ramificada é valina. Em algumas modalidades, o aminoácido de cadeia ramificada é leucina.
[062] Em adição à mutação na posição B16 e/ou à mutação na posição B25 como descrito acima, análogos de insulina providos aqui podem compreender mutações adicionais em relação à insulina de origem.
[063] Por exemplo, o análogo de insulina pode compreender ainda uma mutação na posição A14. Tais mutações são conhecidas aumentar a estabilidade da protease (vide, por exemplo, WO 2008/034881). Em algumas modalidades, o aminoácido na posição A14 é substituído por ácido glutâmico (Glu). Em algumas modalidades, o aminoácido na posição A14 é substituído por ácido aspártico (Asp). Em algumas modalidades, o aminoácido na posição A14 é substituído por histidina (His).
[064] Ainda, os análogos de insulina providos aqui podem compreender uma mutação na posição B30. Em algumas modalidades, a mutação na posição B30 é a deleção de treonina na posição B30 da insulina de origem (também dita como mutação Des(B30)).
[065] Ainda, o análogo de insulina da presente invenção pode compreender ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu) e/ou uma mutação na posição A21 que é substituída por glicina (Gly).
[066] Em uma modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK).
[067] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 24 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[068] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK).
[069] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[070] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 50 (FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[071] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 58 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[072] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 60 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[073] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 64 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[074] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 66
(FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[075] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 70 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK).
[076] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[077] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 80 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[078] As cadeias B resumidas acima compreendem a mutação Des(B30). Desta maneira, o aminoácido que está presente na posição B30 da insulina de origem (treonina em insulina humana e alanina em insulina suína e bovina) é eliminado, isto é, não está presente. No entanto, também se prevê que as cadeias B dos análogos da presente invenção não compreendam esta mutação, isto é, compreendem uma treonina na posição 30. Portanto, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:
[079] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID NO: 85)
[080] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 86)
[081] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 87)
[082] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 88)
[083] FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID
NO: 89)
[084] FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 90)
[085] FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 91)
[086] FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 92)
[087] FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 93)
[088] FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 94)
[089] FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 95)
[090] FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 96)
[091] FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 97)
[092] Em uma modalidade, a cadeia A do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN).
[093] Em uma outra modalidade, a cadeia A do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN).
[094] Em uma outra modalidade, a cadeia A do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 45 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG).
[095] Tipicamente, o análogo de insulina da presente invenção compreende uma cadeia A e uma cadeia B como mostrado acima.
[096] Por exemplo, o análogo de insulina da presente invenção é selecionado do grupo consistindo em:
[097] Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana, isto é, Leu(B16)-insulina humana),
[098] Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana, isto é, Val(B16)-insulina humana),
[099] Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0100] Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0101] Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0102] Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0103] Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0104] Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0105] Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0106] Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0107] Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0108] Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0109] Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0110] Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0111] Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0112] Glu(A14)Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0113] Glu(A14)Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0114] Glu(A14)Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0115] Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0116] Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0117] Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0118] Glu(A14)Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0119] Glu(A14)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0120] Glu(A14)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0121] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0122] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0123] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0124] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0125] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[0126] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0127] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0128] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0129] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[0130] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0131] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0132] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0133] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0134] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0135] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0136] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0137] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana) e
[0138] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana).
[0139] Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos aqui são selecionados do grupo consistindo em:
[0140] Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana, isto é, Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana),
[0141] Asp(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0142] Asp(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0143] Asp(A14)Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0144] Asp(A14)Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0145] Asp(A14)Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0146] Asp(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0147] Asp(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0148] Asp(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0149] Asp(A14)Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0150] Asp(A14)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0151] Asp(A14)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0152] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0153] Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0154] Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0155] Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0156] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[0157] Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0158] Asp(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0159] Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0160] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[0161] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0162] Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0163] Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0164] Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0165] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0166] Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0167] Asp(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0168] Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana) e
[0169] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana).
[0170] Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos aqui são selecionados do grupo consistindo em:
[0171] His(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0172] His(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0173] His(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0174] His(A14)Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0175] His(A14)Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0176] His(A14)Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0177] His(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0178] His(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0179] His(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0180] His(A14)Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0181] His(A14)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0182] His(A14)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0183] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0184] His(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0185] His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0186] His(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0187] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0188] His(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0189] His(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0190] His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0191] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[0192] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0193] His(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0194] His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0195] His(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0196] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0197] His(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0198] His(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0199] His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana) e
[0200] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana).
[0201] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Leu(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Leu(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 11). Por exemplo, Leu(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 21 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 22 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK).
[0202] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 12). Por exemplo, Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 23 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 24 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[0203] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 22). Por exemplo, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK).
[0204] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos
(vide Análogo 24). Por exemplo, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[0205] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3) Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 25). Por exemplo, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3) Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 49 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 50 (FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[0206] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 29). Por exemplo, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 57 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 58 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[0207] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16) Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 30). Por exemplo, Glu(A14)Glu(B3) Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 56 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 60 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[0208] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 32). Por exemplo, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 63 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 64 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[0209] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3) Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25) Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 33). Por exemplo, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 65 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 66 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[0210] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 35). Por exemplo, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 69 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 70 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK).
[0211] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Val(B16)Val(B25) Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 38). Por exemplo, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 75 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 76 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[0212] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Glu(B3)Val(B16) Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 39). Por exemplo, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16) Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[0213] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Gly(A21) Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 40). Por exemplo, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 79 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 80 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[0214] O análogo de insulina pode ser preparado através de qualquer método considerado apropriado. Por exemplo, o análogo de insulina pode ser preparado através de métodos recombinantes ou através de síntese em fase sólida.
[0215] As definições e explicações dadas acima se aplicam mutatis mutandis ao que segue.
[0216] São providas aqui cadeias B de insulina, isto é, peptídeos de cadeia B de insulina, como definido acima em conexão com a cadeia B do análogo de insulina provido aqui. Desta maneira, são providas aqui cadeias B de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de insulina da insulina de origem, em que as cadeias B compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. A cadeia B de insulina pode compreender mutações adicionais como aqui descrito acima tal como a deleção des(B30).
[0217] Também são providas aqui pró-insulinas compreendendo uma cadeia A de insulina e/ou uma cadeia B de insulina dos análogos de insulina providos aqui. A cadeia B pode ser qualquer cadeia B como definido aqui para os análogos de insulina providos aqui. Por exemplo, são providas aqui pró-insulinas compreendendo uma cadeia A de insulina e uma cadeia B de insulina, em que a dita cadeia B compreende pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de uma insulina de origem, em que a mutação está na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou em que a mutação está na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. A cadeia B da insulina pode compreender outras mutações como descrito acima para a cadeia B.
[0218] A cadeia A compreendida pela pró-insulina provida aqui pode ser qualquer cadeia A como definido acima para os análogos de insulina providos aqui. Em algumas modalidades, a cadeia A da dita pró-insulina compreende uma mutação na posição A14 que é substituída por um aminoácido selecionado de ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
[0219] Em adição à cadeia A da insulina e/ou à cadeia B da insulina, as pró-insulinas aqui providas podem compreender elementos adicionais tais como sequências líderes ou um peptídeo C. Em algumas modalidades, a pró-insulina pode compreender ainda um peptídeo C que está localizado entre a cadeia B da insulina e a cadeia A da insulina. O peptídeo C pode ter um comprimento de 4-10 aminoácidos, tal como um comprimento de 4 a 9 aminoácidos. A orientação pode ser a seguinte (do terminal N para o terminal C): cadeia B, peptídeo C, cadeia A.
[0220] São providos aqui polinucleotídeos que codificam os análogos de insulina, cadeias B de insulina e as pró-insulinas aqui providas. O dito polinucleotídeo pode estar operavelmente ligado a um promotor que permite a expressão do dito polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o promotor é heterólogo em relação ao dito polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em uma outra modalidade, o promotor é um promotor induzível.
[0221] Além disso, são providos aqui vetores compreendendo o polinucleotídeo codificando os análogos de insulina providos aqui. Em algumas modalidades, o dito vetor é um vetor de expressão.
[0222] São providas aqui células hospedeiras compreendendo ácidos nucleicos codificando os análogos da insulina, cadeias B da insulina e pró-insulinas, os polinucleotídeos e/ou os vetores providos aqui. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana tal como uma célula pertencente ao gênero Escherichia, por exemplo, uma célula de E. coli. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de levedura, como uma célula de Pichia pastoris ou célula de Klyveromyces lactis.
[0223] São providas aqui composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um análogo de insulina provido aqui e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0224] São providos aqui métodos para tratamento de uma doença compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais análogos de insulina providos aqui ou da composição farmacêutica dos mesmos a um sujeito.
[0225] Em algumas modalidades, a doença é diabetes mellitus tal como diabetes mellitus tipo II.
[0226] São providos aqui análogos de insulina ou a composição farmacêutica dos mesmos para uso em medicina.
[0227] São providos aqui análogos de insulina ou a composição farmacêutica dos mesmos para uso no tratamento de diabetes mellitus, tal como diabetes mellitus tipo II.
[0228] Finalmente, são providos aqui usos dos análogos de insulina providos aqui ou das composições farmacêuticas dos mesmos para a preparação de um medicamento ou fármaco para o tratamento de diabetes mellitus, tal como de diabetes mellitus tipo II.
[0229] Os análogos de insulina, cadeias B de insulina, pró-
insulinas e usos como descrito na seção A são ilustrados adicionalmente pelas modalidades e combinações de modalidades que seguem como indicado pelas respectivas dependências e referências anteriores. As definições e explicações dadas aqui se aplicam mutatis mutandis às modalidades que seguem.
[0230] Um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
[0231] O análogo de insulina da modalidade 1, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
[0232] O análogo de insulina das modalidades 1 e 2, em que o aminoácido hidrofóbico na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido alifático.
[0233] O análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o dito aminoácido alifático na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
[0234] O análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição A14 que é substituída por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
[0235] O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, por exemplo, em que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (Des(B30)-mutação).
[0236] O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu).
[0237] O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a dita insulina compreende ainda uma mutação na posição A21 que é substituída por glicina (Gly).
[0238] O análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que a cadeia B do análogo de insulina compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em
[0239] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK (SEQ ID NO: 22)
[0240] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 44)
[0241] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 48)
[0242] FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 50)
[0243] FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 58)
[0244] FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 60)
[0245] FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 64)
[0246] FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 66)
[0247] FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 70)
[0248] FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 76)
[0249] FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 78)
[0250] FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 80)
[0251] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID NO: 85)
[0252] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 86)
[0253] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 87)
[0254] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 88)
[0255] FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 89)
[0256] FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 90)
[0257] FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 91)
[0258] FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 92)
[0259] FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 93)
[0260] FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 94)
[0261] FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 95)
[0262] FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 96) e
[0263] FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 97).
[0264] 10. O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 9, compreendendo
[0265] uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK),
[0266] uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), ou
[0267] uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[0268] 11. Um análogo de insulina selecionado do grupo consistindo em
[0269] Leu(B16)-insulina humana,
[0270] Val(B16)-insulina humana,
[0271] Ile(B16)-insulina humana,
[0272] Leu(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0273] Val(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0274] Ile(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0275] Leu(B25)-insulina humana,
[0276] Val(B25)-insulina humana,
[0277] Ile(B25)-insulina humana,
[0278] Leu(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0279] Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0280] Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0281] Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0282] Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0283] Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0284] Glu(A14)Leu(B16)-insulina humana,
[0285] Glu(A14)Ile(B16)-insulina humana,
[0286] Glu(A14)Val(B16)-insulina humana,
[0287] Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0288] Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0289] Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0290] Glu(A14)Leu(B25)-insulina humana,
[0291] Glu(A14)Ile(B25)-insulina humana,
[0292] Glu(A14)Val(B25)-insulina humana,
[0293] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0294] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0295] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0296] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0297] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0298] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0299] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0300] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0301] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0302] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina humana,
[0303] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana,
[0304] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana,
[0305] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana,
[0306] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana,
[0307] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina humana,
[0308] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina humana,
[0309] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana e
[0310] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana.
[0311] 12. Uma cadeia B de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à cadeia B da insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
[0312] 13. A cadeia B de insulina de acordo com a modalidade 12, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
[0313] 14. A cadeia B de insulina, de acordo com as modalidades 12 e 13, em que o aminoácido hidrofóbico na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido alifático.
[0314] 15. A cadeia B de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 12 a 14, em que o dito aminoácido alifático em um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
[0315] 16. A cadeia B de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 12 a 15, em que a dita cadeia B de insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu).
[0316] 17. A cadeia B de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 12 a 16, em que a dita cadeia B de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, em que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (Des (B30)-mutação).
[0317] 18. Uma pró-insulina compreendendo uma cadeia A de insulina e uma cadeia B de insulina, em que a cadeia B de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de uma insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
[0318] 19. A pró-insulina da modalidade 18, em que a cadeia A da insulina da dita pró-insulina compreende uma mutação na posição A14 que é substituída por um aminoácido selecionado de ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
[0319] 20. A pró-insulina de acordo com as modalidades 18 e 19, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
[0320] 21. A pró-insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 20, em que o aminoácido hidrofóbico na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido alifático.
[0321] 22. A pró-insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 21, em que o dito aminoácido alifático é um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
[0322] 23. A pró-insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 22, em que a dita pró-insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu).
[0323] 24. A pró-insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 23, em que a dita pró-insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, em que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (Des(B30)-mutação).
[0324] 25. Um polinucleotídeo codificando o análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 11, a cadeia B de insulina de qualquer uma das modalidades 12 a 17 e/ou a pró-insulina de qualquer uma das modalidades 18 a 24.
[0325] 26. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 25.
[0326] 27. Uma célula hospedeira compreendendo um análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 11, a cadeia B de insulina de qualquer uma das modalidades 12 a 17, a pró-insulina de qualquer uma das modalidades 18 a 24, o polinucleotídeo da modalidade 25 e/ou o vetor de expressão da modalidade 26.
[0327] 28. Método para tratamento de um paciente possuindo diabetes mellitus compreendendo administrar ao paciente um ou mais análogos de insulina, como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 11.
[0328] 29. O análogo de insulina como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 11 para uso no tratamento de diabetes mellitus. Seção B: porções de ligação de albumina do soro
[0329] São providas aqui porções de ligação de albumina do soro (aqui também referidas como "ligantes de albumina" ou "ligantes") que, quando acopladas a um peptídeo tal como um análogo de insulina provido acima, levam a propriedades farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas melhoradas do peptídeo, por exemplo, uma meia- vida farmacocinética prolongada no sangue e/ou plasma sanguíneo e/ou um perfil de ação prolongado, isto é, uma redução prolongada de nível de glicose no sangue. As porções de ligação de albumina de soro providas são sulfonamidas como descrito abaixo.
[0330] Surpreendentemente, foi constatado que tais conjugados de peptídeos podem ser providos usando sulfonamidas específicas, que podem ser usadas para conjugados de peptídeos. Os conjugados de peptídeo resultantes exibem meia-vida favorável no sangue e/ou plasma sanguíneo e um perfil de ação prolongado. Pode ser mostrado que os conjugados de peptídeos resultantes têm uma meia-vida (t1/2) farmacocinética aumentada e também um Tempo de Residência Médio (MRT) aumentado comparado com os peptídeos não conjugados. Além disso, os conjugados de peptídeos têm um prolongamento significativo da duração de ação in vivo em relação aos peptídeos não conjugados.
[0331] Portanto, são providas aqui sulfonamidas de fórmula (A)
O 2 R H H x
N N OR 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (A)
[0332] em que:
[0333] A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo -CH2O-;
[0334] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um halogênio átomo, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0335] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0336] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17;
[0337] n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3;
[0338] p é zero ou 1;
[0339] q é zero ou 1;
[0340] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0341] s é zero ou 1;
[0342] t é zero ou 1;
[0343] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquil halogenado;
[0344] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquil halogenado;
[0345] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de 3-óxido hexafluorfosfato de HATU [1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3- triazol[4,5-b]piridínio] ou HBTU hexafluorfosfato de [3-[bis(dimetil- amino)metiliumil]-3H-benzotriazol-1-óxido]), grupo 4-nitro benzeno e N- succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila.
[0346] Em algumas modalidades, a combinação de s sendo 1, p sendo zero, n sendo zero, A sendo um átomo de oxigênio e t sendo 1 é excluída. Em algumas modalidades, s é zero, em que os resíduos e índices restantes têm o significado conforme indicado acima para a fórmula (A).
[0347] Por exemplo, o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R1 e/ou o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R2 é/são parcialmente halogenado(s) ou per halogenado(s). Em algumas modalidades, o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R1 e/ou o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R2 é/são per halogenado(s).
[0348] Tal como usado aqui, o termo "sulfonamidas de fórmula (A)" compreende as sulfonamidas de fórmula (A), seus sais farmaceuticamente aceitáveis e todas as sulfonamidas isotopicamente marcadas farmaceuticamente aceitáveis de fórmula (A), em que um ou mais átomos são substituídos por átomos possuindo o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa que predomina na natureza. O mesmo se aplica a todos os subtipos das sulfonamidas de fórmula (A), isto é, às sulfonamidas das fórmulas (O-1) a (O-5) conforme detalhado abaixo e também às suas subestruturas, respectivamente, por exemplo, as sulfonamidas de fórmula (O-1-1). Isto é, o termo "sulfonamidas de fórmula (O- ...)", em que (O- ...) representa o número das sulfonamidas de fórmulas (O-1) a (O-5) conforme detalhado abaixo e também suas subestruturas, compreende os próprios compostos, sais farmaceuticamente aceitáveis e todos seus compostos isotopicamente marcados farmaceuticamente aceitáveis.
[0349] Os sais farmaceuticamente aceitáveis das sulfonamidas de fórmula (A) incluem sais de base. Sais de base adequados são formados a partir de bases que formam sais não tóxicos. Exemplos incluem os sais de alumínio, arginina, benzatina, cálcio, colina, dietilamina, bis (2-hidroxietil)amina (diolamina), glicina, lisina, magnésio, meglumina, 2-aminoetanol (olamina), potássio, sódio, 2- amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (tris ou trometamina) e sais de zinco. Para uma revisão sobre sais adequados vide Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use de Stahl e Wermuth (Wiley-VCH, 2002).
[0350] As sulfonamidas de fórmula (A), e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem existir em formas não solvatadas e solvatadas. O termo "solvato" é usado aqui para descrever um complexo molecular compreendendo as sulfonamidas de fórmula (A), ou um sal farmaceuticamente aceitável das mesmas, e uma ou mais moléculas de solvente farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, etanol. O termo “hidrato” é usado quando o dito solvente é água.
[0351] Exemplos de isótopos adequados para inclusão nas sulfonamidas de fórmula (A) incluem isótopos de hidrogênio, tais como 2 H e 3H, carbono, tais como 11 C, 13 Ce 14 C, cloro, tal como 36 Cl, flúor, 18 123 125 13 15 tal como F, iodo, tais como Ie I, nitrogênio, tais como Ne N, oxigênio, tais como 15O, 17O e 18O e enxofre, tal como 35S.
[0352] Certas sulfonamidas de fórmula (A) isotopicamente marcadas, por exemplo, aquelas incorporando um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição em tecido de fármaco e/ou substrato. Os isótopos radioativos trítio, isto é, 3H, e carbono-14, isto é, 14 C, são particularmente úteis para este fim em vista de sua facilidade de incorporação e meios de detecção rápidos.
[0353] A substituição por isótopos mais pesados, tal como 2 deutério, isto é, H, pode prover certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzidas.
[0354] A substituição por isótopos emissores de pósitrons, tais 11 18 15 13 como C, F, O e N, pode ser útil em estudos de Topografia de Emissão de Pósitrons (PET) para examinar ocupação de receptor de substrato.
[0355] As sulfonamidas de fórmula (A) isotopicamente marcadas podem ser geralmente preparadas através de técnicas convencionais conhecidas daqueles versados na técnica.
[0356] Os solvatos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a invenção incluem aqueles em que o solvente de cristalização pode ser isotopicamente substituído, por exemplo, D2O, d6-acetona, d6-DMSO.
[0357] A fim de identificar moléculas ligantes adequadas, que quando ligadas a um peptídeo, tal como uma insulina, são capazes de melhorar a meia-vida no plasma e prolongar o perfil de ação, foi estabelecido um sistema com base em cromatografia de afinidade com colunas de albumina do soro, isto é, colunas com albumina do soro imobilizada.
[0358] O tempo de retenção líquido dos ligantes (amostras) foi calculado de acordo com a fórmula que segue:
[0359] Tempo de retenção líquido = TempoRetoAmostra – TempoRetmarcador t0
[0360] As sulfonamidas de fórmula (A) têm uma retenção líquida na faixa de 9 a 19, por exemplo, na faixa de 9,5 a 18, e foram consequentemente consideradas ligantes úteis para conjugados de peptídeos, tais como conjugados de insulina.
[0361] De acordo com uma modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-1)
O 2
R H H N N x
O O X OR 1 N r O 2 O 2
O R S H q
E N O O O HO p O Ph H N m (A-1)
[0362] em que:
[0363] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um halogênio átomo, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo e é, por exemplo, um átomo de flúor;
[0364] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo –CH-;
[0365] p é zero ou 1;
[0366] q é zero ou 1;
[0367] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0368] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio e átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é, por exemplo, um átomo de flúor ou cloro;
[0369] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado, em que o grupo C1 a C3 alquila é, por exemplo, um grupo metila e o grupo C1 a C3 alquila halogenado é, por exemplo, per-halogenado, tal como um grupo trifluormetila;
[0370] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno e N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; com m sendo um número inteiro na faixa de 5 a 15 se p for zero ou m sendo um número inteiro na faixa de 7 a 15 se p for 1.
[0371] Em uma modalidade da sulfonamida, R1 e R2 são átomos de hidrogênio.
[0372] Em uma modalidade da sulfonamida, X representa um átomo de nitrogênio.
[0373] De acordo com outra modalidade da sulfonamida, o grupo HOOC-(CH2) m-(O)s-(E)p-(CH2)n-(A)t- de fórmula (A) ou o grupo HOOC- (CH2)m-(E)p-O- de fórmula (O-1) está situado na posição meta ou para no anel fenila Ph em relação ao grupo -S(O)2-.
[0374] De acordo com outra modalidade da sulfonamida, se p for 1, o grupo HOOC-(CH2)m-(O)s- e o grupo -(CH2)n-(A)t- estão situados na posição meta ou para em ( E)p de fórmula (A) ou o grupo HOOC- (CH2)m- e o -O- estão situados em posição meta ou para em (E)p de fórmula (O-1).
[0375] De acordo com uma outra modalidade da sulfonamida, q é zero.
[0376] De acordo com uma outra modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-1-1)
O H H x Hal N N OR O O X N r O 2 O 2 O q
H O S O O
N N HO m O Ph H (A-1-1)
[0377] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo –CH-, por exemplo, um átomo de nitrogênio; m é um número inteiro na faixa de 7 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1, por exemplo, zero; Hal é um átomo de halogênio selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo, por exemplo, um átomo de flúor; Rx é um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno e N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um N- grupo succinimidila; e o grupo HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O- está situado na posição meta ou para no anel fenila Ph em relação ao grupo -S(O)2-.
[0378] De acordo com uma modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-1-1a)
O O O O
O O N N 2 N 2 O N
O O H H F S O N N O
H HO 13 O (A-1-1a)
[0379] De acordo com uma outra modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-1-2)
O H H x
X N N OR O O N r O 2 O 2 q
O S H O
N O O O Ph H N
HO m (A-1-2)
[0380] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-, por exemplo, um átomo de nitrogênio; m é um número inteiro na faixa de 5 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1, por exemplo, zero; Rx é um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; e o grupo HOOC-(CH2)m-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0381] De acordo com uma modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-1-2a)
O O O O O
O O O 15 N N 2 N 2 O N
HO H H H N
S N O O O (A-1-2a)
[0382] ou a fórmula (O-1-2b)
O O O O H H
N N N O N HO 15 N 5 O 2 O 2
H H N O O O O
S N O O (A-1-2b)
[0383] ou a fórmula (O-1-2c)
O O O O O
O O O 15 N 2 N 2 O N
HO H H H N
S N O O O (A-1-2c) .
[0384] De acordo com uma outra modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-2)
O O
O O O x O O X N 2 N 2 OR
H H S
N Ph H N
O HO m (A-2) ,
[0385] em que
[0386] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0387] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; e
[0388] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17, por exemplo, na faixa de 11 a 17.
[0389] De acordo com uma modalidade da sulfonamida de fórmula (O-2), o grupo HOOC-(CH2)m- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0390] De acordo com uma outra modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-3)
O O
O O O x O O X N 2 N 2 OR
S H H
N Ph H N HO (E) m O 2 (A-3)
O
[0391] em que
[0392] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0393] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0394] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; e
[0395] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17, por exemplo, 11.
[0396] De acordo com uma modalidade da sulfonamida de fórmula
(O-3), o grupo HOOC-(CH2)m-O- e o grupo –(CH2)2- estão situados em posição para em (E) de fórmula (O-3) e o grupo HOOC-(CH2)m-O-(E)- (CH2)2- está situado em posição para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0397] De acordo com uma outra modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-4)
O O
O O O x O O X N 2 N 2 OR
S H H
O N Ph H N (E) HO m
A (A-4)
[0398] em que
[0399] A é um grupo -OCH2- ou um grupo -CH2O-;
[0400] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0401] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0402] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; e
[0403] m é um número inteiro na faixa de a partir de 5 a 17, por exemplo, na faixa de a partir de 9 a 13.
[0404] De acordo com uma modalidade da sulfonamida de fórmula (O-4), o grupo HOOC-(CH2)m- e o grupo -O- estão situados na posição para em (E) de fórmula (O-4) e o grupo –O- está situado em posição para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0405] De acordo com uma outra modalidade, a sulfonamida tem a fórmula (O-5)
O O O
O O O O X N 2 N 2 OR x
S H H
N Ph H N
HO m 2 (E) O O (A-5)
[0406] em que
[0407] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0408] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0409] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; e
[0410] m é um número inteiro na faixa de a partir de 5 a 17, por exemplo, na faixa de a partir de 7 a 9.
[0411] De acordo com uma modalidade da sulfonamida de fórmula (O-5), o grupo HOOC-(CH2)m- e o grupo –(CH2)2- estão situados em posição para em (E) de fórmula (O-5) e o grupo HOOC-(CH2)mE)- (CH2)2-O- está situado em posição para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0412] Os ligantes de albumina descritos na seção B são ilustrados mais pelas modalidades e combinações de modalidades que seguem como indicado pelas respectivas dependências e referências anteriores. Em particular, é observado que em cada caso em que uma faixa de modalidades é mencionada, por exemplo, no contexto de um termo como "O ... de qualquer uma das modalidades 1 a 4", todas as modalidades nesta faixa pretendem ser explicitamente divulgadas para o especialista, isto é, a redação deste termo deve ser entendida pelo especialista como sendo sinônimo de "O ... de qualquer uma das modalidades 1, 2, 3 e 4".
1. Uma sulfonamida de fórmula (A)
O 2 R H H x
N N OR 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (A)
[0413] em que:
[0414] A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo -CH2O-;
[0415] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0416] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0417] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17;
[0418] n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3;
[0419] p é zero ou 1;
[0420] q é zero ou 1;
[0421] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0422] s é zero ou 1;
[0423] t é zero ou 1;
[0424] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0425] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0426] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de
HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila.
[0427] 2. A sulfonamida de acordo com a modalidade 1 possuindo a fórmula (O-1)
O 2
R H H N N x
O O X OR 1 N r O 2 O 2
O R S H q
E N O O O HO p O Ph H N m (A-1)
[0428] em que:
[0429] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0430] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0431] p é zero ou 1;
[0432] q é zero ou 1;
[0433] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0434] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio e átomo de halogênio;
[0435] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0436] Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; e
[0437] com m sendo um número inteiro na faixa de 5 a 15 se p for zero ou m sendo um número inteiro na faixa de 7 a 15 se p for 1.
[0438] 3. A sulfonamida de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que R1 e R2 são átomo de hidrogênio.
[0439] 4. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que X representa um átomo de nitrogênio.
[0440] 5. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o grupo HOOC-(CH2)m-(O)s-(E)p-(CH2)n- (A)t- de fórmula (A) ou o grupo HOOC-(CH2)m-(E)p-O- de fórmula (O-1) está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0441] 6. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que, se p for 1, o grupo HOOC-(CH2)m-(O)s- e o grupo -(CH2)n-(A)t- estão situados em posição meta ou para em (E)p de fórmula (A) ou o grupo HOOC-(CH2)m- e o grupo -O- estão situados em posição meta ou para em (E)p de fórmula (O-1).
[0442] 7. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que q é zero.
[0443] 8. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a sulfonamida tem a fórmula (O-1-1)
O H H x Hal N N OR O O X N r O 2 O 2 O q
H O S O O
N N HO m O Ph H (A-1-1)
[0444] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo –CH-; m é um número inteiro na faixa de 7 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1; Hal é um átomo de halogênio selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo; Rx representa um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila;
[0445] e o grupo HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0446] 9. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que a sulfonamida tem a fórmula (O-1-1a)
O O O O
O O N N 2 N 2 O N
O O H H F S O N N O
H HO 13 O (A-1-1a) .
[0447] 10. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a sulfonamida tem a fórmula (O-1-2)
O H H x
X N N OR O O N r O 2 O 2 q
O S H O
N O O O Ph H N
HO m (A-1-2)
[0448] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-; m é um número inteiro na faixa de 5 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1; e o grupo HOOC-(CH2)m-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0449] 11. A sulfonamida de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7 ou 10, em que a sulfonamida tem a fórmula (O-1-2a)
O O O O O
O O O 15 N N 2 N 2 O N
HO H H H N
S N O O O (A-1-2a)
[0450] ou a fórmula (O-1-2b)
O O O O H H
N N N O N HO 15 N 5 O 2 O 2
H H N O O O O
S N O O (A-1-2b) ou a fórmula (O-1-2c)
O O O O O
O O O 15 N 2 N 2 O N
HO H H H N
S N O O O (A-1-2c) .
