BR112021011099A2 - Análogos de insulina tendo afinidade de ligação com receptor de insulina reduzida - Google Patents

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Abstract

análogos de insulina tendo afinidade de ligação com receptor de insulina reduzida. a presente invenção refere-se a análogos de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que os análogos de insulina compreendem uma mutação na posição b16 que é substituída com um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição b25 que é substituída com um aminoácido hidrofóbico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLOGOS DE INSULINA TENDO AFINIDADE DE LIGAÇÃO COM RECEPTOR DE INSULINA REDUZIDA".
DESCRIÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a análogos de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que os análogos de insulina compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituído por um aminoácido hidrofóbico.
ANTECEDENTES
[002] Em todo o mundo, mais de 400 milhões de pessoas sofrem de diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2. O diabetes tipo 1 é tratado com substituição de insulina. Em contraste com o diabetes tipo 1, basicamente não há nenhuma deficiência de insulina em diabetes tipo 2, mas em um grande número de casos, especialmente no estágio avançado, pacientes com diabetes tipo 2 são tratados com insulina.
[003] Em uma pessoa saudável, a liberação de insulina pelo pâncreas está estritamente associada à concentração de glicose no sangue. Níveis elevados de glicose no sangue, tal como ocorre após refeições, são rapidamente compensados por um aumento correspondente em secreção de insulina. No estado de jejum, o nível de insulina no plasma cai para um valor basal que é adequado para garantir um suprimento contínuo de glicose aos órgãos e tecidos sensíveis à insulina e manter a produção de glicose hepática baixa de um dia para o outro. Frequentemente, a substituição da secreção endógena de insulina através de administração exógena, principalmente subcutânea, de insulina, não atinge a qualidade da regulação fisiológica da glicose no sangue descrita acima. Desvios da glicose no sangue para cima ou para baixo podem ocorrer, que em suas formas mais graves podem ser um risco de vida. Deve-se deduzir disso que uma terapia melhorada para diabetes tem como objetivo principal manter a glicose no sangue o mais próximo possível da faixa fisiológica.
[004] A insulina humana é um polipeptídeo de 51 aminoácidos, que são divididos em duas cadeias de aminoácidos: a cadeia A tendo 21 aminoácidos e a cadeia B tendo 30 aminoácidos. As cadeias são conectadas umas às outras por meio de duas pontes dissulfeto. Uma terceira ponte dissulfeto existe entre as cisteínas nas posições 6 e 11 da cadeia A. Alguns produtos em uso corrente para o tratamento de diabetes mellitus contêm análogos da insulina, isto é, variantes da insulina cuja sequência difere daquela da insulina humana por uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia A e/ou na cadeia B.
[005] Como muitos outros hormônios peptídicos, a insulina humana tem uma meia-vida curta in vivo. Deste modo, ela é administrada com frequência, o que está associado a desconforto para o paciente. Portanto, são desejados análogos de insulina que tenham uma meia-vida in vivo aumentada e, portanto, uma duração de ação prolongada.
[006] Atualmente existem diferentes abordagens para estender a meia-vida de insulinas.
[007] Uma abordagem é baseada no desenvolvimento de uma formulação solúvel em pH baixo, mas de solubilidade reduzida em relação à insulina nativa em pH fisiológico. O ponto isoelétrico do análogo da insulina é aumentado através da adição de duas argininas ao terminal C da cadeia B. A adição de duas argininas em combinação com uma substituição de glicina em A21 (insulina glargina) provê uma insulina com duração de ação prolongada. O análogo da insulina precipita na presença de zinco quando da injeção em sítios subcutâneos e solubiliza lentamente, resultando em uma presença sustentada de insulina glargina.
[008] Em uma outra abordagem, um grupo de ácido graxo de cadeia longa é conjugado ao grupo epsilon amino de LysB29 de insulina. A presença desse grupo permite a ligação da insulina à albumina do soro através de ligação reversível, não covalente. Como consequência, este análogo de insulina tem um perfil de ação no tempo significativamente prolongado em relação à insulina humana (vide, por exemplo, Mayer e outros, Inc. Biopolymers (Pept Sci) 88: 687-713, 2007; ou WO 2009/115469).
[009] O WO 2016/006963 descreve análogos de insulina tendo uma taxa de eliminação mediada por receptor de insulina reduzida, comparado com insulina humana.
[0010] O WO 2018/056764 descreve análogos de insulina tendo uma taxa de eliminação mediada por receptor de insulina reduzida, comparado com insulina humana.
[0011] O WO 2008/034881 descreve análogos de insulina estabilizados por protease.
[0012] A fim de aumentar a duração de ação de um fármaco, a meia-vida desempenha um papel importante. A meia-vida (t1/2) é proporcional ao volume de distribuição dividido pela eliminação. No caso de insulina humana, a eliminação é principalmente impulsionada pela ligação ao receptor de insulina, internalização e subsequente degradação.
[0013] Consequentemente, existe uma necessidade de análogos de insulina que tenham uma atividade de ligação a receptor de insulina reduzida e, portanto, uma taxa de eliminação mediada por receptor reduzida, mas que tenham uma atividade de transdução de sinal que permita diminuir suficientemente o nível de glicose no sangue in vivo.
SUMÁRIO
[0014] São providos no presente documento análogos de insulina de ação longa tendo uma afinidade de ligação muito baixa (desta maneira uma taxa de eliminação menor) enquanto ainda mantendo transdução de sinal alta.
[0015] Surpreendentemente, foi mostrado no contexto dos estudos subjacentes à presente invenção que uma substituição na posição B16 e/ou B25 de insulina humana por um aminoácido hidrofóbico (tais como leucina, isoleucina, valina, alanina e triptofano) resultou em uma diminuição de atividade de ligação a receptor de insulina (comparado com a atividade de ligação a receptor de insulina da insulina de origem, vide Exemplos). Os efeitos mais fortes sobre atividade de ligação a receptor de insulina foram observados para substituições com aminoácidos de cadeia ramificada (leucina, isoleucina e valina). Curiosamente, análogos de insulina com tais substituições nestas posições (tal como na posição B25) mostraram um aumento de até 6 vezes em transdução de sinal do que o esperado com base em suas afinidades de ligação da isoforma B do receptor de insulina (IR-B) (vide Exemplos). Ainda, alguns análogos de insulina testados mostraram estabilidade proteolítica melhorada contra α-quimiotripsina, catepsina D e enzima degradante de insulina (vide Exemplos).
[0016] Desta forma, são providos no presente documento análogos de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que os análogos de insulina compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. Em algumas modalidades, é provido um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada.
[0017] A expressão "análogo de insulina" tal como no presente documento usado se refere a um peptídeo que tem uma estrutura molecular que formalmente pode ser derivada da estrutura de uma insulina de ocorrência natural (no presente documento também referida como "insulina de origem", por exemplo, insulina humana) através de deleção e/ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido que ocorre na insulina de ocorrência natural e/ou adicionando pelo menos um resíduo de aminoácido. O resíduo de aminoácido adicionado e/ou trocado pode ser ou resíduos de aminoácido codificáveis ou outros resíduos de ocorrência natural ou resíduos de aminoácido puramente sintéticos. O análogo conforme dito no presente documento é capaz de reduzir os níveis de glicose no sangue in vivo, tal como em um sujeito humano.
[0018] Em algumas modalidades, o análogo de insulina provido no presente documento compreende duas cadeias peptídicas, uma cadeia A e uma cadeia B. Tipicamente, as duas cadeias são conectadas por pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína. Por exemplo, em algumas modalidades, os análogos de insulina providos no presente documento compreendem três pontes dissulfeto: uma ponte dissulfeto entre as cisteínas nas posições A6 e A11, uma ponte dissulfeto entre a cisteína na posição A7 da cadeia A e a cisteína na posição B7 da cadeia B, e uma entre a cisteína na posição A20 da cadeia A e a cisteína na posição B19 da cadeia B. Deste modo, os análogos de insulina providos no presente documento podem compreender resíduos de cisteína nas posições A6, A7, A11, A20, B7 e B19.
[0019] Em algumas modalidades providas no presente documento, o análogo de insulina é uma insulina de cadeia única. Uma insulina de cadeia única é uma cadeia polipeptídica única em que a cadeia B da insulina está ligada contiguamente com a cadeia A da insulina por meio de um peptídeo de conexão não clivado.
