MX2011001181A - Insulina estabilizada con halogeno. - Google Patents

Abstract

Un análogo de insulina comprende un polipéptido de cadena B que incorpora una fenilalanina halogenada en la posición B24, B25 o B26. La fenilalanina halogenada puede ser orto-monofluoro-fenilala nina, orto-monobromo-fenilalanina u orto-monocloro-fenilalanina. El análogo puede ser de una insulina de mamífero, tal como insulina humana. Un ácido nucleico codifica tal análogo de insulina. Los análogos de insulina halogenados retienen actividad significante. Un método para tratar un paciente comprende administrar una cantidad fisiológicamente efectiva del análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo a un paciente. La estabilización de la insulina basada en la sustitución con halógeno puede mejorar el tratamiento de la diabetes mellitus en regiones del mundo en desarrollo que carecen de refrigeración.

Description

INSULINA ESTABILIZADA CON HALÓGENO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona a análogos de polipéptido que son resistentes a la degradación térmica. Más particularmente esta invención se relaciona a análogos de insulina térmicamente estabilizados. Aún más particularmente, esta invención se relaciona a análogos de insulina que son químicamente y térmicamente estabilizados mediante la incorporación del elemento flúor, cloro o bromo en un aminoácido del análogo de insulina. Estos elementos se clasifican como halógenos y se distinguen de. los constituyentes ordinarios de las proteínas por su radio atómico, electronegatividad, distribución estereoelectrónica de cargas parciales, y efectos transmitidos sobre las propiedades estereoelectrónicas de átomos vecinos en una molécula.

La ingeniería de proteínas ultra-estables, incluyendo agentes terapéuticos y vacunas, pueden tener amplios beneficios sociales en regiones del mundo en desarrollo donde la electricidad y la refrigeración no están consistentemente disponibles. Un ejemplo de una proteína terapéutica susceptible a la degradación térmica se proporciona por la insulina. El reto presentado por su degradación química y física se profundiza por la epidemia pendiente de diabetes mell'itus en África y Asia. Debido a que las velocidades de degradación química de los análogos de insulina se correlacionan inversamente con sus estabilidades relativas, el diseño de formulaciones ultra-estables puede aumentar la seguridad y eficacia de la terapia de reemplazo de insulina en tales regiones de desafío.

La utilidad de sustituciones fluorosas en moléculas orgánicas pequeñas es conocida en la química medicinal. Los grupos funcionales fluorados son críticos para la eficacia de tales moléculas pequeñas ampliamente prescritas como atorvastatin (Liptor™) , un inhibidor de biosíntesis de colesterol, y clorhidrato de fluoxetina (Prozac™), un inhibidor de recaptación de serotonina selectivo utilizado en el tratamiento de depresión y otros desórdenes afectivos. Aunque el radio atómico de flúor es similar aquel del hidrógeno, sus efectos grandemente inductivos modifican las propiedades estereoelectrónicas de estos fármacos, a su vez aumentando sus actividades biológicas. Consideraciones similares de la química orgánica física pertenecen a la incorporación de átomos de halógeno más grandes, tales como cloro y bromo. La molécula pequeña montelukast sódica (Singulair™) es un inhibidor de leucotrieno cuyas propiedades farmacéuticas son aumentadas por la incorporación; covalente de un átomo de cloro.

La atención se ha enfocado previamente sobre el uso de cadenas laterales alifáticas múltiplemente fluoradas (tal como trifluoro-Y-CF3-Val , trifluoro-5-CF3-Val , trifluoro-d-CF3~Ile, hexafluoro-8i_2-CF3-Val y hexafluoro-5i_2-CF3-Leu) para maximizar la ganancia en la hidrofobicidad asociada con esta modificación. Un ejemplo se proporciona por la estabilización de una porción -helicoidal modelo, la vuelta enrollada homodimérica . Sus cadenas alifáticas interfaciales se sustituyeron simultáneamente por análogos de trifluoro, creando un núcleo fluoroso cuya estabilidad es aumentada por 0.3 - 2.0 kcal/mol. El grado de estabilización por átomo de flúor es < 0.1 kcal/mol. La estabilización más marcada por átomo de flúor se ha logrado en un dominio -helicoidal no relacionado mediante la sustitución de un solo Phe interno mediante pentafluoro-Phe (Fs-Phe)1 (AAGU 0.6 kcal/mol por cinco átomos de flúor) . La estabilización ocurre solamente en una posición especifica en la proteina, sugiriendo que su mecanismo requiere un ambiente espacial particular. La estructura de un dominio modificado con F5-Phe relacionado es idéntica a aquella del dominio no modificado. Sin embargo la estabilización estructural, es solamente una porción de los requerimientos para un polipéptido biológicamente activo. Por lo menos una porción significante de la actividad también debe ser mantenida.

Una literatura extensiva describe el uso de etiquetas de flúor en proteínas como sondas de 19F-NMR. Mientras que tales etiquetas se consideran ampliamente como aplicaciones no perturbantes de aminoácidos fluorados en la ingeniería de proteínas buscan explotar sus propiedades fisicoquímicas alteradas. Los estudios de un pliegue o¡-helicoidal modelo (el subdominio de pieza de . cabeza de villina) que contiene sustituciones de F5-Phe individuales han demostrado que ya sea y a que grado tal modificación puede afectar la estabilidad de la proteína depende del detalle sobre el ambiente estructural. En realidad, la estabilidad aparente de este pliegue modelo se aumentó. por una sustitución de F5-Phe solamente en uno de los siete sitios probados en el núcleo. Sin embargo, se debe observar, que este efecto estabilizante solamente se demostró en un análogo de polipéptido no estándar que contiene un átomo de azufre en la cadena principal cerca del sitio de fluoración; por una parte la sustitución de F5-Phe auto-misma en el subdominio de pieza de cabeza de villina con la cadena principal de polipéptido nativo no tiene efecto sobre su estabilidad. Así, para el conocimiento de los inventores, los datos bona fide que demuestran el aumento de la estabilidad de proteína debido a la halogenación de un residuo aromático en la proteína de otra manera nativa no se reportaron previamente. Estas observaciones sugieren que un ambiente generalmente hidrofóbico no asegura por si mismo que la modificación será estabilizante. Debido a que los interiores de la proteína son frecuentemente estabilizados por interacciones aromáticas- aromáticas con una dependencia de distancia y angular específica, un subconjunto de sustituciones de F5.Phe estabilizantes puede adoptar geometrías de perfluroarilo/arilo particularmente favorables. Tales interacciones surgen de la distribución asimétrica de cargas parciales en estos sistemas aromáticos. La modulación de las propiedades químicas, físicas y biológicas de las" proteínas mediante la incorporación específica del sitio de átomos de cloro o bromo en aminoácidos modificados son menos bien caracterizados en la literatura científica que son los efectos anteriores de incorporación de átomos de flúor.

Las cadenas laterales aromáticas pueden acoplarse en una variedad de interacciones débilmente polares, que involucran no solamente los anillos aromáticos vecinos sino también otras fuentes de potencial electroestático positivo o negativo. Ejemplos incluyen grupos de carbonilo y amida de cadena principal en enlaces de péptido.

La administración de insulina se ha establecido por mucho tiempo como un tratamiento para la diabetes mellitus. La insulina es una proteína globular pequeña que desempeña una función central en el metabolismo en vertebrados. La insulina contiene dos cadenas, una cadena A, que contiene 21 residuos y una cadena B que contiene 30 residuos. :La hormona se almacena en la célula ß pancreática como un hexámero estabilizado con Zn2+, pero funciona como un monómero libre de Zn + en la corriente sanguínea. La insulina es el producto de un precursor de cadena individual, proinsulina, en la cual una región de conexión (35 residuos) enlaza el residuo C-terminal de la cadena B (residuo B30) al residuo N-terminal de la cadena A (Fig. 1A) . Aunque la estructura de la proinsulina no se ha determinado, una variedad de evidencia indica qué esta consiste de un núcleo similar a insulina y el péptido de conexión desordenado (Fig. IB). La formación de tres puentes de disulfuro específicos (A6-A11, A7-B7 y A20-B19; Figs. 1A y IB) se cree que esta acoplado al plegamiento oxidante de la proinsulina en el retículo endoplásmico rugoso (ER) . La proinsulina se ensambla para formar hexámeros coordinados con Zn2+ solubles poco tiempo después de la exportación del ER al aparato de Golgi. La digestión endoproteolítica y la conversión de insulina ocurre en los gránulos secretorios inmaduros seguidos por la condensación morfológica. Los arreglos cristalinos de hexámeros de insulina de zinc dentro de gránulos de almacenamiento maduros se han visualizado mediante la microscopía electrónica (EM) .

Las sustituciones de aminoácido en la insulina se han investigado para efectos sobre la estabilidad termodinámica y la actividad biológica. No se ha observado relación consistente entre la estabilidad y la ; actividad. Mientras que algunas sustituciones que aumentan la estabilidad termodinámica también aumentan el enlace al receptor de insulina, otras sustituciones que aumentan la estabilidad impiden tal enlace. Los efectos de la sustitución de ThrA8 por otros diversos aminoácidos se ha investigado en la insulina humana de tipo silvestre y en el contexto de un monómero de insulina diseñado que contiene tres sustituciones no relacionadas en la cadena B (His —»Asp, Pro —Lys y LysB29?Pro) se ha reportado. También se conocen ejemplos en la ' técnica de sustituciones que aceleran o retardan el curso de tiempo de absorción. Tales sustituciones (tal como Asp en Novalog® y [LysB28, ProB29] en Humalog®) pueden ser y frecuentemente están asociadas con la fibrilación más rápida y la estabilidad física más pobre. En realidad, una serie de diez análogos de insulina humana se han probado para la susceptibilidad a la fibrilación, incluyendo AspB28-insulina y AspB10-insulina . Todos los diez se encontraron que son más susceptibles a la fibrilación en pH 7.4 y 37°C que es la insulina humana. Las diez sustituciones se localizaron en sitios diversos en la molécula de insulina y son probables que están asociados con una amplia variación de cambios en la estabilidad termodinámica clásica. Aunque una gama de efectos se ha observado, no existe correlación entre la actividad y la estabilidad termodinámica.