Seção C: Conjugado
[0451] São providos aqui conjugados compreendendo um ligante de albumina e um ingrediente farmacêutico ativo ou um composto de diagnóstico. Em uma modalidade, o ligante de albumina é um ligante de albumina como definido na seção B acima e o ingrediente farmacêutico ativo é um análogo de insulina como definido na seção A acima.
[0452] São providos aqui conjugados compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo ou um composto de diagnóstico
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (I)
[0453] em que na sulfonamida de fórmula (I):
[0454] A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo -CH2O-;
[0455] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0456] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0457] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17;
[0458] n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3;
[0459] p é zero ou 1;
[0460] q é zero ou 1;
[0461] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0462] s é zero ou 1;
[0463] t é zero ou 1;
[0464] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0465] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0466] em que a sulfonamida de fórmula (I) é ligada covalentemente ao ingrediente farmacêutico ativo ou ao composto de diagnóstico.
[0467] Em algumas modalidades, a combinação de s sendo 1, p sendo zero, n sendo zero, A sendo um átomo de oxigênio e t sendo 1 é excluída para a sulfonamida de fórmula (I). Em algumas modalidades, s é zero, em que os resíduos e índices restantes têm o significado como indicado acima para a fórmula (I).
[0468] Em algumas modalidades, a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao ingrediente farmacêutico ativo ou ao composto de diagnóstico em que o grupo carboxi terminal "a" da sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligado a um grupo funcional adequado do ingrediente farmacêutico ativo ou do composto de diagnóstico, por exemplo, a um grupo amino ou um grupo hidroxila do ingrediente farmacêutico ativo ou do composto de diagnóstico. Por exemplo, o ingrediente farmacêutico ativo é um peptídeo, em que o peptídeo e a sulfonamida de fórmula (I) são, por exemplo, conectados por uma ligação amida, por exemplo, formada entre o grupo carbóxi terminal “a” da sulfonamida de fórmula (I) e um grupo amino do peptídeo. Desnecessário dizer que no caso de uma ligação amida, o grupo carboxila "a" está presente no conjugado como grupo carbonila –C(=O)-, como mostrado abaixo, em que todos os resíduos E, A, R1, R2, X, bem como os índices m, s, p, n, t, r e q têm o significado como indicado acima para a fórmula (I) e o grupo NH ---- já é a parte restante do grupo amino do peptídeo:
O 2
R H H H N N aN 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t
[0469] Em algumas modalidades, o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R1 e/ou o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R2 da sulfonamida de fórmula (I) é/são parcialmente halogenado(s) ou per halogenado(s). Em algumas modalidades, o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R1 e/ou o grupo C1 a C3 alquila halogenado de R2 da sulfonamida de fórmula (I) é/são por halogenado(s).
[0470] Como já discutido acima, foi surpreendentemente constatado que os ditos conjugados exibem meia-vida favorável em sangue e/ou plasma sanguíneo e um perfil de ação prolongado, o que foi, por exemplo, comprovado em modelos animais pré-clínicos.
[0471] Conforme usado aqui, o termo "ingrediente farmacêutico ativo" (API) inclui qualquer composto químico ou biológico farmaceuticamente ativo e qualquer sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e qualquer mistura dos mesmos, que provê algum efeito farmacológico e é usado para tratar ou prevenir uma condição. Conforme usado aqui, os termos "ingrediente farmacêutico ativo", "agente ativo", "ingrediente ativo", "substância ativa" e "fármaco" são sinônimos, isto é, têm significado idêntico.
[0472] Tal como aqui usado, o termo "conjugados compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo ou um composto de diagnóstico" compreende os próprios conjugados, seus sais farmaceuticamente aceitáveis e conjugados isotopicamente marcados farmaceuticamente aceitáveis, em que um ou mais átomos são substituídos por átomos com o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa que predomina na natureza. O mesmo se aplica a todos os subtipos dos conjugados, isto é, aos conjugados compreendendo sulfonamidas de fórmulas (I-1) a (I-5) conforme detalhado abaixo e também às suas subestruturas, por exemplo, conjugados compreendendo as sulfonamidas de fórmula (I-1-1). O mesmo se aplica a todos os subtipos das sulfonamidas de fórmula (I), isto é, às sulfonamidas de fórmulas (I-1) a (I-5) conforme detalhado abaixo e também às suas subestruturas, respectivamente, Por exemplo, as sulfonamidas de fórmula ( I-1-1). Isto é, o termo "conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I- ...)", em que (I- ...) representa o número das sulfonamidas de fórmulas (I-1) a (I-5) como detalhado abaixo e também suas subestruturas compreendem os próprios conjugados, sais farmaceuticamente aceitáveis e todos os seus compostos isotopicamente marcados farmaceuticamente aceitáveis.
[0473] Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos conjugados incluem sais de adição ácidos e básicos. Sais de adição ácidos adequados são formados a partir de ácidos que formam sais não tóxicos. Exemplos incluem os sais de acetato, adipato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato/carbonato, bissulfato/sulfato, borato, camsilato, citrato, ciclamato, edisilato, esilato, formato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hexafluorfosfato, hibenzato, cloridrato/cloreto , bromidrato/brometo, iodrato/iodeto, isetionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, 2- napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogenofosfato/di-hidrogenofosfato, piroglutamato, sacarato, estearato, succinato, tanato, tartarato, tosilato, trifluoroacetato, ácido 1,5-nafatalenodissulfônico e xinafoato. Sais de base adequados são formados a partir de bases que formam sais não tóxicos. Exemplos incluem os sais de alumínio, arginina, benzatina, cálcio, colina, dietilamina, bis(2-hidroxietil)amina (diolamina), glicina, lisina, magnésio, meglumina, 2-aminoetanol (olamina), potássio, sódio, 2-
amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (tris ou trometamina) e zinco. Hemissais de ácidos e bases também podem ser formados, por exemplo, sais de hemissulfato e hemicálcio. Para uma revisão sobre os sais adequados vide Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use de Stahl e Wermuth (Wiley-VCH, 2002).
[0474] Os conjugados e seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem existir em formas não solvatadas e solvatadas. O termo “solvato” é usado aqui para descrever um complexo molecular compreendendo o composto de fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e uma ou mais moléculas de solvente farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, etanol. O termo “hidrato” é usado quando o dito solvente é água.
[0475] Exemplos de isótopos adequados para inclusão nos 2 3 conjugados incluem isótopos de hidrogênio, tais como H e H, 11 13 14 36 carbono, tais como C, Ce C, cloro, tal como Cl, flúor, tal como 18 F, iodo, tais como 123I e 125 I, nitrogênio, tais como 13N e 15 N, oxigênio, tais como 15O, 17O e 18O e enxofre, tal como 35S.
[0476] Certos conjugados isotopicamente marcados, por exemplo, aqueles que incorporam um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição em tecido de fármaco e/ou substrato. Os isótopos 3 14 radioativos trítio, isto é, H, e carbono-14, isto é, C, são particularmente úteis para este fim devido à sua facilidade de incorporação e meios de detecção prontos.
[0477] Substituição por isótopos mais pesados tal como deutério, isto é, 2H, pode prover certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzidas.
[0478] A substituição por isótopos emissores de pósitrons, tais 11 18 15 13 como C, F, O e N, pode ser útil em estudos de Topografia de Emissão de Pósitrons (PET) para examinar ocupação de receptor de substrato.
[0479] Os conjugados isotopicamente marcados podem ser geralmente preparados através de técnicas convencionais conhecidas daqueles versados na técnica.
[0480] Os solvatos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a invenção incluem aqueles em que o solvente de cristalização pode ser isotopicamente substituído, por exemplo, D2O, d6-acetona, d6-DMSO.
[0481] Em uma modalidade, o ingrediente farmacêutico ativo é selecionado do grupo compreendendo agente antidiabético, agente antiobesidade, agente regulador do apetite, agente anti-hipertensivo, agente para o tratamento e/ou prevenção de complicações resultantes de ou associadas com diabetes e agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicações e distúrbios resultantes ou associados à obesidade. Exemplos desses ingredientes farmacêuticos ativos são: insulina, sulfonilureias, biguanidas, meglitinidas, inibidores de glucosidase, antagonistas de glucagon, inibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidase-IV), inibidores de enzimas hepáticas envolvidas na estimulação da gluconeogênese e/ou glicogenólise, moduladores de absorção de glicose, compostos que modificam o metabolismo lipídico, tais como agentes anti-hiperlipidêmicos como inibidores de HMG CoA (estatinas), Polipeptídeos Inibitórios Gástricos (análogos de GIP), compostos que diminuem a ingestão de alimentos, agonistas de RXR e agentes que agem sobre o canal de potássio dependente de ATP das células; colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina, sinvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; -bloqueadores, tais como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol e metoprolol, inibidores da ACE (enzima de conversão da angiotensina), tais como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril e ramipril, bloqueadores de canais de cálcio, tais como nifedipina, felodipina,
nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem e verapamil, e o- bloqueadores tais como doxazosina, urapidil, prazosina e terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado pela cocaína e anfetamina), antagonistas de NPY (neuropeptídeo Y), agonista de PYY, agonistas de PYY2, agonistas de PYY4, agonistas mistos de PPY2/PYY4, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas de TNF (fator de necrose tumoral), agonistas de CRF (fator de liberação de corticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína de ligação a fator de liberação de corticotropina), agonistas de urocortina, 3 agonistas, agonistas de MSH (hormônio estimulador de melanócitos), antagonistas de MCH (hormônio de concentração de melanócitos), agonistas de CCK (colecistoquinina), agonistas de CCK (colecistocinina), inibidores de reabsorção de serotonina, inibidores de reabsorção de serotonina e noradrenalina, compostos mistos de serotonina e noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormônio do crescimento, compostos de liberação de hormônio do crescimento, agonistas de TRH (hormônio liberador de tireotropina, moduladores de UCP 2 ou 3 (proteína de não acoplamento 2 ou 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inibidores de lipase/amilase, moduladores de RXR (receptor de retinoide X), agonistas de TR; antagonistas de histamina H3, Polipeptídeo Inibitório Gástrico para agonistas ou antagonistas (análogos de GIP), gastrina e análogos de gastrina.
Em uma modalidade, o ingrediente farmacêutico ativo é selecionado do grupo consistindo em agente antidiabético, agente antiobesidade, agente regulador do apetite, agente anti- hipertensivo, agente para o tratamento e/ou prevenção de complicações resultantes de ou associadas com diabetes e agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicações e distúrbios resultantes ou associados à obesidade.
Exemplos desses ingredientes farmacêuticos ativos são: insulina, sulfonilureias, biguanidas, meglitinidas, inibidores da glicosidase, antagonistas do glucagon, inibidores da DPP-IV (dipeptidil peptidase-IV), inibidores das enzimas hepáticas envolvidas em estimulação da gluconeogênese e/ou glicogenólise, moduladores da absorção de glicose , compostos que modificam o metabolismo lipídico, tais como agentes anti- hiperlipidêmicos como inibidores de HMG CoA (estatinas), Polipeptídeos Inibitórios Gástricos (análogos de GIP), compostos que diminuem ingestão de alimentos, agonistas de RXR e agentes que atuam sobre o canal de potássio dependente de ATP das células; colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina, sinvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; bloqueadores tais como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol e metoprolol, inibidores da ECA (enzima de conversão da angiotensina) tais como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril e ramipril, bloqueadores de canais de cálcio tais como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem e verapamil, e o-bloqueadores, tais como doxazosina, urapidil, prazosina e terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por cocaína e anfetamina), antagonistas de NPY (neuropeptídeo Y), agonista de PYY, agonistas de PYY2, agonistas de PYY4, agonistas mistos de PPY2/PYY4, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas de TNF (fator de necrose tumoral), agonistas de CRF (fator de liberação de corticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína de ligação a fator de liberação de corticotropina), agonistas de urocortina, 3 agonistas, agonistas de MSH (hormônio estimulador de melanócitos), antagonistas de MCH (hormônio de concentração de melanócitos), agonistas de CCK (colecistocinina), agonistas de CCK (colecistocinina), inibidores de reabsorção de serotonina, inibidores de reabsorção de serotonina e noradrenalina, compostos mistos de serotonina e noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormônio do crescimento, compostos de liberação de hormônio do crescimento, agonistas de TRH (hormônio liberador de tireotropina, moduladores de proteína UCP 2 ou 3 (proteína de não acoplamento 2 ou 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inibidores de lipase/amilase, moduladores de RXR (receptor de retinoide X), agonistas de TR; antagonistas de histamina H3, Polipeptídeo Inibitório Gástrico para agonistas ou antagonistas (análogos de GIP), gastrina e análogos de gastrina.
[0482] Em uma modalidade, o ingrediente farmacêutico ativo é um peptídeo terapeuticamente ativo, em que o peptídeo compreende pelo menos 2 aminoácidos. Em algumas modalidades, o peptídeo compreende pelo menos 10 aminoácidos ou pelo menos 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o peptídeo compreende não mais do que 1000 aminoácidos, tal como não mais do que 500 aminoácidos, por exemplo, não mais do que 100 aminoácidos.
[0483] Em uma modalidade do conjugado, o ingrediente farmacêutico ativo é um agente antidiabético, tal como um peptídeo. Em algumas modalidades, o peptídeo é GLP-1, análogo de GLP-1, agonista de GLP-1; agonista de receptor de GLP-1/receptor de glucagon duplo; FGF21 humano, análogo de FGF21, derivado de FGF21; insulina (por exemplo, insulina humana), análogo de insulina ou derivado de insulina.
[0484] De acordo com uma modalidade do conjugado, o ingrediente farmacêutico ativo é selecionado do grupo compreendendo insulina, análogo de insulina, GLP-1 e análogo de GLP-1 (por exemplo, agonista de GLP(-1)). Em uma modalidade do conjugado, o ingrediente farmacêutico ativo é selecionado do grupo consistindo em insulina, análogo de insulina, GLP-1 e análogo de GLP-1 (por exemplo, agonista de GLP(-1)).
[0485] Tal como aqui usado, o termo "análogo de GLP-1" se refere a um polipeptídeo que tem uma estrutura molecular que formalmente pode ser derivada da estrutura de um peptídeo-1 do tipo glucagon de ocorrência natural (GLP-1), por exemplo, aquele de GLP-1 humano, através de deleção e/ou troca de pelo menos um resíduo de aminoácido ocorrendo no GLP-1 de ocorrência natural e/ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido. O resíduo de aminoácido adicionado e/ou trocado pode ser resíduos de aminoácido codificáveis ou outros resíduos de ocorrência natural ou resíduos de aminoácido puramente sintéticos.
[0486] Como usado aqui, o termo “agonista de GLP(-1)” se refere a análogos de GLP(-1) que ativam o receptor de peptídeo-1 do tipo glucagon (receptor de GLP-1). Exemplos de agonistas de GLP(-1) incluem, mas não estão limitados a, o que segue: lixisenatida, exenatida/exendino-4, semaglutida, taspoglutida, albiglutida, dulaglutida.
[0487] A lixisenatida tem a sequência de aminoácidos que segue (SEQ ID NO: 98): His–Gly–Glu–Gly–Thr–Phe–Thr–Ser–Asp–Leu–Ser– Lys–Gln–Met–Glu–Glu–Glu–Ala–Val–Arg–Leu–Phe–Ile–Glu–Trp–Leu– Lys–Asn–Gly–Gly–Pro–Ser–Ser–Gly–Ala–Pro–Pro–Ser–Lys–Lys–Lys– Lys–Lys–Lys–NH2.
[0488] A exenatida tem a sequência de aminoácidos que segue (SEQ ID NO: 99):
[0489] His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- Met-Glu-Glu-Glu-Alo-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly- Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Alo-Pro-Pro-Pro-Ser- NH2.
[0490] Ligante de Semaglutida-Albumina acoplado a Lys (20) tem a sequência de aminoácidos que segue (SEQ ID NO: 100):
[0491] His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu- Glu-Gly-Gln-Alo-Alo-Lys (AEEAc-AEEAc-γ-Glu-17- carboxieptadecanoil)-Glu-Phe-Ile-Alo-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly.
[0492] A dulaglutida (GLP1 (7-37) acoplada por meio de ligante peptídico a um fragmento fc) tem a sequência de aminoácidos que segue (SEQ ID NO: 101):
[0493] His-Alo-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu- Glu-Gly-Gln-Alo-Alo-Lys-Glu-Phe-Ile-Alo-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly.
[0494] Conforme usado aqui, o termo "FGF-21" significa "fator de crescimento de fibroblastos 21". Os compostos FGF-21 podem ser FGF-21 humano, um análogo de FGF-21 (referido como "análogo de FGF-21") ou um derivado de FGF-21 (referido como "derivado de FGF- 21").
[0495] Em algumas modalidades, o ingrediente farmacêutico ativo é um análogo da insulina. Exemplos de análogos de insulina incluem, mas não estão limitados a, os que seguem:
[0496] (i). “Insulina asparte” é insulina humana onde o aminoácido B28 (isto é, o aminoácido nº 28 na cadeia B de insulina humana), que é a prolina, é substituído por ácido aspártico.
[0497] (ii). “Insulina lispro” é insulina humana onde os penúltimos resíduos de lisina e prolina na extremidade C-terminal da cadeia B de são invertidos (insulina humana: ProB28LysB29; insulina lispro: LysB28ProB29).
[0498] (iii). “Insulina glulisina” difere de insulina humana pelo fato que o aminoácido asparagina na posição B3 é substituído por lisina e a lisina na posição B29 é substituída por ácido glutâmico.
[0499] (iv). “Insulina glargina” difere de insulina humana pelo fato que asparagina na posição A21 é substituída por glicina e a cadeia B é estendida no terminal carbóxi por duas argininas.
[0500] Ainda, o análogo de insulina pode ser "Insulina detemir"
que difere da insulina humana pelo fato que o aminoácido treonina na posição B30 é deletado e um resíduo de ácido graxo (ácido mirístico) é ligado à função épsilon-amino da lisina na posição B29. Alternativamente, o análogo da insulina pode ser “Insulina degludec” que difere da insulina humana pelo fato que o aminoácido treonina na posição B30 é deletado e que um ácido hexadecanodioico é conjugado ao aminoácido lisina B29 por meio de um ligante gamo-L- glutamila. A insulina degludec é uma insulina de ação prolongada.
[0501] Em algumas modalidades, o análogo da insulina é um análogo da insulina como descrito na seção A acima. As definições e explicações providas acima se aplicam de acordo. Em algumas modalidades, o análogo de insulina compreendido pelo conjugado é um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou um mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. Como descrito acima na seção A, o análogo de insulina pode compreender opcionalmente mutações adicionais. Por exemplo, o resíduo de aminoácido na posição 14 da cadeia A (A14) da insulina de origem (tal como insulina humana) pode ser substituído por ácido glutâmico, e o aminoácido na posição 30 da cadeia B pode ser deletado, isto é, está ausente (mutação desB30).
[0502] Em algumas modalidades, o análogo de insulina compreendido pelo conjugado é Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 24). Por exemplo, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID
NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[0503] Em algumas modalidades, o análogo de insulina compreendido pelo conjugado é Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 4 da seção de Exemplos (vide Análogo 22). Por exemplo, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)- Insulina compreende uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK).
[0504] Em algumas modalidades, o análogo de insulina compreendido pelo conjugado é Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 39).
[0505] De acordo com uma modalidade do conjugado, o ingrediente farmacêutico ativo é insulina ou um análogo de insulina, por exemplo, um análogo de insulina como mostrado acima (tal como Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana) ou Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana), em que o grupo amino do peptídeo, ao qual a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada, é um grupo amino epsilon de uma lisina presente na insulina ou análogo da insulina ou é o grupo amino N- terminal da cadeia B da insulina ou análogo de insulina. Por exemplo, a insulina ou análogo de insulina tem uma lisina na cadeia A e/ou cadeia B. Em algumas modalidades, a insulina ou análogo de insulina tem uma lisina na cadeia A e na cadeia B.
[0506] De acordo com uma modalidade do conjugado, o grupo amino do peptídeo, ao qual a sulfonamida de fórmula (I) está covalentemente ligada, é um grupo amino epsilon de uma lisina presente nas posições B26 a B29, por exemplo, B29, da cadeia B de insulina humana ou análogo de insulina humana, por exemplo, de análogo de insulina humana.
[0507] Em algumas modalidades, os análogos de insulina providos na seção A acima de um único resíduo de lisina estão presentes. Por exemplo, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana) e Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana Des(B30) têm um resíduo de lisina na posição B29. O dito resíduo de lisina é o aminoácido terminal no terminal C da cadeia B, uma vez que o aminoácido na posição B30 está ausente. Em algumas modalidades dos conjugados providos aqui, a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao grupo amino epsilon do dito resíduo de lisina, tipicamente através de uma ligação amida.
[0508] Conjugados exemplares são mostrados na Figura 5 até a Figura 8 e descritos na seção de Exemplos, por exemplo, no Exemplo 10.
[0509] Em algumas modalidades do conjugado provido aqui, o conjugado compreende Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana (como análogo de insulina) e uma sulfonamida da fórmula que segue (como ligante de albumina):
O O O H O O N O HO N N O O OH H NH O S N O O
[0510] O conjugado acima pode ter a estrutura que segue (vide também Figura 5, conjugado 1):
[0511] As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 47) e da cadeia B (SEQ ID NO: 48) são indicadas em código de três letras, exceto pelo último aminoácido na cadeia B (lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (por meio do aminoácido epsilon do resíduo de lisina).
[0512] Em algumas modalidades do conjugado provido aqui, o conjugado compreende Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana (como análogo de insulina) e uma sulfonamida da fórmula que segue (como ligante de albumina):
O O H O N O O N N O O OH O H F S O O N N H HO O
[0513] O conjugado acima pode ter a estrutura que segue (vide também Figura 6, conjugado 2):
[0514] As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 47) e da cadeia B (SEQ ID NO: 48) são indicadas em código de três letras, exceto pelo último aminoácido na cadeia B (Lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (por meio do aminoácido epsilon do resíduo de lisina).
[0515] Em algumas modalidades do conjugado provido aqui, o conjugado compreende Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina humana (como análogo de insulina) e uma sulfonamida da fórmula que segue (como ligante de albumina):
O O O H O O N O HO N N O O OH H NH O S N O O
[0516] Conjugado acima pode ter a estrutura que segue (vide também Figura 7, conjugado 3):
[0517] As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 77) e da cadeia B (SEQ ID NO: 78) são indicadas em código de três letras, exceto pelo último aminoácido na cadeia B (lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (por meio do aminoácido epsilon do resíduo de lisina).
[0518] Em algumas modalidades dos conjugados providos aqui, o conjugado compreende Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana (como análogo de insulina) e uma sulfonamida da fórmula que segue (como ligante de albumina):
O O O H O O N O HO N N O O OH H NH O S N O O
[0519] O conjugado acima pode ter a estrutura que segue (vide também Figura 8, conjugado 4):
[0520] As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 43) e da cadeia B (SEQ ID NO: 44) são indicadas em código de três letras, exceto pelo último aminoácido na cadeia B (lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (por meio do grupo épsilon amino do resíduo de lisina).
[0521] Também são providos aqui conjugados compreendendo um composto de diagnóstico. Em algumas modalidades do conjugado, o composto de diagnóstico é um agente de contraste, tal como um agente de radiocontraste. Em algumas modalidades, o agente de contraste é um agente de contraste de imagem por ressonância magnética (MRI) baseado em gadolínio ou iodo. Em algumas modalidades, o agente de contraste é gadopentetato dimeglumina, gadoterato meglumina, gadobenato dimeglumina, gadoteridol, gadodiamida, gadoversetamida, gadoxetato dissódico, amidotrizoato ou um sal de amidotrizoato, por exemplo, uma meglumina, sal de sódio e/ou lisina de amidotrizoato, ioexol 5-[acetil (2,3-di-hidroxipropil)amino]-1-N,3-N-bis(2,3-di-hidroxipropil)-2,4,6- tri-iodo-benzeno-1,3-dicarboxamida), iopamidol (1-N,3-N-bis(1,3-di- hidroxipropan-2-il)-5-[[(2S)-2-hidroxipropanoil]amino]-2,4,6-tri- iodobenzeno-1,3-dicarboxamida), iopromida (1-N,3-N-bis(2,3-di- hidroxipropil)-2,4,6-tri-iodo-5-[(2-metoxiacetil)amino]-3-N-metil-benzeno- 1,3-dicarboxamida) ou ioxidanol (5-[acetil-[3-[acetil-[3,5-bis(2,3-di- hidroxipropilcarbamoil)-2,4,6-tri-iodo-fenil]amino]-2-hidróxi-propil]amino]-N, N'-bis(2,3-di-hidroxipropil)-2,4,6-tri-iodo-benzeno-1,3-dicarboxamida). Em algumas modalidades, o agente de contraste é selecionado do grupo consistindo em gadopentetato dimeglumina, gadoterato meglumina, gadobenato dimeglumina, gadoteridol, gadodiamida, gadoversetamida, gadoxetato dissódico, amidotrizoato ou um sal de amidotrizoato, por exemplo, um sal de meglumina, sódio e/ou lisina de amidotrizoato, ioexol (5-[acetil(2,3-di-hidroxipropil)amino]-1-N, 3-N-bis(2,3-di-hidroxipropil)-2,4,6- tri-iodo-benzeno-1,3-dicarboxamida), iopamidol (1-N,3-N-bis(1,3-di- hidroxipropan-2-il)-5-[[(2S)-2-hidroxipropanoil]amino]-2,4,6-tri- iodobenzeno-1,3-dicarboxamida), iopromida (1-N,3-N-bis(2,3-di- hidroxipropil)-2,4,6-tri-iodo-5-[(2-metoxiacetil)amino]-3-N-metilbenzeno-1,3- dicarboxamida) ou ioxidanol (5-[acetil-[3-[acetil-[3,5-bis(2,3-di- hidroxipropilcarbamoil)-2,4,6-tri-iodo-fenil]amino]-2-hidróxi-propil]amino]- N,N'-bis(2,3-di-hidroxipropil)-2,4,6-tri-iodo-benzeno-1,3-dicarboxamida).
[0522] Como discutido acima, a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao composto de diagnóstico em que o grupo carbóxi terminal "a" da sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligado a um grupo funcional adequado do composto de diagnóstico. O grupo funcional adequado pode ser, por exemplo, um grupo amino (primário ou secundário) ou um grupo hidroxila do composto de diagnóstico.
[0523] De acordo com uma modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-1)
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2
O R S H q
E N O O O HO p O Ph H N m (I-1)
[0524] em que:
[0525] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo e é, por exemplo, um átomo de flúor;
[0526] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0527] p é zero ou 1;
[0528] q é zero ou 1;
[0529] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0530] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio e átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é, por exemplo, um átomo de flúor ou cloro;
[0531] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado, em que o grupo C1 a C3 alquila é, por exemplo, um grupo metila e o grupo C1 a C3 alquila halogenado é, por exemplo, per-halogenado tal como um grupo trifluormetila;
[0532] com m sendo um número inteiro na faixa de 5 a 15 se p for zero ou m sendo um número inteiro na faixa de 7 a 15 se p for 1.
[0533] Em uma modalidade do conjugado, os resíduos R1 e R2 da sulfonamida são átomo de hidrogênio.
[0534] Em uma modalidade do conjugado, o resíduo X da sulfonamida representa um átomo de nitrogênio.
[0535] De acordo com outra modalidade do conjugado, o grupo HOOC-(CH2)m-(O)s-(E)p-(CH2)n-(A)t- de fórmula (I) ou o grupo HOOC- (CH2)m-(E)pO- de fórmula (I-1) da sulfonamida está situado em posição meta ou para em anel fenila Ph em relação ao grupo -S(O)2-.
[0536] De acordo com uma outra modalidade do conjugado, se p for 1, o grupo HOOC-(CH2)m-(O)s- e o grupo -(CH2)n-(A)t- estão situados em posição meta ou para em (E)p de fórmula (I) da sulfonamida ou o grupo HOOC-(CH2)m- e o -O- estão situados em posição meta ou para em (E)p de fórmula (I-1).
[0537] De acordo com outra modalidade do conjugado, o índice q da sulfonamida é zero.
[0538] De acordo com uma outra modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-1-1)
O
H H Hal N N a OH O O X N r O 2 O 2 O q
H O S O O
N N HO m O Ph H (I-1-1)
[0539] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo –CH-, por exemplo, um átomo de nitrogênio; m é um número inteiro na faixa de 7 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1, por exemplo, zero; Hal é um átomo de halogênio selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo, por exemplo, um átomo de flúor; e o grupo HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0540] De acordo com uma modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-1-1a)
O O O
O O N N 2 N 2 a OH
O O H H F S O N N
H HO 13 O (I-1-1a)
[0541] De acordo com uma outra modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-1-2)
O
H H N N a OH O O X N r O 2 O 2 q
O S H O
N O O O Ph H N
HO m (I-1-2)
[0542] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-, por exemplo, um átomo de nitrogênio; m é um número inteiro na faixa de 5 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1, por exemplo, zero; e o grupo HOOC-(CH2)m-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0543] De acordo com uma modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-1-2a)
O O O O
O O O 15 N N 2 N 2 a OH
HO H H H N
S N O O (I-1-2a)
[0544] ou a fórmula (I-1-2b)
O O
O H H N N a OH HO 15 N N 5 O 2 O 2
H H N O O O
S N O O (I-1-2b)
[0545] ou a fórmula (I-1-2c)
O O O O
O O O 15 N 2 N 2 a OH
HO H H H N
S N O (I-1-2c) O .
[0546] De acordo com uma outra modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-2)
O O O
O O O O X N 2 N 2 a OH
H H S
N Ph H N
O HO m (I-2) ,
[0547] em que
[0548] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-; e
[0549] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17, por exemplo, na faixa de 11 a 17.
[0550] De acordo com uma modalidade do conjugado, o grupo HOOC-(CH2)m- da sulfonamida de fórmula (I-2) está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0551] De acordo com uma outra modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-3)
O O O
O O O O X N 2 N 2 a OH
S H H
N Ph H N HO (E) m 2 O (I-3)
O
[0552] em que
[0553] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0554] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0555] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17, por exemplo, 11.