[0020] Mutações de insulina, isto é, mutações de uma insulina de origem, são indicadas no presente documento através de referência à cadeia, isto é, ou à cadeia A ou à cadeia B do análogo, à posição do resíduo de aminoácido mutado na cadeia A ou B (tais como A14, B16 e B25) e ao código de três letras para o aminoácido substituindo o aminoácido nativo na insulina de origem. O termo "desB30" se refere a um análogo sem o aminoácido B30 da insulina de origem (isto é, o aminoácido na posição B30 está ausente). Por exemplo, a insulina humana Glu(A14)Ile(B16)desB30 é um análogo da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição 14 da cadeia A (A14) da insulina humana é substituído por ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na posição 16 da cadeia B (B16) é substituído por isoleucina e o aminoácido na posição 30 da cadeia B é deletado (isto é, está ausente).
[0021] Os análogos de insulina providos no presente documento compreendem pelo menos uma mutação (substituição, deleção ou adição de um aminoácido) em relação à insulina de origem. O termo "pelo menos um", conforme usado no presente documento, significa um ou mais de um, tal como "pelo menos dois", "pelo menos três", "pelo menos quatro", "pelo menos cinco", etc. Em algumas modalidades, os análogos de insulina providos no presente documento compreendem pelo menos uma mutação na cadeia B e pelo menos uma mutação na cadeia A. Em uma modalidade adicional, os análogos de insulina providos no presente documento compreendem pelo menos duas mutações na cadeia B e pelo menos uma mutação na cadeia A. Por exemplo, o análogo de insulina pode compreender uma substituição na posição B16, uma deleção na posição B30 e uma substituição na posição A14. Alternativamente, o análogo de insulina pode compreender uma substituição na posição B25, uma deleção na posição B30 e uma substituição na posição A14. Ainda, o análogo de insulina pode compreender uma substituição na posição B16, uma substituição na posição B25, uma deleção na posição B30 e uma substituição na posição A14.
[0022] Os análogos de insulina providos no presente documento podem compreender mutações em adição às mutações acima. Em algumas modalidades, o número de mutações não excede um certo número. Em algumas modalidades, os análogos de insulina compreendem menos de doze mutações (isto é, deleções, substituições, adições) em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de dez mutações em relação à insulina de origem. Em outra modalidade, o análogo compreende menos de oito mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de sete mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de seis mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de cinco mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de quatro mutações em relação à insulina de origem. Em uma outra modalidade, o análogo compreende menos de três mutações em relação à insulina de origem.
[0023] A expressão "insulina de origem" tal como no presente documento usado se refere à insulina de ocorrência natural, isto é, a uma insulina do tipo selvagem, não mutada. Em algumas modalidades, a insulina de origem é insulina animal, tal como insulina de mamífero. Por exemplo, a insulina de origem pode ser insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
[0024] Em algumas modalidades, a insulina de origem é insulina humana. A sequência de insulina humana é bem conhecida na técnica e mostrada na Tabela 1 na seção de Exemplos. A insulina humana compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 1 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 2 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT).
[0025] Em uma outra modalidade, a insulina de origem é insulina bovina. A sequência de insulina bovina é bem conhecida na técnica. A insulina bovina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID Nº: 81 (GIVEQCCASVCSLYQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID Nº: 82 (FVNQHLCGSHLVEALYLVC-GERGFFYTPKA).
[0026] Em uma outra modalidade, a insulina de origem é insulina suína. A sequência de insulina suína é bem conhecida na técnica. A insulina suína compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID Nº: 83 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID Nº: 84 (FVNQHLCGSHLVEALYLVC GERGFFYTPKA).
[0027] As insulinas humana, bovina e suína compreendem três pontes dissulfeto: uma ponte dissulfeto entre as cisteínas nas posições A6 e A11, uma ponte dissulfeto entre a cisteína na posição A7 da cadeia A e a cisteína na posição B7 da cadeia B e uma entre a cisteína na posição A20 da cadeia A e a cisteína na posição B19 da cadeia B.
[0028] Os análogos de insulina providos no presente documento têm uma afinidade de ligação com receptor de insulina que é reduzida comparado com a afinidade de ligação com receptor de insulina da insulina de origem correspondente, por exemplo, de insulina humana.
[0029] O receptor de insulina pode ser qualquer receptor de insulina de mamífero, tal como um receptor de insulina bovina, suína ou humana. Em algumas modalidades, o receptor de insulina é um receptor de insulina humana, por exemplo, isoforma A do receptor de insulina humana ou isoforma B do receptor de insulina humana (que foi usada na seção de Exemplos).
[0030] Vantajosamente, os análogos de insulina humana providos no presente documento têm uma afinidade de ligação significativamente reduzida com o receptor de insulina humana comparado com a afinidade de ligação de insulina humana com o receptor de insulina humana (vide Exemplos). Portanto, os análogos de insulina têm uma taxa de eliminação muito baixa, isto é, uma taxa de eliminação mediada por receptor de insulina muito baixa.
[0031] Em algumas modalidades, os análogos de insulina têm, isto é, exibem, menos de 20% da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem. Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos no presente documento têm menos de 10% da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem. Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos no presente documento têm menos de 5% da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com a insulina de origem, tal como menos de 3% da afinidade de ligação comparado com a insulina de origem. Por exemplo, os análogos de insulina providos no presente documento podem ter entre 0,1% a 10%, tal como entre 0,3% a 5%, da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem. Além disso, os análogos de insulina providos no presente documento podem ter entre 0,5% a 3%, tal como entre 0,5% a 2%, da afinidade de ligação com o receptor de insulina correspondente comparado com sua insulina de origem.
[0032] Métodos para determinar a afinidade de ligação de um análogo de insulina com um receptor de insulina são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade de ligação com receptor de insulina pode ser determinada através de um ensaio de proximidade de cintilação que se baseia na avaliação de ligação competitiva entre insulina de origem marcada com [125I], tal como insulina humana marcada com [125I], e o análogo de insulina (não marcado) ao receptor de insulina. O receptor de insulina pode estar presente na membrana de uma célula, por exemplo, de célula CHO (Ovário de Hamster Chinês), que superexpressa um receptor de insulina recombinante. Em uma modalidade, a afinidade de ligação com receptor de insulina é determinada como descrito na seção de Exemplos.
[0033] Ligação de uma insulina de ocorrência natural ou de um análogo da insulina ao receptor de insulina ativa a via de sinalização da insulina. O receptor de insulina tem atividade de tirosina cinase. Ligação da insulina ao seu receptor induz uma mudança conformacional que estimula a autofosforilação do receptor em resíduos de tirosina. A autofosforilação do receptor de insulina estimula a atividade da tirosina cinase do receptor em relação aos substratos intracelulares envolvidos na transdução do sinal. A autofosforilação do receptor de insulina por um análogo de insulina é, portanto, considerada uma medida para transdução de sinal causada pelo dito análogo.
[0034] Os análogos da insulina na Tabela 1 da seção de Exemplos foram submetidos a ensaios de autofosforilação. Curiosamente, análogos de insulina com substituições alifáticas nas posições B16 e B25 causaram autofosforilação do receptor de insulina maior do que o esperado com base em suas afinidades de ligação com receptor de insulina. Desse modo, os análogos de insulina providos no presente documento têm uma baixa atividade de ligação e, consequentemente, uma taxa de eliminação mediada por receptor menor, mas são, no entanto, capazes de causar uma transdução de sinal relativamente alta. Portanto, os análogos de insulina providos no presente documento poderiam ser usados como insulinas de ação prolongada.
Em algumas modalidades, o análogo de insulina provido no presente documento é capaz de induzir 1 a 10%, tal como 2 a 8%, de autofosforilação de receptor de insulina em relação à insulina de origem (tal como insulina humana). Além disso, em algumas modalidades, os análogos de insulina providos no presente documento são capazes de induzir 3 a 7%, como 5 a 7%, da autofosforilação do receptor de insulina em relação à insulina de origem (tal como insulina humana). A autofosforilação do receptor de insulina em relação a uma insulina de origem pode ser determinada como descrito na seção de Exemplos.
