JP2022507627A - ポリ－アラニンｃ－ドメインのサブセグメントを有する単鎖インスリンアナログ - Google Patents

Abstract

【解決手段】 配列パターン［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］－Ａｌａ－Ａｎ－Ａｌａ－Ｘａａに適合する長さ４－１１の人工Ｃドメインセグメントを含む単鎖インスリンアナログであって、Ａｎは０－７個のアラニン残基のサブセグメントを示し、Ｘａａはアミノ酸のアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基を示すものである。アナログは、ヒトインスリンなどの哺乳類インスリンのアナログであっても良く、（ｉ）インスリンの安定性を増強する、（ｉｉ）等電点のシフトを引き起こして中性ｐＨでのタンパク質の溶解性を高めるもしくは損なう、または（ｉｉｉ）Ｉ型ＩＧＦ受容体へのタンパク質のクロスバインディングを低減する標準的または非標準的な修飾を選択的に含んでいても良い。本発明は、生理学的に有効な量のタンパク質またはその生理学的に許容される塩を患者に投与することを含む、糖尿病の患者を治療する方法である。【選択図】 図１Ａ

Description

本発明は、米国国立衛生研究所の助成金番号ＤＫ０４０９４９およびＤＫ０７４１７６による政府の支援を受けて作製された。政府は本発明に対して一定の権利を有する。

本発明は、対応する野生型ヒトホルモンの可溶性製剤に対して、熱力学的安定性の増加、室温以上での熱細動に対する抵抗性の増強、マイトジェニック性の減少、および／または薬物動態および薬力学的特性の変化、すなわち作用時間のより長期化または作用時間のより迅速な付与など、強化された医薬特性を示すポリペプチドホルモン類縁体に関する。より詳細には、本発明は、ＡドメインとＢドメインの間に新規なクラスの前短縮された連結（Ｃ）ドメインを含む単一のポリペプチド鎖からなるインスリン類似体に関するものである。長さ４～１１残基のこのクラスのＣドメインは、Ｎ－末端の酸性要素と、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基を含むＣ－末端セグメントからなる。本発明の単鎖インスリン類縁体は、ＡまたはＢドメインの他の部位に標準的または非標準的なアミノ酸置換を選択的に含むことができる。

治療薬やワクチンなどの非標準的なタンパク質を工学的に開発することは、医学的にも社会的にも大きな利益をもたらす可能性がある。天然に存在するタンパク質は、ヒト、他の哺乳類、脊椎動物、無脊椎動物、あるいは真核細胞のゲノムにおいてコード化されており、多くの場合、複数の生物活性を付与する。非標準的なタンパク質の利点は、室温またはそれ以上の温度での分解に対する耐性が増強され、輸送、流通、使用が容易になることである。治療用タンパク質の一例として、インスリンが挙げられる。野生型のヒトインスリンや他の哺乳類のゲノムにコードされているインスリン分子は、ＲＮＡスプライシングの代替モードや翻訳後のグリコシル化の代替パターンによって生成された受容体アイソフォームとは無関係に、複数の器官や多様なタイプの細胞のインスリン受容体に結合する。また、野生型インスリンは、相同性の高い１型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）と低い親和性で結合する。

医学的なメリットとしては、タンパク質の展開や分解に対する安定性を最適化することが挙げられる。このような社会的な利益は、室温以上での分解に関して標準的なタンパク質よりも抵抗性のあるタンパク質を工学的に開発することで、特に電気や冷蔵が一貫して利用できない発展途上国の地域での使用に適する。単一のポリペプチド鎖で構成され、選択的に非標準的なアミノ酸置換を含むインスリンの類似体は、熱劣化への耐性や分裂促進性の低下に関して優れた特性を示す可能性がある。インスリンの物理的劣化による問題は、アフリカやアジアでの糖尿病の流行により、さらに深刻化している。フィブリル化は室温以上での主な分解経路であるため、フィブリル化に耐性のある製剤を設計することで、このような問題を抱える地域でのインスリン補充療法の安全性と有効性を高めることができる。

インスリンの投与は、糖尿病の治療法として長い間確立される。糖尿病患者に対する従来のインスリン補充療法の主な目的は、血糖値が健康な人に特有の正常範囲を超えたり、下回ったりしないようにしっかりとコントロールすることである。正常範囲を下回ると、すぐにアドレナリン作動性症状や神経糖質減少性症状が現れ、重篤な場合には痙攣、昏睡、死に至ることもある。正常範囲を超えた場合は、網膜症、失明、腎不全などの微小血管障害の長期的なリスクが高まる。