[0556] De acordo com uma modalidade do conjugado, o grupo HOOC-(CH2)m-O- e o grupo –(CH2)2- da sulfonamida de fórmula (I-3) estão situados em posição para em (E) de fórmula (I-3) e o grupo HOOC-(CH2)m-O-(E)-(CH2)2- está situado em posição para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0557] De acordo com uma outra modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-4)
O O O
O O O O X N 2 N 2 OH H H a
S
O N Ph H N (E) HO m
A (I-4)
[0558] em que
[0559] A é um grupo OCH2- ou um grupo -CH2O-;
[0560] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0561] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0562] m é um número inteiro na faixa de a partir de 5 a 17, por exemplo, na faixa de a partir de 9 a 13.
[0563] De acordo com uma modalidade do conjugado, o grupo HOOC-(CH2)m- e o grupo -O- da sulfonamida de fórmula (I-4) estão situados na posição para em (E) de fórmula (I-4) e o grupo –O- está situado em posição para no anel fenila Ph com relação ao grupo - S(O)2-.
[0564] De acordo com uma outra modalidade do conjugado, a sulfonamida tem a fórmula (I-5)
O O O
O O O O X N 2 N 2 a OH
S H H
N Ph H N
HO m 2 (E) O O (I-5)
[0565] em que
[0566] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0567] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0568] m é um número inteiro na faixa de a partir de 5 a 17, por exemplo, na faixa de a partir de 7 a 9.
[0569] De acordo com uma modalidade do conjugado, o grupo HOOC-(CH2)m e o grupo –(CH2)2- da sulfonamida de fórmula (I-5) estão situados em posição para em (E) de fórmula (I-5) e o grupo HOOC-(CH2)m (E)-(CH2)2-O- está situado em posição para em anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-. Processo para preparação de um conjugado
[0570] São providos aqui processos para preparação de um conjugado como descrito na seção C acima. Desta maneira, são providos aqui processos para preparação de um conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (I)
[0571] em que na sulfonamida de fórmula (I):
[0572] A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo -CH2O-;
[0573] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0574] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0575] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17;
[0576] n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3;
[0577] p é zero ou 1;
[0578] q é zero ou 1;
[0579] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0580] s é zero ou 1;
[0581] t é zero ou 1;
[0582] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0583] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0584] em que a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao ingrediente farmacêutico ativo pelo fato do grupo carbóxi terminal “a” da sulfonamida de fórmula (I) estar covalentemente ligado a um grupo amino do ingrediente farmacêutico ativo;
[0585] prover uma sulfonamida de fórmula (Aa)
O 2
R H H N N a ORx 1 O O X N r O 2 O 2
R S H q
O O O
N O Ph H N (O)s O m (E)p n A t 3 (Aa)
R
[0586] em que X, Y, A, E, R1, R2 e os índices m, n, p, q, r, s, t têm o significado definido acima com relação à fórmula (I), Rx é um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), grupo 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N- succinimidila,
[0587] e R3 é um grupo protetor ou um átomo de hidrogênio, opcionalmente um átomo de hidrogênio; e um ingrediente farmacêutico ativo possuindo um terminal C protegido ou não protegido;
[0588] (b) reagir a sulfonamida de fórmula (Aa) e o ingrediente farmacêutico ativo possuindo um terminal C protegido ou desprotegido sob condições adequadas para formar uma ligação amida entre o grupo carbóxi "a" livre ou ativado, opcionalmente ativado d uma sulfonamida de fórmula (Aa) e um grupo amino do ingrediente farmacêutico ativo possuindo um terminal C protegido ou não protegido;
[0589] (c) opcionalmente remover um ou ambos grupos de proteção, por exemplo, remover ambos grupos de proteção.
[0590] Em algumas modalidades do processo, a combinação de s sendo 1, p sendo zero, n sendo zero, A sendo um átomo de oxigênio e t sendo 1 é excluída para a sulfonamida de fórmula (I), bem como para a sulfonamida de fórmula (Aa). Em algumas modalidades, s é zero para uma sulfonamida de fórmula (I), bem como para a sulfonamida de fórmula (Aa), em que os resíduos e índices restantes têm o significado conforme indicado acima para as fórmulas (I) e (Aa), respectivamente.
[0591] Também é possível preparar um conjugado como descrito aqui na seção C acima através de um processo que compreende:
[0592] prover uma sulfonamida de fórmula (Aa) em que Rx representa um grupo de ativação (Rx = grupo de ativação);
[0593] prover uma solução aquosa de um ingrediente farmacêutico ativo, em que a solução aquosa compreende opcionalmente um álcool;
[0594] contato da solução aquosa de b) com uma sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) de a); e
[0595] reagir uma sulfonamida de fórmula (Aa) com o ingrediente farmacêutico ativo, obtendo uma solução compreendendo o conjugado da sulfonamida e do ingrediente farmacêutico ativo, em que a sulfonamida é ligada covalentemente ao ingrediente farmacêutico ativo.
[0596] Nesse processo, o ingrediente farmacêutico ativo é opcionalmente um polipeptídeo de insulina possuindo um grupo amino livre, opcionalmente um análogo de insulina como na Seção A acima ou um precursor do mesmo, cada um possuindo um grupo amino livre, em que o precursor do análogo de insulina compreende um peptídeo ligante adicional que tem um comprimento de pelo menos dois aminoácidos ou um comprimento na faixa de 2 a 30 aminoácidos ou um comprimento na faixa de 4 a 9 aminoácidos. Neste processo, a solução aquosa provida em a) tem um valor de pH na faixa de 9 a 12 ou na faixa de 9,5 a 11,5 ou na faixa de 10 a 11, em que o valor do pH é determinado com um eletrodo de vidro sensível ao pH de acordo com ASTM E 70:2007; em que o valor do pH é opcionalmente ajustado na respectiva faixa pela adição de uma base, ou uma base selecionada do grupo consistindo em hidróxidos alcalinos (hidróxido de lítio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), alquilaminas e misturas de dois ou mais dos mesmos; ou selecionada do grupo de alquil aminas terciárias N(C1-C5 alquila)3, alquil aminas primárias H2N-C(C1-
C5 alquila)3 e misturas de duas ou mais das mesmas, em que os grupos C1-C5 alquila das aminas terciárias e das aminas primárias são, cada um, independentemente selecionados de grupos C1-C5 alquila ramificados ou retos e em que cada grupo C1-C5 alquila tem pelo menos um substituinte selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, grupo hidroxila e grupo carboxila; ou selecionado do grupo de alquil aminas terciárias N(C1-C3 alquila)3, alquil aminas primárias H2N-C(C1-C3 alquil)3 e misturas de duas ou mais das mesmas, em que os grupos C1-C3 alquila das aminas terciárias e das aminas primárias são, cada uma, independentemente selecionadas de grupos C1-C3 alquila lineares ou ramificados e em que cada grupo C1-C3 alquila tem pelo menos um substituinte selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, grupo hidroxila e grupo carboxila; ou selecionado do grupo de bicina, trimetilamina, tris(hidroximetil)aminometano e misturas de dois ou mais dos mesmos; em que a base compreende opcionalmente pelo menos trietilamina.
[0597] Em uma variante deste processo, contato da solução aquosa de b) com a sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) de a) de acordo com a etapa c) é feito em que a sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) de a) é adicionada como uma solução da sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) à solução aquosa de b), em que a solução da sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) é opcionalmente uma solução orgânica, opcionalmente uma solução compreendendo a sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) e um solvente orgânico aprótico polar, opcionalmente um solvente orgânico aprótico polar possuindo um coeficiente de divisão octanol-água (KOW ) na faixa de 1 a 5 ou na faixa de 2 a 4 em condições padrão (T: 20-25 °C, p: 1013 mbar); ou selecionado do grupo consistindo em tetra-hidrofurano, acetonitrila, dimetilformamida e misturas de dois ou mais dos mesmos; ou selecionado do grupo de tetra-hidrofurano, acetonitrila e misturas de tetra-hidrofurano e acetonitrila.
[0598] Em uma variante deste processo, contato da solução aquosa de b) com a sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) de a) de acordo com a etapa c) é feito em que a sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) de a) é adicionada em forma sólida à solução aquosa de b), ou pelo menos parcialmente em forma cristalina ou pelo menos 90% em peso em forma cristalina.
[0599] Neste processo, a etapa d) compreende opcionalmente: d.1) reagir a sulfonamida de fórmula (Aa) (Rx = grupo de ativação) com um precursor do análogo de insulina em um pH na faixa de 9 a 12 ou na faixa de 9,5 a 11.5 ou na faixa de 10 a 11, obtendo um pré- conjugado compreendendo a sulfonamida de fórmula (I) e o precursor do análogo de insulina, em que a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao precursor de análogo de insulina por uma ligação amida C (=O)-NH- formada entre –C(=O)-O(R) da sulfonamida de Fórmula (I) e o grupo amino do precursor do análogo de insulina; d.2) digestão enzimática, opcionalmente em um pH na faixa abaixo de 9, ou em um pH na faixa de 7 a 9, do precursor do análogo de insulina do pré-conjugado obtido de acordo com d.1), obter uma solução compreendendo o conjugado de uma sulfonamida de fórmula (I) e o análogo de insulina. O processo compreende opcionalmente ainda: e) isolar o conjugado da sulfonamida de fórmula (I) e do análogo de insulina da solução obtida em d) ou d.2).
[0600] Neste processo, o grupo de ativação Rx de uma sulfonamida de fórmula (Aa) é opcionalmente selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N-succinimidila, em que Rx é mais opcionalmente um grupo N-succinimidila.
[0601] Em uma variante deste processo, a solução aquosa do precursor do análogo de insulina de acordo com b) compreende um álcool que é selecionado do grupo consistindo em monoálcoois C1-C4 e misturas de dois ou mais dos mesmos ou do grupo consistindo em metanol, etanol, propan-2-ol, propan-1-ol, butan-1-ol e misturas de dois ou mais dos mesmos ou do grupo consistindo em etanol, propan- 2-ol, propan-1-ol e misturas de dois ou mais dos mesmos. Opcionalmente, o álcool está presente na solução aquosa em uma quantidade na faixa de 0,0001 a 35% em volume ou na faixa de 0,001 a 30% em volume ou na faixa de 0,01 a 25% em volume ou na faixa de 0,1 a 20% em volume, cada um com base no volume total de água e álcool. Neste processo, a digestão enzimática de acordo com d.2) compreende uso de pelo menos uma enzima selecionada do grupo consistindo em tripsina, uma protease TEV (protease do vírus da necrose do tabaco) e misturas de duas ou mais destas. Neste processo, o análogo da insulina é um análogo da insulina como descrito na seção A acima e/ou na seção C acima. Neste processo, a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao análogo de insulina e ao seu precursor, respectivamente, por uma ligação amida C(=O)-NH- formada entre o –C(=O)-O(R3) de uma sulfonamida de fórmula (I) e o grupo amino livre do análogo de insulina e seu precursor, respectivamente, em que o grupo amino livre do análogo de insulina e seu precursor, respectivamente, é opcionalmente o grupo amino de uma lisina compreendida no análogo de insulina e o seu precursor, respectivamente, opcionalmente uma lisina terminal, opcionalmente uma lisina presente em um terminal C do análogo da insulina e o seu precursor, respectivamente, opcionalmente uma lisina presente no terminal C da cadeia B.
[0602] São providos aqui processos para preparação de um conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um composto de diagnóstico, em que o composto de diagnóstico é covalentemente ligado a um grupo funcional adequado a um grupo carbóxi "a" livre ou ativado, opcionalmente ativado, da sulfonamida de fórmula (Aa) de acordo com o método descrito acima para a ligação com o ingrediente farmacêutico ativo.
[0603] São providos aqui conjugados compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo ou um composto de diagnóstico obtido ou obtenível a partir dos processos descritos acima.
[0604] São providas aqui composições farmacêuticas compreendendo em uma quantidade farmaceuticamente ou diagnosticamente eficaz o conjugado que compreende uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo ou um composto de diagnóstico como descrito acima.
[0605] São providos aqui conjugados compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo como descrito acima para uso como um medicamento.
[0606] Uma modalidade se refere ao conjugado que compreende uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo como descrito acima para uso como um medicamento para tratamento de uma doença selecionada do grupo consistindo em diabetes gestacional, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e hiperglicemia e/ou para redução dos níveis de glicose no sangue. Em algumas modalidades, a doença é diabetes mellitus tipo 2.
[0607] São providos aqui métodos de tratamento de um paciente sofrendo de uma doença selecionada do grupo consistindo em diabetes gestacional, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e hiperglicemia e/ou com necessidade diminuir os níveis de glicose no sangue; compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo como descrito acima.
[0608] São providos aqui usos do conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um ingrediente farmacêutico ativo como descrito acima para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença selecionada do grupo consistindo em diabetes gestacional, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e hiperglicemia e/ou para redução de níveis de glicose no sangue.
[0609] São providos aqui conjugados compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um composto de diagnóstico como descrito acima para uso como um agente de diagnóstico.
[0610] São providos aqui métodos de diagnóstico de uma doença, por exemplo, uma doença selecionada do grupo de doenças cardiovasculares e cânceres, em um paciente ou para determinar o risco de um paciente desenvolver uma doença, por exemplo, uma doença selecionada do grupo de doenças cardiovasculares e cânceres, compreendendo administrar uma quantidade eficaz para o diagnóstico do conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um composto de diagnóstico como descrito acima.
[0611] São providos aqui usos do conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um composto de diagnóstico como descrito acima para a fabricação de um agente de diagnóstico para o diagnóstico de uma doença, por exemplo, uma doença selecionada do grupo de doenças cardiovasculares e cânceres.
[0612] As composições, composições farmacêuticas e usos como descritos na seção C são ilustrados ainda pelas modalidades e combinações de modalidades que seguem, conforme indicado pelas respectivas dependências e referências anteriores. As definições e explicações dadas acima nas seções A, B e C se aplicam mutatis mutandis às modalidades que seguem.
[0613] 1. Um conjugado compreendendo um análogo de insulina e uma sulfonamida de fórmula (I)
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (I)
[0614] em que:
[0615] A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo -CH2O-;
[0616] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0617] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0618] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17;
[0619] n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3;
[0620] p é zero ou 1;
[0621] q é zero ou 1;
[0622] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0623] s é zero ou 1;
[0624] t é zero ou 1;
[0625] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0626] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado
[0627] em que a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao análogo de insulina pelo fato que o grupo carbóxi terminal “a” da sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada a um grupo amino do análogo de insulina.
[0628] 2. O conjugado de acordo com a modalidade 1, em que a sulfonamida tem a fórmula (I-1)
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2
O R S H q
E N O O O HO p O Ph H N m (I-1)
[0629] em que:
[0630] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0631] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0632] p é zero ou 1;
[0633] q é zero ou 1;
[0634] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0635] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio e átomo de halogênio;
[0636] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0637] com m sendo um número inteiro na faixa de 5 a 15 se p for zero ou m sendo um número inteiro na faixa de 7 a 15 se p for 1.
[0638] 3. O conjugado de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-1)
O
H H Hal N N a OH O O X N r O 2 O 2
O H q
S O O O
N N HO m O Ph H (I-1-1)
[0639] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo –CH-; m é um número inteiro na faixa de 7 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1; Hal é um átomo de halogênio selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo; e o grupo HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O- está situado em posição meta ou para em anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
[0640] 4. O conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-1a)
O O O
O O N N 2 N 2 a OH
O O H H F S O N N
H HO 13 O (I-1-1a)
[0641] 5. O conjugado de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-2)
O
H H N N a OH O O X N r O 2 O 2 q
O S H O
N O O O Ph H N
HO m (I-1-2)
[0642] em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-; m é um número inteiro na faixa de 5 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1; e o grupo HOOC-(CH2)m-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2- p.
[0643] 6. O conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 2 ou 5, em que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-2a)
O O O O
O O O 15 N N 2 N 2 a OH
HO H H H N
S N O O (I-1-2a)
[0644] ou a fórmula (I-1-2b)
O O O H H a OH
N N N HO 15 N 5 O 2 O 2
H H N O O O
S N O O (I-1-2b)
[0645] ou a fórmula (I-1-2c)
O O O O
O O O 15 N 2 N 2 a OH
HO H H H N
S N O O (I-1-2c)
[0646] 7. O conjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação em posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e, opcionalmente, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição A14 que é substituída por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His) e/ou uma mutação na posição B30.
[0647] 8. O conjugado de acordo com a modalidade 7, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
[0648] 9. O conjugado de acordo com as modalidades 7 e 8, em que o aminoácido hidrofóbico é um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
[0649] 10. O conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o análogo de insulina é selecionado de
[0650] Leu(B16)-insulina humana,
[0651] Val(B16)-insulina humana,
[0652] Ile(B16)-insulina humana,
[0653] Leu(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0654] Val(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0655] Ile(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0656] Leu(B25)-insulina humana,
[0657] Val(B25)-insulina humana,
[0658] Ile(B25)-insulina humana,
[0659] Leu(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0660] Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0661] Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0662] Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0663] Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0664] Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina humana,
[0665] Glu(A14)Leu(B16)-insulina humana,
[0666] Glu(A14)Ile(B16)-insulina humana,
[0667] Glu(A14)Val(B16)-insulina humana,
[0668] Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0669] Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0670] Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0671] Glu(A14)Leu(B25)-insulina humana,
[0672] Glu(A14)Ile(B25)-insulina humana,
[0673] Glu(A14)Val(B25)-insulina humana,
[0674] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0675] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0676] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0677] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0678] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina humana,
[0679] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0680] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0681] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
[0682] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina humana,
[0683] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina humana,
[0684] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana,
[0685] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana,
[0686] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana,
[0687] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana,
[0688] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina humana,
[0689] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina humana,
[0690] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana, e
[0691] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana.
[0692] 11. O conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que o análogo de insulina compreende
[0693] uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK),
[0694] uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), ou
[0695] uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[0696] 12. O conjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que o grupo amino do análogo da insulina, ao qual uma sulfonamida de fórmula (I) está ligada covalentemente, é um grupo épsilon amino de uma lisina presente no análogo de insulina ou é o grupo amino N-terminal da cadeia B da insulina ou análogo da insulina.
[0697] 13. O conjugado de acordo com a modalidade 12, em que o grupo amino é o grupo épsilon amino da lisina presente na posição B29 da cadeia B.
[0698] 14. O conjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que o conjugado é o conjugado 1 (sequência da cadeia A: SEQ
ID NO: 47; sequência da cadeia B: SEQ ID NO: 48):
[0699] ou
[0700] conjugado 3 (sequência de cadeia A: SEQ ID NO: 77; sequência de cadeia B: SEQ ID NO: 78):
[0701] ou
[0702] conjugado 4 (sequência de cadeia A: SEQ ID NO: 43; sequência de cadeia B: SEQ ID NO: 44):
[0703] 15. Um processo para preparação de um conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (I) em que na sulfonamida de fórmula (I):
[0704] A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo –CH2O-;
[0705] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo, opcionalmente um átomo de flúor;
[0706] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0707] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17;
[0708] n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3;
[0709] p é zero ou 1;
[0710] q é zero ou 1;
[0711] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0712] s é zero ou 1;
[0713] t é zero ou 1;
[0714] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0715] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0716] em que a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao ingrediente farmacêutico ativo pelo fato que o grupo carbóxi terminal “a” de uma sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligado a um grupo amino do ingrediente farmacêutico ativo;
[0717] compreendendo:
[0718] prover uma sulfonamida de fórmula (Aa)
O 2
R H H N N a ORx 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s O m (E)p n A t
R 3 (Aa)
[0719] em que X, Y, A, E, R1, R2 e os índices m, n, p, q, r, s, t têm o significado como definido na modalidade 1, Rx é um átomo de hidrogênio ou um grupo de ativação, opcionalmente um grupo de ativação selecionado do grupo consistindo em grupo 7-azabenzotriazol (opcionalmente derivado de HATU ou HBTU), 4-nitro benzeno ou N- succinimidila, em que Rx é opcionalmente um grupo N-succinimidila; e R3 é um grupo protetor ou um átomo de hidrogênio, opcionalmente um átomo de hidrogênio; e um análogo de insulina possuindo um terminal C protegido ou não protegido;
[0720] reagir a sulfonamida de fórmula (Aa) e o análogo de insulina possuindo um terminal C protegido ou não protegido sob condições adequadas para formar uma ligação amida entre o grupo carbóxi "a" livre ou ativado, opcionalmente ativado, da uma sulfonamida de fórmula (Aa) e um grupo amino do análogo de insulina possuindo um terminal C protegido ou não protegido;
[0721] opcionalmente remover um ou ambos grupos de proteção.
[0722] 16. Um conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina obtido ou obtenível a partir do processo de acordo com a modalidade 15.
[0723] 17. Composição farmacêutica compreendendo em uma quantidade farmaceuticamente eficaz o conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15 ou de acordo com a modalidade 16.
[0724] 18. O conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15 ou de acordo com a modalidade 16 para uso como um medicamento.
[0725] 19. O conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 15 ou de acordo com a modalidade 16 para uso como um medicamento para o tratamento de uma doença selecionada do grupo consistindo em diabetes gestacional, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e hiperglicemia e/ou para redução dos níveis de glicose no sangue.
[0726] 20. Método de tratamento de uma doença selecionada do grupo consistindo em diabetes gestacional, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e hiperglicemia e/ou para redução dos níveis de glicose no sangue compreendendo administrar a um paciente com necessidade do mesmo um conjugado compreendendo um análogo de insulina e uma sulfonamida de fórmula (I)
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (I)
[0727] em que:
[0728] A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo -CH2O-;
[0729] E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo;
[0730] X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-;
[0731] m é um número inteiro na faixa de 5 a 17;
[0732] n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3;
[0733] p é zero ou 1;
[0734] q é zero ou 1;
[0735] r é um número inteiro na faixa de 1 a 6;
[0736] s é zero ou 1;
[0737] t é zero ou 1;
[0738] R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado;
[0739] R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado,
[0740] em que a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada ao análogo de insulina pelo fato que o grupo carbóxi terminal “a” de uma sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligado a um grupo amino do análogo de insulina,
[0741] dessa maneira tratando a doença.
[0742] A presente invenção é ilustrada mais pelos exemplos que seguem.
[0743] Exemplos
1. Lista de abreviações usadas: Ac Acetila Boc terc-Butiloxicarbonila DCM Diclorometano DIAD Azodicarboxilato de di-isopropila DIPEA N,N-di-isopropiletilamina DMAP 4-Dimetilaminopiridina DMF Dimetilformamida DMSO Sulfóxido de dimetila EA Acetato de etila HMPA Hexametilfosforamida HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho LC Cromatografia líquida LCMS Cromatografia líquida/espectrometria de massa MeCN MeCN NMM N-metilmorfolina NMP N-metil-2-pirrolidona PE Éter de petróleo
RP Fase reversa RT Temperatura ambiente (25 °C) TEA Trietilamina TEMPO 2,2,6,6-Tetrametilpiperidino-N-óxido TFA Ácido trifluoracético TFAA Anidrido trifluoracético TMS Trimetil silila Ts Tosila TSTU Tetrafluorborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N,N-tetrametilurônio
[0744] Os processos gerais adequados para preparação de compostos da fórmula (I) são descritos abaixo. Os compostos da fórmula I foram preparados através de processos químicos diferentes. Os grupos e índices mencionados nos métodos que seguem, especialmente nos esquemas, têm o significado mencionado acima indicado para a fórmula (I), a menos que sejam explicitamente definidos de outra forma.
[0745] 2. Síntese geral dos compostos de fórmula (I)
[0746] Os compostos da fórmula (I) foram sintetizados a partir do intermediário I correspondente (esquema 1). Após a ativação com TSTU, o intermediário I foi acoplado ao aminoácido (4) (etapa 3) ou ao composto (2) (etapa 2) para dar as espécies (3) e (6), respectivamente. No caso da etapa 3, foi usado um éster de alquila (R = alquila), saponificação com LiOH foi obtida. Ambos ácidos carboxílicos (6) e (7) foram ativados com TSTU e acoplados com (2) para produzir a espécie (3). Para terminar a síntese dos compostos da fórmula (I), o éster de terc-butila de (3) foi clivado na etapa final 7 através de tratamento com CF3CO2H. A síntese do intermediário I é mostrada no esquema 2.
O O
OR O O X OH X N r
O O H
S S O N TSTU step3etapa 3 N
O H N O H N (Q)s OR (Q)s O m (E)p n (A)t H 2N r O m n (A)t (6) (E)p (4) O Intermediate I Intermediário I O R = alkyl R = OH step6
H O TSTU TSTU O OH step4 R = alquila
O N O H 2N O O OH H O LiOH
N O step2 etapa 4 O (2) O O O O (2) OH H 2N O O X N r etapa 2 O O X Y H
S S O
N N N TSTU step5 O H N
O H (Q)s (Q)s O m n (A)t (3) H O O m (E)p n (A)t (E)p H 2N O N etapa 5O (7)
O O OH
O (2) step7 CF3CO2H
O O H
N O O OH N r O N O
O O X Y H H
O O etapa 7 S
N O H N or Y= (Q)s HO m (E)p n (A) t O
H O N O N O O OH (I) H O
[0747] Esquema 1
[0748] 2.1 Síntese geral de intermediário I
[0749] O intermediário I foi sintetizado como mostrado no esquema 2. A partir do Brometo I ou Tosilato I, a alquilação do intermediário III foi obtida na presença de K2CO3 (etapa 8). Alternativamente, a espécie (8) foi isolada após uma sequência de reações começando com uma reação Sonogashira da alcina I e intermediário II (etapa 11) seguido por uma hidrogenação do (11) resultante sob uma atmosfera de hidrogênio catalisada por paládio e platina, respectivamente (etapa 12). A espécie (8) foi então condensada ou com 2-cloro piridina (9) (etapa 9) em uma reação catalisada por paládio ou termicamente condensada com 2-cloro pirimidina (10) (etapa 10). Em ambos os casos, o éster de alquila foi subsequentemente hidrolisado com LiOH para obter o intermediário I.
O O O OH S N
O H N (Q)s Intermediário II Intermediate O m (E)p n (A)t
O etapa 9 X OMe step9 Cl N (9) X = CH2 Intermediário III "Pd", Cs2CO 3; Intermediate III O O LiOH
S H NH2 O O
O O S (Q)s S NH 2 O (E)p n (A)t NH 2 hidrogenação
O O hydrogenation X (Q)s (E)p n (A)t O m O m n (A)t O (E)p m-2 K2CO3 step8 step12 etapa 12 Bromide I; X=Br etapa 8 (8) (11) Bromo I; X=Br etapa 11
O Tosylate Tosilato I; X=OTs I; X=OTs s=1 step11 X OMe O Sonogashira X=N Cl N (10) O m-2
O O step10 etapa 10 Cs Cs22CO3 , , heat; CO alkyne S 3 O alcina I I aquecimento; LiOH LiOH NH 2 O O N OH Br/I (E)p n (A)t
S
N O H N Intermediate Intermediário II II (Q)s O m (E)p n (A)t s=0 Intermediário I Intermediate I
[0750] Esquema 2
[0751] 2.2 Síntese geral de intermediário II
[0752] Como mostrado no esquema 3, o intermediário II foi isolado após uma reação Mitsunobu de fenol (13) e álcool (12) (etapa 13). Alternativamente, o intermediário II foi sintetizado por meio de alquilação de fenol (13) (etapa 14) ou fenol (15) (etapa 15) na presença de K2CO3. Os agentes de alquilação adequados foram (14) e (16), respectivamente. Substituição nucleofílica aromática de fluoreto (18) por fenol (17) também proveu o intermediário II (etapa 16).
Br/I (E)p n Br (14)
O O A= O S t=1 NH 2 K2CO3 HO (13) step14 A= O etapa 14 t=1 A= O n= 0 t=1 O O etapa 16 step16 S Ar-Sn step13 etapa 13 NH2 Mitsunobu K2CO3 Br/I A Br/I Br/I (E)p (E)p n OH n (A)t (E)p O O
O O (12) S S (17) NH 2 Intermediário Intermediate II II NH 2 HO (13) F n= 0 (18) A = OCH 2
O O
S t=1 NH2 Br K2CO3 (16) etapa 15 step15 Br/I OH (E)p (15)
[0753] Esquema 3
[0754] 2.3 Síntese geral de intermediário III
[0755] O intermediário III foi obtido após uma sequência de reação linear como descrito no esquema 4. Começando com uma alquilação de alcina (20) com brometo (19), a alcina protegida com TMS (21) foi isolada. A alcina (21) foi desprotegida sob condições básicas usando NaOH. A reação de Sonogashira subsequente da alcina isolada (22) com um haleto aromático correspondente (23) (etapa 19) proveu a espécie (24). Um grupo de proteção adequado para a espécie (24) foi, por exemplo, acetila (PG = Ac), que foi clivado após tratamento com NaOH (etapa 20). A etapa final de hidrogenação 21 foi catalisada por paládio ou platina sob uma atmosfera de H2 para prover o intermediário III desejado.
etapa 19
PG A=CH2CH step19
O O O O O O O O A =CH etapa 17 2CH 2 (Q)s (24) tms S S Sonogashira (E)p S step17 NaOH NH 2 S NH2 NH2 NH2 * * * n PG Br * n step18 n n TMS etapa 18 (23) (22) (Q)s Br/I (19) (20) (21) (E)p etapastep20 20 deprotection; desproteção;
PGPG = Ac; NaOH = Ac; NaOH
O O H S hidrogenação H NH 2 hydrogenation (Q)s O O (E)p S (Q)s NH2 (E)p n (A)t step21 * etapa 21 n intermediate III (25)
[0756] Esquema 4
[0757] 2.4 Síntese geral de alcina I e brometo I
[0758] Os materiais de partida brometo I e alcina I foram sintetizados como mostrado no esquema 5. Para alcina I foram utilizadas duas vias sintéticas diferentes. Ácido carboxílico (28) foi isolado ou após a oxidação de álcool (29)- a oxidação mencionada foi obtida através de uma mistura de NaOCl e NaClO2 na presença de uma quantidade catalítica de TEMPO (etapa 24)- ou através de uma sequência de alquilação/desproteção de brometo (26). Para a alquilação, reagente (20) foi usado. O produto isolado (27) foi então tratado com NaOH para clivar o grupo de proteção TMS. A proteção necessária de ácido carboxílico (28) como um éster de terc-butila para obter a alcina I desejada foi obtida após ativação com (CF3CO)2O e reação com terc-butanol.
