CN102171245B - 卤素稳定型胰岛素 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种包含在B24、B25或B26位掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽的胰岛素类似物、编码这类胰岛素类似物的核酸和治疗患者的方法。所述卤化苯丙氨酸可以是邻-一氟-苯丙氨酸、邻-一溴-苯丙氨酸或邻-一氯-苯丙氨酸。所述类似物可以是哺乳动物胰岛素,例如人胰岛素。所述卤化胰岛素类似物保持显著活性。所述治疗患者的方法包括将生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐给予患者。在缺乏冷藏条件的发展中世界地区,卤素取代型稳定胰岛素可增强对糖尿病的治疗。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年7月31日申请的美国临时申请号61/085,212的权益。
有关联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明得到在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)于资助号DK40949和DK074176中签订的合作协议下的政府支持。美国政府对本发明可享有一定的权利。
发明背景
本发明涉及抗热降解的多肽类似物。更具体地讲,本发明涉及热稳定型胰岛素类似物。甚至更具体地讲,本发明涉及通过将元素氟、氯或溴掺入胰岛素类似物的氨基酸中而实现化学稳定和热稳定的胰岛素类似物。这些元素归类为卤素,并且由于其原子半径、电负性、部分电荷的立体电子分布和对分子中相邻原子的立体电子性质的发射效应而不同于蛋白质的通常组分。
超稳定蛋白质(包括治疗药物和疫苗)的工程改造,对电力和冷藏条件受到限制的发展中国家和地区具有广泛的社会效益。胰岛素是易受热降解影响的治疗性蛋白质实例之一。糖尿病在非洲和亚洲的普遍盛行使得胰岛素的化学降解和物理降解面临更严峻的挑战。因为胰岛素类似物的化学降解速率与其相对稳定性呈负相关,所以在非洲和亚洲这样的形势严峻的地区设计超稳定制剂可提高胰岛素替代疗法的安全性和功效。
在药物化学中,已知在有机小分子中使用氟取代。氟化官能团对于广泛处方使用的小分子药物的功效十分关键,所述小分子药物例如胆固醇的生物合成抑制剂阿托伐他汀(LiptorTM)以及用于治疗抑郁症和其它情感型障碍的选择性5-羟色胺重摄取抑制剂盐酸氟西汀(ProzacTM)。尽管氟的原子半径类似于氢的原子半径,但是其巨大的诱导效应改变这些药物的立体电子性质,进而提高其生物活性。物理有机化学的类似考虑涉及掺入较大的卤素原子,例如氯和溴。小分子孟鲁司特钠(SingulairTM)是白三烯抑制剂,其药学性质通过共价掺入氯原子而得到增强。
以前,人们的关注点集中在使用多个氟化脂族侧链(例如三氟-γ-CF3-Val、三氟-δ-CF3-Val、三氟-δ-CF3-Ile、六氟-γ1,2-CF3-Val和六氟-δ1,2-CF3-Leu)以使与这种修饰有关的疏水性增加最大化。一个实例是模型α-螺旋基序即同二聚体卷轴螺旋的稳定。其界面的脂族链被三氟类似物同时取代,产生其稳定性提高0.3-2.0kcal/摩尔的氟核心。每个氟原子的稳定程度<0.1kcal/摩尔。在无关联的α-螺旋结构域中通过一个内部Phe被五氟-Phe(F5-Phe)1取代而实现了每个氟原子更显著的稳定性(ΔΔGu 0.6kcal/摩尔/5个氟原子)。稳定只发生在蛋白质的一个特定位置上,这就表明其机制需要特定的空间环境。相关的F5-Phe修饰的结构域的结构与未修饰的结构域的结构相同。然而,结构稳定只是生物活性多肽要求的一个部分。还必需保持至少可观的活性。
大量的文献披露了在蛋白质中使用氟标记作为19F-NMR探测目标。鉴于普遍认为这类标记是无干扰的,因此在蛋白质工程中应用氟化氨基酸以期利用其改变的物理化学性质。含有单F5-Phe取代的模型α-螺旋折叠(α-helical fold)(绒毛蛋白帽子(headpiece)亚结构域)的研究证实,这类修饰是否可影响蛋白质稳定性以及影响的程度在细节上取决于结构环境。实际上,在测试的核心7个位点中只有一个位点被F5-Phe取代才会提高该模型折叠的表观稳定性。然而,应当注意的是,这种稳定效应只是在氟化位点附近的主链上含有硫原子的非标准多肽类似物中出现;在我们的研究中,在具有天然多肽主链的绒毛蛋白帽子亚结构域中,相同的F5-Phe取代对其稳定性没有影响。因此,据我们所知,之前没有报道表明在其它天然蛋白质中由于芳族残基的卤化而提高蛋白质稳定性的真实数据。这些观察结果表明,一个一般疏水环境并不完全确保修饰都将稳定。由于蛋白质内部常常通过具有特定距离和角度相关性的芳族-芳族相互作用而稳定,因此稳定F5-Phe取代的一个亚类可特别采取有利的全氟芳基/芳基几何结构。这类相互作用产生于部分电荷在这些芳族系统的不对称分布。科技文献中,对将氯或溴原子位点特异性掺入修饰氨基酸中以调节蛋白质的化学、物理学和生物学性质的表征不如对掺入氟原子的上述效应的表征全面。