インスリンは、脊椎動物の代謝に中心的な役割を果たす小型の球状タンパク質である。インスリンは、２１残基のＡ鎖と３０残基のＢ鎖の２つの鎖から構成される。ホルモンは、Ｚｎ^２＋で安定化された６量体として膵β内に貯蔵されるが、血流中ではＺｎ^２＋を含まない単量体として機能する。インスリンは、Ｂ鎖のＣ末端残基（Ｂ３０残基）とＡ鎖のＮ末端残基をつなぐ連結領域（３５残基）を有する単鎖の前駆体であるプロインスリンの産物である（図１Ａ）。様々な証拠から、インスリン様コアと無秩序な連結ペプチドから構成されることが示される（図１Ｂ）。３つの特異的なジスルフィド結合（Ａ６－Ａ１１、Ａ７－Ｂ７、Ａ２０－Ｂ１９、図１Ａおよび図１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）におけるプロインスリンの酸化的な折り畳みと連動すると考えられる。プロインスリンは、小胞体からゴルジ装置に輸送された直後に、可溶性のＺｎ^２＋を配位した６量体に集合する。未熟な分泌顆粒では、エンドプロテアーゼによる消化とインスリンへの変換が行われ、その後、形態が凝縮される。成熟した貯蔵顆粒内のインスリン六量体亜鉛の結晶配列は、電子顕微鏡（ＥＭ）によって可視化される。インスリンの塩基配列を図１Ｃに模式的に示す。個々の残基は、アミノ酸の同一性（典型的には、標準的な１文字または３文字のコードを使用する）、鎖および配列位置（典型的には、上付き文字として）によって示される。本発明で重要なのは、ヒトプロインスリンに特徴的な３６残基の野生型Ｃドメインの代わりに、長さ４～１１残基の新規な前短縮型Ｃドメインを発明することである。

フィブリル化は、糖尿病治療用のインスリンおよびインスリンアナログの製造、保存、使用において深刻な問題であり、高温、低ｐＨ、撹拌、または尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、または疎水性表面の存在によって促進される。現在の米国の医薬品規制では、フィブリル化が１％以上発生した場合、インスリンを廃棄することが求められる。フィブリル化は温度が高くなると促進されるため、糖尿病患者はインスリンを使用する前に冷蔵保存することが望ましい。インスリンやインスリンアナログのフィブリル化は、外付けのインスリンポンプを使用している患者にとっては特に問題となる。このような使用方法では、インスリンまたはインスリンアナログはポンプ装置内で冷蔵保存されないため、インスリンのフィブリル化により、インスリンまたはインスリンアナログを体内に注入するためのカテーテルが閉塞し、予測できない血糖値の変動や、危険な高血糖を引き起こす可能性がある。インスリンは、２５℃以上の温度で１０℃上昇するごとに１０倍以上の分解率になるため、＜３０℃での保存できれば冷蔵保存が望ましいとされる。ｐＨ５以下の可溶性溶液として製剤化された基礎インスリンアナログ製剤（ランタス（登録商標）（サノフィ・アベンティス社）など）のフィブリル化は、ｐＨ４のインスリン・グラルギンと亜鉛イオンの非緩衝溶液を含む。このような製剤に用いられる酸性条件は、インスリンの自己組織化を阻害し、亜鉛イオンの結合力を弱めるため、亜鉛とタンパク質の集合体の中に封じ込めることでインスリンアナログを保護することができる範囲が狭くなる。

インスリンは化学的に劣化しやすく、分子内の原子の再配列が失われて化学結合が切断されたり、異なるインスリン分子間で化学結合が形成されたりする。このような化学結合の変化は、通常、タンパク質の展開状態で起こるため、熱力学的安定性を高めるインスリンの改変は、化学的劣化を遅らせたり、防いだりする可能性がある。

また、インスリンは物理的に分解されやすい。現在のタンパク質フィブリル化理論では、フィブリル化のメカニズムは、部分的に折り畳まれた中間状態を経て、その中間状態が凝集してアミロイド原核を形成すると考えられる。この理論によると、ネイティブな状態を安定化させるアミノ酸置換は、部分的に折り畳まれた中間状態を安定化させる場合とさせない場合があり、また、ネイティブな状態と中間状態の間の自由エネルギー障壁を増加させる場合とさせない場合があると考えられる。したがって、現在の理論では、２本鎖インスリン分子内のあるアミノ酸置換が細動のリスクを増加または減少させる傾向は、非常に予測不可能である。インスリン分子の構造モデルでは、（ネイティブな状態で見られるように）３αヘリックスがほぼ完全に展開し、Ｂ鎖の連続的な積み重ねとＡ鎖の連続的な積み重ねによってβシートが平行に配置され、鎖間およびＡ鎖内のネイティブなジスルフィドペアリングが維持されると考えられる。このような平行なβシートを形成するためには、Ａ鎖のＮ末端とＢ鎖のＣ末端の間にかなりの距離（＞３０Å）が必要であり、通常、インスリンモノマーのネイティブな状態では、これらの末端は近接する（＜１０Å）。