[0759] Para a síntese de brometo I, uma sequência similar à descrita para a conversão de (29) em alcina I foi usada (etapas 24 e 25). Oxidação do álcool (30) e proteção subsequente do ácido carboxílico resultante (31) produziram o brometo I desejado.
[0760] O tosilato I pode ser sintetizado através de tosilação do álcool (33) (etapa 29). (33) foi isolado após uma redução do ácido carboxílico (32), que foi transferido in situ para o anidrido misto e subsequentemente reduzido com NaBH4 (etapa 28).
(CF3CO)2O (20) O O Si O Si NaOH tBuOH
O Br HO O HO m-2 m-2 HO m-2 step23 step25 m-2 step22 etapa 23 etapa 25 (28) alkyne alcina I I etapa 22 (26) (27) NaOCl NaClO2 step24 etapa 24
TEMPO
HO (29) NaOCl NaClO2 (CF3CO)2O
O O TEMPO tBuOH Br Br Br HO m HO m O m step26 etapa 26 etapa 27 step27 bromo I (30) (31) bromide I
NMM O O ClCOOEt O TsCl O NaBH4 TEA O OH O OH O OTs m-1 m-1 m-1 step28 step29 etapa 29 (32) etapa 28 (33) Tosylate Tosilato I I
[0761] Esquema 5
[0762] 2.5 Exemplos para a síntese de alcinas I e brometos I de acordo com o esquema 5 NaClO4 ,TEMPO O NaClO2 HO 10 Br HO 10 Br Tampão pH=4 Buffer pH=4 CH3CNt CH3CN t THF, n-BuLi
TMS HMPA, -78oC,0.5 o h 0 C até TA, 15oC HMPA,0 h to RT, 15h O Si O NaOH, THF HO 9 RT ,3h HO 9 (Boc)2O,DMAP t-BuOH TA, de um dia para o outro RT, overnight
O O 9
[0763] 2.5.1 Síntese de ácido 12-bromododecanoicoo
NaOCl ,TEMPO O NaClO2 HO 10 Br HO 10 Br Tampão pH=4 Buffer pH=4 CH3CNt CH3CN t
[0764] Uma solução de NaClO2 (37,5 g, 414,8 mmol) em H2O (60 ml) e uma solução de NaOCl a 10% (28 g, 37,7 mmol) foram simultaneamente adicionadas a uma solução de 12-bromo-dodecan-1- ol (20 g, 75,4 mmol) e TEMPO (5,9 g, 37,7 mmol) em CH3CN (400 ml) e solução tampão de pH 4 (60 ml). A mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro. A mistura foi diluída com EA (1200 ml), lavada com água (1000 ml) e salmoura, seca em Na2SO4 e concentrada sob vácuo para obter o produto desejado ácido 12- bromododecanoicoo (20 g, 71,6 mmol, rendimento, 95%) como um sólido amarelo. 1
[0765] H RMN (400 MHz, DMSO) δ 11,96 (s, 1H), 3,52 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,18 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,85 – 1,72 (m, 2H), 1,55 – 1,43 (m, 2H), 1,37 (s, 2H), 1,21 (d, J = 32,6 Hz, 12H).
[0766] Os compostos que seguem foram sintetizados desta maneira:
O HO 12 Br Ácido 14-bromotetradecanoico
[0767] 2.5.2 Síntese de ácido 14-(trimetilsilil)tetradec-13-inoico O THF, n-BuLi O Si
TMS -78oC,0.5 h HO 10 Br HO 9 HMPA, 0o C até HMPA,0 oCTA, to 15h RT, 15h
[0768] A uma mistura de etinil-trimetil-silano (63,3 g, 644,7 mmol) em THF (300 ml), n-butil-lítio (2,5M em hexano) (258 ml, 644,7 mmol) foi adicionado a -78oC sob N2. Após 10 min, HMPA (115,5 g, 644,7 mmol) foi adicionado e a mistura foi aquecida para 0oC por 30 min. Então foi adicionado ácido 12-bromododecanoicoo (30 g, 107,45 mmol) em THF (300 mL). Então mistura foi agitada em RT de um dia para o outro. Água (1200 ml) foi adicionada à mistura lentamente a 0oC, então o valor do pH foi ajustado para 3 com solução aquosa de HCl, extraída com EA (800 ml). A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca em Na2SO4, concentrada sob vácuo para prover o produto bruto ácido 14-(trimetilsilil)tetradec-13-inoico (35g) como um óleo marrom e usado para a próxima etapa.
[0769] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo: O Si O Si O Si HO 7 HO 13 HO 3 ácido 18-trimetilsililoctadec- ácido 12- ácido 8-trimetilsililoct-7-inoico 17-inoico trimetilsilildodec-11- inoico
[0770] 2.5.3 Síntese de ácido tetradec-13-inoico O Si O NaOH, THF HO 9 RT ,3h HO 9
[0771] NaOH (8,6g, 214,9 mmol) foi adicionado a uma mistura de ácido 14-(trimetilsilil)tetradec-13-inoico (35 g, 107,45 mmol) em H2O (150 ml) e THF (150 ml). Então a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 3h. Então o valor do pH foi ajustado para 4 com solução aquosa de HCl, extraído com EA (2 x 300 ml). As fases orgânicas foram lavadas com salmoura, secas em Na2SO4 e concentradas sob vácuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em gel de sílica (PE: EA = 4: 1) para obter o produto desejado ácido tetradec- 13-inoico (23 g, 102,5 mmol, rendimento de 2 etapas: 95%) como um sólido amarelo. 1
[0772] H RMN (400 MHz, DMSO) δ 11,96 (s, 1H), 2,73 (s, 1H), 2,17 (dd, J = 16,3, 8,9 Hz, 4H), 1,51 – 1,21 (m, 18H).
[0773] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O O HO 13 HO 7 HO 3 ácido cido octadec-17-inoico ácido cido dodec-11- ácido cido oct-7-inoico inoico
[0774] 2.5.4 Síntese de ácido dec-9-inoico NaClO(10%)(0.5 NaClO (10%) (0,5 eq.) eq) TEMPO(0.5 TEMPO (0,5 eq.) eq) NaClO NAClO 2(5.5 eq) 2 (5,5 eq.) O
HO HO Tampão pH=4 pH=4 Buffer CH3CN,CH TA,CN, de um diaovernight RT, para o outro 3
[0775] Uma solução de NaClO2 (48,2 g, 536 mmol) e NaOCl (36,0 g, 48,7 mmol) foi simultaneamente adicionada a uma solução de dec- 9-in-1-ol (15 g, 97,4 mmol) e TEMPO (7,6 g, 48,7 mmol) em CH3CN (300 ml) e solução tampão de pH 4 (75 ml). A mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro, diluída com EA (900 mL), lavada com água (900 mL) e salmoura, seca em Na2SO4, concentrada sob vácuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em gel de sílica (PE/EA = 1/1) para prover o ácido dec-9-inoico desejado (20 g, bruto) como um óleo incolor. 1
[0776] H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 2,36 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,18 (td, J = 6,9, 2,3 Hz, 2H), 1,93 (t, J = 2,3 Hz, 1H), 1,72 – 1,59 (m, 2H), 1,54 (td, J = 14,1, 7,2 Hz, 2H), 1,48 – 1,30 (m, 6H) ppm.
[0777] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O HO 11 ácido cido hexadec-15-inoico
[0778] 2.5.5 Síntese de tetradec-13-inoato de terc-butila
(Boc)2O,DMAP t-BuOH O RT, overnight O HO 9 O 9
[0779] (Boc)2O (33,6 g, 153,8 mmol) e DMAP (3,7 g, 30,7 mmol) foram adicionados a uma mistura de ácido tetradec-13-inoico (23 g, 102,5 mmol) em t-BuOH (200 ml). Então a mistura foi agitada em RT de um dia para o outro. O solvente foi removido sob vácuo. Água (400 ml) foi adicionada à mistura e extraída com EA (400 ml). A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca em Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia em gel de sílica (PE:EA=30:1) para dar o produto desejado tetradec-13-inoato de terc-butila (23,5g, 83,8 mmol, 82% de rendimento) como um líquido amarelo. 1
[0780] H RMN (400 MHz, DMSO) δ 2,72 (s, 1H), 2,15 (d, J = 8,4 Hz, 4H), 1,49 – 1,21 (m, 27H).
[0781] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O O O 13 O 7 O 11 octadec-17-inoato de terc- dodec-11-inoato de terc- hexadec-15-inoato de terc- butila butila butila
O O O 3 O 5 oct-7-inoato de terc-butila dec-9-inoato de terc-butila
[0782] 2.5.6 Síntese de 6-bromoexanoato de terc-butila TFAA, THF; O O t BuOH, RT Br Br
OH O
[0783] Ácido 6-bromoexanoico (6,0 g, 31 mmol), TFAA (26,0 g, 124 mmol) foi adicionado a THF (60 mL), a mistura reagiu em RT por 1 h. Então terc-butanol (30 mL) foi adicionado à mistura e agitado por 16 horas em RT. Então o pH da mistura de reação foi adaptado a pH=8 com solução de NaHCO3, a mistura foi extraída com EA (3 x 150 ml), seca em Na2SO4, concentrada para prover o composto-alvo 6- bromoexanoato terc-butila (7,6 g, 30,4 mmol, rendimento de 98%). 1
[0784] H RMN (400 MHz, DMSO) δ 3,52 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,20 (dd, J = 15,0, 7,8 Hz, 2H), 1,85 – 1,74 (m, 2H), 1,52 (ddd, J = 19,3,
10.9, 5,7 Hz, 2H), 1,44 – 1,32 (m, 9H).
[0785] 2.5.6 Síntese de tosilatos I
NMM O O ClCOOEt O TsCl O NaBH4 O
TEA
S O 16 OH O 16 OH O 16 O O
[0786] 2.5.7 Síntese de 18-hidroxioctadecanoato de terc-butila
NMM O O ClCOOEt O NaBH4 O 16 OH O 16 OH
[0787] N-metilmorfolina (1638 mg, 16,5 mmol) foi adicionada a uma solução de ácido 18-terc-butóxi-18-oxo-octadecanoico (5 g, 13,5 mmol) em THF (150 ml). A mistura foi arrefecida para -25 °C antes de adicionar cloroformato de etila (1277 mg, 13,5 mmol) em gotas. A mistura foi agitada a -25 °C por 20 minutos e o sólido foi removido através de filtragem. A solução foi adicionada cuidadosamente a uma solução de NaBH4 (770 mg, 20,25 mmol) em água (15 mL) a 0°C. A mistura foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. THF foi removido sob vácuo e a fase aquosa foi extraída com EA (3 x 50 mL). As fases orgânicas combinadas foram secas em MgSO4 e concentradas sob vácuo para prover 18-hidroxioctadecanoato de terc- butila como um sólido branco (4,7 g, 99,8% de rendimento). 1
[0788] H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 3,63 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,19 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,57 (dd, J = 13,0, 6,5 Hz, 4H), 1,43 (d, J = 3,9 Hz, 9H), 1,38 – 1,20 (m, 27H).
[0789] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O 18 OH 20-hidróxi-icosanoate terc-butila
[0790] 2.5.8 Síntese de 18-(p-tolilsulfonilóxi)octadecanoato de terc- butila O TsCl O O
TEA
S O 16 OH O 16 O O
[0791] TEA (400 mg, 39,6 mmol) foi adicionado a uma solução de 18-hidroxioctadecanoato de terc-butila (4700 mg, 13,2 mmol) e TsCl (2508 mg, 13,2 mmol) em DCM (100 mL). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Água (50 mL) foi adicionada e extraída com DCM (2 x 50 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (100 mL), seca em Na2SO4, filtrada e concentrada. O produto bruto foi purificado através de coluna de gel de sílica (EA/n-hexano = 1:20) para prover 18-(p- tolilsulfonilóxi)octadecanoato de terc-butila (4,5g, 67% de rendimento). 1
[0792] H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,79 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,34 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 4,02 (t, J = 6 , 5 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,20 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,69 - 1,57 (m, 4H), 1,44 (s , 9H), 1,25 (t, J = 12,1 Hz, 24H).
O O O Br 9 O Br O 12 Br 13 O 12-bromododecanoato de 14-bromotetradecanoato 16-bromoexadecanoato de terc-butila de terc-butila terc-butila
[0793] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O
S O 18 O O 20-(p-tolilsulfonilóxi)icosanoato de terc-butila
[0794] 2.6 Exemplos para a Síntese de intermediários III de acordo com o esquema 4
O O O TMS K 2CO3 H2N S Br H2N S TMS H2N S MeOH O
O O I O
O Pd(PPh3)2Cl2, CuI, NEt3 ,DMF NaOH
O O THF, MeOH O HO S NH2 S NH 2
O
O O PtO2, H2 THF, MeOH
O H2N S
O OH
[0795] 2.6.1 Síntese de 4-((trimetilsilil)etinil)benzenossulfonamida
O O
TMS H2N S Br H2N S TMS
O O
[0796] Uma mistura de 4-bromobenzenossulfonamida (61 g, 260 mmol), trimetilsililacetileno (38,2 g, 0,09 mol), tetracis(trifenilfosfino)paládio (7,5 g, 6,5 mmol) e iodeto de cobre (2,5 g, 13 mmol) em trietilamina (500 ml) foi aquecida para 80oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante 8 h. A mistura foi concentrada a vácuo e extraída com EA (300 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas (Na2SO4) e concentradas sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em gel de sílica (eluindo com DCM 70%em PE) para obter 4-((trimetilsilil)etinil) benzenossulfonamida (50 g, 75%).
[0797] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA/H2O10 mM, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 2,0 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 90 % (214 nm); Massa: encontrar pico 254,0 (M + H)+ a 1,98 min.
[0798] 2.6.2 Síntese de 4-etinilbenzenossulfonamida
O O K2CO3 H2N S TMS H2N S MeOH O
O
[0799] 4-((Trimetilsilil)etinil)benzenossulfonamida (40 g, 158 mmol), K2CO3 (2,2 g, 15,8 mmol) e metanol (400 ml) foram agitados em temperatura ambiente por 12 h. Depois da reação ter sido terminada (monitorada através LCMS), diluída com água (200 ml) e extraída com EA (2x200 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas (Na2SO4) e concentradas sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em gel de sílica (eluindo com DCM 100% em PE) para prover 4-etinilbenzenossulfonamida (22 g, 77%).
[0800] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA/H2O10 mM, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 2,0 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 90 % (214 nm); Massa: encontrar pico 182,1 (M + H)+ a 1,65 min.
[0801] 2.6.3 Síntese de acetato de 4-((4-sulfamoilfenil)etinil)fenila
I O O O
O O O S NH2 H2N S Pd(PPh3)2Cl2, CuI, O
O NEt3 ,DMF
[0802] Pd(PPh3)2Cl2 (5,8 g, 8,3 mmol), CuI (1,6 g, 8,3 mmol), Et3N (25 g, 249 mmol) e acetato de (4-iodofenila) (27 g, 103 mmol) foram adicionados a uma mistura de 4-etinilbenzenossulfonamida (15 g, 83 mmol) em DMF (150 ml). O frasco foi evacuado e cheio com N2. Então a mistura foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Água (200 ml) foi adicionada à mistura, filtragem por sucção e secagem ao ar proveem acetato de 4-((4-sulfamoilfenil)etinil)fenila como um sólido marrom (18 g, 70%).
[0803] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA/H2O10 mM, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 2,0 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 90 % (214 nm); Massa: encontrar pico 338 (M + Na)+ a 1,88 min.
[0804] 2.6.4 Síntese de 4-((4-hidroxifenil)etinil)benzenossulfonamida
O
O O NaOH S NH2 HO S NH2
O THF, MeOH O
O
[0805] A 0oC, NaOH (4,5 g, 114 mmol) foi adicionado a uma solução de acetato de 4-((4-sulfamoilfenil)etinil)fenila (18 g, 57 mmol) em THF (60 ml), MeOH (60 ml ) e H2O (30 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 h. Depois da reação ter sido terminada (monitorada através de LCMS), a solução foi diluída com EA (50 mL) e lavada com água (20 mL) e NaCl aquoso saturado, seca em MgSO4. O filtrado foi concentrado a vácuo para prover o produto bruto. O produto bruto foi transformado em pasta fluida com DCM. Filtragem por sucção e secagem ao ar proveem 4-((4-hidroxifenil)etinil) benzenossulfonamida como um sólido marrom (10,9 g, 70%).
[0806] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA/H2O10 mM, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 2,0 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 95 % (214 nm); Massa: encontrar pico 296,1 (M + Na)+ em 1,75 min.
[0807] 2.6.5 Síntese de 4-(4-hidroxifenetil)benzenossulfonamida
O O PtO2, H2 H2N S HO S NH2 THF, MeOH O OH
O
[0808] PtO2 (1 g) foi adicionado a uma solução de 4-((4- hidroxifenil)etinil)benzenossulfonamida (10,9 g, 40 mmol) em 40 ml de THF e 40 ml de MeOH. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente sob H2 durante 24 horas. Depois da reação ter sido terminada (monitorada através de LCMS), a mistura foi então filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo para prover 4-(4- hidroxifenetil)-benzenossulfonamida (9,5 g, 86%).
[0809] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA/H2O10 mM, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 2,0 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 100 % (214 nm); Massa: encontrar pico 278,1 (M + H)+ a 1,67 min. 1
[0810] H RMN (400 MHz, DMSO) δ 9,14 (s, 1H), 7,71 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,00 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,72 – 6,60 (m, 2H), 2,96 – 2,84 (dd, J = 9,2, 6,2 Hz, 2H), 2,77 (dd, J = 9,2, 6,3 Hz, 2H).
[0811] 2.7 Exemplos para a Síntese de intermediários II de acordo com o esquema 3
[0812] 2.7.1 Síntese de 4-(3-bromo-4- fluorfenóxi)benzenossulfonamida
O O O
O F S K2CO3 F S NH2 NH2 + Br OH NMP, 190 oC, 5 h F Br O
[0813] Uma mistura de 3-bromo-4-flúor-fenol (12,8 g, 66,8 mmol), 4-fluorobenzeno sulfonamida (9,00 g, 51,4 mmol) e K2CO3 (14,2 g, 103 mmol) em NMP (50 ml) foi agitada a 190oC durante 5 h. A mistura de reação foi diluída com EA (500 ml), lavada com água (50 ml), salmoura (3 x 50 ml), seca em Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash em sílica gel (eluindo com PE/EA = 3/1) para prover 4-(3-bromo-4- fluorfenóxi)benzenossulfonamida como um sólido branco (10,8 g, 31,3 mmol, Rendimento de 61%).
[0814] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA/H2O2,5 mM, B = 2,5mM TFA/MeCN; Gradiente: B = 10%-95% em 1,0 min; Taxa de fluxo: 1,5 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 30  4,6mm, 2,5 um. LC (produto desejado) pureza: 88% (214 nm); Massa: encontrar pico 368,0 (M + Na)+ a 1,74 min.
[0815] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O Br S NH2
O 4-(4-bromofenóxi)benzenossulfonamida
[0816] 2.7.2 Síntese de 4-(4-bromofenetóxi)benzenossulfonamida
O O
S NH2
O O
OH HO S Br NH2 Br PPh3, DIAD, THF
O 0oC to RT, 15h
[0817] DIAD (11,1 g, 54,7 mmol) foi adicionado, a 0oC e em gotas, a uma solução de 2-(4-bromofenil)etanol (10 g, 49,8 mmol), 4- hidroxibenzeno sulfonamida (8,6 g, 49,8 mmol) e PPh3 (14,3 g, 54,795 mmol) em THF seco (200 ml). A reação foi deixada aquecer para temperatura ambiente com agitação por 20 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em EA (200 ml) e então lavado com água (50 ml) e salmoura (50 ml). A fase orgânica foi seca em Na2SO4. Após filtragem, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado através de cromatografia em coluna (sílica gel, eluindo com EA em PE de 0 a 40%) para obter 4-(4- bromofenetóxi)benzenossulfonamida (6,8 g como um sólido branco) com 39% de rendimento.
[0818] Método de LC-Massa: Fase móvel: H2O (TFA 0,01% (A)/MeCN (TFA 0,01%), (B); Gradiente: B 5 % por 0,2 min, aumentou para B 95%dentro de 1,3 min; Taxa de fluxo: 1,8 ml/min; Coluna: SunFire, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 95% (214 nm); Massa: encontrar pico 356 (M + H)+ a 2,08 min
[0819] 2.7.3 Esquema de síntese de 4-((4- iodofenóxi)metil)benzenossulfonamida
O O Cl NH2 S hidróxido dehydroxide amônio S ammonium
O O Br THF Br HO I Cs2CO3, DMF
O NH2
S O O I
[0820] 2.7.4 Síntese de 4-(bromometil)benzenossulfonamida
O O Cl NH2 S hidróxido de amônio S ammonium hydroxide
O O Br THF Br
[0821] Uma solução de cloreto de 4-(bromometil)benzenossulfonila (7 g, 26 mmol) em THF (80 ml) foi resfriada para 0°C, amônia aquosa a 28% (6,5 ml) foi adicionada a ela e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 h. A solução de reação foi concentrada e foi adicionado acetato de etila (200 ml). A camada orgânica foi separada, seca e concentrada. A 4-(bromometil)benzenossulfonamida bruta foi usada diretamente sem purificação adicional. (5,5 g, 86%)
[0822] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA 10 mM /H2O, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 2,0 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50 x 4,6 mm, 3,5 um. Pureza de LC: 90% (214 nm); Massa: encontrar pico 250,1 (M + H)+ a 1,64 min.
[0823] 2.7.5 Síntese de 4-((4-iodofenóxi)metil)benzenossulfonamida
[0824] Cs2CO3 (10,7 g, 33 mmol) e 4-iodofenol (6 g, 27,5 mmol) foram adicionados a uma mistura de 4-(bromometil) benzenossulfonamida (5,5 g, 22 mmol) em DMF (50 ml). Então a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 12h. Água (200 ml) foi adicionada à mistura, o sólido resultante foi filtrado e, em seguida, transformado em pasta fluida com Et2O (50 ml); filtragem por sucção e a secagem ao ar proveem o produto desejado como um sólido branco (5,5 g, 65%).
[0825] Método de LC-Massa: Método: Fase móvel: A = TFA 10 mM /H2O, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 1,8 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50 x 4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 80% (214 nm); Massa: encontrar pico 389,7 (M+H)+ a 1,98 min.
[0826] 2.7.6 Síntese de 4-(4-bromobenzilóxi)benzenossulfonamida
O O O
S O NH2 S NH2 Br
HO
O Br K2CO3, DMF Br
[0827] A uma mistura de 1-bromo-4-(bromometil)benzeno (6,5 g, 26 mmol) em DMF (50 ml) foram adicionados K2CO3 (5,5 g, 40 mmol) e 4-hidroxibenzenossulfonamida (4,5 g, 26 mmol). Então a mistura foi agitada a 50oC por 2h. Água (200 ml) foi adicionada à mistura e o sólido foi filtrado. Então o sólido foi transformado em pasta fluida com PE:EA = 1:2 (50 ml), filtragem por sucção e a secagem ao ar proveem o produto desejado como um sólido branco. (5,3 g, 60%).
[0828] Método de LC-Massa: Método: Fase móvel: A = TFA 10 mM/H2O, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 1,8 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 80% (214 nm); Massa: encontrar pico 364 (M+Na)+ em 1,81min.
[0829] 2.8 Exemplos para a Síntese de intermediários I de acordo com o esquema 2
[0830] 2.8.1 Síntese de 12-(4-sulfamoilfenóxi)dodecanoato de terc- butila
O Br
O
O NH2
S O K2CO3,DMF,50 oC,4 h
HO O O
O NH2
S O O
[0831] Uma mistura de 12-bromododecanoato de terc-butila (6 g, 18 mmol), 4-hidroxibenzeno sulfonamida (3 g, 18 mmol) e K2CO3 (5 g, 36 mmol) em DMF (50 ml) foi aquecida a 50 °C e agitada por 4 h. Então água (300 ml) foi adicionada. O precipitado resultante foi coletado e seco para dar o 12-(4-sulfamoilfenóxi)dodecanoato de terc- butila bruto, que foi transformado em pasta fluida com EA/PE (1/5, 100 ml)para prover 7 g (93%) de 12-( 4-sulfamoilfenóxi)dodecanoato:
[0832] Método de LC-Massa: Fase móvel: A: água (TFA 0,01%) B: MeCN (TFA 0,01%). Gradiente: B 5% por 0,2 min aumentou para B 95% dentro de 1,3 min, B 95% por 1,5 min, de volta para B 5% dentro de 0,01 min; Taxa de Fluxo: 1,8ml/min; Coluna: Sunfire, 50*4,6 mm,3,5 um. Temperatura da Coluna: 50 °C. Pureza de CL-EM: 100% (214 nm); Massa: encontrar pico 450,2 (M +Na)+ a 2,23 min. 1
[0833] H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,83 (t, J = 14,8 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,89 (s, 2H), 4,03 (dt, J = 13,0, 6,6 Hz, 2H), 2,20 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,73-1,80 (m, 2H), 1,50-1,57 (m, 2H), 1,40-1,48 (m, 11H), 1,37 – 1,19 (m, 12H).
[0834] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O
O O O 11 O 13 NH2 NH2
S S
O O O O 14-(4-sulfamoilfenóxi)tetradecanoato de 16-(4-sulfamoilfenóxi)hexadecanoato de terc-butila terc-butila
O O
O O O 13 O 13 NH2 NH2 F S Cl S O Cl O O
O 16-(2-flúor-4-sulfamoil- 16-(2,3-dicloro-4-sulfamoil- fenóxi)hexadecanoato de terc-butila fenóxi)hexadecanoato de terc-butila
O O
O O 9 O O 13 NH2 NH2 Cl S
S
O O O O 12-[4-[2-(4- 16-(2-cloro-4-sulfamoil- sulfamoilfenil)etil]fenóxi]dodecanoato de fenóxi)hexadecanoato de terc-butila terc-butila
O O O O
S S O NH2 O NH2 O 18 O O 16 O 20-(4-sulfamoilfenóxi)icosanoato de terc- 18-(4-sulfamoil-fenóxi)octadecanoato de butila terc-butila
O O O Cl S NH 2 O NH 2 O 14 O S O O O 14 O Cl 16-(3-sulfamoilfenóxi)hexadecanoato de 16-(2,5-dicloro-4-sulfamoil- terc-butila fenóxi)hexadecanoato de terc-butila
[0835] Esquema sintético: Síntese de 14-(4- sulfamoilfenil)tetradecanoato
O O
O O S S NH2 NH2
O O Br O 9 O 9 Pd(PPh3)2Cl2, CuI TEA, DMF, 70°C,4h PtO2, H2,THF TA, de um dia para o outro RT,overnight
O O
S O NH2 O 9
[0836] 2.8.2 Síntese de 14-(4-sulfamoilfenil)tetradec-13-inoato de terc-butila
O O O O
S NH2 Pd(PPh3)2Cl2, CuI TEA, DMF, 70°C,4h Br
O O
S NH2
O O
[0837] Pd(PPh3)2Cl2 (0,47 g, 0,68 mmol), CuI (0,13 g, 0,68 mmol), Et3N (2 g, 20,33 mmol) e tetradec-13-inoato de terc-butila (2,2 g, 7,8 mmol) foram adicionados a uma mistura de 4- bromobenzenossulfonamida (1,6 g, 6,8 mmol) em DMF (20 mL). O frasco foi evacuado e cheio com N2. Então a mistura foi agitada a 70 °C por 4h. Água (80 ml) foi adicionada à mistura, extraída através de EA (2 x 80 ml). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca em Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em gel de sílica (PE:EA = 4:1) para prover 14-(4-sulfamoilfenil)tetradec-13-inoato de terc-butila (2,2 g, 5,05 mmol, rendimento: 76%) como um sólido amarelo.
[0838] Método de LC-Massa: Método: Fase móvel: A = TFA 10 mM/H2O, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 1,8 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50 x 4,6 mm, 3,5 um. Pureza de LC: 98% (214 nm); Massa: encontrar pico 458 (M+H)+ a 2,37min.
[0839] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O
S NH2 O NH2
O S O 9
O O O 13 18-(4-sulfamoilfenil)octadec-17-inoato de 14-(3-sulfamoilfenil)tetradec-13-inoato de terc-butila terc-butila
O O O NH 2 O NH2 S S O 5
O O
O O O 7 12-[4-(4-sulfamoilfenóxi)fenil]dodec-11- 10-[4-[2-(4-sulfamoil-fenóxi)etil]fenil]dec-9- inoato de terc-butila inoato de terc-butila
O O O
S NH2 O NH2
O S
O O O O 9 O 3 8-[4-[(4-sulfamoil fenóxi)metil]fenil]oct-7- 14-[4-(4-sulfamoilfenóxi)fenil]tetradec-13- inoato de terc-butila inoato de terc-butila
O O O O
S NH2 S NH2
O O
O O 5 O 11 10-[4-[(4-sulfamoilfenil)metóxi]fenil]dec-9- 16-(4-sulfamoilfenil)hexadec-15-inoato de inoato de terc-butila terc-butila
O O
F S NH2 O NH2 O
S O O 7 O O O 5 12-(3-sulfamoilfenil)dodec-11-inoato de 10-[2-flúor-5-(4-sulfamoilfenóxi)fenil]dec-9- terc-butila inoato de terc-butila
O O O
S NH 2 NH 2
O S O
O O O 3
O O 9
8-[4-[2-(4-sulfamoilfenóxi)etil]fenil]oct-7- 14-[4-[(4- inoato de terc-butila sulfamoilfenil)metóxi]fenil]tetradec-13- inoato de terc-butila
O O O O
F S S NH2 NH 2
O
O O O 7 O 7 12-[2-flúor-5-(4-sulfamoilfenóxi)fenil]dodec- 12-(4-sulfamoilfenil)dodec-11-inoato de 11-inoato de terc-butila terc-butila
O O
F S NH2 O NH2
O S
O O 13
O O O 9 14-[2-flúor-5-(4- 18-(3-sulfamoilfenil)octadec-17-inoato de sulfamoilfenóxi)fenil]tetradec-13-inoato de terc-butila terc-butila
O O O O
F S F S NH2 NH2
O O
O O O 11 O 3 16-[2-flúor-5-(4- 8-[2-flúor-5-(4-sulfamoilfenóxi)fenil]oct-7- sulfamoilfenóxi)fenil]hexadec-15-inoato de inoato de terc-butila terc-butila
O O
S NH 2
O O 7 10-(4-sulfamoilfenil)dec-9-inoato de terc- butila
[0840] 2.8.3 Síntese de 14-(4-sulfamoilfenil)tetradecanoato de terc- butila
O O
S NH2
O
O PtO , Hum TA, 2de 2,THF dia paraRT,overnight o outro
O O
S O NH2
O
[0841] PtO2 (0,23 g, 1,01 mmol) foi adicionado a uma mistura de 14-(4-sulfamoilfenil)tetradec-13-inoato de terc-butila (2,2 g, 5,05 mmol) em THF (30 ml). O frasco foi evacuado e cheio com H2. Então a mistura foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Filtrada, concentrada sob vácuo para prover 14-(4-sulfamoilfenil) tetradecanoato (2 g, 4,55 mmol, rendimento: 90%) como um sólido cinza.