La insulina -es una proteína globular pequeña que esta altamente disponible a la síntesis y semi-síntesis química, que facilita la incorporación de cadenas laterales no estándares. La insulina contiene tres residuos de fenilalanina (posiciones Bl, B24 y B25) y una tirosina estructuralmente similar en la posición B26. Conservado entre las insulinas de vertebrados y los factores de crecimiento similares a insulina, el anillo aromático de PheB24 se empaca contra (pero no dentro) del núcleo hidrofóbico para estabilizar la estructura súper-secundaria de la cadena B. PheB24 se encuentra en la superficie de enlace de receptor clásico y se ha propuesto para dirigir un cambio en la conformación en el enlace de receptor. PheB25 se proyecta de la superficie del monómero de insulina mientras que TyrB26 se empaca cerca de las cadenas laterales alifáticas (IleA2, ValA3 y Val812) en un borde del núcleo. El cambio conformacional relacionado con B24 se propone para permitir a PheB25 y TyrB25 hacer contacto con los distintos dominios del receptor de insulina .

La presente teoría de fibrilación de proteína asevera que el mecanismo de fibrilación procede por la vía de un estado intermediario parcialmente plegado, que a su vez se agrega para formar un núcleo amiloidogénico . En esta teoría, es posible, que las sustituciones de aminoácidos que estabilizan el estado nativo pueden o no pueden estabilizar el estado intermediario parcialmente plegado y pueden o no pueden incrementar (o disminuir) la barrera de energía libre entre el estado nativo y el estado intermediario. Por lo tanto, la teoría actual indica que la tendencia de una sustitución de aminoácidos dada en la molécula de insulina para incrementar o disminuir el riesgo de fibrilación es altamente impredecible .

La fibrilación, que es un problema serio en la manufactura, almacenamiento y uso de insulina y análogos de insulina para el tratamiento de diabetes, se aumenta con la temperatura más alta, pH menor, agitación o la presencia de urea, guanidina, co-solvente de etanol o superficies hidrofóbicas . Las regulaciones de fármacos de los Estados Unidos actuales demandan que la insulina sea descartada si la fibrilación ocurre a un nivel de un por ciento o más. Debido a que la fibrilación es aumentada en temperaturas más altas, los individuos diabéticos óptimamente deben mantener la insulina refrigerada antes del uso. La fibrilación de la insulina o un análogo de insulina puede ser un problema particular para pacientes diabéticos que utilizan una bomba de insulina externa, en la cual pequeñas cantidades de inulina o análogo de insulina se inyectan en el cuerpo del paciente en intervalos regulares. En tal utilización, la insulina o análogo de insulina no se mantiene refrigerada dentro del aparato de bomba y la fibrilación de la insulina puede dar por resultado el bloqueo del catéter utilizado para inyectar insulina o análogo de insulina en el cuerpo, dando por resultado potencialmente fluctuaciones de nivel de glucosa en al sangre impredecibles o aún hiperglicemia peligrosa. Un reporte por lo menos reciente ha indicado que la insulina lispro (un análogo en el cual los residuos B28 y B29 se intercambian con relación a sus posiciones en la insulina humana de tipo silvestre; nombre comercial Humalog®) puede ' ser particularmente susceptible a fibrilación y la obstrucción resultante de los catéteres de la bomba de insulina. ' La fibrilación de insulina es aún un problema más grande en bombas de insulina implantables , donde la insulina seria contenida dentro del implante de 1-3 meses en alta concentración y a temperaturas fisiológicas (es decir 37°C), antes que a temperatura ambiental como con una bomba externa. Adicionalmente , la agitación causada por el movimiento normal también tendería a acelerar la fibrilación de la insulina. A pesar del potencial incrementado para la fibrilación de insulina, las bombas de insulina implantables son todavía el sujeto de esfuerzos de investigación, debido a las ventajas potenciales de tales sistemas. Estas ventajas incluyen el suministro intraperitoneal de insulina al sistema circulatorio portal, que imita el suministro fisiológico normal de insulina más estrechamente que la inyección subcutánea, que proporciona insulina al paciente por la vía del sistema circulatorio sistémico. El suministro intraperitoneal proporciona absorción más rápida y consistente de la insulina comparada con la inyección subcutánea, que puede proporcionar absorción variable y degradación de un sitio de inyección a otro. La administración de insulina por la vía de una bomba implantable también proporciona potencialmente conveniencia al paciente incrementada. Mientras que los esfuerzos para prevenir la fibrilación, tal como mediante la adición de un surfactante al depós.ito, han proporcionado alguna mejora, estas mejoras hasta ahora sean consideradas insuficientes para permitir la utilización confiable de una bomba de insulina implantada en pacientes diabéticos fuera de experimentos clínicos estrictamente monitoreados .

Como es mencionado en lo anterior, el mundo en desarrollo enfrenta un reto que considera el almacenamiento seguro, suministro y el uso de fármacos y vacunas. Este reto complica el uso de las formulaciones de insulina sensibles a la temperatura en regiones de África y Asia que carecen de acceso consistente a la electricidad y refrigeración, un reto que probablemente es profundizado por la epidemia pendiente de diabetes en el mundo en desarrollo. La insulina exhibe un incremento en la velocidad de degradación de 10 veces o más por cada incremento de 10°C en la temperatura arriba de 25°C y las guías tienen en cuenta el almacenamiento a temperaturas < 30°C y de preferencia con refrigeración. En temperatura más altas la insulina se somete tanto a degradación química (cambios en la estructura covalente tal como la formación de ácido iso-aspártico, rearreglo de fuente de disulfuro y formación de polímeros covalentes) como la degradación física (agregación no nativa y fibrilacion) .

- Se han descrito sustituciones de aminoácidos en la insulina que estabilizan la proteína pero aumentan al receptor de insulina (IR) y su enlace cruzado al receptor homólogo para factores de crecimiento similares a insulina (IGFR) de tal manera para conferir un riesgo de carcinogénesis . Un ejemplo conocido en la técnica se proporciona por la sustitución de HisB1° por ácido aspártico. Aunque AspB10-insulina exhibe propiedades farmacéuticas favorables con respecto a la estabilidad y farmacocinética , sus propiedades de enlace de receptor aumentadas estuvieron asociadas con la tumorigénesis en ratas Sprague-Dawley . Aunque hay muchas sustituciones potenciales en las cadenas A-o B que pueden ser introducidas en AspB10-insulina o análogos relacionados para reducir su enlace a IR y IGFR 1 a niveles similares aquellas de insulina humana, tales sustituciones generalmente deterioran la estabilidad de la insulina (o análogos de insulina) e incrementan sus susceptibilidad a la degradación química y física. Sería deseable descubrir un método de modificación de insulina y de análogos de insulina que permita la "sintonización" de las afinidades de enlace de receptor mientras que al mismo tiempo aumenta la estabilidad y la resistencia a la fibrilación. Tales aplicaciones requerirían un conjunto de modificación estabilizantes que reducen el enlace a IR y IGFR a un grado variante para desviar la carcinogenicidad potencial de los análogos que son súper-activos en sus propiedades de enlace del receptor.

Por lo tanto, hay una necesidad por análogos de insulina que sean estabilizados por la incorporación de un aminoácido no estándar que contiene un átomo de halógeno como un grupo funcional no estándar mientras que mantengan por lo menos una porción de la actividad biológica del análogo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, es un aspecto de la presente invención proporcionar un análogo de insulina que proporcione estabilidad más grande mediante la sustitución de halógeno en un aminoácido, donde el análogo luego mantiene por lo menos una porción de la actividad biológica de la insulina o análogo de insulina no halogenado correspondiente.

En general, la presente invención proporciona un análogo de insulina que comprende un polipéptido de cadena B que incorpora una fenilalanina halogenada en la posición B24, B25, o B26. En una modalidad, la fenilalanina halogenada está localizada en la posición B24. En otra modalidad, la fenilalanina halogenada es ort o-monofluoro-feriilalanina, ort o-monobromo-fenilalanina u ortho-monocloro-feriilalanina . En otra modalidad, el análogo de insulina es un análogo de insulina de mamífero, tal como un análogo de insulina humana. En un conjunto particular de modalidades, el polipéptido de cadena B comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NOS. 4-8 y polipéptidos que tienen tres o menos sustituciones de aminoácido adicionales del mismo.

También se proporciona un ácido nucleico que codifica un análogo de insulina que comprende un polipéptido de cadena B que incorpora una fenilalanina halogenada en la posición B24, B25, o B26. En un ejemplo, la fenilalanina halogenada se codifica por un codón de detención, tal como la secuencia de ácido nucleico TAG. Un vector de expresión puede comprender tal ácido nucleico y una célula hospedera puede contener tal vector de expresión.