前方に短縮されたＣドメインを持つ単鎖インスリンアナログのフィブリル化に対する顕著な抵抗性は、当技術分野では知られており、インスリンのプロトフィラメントにおける平行なクロスベータシートのスプレイ構造と、前方に短縮されたＣドメインがＡ鎖のＮ末端とＢ鎖のＣ末端の間の距離を制約するネイティブなジスルフィドペアリングを持つ単鎖インスリンアナログの構造との間のトポロジー的不適合を反映していると考えられる。図２に、ＣドメインＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ（ＧＧＧＰＲＲ）を含む長さ５７残基の活性で超安定な単鎖インスリンの３次元構造を、Ｌｙｓ^Ｂ２９とＧｌｙ^Ａ１の間にペプチド結合を含む不活性な単鎖アナログ（すなわち長さ５０残基のｄｅｓ－Ｂ３０ ＳＣＩ）との関係で示す。

本発明は、Ａ鎖とＢ鎖の間の化学的テザー（例えば、Ｌｙｓ^Ｂ２９のε－アミノ基とＧｌｙ^Ａ１のα－アミノ基の間）および短縮されたＣドメインによってインスリンに与えられる増大した安定性を最適化する必要がある。後者の類縁体は単鎖インスリン類縁体（ＳＣＩ）と呼ばれる。Ｂ鎖のＣ末端付近の残基（Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０残基）とＧｌｙ^Ａ１との直接のペプチド結合は、一般に生物学的活性を著しく低下させるが、長さ４－１１の短縮型Ｃドメインは、少なくとも受容体結合親和性のかなりの部分を許容するのに十分なコンフォメーション上の「遊び」を提供する。このような長さの区別の構造的な基盤は、ホルモンとインスリン受容体のエクトドメインの２つの部分（Ｎ－末端断片Ｌ１－ＣＲとＣ－末端断片αＣＴ）との間の三元複合体を含む「マイクロ受容体」／インスリン複合体の結晶構造によって示唆される。一般的にＳＣＩは、血流中でのシグナル伝達が長くなることがあり、インスリンポンプや食事時インスリン補充療法での使用には不利な薬力学的特性である。当技術分野で知られる超安定な単鎖または二本鎖のインスリン類似物質は、糖尿病ラットの静脈内ボーラス注射でテストしたところ、不可解な異常なシグナル伝達の延長を示した（図３）。我々の知る限り、あるＢドメインのコンテキストでは二相性の薬力学特性を付与できるが、別のコンテキストでは付与できない混合配列のＣドメイン（Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ［ＥＥＰＲＲ］など）の薬力学的効果を予測できるルールは知られていない。

そのため、生物学的および生物物理学的特性が容易に最適化され、治療への応用が可能な、単純化されたＣドメイン配列を有する単鎖インスリン類似体が必要とされる。このような治療法の例としては、（ｉ）体外式または体内式インスリンポンプでの迅速な作用、（ｉｉ）発展途上国の困難な地域で使用するための超安定単成分可溶性製剤での二相性作用、などが挙げられる。ＡまたはＢドメインにおける安定化置換の存在下で、および／または２鎖インスリンアナログの吸収を促進するために当技術分野で知られるＢドメイン置換の存在下で、糖尿病の哺乳動物の皮下注射におけるＳＣＩの迅速な作用が維持される、単純化されたＣドメイン配列に対する特別な必要性があるだろう。

したがって、本発明は、内部にポリ－アラニンサブセグメントを有する簡略化されたＣ－ドメイン配列を含む単鎖インスリン類似体を提供することを目的とする。これらの配列は長さ４～１１であり、Ｎ末端の酸性残基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）と、アラニン、酸性残基または塩基性残基のいずれかであるＣ末端の残基を含む（グループＸ：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジン、セリン）。したがって、これらのＣドメイン配列は、［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］－Ａｌａ－Ａ_ｎ－Ａｌａ－［Ｘａａ］のパターンに適合し、ここで、Ａ_ｎは、０～７個のアラニン残基のサブセグメントを指定し、Ｘａａは、上記のグループＸから選択されたアミノ酸残基を指定する。本発明のもう一つの側面は、ＩＲ－ＡおよびＩＲ－Ｂに対する単鎖インスリンアナログの絶対的なｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性が、野生型のヒトインスリンに対して５～１５０％の範囲であり、そのためホルモン－受容体複合体における滞留時間が著しく長くなる可能性が低いことである。このような最適化された類似体は、野生型ヒトインスリンよりも分裂を誘発するＩＧＦ－１Ｒ受容体に弱く結合するはずであり、これは哺乳類細胞培養における分裂誘発性の低下を示す傾向があるだろうというのが、本発明のさらに別の側面である。本発明は、単純化されたＣドメイン配列を有する単鎖インスリン類縁体の有用性を示すものであり、治療用途に好ましい生物物理学的、生物学的および薬力学的特徴の共同最適化を容易にするものである。