[0842] Método de LC-Massa: Fase móvel: A = TFA 10 mM/H2O, B = MeCN; Gradiente: B = 5%-95% em 1,5 min; Taxa de fluxo: 1,8 ml/min; Coluna: Xbridge-C18, 50  4,6mm, 3,5 um. Pureza de LC: 93% (214 nm); Massa: encontrar pico 462 (M+H)+ a 2,44 min. 1
[0843] HRMN (400 MHz, DMSO) δ 7,72 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,26 (s, 2H), 2,63 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,16 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,57 (s, 2H), 1,51 – 1,43 (m, 2H), 1,38 (s, 9H), 1,25 (d, J = 14,5 Hz, 18H).
[0844] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O
S O O NH2 NH2 O 9 S O 13 O O 18-(4-sulfamoilfenil)octadecanoato de terc- 14-(3-sulfamoilfenil)tetradecanoato de terc- butila butila
O O
O O NH2 NH2 O 7 S O 5 S
O O O O
12-[4-(4-sulfamoilfenóxi)fenil]dodecanoato 10-[4-[2-(4- de terc-butila sulfamoilfenóxi)etil]fenil]decanoato de terc- butila
O O O
S O NH2 NH2 O O O 9 S
O O O 3 8-[4-[(4- 14-[4-(4-sulfamoilfenóxi)fenil]tetradecanoato sulfamoilfenóxi)metil]fenil]octanoato de de terc-butila terc-butila
O O O O
S NH2 S O O NH2
O O 5 O 11 10-[4-[(4-sulfamoilfenil) 16-(4-sulfamoilfenil)hexadecanoato de terc- metóxi]fenil]decanoato de terc-butila butila
O O O O
S F S O NH2 O NH2 O 5 O O 7 12-(4-sulfamoilfenil)dodecanoato de terc- 10-[2-flúor-5-(4- butila sulfamoilfenóxi)fenil]decanoato de terc-butila
O O
O S NH 2 NH2 O O 7 S O
O O O 9 12-(3-sulfamoilfenil) dodecanoato de terc- 14-[4-[(4-sulfamoilfenil) butila metóxi]fenil]tetradecanoato de terc-butila
O
O NH 2
O O 3 S
O O NH2 O 13 S
O O 8-[4-[2-(4- 18-(3-sulfamoilfenil)octadecanoato de terc- sulfamoilfenóxi)etil]fenil]octanoato de terc- butila butila
O O O O
F S F S O NH 2 O NH2 O 7 O O 3 O 12-[2-flúor-5-(4- 8-[2-flúor-5-(4- sulfamoilfenóxi)fenil]dodecanoato de terc- sulfamoilfenóxi)fenil]octanoato de terc-butila butila
O O O
F S O NH2 O 8 O 9 O NH2
S
O O 14-[2-flúor-5-(4- 10-(4-sulfamoilfenil)decanoato de terc-butila sulfamoilfenóxi)fenil]tetradecanoato de terc-butila
O O
F S O NH2 O 11 O 16-[2-flúor-5-(4- sulfamoilfenóxi)fenil]hexadecanoato de terc-butila
[0845] 2.8.4 Síntese de ácido 2-[[4-[3-(12-terc-butóxi-12-oxo- dodecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonil amino]pirimidino-5-carboxílico
O O
F S O NH2 O 7 O
O N Cs2O CO3, CH3CN;Cs2CO3, CH3CN; LiOH, dioxana, HLiOH, 2O dioxane, H2O Cl N
O O O N OH F S O N N
H O 7 O
[0846] Uma mistura de 12-[2-flúor-5-(4- sulfamoilfenóxi)fenil]dodecanoato de terc-butila (300 mg, 575 µmol), 2- cloropirimidino-5-carboxilato de etila (112 mg, 603 µmol) e Cs2CO 3 (656 mg, 2,01 mmol) em MeCN (6 mL) foi aquecida a 60 °C e agitada por 3 h (controle de TLC). A mistura de reação foi usada na próxima etapa de saponificação sem purificação adicional.
[0847] A suspensão foi diluída com dioxana (6 ml) e uma solução de LiOH (37 mg, 1,56 mmol) em água (6 ml) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h e mais LiOH (37 mg,
1,56 mmol) foi adicionado. No geral, a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 36 h. A suspensão foi despejada em uma solução aquosa de ácido cítrico (10 por cento, 50 mL). A suspensão foi filtrada e a torta de filtro lavada com água e seca a vácuo. O composto do título ácido 2-[[4-[3-(12-terc-butóxi-12-oxo-dodecil)-4-flúor- fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-5-carboxílico foi obtido como um sólido branco (350 mg, quan.). 1
[0848] H RMN (400,23 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,2 (s amplo, 2 H), 8,89 (s, 2 H), 7,99 (d, J=8,93 Hz, 2 H), 7,21 (t, J=9,17 Hz, 1 H), 7,05 (m, 4 H), 2,58 (t amplo, J= 7,46 Hz, 2 H), 2,15 (t, J= 7,27 Hz, 2 H), 1,53 (m, 2 H), 1,47 (m, 2 H), 1,38 (s, 9 H), 1,26-1,22 (m, 14 H).
[0849] No caso do produto desejado não ter precipitado ao ser despejado em ácido cítrico aquoso, a camada aquosa foi extraída com acetato de etila, as camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas a vácuo. Os produtos brutos foram submetidos à cromatografia em coluna usando MeOH/CH2Cl2 como eluente.
[0850] Os compostos que seguem são sintetizados deste modo:
O O
O O O N OH O 9
H S N N N N H S O O
O O N OH O 5
O ácido 5-[[4-(12-terc-butóxi-12-oxo- ácido 5-[[4-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- dodecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- decil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]pirimidin carboxílico o-2-carboxílico
O O O H
N N O O N OH O 9 S
S O O N OH O N N H
O O 9 ácido 5-[[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- ácido 5-[[4-[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino- carboxílico 2-carboxílico
O O H O O N OH
N N F S O 9 S
O N N
H O O N OH O 11 O
O ácido 5-[[4-[3-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 5-[[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- hexadecil)-4-flúor- tetradecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carboxílico carboxílico
O O
O O 9
O O N OH H S N N O N N S H
O O N OH O 13
O ácido 5-[[4-[2-[4-(12-terc-butóxi-12-oxo- ácido 5-[[4-(18-terc-butóxi-18-oxo- dodecóxi)fenil]etil]fenil]sulfonilamino]pirimi octadecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- dino-2-carboxílico carboxílico
O O
O O O 13 H O 11
N N H N N S O N OH S O O O N OH O
O ácido 2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 5-[[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]-4-metil- tetradecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- pirimidino-5-carboxílico carboxílico
O O
O O O 13 H O 13 H
N N N N F S Cl S
O O N OH O O N OH
O O ácido 2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)-3-flúor- hexadecóxi)-3-cloro- fenil]sulfonilamino]pirimidino-5-carboxílico fenil]sulfonilamino]pirimidino-5-carboxílico
O O N OH O O O O N OH S S O N N O N N
H H O 11 O 7 ácido 2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 2-[[4-(12-terc-butóxi-12-oxo- hexadecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- dodecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carboxílico carboxílico
O O N OH N OH O O
N N N N O 7 S H O 13 S H
O O O O ácido 2-[[3-(12-terc-butóxi-12-oxo- ácido 2-[[3-(18-terc-butóxi-18-oxo- dodecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- octadecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carboxílico carboxílico
O O O O F H S H
N N O N N O 5 S O O N OH O 3 O N OH
O
O ácido 5-[[4-[2-[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- ácido 2-[[4-[3-(8-terc-butóxi-8-oxo-octil)-4- decil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidi flúor-fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- no-2-carboxílico carboxílico
O O O S H N N O O N OH O F S N OH O N N O
H O 9 O O 9 O ácido 5-[[4-[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- ácido 2-[[4-[[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)-4-flúor- tetradecil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]pirim fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- idino-5-carboxílico carboxílico
O O O F S H
O O N N O 13
H N N O 5 O N OH
S O N OH O O
O ácido 5-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 2-[[4-[3-(10-terc-butóxi-10-oxo-decil)-4- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino- flúor-fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- 2-carboxílico carboxílico
O O O O N OH O N OH S O N N
H N N O 3 S H
O O O O O 3 ácido 5-[[4-[[4-(8-terc-butóxi-8-oxo- ácido 2-[[4-[2-[4-(8-terc-butóxi-8-oxo- octil)fenil]metóxi]fenil]sulfonilamino]pirimid octil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino- ino-2-carboxílico 5-carboxílico
O O
O F O 13
H O N OH N N O S F F S O O N OH O N N
H O O 16 O ácido 2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 2-[[4-(18-terc-butóxi-18-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]-4- octadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- (trifluorometil)pirimidino-5-carboxílico carboxílico
O O O O N OH N OH
O Cl S O 8
O N N H N N
S H O 14 O Cl O O ácido 2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 2-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- hexadecóxi)-2,5-dicloro- decil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- fenil]sulfonilamino]pirimidino-5-carboxílico carboxílico
O N OH O
N N O 14 O S H
O O ácido 2-[[3-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino- 5-carboxílico
[0851] 2.8.5 Síntese de ácido 6-[[4-[3-(12-terc-butóxi-12-oxo- dodecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonil-amino]piridino-3-carboxílico
O O
F S O NH2 O 7 O
O
O Pd2(dba)3, Xant-Phos, Cs2CO3, dioxane; Cl N LiOH, dioxane, H2O
O O O OH F S O N N
H O 7 O
[0852] Uma mistura de 12-[2-flúor-5-(4- sulfamoilfenóxi)fenil]dodecanoato de terc-butila (300 mg, 575 µmol), 6- cloronicotinoato de metila (102 mg, 603 µmol), Cs2CO3 (468 mg, 1, 44 mmol), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio (26 mg, 29 µmol) e 4,5-bis (difenil-fosfino)-9,9-dimetilxanteno ("xantphos", 17 mg, 29 µmol) em dioxana (6 ml) foi aquecida a 80 °C em uma atmosfera de argônio durante 3 h (controle de TLC). A mistura de reação foi usada na próxima etapa de saponificação sem purificação adicional.
[0853] A suspensão foi diluída com dioxana (6 ml) e uma solução de LiOH (37 mg, 1,56 mmol) em água (6 ml) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h e mais LiOH (37 mg, 1,56 mmol) foi adicionado. No geral, a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 36 h. A suspensão foi despejada em uma solução aquosa de ácido cítrico (10 por cento, 50 mL). A suspensão foi filtrada e a torta de filtro lavada com água e seca a vácuo. O composto do título ácido 6-[[4-[3-(12-terc-butóxi-12-oxo-dodecil)-4-flúor- fenóxi]fenil]sulfonil-amino]piridino-3-carboxílico foi obtido como um sólido branco ( 350 mg, quan.). 1
[0854] H RMN (400,23 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,5 (s amplo, 1H), 8,54 (s amplo, 1 H), 8,11 (dd, J=8,93, 2,20 Hz, 1 H), 7,91 (d amplo, J=8,68 Hz, 2 H), 7,80 (m, 1 H), 7,19 (m, 2 H), 7,04 (m, 4 H), 2,58 (t amplo, J= 7,46 Hz, 2 H), 2,15 (t, J=7,27 Hz, 2 H), 1,48 (m, 4 H), 1,38 (s, 9 H), 1,26-1,22 (m, 14 H).
[0855] No caso do produto desejado não ter precipitado ao ser despejado em ácido cítrico aquoso, a camada aquosa foi extraída com acetato de etila, as camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas a vácuo. Os produtos brutos foram submetidos à cromatografia em coluna usando MeOH/CH2Cl2 como eluente.
[0856] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O O
H O N N O 9 O 7 S H
O O N N OH S O O OH O
O ácido 6-[[4-[4-(12-terc-butóxi-12-oxo- ácido 6-[[4-(12-terc-butóxi-12-oxo- dodecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- dodecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- carboxílico carboxílico
O O O H
OH N N O O O 5 S
S O O OH N N H O O
O O 5 ácido 6-[[4-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- ácido 6-[[4-[2-[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- decil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]piridino- decil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]piridino- 3-carboxílico 3-carboxílico
O O OH O O OH O O F S S O N N O N N H
H O 9 O O 9 ácido 6-[[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- ácido 6-[[4-[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)fenil]sulfonil amino]piridino-3- tetradecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonil carboxílico amino]piridino-3-carboxílico
O O O O OH OH O O F S O N N S H O N N
H O 11 O O 13 ácido 6-[[4-[3-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 6-[[4-(18-terc-butóxi-18-oxo- hexadecil)-4-flúor- octadecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carboxílico carboxílico
O O
O O O 11 O 13
H H
N N N S Cl S O O OH Cl O O N OH
O O ácido 6-[[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- ácido 6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- tetradecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- hexadecóxi)-2,3-dicloro- carboxílico fenil]sulfonilamino]piridino-3-carboxílico
O O
O O O N OH O 13 H S
N N H F S O O N O
O OH O 9
O ácido 6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 6-[[4-[[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- hexadecóxi)-3-flúor- tetradecil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]pir fenil]sulfonilamino]piridino-3-carboxílico idino-3-carboxílico
O O O N OH OH O O N O
N S O 3 S H
O N O O
H O 11 ácido 6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 6-[[4-[2-[4-(8-terc-butóxi-8-oxo- hexadecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- octil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]piridino- carboxílico 3-carboxílico
O O
O N OH O 13
H
O N N Cl S O 13 S H O O N OH
O O
O ácido 6-[[3-(18-terc-butóxi-18-oxo- ácido 6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- octadecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- hexadecóxi)-3-cloro- carboxílico fenil]sulfonilamino]piridino-3-carboxílico
O O
O O N OH O 13 H
O N N
N S O 9 S H O OH
O O O
O ácido 6-[[4-[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- ácido 6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- 3-carboxílico carboxílico
O O
O O 7 H O OH
O N N S S O N N
O O OH H O 16 O
O ácido 6-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- ácido 6-[[4-(18-terc-butóxi-18-oxo- decóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- octadecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- carboxílico carboxílico
O O H O OH
N N O O O 9 S S O O O 6 N N
OH H O
O ácido 6-[[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- ácido 6-[[4-[2-[4-(8-terc-butóxi-8-oxo- tetradecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- octil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]piridino- carboxílico 3-carboxílico
O O O
O O 7 H OH N N O 8
S O OH N N O S H O O
O ácido 6-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- ácido 6-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- decóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- decil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- carboxílico carboxílico
O O H
N N OH O 9 S O O
O O OH S O N N H
O O 18 O ácido 6-[[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- ácido 6-[[4-(20-terc-butóxi-20-oxo- tetradecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- icosóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- carboxílico carboxílico
O O
O O 13 O
H N N O O N OH
S S O 10 N
O O OH H
O ácido 6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- ácido 6-[[3-(12-terc-butóxi-12-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- dodecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- carboxílico carboxílico
O
O O 9
H N N S O O OH
O ácido 6-[[4-[2-[4-(12-terc-butóxi-12-oxo- dodecóxi)fenil]etil]fenil]sulfonilamino]piridino -3-carboxílico
[0857] 2.9 Exemplos para Síntese dos compostos com fórmula I de acordo com o Esquema 1
[0858] 2.9.1 Síntese de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(14-terc- butóxi-14-oxo-tetradecil)-4-flúor- fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
O O O OH F S O N N
H O 9 O TSTU, THF, DIPEA; O
H
O N O EtOH H2 N O O OH
O O O H O N O O O N O O OH H F S O O N N
H O 9 O
[0859] Uma mistura de ácido 6-[[4-[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonil amino]piridino-3-carboxílico (169 mg, 251 µmol), TSTU (80 mg, 264 µmol) e DIPEA (132 µl, 97 mg, 1,25 mmol) em 6 ml de THF foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Após 16h, o solvente foi removido sob pressão reduzida e uma solução de ácido [2- (2-{2-[2-(2-amino-etóxi)-etóxi]-acetilamino}-etóxi)-etóxi]-acético (85 mg, 277 µmol) em 6 ml abs. EtOH foi adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Os componentes voláteis foram removidos sob pressão reduzida, o resíduo resultante dissolvido em CH2Cl2 e lavado com solução de KHSO4 10% aquosa. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura, seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de RP HPLC para prover ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(14-terc-butóxi-14- oxo-tetradecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético (106 mg, 44%). 1
[0860] H RMN (400,23 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,29 (s amplo, 1 H), 8,52 (m, 2 H), 8,09 (dd, J=8,93, 2,32 Hz, 1 H), 7,89 (d, J=8,80 Hz, 2 H), 7,61 (t amplo, J=5,69 Hz, 1 H), 7,18 (m, 2 H), 7,03 (m, 4 H), 4,01 (s, 2 H), 3,86 (s, 2 H), 3,20 – 3,68 (m, 16 H), 2,58 (t amplo, J=7,52 Hz, 2 H), 2,15 (t, J=7,27 Hz, 2 H), 1,49 (m, 4 H), 1,38 (s, 9 H), 1,25 (m, 18 H).
[0861] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O O O O NH O O NH O O NH S F S O N N O N N S H H O O
O N N O 9 O O 11 O O H
H H O O O N O
O N O 13 O
H O O O N HO O HO O O O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(14-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(16-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(18-terc-butóxi-18-oxo- 14-oxo-tetradecil)fenil]sulfonilamino]piridino- 16-oxo-hexadecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonil octadecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- 3- amino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó ético 133/213 tóxi]acético xi]acético
HO O HO O HO O O O O O
O O O 9 O N O O
H O N O N O O H O H O O O H N
O O O O N O 9 O 13
S H H O O N N N N N S S O O O NH O O NH
O O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[2-[4-(12-terc- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(12-terc-butóxi-12- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- butóxi-12-oxo- oxo-dodecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- dodecóxi)fenil]etil]fenil]sulfonilamino]piridino- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac 3- xi]acético ético carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e tóxi]acético
HO O HO O HO O O O O O O O N O N O H H O N O O O O H O O O O
O H O O H N N O 7 N N O 7 S H O 9 S O O N N
O O NH NH S O O O NH O
O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[3-(14-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[4-(12-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- 14-oxo-tetradecil)fenil]sulfonilamino]piridino- 12-oxo- decóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- 3- dodecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó ético tóxi]acético xi]acético 134/213
HO O O O O O NH O N O O N O O H F S O S O O N N O N N O H H
H N N O O O 7 O O O 5 S O O O
O O H
NH H O N O 5 O N O
O O O O HO O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[2-[4-(10-terc- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[[4-(10-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(12-terc-butóxi-12- butóxi-10-oxo- 10-oxo- oxo-dodecil)-4-flúor- decil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- decil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]piridino-3- fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac tóxi]acético xi]acético ético
HO O O O O O O O N NH O N F S O O N NH O H O O N N S
O O H O N N O 13 H O 11 O O H
N O N H O
O N O 13 O
S O N NH O H O O N O O HO O O O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-(16-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[3-(16-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-(18-terc-butóxi-18-oxo- 16-oxo- 16-oxo-hexadecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonil octadecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- amino]pirimidino-2- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó ético 135/213 tóxi]acético xi]acético
O O O O N NH O N N O O O O N NH S F S S N N O N N N N H H O O H O O
O O 9 O O O H O O 9 O N H O 5 O O
O N H O O N O O HO O O HO O O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[3-(14-terc- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-(14-terc-butóxi-14- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[[4-(10-terc-butóxi-10- butóxi-14-oxo-tetradecil)-4-flúor- oxo-tetradecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- oxo-decil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]pirimidino- fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó 2- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e xi]acético carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac tóxi]acético ético
HO O HO O O O O O O N NH O N H O O O O O O N S O O H N N H O
N N H O 5 S O O O O O N O 9 O O O
NH H N N H
O O N S 3 O O
O O N NH O HO O
O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[2-[4-(10-terc- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-(12-terc-butóxi-12- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[[4-(8-terc-butóxi-8-oxo- butóxi-10-oxo- oxo-dodecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- octil)fenil]metóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- decil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac 2- xi]acético ético 136/213 carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e tóxi]acético
HO O O HO O O O O O O N NH O N O N O H F S H O O N N O H O O O O O
O O O H H 7
O N N N N H O 9 S O 9 S O N
O O O N NH O O N NH O HO O O
O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[3-(14-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[3-(12-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[4-(14-terc-butóxi-14- 14-oxo- 12-oxo-dodecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonil oxo-tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- tetradecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- amino]pirimidino-2- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó ético tóxi]acético xi]acético
HO O HO HO O O O O O O O O
O N O 9 H O O O O
O O N O N O H O H H O
N N O O S O 13 H O O O O N NH N O 11 H Cl S N N
O Cl O O N NH S
O O N NH O
O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[2-[4-(12-terc- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(16-terc-butóxi-16- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- butóxi-12-oxo- oxo-hexadecóxi)-2,3-dicloro- tetradecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- dodecóxi)fenil]etil]fenil]sulfonilamino]pirimidin fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac o-2- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó ético 137/213 carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e xi]acético tóxi]acético
HO O HO HO O O O O O O O O O O O O O N N O H O N O O H H
O O O O O 11 H O 13 O O 13 O
N N H H N N N S F S F S O O NH O O N NH O O N NH O
O O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(14-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- 14-oxo- oxo-hexadecóxi)-3-flúor- hexadecóxi)-3-flúor-fenil]sulfonilamino]piridino-3- tetradecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó ético tóxi]acético xi]acético
HO HO HO O O O O O O O O O N O O O O O O O N N H O O
O H H O 13 O
H O O O N O 13 O 13 O
H H Cl S N N N N
O O N NH S S O O N NH O O N NH O O F O
F F ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(16-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- 16-oxo-hexadecóxi)-3-cloro- oxo-hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]-4-metil- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]-4- 138/213 fenil]sulfonilamino]piridino-3- pirimidino-5- (trifluorometil)pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac tóxi]acético xi]acético ético
HO O O O O NH O O O NH O N N O O N O O H S S N
O O N H O 13 O H O O
H O O N N O 11 H Cl S H N O 9 O O
O N NH N O O O O O O O O O HO
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(16-terc-butóxi-16- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[[4-(14-terc-butóxi-14- 16-oxo-hexadecóxi)-3-cloro- oxo-hexadecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- oxo- fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó tetradecil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e xi]acético carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac tóxi]acético ético
O O HO O O O N N O N NH O O O N
N O H O 3 S H
O O O N O O O H O 13 S H F S H
N O O O O N N
O O O O O H O 5 O N NH
HO N O O O O O O
HO ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[2-[4-(8-terc- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[3-(18-terc-butóxi-18- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-[3-(10-terc-butóxi-10- butóxi-8-oxo- oxo-octadecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- oxo-decil)-4-flúor- 139/213 octil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e xi]acético carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac tóxi]acético ético
O O O O N NH N NH
O O N NH O O O Cl S
S N N N O N N
O O S H H H 9
O O O O O O 11 O 14 O Cl O
H H H N N O N O O O O O O O O O O O O
HO HO HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[4-(14-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- 16-oxo- 14-oxo- hexadecóxi)-2,5-dicloro- hexadecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac tóxi]acético xi]acético ético
O O O O N NH O O O N NH
NH O 3
N S H N S O O O O O O N N H H S N O O N N
O O O O 7
H H O O
HO N O O O O O 16 O O
O O H HO O N O O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-[2-[4-(8-terc- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(12-terc-butóxi-12- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(18-terc-butóxi-18-oxo- butóxi-8-oxo- oxo-dodecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- octadecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- octil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac 140/213 5- xi]acético ético carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e tóxi]acético
HO O O O O O O O N N NH H O O O O O O N NH O F S H N N
O N N O 13 S H S O O 10 N O 3 O N NH O O H
H O N O O O O O H O O O N HO O O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-[3-(8-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[3-(18-terc-butóxi-18- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[3-(12-terc-butóxi-12-oxo- 8-oxo-octil)-4-flúor- oxo-octadecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- dodecil)fenil]sulfonilamino]piridino-3-
fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e xi]acético ético tóxi]acético
O O O N NH O O O NH O O N NH
O S S N N O 6 N N
H O N N O 7 S H
H O O O O O O
O H H O 16 O O N O N
O H O O O O N O O O O HO O HO O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(18-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[3-(12-terc-butóxi-12- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[2-[4-(8-terc-butóxi-8- 141/213 18-oxo- oxo-dodecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- oxo-octil)fenil]etóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- octadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e xi]acético ético tóxi]acético
O HO O O O O O O O NH N
O O H NH S O O O O 8
O N N S H N N N N H
O O S H O 18 O O N NH
O O O O H O 9 O O
O N H O O N O O HO O O
HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(20-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-[[4-(14-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-(10-terc-butóxi-10-oxo- 20-oxo-icosóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- 14-oxo- decil)fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e tetradecil)fenóxi]metil]fenil]sulfonilamino]pirimidi carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]ac tóxi]acético no-5- ético carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó xi]acético
O O O
N NH N NH O 8 O
N N N N S H O 14 O S H
O O O O O O
O O 142/213
H H O N O N O O O O
HO O HO O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(10-terc-butóxi- ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[3-(16-terc-butóxi-16- 10-oxo-decil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- oxo-hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]e carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etó tóxi]acético xi]acético
[0862] 2.9.2 Síntese de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[6-[[5-[[4-(16-terc- butóxi-16-oxo-hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carbonil]amino]hexanoilamino]etóxi]etóxi]acetil]- amino]etóxi]etóxi]acético
O
O O 13
H N N S O O N OH O O H
OH O N O H2N O O OH H 2N
O O
1. TSTU, DIPEA, THF, EtOH 2. TSTU, DIPEA, THF, EtOH
O
O O 13 H
N N S H O O N N O O O H O N O HO O O N H O
[0863] Uma mistura de ácido 5-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2-carboxílico (500 mg, 825 µmol), TSTU (310 mg, 1,0 mmol) e DIPEA (360 µl, 266 mg, 2,06 mmol) em 6 ml de THF foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Após 16 h, o solvente foi removido sob pressão reduzida e uma solução de ácido 6-aminoexanoico (130 mg, 990 µmol) e DIPEA (360 µl, 266 mg, 2,06 mmol) em 6 ml abs. EtOH foi adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Os componentes voláteis foram removidos sob pressão reduzida, o resíduo resultante dissolvido em CH2Cl2 e lavado com solução de KHSO4 10% aquosa. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura, seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. 900 mg de ácido 6-[[5-[[4-
(16-terc-butóxi-16-oxo-hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carbonil]amino]hexanoico obtido foram usados na etapa seguinte sem purificação adicional .
[0864] Uma mistura de ácido 6-[[5-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2-carbonil]amino]hexanoico (900 mg bruto, 65% de pureza, 814 µmol), TSTU (306 mg, 1,02 mmol) e DIPEA (355 µl, 262 mg, 2,03 mmol) em 6 ml de THF foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Após 16h, o solvente foi removido sob pressão reduzida e uma solução de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-(2-aminoetóxi) etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético (301 mg, 976 µmol) e DIPEA (355 µl, 262 mg, 2,03 mmol) em 6 ml abs. EtOH foi adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Os componentes voláteis foram removidos sob pressão reduzida, o resíduo resultante dissolvido em CH2Cl2 e lavado com solução aquosa de KHSO4 10%. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura, seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de RP HPLC para prover ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2- [6-[[5-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carbonil]amino]hexanoilamino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acétic o (78 mg, 10%). 1
[0865] H RMN (400,23 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,29 (s amplo, 1 H), 8,82 (s, 2 H), 8,47 (s amplo, 1 H), 7,90 (d, J=8,93 Hz, 2 H), 7,79 (t, J=5,50 Hz, 1 H), 7,63 (t, J=5,75 Hz, 1 H), 7,07 (d, J=8,93 Hz, 2 H), 4,01 (m, 4 H), 3,87 (s, 2 H), 3,20 – 3,68 (m, 18 H), 2,15 (t, J=7,27 Hz, 2 H), 2,05 (t, J=7,34 Hz, 2 H), 1,70 (m, 2 H), 1,48 (m, 6 H), 1,38 (s, 9 H), 1,25 (m, 24 H).