[0035] Os análogos de insulina providos no presente documento foram submetidos a ensaios de estabilidade de protease. Como mostrado na Tabela 3, análogos de insulina providos no presente documento tinham estabilidade maior em relação a pelo menos algumas das proteases testadas comparado com insulina humana. Estabilidade proteolítica melhorada foi observada contra α-quimiotripsina, catepsina D e enzima degradante de insulina (IDE). Desta maneira, análogos de insulina providos no presente documento são, tipicamente, análogos de insulina proteoliticamente estáveis. Então, eles são degradados mais lentamente pelas proteases em relação à insulina de origem. Em algumas modalidades, o análogo de insulina provido no presente documento é estabilizado contra degradação por α-quimiotripsina, catepsina D e enzima degradante de insulina (IDE) comparado com insulina de origem.
[0036] Como mostrado acima, o análogo de insulina compreende pelo menos uma mutação comparado com a insulina de origem.
[0037] Em algumas modalidades, os análogos de insulina providos no presente documento compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. Assim, o aminoácido na posição B16 (tirosina em insulinas humana, bovina e suína) é substituído por um aminoácido hidrofóbico.
[0038] Em outra modalidade, análogos de insulina providos no presente documento compreendem uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. Então, o aminoácido na posição B25 (fenilalanina em insulinas humana, bovina e suína) é substituído por um aminoácido hidrofóbico.
[0039] Em outra modalidade, análogos de insulina providos no presente documento compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
[0040] O aminoácido hidrofóbico pode ser qualquer aminoácido hidrofóbico. Por exemplo, o aminoácido hidrofóbico pode ser um aminoácido alifático tal como um aminoácido de cadeia ramificada.
[0041] Em algumas modalidades dos análogos de insulina providos no presente documento, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 é isoleucina, valina, leucina, alanina, triptofano, metionina, prolina, glicina, fenilalanina ou tirosina (ou com um derivado dos aminoácidos mencionados acima).
[0042] Várias insulinas de origem tais como insulinas humana, bovina e suína compreendem tirosina na posição B16 e fenilalanina na posição B25. Assim, o aminoácido na posição B16 da insulina de origem pode ser substituído por isoleucina, valina, leucina, alanina, triptofano, metionina, prolina, glicina ou fenilalanina (ou por um derivado dos aminoácidos mencionados acima). Ainda, o aminoácido na posição B25 da insulina de origem pode ser substituído por isoleucina, valina, leucina, alanina, triptofano, metionina, prolina, glicina ou tirosina (ou com um derivado dos aminoácidos mencionados acima).
[0043] Derivados dos aminoácidos mencionados acima são conhecidos na técnica.
[0044] Derivados de leucina incluem, mas não estão limitados a, homoleucina e terc-leucina. Portanto, o aminoácido na posição B16 e/ou B25 pode ser substituído por homoleucina ou terc-leucina.
[0045] Um derivado de valina é, por exemplo, 3-etil norvalina. Assim, o aminoácido na posição B16 e/ou B25 pode ser substituído por 3-etil norvalina.
[0046] Derivados de glicina incluem, mas não estão limitados, a cicloexil-glicina, ciclopropilglicina e trifluoretilglicina.
[0047] Derivados de alanina incluem, mas não estão limitados a, beta-t-butilalanina, ciclobutil-alanina, ciclopropil-alanina e homo- cicloexilalanina.
[0048] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 é isoleucina, valina, leucina, alanina ou triptofano.
[0049] Em algumas modalidades, o aminoácido alifático não é alanina. Portanto, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 pode ser isoleucina, valina, leucina ou triptofano.
[0050] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofóbico usado para a substituição na posição B16 e/ou B25 é isoleucina, valina ou leucina.
[0051] Em algumas modalidades, os aminoácidos referidos no presente documento são L-aminoácidos (tal como L-isoleucina, L-valina ou L-leucina). Desta maneira, os aminoácidos (ou derivados dos mesmos) utilizados para, por exemplo, a substituição na posição B16, B25 e/ou A14 são tipicamente L-aminoácidos.
[0052] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofóbico é um aminoácido alifático. Portanto, os análogos de insulina providos no presente documento compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido alifático e uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido alifático (e opcionalmente outras mutações incluindo, mas não limitado a, Des(B30) e Glu(A14)).
[0053] Aminoácidos alifáticos são aminoácidos não polares e hidrofóbicos compreendendo um grupo funcional de cadeia lateral alifático. A hidrofobicidade aumenta conforme o número de átomos de carbono na cadeia de hidrocarboneto aumenta. Uma medida para a hidrofobicidade de um alifático é o índice de hidropatia de acordo com a escala de Kyte e Doolittle que, por exemplo, pode ser determinado como descrito por Kyte J. e outros, Journal of Molecular Biology. 1982 157 (1): 105–32. Em algumas modalidades, o aminoácido alifático é um aminoácido alifático com um índice de hidropatia (de acordo com a escala de Kyte e Doolittle) maior que 2,0, tal como maior que 3,0 ou maior que 3,5.
[0054] Aminoácidos alifáticos incluem, mas não estão limitados a, isoleucina, valina, leucina, alanina e glicina. Por exemplo, o aminoácido alifático pode ser um aminoácido selecionado de isoleucina, valina, leucina e glicina, tal como um aminoácido selecionado de isoleucina, valina e leucina.
[0055] Isoleucina, valina e leucina são aminoácidos de cadeia ramificada (abreviado BCAA). Então, o aminoácido alifático pode ser um aminoácido de cadeia ramificada. Em algumas modalidades, os análogos de insulina providos no presente documento compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido de cadeia ramificada e uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido de cadeia ramificada (e opcionalmente mutações incluindo ainda, mas não limitado a, Des (B30) e Glu (A14)).
[0056] BCAAs são aminoácidos tais como aminoácidos isoleucina, valina e leucina tendo cadeias laterais alifáticas que são não lineares, isto é, aminoácidos de cadeia ramificada são aminoácidos tendo uma cadeia lateral alifática com uma ramificação (um átomo de carbono central ligado a três ou mais átomos de carbono).
[0057] O aminoácido de cadeia ramificada pode ser um BCAA proteinogênico, isto é, um aminoácido que é incorporado biossinteticamente em proteínas durante tradução, ou um BCAA não proteinogênico, isto é, um aminoácido que não é codificado naturalmente ou encontrado no código genético de qualquer organismo. Por exemplo, BCAAs proteinogênicos são leucina, isoleucina e valina. Assim, o aminoácido de cadeia ramificada de aminoácido hidrofóbico/alifático pode ser leucina, isoleucina ou valina (ou um derivado da leucina, isoleucina ou valina, tal como um derivado de leucina ou valina como mostrado acima).
[0058] Em algumas modalidades, o aminoácido de cadeia ramificada é isoleucina.
[0059] Em algumas modalidades, o aminoácido de cadeia ramificada é valina.
[0060] Em algumas modalidades, o aminoácido de cadeia ramificada é leucina.
[0061] Em adição à mutação na posição B16 e/ou à mutação na posição B25 como descrito acima, análogos de insulina providos no presente documento podem compreender mutações adicionais em relação à insulina de origem.
[0062] Por exemplo, o análogo de insulina pode compreender ainda uma mutação na posição A14. Tais mutações são conhecidas aumentar a estabilidade da protease (vide, por exemplo, WO 2008/034881). Em algumas modalidades, o aminoácido na posição A14 é substituído por ácido glutâmico (Glu). Em algumas modalidades, o aminoácido na posição A14 é substituído por ácido aspártico (Asp). Em algumas modalidades, o aminoácido na posição A14 é substituído por histidina (His).
[0063] Ainda, os análogos de insulina providos no presente documento podem compreender uma mutação na posição B30. Em algumas modalidades, a mutação na posição B30 é a deleção de treonina na posição B30 da insulina de origem (também referida como mutação Des(B30)).
[0064] Ainda, o análogo de insulina da presente invenção pode compreender ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu) e/ou uma mutação na posição A21 que é substituída por glicina (Gly).
[0065] Em uma modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID Nº: 22 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK).
[0066] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 24 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[0067] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK).
[0068] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[0069] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 50 (FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[0070] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 58 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[0071] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 60 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[0072] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 64 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[0073] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 66 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[0074] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 70 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK).