図１Ａは、Ａ鎖とＢ鎖を含むヒトプロインスリンの配列を模式的に示したもので、二塩基性切断部位（黒丸）とＣペプチド（白丸）が隣接する連結領域が示される。 図１Ｂは、プロインスリンの構造モデルで、インスリン様部分と無秩序な連結ペプチド（破線）から構成される。 図１Ｃは、Ｂ鎖の残基Ｂ２７およびＢ３０の位置を示すヒトインスリンの配列の概略図である。 図２は、ＳＣＩ－ｃ（ＰＤＢ：２ＪＺＱ（２９）の溶液構造を示しており、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、およびネイティブなジスルフィドが示される。 図３Ａは、［Ａｓｐ^Ｂ１０，Ｌｙｓ^Ｂ２８，Ｐｒｏ^Ｂ２９，Ｃｙｓ^Ｂ４，Ｃｙｓ^Ａ１０］インスリン（「４ＳＳ－ＤＫＰ」）のリボン構造図であり、アスタリスクは４番目のジスルフィドブリッジを示す。 図３Ｂは、Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（（２００８）"Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．"のＳＣＩ－ｃのリボン構造表示である。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１４７０３－１４７１６）． 図３Ｃは、Ｖｉｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（（２０１３）糖尿病ラットにおける"Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ ｗｉｔｈ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｈａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ．"Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２：２９６－３０５）によると、ＷＴインスリンおよび希釈剤に対する４ＳＳ－ＤＫＰ－ｉｎｓｕｌｉｎの経時的なインスリン作用のグラフィック表示である。 図３Ｄは、インスリンリスプロ（Ｎ＝１３）、４ＳＳ－ＤＫＰ－インスリン（Ｎ＝１０）、［Ａｓｐ^Ｂ１０，Ｌｙｓ^Ｂ２８，Ｐｒｏ^Ｂ２９］－インスリン（「ＤＫＰ」；Ｎ＝９）、ＳＣＩ－ｃ（Ｎ＝８）をＩＶ注射した後に得られたインスリン作用のグラフィック表示である。ネガティブコントロールとして，Ｌｉｌｌｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（バイオレット）を静脈注射した（Ｎ＝１２）．インスリン投与量はそれぞれ１．７ｎｍｏｌ／３００ｇラットとした。 図４は、本発明の単純化されたＣドメインの模式図である。Ｎ末端要素（Ｅ－Ａ－）、ｎ＝０、１、２、３、４、５、６または７残基を含むポリ－アラニンサブセグメント（Ａ_ｎ）、およびＣ末端要素であるＡ－Ｘ（ここで、Ｘはアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジンまたはセリンからなるアミノ酸のサブセットから選択される）を含む。 図５は、本発明に関連する静電的特徴を強調した、ネイティブインスリンのＡ１－Ａ８αヘリックスの模式図である（下に配列がある円柱として示される）。野生型の配列には中央に酸性残基（Ｇｌｕ^Ａ４）があり、その負電荷が（ｉ，ｉ－４）および（ｉ，ｉ＋４）の静電相互作用に関与する可能性がある。前者はＣドメインのＣ末端側鎖が関与しており、後者はＡ８位の変異型側鎖が関与する可能性がある。Ａ４関連の静電相互作用の例としては、（ａ）ＣドメインのＣ末端位置にあるＡｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ、または（ｂ）Ａ８位置にあるＡｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓが挙げられる。ＣドメインのＣ末端位置にあるＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＳｅｒは、このヘリックスの好ましいＮ－Ｃａｐを提供する可能性があり、一方、Ａ８位置にあるＡｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓは、野生型Ｔｈｒ^Ａ８よりも好ましいＣ－Ｃａｐを提供する可能性がある。 図６は，ストレプトゾトシンで糖尿病にしたＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを用いた生物学的試験の結果を示す。３種類のＳＣＩを皮下注射し，対照としてインスリンリスプロを皮下注射した場合と比較して検討した（１群あたりＮ＝６）。投与量は３００ｇのラットに１５μｇのインスリンリスプロを投与し，ＳＣＩの投与量は３００ｇのラットにナノモル単位で換算した（すなわち，それぞれの分子量で補正したマイクログラムである）。結果は、平均血糖値（縦軸）を分単位の時間（横軸）の関数として表す。シンボルコード（右上のボックス）：（黒塗り四角■）ポジティブコントロールとしてのインスリンリスプロ；（黒塗り三角▲）ＳＣＩ－２（ＡドメインをＴｈｒ^Ａ８→ＨｉｓとＴｙｒ^Ａ１４→Ｇｌｕに、ＢドメインをＰｒｏ^Ｂ２８→ＡｓｐとＬｙｓ^Ｂ２９→Ｐｒｏに置換したリンカーＥＥＧＰＲＲ）を示した；（黒塗り丸●）ＳＣＩ－３（Ｈｉｓ^Ａ８を野生型Ｔｈｒに、Ｇｌｕ^Ａ１４を野生型Ｔｙｒに戻したＳＣＩ－２の変種）；及び（黒塗り菱形◆）Ｈｉｓ^Ａ８、Ｔｙｒ^Ａ１４、Ａｓｐ^Ｂ２８、及びＰｒｏ^Ｂ２９のコンテクストでリンカーＥＡＡＡＡＡを有するＳＣＩ－４。