La invención también proporciona un método para tratar un paciente. El método comprende administrar una cantidad fisiológicamente efectiva de un análogo de insulina o una sal fisiológicamente . aceptable del mismo al paciente, en donde el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene un polipéptido de cadena B que incorpora una fenilalanina halogenada en la posición B24, B25, o B26. En una modalidad, la fenilalanina halogenada en el análogo de insulina administrado a un paciente está ubicada en la posición B24. En otra modalidad, la fenilalanina halogenada es ortho-monofluoro-fenilalanina , ort o-monobromo-fenilalanina u ortho-monocloro-fenilalanina . En todavía otra modalidad, el análogo de insulina es un análogo de insulina de mamífero, tal como un análogo de insulina humana. En un conjunto particular de modalidades, el polipéptido de cadena B comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NOS. 4-8 y polipéptidos que tienen tres o menos sustituciones de aminoácidos adicionales del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS LA FIG. 1A es una representación esquemática de la secuencia de proinsulina humana que incluye las cadenas A y B y la región de conexión mostrada con sitios de segmentación dibásicos flanqueantes (círculos llenos) y el C-péptido (círculos vacíos) .

La FIG. IB es un modelo estructural de proinsulina, que consiste de una porción similar a insulina y un péptido de conexión desordenado (línea de guiones) .

La FIG. 1C es una representación esquemática de la secuencia de insulina humana que indica la posición del residuo B24 en la cadena B.

La FIG. ID es un modelo de cinta de un monómero de insulina que muestra el residuo aromático de PheB24 en relación a los tres puentes de disulfuro. Las cadenas laterales adjuntas de LeuB15 (flecha) y PheB24 se muestran. Las cadenas de la cadena A .y B de otra manera se muestran en gris claro y oscuro, respectivamente, y los átomos de azufre de cisteína como círculos.

La FIG. 1E es un modelo lleno de espacio de insulina que muestra la cadena lateral de PheB24 dentro de una cavidad en el borde del núcleo hidrofóbico.

La FIG. 2A es una representación de pentafluoro-fenilalanina (F5-Phe) .

La FIG. 2B es una representación de ortho-monofluoro-fenilalanina (2F-Phe) .

La FIG. 2C es una representación de meta-monofluoro-fenilalanina (3F-Phe) .

La FIG. 2D es una representación de para-monofluoro-fenilalanina (4F-Phe).

La FIG. 3 es un conjunto de cuatro espectros de dicroísmo circular (CD) para las longitudes de onda de UV alejadas. Panel A: DKP-insulina (línea negra sólida) y 2F-PheB24-DKP-insulina (?) ; Panel B: DKP-insulina (línea negra sólida) y 3F-PheB24-DKP-insulina ( A ) ; ' Panel C: DKP-insulina (línea negra sólida) y 4 F-PheB24-DKP-insulina {Y ) Panel D: DKP-insulina (línea negra sólida) y F5-PheB 4-DKP-insulina (·)¦ La FIG. 4 es un conjunto de cuatro gráficas para estudios de desnaturalización de guanidina detectada con CD. Panel A: DKP-insulina (línea negra sólida) y 2F-PheB24-DKP-insulina (?) ; Panel B: DKP-insulina (línea negra sólida) y 3F-PheB 4-DKP-insulina (A); Panel C: DKP-insulina (línea negra sólida) y 4 F-PheB24-DKP-insulina (Y); Panel D: DKP-insulina (línea negra sólida) y F5-PheB2 -DKP-insulina (·) .

La FIG. 5 es una gráfica que muestra los resultados de los estudios de enlace de receptor de análogos de insulina. Las actividades relativas se determinan mediante el ensayo de enlace competitivo en el cual la insulina humana marcada con 125I enlazada al receptor se desplaza al incrementar las concentraciones de DKP-insulina (¦) o sus análogos: pentafluoro-PheB24. (? ) , 2F-PheB24 (Y), 3F-PheB24 (?), y 4F-PheB24 (·) .

La FIG. 6 es una gráfica que muestra los resultados de los estudios de enlace de receptor de análogos de insulina. Las actividades relativas se determinan mediante el ensayo de enlace competitivo en el cual la insulina humana marcada con 1 5I enlazada al receptor se desplaza al incrementar las concentraciones de DKP-insulina 1 (¦') o sus análogos: pe2Br-PheB24-KP-insulina ( A ) , 2Cl-PheB24-KP-insulina (Y), 2F-PheB24-KP-insulina (?), y 4 F-PheB24-KP-insulina (·). El ensayo empleó la isoforma B del receptor de insulina y la 125I-TyrA14- insulina humana como un trazador.

La FIG. 7A es una gráfica para los estudios de desnaturalización de guanidina detectada con CD de insulina humana (línea sólida), KP-insulina (línea de: guiones; "origen"), análogos de KP-insulina que contienen sustitución monofluorosa de 2F-PheB2 -KP-insulina (A), 3F-PheB24-KP-insulina (¦) y 4 F-PheB24-KP-insulina (o) .

La FIG. 7B es una gráfica para los estudios de desnaturalización de guanidina detectada con CD de insulina humana (línea sólida), KP-insulina (linea de guiones; "origen"), 2-Cl-PheB24-KP-insulina (T) y 2-Br-PheB2 -KP-insulina (?) .

La FIG. 8A es un espectro de 1H-NMR para análogos de DKP-insulina que compara las sustituciones de fluoro en las posiciones 2, 3 y 4 de PheB24 en relación a DKP-insulina, registrado en 700 MHz a 32°C y pD 7.0. ' La FIG. 8B es un espectro de N R para análogos de KP-insulina que compara las sustituciones de fluoro, bromo y cloro en la posición 2 de PheB24 en relación a KP-insulina, registrado en 700 MHz a 32°C y pD 7.0.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un análogo de insulina que proporciona estabilidad más grande mediante la sustitución de halógeno en un aminoácido, donde .el análogo luego mantiene por lo menos una porción de la actividad biológica en la insulina o análogo de insulina no halogenado correspondiente. Particularmente, la presente invención proporciona análogos de insulina que proporcionan estabilidad más grande mediante la sustitución de un solo halógeno en un aminoácido, donde el análogo luego mantiene por lo menos una porción de la actividad biológica de la insulina o análogo de insulina no halogenado correspondiente. En un ejemplo, la presente invención proporciona un análogo de insulina que proporciona estabilidad más grande mediante la sustitución de flúor, cloro o bromo en un aminoácido, donde el análogo luego mantiene por lo menos una porción de la actividad biológica de la insulina o análogo de insulina no halogenado correspondiente. Una aplicación potencial es aumentar la estabilidad química y física de un análogo de insulina mientras que se retiene una porción de su actividad biológica; otra aplicación es calibrar las propiedades de enlace de receptor de un análogo de insulina para no exceder aquel de la insulina humana. Con estos fines, la presente invención proporciona análogos de insulina que contienen un residuo de fenilalanina (Phej halogenado como una sustitución en la posición B24, B25 o B26. Mientras que las sustituciones de una fenilalanina halogenada en B24 o B25 no cambian la secuencia de aminoácido implícita de la insulina o un análogo de insulina, una fenilalanina halogenada en la posición B26 de la insulina debe sustituir para tirosina (Tyr) Encontrada en la secuencia de tipo silvestre de la insulina.

La presente invención, sin embargo no está limitada a la insulina humana y sus análogos. También se contempla que estas sustituciones también se pueden hacer en insulinas animales tales como insulinas porcinas, bovinas, equinas y caninas, a manera de ejemplos ño limitativos.

Además, en vista de la similitud entre las insulinas humanas y animales, y el uso en el pasado de insulinas animales en pacientes diabéticos humanos, también se contempla que otras modificaciones menores en la secuencia de insulina se pueden introducir, especialmente aquellas sustituciones consideradas "conservativas". Por ejemplo, las sustituciones adicionales de aminoácidos se pueden hacer dentro del grupo de aminoácidos' con cadenas laterales similares, sin apartarse de la presente invención. Estos incluyen los aminoácidos hidrofóbicos neutros: Alanina (Ala o A), Valina (V al o V), Leucina (Leu o L) , Isoleucina (lie o I), Prolina (Pro o P) , Triptofano (Trp o W) , Fenilalanina (Phe o F) y Metionina (Met o M) . Del ¦' mismo modo, los aminoácidos polares neutros pueden ser sustituidos entre si dentro de su grupo de Glicina (GLy o G) , Serina (Ser o S), Treonina (Thr o T) , Tirosina (Tyr o Y) , Cisteina (Cys o C) , Glutamina (Glu o Q) y Asparagina (Asn o N) . Los aminoácidos básicos se consideran que incluyen Lisina (Lys o K) , Arginina (Arg o R) e Histidina (His o H) . Los aminoácidos acidicos son ácido Aspártico (Asp o D) y ácido Glutámico (Glu o E) . A menos que se mencione de otra manera o sea obvio del contexto, los aminoácidos mencionados en la presente deben ser considerados que son L-aminoácidos . En un ejemplo, el análogo de insulina de la presente invención contiene tres o menos sustituciones conservativas diferentes de las sustituciones de Phe halogenadas de la presente invención. En otro ejemplo, el análogo de insulina de la presente invención contiene uno o menos sustituciones conservativas diferentes de las sustituciones Phe halogenadas de la presente invención.