[0075] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[0076] Em uma outra modalidade, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 80 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[0077] As cadeias B sumarizadas acima compreendem a mutação Des(B30). Desta maneira, o aminoácido que está presente na posição B30 da insulina de origem (treonina em insulina humana e alanina em insulina suína e bovina) é eliminado, isto é, não está presente. No entanto, também se prevê que as cadeias B dos análogos da presente invenção não compreendam esta mutação, isto é, compreendem uma treonina na posição 30. Portanto, a cadeia B do análogo de insulina da presente invenção pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID Nº: 85) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 86) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 87) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 88) FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 89) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 90) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 91) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 92) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 93) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 94) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 95) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 96) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 97)
[0078] Em uma modalidade, a cadeia A do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 1 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN).
[0079] Em uma outra modalidade, a cadeia A do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN).
[0080] Em uma outra modalidade, a cadeia A do análogo de insulina da presente invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 45 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG).
[0081] Tipicamente, o análogo de insulina da presente invenção compreende uma cadeia A e uma cadeia B como mostrado acima.
[0082] Por exemplo, o análogo de insulina da presente invenção é selecionado do grupo consistindo em:
[0083] Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana, isto é, Leu(B16)-insulina humana),
[0084] Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana, isto é, Val(B16)-insulina humana),
[0085] Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0086] Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0087] Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0088] Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0089] Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0090] Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0091] Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0092] Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0093] Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0094] Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0095] Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0096] Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0097] Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0098] Glu(A14)Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[0099] Glu(A14)Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00100] Glu(A14)Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00101] Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00102] Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00103] Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00104] Glu(A14)Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00105] Glu(A14)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00106] Glu(A14)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00107] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00108] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00109] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00110] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00111] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[00112] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00113] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00114] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00115] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[00116] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00117] Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00118] Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00119] Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00120] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00121] Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00122] Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00123] Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana) e
[00124] Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana).
[00125] Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos no presente documento são selecionados do grupo consistindo em:
[00126] Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana, isto é, Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana),
[00127] Asp(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00128] Asp(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00129] Asp(A14)Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00130] Asp(A14)Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00131] Asp(A14)Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00132] Asp(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00133] Asp(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00134] Asp(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00135] Asp(A14)Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00136] Asp(A14)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00137] Asp(A14)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00138] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00139] Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00140] Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00141] Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00142] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[00143] Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00144] Asp(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00145] Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00146] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[00147] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00148] Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00149] Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00150] Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00151] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00152] Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00153] Asp(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00154] Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana) e
[00155] Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana).
[00156] Em uma outra modalidade, os análogos de insulina providos no presente documento são selecionados do grupo consistindo em:
[00157] His(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00158] His(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00159] His(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00160] His(A14)Leu(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00161] His(A14)Ile(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00162] His(A14)Val(B16)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00163] His(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00164] His(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00165] His(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00166] His(A14)Leu(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00167] His(A14)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00168] His(A14)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00169] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00170] His(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00171] His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00172] His(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00173] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00174] His(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00175] His(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00176] His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00177] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- insulina (por exemplo, insulina humana),
[00178] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00179] His(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00180] His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00181] His(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00182] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00183] His(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00184] His(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana),
[00185] His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana) e
[00186] His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina (por exemplo, insulina humana).
[00187] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Leu(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Leu(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 11). Por exemplo, Leu(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 21 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 22 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK).
[00188] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 12). Por exemplo, Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 23 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 24 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[00189] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 22). Por exemplo, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK).
[00190] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Val(B25)Des(B30)- insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 24). Por exemplo, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[00191] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3) Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 25). Por exemplo, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3) Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 49 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 50 (FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
[00192] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 29). Por exemplo, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 57 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 58 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[00193] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16) Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 30). Por exemplo, Glu(A14)Glu(B3) Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 56 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 60 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
[00194] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 32). Por exemplo, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 63 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 64 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[00195] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 33). Por exemplo, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 65 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 66 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
[00196] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de
Exemplos (vide Análogo 35). Por exemplo, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 69 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 70 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK).
[00197] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Val(B16)Val(B25) Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 38). Por exemplo, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 75 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 76 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[00198] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 39). Por exemplo, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16) Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[00199] Em uma outra modalidade, o análogo de insulina é Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina (tal como Glu(A14)Gly(A21) Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana). A sequência desse análogo é, por exemplo, mostrada na
Tabela 1 da seção de Exemplos (vide Análogo 40). Por exemplo, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina compreende uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 79 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 80 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
[00200] O análogo de insulina pode ser preparado através de qualquer método considerado apropriado. Por exemplo, o análogo de insulina pode ser preparado através de métodos recombinantes ou através de síntese em fase sólida.
[00201] As definições e explicações dadas acima se aplicam mutatis mutandis ao que segue.
[00202] São providas no presente documento cadeias B de insulina, isto é, peptídeos de cadeia B de insulina, como definido acima em conexão com a cadeia B do análogo de insulina provido no presente documento. Desta maneira, são providas no presente documento cadeias B de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de insulina da insulina de origem, em que as cadeias B compreendem uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. A cadeia B de insulina pode compreender mutações adicionais como no presente documento descrito acima tal como a deleção des(B30).
[00203] Também são providas no presente documento pró-insulinas compreendendo uma cadeia A de insulina e/ou uma cadeia B de insulina dos análogos de insulina providos no presente documento. A cadeia B pode ser qualquer cadeia B como definido no presente documento para os análogos de insulina providos no presente documento. Por exemplo, são providas no presente documento pró-insulinas compreendendo uma cadeia A de insulina e uma cadeia B de insulina, em que a dita cadeia B compreende pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de uma insulina de origem, em que a mutação está na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou em que a mutação está na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico. A cadeia B da insulina pode compreender outras mutações como descrito acima para a cadeia B.
[00204] A cadeia A compreendida pela pró-insulina provida no presente documento pode ser qualquer cadeia A como definido acima para os análogos de insulina providos no presente documento. Em algumas modalidades, a cadeia A da dita pró-insulina compreende uma mutação na posição A14 que é substituída por um aminoácido selecionado de ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
[00205] Em adição à cadeia A da insulina e/ou à cadeia B da insulina, as pró-insulinas no presente documento providas podem compreender elementos adicionais tais como sequências líderes ou um peptídeo C. Em algumas modalidades, a pró-insulina pode compreender ainda um peptídeo C que está localizado entre a cadeia B da insulina e a cadeia A da insulina. O peptídeo C pode ter um comprimento de 4-10 aminoácidos, tal como um comprimento de 4 a 9 aminoácidos. A orientação pode ser a seguinte (do terminal N para o terminal C): cadeia B, peptídeo C, cadeia A.
[00206] São providos no presente documento polinucleotídeos que codificam os análogos de insulina, cadeias B de insulina e as pró- insulinas no presente documento providas. O dito polinucleotídeo pode estar operavelmente ligado a um promotor que permite a expressão do dito polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o promotor é heterólogo em relação ao dito polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em uma outra modalidade, o promotor é um promotor induzível.
[00207] Além disso, são providos no presente documento vetores compreendendo o polinucleotídeo codificando os análogos de insulina providos no presente documento. Em algumas modalidades, o dito vetor é um vetor de expressão.
[00208] São providas no presente documento células hospedeiras compreendendo ácidos nucleicos codificando os análogos da insulina, cadeias B da insulina e pró-insulinas, os polinucleotídeos e/ou os vetores providos no presente documento. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana tal como uma célula pertencente ao gênero Escherichia, por exemplo, uma célula de E. coli. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de levedura, como uma célula de Pichia pastoris ou célula de Klyveromyces lactis.
[00209] São providas no presente documento composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um análogo de insulina provido no presente documento e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00210] São providos no presente documento métodos para tratamento de uma doença compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais análogos de insulina providos no presente documento ou da composição farmacêutica dos mesmos a um sujeito.
[00211] Em algumas modalidades, a doença é diabetes mellitus tal como diabetes mellitus tipo II.
[00212] São providos no presente documento análogos de insulina ou a composição farmacêutica dos mesmos para uso em medicina.
[00213] São providos no presente documento análogos de insulina ou a composição farmacêutica dos mesmos para uso no tratamento de diabetes mellitus, tal como diabetes mellitus tipo II.