本発明は、（ｉ）簡略化された前短縮されたＣドメイン（長さ４～１１残基）の存在に起因する強化された安定性とフィブリル化に対する抵抗性、および（ｉｉ）生物学的、生物物理学的および薬力学的特性の容易で便利な共同最適化を提供する単鎖のインスリンアナログを対象とする。本発明の単鎖インスリンアナログは、４．０～６．０の間の等電点を有していても良く（従って、速効性インスリンアナログ製剤として中性ｐＨ条件下での製剤化に適する）、あるいは６．５から８．０の間の等電点を有していても良い（従って、基礎インスリンアナログ製剤として酸性ｐＨ条件下での製剤化に適する）。この戦略の分子的な実施形態は、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでの生合成発現によって調製され、ＳＣＩ－４と名付けられ、その特性は当技術分野で知られるＳＣＩ（ＳＣＩ－１、ＳＣＩ－２、ＳＣＩ－３と名付けられた）と関連する。

本発明の短縮されたＣドメインを図５に模式的に示す。ネイティブインスリンのＡ１－Ａ８ α－ｈｅｌｉｘ（下に配列がある円柱として示す）は、本発明に関連する静電的特徴を強調する。野生型の配列には中央に酸性の残基（Ｇｌｕ^Ａ４）があり、その負電荷が（ｉ，ｉ－４）および（ｉ，ｉ＋４）の静電相互作用に関与する可能性がある。前者にはＣドメインのＣ末端側鎖が関与し、後者にはＡ８位置の変異型側鎖が関与する可能性がある。Ａ４関連の静電相互作用の例としては、（ａ）ＣドメインのＣ末端位置にあるＡｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ、または（ｂ）Ａ８位置にあるＡｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓが挙げられる。ＣドメインのＣ末端位置のＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒは、このヘリックスの好ましいＮ－Ｃａｐを提供し、一方、Ａ８位置のＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓは、野生型Ｔｈｒ^Ａ８よりも好ましいＣ－Ｃａｐを提供する可能性がある。ＣドメインのＮ－末端残基は、インスリン受容体アイソフォーム（ＩＲ－ＡおよびＩＲ－Ｂ）に相対する分裂促進性のタイプ１ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）への類似体の結合を損なうために、酸性（アスパラギン酸またはグルタミン酸）である。

ＣドメインのＣ末端残基は、アナログの等電点（ひいてはｐＨ依存性溶解度）、熱力学的安定性、セグメントＡ１－Ａ８ヘリカルダイナミクス、薬物動態特性、及び薬力学特性の共同最適化を容易にする「調整可能なノブ」を提供する。理論的な制約を意図しているわけではないが、このノブは、Ｎ－Ｃａｐ残基としての可能性も含め、らせんの双極子軸（図５の横矢印）との静電的な相互作用や、（ｉ，ｉ－４）側鎖の相互作用を介してＧｌｕ^Ａ４の負電荷と相互作用するように配置される。このα－ヘリカルセグメントの静電特性をさらに変化させるには、（ｉ，ｉ＋４）側鎖相互作用を介したＡ８位の置換が有効である。ヒトインスリンのスレオニンであるＡ８位の野生型残基は、α－ヘリカル傾向とＣ－Ｃａｐ傾向の両方に関して最適ではないβ分岐型の側鎖を含む。このようなＣドメインは、最小のものでは４つの残基が中央にジ－アラニン要素（［Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｘａａ］）を有し、最長のものでは１１残基が９残基のポリ－アラニンサブセグメントを有する。