Como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones, varios aminoácidos en la insulina o un análogo de insulina se pueden notar por el residuo de aminoácido en cuestión, seguido por la posición del aminoácido, opcionalmente en superindice. La posición del aminoácido en cuestión incluye la cadena A o B de insulina donde se ubica la sustitución. Asi, PheB24 denota una fenilalanina en el veinticuatroavo aminoácido de la cadena B de insulina, mientras que PheB25 denota una fenilalanina en el veiticincoavo aminoácido de la cadena B de insulina, y PheB26 denota una sustitución de fenilalanina para tirosina en el veintiseisavo aminoácido de la cadena B de insulina. Un aminoácido fluorado puede ser indicado con el prefijo "F-", un aminoácido bromado pueden ser indicado con el prefijo "Br-" y un aminoácido clorado puede ser indicado con el prefijo "C1-". Por lo tanto, la fenilalanina fluorada puede ser abreviada "F-Phe", fenilalanina clorada puede ser abreviada "Cl-Phe" y fenilalanina bromada puede ser abreviada "Br-Phe". En el caso de fenilalanina, la posición de los sustituyentes de halógeno o sustituyentes sobre la cadena lateral de fenilo pueden ser además indicados por el número del carbono al cual se une el halógeno. Por lo tanto, ort o-monofluoro-fenilalanina (mostrado en la Fig. 2B) se abrevia "2F-Phe", meta-monofluoro-fenilalanina (mostrado en la Fig. 2C) se abrevia "3F-Phe" y para-monofluoro-fenilalanina (mostrado en la Fig. 2D) se abrevia 4F-Phe. Pentafluoro-fenilalanina (mostrado en la Fig. 2A) se abrevia como "Fs-Phe". De manera similar, ort o-monobromo-fenilalanina se puede abreviar "2Br-Phe", ort o-monocloro-fenilalanina se puede abreviar "2C1-Phe".

La fenilalanina en B24 es un aminoácido invariante en la insulina funcional y contiene una cadena lateral aromática. La importancia biológica de PheB24 en la insulina es indicada por una mutación clínica (SerB2<!) que causa diabetes mellitus humana. Como se ilustra en las Figs. ID y 1E, y mientras que no se desea que sea limitado por la teoría, PheB24 se cree que se empaca en el borde de un núcleo hidrofóbico en la superficie de enlace de receptor clásico. Estos modelos están basados en un protómero cristalográfico (molécula 1 de 2-Zn; identificador de Banco de datos de Proteína 4INS). Encontrándose dentro de la hebra ß C-terminal de la cadena B (residuos B24-B28), PheB24 se une 'a a-hélice central (residuos B9-B19) . Una cara y borde del anillo aromático se asientan dentro de una cavidad baja definida por LeuB15 y CysB19; la otra cara y borde se exponen al solvente (Fig. 1E) . Esta cavidad es en parte circundada por los grupos carbonilo y amida de cadena principal y asi crea un complejo y ambiente electroestático asimétrico. Los efectos del sustituyente cercano al simétrico tretrafluoro-fenilalanina (F5-Phe ) (con su hidrofobicidad general aumentada e interacciones de fluorarilo-arilo) ; (Fig. 2A) son aquellos de análogos "no balanceados" que contienen sustituciones orto-, meta-, o para-fluorosas individuales (designadas 2F-Phe, 3F-Phe, o 4F-Phe, Figs . 2B-2D, respectivamente) . sobre la estabilidad de la insulina son proporcionadas.

PheB25 se creé que se encuentra en la superficie del monómero de insulina y en solución las estructuras se proyectan en el solvente con una organización menos estructural que aquella de PheB24. Su importancia biológica es del mismo modo indicada por una mutación clínica (LeuB25) que causa diabetes humana. TyrB26, similar a PheB24, se encuentra en el borde del núcleo hidrofóbico donde se empaca cerca de los residuos no polares IleA2, ValA3 y ValB12. Los estudios de foto-reticulación sugieren que las cadenas laterales de los residuos B24, B25 y B26 cada uno hacen contacto con el receptor de insulina en dímeros y hexámeros de residuos de insulina, los residuos B24-B26 y residuos relacionados con simetría B24'-B26' se cree que participan en una ß-lámina anti-paralela intermolecular. Las cadenas laterales aromáticas en estas posiciones se cree que estabilizan el empacamiento entre los monómeros en esta interfase de ß-lámina.

Se contempla que las sustituciones de la presente invención se pueden hacer en cualquiera de un número de análogos de insulina existentes. Por ejemplo, las sustituciones de fenilalanina halogenada (X-Phe) proporcionadas en la presente se pueden hacer en análogos de insulina tales como insulina Lispro, insulina Aspart, otras insulinas modificadas o análogos de insulina, o dentro de varias formulaciones farmacéuticas, tal como insulina regular, NPH insulina, lente insulina o ultralente insulina, además de la insulina humana. La insulina Aspart contiene una sustitución AspB28 y es vendida como Novalog® mientras que la insulina Lispro contiene sustituciones Lys B28 y ProB29 y es conocida como y vendida bajo el nombre Humalog®. Esto análogos son descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,149,777 y 5,474,978, la descripción de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Ambos de estos análogos son conocidos como insulinas de acción rápida.

Una sustitución Phe halogenada en B24, B25 y/o B26 también se puede introducir en análogos de insulina humana que, mientras que no son utilizados previamente de manera clínica, todavía son útiles experimentalmente , tal como' DKP insulina descrita más completamente enseguida, o mini proinsulina, un análogo de proinsulina que contiene un enlazador de dipéptido (Ala-Lys) entre las porciones de cadena A y cadena B de insulina en lugar de la región de conexión de 35 aminoácidos normal entre residuos C-terminal de la cadena B y el residuo. N-terminal de la cadena A. la incorporación de residuos aromáticos halogenados en las posiciones B24, B25, o B26 en DKP-insulina (u otros análogos de insulina que contienen AspB1° o que exhiben afinidades de enlace de receptor más altas que aquellas de insulina humana) pueden reducir sus afinidades de enlace del receptor para ser similares o abajo de aquella de insulina humana y asi potencialmente permitir el uso clínico. De esta' manera la reticulación de los análogos de insulina a IGFR . mitogénico también se puede reducir.

La secuencia de aminoácidos de proinsulina humana es proporcionada, para propósitos comparativos, como SEQ. ID. NO. 1.

SEQ . ID. NO. 1 (proinsulina) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn La secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana es proporcionada como SEQ. ID. NO. 2.

SEQ. ID. NO. 2 (cadena A) Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn La secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana es proporcionada como SEQ. ID. NO. 3.

SEQ. ID. NO. 3 (cadena B) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr La secuencia de aminoácidos de una cadena B de insulina humana se puede modificar con una sustitución de un Phe halogenado en la posición B24, B25, o B26. Un ejemplo de tal secuencia se proporciona como SEQ. ID. NO 4, donde Xaa pueden ser Tyr o Phe. El halógeno utilizado en cualquiera de estas sustituciones puede ser flúor, cloro o bromo, por e emplo .

SEQ. ID. NO. 4 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Pro-Lys-Thr [Xaa es Tyr o Phe] Combinaciones adicionales de otras sustituciones también están dentro del alcance de la presente invención. También se contempla que las sustituciones de la presente invención también se pueden combinar con sustituciones de análogos de insulina conocidos previos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un análogo de la cadena B de insulina humana que contiene las sustituciones Lys Pro de insulina lispro (Humalog®) , en la cual una de la sustitución Phe halogenada también se puede ser introducida, se proporciona como SEQ. ID. NO. 5. Del mismo modo, la secuencia de aminoácidos de un análogo de la cadena B de insulina humana que contiene la sustitución AspB28 de la insulina aspart, en la cual la sustitución F-PheB24 también puede ser introducida, se proporciona como SEQ. ID. NO. 6.

SEQ . ID. NO. 5 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Lys-Pro-Thr [Xaa es Tyr o Phe] SEQ. ID. NO. 6 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Asp-Lys-Thr [Xaa es Tyr o Phe] La sustitución F-PhéB24 también se puede introducir en combinación con otras sustituciones de análogo de insulina tales como análogos de insulina humana que contiene sustituciones His en los residuos A4 , A8 y/o Bl como es descrito más completamente en la Solicitud Internacional copendiente No. PCT/US07/00320 y la Solicitud Norteamericana No.12/160, 187, la descripción de las cuales son incorporadas por referencia en la presente. Por ejemplo, la sustitución F- PheB24 puede estar presente con [HisA4, HisA8] , y/o sustituciones HisBi en un análogo de insulina o análogo de insulina que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ. ID. NO. 7, SEQ. ID. NO. 7 Rl-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu- Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-R2- Thr-R3-R4-Thr-Xaa0-35-Gly-Ile-Val-R5-Gln-Cys-Cys-R6- Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys- Asn; en donde Rl es His o Phe; en donde R2 es Tyr o Phe, R3 es Pro, Lys, o Asp; en donde R4 es Lys o Pro; en donde R5 es His o Glu; en donde R6 es His o Thr; y en donde Xaao-35 es 0-35 de cualquier aminoácido o una ruptura en la cadena de aminoácidos; y además en donde por lo menos una sustitución seleccionada del grupo de las siguientes sustituciones de aminoácido esta presente: Rl es His; y R6 es His; y R5 y R6 conjuntamente son His.

Una sustitución Phe-halogenada en B24, B25, o B26 también se puede introducir en un análogo de insulina de cadena individual como es divulgado en la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana copendiente No. 60/828,153, la descripción de la cual es incorporada por referencia en la presente.