[0866] O composto que segue foi sintetizado deste modo:
O
O O 13 H
N N S H O O N O O O H O N O HO O O N H
O ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[6-[[6-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]hexanoilamino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
[0867] 2.10 Incorporação de espécie (2)
[0868] 2.10.1 Síntese de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[3-[[5-[[4-[4-(14- terc-butóxi-14-oxo-tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonil amino]pirimidino-2- carbonil]- amino]propanoilamino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
O O H
N N O 9 S
O O N OH O
1. TSTU, DIPEA, THF, EtOH 2. LiOH, THF / H2O
O
3. TSTU, DIPEA, THF, EtOH
O
H H 2N O O N O H2N O O OH
O HO O O O O N H O O O O H
N N O 9 S
O O N H N NH O O
[0869] 2.10.2 Síntese de 14-[4-[4-[[5-[(3-metóxi-3-oxo- propil)carbamoil]pirimidin-2-il] sulfamoil]fenóxi]fenil]tetradecanoato de terc-butila
O O H
N N O 9 S
O O N OH
1. TSTU, DIPEA, THF, EtOH O
O H2N O
O O H
N N O 9 S
O O N H N O O O
[0870] Uma mistura de ácido 5-[[4-[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonil amino]pirimidino-2-carboxílico (1,0 g, 764 µmol), TSTU ( 241 mg, 803 µmol) e DIPEA (494 mg, 3,82 mmol) em 10 ml de THF foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Mais TSTU foi adicionado (80 mg, 267 µmol) e agitação em temperatura ambiente foi continuada por 2h. Cloridrato de 3-aminopropanoato de metila (117 mg, 841 µmol) foi adicionado e agitação em temperatura ambiente foi continuada por 16 h. Os componentes voláteis foram removidos sob pressão reduzida, o resíduo resultante dissolvido em CH2Cl2 e lavado com solução aquosa de KHSO4 10%. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura, seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de RP HPLC preparativa para prover tetradecanoato de 14-[4-[4-[[5-[(3- metóxi-3-oxo-propil)carbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]fenóxi]fenila] (235 mg, 42%). 1
[0871] H RMN (400,23 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,11 (s amplo, 1 H), 8,84 (s, 2 H), 8,66 (t, J=5,44 Hz, 1 H), 7,98 (d, J=8,93 Hz, 2 H), 7,26 (d, J=8,44 Hz, 2 H), 7,04 (m, 4 H), 3,60 (s, 3 H), 3,46 (m, 2H), 2,57 (m, 4 H), 2,15 (t, J=7,27 Hz, 2 H), 1,56 (m, 2 H), 1,46 (m, 2 H),
1,38 (s, 9 H), 1,29 (m, 18 H).
[0872] 2.10.3 Síntese de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[3-[[5-[[4-[4-(14- terc-butóxi-14-oxo-tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonil amino]pirimidino-2- carbonil]amino]propanoilamino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
O O H
N N O 9 S
O O N H N O O O
1. LiOH, THF / H2O
2. TSTU, DIPEA, THF, EtOH
O H
O N O H 2N O O OH
O HO O O O O N H O O O O H
N N O 9 S
O O N H N NH O O
[0873] Uma mistura de tetradecanoato de 14-[4-[4-[[5-[(3-metóxi-3- oxo-propil)carbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]fenóxi]fenila] (235 mg, 318 µmol), LiOH (38 mg, 1,59 mmol), THF (5 mL) e H2O (5 mL) foi agitada em temperatura ambiente por 2h. A mistura de reação foi acidificada para aproximadamente pH = 1,0 com HCl (2,0 M) e extraída com CH2Cl2. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca com Na2SO4, filtrada e concentrada para prover ácido 3-[[5-[[4-[4-(14-terc- butóxi-14-oxo-tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carbonil]amino]propanoico (207 mg, 89% de rendimento) como um sólido branco, que foi usado na reação seguinte sem purificação adicional.
[0874] Uma mistura de ácido 3-[[5-[[4-[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonil amino]pirimidino-2-
carbonil]amino]propanoico (207 mg, 285 µmol), TSTU (90 mg, 300 µmol) e DIPEA (150 µl, 110 mg, 850 µmol) em 6 ml de THF foi agitada em temperatura ambiente por 1 h. Após 1h, o solvente foi removido sob pressão reduzida e uma solução de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-(2- aminoetóxi)etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético (97 mg, 314 µmol) e DIPEA (150 µl, 110 mg, 850 µmol) em 6 ml abs. EtOH foi adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Os componentes voláteis foram removidos sob pressão reduzida, o resíduo resultante dissolvido em CH2Cl2 e lavado com solução aquosa de KHSO4 10%. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura, seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de RP HPLC para prover ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[3-[[5-[[4-[4-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carbonil]amino]propanoilamino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acéti co (163 mg, 56%). 1
[0875] H RMN (400,23 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,11 (s amplo, 2 H), 8,84 (s, 2 H), 8,61 (t, J= 5,62 Hz, 1 H), 7,97 (m, 3 H), 7,62 (t, J=5,56 Hz, 1 H), 7,26 (d, J=8,44 Hz, 2 H), 7,04 (m, 4 H), 4,01 (s, 2 H), 3,86 (s, 2 H), 3,20 – 3,60 (m, 18 H), 2,58 (m, 2 H), 2,34 (t, J=7,03 Hz, 2 H), 2,15 (t, J=7,27 Hz, 2 H), 1,56 (m, 2 H), 1,46 (m, 2 H), 1,38 (s, 9 H), 1,29 (m, 18 H).
[0876] 2.1 Desproteção
[0877] Síntese de ácido 14-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- piridil]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]tetradecanoico
O O O O NH O O NH F S
F S O N N O N N TFA, CH2Cl2 H
H HO 9 O O O 9 O O O
O H H O N O N O O O O HO O HO O
[0878] Ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonilamino]piridino-3- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi] (20 mg, 21 µmol) foi dissolvido em DCM (3, 0 mL) e TFA (0,5 mL) foi adicionado em RT. A agitação foi continuada em temperatura ambiente por 16h. Os componentes voláteis foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo resultante dissolvido em DCM e novamente evaporado duas vezes. O produto bruto foi purificado através de RP HPLC preparativa. O composto título ácido 14-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilaxi)etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- piridil]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]tetradecanoico foi obtido como um sólido incolor (19 mg, 21 µmol, quan.). 1
[0879] H RMN (400,23 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,19 (s amplo, 1 H), 8,51 (m, 2 H), 8,09 (dd, J=8,93, 2,32 Hz, 1 H), 7,89 (d, J=8,93 Hz, 2 H), 7,61 (t amplo, J=5,56 Hz, 1 H), 7,20 (t, J=8,93 Hz, 1 H), 7,15 (d, J=8,19 Hz, 1 H), 7,03 (m, 4 H), 4,01 (s, 2 H), 3,86 (s, 2 H), 3,20 – 3,68 (m, 16 H), 2,58 (t amplo, J=7,52 Hz, 2 H), 2,17 (t, J=7,34 Hz, 2 H), 1,49 (m, 4 H), 1,25 (m, 18 H).
[0880] Os compostos que seguem foram sintetizados deste modo:
O O O NH O O NH NH O O O O S F S O N N S O N N H O N N
H H HO 11 O O HO 9
O O O O H HO 13 O
H O N O N O H O O N O O O HO O HO O O
HO O ácido 14-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 18-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etil carbamoil]-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] 150/213 piridil]sulfamoil]fenil]tetradecanoico sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]hexadecanoico sulfamoil]fenil]octadecanoico
HO O HO O HO O O O O O
O O O O HO 9 O N N O N
H O O O H O H O O O
O O O O H HO 9 HO 13
N N H H S N N N N O O NH S S O NH O O NH O O
O O ácido 12-[4-[2-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 12-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] sulfamoil]fenil]etil]fenóxi]dodecanoico sulfamoil]fenóxi]dodecanoico sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico
HO O HO O HO O O O O O O O O N O N O N H H O H O O O O
O O O O O O HO 7
H H H
N N N N N N HO 9 S HO 7 S
S O O NH O O NH O O NH
O O O ácido 14-[3-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 12-[4-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 10-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] sulfamoil]fenil]tetradecanoico sulfamoil]fenóxi]fenil]dodecanoico sulfamoil]fenóxi]decanoico
HO O O O 151/213
O O NH NH O N O O O O H S F S O O N N O N N O H H O O
H O O N N O O HO 7 O O HO 5 S H H
O O HO O N O N NH 5 O O
O O O HO O
HO O ácido 10-[4-[2-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 10-[4-[[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 12-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] sulfamoil]fenóxi]etil]fenil]decanoico sulfamoil]fenil]metóxi]fenil]decanoico sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]dodecanoico
HO O O O O O O N NH O N O NH O N F S O O H O N N S O H N
O O O N HO 13 HO 11 O O H
H O N N H HO 13
O O N O S O H O O N NH O N O O HO O O O
HO O ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 18-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico il]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]hexadecanoico il]sulfamoil]fenil]octadecanoico
O O O 152/213
O O N NH O O N NH O O N NH F S S O N N S N N H O N N H
O H O HO 9 O O O
O O O H HO 9 O H
O N H N O O HO 5 O O
N O O HO O O O HO O
HO O ácido 14-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 14-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 10-[4-[[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- il]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]tetradecanoico il]sulfamoil]fenil]tetradecanoico il]sulfamoil]fenil]metóxi]fenil]decanoico
HO O HO O O O O O O N H O O O N NH O O N S O O O H N N O O H H
N N O O HO 5 S HO 9 O O O
H O O O N H NH N N
HO N S 3 O O
O O O N NH O HO O
O ácido 10-[4-[2-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 12-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 8-[4-[[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il] sulfamoil]fenóxi]etil]fenil]decanoico sulfamoil]fenóxi]dodecanoico sulfamoil]fenóxi]metil]fenil]octanoico
HO O O HO O 153/213
O O O O O N NH O O N F O N S H H O N N O O H O O
O O O O HO 7 O O H
H H N N N N O N HO 9 S HO 9 S O O O N N
O O N NH O HO O O
O ácido 14-[3-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 12-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 14-[4-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- sulfamoil]fenil]tetradecanoico il]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]dodecanoico il]sulfamoil]fenóxi]fenil]tetradecanoico
HO O HO O O O O O
O O O O N O HO 13 HO 9 H O N H
O H N N O O O O S H H O N N H O O N N
S N N HO 9 S
O O N NH H O O O N N O O O H O O O N O HO O O N H
O ácido 12-[4-[2-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 14-[4-[4-[[5-[[3-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[4-[[5-[[6-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilamino]-3-oxo- etóxi]etóxi]etilamino]-6-oxo-hexil] il]sulfamoil]fenil]etil]fenóxi]dodecanoico propil]carbamoil]pirimidin-2- carbamoil]pirimidin-2-il] il]sulfamoil]fenóxi]fenil]tetradecanoico sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico 154/213
O HO HO O O O O
O HO 13 O O O O
H N N O N O N H O H
S H O O O O O N HO 13 O O
H N HO 11
H O Cl S N N
O O H Cl O O N NH S
O N O O O NH HO O O N H O O
O ácido 16-[4-[[5-[[6-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 14-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilamino]-6-oxo-hexil]carbamoil]-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil]sulfamoil]-2,3- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- piridil]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico dicloro-fenóxi]hexadecanoico piridil]sulfamoil]fenóxi]tetradecanoico
HO O O HO O O O O O O N NH O O O O N S N O H N O H O H
O O O O O HO 11 HO 13 O
H O H H
N N N N S HO 9 O O
F S O O N NH O O O N NH O
O HO O O ácido 14-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 14-[4-[[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etil carbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil]sulfamoil]-2- il]sulfamoil]fenóxi]tetradecanoico piridil]sulfamoil]fenil]metóxi]fenil]tetradecanoico flúor-fenóxi]hexadecanoico 155/213
HO HO O O O O O O O O O O O O N O N O N O H H
N O O O O HO 3 S H HO 13 HO 13 O
H H O O
N N N H Cl S S N
O N O N O O O O NH O NH O O F HO O O
F F ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 8-[4-[2-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil]sulfamoil]-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-4- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- cloro-fenóxi]hexadecanoico (trifluorometil)pirimidin-2- piridil]sulfamoil]fenóxi]etil]fenil]octanoico il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico
O O HO O O O O N NH O O O S O O N N O N H
O N S O H N N HO 13 O
O O H HO 11
H N N
H O N HO 7 Cl S
O O O H O O N NH N O O O O O HO O O O
HO ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 12-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]- etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- 2-piridil]sulfamoil]fenil]hexadecanoico etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]-2- 156/213 il]sulfamoil]fenil]dodecanoico cloro-fenóxi]hexadecanoico
O O HO O O N NH N NH O O O O N O H
N N N HO 13 S H O O O HO 13 S H O O O F S H
O O O O N N H
H N N O O O HO 5 O N NH
O O O O O O O HO O
HO ácido 18-[3-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 18-[3-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 10-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- 2-piridil]sulfamoil]fenil]octadecanoico etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- il]sulfamoil]fenil]octadecanoico il]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor-fenil]decanoico
O O O O N NH O N NH O O N NH
N O HO 9 S H N N
O O O HO 7 S H Cl S
H O O O O N N N H O O O H N O
O O O O O HO 14 O Cl O
HO H O O O N HO O O
HO O ácido 14-[4-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 12-[3-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]- 157/213 piridil]sulfamoil]fenóxi]fenil]tetradecanoico il]sulfamoil]fenil]dodecanoico 2,5-dicloro-fenóxi]hexadecanoico
HO HO O O O O O O O O O O O N O N H O O NH H O O O
O O S H S HO 13 H N N O N N
N N O H
F S O N NH O O O N NH HO 16 O O HO 9 O H
O O N O O
HO O ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 14-[4-[[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 18-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]- etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- flúor-fenóxi]hexadecanoico il]sulfamoil]fenil]metóxi]fenil]tetradecanoico piridil]sulfamoil]fenóxi]octadecanoico
HO O O O O O O O O N H N NH O O O N NH O
O O S HO 13 H N N HO 10 N N N HO 14 O S H H
S O O O N NH O O O O O H H O O N O N O O O O
HO O HO O ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 16-[3-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 12-[3-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]- etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- 4-metil-pirimidin-2- etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- 158/213 il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico fenóxi]hexadecanoico piridil]sulfamoil]fenil]dodecanoico
O O O N NH O NH O O O O S O O NH N N S
O HO N N H 6
H S
O O N N HO 11 O
H O O H
N H O O O O O N HO 18 O
O O O O H HO O N O HO O O O
HO O ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 8-[4-[2-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 20-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- pirimidin-2-il]sulfamoil]fenil]hexadecanoico etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2-piridil] etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- sulfamoil]fenóxi]etil]fenil]octanoico piridil]sulfamoil]fenóxi]icosanoico
O O O O N NH O O O
N N NH N NH HO 3
O
S H O O HO 8 HO 8
H N N N N N O O O S H S H O O HO O O O O O O O O H H O N O N O O O O
HO O HO O ácido 8-[4-[2-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 10-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- ácido 10-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]-2- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- 159/213 fenóxi]etil]fenil]octanoico piridil]sulfamoil]fenil]decanoico il]sulfamoil]fenil]decanoico
HO O O O O O O N H O O N NH O O O O F S H N N S
O N N HO 3 O N NH H
O O HO 16 O O
H O N O O
HO O ácido 8-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)- ácido 18-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi) etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]- etóxi]etilamino]-2-oxo- pirimidin-2-il]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- fenil]octanoico il]sulfamoil]fenóxi]octadecanoico
[0881] 3. Insulinas e Síntese de conjugado
[0882] 3.1. Insulina humana
[0883] As sequências de aminoácido das cadeias A e B de insulina humana são:
[0884] Cadeia A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 102)
[0885] Cadeia B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO:103)
[0886] Uma ponte dissulfeto intrachenar está presente entre Cys(A6) e Cys(A11), duas pontes dissulfeto interchenar estão presentes entre Cys(A7) e Cys(B7) e entre Cys(A20) e (Cys(B19).
[0887] 3.2 Análogo de insulina 41
[0888] O análogo de insulina 41 é baseado em insulina humana com mutações nas posições A14, B16, B25 e uma remoção do aminoácido na posição B30:
[0889] Glu(A14): O aminoácido na posição 14 da cadeia A de insulina humana (Y, tirosina, Tyr) é substituído por ácido glutâmico (E, Glu),
[0890] His(B16): O aminoácido na posição 16 da cadeia B de insulina humana (Y, tirosina, Tyr) é substituído por histidina (H, His),
[0891] His(B25): O aminoácido na posição 25 da cadeia B de insulina humana (F, fenilalanina, Phe) é substituído por histidina (H, His),
[0892] Des(B30): O aminoácido na posição 30 da cadeia B de insulina humana é deletado.
[0893] A sequência de aminoácido completa de análogo de insulina 41 em vista das cadeias A e B é:
[0894] Cadeia A: GIVEQCCTSICSLEQLENYCN (SEQ ID NO: 104)
[0895] Cadeia B: FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPK- (SEQ ID NO: 105)
[0896] A uma ligação dissulfeto intrachenar e as duas interchenar são de acordo com a insulina humana.
[0897] 3.3 Conjugado com insulina humana/Síntese de ácido [16- [4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico]Lys(B29)-insulina
[0898] Um conjugado foi preparado a partir de insulina humana de acordo com 3.1 e ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético do Exemplo 2.9.
[0899] Síntese de 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1- il)óxi-2-oxo-etóxi]etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoato:
[0900] A uma solução de 296 mg de ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4- (16-terc-butóxi-16-oxo-hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético em 9 ml de DMF, 92,7 µl de trietilamina, 106 mg de TSTU e um traço de DMAP foram adicionados. A solução foi agitada por uma hora. 100 ml de cloreto de metileno foram adicionados e a solução resultante foi lavada três vezes com 50 ml de salmoura. A camada orgânica foi separada, seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo . O produto bruto foi absorvido em 11 ml de cloreto de metileno e 5,5 ml de ácido trifluoracético e armazenado de um dia para o outro a 5 °C.
[0901] A solução foi concentrada. Então, o produto bruto foi dissolvido três vezes em 30 ml de cloreto de metileno e evaporado. O material sólido foi suspenso em 5 ml de éter de metil terc-butila, o éter decantado. O resíduo foi seco a vácuo e usado sem purificação adicional.
[0902] Uma solução de 480 mg de insulina foi suspensa em 25 ml de água e então 0,45 ml de trietilamina foi adicionado. À solução transparente, 25 ml de MeCN e então 0,9 ml (45,89 mM em DMF) de
16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi-2-oxo- etóxi]etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoato foram adicionados. A solução foi agitada por 3 horas em temperatura ambiente. A reação foi analisada com Waters UPLC H-class a 214 nm em tampão fosfato de cloreto de sódio. Waters BEH300 10 cm. Tempo de retenção de insulina: 3,85 min. Tempo de retenção de conjugado de insulina 6,46 min. O produto foi purificado através de HPLC com ÄKTA avant 25, Kinetex 5 µm C18 100 A 250 x 21,2 mm.
[0903] Volume da coluna (CV) 88 ml.
[0904] Volume da coluna (CV) 88 ml.
[0905] Solvente A: ácido acético 0,5% em água
[0906] Solvente B: ácido acético 0,5 em água/MeCN 2: 8
[0907] Gradiente: A 95% B 5% a A 40% B 60% em 14 CV
[0908] A reação foi analisada com Waters UPLC H-class a 214 nm em um tampão de fosfato de cloreto de sódio. Waters BEH300 10 cm. Tempo de retenção de conjugado de insulina: 6,419 min. A solução foi liofilizada e proveu o produto desejado. 93 mg 34% de rendimento. Espectro de massa: 6629,6 g/mol.
[0909] 3.5 Conjugados com análogo de insulina 41
[0910] Conjugados de análogo de insulina 41 de acordo com 3.2 foram preparados com moléculas ligantes do Exemplo 2.9 (quanto à estrutura, vide também Tabela 1):
[0911] Ligante 5: ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico;
[0912] éster de terc-butila:
[0913] ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
[0914] Ligante 8: ácido 14-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]fenóxi]-2-flúor- fenil]tetradecanoico; éster de terc-butila:
[0915] ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[3-(14-terc-butóxi-14-oxo- tetradecil)-4-flúor-fenóxi]fenil]sulfonilamino]pirimidino-2- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
[0916] Ligante 50: ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- il]sulfamoil]-2-cloro-fenóxi]hexadecanoico; éster de terc-butila:
[0917] ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecóxi)-3-cloro-fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
[0918] Ligante 54: ácido 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2- (carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxo-etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2- il]sulfamoil]fenil]hexadecanoico; e éster de terc-butila:
[0919] ácido 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16-oxo- hexadecil)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético
[0920] 3.4.1 Síntese de Glu(A14)His(B16)His(B25) ácido [16-[4-[[5- [2-[2-[2-[2-[2-(carboximetilóxi)etóxi]etilamino]-2-oxoetóxi]etóxi]- etilcarbamoil]pirimidin-2- il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoico]Lys(B29)Des(B30)-insulina
[0921] Uma ligação amida foi formada entre o grupo ε-amino de lisina B29 e o resíduo de ácido acético ativado do ligante em sua forma de éster de terc-butila 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-terc-butóxi-16- oxo-hexadecóxi)fenil]sulfonilamino]pirimidino-5- carbonil]amino]etóxi]etóxi]acetil]amino]etóxi]etóxi]acético como segue:
[0922] uma solução de 400 mg de análogo de insulina 41 (Glu (A14) His (B16) His (B25) Des (B30)-insulina de acordo com o
Exemplo 3.2) foi suspensa em 20 ml de água e então 0,4 ml de trietilamina foi adicionado . À solução transparente, 20 ml de DMF e então 5 ml (17,04 mM em DMF) de 16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5- dioxopirrolidin-1-il) óxi-2-oxo-etóxi]etóxi]etilamino]-2-oxo- etóxi]etóxi]etilcarbamoil]pirimidin-2-il]sulfamoil]fenóxi]hexadecanoato) de terc-butila foram adicionados. A solução foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. A reação foi analisada com Waters UPLC H- class a 214 nm em um tampão de fosfato de cloreto de sódio.
[0923] Waters BEH300 de 10 cm.
[0924] Tempo de retenção de insulina: 2,643 min.
[0925] Tempo de retenção de conjugado de insulina: 6,224 min.
[0926] O produto foi purificado através de HPLC com ÄKTA avant 25,
[0927] Kinetex 5 µm C18 100 A 250 x 21,2 mm. Volume da coluna (CV) 88 ml.
[0928] Solvente A: ácido acético 0,5% em água
[0929] Solvente B: ácido acético 0,5% em água/MeCN 4:6
[0930] Gradiente: A 80% B 20% a A 20% B 80% em 10 CV
[0931] Após liofilização do produto, o pó foi dissolvido em 2 ml de ácido trifluoracético. Após uma hora, a solução foi neutralizada com bicarbonato de sódio diluído. O produto foi purificado através de HPLC com ÄKTA avant 25, Kinetex 5 µm C18 100 A 250 x 21,2 mm. Volume da coluna (CV) 88 ml.
[0932] Solvente A: ácido acético 0,5% em água
[0933] Solvente B: ácido acético 0,5% em água/MeCN 4:6
[0934] Gradiente: A 70% B 30% a A 30% B 70% em CV 8
[0935] A reação foi analisada com Waters UPLC H-class a 214 nm em tampão de fosfato de cloreto de sódio
[0936] Waters BEH300 10 cm
[0937] Tempo de retenção do conjugado de insulina: 5,121 min
[0938] A solução foi liofilizada e proveu o produto desejado.
[0939] Rendimento de 63 mg 14%.
[0940] Espectro de massa: 6453,9 g/mol.
[0941] Conjugados de ligantes 8, 50 e 54 e análogo de insulina 41 foram preparados como segue.
[0942] 4. Dados analíticos
[0943] 4.1 Análise de Cromatografia líquida espectrometria de massa (LCMS) Método de Descrição do método Tipo de espectrometria espectrometria de massa de massa Waters SQD Single Quadrupol, tempo de UPLC esi a varredura de 0,13s para massa 100-1400 Waters SQD Single Quadrupol, tempo de UPLC esi b varredura de 0,5s para massa 100-1400 Método de cromatografia Descrição do método líquida Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1,7um 2,1x50mm MV Kit; H2O+TFA A 0,05%:MeCN+TFA 0,035% 98:2(0min) a 98:2(0,2min) a 2:98(3,8min) a 2:98(4,3min) a 98:2(4,5min), 1 ml/min 55°C Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1,7um 2,1x50mm; H2O+TFA B 0,05%:MeCN+TFA 0,035% 95:5(0min) a 5:95(2min) a 5:95(2,6min) a 95:5(2,7min) a 95:5(3min), 0,9 ml/min 55°C Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1,7um 2,1x50mm; H2O+TFA C 0,05%:MeCN+TFA 0,035% 98:2(0min) a 98:2(0,2min) a 2:98(3,8min) a 2:98(4,3min) a 98:2(4,5min), 1 ml/min 55°C
[0944] A Tabela 1 na seção 4.2 mostra os resultados de análise de LCMS dos ligantes isolados.
[0945] 4.2 Análise de ligação de albumina
Instrumento: Waters Alliance 2795/Waters PDA 2996 ou Waters H-Class UPLC equipado com um detector de matriz de fotodiodos Waters Acquity Software: Waters Empower 3 Coluna: CHIRALPAK® HSA 50 x 4 mm; Tamanho de partícula 5µm Número de Ordem Chiraltech: HSA: 34712 Eluente A: Solução salina de Tampão de fosfato (PBS) em pH=7,4 Gibco PBS pH7,4 (10x) Solução Salina Tamponada com Fosfato 500 ml; Número de Ordem: 70011-036 (500 ml) Eluente B: Isopropanol Número de Ordem Fisher: A461-1 (1L)
[0946] Gradiente: Tempo [min] %A %B 0 98 2 2 98 2 17 60 40 22 60 40 22,2 98 2 30 98 2 31 95 5 Temperatura da 25 °C Coluna: Taxa de fluxo: 1,0 ml/min Detection: λ = 220 nm Volume de injeção: 20 μL Conc. da Amostra: 1 mg/ml de solução de insulina em PBS para amostras de insulina 5µL de solução de estoque de DMSO 10mM (DMSO evaporado e redissolvido em 200 µL de i-propanol/água 1:1 v/v) para amostras de ligante isoladas (250µM, 0,2mg/ml a 800Da Mol/Peso) Marcador t0 Solução de Nitrato de Sódio (NaNO3) em água, 0,05mg/ml diluído de 1 mg/ml de solução de estoque aquosa (Número de Ordem Fluka: 74246-100ML) Valor Reportado Tempo de retenção líquido da amostra: TempoRet Amostra – TempoRet marcador t0
[0947] Cromatografia de afinidade foi realizada i) para conjugados de insulina de acordo com os Exemplos 3.3 e 3.4 em um Waters Alliance Separation Module 2695 equipado com um detector de matriz de fotodiodos Waters 2996 ou Waters H-Class UPLC equipado com um detector de matriz de fotodiodos Waters Acquity e ii) para ligantes isolados de acordo com o Exemplo 2.11 em um Waters Alliance Separation Module 2795 equipado com um detector de matriz de fotodiodos Waters 2996 ou Waters H-Class UPLC equipado com um detector de matriz de fotodiodos Waters Acquity.
[0948] Waters Empower 3 foi usado para todas as medições como software de processamento de dados.
[0949] Colunas com albumina de soro humano imobilizado (50 x 4 mm; tamanho de partícula de 5 µm) foram adquiridas da Chiralpak e usadas para separações.
[0950] Solução salina de Tampão de Fosfato (PBS) foi adquirida da Gibco e usada como Eluente A, isopropanol foi comprado da Fisher e usado como Eluente B.
[0951] O gradiente aplicado com fluxo de 1,0 ml/min é mostrado abaixo: Tempo [min] %Eluente A %Eluente B 0 98 2 2 98 2 17 60 40 22 60 40 22,2 98 2 30 98 2 31 95 5
[0952] As colunas com albumina do soro imobilizada foram mantidas a 25 °C durante a operação de LC, a detecção de UV foi realizada a 220 nm e o volume de injeção foi de 20 µL.
[0953] O tempo de retenção líquido das amostras foi reportado de acordo com
[0954] Tempo de retenção líquido = TempoRet AMostra – TempoRet Marcador t0
[0955] A Tabela 1 mostra os resultados de ligação de albumina dos ligantes isolados, juntamente com os dados de LCMS da seção 4.1.
[0956] As abreviações usadas na Tabela 1 são definidas como segue:
[0957] NRT: Tempo de retenção líquido em colunas com albumina de soro humano imobilizada
[0958] LCMS: Cromatografia líquida espectrometria de massa
[0959] MSM: Método de espectrometria de massa
[0960] OIM: Massa iônica observada
[0961] OIT: Tipo de íon observado
[0962] IM: Método de ionização
[0963] LCRT: Tempo de retenção de cromatografia líquida
[0964] LCM: Método de cromatografia líquida
Tabela 1
[0965] Resultados das Colunas com dados de albumina de soro imobilizada e LCMS 169/213
Legenda: Estrutura.
[0966] Afinidade de ligação de receptor de insulina
[0967] A afinidade de ligação do receptor de insulina com a insulina, análogo de insulina 41 e os respectivos conjugados listados na Tabela 2 foi determinada como descrito em Hartmann e outros (“Effect of the long-acting insulin analogues glargine and degludeca on cardiomyocyte cell signaling and function”. Cardiovasc Diabetol. 2016; 15:96). O isolamento de membranas plasmáticas embutidas em receptor de insulina (M-IR) e experimentos de ligação de competição foram realizados como anteriormente descrito (Sommerfeld e outros, PLoS One. 2010; 5(3): e9540). Em suma, células CHO superexpressando o IR foram coletadas e ressuspensas em tampão STM 2,25 resfriado em gelo (sacarose 2,25 M, Tris-HCl 5 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e rompidas usando um homogeneizador Dounce seguido por sonificação. O homogenato foi sobreposto com tampão STM 0,8 (sacarose 0,8 M, Tris-HCl 5 mM, pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e ultra-centrifugado por 90 min a 100.000 g. Membranas plasmáticas na interface foram coletadas e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). O pelete final foi ressuspenso em tampão de diluição (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e novamente homogeneizado com um homogeneizador Dounce. Experimentos de ligação de competição foram realizados em um tampão de ligação (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, BSA 0,1%, inibidor de protease completo, ajustado para pH 7,8) em microplacas de 96 poços. Em cada poço, 2 µg de membrana isolada foram incubados com esferas de ensaio de proximidade de cintilação (SPA) de aglutinina gérmen de trigo poliviniltolueno polietilenimina. Concentrações constantes de Ins humanos marcados com [125I] (100 pM) e várias concentrações dos respectivos Ins não marcados (0,001- 1000 nM) foram adicionadas por 12 h em temperatura ambiente
(23°C). A radioatividade foi medida em equilíbrio em um contador de cintilação de microplaca (Wallac Microbeta, Freiburg, Alemanha).