本発明の単鎖インスリン類縁体は、それぞれのＡドメインおよびＢドメイン内に置換を含んでいても良い。Ｂドメインの置換には、自己組織化を弱め、皮下注射時の迅速な吸収を可能にすることが知られる変異体が含まれる。その例としては、ＡｓｐＢ２８（Ｎｏｖｏｌｏｇ（登録商標）；ｉｎｓｕｌｉｎ ａｓｐａｒｔ）、Ｌｙｓ^Ｂ２８－Ｐｒｏ^Ｂ２９（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）；ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｓｐｒｏ）またはＡｓｐ^Ｂ２８－Ｐｒｏ^Ｂ２９が挙げられる。Ｔｙｒ^Ａ１４をＧｌｕで置換することにより、熱力学的安定性を向上させる逆疎水性効果を緩和し、同時に化学的分解の可能性のある芳香族部位を取り除くことができる。本発明の類縁体は、細胞培養での有糸分裂性やラット実験での発癌性の増加に関連するＨｉｓ^Ｂ１０→Ａｓｐの置換を除外する。

ヒトと動物のインスリンが類似することや、過去に動物のインスリンがヒトの糖尿病患者に使用されたことを考慮すると、インスリンの配列に他のマイナーな変更が導入されることも想定され、特に「保守的」と考えられる置換が導入されることも想定される。例えば、本発明から逸脱することなく、類似した側鎖を持つアミノ酸のグループ内で、アミノ酸の追加的な置換を行っても良い。中性の疎水性アミノ酸としては、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、及びメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）などが挙げられる。同様に、中性極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、およびアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）のそれらのグループ内で互いに置換されていても良い。塩基性アミノ酸としては、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、及びヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）などが考えらレル。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。別段の記載がない限り、または文脈から明らかな場合は、本明細書に記載されたアミノ酸はＬ－アミノ酸であると考えるべきである。標準的なアミノ酸は、同じ化学的クラスに属する非標準的なアミノ酸で置換することもできる。非限定的な例として、塩基性側鎖Ｌｙｓは、より短い側鎖長の塩基性アミノ酸（オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸）で置き換えられても良い。また、Ｌｙｓは中性脂肪族イソステアのノルロイシン（Ｎｌｅ）で置換されていても良く、その場合、より短い脂肪族側鎖を含む類似体（アミノ酪酸、アミノプロピオン酸）で置換されていても良い。

本発明の代表的なアナログは、記載されているように、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの人工株から精製された（Ｇｌｉｄｄｅｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２０１７ａｂ，"Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｕｌｔｒａ－ｓｔａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎａｌｏｇ ｃｏｎｎｅｃｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｔｏ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ．"．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｐｉｉ：ｊｂｃ．Ｍ１１７．８０８６６７．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１７．８０８６６７［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）に記載される。この類似体は長さ５７残基で、配列Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ（ＥＡＡＡＡＡ）のＣドメインを含んでおり、したがって、ｎ＝２（上記の下線）でＸａａもアラニンであるテンプレートＧｌｕ－Ａｌａ－Ａ_ｎ－Ｘａａに適合する。類似品（ＳＣＩ－４と命名）は、インスリン部分に４つの置換基を含んでいた。インスリン部分にはＴｈｒ^Ａ８→ＨｉｓとＴｙｒ^Ａ１４→Ｇｌｕ、ＢドメインにはＰｒｏ^Ｂ２８→ＡｓｐとＬｙｓ^Ｂ２９→Ｐｒｏの４つの置換があった。これらの置換基の理由は以下の通りである。Ｈｉｓ^Ａ８は受容体結合親和性と熱力学的安定性を高めるために、Ｇｌｕ^Ａ１４は安定性を高め、等電点を下げるために（Ｈｉｓ^Ａ８の部分電荷によって上昇する）、Ａｓｐ^Ｂ２８－Ｐｒｏ^Ｂ２９は二量体化を弱め、等電点をさらに下げるために導入されたものである。

ＳＣＩ－４の連結ドメインまたはＣドメインは、Ｎ－末端の［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］－Ａｌａ要素からなる一般的な構造を有しており、ＳＣＩの分裂促進性のタイプ１ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）への結合を損なうように機能する。Ｃ末端のＡｌａ－Ｘａａ（ここでＸａａは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジン、またはセリンからなるアミノ酸のサブセットから選択される）は、アナログの等電点、安定性、セグメントヘリカルの安定性、および薬力学的特性を調整するための調整可能なノブとなる。本発明の短縮されたＣドメインは、ｎ＝０、１、２、３、４、５、６または７残基を含むポリ－アラニンサブセグメント（Ａ_ｎ）を選択的に含む。そのため、Ｃドメインの全長は４～１１残基の範囲となる。最も短いＣドメインは中央にジ－アラニンサブセグメント（［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］－Ａｌａ－Ａｌａ）を含み、最も長いＣドメインは中央に７つのアラニンを含むポリ－アラニンサブセグメントを含み、合計９つのアラニン残基を持つ。