Las sustituciones de flúor se introdujeron dentro de un monómero de insulina diseñado de alta actividad, DKP-insulina, designada DKP insulina, que contiene sustituciones AspB1° (D), LysB28 (K) y ProB29 (P). Estas tres sustituciones sobre la superficie de la cadena B se creé que impide la formación de dimeros y hexámeros. El uso del monómero diseñado evita confundir los efectos de autoensamble en ensayo de estabilidad. La estructura de DKP-insulina estrechamente se asemeja a un protómero cristalográfico. La secuencia del polipéptido de cadena B para DKP insulina se proporciona como la SEQ. ID. NO. 8, donde Xaa es Tyr o Phe. SEQ. ID. NO. 8 (Secuencia de cadena B de DKP) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Lys-Pro-Thr Análogos de DKP-insulina se prepararon mediante la semi-sintesis catalizada con tripsina y se purificaron mediante la cromatografía líquida de alto desempeño (Mirmira, R.G, and Tager, H. S, 1989. J. Biol. Chem. 264: 6349-6354). Este protocolo emplea (i) un octapéptido sintético que representa residuos (N) -GF* FYTKPT (incluyendo el residuo modificado (F*) y sustituciones "KP" (subrayadas); SEQ. ID. NO. 9) y (ii) el análogo truncado es des-octapéptido [B23-B30]-AspB10- insulina (SEQ. ID. NO. 16). Debido a que el octapéptido difiere de la secuencia B23-B30 de tipo silvestre (GFFYTP T; SEQ. ID. NO. 10) por el intercambio de ProB28 y LysB29 (cursivas), la protección del grupo e-amino de lisina no es requerido durante el tratamiento de tripsina. En breve, el des-octapépt ido (15 mg) y octapéptido (15 mg) se disolvieron en una mezcla de dimetilacetamida/l , 4-butandiol/Tris acetato 0.2 M (pH 8) que contiene : acetato de calcio 10 mM y ácido etilen diamina tetraacético 1 mM (EDTA) (35:35:30, v/v, 0.4 mL) . El pH final se ajustó a 7.0 con 10 µ]^ de N-metilmorfolina . La solución se enfrió a 12°C, y 1.5 mg de TPCK-tripsina se adicionó y se incubó durante 2 días a 12°C. 1.-5 mg adicional de tripsina se adicionó después de 24 hr. La reacción se acidificó con ácido trifluoroacético al 0.1% y se purificó mediante la HPLC de fase inversa preparativa (C4) . La espectrometría de masas utilizando el tiempo de vuelo de desorción/ionización de láser asistido con matriz ( ALDI-TOF; Applied Biosystems, Foster City, CA) en cada caso dio los valores esperados (no mostrados) . El protocolo general para la síntesis en fase sólida es como es descrito (Merrifield y colaboradores, 1982. Biochemistry 21: 5020-5031) . Los análogos de fenilalanina protegidos con 9-fluoren-9-il-metoxi-carbonilo (F-moc) se adquirieron de Chem-Impex International (Wood Dale, IL) .

Los espectros de dicroísmo circular (CD) se obtuvieron a 4°C y 25°C utilizando un espectropolarímetro Aviv (Weiss y colaboradores, Biochemistry 39: 15429-15440) . Las muestras contuvieron DKP-insulina de aproximadamente 25 µ? o análogos en fosfato de potasio 50 mM (pH 7.4); las muestras se diluyeron a 5 µ para los estudios de desnaturalización . inducida por guanidina a 25°C. Para extraer las energías libres del desplegamiento, las transiciones de desnaturalización se ajustaron mediante mínimos cuadrados no lineales a un modelo de dos estados como es descrito por Sosnick y colaboradores, Methods Enzymol. 317: 393-409. En breve, los datos de CD ?(?) , donde x indica la concentración del desnaturalizante, se ajustaron mediante un programa de mínimos cuadrados no lineal de acuerdo con donde x es la concentración de guanidina y donde T? y T? son valores de línea de base en los estados nativo y desplegado. Las líneas de base se aproximaron mediante las líneas de pre- y post-transición T? (x) = T??2° + mAx y T? (x) = T??2° + mBx. Los valores m obtenidos en el ajuste de las transiciones de desplegamiento variantes son menores que el valor m obtenido en el ajuste de la curva de desplegamiento de tipo silvestre. Para probar si esta diferencia y cambio aparente en &GU resulta de una incapacidad para medir la señal CD del estado completamente desplegado, se realizaron simulaciones en las cuales los datos se extrapolaron a los valores CD de meseta en concentraciones más altas de guanidina; estimados esencialmente idénticos de AGu y m se obtuvieron .

La actividad relativa se define como la relación del análogo a la insulina humana de tipo silvestre requerida para desplazar 50 por ciento de 125I-insulina humana específicamente enlazada. Una preparación de membrana de placenta humana que contiene el receptor de insulina (IR) se empleó como es conocido en la técnica. Los fragmentos de membrana (0.025 mg de proteína/tubo) se incubaron con insulina marcada con 125I (aproximadamente 30,000 cpm) en la presencia de concentraciones seleccionadas de análogo no marcado por 18 horas a 4°C en un volumen final de 0.25 mi de Tris-HCl 0.05 M y 0.25 por ciento (p/v) de albúmina de suero bovino a pH 8. Subsecuente a la incubación, las mezclas se diluyeron con 1 mi de solución reguladora enfriada en hielo y se centrifugaron (10, 000g) durante 5 min a 4°C. El sobrenadante luego se remueve por aspiración, y la pelotilla de membrana se contó para la radioactividad. El dato se corrige para el enlace no específico (cantidad de membrana que permanece de radioactividad asociada en la presencia de 1 µ? de insulina humana. En todos los ensayos el porcentaje de trazador enlazado en la ausencia de ligando de competición fue menor que 15% para evitar los artefactos de ligando- agotamiento. El ensayo de enlace de receptor de insulina adicional para inspeccionar los cambios en la actividad durante el curso de incubación del análogo de insulina a 37°C se realizó utilizando una captura de anticuerpo de placa de microtitulo como es conocida en la técnica. Las placas de tira de microtitulo (Nunc Maxisorb) se incubaron durante la noche a 4°C con AU5 IgG (100 µ?/cavidad de 40 mg/ml en solución salina regulada con fosfato) . Los datos de enlace se analizaron mediante un modelo secuencial de dos sitios. Un ensayo de anticuerpo de placa de microtitulo correspondiente utilizando el receptor IGF Tipo I se empleó para ^estimar el enlace cruzado a este receptor homólogo.

Los espectros de dicroísmo circular ' de ultravioleta profundo (CD) de los análogos individualmente fluorados son esencialmente idénticos a aquellos del análogo de origen (Fig. 3); una distorsión ligera se observa en el espectro del análogo F5-PheB24 (Fig. 3, Panel D) . Las estabilidades y actividades de enlace de receptor de los análogos se proporcionan -en la Tabla 1. Los residuos B24 modificados se introdujeron dentro del contexto de DKP-insulina . Los valores de actividad mostrados están basados en la relación de las constantes de disociación de receptor de hormona con relación a la insulina humana; la actividad de la insulina humana es asi 1.0 por definición. Los errores estándares en los valores de actividad fueron en general menores que 25%. Las energías libres de desplegamiento (AG0) a 25°C se estimaron basando en un modelo de dos estados como es extrapolado a la concentración de desnaturalizante de cero. El tiempo de retardo indica el tiempo (en días) requerido para la iniciación de la fibrilacion de proteína sobre agitación leve a 37°C en solución regulada con fosfato libre de zinc (pH 7.4) .

Tabla 1 Actividades y Estabilidades de Análogos de Insulina análogo actividad AGU ¦ Cmic¡ (M) m (kcal Tiempo ( kca/mol ) mol"1 M"1) de retardo DKP insulina 2 .42 4. .0±0. .1 5. .6±0. .1 0 .7010 .0 12 , .4±2. .5 F5.PheB2-DKP 0. 013 4. .8+0. .1 5. , 8±0. .1 0. 84±0. 02 17. .7±2. .1 2F-PheB2-DKP 0 .37 4. ,9±0. .1 5. ,8±0. .1 0. 85±0. 02 16. ,0±0. .1 3F-PheB2-DKP 1 .02 3. .8+0. .1 5. .5+0. .2 0. 70+0. 02 17. .713. .7 4F-PheB2-DKP 0 .43 3. .9±0. .1 5. .6±0. .2 0. 70±0. 02 11 , .0+1. .6 La sustitución de Phe por F5-Phe aumenta la estabilidad de la DKP-insulina por 0.8 + 0.1 kcal/mol a 25°C (Fig. 4, Panel D) . A pesar de tal efecto favorable sobre la estabilidad, la actividad del análogo es insignificante (< 1% de afinidad de enlace de receptor con relación al análogo de origen; Tabla 1 y Fig. 5) . Este deterioro es más marcado que aquel ordinariamente observado en la sustitución de aminoácido individual estándar. En contraste, los análogos individualmente sustituidos cada uno retiene actividad significante: orto (37% con relación a la insulina humana), meta (100%), y para (43%). Tales actividades están cada una arriba del umbral de 10% (correspondiente a una constante de disociación de receptor de hormona de < 1 nM) generalmente predictivo de la eficacia terapéutica. Además, mientras que los análogos de insulina 3F-PheB24 y 4F-PheB24 no son más estables (y posiblemente ligeramente menos estables) que el análogo de origen (Fig. 4 y Tabla 1), la 2 F-PheB24-DKP-insulina es por lo menos tan estable como el análogo F5"Phe (AAGu 0.9 ± 0.1 kcal/mol) . La estabilidad física de los análogos se evaluaron por triplicado durante la incubación en solución salina regulada con fosfato 60 µ? (PBS) a pH 7.4 a 37°C bajo agitación leve. Las muestras se observaron durante 20 días o hasta que los signos de precipitación o congelación del frasquito de vidrio se observaron. Los análogos F5-, 2F-y 3F-PheB24-DKP-insulina (pero no 4F-PheB24-DKP-insulina) cada uno exhibe un incremento en el tiempo de retardo (con relación al análogo de origen) antes del inicio de la fibrilación de proteína (Tabla 1). La sustitución de un solo átomo de flúor así es capaz de aumentar la estabilidad de un análogo de insulina monomérico con la retención de la actividad reducida. pero clínicamente significante; La modificación también puede prolongar el tiempo de retardo antes de la fibrilación de proteína en la agitación leve a pH 7.4 y 37°C.

Mientras que la sustitución F5-PheB24 es altamente estabilizante, este análogo de insulina está esencialmente sin actividad biológica. Notablemente, la modificación regioespecifica 2F-PheB24 es igualmente estabilizante mientras que retiene afinidad sustancial (aunque reducida) para el receptor de insulina.