[0968] A afinidade de ligação de receptor de insulina em relação à insulina humana com o análogo mostrado na Tabela 2 compreende as faixas que seguem: A (≥ 40%); B (<20%). Conjugado insulina humana + ligante no. 5 pertence à categoria A, enquanto todos os outros conjugados e o análogo de insulina 41 foram classificados na categoria B. Tabela 2
[0969] Afinidade de ligação de receptor B de insulina em relação à insulina humana No. do ligante Estrutura principal Ativação de receptor B de insulina In vitro 5 Insulina humana A 5 Análogo de insulina 41 B 8 Análogo de insulina 41 B 50 Análogo de insulina 41 B 54 Análogo de insulina 41 B --- Análogo de insulina 41 B
[0970] 6. Teste In vivo – Avaliação de efeitos farmacocinéticos
[0971] Minoporcos Göttingen normoglicêmicos saudáveis (com idade entre 8-11 meses, peso corporal ~ 12-18 kg) foram usados para avaliar os efeitos farmacodinâmicos e farmacocinéticos de análogos de insulina de ação muito longa em animais. Os porcos foram mantidos em condições normais de biotério e foram alimentados uma vez por dia com acesso à água da torneira ad libitum. Após jejum de um dia para o outro, os porcos foram tratados com uma injeção subcutânea única de uma solução que continha ou uma formulação de placebo, insulina ou um análogo de insulina ou o respectivo conjugado. Insulina humana pura e análogo de insulina puro 41, bem como o conjugado de ligante no. 5 com insulina humana e os conjugados de ligantes 5, 50 e 54 com análogo de insulina 41 foram testados.
[0972] Coleta de sangue foi realizada por meio de cateteres venosos centrais pré-implantados para determinação de glicose no sangue, farmacocinética e biomarcadores adicionais de plasma K- EDTA. A coleta de sangue começou antes da administração do item de teste (linha basal) e foi repetida 1-4 vezes por dia até o final do estudo. Durante o estudo, os animais foram alimentados após a última coleta de sangue do dia. Todos os animais foram manuseados regularmente e os sinais clínicos foram registrados pelo menos duas vezes no dia de tratamento e uma vez por dia durante o restante do estudo. Os animais foram monitorados cuidadosamente quanto a quaisquer sinais clínicos de hipoglicemia, incluindo comportamento, pelos, urina e excreção fecal, condição dos orifícios corporais e quaisquer sinais de doença. Em caso de hipoglicemia grave, o investigador tinha permissão para oferecer alimentos ou infundir solução de glicose por via intravenosa (i.v.) caso a ingestão de alimentos não fosse possível. Após a última coleta de sangue, os animais foram transportados de volta para a instalação de criação de animais não GLP.
[0973] Para determinação dos parâmetros farmacocinéticos as condições experimentais que seguem foram usadas.
[0974] 6.1 Materiais e Agente Químicos
[0975] MeCN (hyperSolv cromanorm), sulfóxido de dimetila (uvasol), 2-propanol, metanol (hyperSolv cromanorm), água (hyperSolv cromanorm), ácido fórmico (98-100%) foram comprados da Merck (Darmstadt, Alemanha). Analito e referência interna adequada foram obtidos na Sanofi. O plasma blank (K2-EDTA como anticoagulante) foi obtido na Seralab (West Sussex, Reino Unido).
[0976] 6.2 Soluções de estoque e trabalho do composto de teste e padrão interno
[0977] Soluções estoque do composto de teste e seu padrão interno foram preparadas em MeCN/água/ácido fórmico (50:50: 1, v/v/v) em uma concentração de 1 mg/ml. As soluções de trabalho do composto de teste e o padrão interno correspondente foram preparadas no mesmo solvente em uma concentração de, respectivamente, 100 µg/ml e 1250 ng/ml.
[0978] 6.3 Preparação da amostra de plasma
[0979] Uma porção de 25 µl de plasma foi salpicada com 10 µl de solução de trabalho padrão interna (1250 ng/ml) em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Após selagem e mistura, 75 µl de MeCN/metanol (80:20, v/v) foram adicionados e as amostras foram vortexadas por 5 s e vortexadas por 10 min em aproximadamente 5 °C e 3000 g. Em seguida, 75 µl de sobrenadante foram transferidos para um frasco de autoamostrador contendo 75 µl de água. Os frascos foram selados, misturados e analisados.
[0980] 6.4 Análise de LC-MS/MS
[0981] A análise LC-MS/MS da insulina intacta foi realizada em um HPLC Agilent 1290 Series (Waldbronn, Alemanha), acoplado a um espectrômetro de massa ABSciex QqQ API 4000 (Darmstadt, Alemanha). O LC foi equipado com uma coluna analítica Aeris PEPTIDE XB-C18 (100 x 2,1 mm, tamanho de partícula 3,6 µm, Phenomenex) operada a 40 °C. A Fase móvel A consistia em água/ácido fórmico/DMSO (100:0,1:1, v/v/v) e Fase móvel B em MeCN/ácido fórmico/DMSO (100:0,1:1, v/v/v). O programa de HPLC começou mantendo as condições iniciais de B 2% por 0,5 min, então um gradiente de B 2% a B 90% em 7,5 minutos foi aplicado e a coluna foi novamente equilibrada por 2 minutos. A taxa de fluxo foi de 600 µl/min e um volume de 40 µl foi injetado no sistema. O espectrômetro de massa foi operado no modo positivo em uma tensão de pulverização de íons de 5500 V e o potencial de desagregação foi otimizado para o isolamento eficiente das moléculas protonadas 5 vezes. O espectrômetro de massa estava operando em modo positivo e os parâmetros específicos do composto MS foram otimizados para melhor sensibilidade. Nitrogênio foi usado como gás de colisão.
[0982] O tempo de meia-vida dos parâmetros farmacocinéticos (PK) (t1/2) e o Tempo Médio de Residência (MRT) são mostrados na Tabela 3.
[0983] Para insulina humana, o valor de MRT da literatura obtido em miniporcos Yucatan diabéticos crônicos é dado (Senshang Lin, Li- Lan H. Chen e Yie W. Chien, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1998, 286, 959-966). O t1/2 listado foi calculado como uma aproximação usando a fórmula t1/2 * 1,44 de acordo com o livro Clinical Pharmacokinetics Concepts and applications de Tozer e Rowland, 3ª edição (Publisher Lippincott Williams & Wilkins), 1995- Seção II-6).
[0984] Como pode ser visto, conjugação de derivados de insulina, aqui insulina humana ou análogo de insulina 41, com os ligantes da invenção teve um impacto significante sobre as propriedades PK (farmacocinéticas) dos conjugados resultantes, levando em todos os casos a aumento de t1/2 e MRTs.
Tabela 3
[0985] Resultados farmacocinéticos de insulinas puras vs. conjugados No. de Estrutura Estrutura de ligante PK t1/2 MRT ligante principal --- Insulina humana ~2h** 2,8 h* Sem ligante 5 Insulina humana 30 h 47,2 h 189/213 Análogo de 5 37h 57,7 h insulina 41 Análogo de 8 38h 63,3 h insulina 41 Análogo de 50 52h 83 h insulina 41
No. de Estrutura Estrutura de ligante PK t1/2 MRT ligante principal
Análogo de 54 33h 56,5 h insulina 41
 De: Senshang Lin, Li-Lan H.
Chen e Yie W.
Chien, The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 1998, 286, 959-966,
190/213 ** Calculado a partir de t1/2 = MRT/1,44 de acordo com Clinical Pharmacokinetics Concepts and applications de Tozer e Rowland, 3a edição (Publisher Lippincott Williams & Wilkins), 1995- Seção II-6).
[0986] Os efeitos farmacodinâmicos de várias insulinas e conjugados são mostrados nas Figuras 1 e 2, isto é, o efeito sobre glicose no sangue após administração s.c. é mostrado. Os dados demonstraram um prolongamento significante da duração de ação para todos os conjugados de insulina-ligante testados (> 48 h), em relação ao análogo de insulina 41 e à insulina humana, respectivamente, para os quais uma duração de ação nas doses testadas menor do que 24 h foi observada. Para os conjugados de insulina de teste com uma afinidade de ligação de receptor de insulina reduzida, a dose in vivo escolhida foi mais alta do que para as insulinas de origem correspondentes, que não foram testadas em doses mais altas para evitar efeitos hipoglicêmicos.
[0987] Exemplo 7: Produção de insulina humana e análogos de insulina
[0988] Insulina humana, bem como os análogos da insulina, foram produzidos recombinantemente. Polinucleotídeos codificando pré-pró- insulina foram encomendados da Geneart®. Os polinucleotídeos projetados foram otimizados para expressão em leveduras. Eles foram inseridos em um vetor de expressão através de clonagem de restrição clássica permitindo expressão e secreção funcionais em Klyveromyces lactis K. Como líder de secreção, o gene foi fundido no terminal C a uma sequência de DNA codificando o sinal do fator de acoplamento alfa de Saccharomyces cerevisiae. A expressão de gene recombinante foi controlada por um promotor de K. lactis induzível por lactose.
[0989] Insulina humana, bem como análogos da insulina, foram fabricados como uma pré-pró-insulina. Uma pré-sequência N-terminal geneticamente fundida foi usada para melhorar os rendimentos de expressão e secreção e para estabilizar o peptídeo no caldo de cultura. Uma ampla variedade de sequências pode ser usada para esse propósito e foram testadas quanto à eficiência. A pró-insulina em si consiste em uma cadeia B fundida a um peptídeo C seguido pela cadeia A do terminal C. Como peptídeo C, uma variedade de combinações de aminoácidos é descrita. Foi mostrado que peptídeos curtos de 1-10 aminoácidos funcionam bem como sequências C. Para processamento posterior da insulina, os locais de reconhecimento para proteases específicas, que flanqueiam o peptídeo C para permitir sua excisão, são importantes.
[0990] As células de K. lactis foram tornadas competentes por meios químicos. Subsequentemente, as células foram transformadas com o plasmídeo de expressão codificando a respectiva pré-pró- insulina. Após inserção do plasmídeo, as células foram plaqueadas em placas de ágar seletivas contendo geneticina. Colônias cultivadas foram isoladas e testadas quanto à expressão de gene recombinante. As células foram cultivadas até densidades celulares suficientemente altas em meio de dextrose peptona levedura suplementado com geneticina. Após uma fase de crescimento inicial, um meio de extrato de levedura tamponado com sal com geneticina suplementado com lactose foi adicionado às culturas para induzir expressão do gene recombinante. As culturas foram cultivadas vários dias e os sobrenadantes foram colhidos através de centrifugação.
[0991] Purificação da insulina funcional ou análogos da insulina foi iniciada através de um procedimento de filtragem. Procedimento de captura cromatográfica inicial foi feito com uma resina de troca iônica. Clivagem da pré-pró-insulina em insulina foi realizada com uma protease altamente específica. Depleções de proteína de célula hospedeira, pré-sequência e produtos relacionados a produto foram feitas por uma cascata de duas etapas cromatográficas adicionais. Próximo a uma cromatografia de interação hidrofóbica, um outro procedimento de troca iônica foi aplicado para atingir esse objetivo. Polimento final foi feito através de cromatografia de fase reversa.
Filtragem, precipitação e secagem por congelamento foram utilizadas para finalizar o processo de produção da molécula de insulina.
[0992] Após reações de acoplamento com um derivado de ácido carboxílico ativado, a solução com moléculas de insulina conjugadas foi filtrada. Purificação final foi feita através de cromatografia de fase reversa. Filtragem, precipitação e secagem por congelamento foram usadas para finalizar a síntese da molécula-alvo.
[0993] Vários análogos de insulinas com mutações, por exemplo, nas posições B16, B25 e/ou A14 foram gerados. A Tabela 4 provê uma visão geral das insulinas geradas.
[0994] Tabela 4: análogos gerados de insulina humana Análogo Estrutura principal A14 B16 B25 Cadeia A da sequência SEQ ID NO Cadeia B da sequência de SEQ ID NO (Cadeia de aminoácido (Cadeia A) aminoácido B) WT Insulina humana (tipo Tyr Tyr Phe GIVEQCCTSICSLYQLE 1 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 2 selvagem) NYCN GERGFFYTPKT 2 Glu(A14)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Phe GIVEQCCTSICSLEQLE 3 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 4
NYCN GERGFFYTPK 3 Leu(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Leu Phe GIVEQCCTSICSLYQLE 5 FVNQHLCGSHLVEALLLVC 6
NYCN GERGFFYTPK 4 Gly(A21)Trp(B16)Des(B30)- Tyr Trp Phe GIVEQCCTSICSLYQLE 7 FVNQHLCGSHLVEALWLVC 8 194/213 Insulina NYCG GERGFFYTPK 5 His(B16)Des(B30)-Insulina Tyr His Phe GIVEQCCTSICSLYQLE 9 FVNQHLCGSHLVEALHLVC 10
NYCN GERGFFYTPK 6 Val(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Val Phe GIVEQCCTSICSLYQLE 11 FVNQHLCGSHLVEALVLVC 12
NYCN GERGFFYTPK 7 Ala(B25)-Insulina Tyr Tyr Ala GIVEQCCTSICSLYQLE 13 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 14
NYCN GERGFAYTPKT 8 Ala(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Ala GIVEQCCTSICSLYQLE 15 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 16
NYCN GERGFAYTPK 9 Glu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Glu GIVEQCCTSICSLYQLE 17 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 18
NYCN GERGFEYTPK 10 His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr His GIVEQCCTSICSLYQLE 19 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 20
NYCN GERGFHYTPK
Análogo Estrutura principal A14 B16 B25 Cadeia A da sequência SEQ ID NO Cadeia B da sequência de SEQ ID NO (Cadeia de aminoácido (Cadeia A) aminoácido B) 11 Leu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Leu GIVEQCCTSICSLYQLE 21 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 22
NYCN GERGFLYTPK 12 Val(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Val GIVEQCCTSICSLYQLE 23 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 24
NYCN GERGFVYTPK 13 His(B16)His(B25)Des(B30)- Tyr His His GIVEQCCTSICSLYQLE 25 FVNQHLCGSHLVEALHLVC 26 Insulina NYCN GERGFHYTPK 14 Gly(A21)Trp(B16)His(B25)Des Tyr Trp His GIVEQCCTSICSLYQLE 27 FVNQHLCGSHLVEALWLVC 28 (B30)-Insulina NYCG GERGFHYTPK 195/213 15 Gly(A21)Trp(B16)Trp(B25)Des Tyr Trp Trp GIVEQCCTSICSLYQLE 29 FVNQHLCGSHLVEALWLVC 30 (B30)-Insulina NYCG GERGFWYTPK 16 Glu(A14)His(B16)Des(B30)- Glu His Phe GIVEQCCTSICSLEQLE 31 FVNQHLCGSHLVEALHLVC 32 Insulina NYCN GERGFFYTPK 17 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B16)Des Glu Trp Phe GIVEQCCTSICSLEQLE 33 FVNQHLCGSHLVEALWLVC 34 (B30)-Insulina NYCG GERGFFYTPK 18 Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)- Glu Ile Phe GIVEQCCTSICSLEQLE 35 FVNQHLCGSHLVEALILVC 36 Insulina NYCN GERGFFYTPK 19 Glu(A14)Val(B16)Des(B30)- Glu Val Phe GIVEQCCTSICSLEQLE 37 FVNQHLCGSHLVEALVLVC 38 Insulina NYCN GERGFFYTPK 20 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Des( Glu Val Phe GIVEQCCTSICSLEQLE 39 FVEQHLCGSHLVEALVLVC 40 B30)-Insulina NYCN GERGFFYTPK 21 Glu(A14)His(B25)Des(B30)- Glu Tyr His GIVEQCCTSICSLEQLE 41 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 42
Análogo Estrutura principal A14 B16 B25 Cadeia A da sequência SEQ ID NO Cadeia B da sequência de SEQ ID NO (Cadeia de aminoácido (Cadeia A) aminoácido B) Insulina NYCN GERGFHYTPK 22 Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)- Glu Tyr Ile GIVEQCCTSICSLEQLE 43 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 44 Insulina NYCN GERGFIYTPK 23 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B25)Des Glu Tyr Trp GIVEQCCTSICSLEQLE 45 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 46 (B30)-Insulina NYCG GERGFWYTPK 24 Glu(A14)Val(B25)Des(B30)- Glu Tyr Val GIVEQCCTSICSLEQLE 47 FVNQHLCGSHLVEALYLVC 48 Insulina NYCN GERGFVYTPK 25 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val( Glu Tyr Val GIVEQCCTSICSLEQLE 49 FVEQHLCGSHLVEALYLVC 50
196/213 B25)Des(B30)-Insulina NYCG GERGFVYTPK 26 Glu(A14)Glu(B16)His(B25)Des Glu Glu His GIVEQCCTSICSLEQLE 51 FVNQHLCGSHLVEALELVC 52 (B30)-Insulina NYCN GERGFHYTPK 27 Glu(A14)His(B16)Ala(B25)Des Glu His Ala GIVEQCCTSICSLEQLE 53 FVNQHLCGSHLVEALHLVC 54 (B30)-Insulina NYCN GERGFAYTPK 28 Glu(A14)His(B16)His(B25)Des Glu His His GIVEQCCTSICSLEQLE 55 FVNQHLCGSHLVEALHLVC 56 (B30)-Insulina NYCN GERGFHYTPK 29 Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des( Glu Ile Ile GIVEQCCTSICSLEQLE 57 FVNQHLCGSHLVEALILVC 58 B30)-Insulina NYCN GERGFIYTPK 30 Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B2 Glu Ile Ile GIVEQCCTSICSLEQLE 59 FVEQHLCGSHLVEALILVC 60 5)Des(B30)-Insulina NYCN GERGFIYTPK 31 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B Glu Ile Trp GIVEQCCTSICSLEQLE 61 FVEQHLCGSHLVEALILVC 62 16)Trp(B25)Des(B30)-Insulina NYCG GERGFWYTPK
Análogo Estrutura principal A14 B16 B25 Cadeia A da sequência SEQ ID NO Cadeia B da sequência de SEQ ID NO (Cadeia de aminoácido (Cadeia A) aminoácido B) 32 Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des( Glu Ile Val GIVEQCCTSICSLEQLE 63 FVNQHLCGSHLVEALILVC 64 B30)-Insulina NYCN GERGFVYTPK 33 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B Glu Ile Val GIVEQCCTSICSLEQLE 65 FVEQHLCGSHLVEALILVC 66 16)Val(B25)Des(B30)-Insulina NYCG GERGFVYTPK 34 Glu(A14)Leu(B16)Ala(B25)De Glu Leu Ala GIVEQCCTSICSLEQLE 67 FVNQHLCGSHLVEALLLVC 68 s(B30)-Insulina NYCN GERGFAYTPK 35 Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des( Glu Val Ile GIVEQCCTSICSLEQLE 69 FVNQHLCGSHLVEALVLVC 70 B30)-Insulina NYCN GERGFIYTPK
197/213 36 Glu(A14)Gly(A21)Val(B16)Trp( Glu Val Trp GIVEQCCTSICSLEQLE 71 FVNQHLCGSHLVEALVLVC 72 B25)Des(B30)-Insulina NYCG GERGFWYTPK 37 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val( Glu Val Trp GIVEQCCTSICSLEQLE 73 FVEQHLCGSHLVEALVLVC 74 B16)Trp(B25)Des(B30)- NYCG GERGFWYTPK Insulina 38 Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des Glu Val Val GIVEQCCTSICSLEQLE 75 FVNQHLCGSHLVEALVLVC 76 (B30)-Insulina NYCN GERGFVYTPK 39 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val( Glu Val Val GIVEQCCTSICSLEQLE 77 FVEQHLCGSHLVEALVLVC 78 B25)Des(B30)-Insulina NYCN GERGFVYTPK 40 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val( Glu Val Val GIVEQCCTSICSLEQLE 79 FVEQHLCGSHLVEALVLVC 80 B16)Val(B25)Des(B30)- NYCG GERGFVYTPK Insulina
[0995] Exemplo 8: ensaios de afinidade de ligação de receptor de insulina/ensaios de autofosforilação de receptor de insulina
[0996] Ligação de insulina e transdução de sinal de vários análogos de insulina gerados foram determinadas através de um ensaio de ligação e um ensaio de autofosforilação de receptor. A) Ensaio de afinidade de ligação de receptor de insulina
[0997] Afinidade de ligação de receptor de insulina com os análogos listados na Tabela 4 foi determinada como descrito em Hartmann e outros (“Effect of the long-acting insulin analogs glargine and degludeca on cardiomyocite cell signaling and function”. Cardiovasc Diabetol. 2016;15:96). Isolamento de membranas plasmáticas embutidas no receptor de insulina (M-IR) e experimentos de ligação de competição foram realizados como descrito anteriormente (Sommerfeld e outros, PLoS One. 2010; 5 (3): e9540). Em suma, células CHO superexpressando o IR foram coletadas e ressuspensas em tampão STM 2,25 resfriado em gelo (sacarose 2,25 M, Tris-HCl 5 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e rompidas usando um homogeneizador Dounce seguido por sonificação. O homogenato foi sobreposto com tampão STM 0,8 (sacarose 0,8 M, Tris-HCl 5 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e ultracentrifugado por 90 min a 100.000 g. Membranas plasmáticas na interface foram coletadas e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). O pelete final foi ressuspenso em tampão de diluição (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e novamente homogeneizado com um homogeneizador Dounce. Os experimentos de ligação de competição foram realizados em um tampão de ligação (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, BSA 0,1%, inibidor de protease completo, ajustado para pH 7,8) em microplacas de 96 poços. Em cada poço 2 µg de membrana isolada foram incubados com esferas de ensaio de proximidade de cintilação (SPA) de gérmen de trigo aglutinina poliviniltolueno polietilenimina. Concentrações constantes de insulina humana marcada com [125I] (100 pM) e várias concentrações da respectiva insulina não marcada (0,001–1000 nM) foram adicionadas por 12 h em temperatura ambiente (23 °C). A radioatividade foi medida em equilíbrio em um contador de cintilação de microplaca (Wallac Microbeta, Freiburg, Alemanha).
[0998] Os resultados dos ensaios de afinidade de ligação de receptor de insulina para os análogos testados em relação à insulina humana são mostrados na Tabela 5. B) Ensaios de autofosforilação de receptor de insulina (como uma medida para transdução de sinal)
[0999] A fim de determinar transdução de sinal de um análogo de insulina se ligando a receptor B de insulina, autofosforilação foi medida in vitro.
[01000] Células CHO expressando isoforma B de receptor de insulina humana (IR-B) foram usadas para ensaios de autofosforilação de IR usando tecnologia In-Cell Western como descrito anteriormente (Sommerfeld e outros, PLoS One. 2010; 5 (3): e9540). Para a análise da autofosforilação de IGF1R, o receptor foi superexpresso em uma linhagem celular 3T3 Tet off de fibroblasto de embrião de camundongo (BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha) que foi transfectada estavelmente com plasmídeo de expressão regulável por tetraciclina IGF1R. A fim de determinar o nível de fosforilação de tirosina do receptor, as células foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas por 44 h. As células foram privadas de soro com meio sem soro F12 da HAM (Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) por 2 h. As células foram subsequentemente tratadas com concentrações crescentes ou de insulina humana ou do análogo de insulina por 20 min a 37 °C. Após a incubação o meio foi descartado e as células fixadas em paraformaldeído 3,75% recém-preparado por 20 min. As células foram permeabilizadas com Triton X-100 0,1% em PBS por 20 min. Bloqueio foi realizado com tampão de bloqueio Odyssey (LICOR, Bad Homburg, Alemanha) por 1 hora em temperatura ambiente. Anti- pTyr 4G10 (Millipore, Schwalbach, Alemanha) foi incubado por 2 h em temperatura ambiente. Após incubação do anticorpo primário, as células foram lavadas com PBS + Tween 20 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O anticorpo -anticamundongo secundário -IgG-800- CW (LICOR, Bad Homburg, Alemanha) foi incubado por 1 h. Os resultados foram normalizados através da quantificação de DNA com corante TO-PRO3 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Os dados foram obtidos como unidades relativas (RU). Os resultados dos ensaios de autofosforilação de receptor de insulina para os análogos testados em relação à insulina humana são mostrados na Tabela 5.
[01001] Tabela 5. Afinidades de ligação de receptor de insulina relativas e atividades de autofosforilação de análogos testados de insulina humana (quanto às sequências, vide Tabela 4) Análo Estrutura principal A14 B16 B25 Afinidade Atividade go de ligação de de receptor autofosforil de insulina* ação* WT Insulina humana (tipo selvagem) Tyr Tyr Phe 1 1 2 Glu(A14)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Phe 1,05 0,87 3 Leu(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Leu Phe 0,24 0,34 4 Gly(A21)Trp(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Trp Phe 0,57 0,4 5 His(B16)Des(B30)-Insulina Tyr His Phe nd nd 6 Val(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Val Phe nd 0,32 7 Ala(B25)-Insulina Tyr Tyr Ala 0,05 0,2 8 Ala(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Ala nd 0,17 9 Glu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Glu nd nd 10 His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr His 0,37 0,31 11 Leu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Leu 0,01 0,06
Análo Estrutura principal A14 B16 B25 Afinidade Atividade go de ligação de de receptor autofosforil de insulina* ação* 12 Val(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Val 0,01 0,06 13 His(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr His His 0,11 0,1 14 Gly(A21)Trp(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Trp His 0,4 0,35 15 Gly(A21)Trp(B16)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Trp Trp 0,43 0,38 16 Glu(A14)His(B16)Des(B30)-Insulina Glu His Phe 0,36 0,29 17 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B16)Des(B30)-Insulina Glu Trp Phe 0,63 0,38 18 Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-Insulina Glu Ile Phe 0,23 0,18 19 Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-Insulina Glu Val Phe nd 0,32 20 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Des(B30)-Insulina Glu Val Phe 0,4 0,28 21 Glu(A14)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr His nd nd 22 Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Ile 0,01 0,04 23 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Trp 0,56 0,37 24 Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Val 0,01 0,04 25 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)- Glu Tyr Val 0,02 0,03 Insulina 26 Glu(A14)Glu(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu Glu His 0,01 0,07 27 Glu(A14)His(B16)Ala(B25)Des(B30)-Insulina Glu His Ala 0,11 28 Glu(A14)His(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu His His 0,12 0,11 29 Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Ile 0,01 30 Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)- Glu Ile Ile 0** 0,01 Insulina 31 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Trp(B25)D Glu Ile Trp 0,12 0,13 es(B30)-Insulina 32 Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Val 0 0,04 33 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)D Glu Ile Val 0,01 0,02 es(B30)-Insulina 34 Glu(A14)Leu(B16)Ala(B25)Des(B30)- Glu Leu Ala 0,01 0,04 Insulina 35 Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Ile 0 0,01 36 Glu(A14)Gly(A21)Val(B16)Trp(B25)Des(B30 Glu Val Trp 0,17 0,23 )-Insulina 37 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Trp(B25) Glu Val Trp 0,21 0,19 Des(B30)-Insulina 38 Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Val 0 0,03
Análo Estrutura principal A14 B16 B25 Afinidade Atividade go de ligação de de receptor autofosforil de insulina* ação* 39 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- Glu Val Val 0 0,02 Insulina 40 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)D Glu Val Val 0,01 0,01 es(B30)-Insulina  em relação à insulina humana , nd: não determinado
[01002] ** um valor de 0 significa que a afinidade de ligação estava abaixo do limite de detecção C) Conclusões
[01003] Como pode ser apreendido da Tabela 5, várias substituições hidrofóbicas nas posições B16 e/ou B25 foram testadas (triptofano, alanina, valina, leucina e isoleucina). Embora em uma extensão diferente, todos os análogos de insulina testados com substituições hidrofóbicas nessas posições mostraram uma diminuição de atividade de ligação de receptor de insulina. Comparado com as substituições de triptofano (vide, por exemplo, Análogos 4, 15 e 23), substituições com aminoácidos alifáticos tais como alanina, valina, leucina e isoleucina tiveram um impacto mais forte sobre atividade de ligação de receptor de insulina. Os efeitos mais fortes foram observados para valina, leucina e isoleucina, que são todos aminoácidos de cadeia ramificada. Substituições por isoleucina, valina e leucina resultaram em uma diminuição significativa de atividade de ligação a receptor de insulina. Interessantemente, análogos de insulina com tais substituições na posição B25 (tais como substituição de valina, leucina ou isoleucina em B25, Análogos 11, 12, 22, 24, 25, 29, 30, 32, 33, 35 38, 39, 40) mostraram aumento de até 6 vezes em transdução de sinal do que o esperado com base em suas afinidades de ligação com IR-B. Especificamente, Leu(B25)Des(B30)-insulina e Val(B25)Des(B30)-Insulina (Análogos 11 e 12, respectivamente)
mostraram apenas 1% de ligação ao receptor B de insulina e 6% de autofosforilação em relação à insulina humana. Similarmente, uma única substituição de leucina na posição B16 (Análogo 3) também mostrou um aumento similar em transdução de sinal, embora em uma extensão ligeiramente menor. Por comparação, com exceção do Análogo 26, análogos com uma substituição de histidina B25 (Análogos 10, 13, 14, 21, 28) também mostraram ligação reduzida a receptor, no entanto, uma redução concomitante na autofosforilação.
[01004] Em alguns casos (Análogos 30, 32, 35, 38, 39), ligação a receptor de insulina foi 0% enquanto ainda mostrando atividade no ensaio de autofosforilação. Todos esses análogos têm combinações de substituições de valina e/ou isoleucina nas posições B16 e B25 em comum, sugerindo que a combinação é responsável pela queda adicional em ligação a receptor de insulina. Insulinas sem substituição na posição B25, mas com trocas na posição B16, exibiram afinidades de ligação ligeiramente maiores em comparação com seus valores de autofosforilação (Análogos 3, 4, 16, 17, 18, 19, 20).