[00214] Finalmente, são providos no presente documento usos dos análogos de insulina providos no presente documento ou das composições farmacêuticas dos mesmos para a preparação de um medicamento ou fármaco para o tratamento de diabetes mellitus, tal como de diabetes mellitus tipo II.
[00215] Os análogos de insulina, cadeias B de insulina, pró-insulinas e usos são ilustrados adicionalmente pelas modalidades e combinações de modalidades que seguem como indicado pelas respectivas dependências e referências anteriores. As definições e explicações dadas no presente documento se aplicam mutatis mutandis às modalidades que seguem.
1. Um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
2. O análogo de insulina da modalidade 1, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
3. O análogo de insulina das modalidades 1 e 2, em que o aminoácido hidrofóbico na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido alifático.
4. O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o dito aminoácido alifático na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
5. O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição A14 que é substituída por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
6. O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, por exemplo, em que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (mutação Des(B30).
7. O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu).
8. O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a dita insulina compreende ainda uma mutação na posição A21 que é substituída por glicina (Gly).
9. O análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que a cadeia B do análogo de insulina compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK (SEQ ID Nº: 22) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 44) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 48) FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 50) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 58) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 60) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 64) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 66) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 70) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 76) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 78) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 80) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID Nº: 85) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 86) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 87) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 88)
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 89) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 90) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 91) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 92) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 93) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 94) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 95) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 96) e FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 97).
10. O análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 9, compreendendo (a) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK), (b) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), ou (c) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
11. Um análogo de insulina selecionado do grupo consistindo em Leu(B16)-insulina humana, Val(B16)-insulina humana, Ile(B16)-insulina humana,
Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Val(B16)Des(B30)-insulina humana, Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Leu(B25)-insulina humana, Val(B25)-insulina humana, Ile(B25)-insulina humana, Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana,
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana e Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana.
12. Uma cadeia B de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à cadeia B da insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
13. A cadeia B de insulina de acordo com a modalidade 12, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
14. A cadeia B de insulina de acordo com as modalidades 12 e 13, em que o aminoácido hidrofóbico na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido alifático.
15. A cadeia B de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 12 a 14, em que o dito aminoácido alifático em um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
16. A cadeia B de insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 12 a 15, em que a dita cadeia de insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu).
17. A cadeia B de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 12 a 16, em que a dita cadeia B de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, em que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (mutação Des(B30)).
18. Uma pró-insulina compreendendo uma cadeia A de insulina e uma cadeia B de insulina, em que a cadeia B de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de uma insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição B16 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída por um aminoácido hidrofóbico.
19. A pró-insulina da modalidade 18, em que a cadeia A da insulina da dita pró-insulina compreende uma mutação na posição A14 que é substituída por um aminoácido selecionado de ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
20. A pró-insulina de acordo com as modalidades 18 e 19, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
21. A pró-insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 20, em que o aminoácido hidrofóbico na posição B16 e/ou na posição B25 é um aminoácido alifático.
22. A pró-insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 21, em que o dito aminoácido alifático é um aminoácido de cadeia ramificada, tal como um aminoácido de cadeia ramificada selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
23. A pró-insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 22, em que a dita pró-insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída por um ácido glutâmico (Glu).
24. A pró-insulina de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a
23, em que a dita pró-insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, em que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (mutação Des(B30)).
25. Um polinucleotídeo codificando o análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 11, a cadeia B de insulina de qualquer uma das modalidades 12 a 17 e/ou a pró-insulina de qualquer uma das modalidades 18 a 24.
26. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo da modalidade 25.
27. Uma célula hospedeira compreendendo um análogo de insulina de qualquer uma das modalidades 1 a 11, a cadeia B de insulina de qualquer uma das modalidades 12 a 17, a pró-insulina de qualquer uma das modalidades 18 a 24, o polinucleotídeo da modalidade 25 e/ou o vetor de expressão da modalidade 26.
28. Um método para tratamento de um paciente tendo diabetes mellitus compreendendo administrar ao paciente um ou mais análogos de insulina como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 11.
29. O análogo de insulina como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 11 para uso em tratamento de diabetes mellitus.
[00216] Todas as referências citadas no presente pedido são no presente documento incorporadas a título de referência com relação ao seu teor descritivo total e ao teor descritivo especificamente mencionado no presente pedido. Exemplo 1: produção de insulina humana e análogos de insulina
[00217] Insulina humana, bem como os análogos da insulina, foram produzidos recombinantemente. Polinucleotídeos codificando pré-pró- insulina foram encomendados da Geneart®. Os polinucleotídeos projetados foram otimizados para expressão em levedura. Eles foram inseridos em um vetor de expressão através de clonagem de restrição clássica permitindo expressão e secreção funcionais em Klyveromyces lactis K. Como líder de secreção, o gene foi fundido no terminal C a uma sequência de DNA codificando o sinal do fator de acoplamento alfa de Saccharomyces cerevisiae. A expressão de gene recombinante foi controlada por um promotor de K. lactis induzível por lactose.
[00218] Insulina humana, bem como análogos da insulina, foram fabricados como uma pré-pró-insulina. Uma pré-sequência N-terminal geneticamente fundida foi usada para melhorar os rendimentos de expressão e secreção e para estabilizar o peptídeo no caldo de cultura. Uma ampla variedade de sequências pode ser usada para esse propósito e foram testadas quanto à eficiência. A pró-insulina em si consiste em uma cadeia B fundida a um peptídeo C seguido pela cadeia A do terminal C. Como peptídeo C, uma variedade de combinações de aminoácidos é descrita. Foi mostrado que peptídeos curtos de 1-10 aminoácidos funcionam bem como sequências C. Para processamento posterior da insulina, os locais de reconhecimento para proteases específicas, que flanqueiam o peptídeo C para permitir sua excisão, são importantes.
[00219] As células de K. lactis foram tornadas competentes por meios químicos. Subsequentemente, as células foram transformadas com o plasmídeo de expressão codificando a respectiva pré-pró- insulina. Após inserção do plasmídeo, as células foram plaqueadas em placas de ágar seletivas contendo geneticina. Colônias cultivadas foram isoladas e testadas quanto à expressão de gene recombinante. As células foram cultivadas até densidades celulares suficientemente altas em meio de dextrose peptona levedura suplementado com geneticina. Após uma fase de crescimento inicial, um meio de extrato de levedura tamponado com sal com geneticina suplementado com lactose foi adicionado às culturas para induzir expressão do gene recombinante.
As culturas foram cultivadas vários dias e os sobrenadantes foram colhidos através de centrifugação.
[00220] Purificação da insulina funcional ou análogos de insulina foi iniciada através de um procedimento de filtragem. Procedimento de captura cromatográfica inicial foi feito com uma resina de troca iônica. Clivagem da pré-pró-insulina em insulina foi realizada com uma protease altamente específica. Depleções de proteína de célula hospedeira, pré-sequência e produtos relacionados a produto foram feitas por uma cascata de duas etapas cromatográficas adicionais. Próximo a uma cromatografia de interação hidrofóbica, um outro procedimento de troca iônica foi aplicado para atingir esse objetivo. Polimento final foi feito através de cromatografia de fase reversa. Filtragem, precipitação e secagem por congelamento foram utilizadas para finalizar o processo de produção da molécula de insulina.
[00221] Após reações de acoplamento com um derivado de ácido carboxílico ativado, a solução com moléculas de insulina conjugadas foi filtrada. Purificação final foi feita através de cromatografia de fase reversa. Filtragem, precipitação e secagem por congelamento foram usadas para finalizar a síntese da molécula-alvo.
[00222] Vários análogos de insulinas com mutações, por exemplo, nas posições B16, B25 e/ou A14 foram gerados. A Tabela 1 provê uma visão geral das insulinas geradas.