También se introdujeron sustituciones : de flúor, esencialmente como es descrito en lo anterior, con la excepción de orto-, meta-, para-, y penta-fenilalanina fluorada que es introducida en las posiciones B24, B25 y B26 en la insulina lispro (esto es, un análogo de insulina que también contiene las sustituciones LysB28, ProB29 (vendida bajo el nombre Humalog®) ) . Los análogos que contienen sustituciones de fenilalanina orto-, meta-, para-, y penta-fluorada en la posición B24 se designan 2F-PheB24-KP-insulina, 3F-PheB 4-KP-insulina, 4F-PheB24-KP-insulina, F5-PheB24-KP-insulina, respectivamente. .Los análogos que contienen sustituciones de fenilalanina orto-, meta-, para-, y penta-fluorada en la posición B25 se designan 2F-PheB25-KP-insulina, 3F-PheB25-KP-insulina, 4F-Phe-KP-insulina , Fs-Phe-KP-insulina , respectivamente. Los análogos que contienen sustituciones de fenilalanina orto-, meta-, para-, y penta-fluorada en la posición B26 (sustitución para tirosina) se designan 2F-PheB 6-KP-insulina, 3F-PheB26-KP-insulina , 4 F-PheB26-KP- insulina, F5-PheB26-KP-insulina, respectivamente.

Adicionalmente, la orto-bromo y orto-cloro fenilalanina se sustituyó en la insulina lispro en la posición B24. Estos análogos se designan 2Br-PheB2 -KP-insulina y 2Cl-PheB2 -KP-insulina, respectivamente. Las designaciones de los análogos respectivos de KP-insulina y DKP-insulina se abrevian en las tablas y las figura como KP y DKP con "insulina" omitida por brevedad.

Más específicamente, para las sustituciones de fenilalanina halogenada en B24, un octapéptido sintético que representa residuos (N) -GF*FYTKPT (residuo de fenilalanina halogenada indicada como sustituciones "F*" y "KP" (subrayada) ; SEQ ID NO. 9) y el análogo truncado des-octapéptido [B23-B30 ] -insulina (de tipo silvestre en la posición B10, SEQ ID NO. 17) se utilizaron. Para sustituciones de fenilalanina fluorada en B25, un octapéptido sintético que representa los residuos (N) -GFF*YTKPT (fenilalanina fluorada indicada nuevamente como sustituciones "F*" y "KP" (subrayado); SEQ ID NO. 9) y el análogo truncado des-octapéptido [B23-B30] -insulina (tipo silvestre en la posición B10; SEQ. ID. NO 17) se utilizaron. Para la sustitución de fenilalanina fluorada en B26, un octapéptido sintético que representa residuos (N) -GFFF*T PT (fenilalanina fluorada indicada nuevamente como sustituciones "F*" y "KP" (subrayadas) ; SEQ ID NO. 18) y el análogo truncado de des- octapéptido [B23-B30 ] -insulina (tipo silvestre en la posición B10; SEQ. ID. NO 17) se utilizaron. De manera similar, para la sustituciones de cloro-y bromo-fenilalanina en B24 (2C1 y 2Br) , un octapéptido sintético que representa los residuos (N) -GF*FYTKPT (residuo de fenilalanina halogenada indicado como sustituciones "F*" y "KP" (subrayado); SEQ ID NO. 9) y análogo truncado des-octapéptido [B23-B30 ] -insulina (tipo silvestre en la posición B10, SEQ ID NO. 17) se utilizaron. Típicamente, el des-octapéptido (15 mg) y octapéptido (15 mg) se disolvieron en una mezcla de dimetilacetamida/1, 4-butandiol/Tris acetato 0.2 M (pH 8) que contiene acetato de calcio 10 mM y ácido etilen diamina tetracético (EDTA) 1 mM (35:35:30, v/v, 0.4 mL) . El pH final se ajustó a 7.0 con 10 L de N-metilmorfolina . La solución se enfrió a 12°C, y 1.5 mg de TPCK-tripsina se adicionó y se incubó durante 2 días a 12°C. 1.5 mg' adicional de tripsina se adicionaron después de 24 hr. La reacción se acidificó con. ácido trifluoroacético al 0.1% y se purificó mediante la HPLC de fase inversa preparativa (C4). La espectrometría de masas utilizando el tiempo de vuelo de desorción/ionización de enlace asistido con matriz (MALDI-TOF; Applied Biosystems, Foster City, CA) en cada caso dio los valores esperados. La actividad relativa y las constantes de disociación se determinaron como es descrito en lo anterior.

Los datos resultantes se presentan en la Tabla 2 para la sustitución de una fenilalanina fluorada en la posición B24 de insulina. Para propósitos de comparación, la insulina de tipo silvestre y 2F-PheB24-DKP-insulina se probaron bajo las mismas condiciones a 37°C. Los. datos para la prueba a 37°C se presentan enseguida en la Tabla 3. Los datos para las sustituciones de fenilalanina fluorada en las posiciones B24, B25 y B26 y la fenilalanina sustituida con bromo- y cloro- en un análogo de insulina lispro antecedente se presenta enseguida en la Tabla 4.

Tabla 2 Estabilidad y Actividad de PheB24-DKP Muestra AGU AAGU Cmid (M m (kcal/ Enlace (kcal/mol) (kcal/mol) Gu-HCI) mol/M) de receptor DKP insulina 4. 3±0. 06 / 5. .4±0, .1 0. ,80±0. .01 161 F5-PheB2 -DKP 4 .9±0. .1 -0.6 ¦ 5. .8+0. .1 0, .85+0. .02 37 2F-PheB24-DKP 3 .8 +0. .1 "-0.5 5. ,5±0. .2 0. ,70±0. .02 102 3F-PheB2 -DKP 3 .9+0. .1 -0.4 5. .6+0. .2 0. ,70±0. .02 43 4F-PheB24-DKP 4. 84 +0 .1 0.54 5. .8±0. .1 0. .8510. ,02 1 Tabla 3 Estabilidad y Actividad de la Insulina y PheB24-DKP Insulina [37°C] ; Muestra AGU AAGU Cmid (M m (kcal/ Enlace (kcal/mol) (kcal/mol) Gu-HCI)' mol/M) de receptor Wt-insulina 8.4±0.10 - 4.110.17 0.57±0.06 100 2F-PheB24-DKP 3.110.1 0.7 4.9+0.1 0.6410.03 Tabla 4 Estabilidad y Actividad del Análogo Halogenado-Phe de Insulina Lispro Muestra de AGU AAGU Cmid ( m (kcal/ enlace receptor (kcal/mol) (kcal/mol) Gu-HCI) mol/M) KP-insulina 3. 0+0. 06 / 4 .510, .1 0, .61+0, .01 92 2F-PheB24-KP 3 .8+0. .1 1. .0+0. 16 4 .9+0, .1 0, .7610. .02 17 3F-PheB2 -KP 3 .0+0. .1 0. .2+0. 16 4. 5+0. 15 0, .67+0 , .02 12 4F-PheB2 -KP 2. 75+0 .1 0. 05+0 .16 4 .4+0 , .1 0. .62+0. .02 32 5F-PheB2 -KP 3 .8 +0. .1 1. .0+0. 16 5 .0+0 .1 0 , .7610 , .01 0.04 2F-PheB25-KP 3 .310. .1 0. .510. 16 4 .3+0 , .2 0. .76+0. .03 15 3F-PheB25-KP 2 .9+0. .1 0. .1+0. 16 4 .5+0, .2 0 , .65+0. .02 41 4F-PheB25-KP 2 .910. .1 0. .110. 16 4 .5+0, .1 0. .65+0. .01 78 F5-PheB25-KP 2 .9+0. .1 0. .1+0. 16 4 .5+0 , .2 0 , .65+0. .03 0.4 2F-PheB25-KP 1 .7+0. .1 -1 .1+0 .16 4 .0+0 .2 0. .4310, .03 0.1 3F-PheB25-KP 3 .3+0. .1 0. .510. 16 4. 86+0 .2 0. .69+0. .03 17 4F-PheB25-KP 3 .7+0. .1 0. .9+0. 16 4 .9+0, .2 0, .75+0. .02 13 F5-PheB 6-KP 3 .6+0. .2 0. .810. 26 4. 7+0. 26 0. .76+0. .04 3 2Br-PheBZ4-KP 3. 6+00 .5 0. .8+0. 11 4 .8+0, .1 0, .75+0. .01 31 2Cl-PheB24-KP 3. 8+0. 06 1. .010. 12 4 .9+0, .1 0. .77+0. .01 36 Los datos de enlace de receptor para análogos de insulina lispro mediante desplazamiento competitivo también se presenta en la Fig. 6. El ensayo empleó la isoforma B de receptor de insulina y 125I-TyrA1 -insulina humana como trazador .