このアナログの薬力学的特徴は、Ｍｅｎｔｉｎｇ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｈｉｎｇｅ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｏｐｅｎｓ ｔｏ ｅｎａｂｌｅ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．"）で提供されているように、糖尿病のラットモデルで皮下注射後にテストされた。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１（３３）：Ｅ３３９５－４０４）に記載される。図６に示すように、ＳＣＩ－４の生物学的活性、作用の開始、および作用の持続時間は、インスリンリスプロと、当技術分野で従来知られているより複雑なＣドメインを含む２つの単鎖類似体（Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ；ＥＥＧＰＲＲ）とを相対的に定義した。ＳＣＩ－２は、ＳＣＩ－４と同じ４つの置換をＡ－およびＢ－ドメインに含み、作用の開始は早いが（インスリンリスプロと同様）、インスリン作用の延長された尾部を示す。ＳＣＩ－３は、ＳＣＩ－２のＡドメインに野生型の残基（すなわちＴｈｒ^Ａ８とＴｙｒ^Ａ１４）が復元された変異体で、この変異体は作用発現が遅いが、そのオフセットはインスリンリスプロと同様であった。驚くべきことに、ＳＣＩ－４の薬力学的プロファイルは、作用の開始、作用のオフセット、および統合された効力（曲線上の面積）に関して、インスリン・リスプロと本質的に同じである。Ｈｉｓ^Ａ８とＧｌｕ^Ａ１４が存在するにもかかわらず、長く続く尾部がないことから、Ｃドメインの配列とインスリン部分の改変が相互に影響し合っていることがわかる。

糖尿病の患者を治療する方法は、本明細書に記載の単鎖のインスリンアナログを投与する工程を含む。本発明のインスリンアナログは、医薬品として、または疾患の治療のために使用することができる。いくつかの例では、本発明のインスリンアナログは、糖尿病の治療のための医薬品の製造に使用されても良い。

本発明の別の側面として、単鎖インスリン類似体は、酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて調製するか、ネイティブフラグメントライゲーションによる全化学合成を行うことができる。合成法による調製は、Ｄ－アミノ酸置換、ＰｈｅやＴｙｒの芳香環内のハロゲン置換、炭水化物によるセリンやスレオニンのＯ－結合型修飾などの非標準的な修飾の場合に好ましいが、非標準的な修飾を含む単鎖類縁体のサブセットを、拡張遺伝暗号技術や４塩基コドン技術によって製造することも可能であると考えられる。非標準的なアミノ酸置換の使用が、化学的分解または物理的分解に対する単鎖インスリンアナログの耐性を増強することができるというのが、本発明のさらに別の側面である。さらに、本発明の類似体が、糖尿病またはメタボリックシンドロームの治療方法を提供することを想定する。インスリンアナログの送達経路は、典型的には、シリンジまたはペンデバイスの使用による皮下注射である。インスリンポンプも同様に、外部インスリンポンプや移植可能な腹腔内ポンプなどを使用することができる。

本発明の単鎖インスリンアナログは、米国特許第８，９２１，３１３号に詳細に記載されているように、Ｂ２４、Ｂ２５、またはＢ２６の位置にハロゲン原子などの他の修飾を含んでいても良い（その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。本発明のインスリンアナログはまた、残基Ｂ１－Ｂ３の欠失による前短縮されたＢ鎖を含んでいても良い。

医薬組成物は、このようなインスリンアナログ、およびその生理学的に許容される塩を含んでいても良く、選択的に亜鉛を含んでいても良い。亜鉛イオンは、インスリンアナログ６量体あたり２．２個の亜鉛原子から１０個の亜鉛原子まで、さまざまな亜鉛イオン：タンパク質の比率で含まれていても良い。製剤のｐＨは、ｐＨ３．０～４．５（ｐＩシフトした単鎖インスリンアナログの基礎製剤として）、またはｐＨ６．５～８．０（ｐＩが野生型インスリンと同様の単鎖インスリンアナログのプランディアルインスリン製剤として）の範囲であっても良い。このようないずれの製剤においても、インスリンアナログの濃度は、典型的には約０．６～５．０ｍＭとなるだろう。５ｍＭまでの濃度は、バイアルまたはペンで使用することができる。より濃縮された製剤（Ｕ－２００以上、範囲Ｕ－５００～Ｕ－１０００を含む）は、顕著なインスリン抵抗性を有する患者において特に有益であると考えられる。賦形剤としては、グリセロール、グリシン、アルギニン、トリスなどの緩衝剤や塩類、フェノールやメタクレゾールなどの抗菌防腐剤などが挙げられ、後者の防腐剤はインスリン六量体の安定性を高めることが知られている。このような医薬組成物は、生理学的に有効な量の組成物を患者に投与することにより、糖尿病または他の病状を有する患者を治療するために使用することができる。