Tabela 1: análogos gerados de insulina humana Análogo Estrutura principal A14 B16 B25 Cadeia A da sequência de SEQ ID Nº Cadeia B da sequência de aminoácido SEQ ID Nº aminoácido (Cadeia A) (Cadeia B) WT Insulina humana (tipo selvagem) Tyr Tyr Phe GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 1 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT 2 2 Glu(A14)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Phe GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 3 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK 4 3 Leu(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Leu Phe GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 5 FVNQHLCGSHLVEALLLVCGERGFFYTPK 6 4 Gly(A21)Trp(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Trp Phe GIVEQCCTSICSLYQLENYCG 7 FVNQHLCGSHLVEALWLVCGERGFFYTPK 8 5 His(B16)Des(B30)-Insulina Tyr His Phe GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 9 FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFFYTPK 10 6 Val(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Val Phe GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 11 FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFFYTPK 12 7 Ala(B25)-Insulina Tyr Tyr Ala GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 13 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFAYTPKT 14 8 Ala(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Ala GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 15 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFAYTPK 16
41/56 9 Glu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Glu GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 17 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFEYTPK 18 10 His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr His GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 19 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPK 20 11 Leu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Leu GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 21 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK 22 12 Val(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Val GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 23 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK 24 13 His(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr His His GIVEQCCTSICSLYQLENYCN 25 FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPK 26 14 Gly(A21)Trp(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Trp His GIVEQCCTSICSLYQLENYCG 27 FVNQHLCGSHLVEALWLVCGERGFHYTPK 28 15 Gly(A21)Trp(B16)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Trp Trp GIVEQCCTSICSLYQLENYCG 29 FVNQHLCGSHLVEALWLVCGERGFWYTPK 30 16 Glu(A14)His(B16)Des(B30)-Insulina Glu His Phe GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 31 FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFFYTPK 32 17 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B16)Des(B30)-Insulina Glu Trp Phe GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 33 FVNQHLCGSHLVEALWLVCGERGFFYTPK 34 18 Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-Insulina Glu Ile Phe GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 35 FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFFYTPK 36 19 Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-Insulina Glu Val Phe GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 37 FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFFYTPK 38 20 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Des(B30)-Insulina Glu Val Phe GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 39 FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFFYTPK 40 21 Glu(A14)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr His GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 41 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPK 42 22 Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Ile GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 43 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK 44 23 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Trp GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 45 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFWYTPK 46
Análogo Estrutura principal A14 B16 B25 Cadeia A da sequência de SEQ ID Nº Cadeia B da sequência de aminoácido SEQ ID Nº aminoácido (Cadeia A) (Cadeia B) 24 Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Val GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 47 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK 48 25 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Val GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 49 FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK 50 26 Glu(A14)Glu(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu Glu His GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 51 FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPK 52 27 Glu(A14)His(B16)Ala(B25)Des(B30)-Insulina Glu His Ala GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 53 FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTPK 54 28 Glu(A14)His(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu His His GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 55 FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPK 56 29 Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Ile GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 57 FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK 58 30 Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Ile GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 59 FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK 60 31 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Trp(B25)Des(B30)- Glu Ile Trp GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 61 FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFWYTPK 62 Insulina 32 Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Val GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 63 FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK 64
42/56 33 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)- Glu Ile Val GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 65 FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK 66 Insulina 34 Glu(A14)Leu(B16)Ala(B25)Des(B30)-Insulina Glu Leu Ala GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 67 FVNQHLCGSHLVEALLLVCGERGFAYTPK 68 35 Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Ile GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 69 FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK 70 36 Glu(A14)Gly(A21)Val(B16)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Trp GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 71 FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFWYTPK 72 37 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Trp(B25)Des(B30) Glu Val Trp GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 73 FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFWYTPK 74 -Insulina 38 Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Val GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 75 FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK 76 39 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Val GIVEQCCTSICSLEQLENYCN 77 FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK 78 40 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- Glu Val Val GIVEQCCTSICSLEQLENYCG 79 FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK 80 Insulina
Exemplo 2: ensaios de afinidade de ligação de receptor de insulina/ensaios de autofosforilação de receptor de insulina
[00223] Ligação de insulina e transdução de sinal de vários análogos de insulina gerados foram determinadas através de um ensaio de ligação e um ensaio de autofosforilação de receptor. A) Ensaio de afinidade de ligação de receptor de insulina
[00224] Afinidade de ligação de receptor de insulina com os análogos listados na Tabela 1 foi determinada como descrito em Hartmann e outros ("Effect of the long-acting insulin analogs glargine and degludeca on cardiomyocite cell signaling and function". Cardiovasc Diabetol. 2016;15:96). Isolamento de membranas plasmáticas embutidas no receptor de insulina (M-IR) e experimentos de ligação de competição foram realizados como descrito anteriormente (Sommerfeld e outros, PLoS One. 2010; 5 (3): e9540). Em suma, células CHO superexpressando o IR foram coletadas e ressuspensas em tampão STM 2,25 resfriado em gelo (sacarose 2,25 M, Tris-HCl 5 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e rompidas usando um homogeneizador Dounce seguido por sonificação. O homogenato foi sobreposto com tampão STM 0,8 (sacarose 0,8 M, Tris-HCl 5 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e ultracentrifugado por 90 min a 100.000 g. Membranas plasmáticas na interface foram coletadas e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). O pelete final foi ressuspenso em tampão de diluição (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, inibidor de protease completo) e novamente homogeneizado com um homogeneizador Dounce. Os experimentos de ligação de competição foram realizados em um tampão de ligação (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, BSA 0,1%, inibidor de protease completo, ajustado para pH 7,8) em microplacas de 96 poços. Em cada poço 2 µg de membrana isolada foram incubados com esferas de ensaio de proximidade de cintilação (SPA) de gérmen de trigo aglutinina poliviniltolueno polietilenoimina de 0,25 mg. Concentrações constantes de insulina humana marcada com [125I] (100 pM) e várias concentrações da respectiva insulina não marcada (0,001–1000 nM) foram adicionadas por 12 horas em temperatura ambiente (23°C). A radioatividade foi medida em equilíbrio em um contador de cintilação de microplaca (Wallac Microbeta, Freiburg, Alemanha).
[00225] Os resultados dos ensaios de afinidade de ligação de receptor de insulina para os análogos testados em relação à insulina humana são mostrados na Tabela 2. B) Ensaios de autofosforilação de receptor de insulina (como uma medida para transdução de sinal)
[00226] A fim de determinar transdução de sinal de um análogo de insulina se ligando a receptor B de insulina, autofosforilação foi medida in vitro.
[00227] Células CHO expressando isoforma B de receptor de insulina humana (IR-B) foram usadas para ensaios de autofosforilação de IR usando tecnologia In-Cell Western como descrito anteriormente (Sommerfeld e outros, PLoS One. 2010; 5 (3): e9540). Para a análise da autofosforilação de IGF1R, o receptor foi superexpresso em uma linhagem celular 3T3 Tet off de fibroblasto de embrião de camundongo (BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha) que foi transfectada estavelmente com plasmídeo de expressão regulável por tetraciclina IGF1R. A fim de determinar o nível de fosforilação de tirosina do receptor, as células foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas por 44 h. As células foram privadas de soro com meio sem soro F12 da Ham (Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) por duas horas. As células foram subsequentemente tratadas com concentrações crescentes ou de insulina humana ou do análogo de insulina por 20 minutos a 37°C. Após incubação o meio foi descartado e as células fixadas em paraformaldeído 3,75% recém-preparado por 20 minutos. As células foram permeabilizadas com Triton X-100 0,1% em PBS por 20 minutos. Bloqueio foi realizado com tampão de bloqueio Odyssey (LICOR, Bad Homburg, Alemanha) por uma hora em temperatura ambiente. Anti-pTyr 4G10 (Millipore, Schwalbach, Alemanha) foi incubado por duas horas em temperatura ambiente. Após incubação do anticorpo primário, as células foram lavadas com PBS + Tween 20 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O anticorpo anticamundongo secundário-IgG-800-CW (LICOR, Bad Homburg, Alemanha) foi incubado por uma hora. Os resultados foram normalizados através da quantificação de DNA com corante TO-PRO3 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Os dados foram obtidos como unidades relativas (RU).