Los análogos de insulina lispro que contienen ya sea fenilalanina sustituida con cloro o bromo en B24 (2C1-PheB24-KP-insulina y 2Br-PheB24-KP-insulina, respectivamente) se probaron para la habilidad para disminuir el azúcar en la sangre en ratas diabéticas en comparación a la insulina lispro no halogenada (KP) . Ratas Lewis machos (-250 g de peso corporal) se volvieron diabéticas con estreptozotocina . El análogo de insulina lispro 2Cl-PheB2 -KP-insulina y .2Br-PheB24-KP-insulina se purificaron mediante HPLC, se secaron a un polvo y se diluyeron en diluyente de insulina (Eli Lilly Corp) . Las ratas se inyectaron subcutáneamente en el tiempo = 0 con 20 µg o 6.7 µg de análogo de insulina en 100 µ? de diluyente. La sangre se obtuvo de la punta sujetada de la cola en el tiempo 0 y cada diez 10 minutos hasta 90 min. La glucosa sanguínea se midió utilizando un medidor Hypoguard Advance Micro-Draw. Los cambios de concentración de la glucosa sanguínea (en miligramos (mg) por decalitro (dL) por hora (h) ) se listan en las Tablas 5 y 6 (estos estudios se realizaron con diferentes conjuntos de ratas y así exhiben diferencias en la respuesta farmacodinámica de línea de base a las inyecciones de control de KP-insulina; líneas superiores en cada tabla) Tabla 5 Niveles de Glucosa Sanguínea en Respuesta a los Análogos Halogenados de Insulina Lispro Muestra Análogo de Insulina ? Glucosa, Sanguínea (Ug) (mg/dL/h) KP-insulina 20 191+/-20 KP-insulina 6.7 114+/-15 2Cl-PheB -KP 20 194+/-26 2Cl-PheB24-KP 6.7 179+/-30 2Brl-PheB^-KP 20 224+/-39 2Br-Phe -KP 6.7 189+/-13 Tabla 6 Niveles de Glucosa Sanguínea en Respuesta a los Análogos Insulina Halogenados Muestra. Análogo de Insulina ? Glucosa Sanguínea (µ ) (mg/dL/h) KP-insulina 6.7 164+/-20 2F-PheB24-DKP 6.7 180+/-8 2F-PheB24-DKP 6.7 131+/-16 4F-PheB24-DKP 6.7 164 +/-17 Como se observa en las Tablas 5 y 6, los análogos de insulina que contienen fenilalanina halogenada fueron . iguales o más grandes en potencia que la insulina lispro (Humalog®) con la excepción de 2F-PheB2 -KP-insulina . La potencia de un análogo de 2F-PheB24 insulina se puede restaurar aquella de la KP-insulina mediante la inclusión de la sustitución AspB1° en el análogo de 2F-PheB24-DKP-insulina (linea de la 2 de la Tabla 6) . Adicionalmente, la presencia de una fenilalanina halogenada en la posición B24 incrementa el tiempo de retardo de fibrilación entre tres veces y cuatro veces; asi, mientras que la- KP-insulina bajo las condiciones experimentales anteriores exhibe un tiempo de retardo de aproximadamente 3 días, la sustitución de PheB24 por ya sea 2Cl-PheB24, o 2Br-PheB24 extiende el tiempo de retardo a entre 10-12 días. Estas modificaciones también incrementan la estabilidad termodinámica (como es sondeado por la desnaturalización de guanidina) por entre 0.5 y 1 kcal/mol (Tabla 4) .

Las constantes de disociación (Kd) se determinaron como es descrito por hittaker y hittaker. (2005. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936), mediante un ensayo de desplazamiento competitivo utilizando 125I-TyrA14-insulina ( cordialmente proporcionada por Novo-Nordisk) y el receptor de insulina purificado y solubilizado (isoforma B) en un ensayo de captura de anticuerpo de placa de microtitulo con modificación menor; los receptores transíectados se etiquetaron en su C-terminal por una repetición triple del epitope FLAG (DYKDDDDK; SEQ. ID. NO 11) y las placas de microtitulo se recubrieron mediante el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma) . El porcentaje de trazador enlazado en la ausencia de ligando de competición fue menor que 15% para evitar los artefactos de ligando-agotamiento. Los datos de enlace se analizaron mediante la regresión no lineal utilizando un modelo de competición heterólogo (Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111-114) para obtener las constantes disociación.

Tabla 7 Enlace Cruzado de Análogos de Insulina al Receptor IGF Proteina Kd(nM) Con relación a insulina IGF-I 0.03710.003 260 Insulina humana 9.6±0.3 1 KP-insulina 10.6±1 1 Aspeio-insulina 4.2 2 ArgB3i, ArgBi2, GlyA2i- 3.1 3 insulina DKP-insulina 1.6+0.1 6 2F-PheB24-KP 34 <0.3 2Br-PheB24-KP 10.1 1 2Cl-PheB24-KP 9.6 1 2F-PheB24-DKP 9.2 1 Las mediciones del enlace cruzado de análogos de insulina seleccionados al receptor IGF se resume en la Tabla 7. La insulina humana bajo estas condiciones enlaza a IGFR 260-veces menos estrechamente que lo hace IGF-I. En enlace cruzado de AspB10-insulina se incrementa por dos veces mientras que el enlace cruzado por un análogo en uso clínico amplio, ArgB31, ArgB32, GlyA21insulina (insulina 'glargine™; Lantus™) , se incrementa por tres veces. Tal aumento del enlace cruzado de IGFR es indeseable ya que el tratamiento de las ratas Sprague-Dawley con AspB10-insulina está asociado con una incidencia incrementada de tumores mamarios mientras que estudios clínicos recientes sugieren la posibilidad de que el uso humano de Lantus confiere un incremento dependiente de la dosis en el riesgo de diversos cánceres. (La secuencia de IGF-I contiene Glu en la posición 10, similar en la carga negati •va AspB10. Mi·entras que no se desea que sea limitada por la teoría, se creé que el enlace cruzado por Lantus se aumenta por dos residuos básicos, en el C-terminal de la cadena B. Debido a que IGF-I también contiene Lys en la posición B28 y Pro en la posición B29, es posible que KP-insulina puede exhibir un incremento pequeño en 1 el enlace cruzado para los datos anteriores no son suficientemente precisos para establecer estos) . La DKP-insulina exhibe un incremento de seis veces en el enlace cruzado de IGFR. Significantemente, este incremento es contra balanceado por una sustitución de orto-monofluoro en B24: 2F-PheB2 -DKP-insulina exhibe el mismo nivel bajo de enlace cruzado como la insulina humano de tipo silvestre. Su potencia hipoglucémica en ratas diabéticas también es la misma como aquella de la insulina humana (Tabla 6) . Debido a que 2F-PheB24-DKP-insulina es monomérica aún en concentraciones de proteina > 0.5 mM, este análogo por lo tanto es de utilidad potencial como una formulación de insulina de ultra acción rápida y ultra-estable para el uso clínico. Las afinidades de enlace cruzado de 2Cl-PheB2 -KP-insulina y 2Br-PheB 4-KP-insulina también esta en un nivel bajo similar a aquel de la insulina humana. Estos análogos también son completamente activos en ratas diabéticas (Tabla 5) .

Los espectros de CD se determinaron para la insulina humana, KP-insulina (lispro) y análogos de PheB24 insulina halogenados como es descrito en lo anterior. La desnaturalización de la proteína detectada con CD se proporciona como una función de la concentración de clorhidrato de guanidina en las Figs. 7A y 7B. La Fig. 7A proporciona una comparación de la insulina humana (línea sólida) y KP-insulina (líneas de guiones; "origen") con análogos de KP-insulina que contiene sustitución inonofluorosa de PheB24 en la posición. 2, 3, o 4 (triángulos llenos, cuadro llenos y círculos vacíos, respectivamente). La Fig. 7B proporciona una comparación de la insulina humana (línea sólida) y KP-insulina (línea de guiones; "origen") con análogos que contienen modificación 2-C1 o 2-Br de PheB24 (triángulos invertidos llenos y triángulos vacíos, respectivamente). Los parámetros termodinámicos inferidos se proporcionan en los anteriores en la Tabla . El desplegamiento fraccional se monitoreó por medio de la elipticidad de residuo en 222 nm a 25°C.

La estructura de NMR de análogos de insulina seleccionados se ha obtenido para demostrar que las sustituciones de halógeno están bien adaptadas en la insulina y no causan perturbaciones conformacionales transmitidas. Los espectros de 1H-NMR se proporcionan en las Figs . 8 A y 8B. La estructura de NMR de 2Cl-PheB24-KP-insulina como un monómero en solución asi es similar aquella de la KP-insulina; de manera similar, la estructura de NMR de 2F-PheB24-DKP-insulina' (también como un monómero en solución) es similar aquella de la DKP-insulina . El análisis cualitativo de los efectos de NMR de 2F-PheB24-KP-insulina y 2Br-PheB24-KP-insulina del mismo modo indica estructuras similares a las nativas.

Las estructuras de cristal se han determinado de 2F-PheB24-KP-insulina y 4F-PheB24-KP-insulina como hexámeros estabilizados con zinc en la presencia del fenol conservador (datos no mostrados). Las estructuras son similares a aquellas previamente reportadas para KP-insulina como un hexámero estabilizado con zinc en la presencia de fenol. En cada caso la conformación del hexámero es T3Rf3 que contiene dos iones de zinc axiales y tres moléculas de fenol enlazadas. La densidad electrónica para los átomos de halógeno se observa fácilmente. La estructura de las superficies que forman dimero y trímero se preservan en los análogos halogenados, sugiriendo que las formulaciones farmacéuticas se pueden obtener similares a aquellas empleadas para KP-insulina y otros análogos de insulina de acción rápida.

Un método para tratar a 'un paciente comprende administrar un análogo de insulina sustituido con halógeno al. paciente. En un ejemplo, el análogo de insulina sustituido con halógeno es un análogo de insulina que contiene fenilalanina sustituida con halógeno, tal como fenilalanina sustituida con fluoro, cloro o bromo. En un ejemplo particular la fenilalanina sustituida con halógeno es 2F-PheB24, 2F-PheB25, o 2F-PheB26. En otro ejemplo, el análogo de insulina sustituido con halógeno adicionalmente contiene uno o más sustituciones en otra parte en la molécula de insulina diseñada para alterar la velocidad de acción del análogo en el cuerpo. En todavía otro ejemplo, el análogo de insulina se administra mediante una bomba de insulina externa o implantable. En un análogo de insulina de la presente invención también puede contener otras modificaciones, tal como un teter entre el C-terminal de la cadena B y el N-terminal de la cadena A como es descrito completamente en la Solicitud Internacional Copendiente No. PCT/US07 /080467 , la descripción de la cual se incorporada por referencia en la presente.