ヒトプロインスリンのアミノ酸配列は、比較のために、配列ＩＤ番号：１として提供される。

配列ＩＤ番号：１（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ

ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：２として提供される。
配列ＩＤ番号：２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ

ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：３として提供される。
配列ＩＤ番号：３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ

ＳＣＩ－４のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：４として提供される。
配列ＩＤ番号：４
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ

ＳＣＩ－２のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：５として提供される。
配列ＩＤ番号：：５
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ

ＳＣＩ－３のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号：６として提供される。
配列ＩＤ番号：：６
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ
前述の開示に基づき、ポリ－アラニンサブセグメントを含む短縮された単純化されたＣドメインを共同で設計することにより、超安定な単鎖インスリンアナログがインスリンシグナルの持続時間を妨げずに適合するようになることが明らかになるはずである。結果として提供される単鎖インスリンアナログは、本明細書に記載された目的を遂行する。すなわち、これらの修飾されたタンパク質は、望ましい薬物動態学的特徴（治療上必要な皮下デポからの迅速または長時間の吸収率を付与する）を保持し、野生型インスリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持しながら、フィブリル化に対する強化された耐性を示す。したがって、明らかな変形は本発明の範囲内であり、したがって、特定の構成要素の選択は、本明細書に開示され記載された本発明の精神から逸脱することなく決定することができることを理解されたい。

Claims (16)

1. インスリンＡ鎖ポリペプチド配列と、インスリンＢ鎖ポリペプチド配列と、およびインスリンＡ鎖ポリペプチド配列をＢ鎖ポリペプチド配列と連結する連結ペプチドとを含む単鎖インスリンアナログであって、前記連結ペプチドが
   ［Ａｓｐ／Ｇｌｕ］－Ａｌａ－Ａ_ｎ－Ａｌａ－Ｘａａ
   の配列を有し、
   前記Ａ_ｎは、長さが０～７個のアラニンの選択的なポリ－アラニンサブセグメントであり、Ｘａａはアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチン、リジンおよびセリンからなるアミノ酸の群から選択される、単鎖インスリンアナログ。
2. 請求項１記載の単鎖インスリンアナログにおいて、前記連結ペプチドのＮ末端アミノ酸がＧｌｕである、単鎖インスリンアナログ。
3. 請求項２記載の単鎖インスリンアナログにおいて、ＸａａがＡｌａである、単鎖インスリンアナログ。
4. 請求項３記載の単鎖インスリンアナログにおいて、Ａ_ｎがＡｌａ－Ａｌａを含む、単鎖インスリンアナログ。
5. 請求項４記載の単鎖インスリンアナログにおいて、Ａ_ｎがＡｌａ－Ａｌａからなる、単鎖インスリンアナログ。
6. 請求項１記載の単鎖インスリンアナログにおいて、ＸａａがＡｌａである、単鎖インスリンアナログ。
7. 請求項６記載の単鎖インスリンアナログにおいて、Ａ_ｎがＡｌａ－Ａｌａを含む、単鎖インスリンアナログ。
8. 請求項７記載の単鎖インスリンアナログにおいて、Ａ_ｎがＡｌａ－Ａｌａからなる、単鎖インスリンアナログ。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のインスリンアナログであって、さらに、ヒトインスリンのＡ８位に相当する位置にＨｉｓ置換、ヒトインスリンのＡ１４位に相当する位置にＴｙｒ置換、またはその両方を含む、インスリンアナログ。
10. 請求項９記載のインスリンアナログにおいて、さらに、ヒトインスリンのＢ２８位に相当する位置にＡｓｐ置換、ヒトインスリンのＢ２９位に相当する位置にＰｒｏ置換、またはその両方を含む、インスリンアナログ。
11. 請求項１～８のいずれか１項に記載のインスリンアナログであって、さらに、ヒトインスリンのＢ２８位に相当する位置にＡｓｐ置換、ヒトインスリンのＢ２９位に相当する位置にＰｒｏ置換、またはその両方を含む、インスリンアナログ。
12. それを必要とする患者の血糖値のを低下させる方法であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の単鎖インスリンアナログまたはその生理学的に許容される塩を前記患者に投与する工程を含む、方法。
13. 請求項１２記載の方法において、単鎖インスリンアナログが、インスリンペン、外部インスリンポンプまたは移植可能な腹腔内ポンプを使用して投与される、方法。
14. 疾患の治療のための薬剤の製造のための請求項１～８のいずれか１項に記載の単鎖インスリンアナログの使用。
15. 疾患の治療のための、請求項１～８のいずれか１項に記載の単鎖インスリンアナログ、またはその生理学的に許容される塩。
16. 請求項１～８のいずれか１項に記載の単鎖インスリンアナログをコード化する核酸。

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