[00228] Os resultados dos ensaios de autofosforilação de receptor de insulina para os análogos testados em relação à insulina humana são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2. Afinidades de ligação de receptor de insulina relativas e atividades de autofosforilação de análogos testados de insulina humana (quanto às sequências, vide Tabela 1) Aná- Estrutura principal A14 B16 B25 Afinidade Atividade logo de ligação de autofos- de receptor forilação* de insulina* WT Insulina humana (tipo selvagem) Tyr Tyr Phe 1 1 2 Glu(A14)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Phe 1,05 0,87 3 Leu(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Leu Phe 0,24 0,34 4 Gly(A21)Trp(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Trp Phe 0,57 0,4 5 His(B16)Des(B30)-Insulina Tyr His Phe nd nd 6 Val(B16)Des(B30)-Insulina Tyr Val Phe nd 0,32 7 Ala(B25)-Insulina Tyr Tyr Ala 0,05 0,2 8 Ala(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Ala nd 0,17 9 Glu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Glu nd nd 10 His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr His 0,37 0,31 11 Leu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Leu 0,01 0,06 12 Val(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Val 0,01 0,06 13 His(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr His His 0,11 0,1 14 Gly(A21)Trp(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Trp His 0,4 0,35 15 Gly(A21)Trp(B16)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Trp Trp 0,43 0,38 16 Glu(A14)His(B16)Des(B30)-Insulina Glu His Phe 0,36 0,29 17 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B16)Des(B30)-Insulina Glu Trp Phe 0,63 0,38 18 Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-Insulina Glu Ile Phe 0,23 0,18 19 Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-Insulina Glu Val Phe nd 0,32 20 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Des(B30)-Insulina Glu Val Phe 0,4 0,28 21 Glu(A14)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr His nd nd 22 Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Ile 0,01 0,04 23 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Trp 0,56 0,37 24 Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Val 0,01 0,04 25 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Val 0,02 0,03 26 Glu(A14)Glu(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu Glu His 0,01 0,07 27 Glu(A14)His(B16)Ala(B25)Des(B30)-Insulina Glu His Ala 0,11 28 Glu(A14)His(B16)His(B25)Des(B30)-Insulina Glu His His 0,12 0,11 29 Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Ile 0,01 30 Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Ile 0** 0,01 31 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Trp 0,12 0,13 32 Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Val 0 0,04 33 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Ile Val 0,01 0,02 34 Glu(A14)Leu(B16)Ala(B25)Des(B30)-Insulina Glu Leu Ala 0,01 0,04 35 Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Ile 0 0,01 36 Glu(A14)Gly(A21)Val(B16)Trp(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Trp 0,17 0,23 37 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Trp(B25)Des(B30)- Glu Val Trp 0,21 0,19 Insulina 38 Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Val 0 0,03 39 Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Val Val 0 0,02 40 Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- Glu Val Val 0,01 0,01 Insulina
* em relação à insulina humana, nd: não determinado ** um valor de 0 significa que a afinidade de ligação estava abaixo do limite de detecção
C) Conclusões
[00229] Como pode ser apreendido da Tabela 2, várias substituições hidrofóbicas nas posições B16 e/ou B25 foram testadas (triptofano, alanina, valina, leucina e isoleucina). Embora em uma extensão diferente, todos os análogos de insulina testados com substituições hidrofóbicas nessas posições mostraram uma diminuição de atividade de ligação de receptor de insulina. Comparado com as substituições de TRP (vide, por exemplo, Análogos 4, 15 e 23), substituições com aminoácidos alifáticos tais como alanina, valina, leucina e isoleucina tiveram um impacto mais forte sobre atividade de ligação de receptor de insulina. Os efeitos mais fortes foram observados para valina, leucina e isoleucina, que são todos aminoácidos de cadeia ramificada. Substituições por isoleucina, valina e leucina resultaram em uma diminuição significativa de atividade de ligação a receptor de insulina. Interessantemente, análogos de insulina com tais substituições na posição B25 (tal como substituição de valina, leucina ou isoleucina em B25, Análogos 11, 12, 22, 24, 25, 29, 30, 32, 33, 35, 38, 39, 40) mostraram aumento de até 6 vezes em transdução de sinal do que o esperado com base em suas afinidades de ligação com IR-B. Especificamente, Leu(B25)Des(B30)-insulina e Val(B25)Des(B30)- Insulina (Análogos 11 e 12, respectivamente) mostraram apenas 1% de ligação ao receptor B de insulina e 6% de autofosforilação em relação à insulina humana. Similarmente, uma única substituição de leucina na posição B16 (Análogo 3) também mostrou um aumento similar em transdução de sinal, embora em uma extensão ligeiramente menor. Por comparação, com exceção do Análogo 26, análogos com uma substituição de histidina B25 (Análogos 10, 13, 14, 21, 28) também mostraram ligação reduzida a receptor, no entanto, uma redução concomitante em autofosforilação.
[00230] Em alguns casos (Análogos 30, 32, 35, 38, 39), ligação a receptor de insulina foi 0% enquanto ainda mostrando atividade no ensaio de autofosforilação. Todos esses análogos têm combinações de substituições de valina e/ou isoleucina nas posições B16 e B25 em comum, sugerindo que a combinação é responsável pela queda adicional em ligação a receptor de insulina. Insulinas sem substituição na posição B25, mas com trocas na posição B16, exibiram afinidades de ligação ligeiramente maiores em comparação com seus valores de autofosforilação (Análogos 3, 4, 16, 17, 18, 19, 20).
[00231] Alanina na posição B25 mostra efeitos similares aos da substituição de valina, leucina ou isoleucina (Análogos 11, 12, 22), embora em um grau menor. A afinidade de ligação de receptor e a atividade de autofosforilação de análogos com substituição de valina, leucina ou isoleucina são menores do que análogos com uma substituição de alanina. Exemplo 3: determinação de estabilidade in vitro em proteases recombinantes diferentes e fluido gástrico simulado
[00232] Análogos de insulina foram testados quanto à estabilidade proteolítica (α-quimiotripsina, catepsina D, enzima de degradação de insulina (IDE) e fluido gástrico simulado). A) Condições de Ensaio Protease Concentração de Sistema puffer usado protease final no ensaio [µg/ml] Tripsina 2 Bicarbonato de amônio 0,1 M, pH 8,3 α-Quimiotripsina 0,5 Bicarbonato de amônio 0,1 M, pH 8,3 Carboxipeptidase A 0,1 Pré-ativação (60 min) com Tripsina em tampão de TCNB, Ensaio Tris-Puffer 7,5 Carboxipeptidase B 0,1 Pré-ativação (30 min) com Tripsina em tampão de TCNB, Ensaio Tris-Buffer 7,5 Catepsina D 2 Tampão de Acetato, pH 4,5 IDE 2 Tris-Buffer pH 7,5
B) Preparação de Fluido Gástrico Simulado
[00233] Dois gramas de cloreto de sódio e 3,2 g de pepsina purificada (da mucosa do estômago de suíno, com uma atividade de 800 a 2500 unidades por mg de proteína) foram dissolvidos em 7,0 ml de ácido clorídrico. O volume foi ajustado com água até 1000 ml. A solução resultante foi misturada e ajustada com hidróxido de sódio 0,2 N ou ácido clorídrico 0,2 N para um pH de 1,2 ± 0,1. C) Procedimento Geral de Ensaio
[00234] A determinação da estabilidade foi feita em pontos de tempo apropriados (para SIF e SGF 15, 30, 60, 120 e 240 minutos; para proteases 15, 30, 60 e 120 minutos). A incubação foi feita a 37°C e a % de composto de origem remanescente foi calculada em referência a um ponto de tempo T0.
[00235] Para a determinação do composto de origem, um método bioanalítico de LC-MS/MS ou LC-HRMS apropriado foi usado, usando o sobrenadante, após precipitação de proteína com etanol (1 eq. v/v) e uma etapa de centrifugação. D) Preparação de Amostras
[00236] Os compostos foram dissolvidos em ácido clorídrico diluído em uma concentração final de 40 μM. A concentração de composto no ensaio foi 2 µM. Uma diluição de 1:20 da solução de trabalho foi feita no tampão de protease e as amostras são então incubadas a 37°C, sob agitação. No ponto de tempo apropriado uma alíquota foi retirada, a reação foi extinta com etanol (1 eq. v/v), então centrifugada. O sobrenadante foi analisado. Conclusões
[00237] Em particular, as substituições de aminoácidos lipofílicos tais como valina e isoleucina nas posições 16 e 25 na cadeia B foram investigadas. Dos análogos testados (2, 7, 11, 12, 14, 16, 19, 22, 23, 24 e 38), apenas pequenas diferenças em estabilidade foram observadas contra as proteases tripsina, carboxipeptidase A e carboxipeptidase B em relação à insulina humana (dados não mostrados). Em geral, todos os análogos com substituição de A14 e B25 (Análogos 22, 24, 38) mostraram estabilidade proteolítica melhorada contra α-quimiotripsina, catepsina D e enzima de degradação de insulina (IDE). Por exemplo, no caso de α-quimiotripsina, insulina humana foi completamente degradada dentro de duas horas enquanto o Análogo 22 era quase completamente resistente. Similarmente, todos os análogos substituídos com B25 testados mostraram estabilidade melhorada contra a catepsina D, embora com o Análogo 38 (uma variante de B16/B25) mostrando estabilidade superior comparado com as outras variantes de B25.