Una composición farmacéutica- puede comprender tales análogos de insulina y opcionalmente puede incluir zinc. Los iones de zinc se pueden incluir en tal composición a un nivel de una relación molar de entre 2.2 y 3.0 por hexámero del análogo de insulina. En tal formulación, la concentración del análogo de insulina típicamente estaría entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 3 mM; concentraciones de hasta 3 mM se pueden utilizar en el depósito de una bomba de insulina. Las modificaciones de los análogos de insulina en el tiempo de la comida se pueden formular como es descrito para (a) formulaciones "regulares" de Humulin™ (Eli Lilly y Co.), Humalog™ (Eli Lilly y Co.), Novalin™ (Novo-Nordisk) , y Novalog™ (Novo-Nordisk) y otras formulaciones de insulina de acción rápida actualmente aprobadas para el uso humano, (b) formulaciones "NPH" de los análogos de insulina anteriores y otros, y (c) mezclas de tales formulaciones.

Los excipientes pueden incluir glicerol, glicina, otras soluciones reguladoras .y. sales, . y conservadores antimicrobianos tales como fenol y meta-cresol; estos últimos conservadores se saben que aumentan la estabilidad del hexámero de insulina. Tal composición farmacéutica se puede utilizar para tratar un paciente que tiene diabetes mellitus u otra condición médica al administrar una cantidad fisiológicamente efectiva de la composición al paciente.

Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que codifica un análogo de insulina que contiene una secuencia que codifica por lo menos una cadena B de insulina con una fenilalanina fluorada en la posición B24, B25 o B26 también es contemplado. Esto se puede realizar a través de la introducción de un codón de detención (tal como el codón ámbar, TAG) en la posición B24 en conjunción con tRNA supresor (un supresor ámbar cuando se utiliza un codón ámbar) y una tRNA sintetasa correspondiente, que incorpora un aminoácido no estándar en un polipéptido de respuesta al codón de detención, como es descrito previamente (Furter, 1998, Protein Sci 7:419-426; Xie y colaboradores, 2005, Methods . 36: 227-238). La secuencia particular puede depender de la utilización de codón preferida de una especie en la cual será introducida a la secuencia de ácido nucleico. El ácido nucleico también puede codificar otras modificaciones de la insulina de tipo silvestre. La secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia de cadena A o B modificada que contiene una sustitución no relacionada o extensión en otra parte en el polipéptido o análogos de proinsulina modificados. El ácido nucleico también puede ser una porción de un vector de expresión, y ese vector se pueden insertar en una célula hospedera tal como una célula hospedera procariótica similar a una linea de células de E. coli, una linea de célula eucariótica tal como la cepa o Lenina de células de S. cereviciae o Pischia pastoris .

Por ejemplo, se contempla que los genes sintéticos se pueden sintetizar para dirigir la expresión de un polipéptido de cadena B en la levadura Piscia pastoris y otro microorganismo. La secuencia de nucleótidos de un polipéptido de cadena B que utiliza un codón de detención en la posición B24 para el propósito de incorporar una fenilalanina halogenada en esta posición pueden ser ya sea de lo siguiente o variantes del mismo: (a) Con Preferencias de Codón Humano: TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGG AACGAGGCTAGTTCTACACACCCAAGACC (SEQ. ID. NO.12) (b) Con Preferencias de Codón de Pichia: TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTG AAAGAGGTTAGTTTTACACTCCAAAGACT (SEQ. ID. NO.13) De manera similar, un cDNA de pro-insulina de longitud completa que tiene preferencias de codón humano y que utiliza un codón de detención en la posición B24 para el propósito de incorporar una fenilalanina halogenada en esa posición puede tener la secuencia de SEQ. ID NO. 14.

TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG ' CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT AGTTCTACAC ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (SEQ.ID. NO.14) Del mismo modo, un cDNA de pro-insulina humana de longitud completa que utiliza un codón de detención en la posición B24 para el propósito de incorporar una fenilalanina halogenada en esta posición y que tiene codones preferidos por P. pastoris puede tener la secuencia de SEQ. ID. NO 15 TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT AGTTTTACAC TCCAAAGACT : AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA TTGGAAAACT ACTGTAACTA A (SEQ. ID. NO. 15) De manera similar, una secuencia de nucleótidos de un polipéptido de cadena B que utiliza un codón de detención en la posición B25 para el propósito de incorporar una fenilalanina halogenada en esa posición puede ser ya sea de lo siguiente o variante del mismo: (b) Con Preferencias de Codón humano: TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGG AACGAGGCTTCTAGTACACACCCAAGACC (SEQ. ID. NO.19) (b) Con Preferencias de Codón de Pichia: TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTG AAAGAGGTTTTTAGTACACTCCAAAGACT (SEQ. ID. NO.20) Un cDNA de pro-insulina de longitud completa que tiene preferencias de codón humano y que utiliza un codón de detención en la posición B25 para el propósito de incorporar una fenilalanina halogenada tal como fenilalanina fluorada en esta posición puede tener la secuencia de SEQ. ID NO.' 21.

TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTAGTACAC ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (SEQ. ID. NO.21) Del mismo modo, un cDNA de pro-insulina humana de longitud completa que utiliza un codón de detención en la posición B25 para el propósito de incorporar una fenilalanina halógenada tal como una fenilalanina fluorada en esa posición y que tiene codones preferidos por P. pastoris pueden tener la secuencia de SEQ. ID. NO 22. : TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT TTTAGTACAC TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA TTGGAAAACT ACTGTAACTA A (SEQ. ID. NO. 22) Del mismo modo, una secuencia de nucleótido de un polipéptido de cadena B que utiliza un codón de detención en la posición B26~ para el propósito de incorporar una fenilalanina halogenada en esa posición puede ser ya sea de lo siguiente o variantes del mismo: (c) Con Preferencias de Codón Humano: TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGG AACGAGGCTTCTTCTAGACACCCAAGACC (SEQ. ID. NO. 23) (b) Con Preferencia de Codón de , Pichia: TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTG AAAGAGGTTTTTTTTAGACTCCAAAGACT (SEQ. ID. NO. 24) 1 Un cDNA de pro-insulina de longitud completa que tiene preferencias de codón humano y que utiliza un codón de detención en la posición B26 para el propósito de incorporar una fenilalanina halogenada en esa posición puede tener la secuencia de SEQ . ID NO. 25.

TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTTCTAGAC ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG : CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (SEQ. ID. NO.25) Del mismo modo, un cDNA de pro-insulina humana de longitud completa que utiliza un codón de detención en la posición B26 para el propósito' de incorporar una fenilalanina halogenada en esa posición y que tiene codones preferidos por P. pastoris puede tener la secuencia de SEQ. ID. NO 26.

TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT TTTTTTAGAC TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA TTGGAAAACT ACTGTAACTA A (SEQ. ID. NO. 26) Otras variantes de estas secuencias, que codifican la misma secuencia de polipéptido, son posibles, dados los sinónimos en el código genético.

Basado en la descripción anterior, ahora debe ser evidente que los análogos de insulina sustituidos con halógeno llevarán a cabo los objetivos expuestos anteriormente en la presente. Específicamente, estos análogos de insulina exhiben estabilidad termodinámica ¦ aumentada, resistencia a la fibrilación y potencia en reducir los niveles de glucosa en la sangre. Los análogos de insulina que contienen fenilalanina sustituida con halógeno también tienen reactividad cruzada reducida al factor de crecimiento similar a insulina (IGFR) . Por lo tanto, se entiende que cualquiera de las variaciones evidentes caen dentro del alcance de la invención reclamada y así, la selección de > elementos componentes específicos se puede determinar sin apartarse del espíritu de la invención divulgada y descrita en la presente.' La siguiente literatura se cita para demostrar que los métodos de prueba y de ensayo descritos en la presente serían entendidos por un experto ordinario en la técnica.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un análogo de insulina, caracterizado porque comprende un polipéptido de cadena B que incorpora una fenilalanina halogenada en la posición B24, B25 o B26.

2. El análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fenilalanina halogenada está ubicada en la posición B24.

3. El análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fenilalanina halogenada es orto-monofluoro-fenilalanina, orto-monobromo-fenilalanina u orto-monocloro-fenilalanina .

4. El análogo de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el análogo es un análogo de una insulina de mamífero.

5 . El análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el análogo es un análogo de insulina humana.

6. El análogo de insulina de conformidad con la reivindicación. 4, caracterizado porque el polipéptido de cadena B comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NOS. 4-8 y polipéptidos que tienen tres o menos sustituciones de aminoácido adicionales del mismo.

7. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica un análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 4.

8. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la fenilalanina halogenada se codifica por un codón de detención.

9. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el codón de detención es la secuencia de ácido nucleico TAG. ·

10. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 7, 8 o 9.

11. Una célula hospedera, caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de la reivindicación 10.

12. Un método para tratar a un paciente, caracterizado porque comprende administrar una cantidad fisiológicamente efectiva de un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo al paciente, en donde el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene un polipéptido de cadena B que incorpora un fenilalanina halogenada en la posición B24, B25 o B26.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la fenilalanina halogenada está ubicada en la posición B24.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la fenilalanina halogenada es orto- monofluoro-fenilalanina, orto-monobromo-fenilalanina u orto-monocloro-fenilalanina . .

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido de cadena B comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NOS: 4-8 y polipéptidos que tienen tres o menos sustituciones de aminoácido adicionales del mismo.