[01005] Alanina na posição B25 mostra efeitos similares aos da substituição de valina, leucina ou isoleucina (análogos 11, 12, 22), embora em um grau menor. A afinidade de ligação com receptor e a atividade de autofosforilação de análogos com substituição de valina, leucina ou isoleucina são menores do que análogos com uma substituição de alanina.
[01006] Exemplo 9: determinação de estabilidade in vitro em proteases recombinantes diferentes e fluido gástrico simulado
[01007] Análogos de insulina gerados foram testados quanto à estabilidade proteolítica (α-quimiotripsina, catepsina D, enzima de degradação de insulina (IDE) e fluido gástrico simulado). Condições de ensaio
Protease Concentração de protease Sistema de tampão usado final no ensaio [µg/ml] Tripsina 2 Bicarbonato de amônio 0,1 M, pH 8,3 α-Quimiotripsina 0,5 Bicarbonato de amônio 0,1 M, pH 8,3 Carboxipeptidase A 0,1 Pré-ativação (60 min) com Tripsina em tampão de TCNB, Ensaio Tris-Buffer 7,5 Carboxipeptidase B 0,1 Pré-ativação (30 min) com Tripsina em tampão de TCNB, Assay Tris-Buffer 7,5 Catepsina D 2 Tampão de Acetato, pH 4,5 IDE 2 Tris-Buffer pH 7,5 Preparação de fluido gástrico simulado
[01008] Dois gramas de cloreto de sódio e 3,2 g de pepsina purificada (da mucosa do estômago de suíno, com uma atividade de 800 a 2500 unidades por mg de proteína) foram dissolvidos em 7,0 ml de ácido clorídrico. O volume foi ajustado com água até 1000 ml. A solução resultante foi misturada e ajustada com hidróxido de sódio 0,2 N ou ácido clorídrico 0,2 N para um pH de 1,2 ± 0,1, C)procedimento geral de ensaio
[01009] A determinação da estabilidade foi feita em pontos de tempo apropriados (para SIF e SGF 15, 30, 60, 120 e 240 minutos; para proteases 15, 30, 60 e 120 minutos). A incubação foi feita a 37 °C e a % de composto de origem remanescente foi calculada em referência a um ponto de tempo T0.
[01010] Para a determinação do composto de origem, um método bioanalítico de LC-MS/MS ou LC-HRMS apropriado foi usado, usando o sobrenadante, após precipitação de proteína com etanol (1 eq. v/v) e uma etapa de centrifugação. D) Preparação de amostras
[01011] Os compostos foram dissolvidos em ácido clorídrico diluído em uma concentração final de 40 μM. A concentração de composto no ensaio foi de 2 µM. Uma diluição de 1:20 da solução de trabalho foi feita no tampão de protease e as amostras são então incubadas a 37°C, sob agitação. No ponto de tempo apropriado uma alíquota foi retirada, a reação foi extinta com etanol (1 eq. v/v), então centrifugada. O sobrenadante foi analisado. E) Conclusões
[01012] Em particular, as substituições de aminoácidos lipofílicos tais como valina e isoleucina nas posições 16 e 25 na cadeia B foram investigadas. Dos análogos testados (2, 7, 11, 12, 14, 16, 19, 22, 23, 24 e 38), apenas pequenas diferenças em estabilidade foram observadas contra as proteases tripsina, carboxipeptidase A e carboxipeptidase B em relação à insulina humana (dados não mostrados). Em geral, todos os análogos com substituição de A14 e B25 (Análogos 22, 24, 38) mostraram estabilidade proteolítica melhorada contra α-quimiotripsina, catepsina D e enzima de degradação de insulina (IDE). Por exemplo, no caso de α- quimiotripsina, insulina humana foi completamente degradada dentro de 2 horas enquanto o análogo 22 era quase completamente resistente. Similarmente, todos os análogos substituídos com B25 testados mostraram estabilidade melhorada contra a catepsina D, embora com o análogo 38 (uma variante de B16/B25) mostrando estabilidade superior comparado com as outras variantes de B25.
[01013] Uma exceção notável foi observada no caso de IDE, no qual o análogo 19 com substituições A14/B16 mostrou desempenho melhorado comparado com as variantes de B25. Os dados sugerem, no entanto, que uma substituição em A14, testada aqui com ácido glutâmico, é importante para estabilidade aumentada. Outras substituições também foram mostradas ser benéficas para estabilidade aumentada: tais como substituições na posição B16 e na posição B25. Por exemplo, o análogo 7 com uma troca de aminoácido na posição B25 levou à instabilidade aumentada.
[01014] Tabela 6: Porcentagem de análogo de insulina restante após incubação de análogos de insulina diferentes por 30 ou 120 minutos com quatro proteases diferentes (quanto às sequências dos análogos testados, vide Tabela 4). Análogo Estrutura A14 B16 B25 Fluido α- Catepsina Enzima de principal gástrico Quimiotripsi D degradação de (30 na (30 insulina, IDE minutos) (120 minutos) (30 minutos) [%] minutos) [%] [%] [%] WT Insulina Tyr Tyr Phe 0 5 0 38
2 Glu(A14) Glu Tyr Phe 0 35 0 81 Des(B30) -Insulina 7 Ala(B25)- Tyr Tyr Ala 30 58 52 2 Insulina 11 Leu(B25) Tyr Tyr Leu nd nd nd 12 Des(B30) -Insulina 12 Val(B25) Tyr Tyr Val 44 31 43 11 Des(B30) -Insulina 14 Gly(A21) Tyr Trp His nd nd nd 41 Trp(B16) His(B25) Des(B30) -Insulina 16 Glu(A14) Glu His Phe nd nd nd 88 His(B16) Des(B30) -Insulina 19 Glu(A14) Glu Val Phe 0 30 0 98 Val(B16) Des(B30) -Insulina 22 Glu(A14) Glu Tyr Ile 52 99 20 77
Análogo Estrutura A14 B16 B25 Fluido α- Catepsina Enzima de principal gástrico Quimiotripsi D degradação de (30 na (30 insulina, IDE minutos) (120 minutos) (30 minutos) [%] minutos) [%] [%] [%] Ile(B25)D es(B30)- Insulina 23 Glu(A14) Glu Tyr Trp nd nd nd 80 Gly(A21) Trp(B25) Des(B30) -Insulina 24 Glu(A14) Glu Tyr Val 52 40 59 86 Val(B25) Des(B30) -Insulina 38 Glu(A14) Glu Val Val 36 34 62 86 Val(B16) Val(B25) Des(B30) -Insulina
[01015] n.d.: não determinado
[01016] Exemplo 10: geração de conjugados adicionais – teste in vivo – avaliação de efeitos farmacocinéticos
[01017] Os conjugados de insulina 1 a 4 foram preparados (como descrito no Exemplo 3.4.1) e testados. Como um controle, o conjugado de insulina 5 foi preparado, o qual tinha sido descrito no WO2018109162A1.
[01018] Os conjugados de insulina preparados são sumarizados na tabela que segue (Tabela 7).
[01019] Ainda, os conjugados de insulina 1 a 4 são mostrados nas Figs. 5 a 8.
[01020] Tabela 7. Visão geral dos Conjugados 1 a 5
Conjug Estrutura principal de Cadeia Ligante de albumina ado de insulina* lateral insulina
O O O Conjug Glu(A14)Val(B25)Des(B Ligante HO
O N N H O O H N O O OH NH O
S N ado 1 30)-Insulin a No. 5 na O O (vide (Análogo 24 na Tabela Tabela 1 Figura 4) 5)
O O Conjug Glu(A14)Val(B25)Des(B Ligante O O N N
H O O H N O O OH F S O O N N
H ado 2 30)-Insulina No. 8 na HO O (vide (Análogo 24 na Tabela Tabela 1 Figura 4) 6)
O O Conjug Glu(A14)Glu(B3)Val(B16 Ligante HO
O N N H O O H N O O O OH NH O
S N ado 3 )Val(B25)Des(B30)- No. 5 na O O (vide Insulin a Tabela 1 Figura (Análogo 39 na Tabela 7) 4)
O O Conjug Glu(A14)Ile(B25)Des(B3 Ligante HO
O N N H O O H N O O O OH NH O
S N ado 4 0)-Insulina No. 5 na O O (vide (Análogo 22 na Tabela Tabela 1 Figura 4) 8) Conjug Glu(A14)His(B16)His(B2 Eicosandi Eicosandioil-gamaGlu-OEG2 ado 5 5)Des(B30)-Insulina oil- (descrie Análogo 28 na Tabela 4 gamaGlu- d no OEG2 WO201 810916 2A1)
[01021] *quanto à sequência, vide Tabela 4 no Exemplo 7
[01022] Miniporcos Göttingen normoglicêmicos saudáveis foram usados para avaliar os efeitos farmacodinâmicos e farmacocinéticos de conjugados de insulina de ação muito longa in vivo (porcos entre 0,5-6 anos foram usados com faixas de peso corporal, dependendo da idade, entre ~ 12-40 kg). Os porcos foram mantidos sob condições de alojamento de animais de laboratório normais e foram alimentados uma vez por dia com acesso ad libitum à água da torneira. Após jejum de um dia para o outro, os porcos foram tratados com uma injeção subcutânea única de uma solução que contém ou uma formulação de placebo ou o respectivo conjugado de insulina. Os conjugados de insulina 1-4 bem como o conjugado de insulina 5 (descrito no WO2018109162A1) foram testados.
[01023] Coleta de sangue foi realizada por meio de cateteres venosos centrais pré-implantados para determinação de glicose no sangue, farmacocinética e biomarcadores adicionais de plasma K- EDTA. Coleta de sangue começou antes da administração do item de teste (linha basal) e foi repetida 1-4 vezes por dia até o final do estudo. Durante o estudo, os animais foram alimentados após a última coleta de sangue do dia. Todos os animais foram manuseados regularmente e sinais clínicos foram registados pelo menos duas vezes no dia de tratamento e uma vez por dia durante o restante do estudo. Os animais foram monitorados cuidadosamente quanto a quaisquer sinais clínicos de hipoglicemia, incluindo comportamento, pelo, urina e excreção fecal, condição dos orifícios corporais e quaisquer sinais de doença. Em caso de hipoglicemia grave, o investigador tinha permissão para oferecer alimentos ou infundir solução de glicose por via intravenosa (i.v.), caso a ingestão de alimentos não fosse possível. Após a última coleta de sangue, os animais foram transportados de volta ao biotério. A) Efeitos sobre glicose no sangue em jejum
[01024] Os resultados são também mostrados na Figura 3.
[01025] Tabela 8: Efeito sobre glicose no sangue Conjugado Estrutura principal de insulina Cadeia Dose Duração de Diminuição de Insulina lateral [nM/kg] FPG de de glicose diminuição de máxima [%] glicose >15% vs Placebo [h]
Conjugado Estrutura principal de insulina Cadeia Dose Duração de Diminuição de Insulina lateral [nM/kg] FPG de de glicose diminuição de máxima [%] glicose >15% vs Placebo [h] Conjugado Glu(A14)Val(B25)Des(B30)- ligante No. 5 30 >128 45 1 insulina (Análogo 24 na Tabela 4) Conjugado Glu(A14)Val(B25)Des(B30)- ligante No. 8 30 >104 39 2 Insulina, (Análogo 24 na Tabela 4) Conjugado Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B2 ligante No. 5 30 >152 30 3 5)Des(B30)-insulina (Análogo 39 na Tabela 4) Conjugado Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)- ligante No. 5 30 >104 27 4 insulina (Análogo 22 na Tabela 4) Conjugado Glu(A14)His(B16)His(B25)Des( Eicosandioil- 18 >128 62 5 B30)-Insulina, Análogo 28 na Glu-OEG2 Tabela 4 B) Medição de parâmetros farmacocinéticos
[01026] Os resultados são também mostrados na Figura 4.
[01027] Tabela 9. Efeito sobre Glicose no Sangue Conjugado Sequência Cadeia Dose PK PK t½ Lateral [nM/kg] tmax [h] [h] Conjugado Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulin ligante No. 5 30 8 45 1 Conjugado Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulin ligante No. 8 30 20 38,9 2 Conjugado Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulin ligante No. 5 30 8 42,8 3 Conjugado Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulin ligante No. 5 30 14,7 45,2 4 Conjugado Glu(A14)His(B16)His(B25)Des(B30)-Insulin Eicosandioil- 18 32 39 5 Glu-OEG2 C) Conclusões
[01028] Uma administração única de conjugado de insulina 4 (Ile (B25)), dosado a 30 nM/kg, exibiu um efeito de diminuição de glicose de baixo a moderado com um perfil estável de até 152 horas. O conjugado de insulina 3, que contém as mutações Val(B16) e Val(B25), exibiu um perfil estável de até 152 horas com um efeito de diminuição de glicose moderado a médio. Ainda, ambos os conjugados de insulina 1 e 2, contendo a mutação Val(B25), levam a um efeito de diminuição de glicose estável sem indução de hipoglicemia em uma dose de 30 nM/kg. Em contraste, o conjugado de insulina 5 (descrito no WO2018109162A1) foi verificado exibir efeito de redução da glicose mais forte com um perfil de ação de tempo menos estável comparado com os conjugados de insulina 1-4 em uma dose de apenas 18 nM/kg. O composto pode ter um risco maior de hipoglicemia.
[01029] Os parâmetros farmacocinéticos mostram que os conjugados de insulina 1-4 exibem um Tmax anterior na faixa de 8-20 horas em combinação com um platô em Cmax de até 50 horas. Uma vez que eles exibem um t½ longo terminal na faixa de 39-45 horas, um perfil PK (farmacocinético) estável é obtido, o que é desejado para dosagem uma vez por semana devido ao risco potencialmente reduzido de eventos hipoglicêmicos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[01030] A Figura 1 mostra o efeito de diminuição de glicose no sangue após aplicação s.c. dos conjugados de análogo de insulina 41 com ligante no. 50 e ligante no. 54, respectivamente, em miniporcos (Göttingen) (12-18 kg, n = 3). Ambos compostos foram testados em uma dose de (18 nmol/kg).
[01031] A Figura 2 mostra o efeito de diminuição de glicose no sangue após aplicação s.c. das insulinas e conjugados de insulina, respectivamente, em miniporcos (Göttingen) (19-20 kg, n = 3): Insulina humana + ligante no. 5 (18 nmol/kg), insulina humana (3 nmol/kg),
análogo de insulina 41 + ligante no. 5 (18 nmol/kg), análogo da insulina 41 (3 nmol/kg).
[01032] A Figura 3 mostra os níveis de glicose no sangue [% em relação ao placebo] após administração subcutânea de conjugados de insulina 1 a 5 (vide Tabela 7 no Exemplo 10).
[01033] A Figura 4 mostra as curvas de concentração no plasma [ng/ml] - tempo [h] normalizadas para conjugados de insulina 1 a 5 (vide Tabela 7 no Exemplo 10).
[01034] A Figura 5 mostra o conjugado de insulina No. 1 (vide Exemplo 10 para mais detalhes). As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 47) e da cadeia B (SEQ ID NO: 48) são indicadas em código de três letras, exceto o último aminoácido na cadeia B (lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (por meio do aminoácido épsilon do resíduo de lisina).
[01035] A Figura 6 mostra o conjugado de insulina No. 2 (vide Exemplo 10 para mais detalhes). As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 47) e da cadeia B (SEQ ID NO: 48) são indicadas em código de três letras, exceto o último aminoácido na cadeia B (lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (por meio do aminoácido epsilon do resíduo de lisina).
[01036] A Figura 7 mostra o conjugado de insulina No. 3 (vide Exemplo 10 para mais detalhes). As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 77) e da cadeia B (SEQ ID NO: 78) são indicadas no código de três letras, exceto o último aminoácido na cadeia B (lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (por meio do aminoácido epsilon do resíduo de lisina).
[01037] A Figura 8 mostra o conjugado de insulina No. 4 (vide
Exemplo 10 para mais detalhes). As sequências da cadeia A (SEQ ID NO: 43) e da cadeia B (SEQ ID NO: 44) são indicadas no código de três letras, exceto o último aminoácido na cadeia B (lisina na posição B29). A estrutura do resíduo de lisina é mostrada. O resíduo de lisina é covalentemente ligado ao ligante (através do aminoácido epsilon do resíduo de lisina).
LITERATURA CITADA
[01038] Senshang Lin, Li-Lan H. Chen e Yie W. Chien, The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 1998, 286, 959-966.
[01039] Clinical Pharmacokinetics Concepts and applications de Tozer and Rowland, 3a edição (Publisher Lippincott Williams & Wilkins), 1995- Section II-6).
[01040] Hartmann e outros, Effect of the long-acting insulin analogues glargine and degludec on cardiomyocyte cell signaling and function, Cardiovasc Diabetol. 2016;15:96,
[01041] Sommerfeld e outros, PLoS One. 2010; 5(3): e9540,
[01042] Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use de Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002).

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um análogo de insulina e uma sulfonamida de fórmula (I)
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2 R q
S H O
N O O O Ph H N (O)s HO m (E)p n A t (I) em que A é selecionado do grupo consistindo em átomo de oxigênio, grupo -CH2CH2-, grupo -OCH2- e grupo -CH2O-; E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo; X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-; m é um número inteiro na faixa de 5 a 17; n é zero ou um número inteiro na faixa de 1 a 3; p é zero ou 1; q é zero ou 1; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; s é zero ou 1; t é zero ou 1; R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado; R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, átomo de halogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado; em que a sulfonamida de fórmula (I) é ligada covalentemente ao análogo de insulina pelo fato que o grupo carbóxi terminal “a” da sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligado a um grupo amino do análogo de insulina.
2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sulfonamida tem a fórmula (I-1)
O 2
R H H N N a OH 1 O O X N r O 2 O 2
O R S H q
E N O O O HO p O Ph H N m (I-1) em que: E representa um grupo -C6H3R- com R sendo um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio, em que o átomo de halogênio é selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo; X representa um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-; p é zero ou 1; q é zero ou 1; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; R1 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio e átomo de halogênio; R2 representa pelo menos um resíduo selecionado do grupo de átomo de hidrogênio, grupo C1 a C3 alquila e grupo C1 a C3 alquila halogenado; com m sendo um número inteiro na faixa de 5 a 15 se p for zero ou m sendo um número inteiro na faixa de 7 a 15 se p for 1.
3. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-1)
O
H H Hal N N a OH O O X N r O 2 O 2 O q
H O
S O O
N N HO m O Ph H (I-1-1) em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo –CH-; m é um número inteiro na faixa de 7 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1; Hal é um átomo de halogênio selecionado do grupo consistindo em átomo de flúor, cloro, bromo e iodo; e o grupo
HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
4. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-1a)
O O O
O O N N 2 N 2 a OH
O O H
H
F S
O N N
H HO 13 O (I-1-1a)
5. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-2)
O
H H N N a OH O O X N r O 2 O 2 q
O S H O
N O O O Ph H N
HO m (I-1-2) em que X é um átomo de nitrogênio ou um grupo -CH-; m é um número inteiro na faixa de 5 a 15; r é um número inteiro na faixa de 1 a 6; q é zero ou 1; e o grupo HOOC-(CH2)m-O- está situado em posição meta ou para no anel fenila Ph com relação ao grupo -S(O)2-.
6. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 5, caracterizado pelo fato de que a sulfonamida tem a fórmula (I-1-2a).
O O O
O
O O O 15 N N 2 N 2 a OH
HO H H
H
N
S N O O (I-1-2a) ou a fórmula (I-1-2b)
O O
O H H N N a OH HO 15 N N 5 O 2 O 2
H H
N O O O
S N O O (I-1-2b) ou a fórmula (I-1-2c)
O O O
O
O O O 15 N 2 N 2 a OH
HO H H
H
N
S N O (I-1-2c) O .
7. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída com um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido hidrofóbico e, opcionalmente, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição A14 que é substituída com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His) e/ou uma mutação na posição B30.
8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina e/ou de que o aminoácido hidrofóbico é um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
9. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina é selecionado de Leu(B16)-insulina humana, Val(B16)-insulina humana, Ile(B16)-insulina humana, Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Val(B16)Des(B30)-insulina humana, Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Leu(B25)-insulina humana,
Val(B25)-insulina humana, Ile(B25)-insulina humana, Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina humana,
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana, e Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana.
10. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o análogo de insulina compreende (d) uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK), (e) uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), ou (f) uma cadeia A possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B possuindo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
11. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o grupo amino do análogo de insulina, ao qual a sulfonamida de fórmula (I) é covalentemente ligada, é um grupo amino épsilon de uma lisina presente no análogo de insulina ou é o grupo amino N-terminal da cadeia B da insulina ou análogo de insulina, por exemplo, em que o grupo amino é o grupo amino épsilon de lisina presente na posição B29 da cadeia B.
12. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o conjugado é conjugado 1 (sequência de cadeia A: SEQ ID NO: 47; sequência de cadeia B: SEQ ID NO: 48): ou conjugado 3 (sequência de cadeia A: SEQ ID NO: 77; sequência de cadeia B: SEQ ID NO: 78): ou conjugado 4 (sequência de cadeia A: SEQ ID NO: 43; sequência de cadeia B: SEQ ID NO: 44):
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do conjugado compreendendo uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina como definido qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
14. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para uso como um medicamento.
15. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sulfonamida de fórmula (I) e um análogo de insulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para uso como um medicamento para tratamento de uma doença selecionada do grupo consistindo em diabetes gestacional, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e hiperglicemia e/ou para diminuição dos níveis de glicose no sangue.
16. Uso de um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento ou uma composição farmacêutica para tratamento de uma doença selecionada do grupo consistindo em diabetes gestacional, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 e hiperglicemia e/ou para diminuição dos níveis de glicose no sangue.
17. Invenção, caracterizada em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação,
por exemplo, produto ou processo ou uso, ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.
Petição 870210051877, de 09/06/2021, pág. 69/299 1/8
Glicose [Mm] Análogo de insulina 41 + ligante 54
Análogo de insulina 41 + ligante 50
Horas após administração
Petição 870210051877, de 09/06/2021, pág. 70/299 2/8
Análogo de insulina 41 + ligante 5
Insulina humana + ligante 54
Análogo de insulina 41
Insulina humana
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado
Conjugado
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112876388B (zh) * 2021-01-14 2023-03-31 山东大学 一种gpr120激动剂及其制备方法与应用
CN116162147B (zh) * 2021-11-24 2023-10-03 成都奥达生物科技有限公司 一种长效胰岛素类似物
CN114230451A (zh) * 2021-12-29 2022-03-25 上海药坦药物研究开发有限公司 卤代酸类化合物的制备方法
WO2023144277A1 (en) * 2022-01-26 2023-08-03 Sanofi Insulin conjugates
WO2023247640A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Sanofi Single chain insulins and fc conjugates thereof
CN115947822B (zh) * 2022-07-04 2023-08-18 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效酰化胰岛素衍生物及其药物组合物和应用
WO2024051787A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效酰化胰岛素衍生物及其应用

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2164520C2 (ru) 1993-09-17 2001-03-27 Ново Нордиск А/С Производное инсулина, растворимая пролонгированная фармацевтическая композиция, способ пролонгирования гипогликемического действия при лечении диабета
KR19980703039A (ko) 1995-03-17 1998-09-05 켈스버그 라아스 인슐린 유도체
US6451970B1 (en) 1996-02-21 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
WO1999021578A1 (en) 1997-10-24 1999-05-06 Eli Lilly And Company Insoluble insulin compositions
KR20070029247A (ko) 2004-07-08 2007-03-13 노보 노르디스크 에이/에스 폴리펩티드 연장 태그
ES2490243T3 (es) 2005-02-02 2014-09-03 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
EP1846446B1 (en) 2005-02-02 2013-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
JP5366546B2 (ja) 2005-08-16 2013-12-11 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
DE602007009496D1 (de) 2006-02-27 2010-11-11 Novo Nordisk As Insulinderivate
WO2007104736A2 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Acylated single chain insulin
JP5269766B2 (ja) 2006-05-09 2013-08-21 ノボ・ノルデイスク・エー／エス インスリン誘導体
MX2008014061A (es) 2006-05-09 2008-11-14 Novo Nordisk As Derivado de insulina.
CN101573133B (zh) 2006-07-31 2014-08-27 诺沃-诺迪斯克有限公司 Peg化延长的胰岛素
WO2008034881A1 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
WO2008049711A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
GB0621973D0 (en) 2006-11-03 2006-12-13 Philogen Spa Binding molecules and uses thereof
WO2009010428A1 (en) 2007-07-16 2009-01-22 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues
US9150633B2 (en) 2007-08-15 2015-10-06 Novo Nordisk A/S Insulin analogues with an acyl and alkylene glycol moiety
JP5721432B2 (ja) 2007-08-15 2015-05-20 ノボ・ノルデイスク・エー／エス アミノ酸含有アルキレングリコール反復単位を含むアシル部を有するインスリン
DK2217265T3 (en) 2007-11-20 2017-07-03 Ambrx Inc Modified insulin polypeptides and their use
EP2254905B1 (en) * 2008-03-14 2016-12-14 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
WO2009115469A1 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
WO2009121884A1 (en) 2008-04-01 2009-10-08 Novo Nordisk A/S Insulin albumin conjugates
PL219335B1 (pl) 2008-07-04 2015-04-30 Inst Biotechnologii I Antybiotyków Pochodna insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól, jej zastosowanie oraz zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna
US9603904B2 (en) 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
JP2012511506A (ja) 2008-12-09 2012-05-24 ノヴォ・ノルディスク・アー／エス 新規インスリンアナログ
CA2744558A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
AU2009335712B2 (en) 2008-12-19 2015-09-17 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analogs
WO2010130638A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Evotec Ag Sulfonamide compounds, pharmaceutical compositions and uses thereof
SG184988A1 (en) 2010-04-27 2012-11-29 Zealand Pharma As Peptide conjugates of glp-1 receptor agonists and gastrin and their use
KR20130092972A (ko) 2010-05-10 2013-08-21 노보 노르디스크 에이/에스 인슐린-아연 복합체의 제조 방법
CN103119057B (zh) 2010-06-24 2016-06-15 印第安纳大学研究及科技有限公司 基于酰胺的胰岛素前药
JP2013540771A (ja) 2010-10-15 2013-11-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規ｎ末端修飾インスリン誘導体
CN103596584B (zh) 2011-06-15 2016-12-14 诺沃—诺迪斯克有限公司 多取代的胰岛素
WO2013086785A1 (zh) 2011-12-15 2013-06-20 Qin Shulin 具有降血糖作用的化合物、组合物及其用途
AU2012350586B2 (en) 2011-12-15 2017-02-02 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Human insulin analogue and acylated derivative thereof
CN104364262A (zh) 2011-12-21 2015-02-18 诺沃—诺迪斯克有限公司 N末端修饰的胰岛素衍生物
US20150111820A1 (en) 2012-07-09 2015-04-23 Novo Nordisk A/S Novel use of insulin derivatives
WO2014071405A2 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Case Western Reserve University Long-acting single-chain insulin analogues
ES2868351T3 (es) 2013-02-26 2021-10-21 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugados de análogos de insulina y usos de los mismos
AU2014241743B2 (en) * 2013-03-14 2018-07-05 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin-incretin conjugates
CN105188736A (zh) 2013-03-20 2015-12-23 诺和诺德股份有限公司 胰岛素给药方案
WO2014177623A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Novo Nordisk A/S Novel administration regime
CN105308067B (zh) 2013-06-07 2020-07-24 诺和诺德股份有限公司 制备成熟胰岛素多肽的方法
JP6347451B2 (ja) * 2013-08-02 2018-06-27 国立大学法人富山大学 （ベンゼンスルホニルアミノ）ベンズアミド誘導体およびそれらを有効成分とするｓｈｉｐ２阻害剤
JP2017505141A (ja) 2014-01-20 2017-02-16 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 長時間作用型インスリンおよびその使用
AR099569A1 (es) 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
AR100639A1 (es) 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
KR20160001391A (ko) 2014-06-27 2016-01-06 한미약품 주식회사 신규한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도
WO2016001185A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Novo Nordisk A/S Dosage regimen for the treatment of diabetes
KR20160007295A (ko) 2014-07-11 2016-01-20 한미약품 주식회사 인슐린 아날로그
US20180000742A1 (en) 2015-01-29 2018-01-04 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical Composition for Oral Insulin Administration Comprising a Tablet Core and a Polyvinyl Alcohol Coating
WO2016172269A2 (en) 2015-04-20 2016-10-27 University Of Utah Research Foundation Insulin analogs having shortened b chain peptides and associated methods
MX2018002221A (es) 2015-08-25 2018-03-23 Novo Nordisk As Dispositivo medico de inyeccion con camara limpiadora.
JP2018531899A (ja) 2015-08-25 2018-11-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規インスリン誘導体及びその医学的使用
US20190010206A1 (en) 2015-08-25 2019-01-10 Novo Nordisk A/S Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof
PL239062B1 (pl) 2016-01-22 2021-11-02 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych
WO2018024186A1 (zh) 2016-08-02 2018-02-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人胰岛素或其类似物的酰化衍生物
AU2017332408B2 (en) 2016-09-23 2022-02-10 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof
JP7286160B2 (ja) 2016-11-21 2023-06-05 ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ 安定性が増強された速効性インスリン類似体
AU2017378102B2 (en) 2016-12-16 2022-10-13 Novo Nordisk A/S Insulin containing pharmaceutical compositions
CA3052410A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Conjugate of bioactive material having enhanced sustainability and use thereof
KR102629006B1 (ko) 2017-03-23 2024-01-25 한미약품 주식회사 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도
JOP20190273A1 (ar) 2017-05-26 2019-11-24 Lilly Co Eli مركب إنسولين معالج بأسيل
KR20190036956A (ko) 2017-09-28 2019-04-05 한미약품 주식회사 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체
EP3740212A4 (en) 2017-12-18 2021-10-27 Merck Sharp & Dohme Corp. CONJUGATE-BASED SYSTEMS FOR CONTROLLED INSULIN DELIVERY

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