[00238] Uma exceção notável foi observada no caso de IDE, no qual o análogo 19 com substituições A14/B16 mostrou desempenho melhorado comparado com as variantes de B25. Os dados sugerem, no entanto, que uma substituição em A14, testada no presente documento com ácido glutâmico, é importante para estabilidade aumentada. Outras substituições também foram mostradas ser benéficas para estabilidade aumentada: tais como substituições na posição B16 e na posição B25. Por exemplo, o análogo 7 com uma troca de aminoácido na posição B25 levou à instabilidade aumentada.
Tabela 3: Porcentagem de análogo de insulina restante após incubação de análogos de insulina diferentes por 30 ou 120 minutos com quatro proteases diferentes (quanto às sequências dos análogos testados, vide Tabela 4) Aná- Estrutura principal A14 B16 B25 Fluido α-Quimio- Catepsina Enzima de logo gástrico tripsina D (30 degradação (30 (120 minutos) de insulina, minutos) minutos) [%] IDE (30 [%] [%] minutos) [%] WT Insulina Tyr Tyr Phe 0 5 0 38 2 Glu(A14)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Phe 0 35 0 81 7 Ala(B25)-Insulina Tyr Tyr Ala 30 58 52 2 11 Leu(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Leu nd nd nd 12 12 Val(B25)Des(B30)-Insulina Tyr Tyr Val 44 31 43 11 14 Gly(A21)Trp(B16)His(B25)Des(B30)- Tyr Trp His nd nd nd 41 Insulina 16 Glu(A14)His(B16)Des(B30)-Insulina Glu His Phe nd nd nd 88 19 Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-Insulina Glu Val Phe 0 30 0 98 22 Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Ile 52 99 20 77 23 Glu(A14)Gly(A21)Trp(B25)Des(B30)- Glu Tyr Trp nd nd nd 80 Insulina 24 Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-Insulina Glu Tyr Val 52 40 59 86 38 Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)- Glu Val Val 36 34 62 86 Insulina n.d.: não determinado
[00239] As cláusulas que seguem são partes da descrição:
CLÁUSULAS
1. Um análogo de insulina compreendendo pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada.
2. O análogo de insulina da cláusula 1, em que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
3. O análogo de insulina das cláusulas 1 e 2, em que o aminoácido de cadeia ramificada é selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
4. O análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 3, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição A14 que é substituída com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
5. O análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 4, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30.
6. O análogo de insulina da cláusula 5, em que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (mutação Des(B30)).
7. O análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída com um ácido glutâmico (Glu).
8. O análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 7, em que a dita insulina compreende ainda uma mutação na posição A21 que é substituída com glicina (Gly).
9. O análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 8, em que a cadeia B do análogo de insulina compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK (SEQ ID Nº: 22) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 44) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 48) FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 50) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 58) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 60) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 64) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 66) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 70) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 76)
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 78) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 80) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID Nº: 85) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 86) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 87) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 88) FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 89) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 90) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 91) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 92) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 93) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 94) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 95) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 96) e FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 97).
10. O análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 9, compreendendo: (a) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK), (b) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), ou
(c) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
11. Um análogo de insulina selecionado do grupo consistindo em Leu(B16)-insulina humana, Val(B16)-insulina humana, Ile(B16)-insulina humana, Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Val(B16)Des(B30)-insulina humana, Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Leu(B25)-insulina humana, Val(B25)-insulina humana, Ile(B25)-insulina humana, Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)-insulina humana,
Glu(A14)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana e Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana.
12. Uma cadeia de insulina B compreendendo pelo menos uma mutação em relação à cadeia B da insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição 16 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e/ou a mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e, opcionalmente, em que a dita cadeia B de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, em que a mutação na posição B30 é a deleção de treonina na posição B30 da insulina de origem (mutação Des(B30)).
13. Uma pró-insulina compreendendo uma cadeia A de insulina e uma cadeia B de insulina, em que a cadeia B de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de uma insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição B16 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada, e opcionalmente em que a dita cadeia A de insulina da dita pró-insulina compreende uma mutação na posição A14 que é substituída com um aminoácido selecionado de ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
14. Um polinucleotídeo codificando o análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 11, a cadeia B de insulina da cláusula 12 e/ou a pró-insulina da cláusula 13.
15. Uma célula hospedeira compreendendo análogo de insulina de qualquer uma das cláusulas 1 a 11, a cadeia B de insulina da cláusula 12, a pró-insulina da cláusula 13 e/ou o polinucleotídeo da cláusula 14.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Análogo de insulina, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma mutação em relação à insulina de origem, em que o análogo de insulina compreende uma mutação na posição B16 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada.
2. Análogo de insulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a insulina de origem é insulina humana, insulina suína ou insulina bovina.
3. Análogo de insulina de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o aminoácido de cadeia ramificada é selecionado do grupo consistindo em valina (Val), isoleucina (Ile) e leucina (Leu).
4. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição A14 que é substituída com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
5. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30.
6. Análogo de insulina da de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a mutação na posição B30 é a deleção do aminoácido na posição B30 da insulina de origem (mutação Des(B30)).
7. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito análogo de insulina compreende ainda uma mutação na posição B3 que é substituída com um ácido glutâmico (Glu).
8. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a dita insulina compreende ainda uma mutação na posição A21 que é substituída com glicina (Gly).
9. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia B do análogo de insulina compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK (SEQ ID Nº: 22) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 44) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 48) FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 50) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 58) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 60) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 64) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 66) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK (SEQ ID Nº: 70) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 76) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 78) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID Nº: 80) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID Nº: 85) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 86) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 87) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 88) FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 89) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 90) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 91) FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 92) FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 93) FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID Nº: 94)
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 95) FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 96) e FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID Nº: 97).
10. Análogo de insulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK), (b) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), ou (c) uma cadeia A tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN) e uma cadeia B tendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
11. Análogo de insulina, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em Leu(B16)-insulina humana, Val(B16)-insulina humana, Ile(B16)-insulina humana, Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Val(B16)Des(B30)-insulina humana,
Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Leu(B25)-insulina humana, Val(B25)-insulina humana, Ile(B25)-insulina humana, Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B16)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Leu(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana,
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-insulina humana, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-insulina humana, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana e Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-insulina humana.
12. Cadeia B de insulina, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma mutação em relação à cadeia B da insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição 16 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e/ou a mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e, opcionalmente, em que a dita cadeia B de insulina compreende ainda uma mutação na posição B30, em que a mutação na posição B30 é a deleção de treonina na posição B30 da insulina de origem (mutação Des(B30)).
13. Pró-insulina, caracterizada pelo fato de que compreende uma cadeia A de insulina e uma cadeia B de insulina, em que a cadeia B de insulina compreende pelo menos uma mutação em relação à cadeia B de uma insulina de origem, em que a cadeia B compreende uma mutação na posição B16 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada e/ou uma mutação na posição B25 que é substituída com um aminoácido de cadeia ramificada, e opcionalmente em que a dita cadeia A de insulina da dita pró-insulina compreende uma mutação na posição A14 que é substituída com um aminoácido selecionado de ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp) e histidina (His).
14. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o análogo de insulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, a cadeia B de insulina da reivindicação 12 e/ou a pró-insulina como definida na reivindicação 13.
15. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende análogo de insulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, a cadeia B de insulina como definida na reivindicação 12, a pró-insulina como definida na reivindicação 13 e/ou o polinucleotídeo como definido na reivindicação 14.
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