芳族侧链可参与许多弱极性相互作用,不仅包括相邻芳环,而且还包括正静电位或负静电位的其它来源。实例包括肽键中的主链羰基和酰胺基。
给予胰岛素早被证实为糖尿病的治疗法。胰岛素是小的球状蛋白质,在脊椎动物的代谢中起重要作用。胰岛素含有2条链,A链含有21个残基,B链含有30个残基。胰岛素以Zn2+稳定的六聚体贮存于胰β细胞内,但在血液中为无Zn2+单体。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物,胰岛素原中一个连接区(35个残基)将B链的C端残基(残基B30)与A链的N端残基连接起来(图1A)。尽管尚未确定胰岛素原的结构,但是许多证据表明它由胰岛素样核心和无序的连接肽组成(图1B)。一般认为在粗面内质网(ER)中,3个特定二硫键(A6-A11、A7-B7和A20-B19;图1A和图1B)的形成偶联成为氧化可折叠的胰岛素原。在从ER输出至高尔基体后不久,胰岛素原装配形成可溶性Zn2+配位的六聚体。内切蛋白酶消化并转化成胰岛素发生于未成熟的分泌颗粒中,接着发生形态缩合。通过电子显微镜术(EM)观察到成熟贮藏粒内晶体排列的锌胰岛素六聚体。
已经研究了胰岛素中的氨基酸取代对热力学稳定性和生物活性的作用。在稳定性和活性之间未观察到一致的关系。尽管提高热力学稳定性的一些取代也提高与胰岛素受体的结合,但是提高稳定性的其它取代妨碍这类结合。已研究了野生型人胰岛素中ThrA8被若干其它氨基酸取代的作用,并且报道了在工程胰岛素的情况下B链中含有3个无关取代的单体(HisB10→Asp、ProB28→Lys和LysB29→Pro)。在本领域中还已知加快或延迟吸收时程的取代的实例。这类取代(例如Novalog中的AspB28和Humalog中的[LysB28、ProB29])可能并常常与较快的原纤维形成和较差的物理稳定性有关。实际上,已测试了一系列共10种人胰岛素的类似物易于原纤维形成,包括AspB28-胰岛素和AspB10-胰岛素。发现在pH 7.4和37℃下,所有10种人胰岛素类似物都比人胰岛素易于原纤维形成。10种取代位于胰岛素分子的不同位点上,并很可能与典型的热力学稳定性的大范围变化有关。尽管观察到一系列的影响,但是在活性和热力学稳定性之间不存在相关性。
胰岛素是小的球状蛋白质,十分适于有利于非标准侧链掺入的化学合成和半合成。胰岛素含有3个苯丙氨酸残基(B1、B24和B25位)和B26位上的结构相似的酪氨酸。在脊椎动物胰岛素和胰岛素样生长因子中是保守的PheB24的芳环紧靠着疏水核心(但不在其内)装配以稳定B链的超二级结构。PheB24位于典型的受体结合表面,并被认为在受体结合中指导构象的改变。PheB25自胰岛素单体的表面伸出,而TyrB26装配在所述核心一边的脂族侧链(IleA2、ValA3和ValB12)附近。B24相关的构象变化被认为能够使PheB25和TyrB26与胰岛素受体的独特结构域接触。
蛋白质原纤维形成的现有理论假定,原纤维形成的机制先是形成部分折叠的中间状态,进而聚集形成促淀粉状蛋白生成的核(amyloidogenic nucleus)。在这个理论中,有可能稳定天然状态的氨基酸取代可以或者不可以稳定部分折叠的中间状态,以及可以或者不可以增加(或降低)天然状态和中间状态之间的自由能屏障。因此,现有理论表明胰岛素分子中给定氨基酸取代增加或降低原纤维形成的风险的趋向是极其不可预测的。
原纤维形成是治疗糖尿病的胰岛素和胰岛素类似物的制造、贮存和使用中格外受到关注的问题,其随着较高的温度、较低的pH、震动或者脲、胍、乙醇助溶剂的存在或疏水表面而增加。现行的美国药物规章要求如果原纤维形成发生的水平为1%以上,则胰岛素不得再使用。由于较高温度促进原纤维形成,因此糖尿病人最好用前将胰岛素冷冻保存。使用外部胰岛素泵(其中每隔一定时间便将少量胰岛素或胰岛素类似物注射到患者体内)的糖尿病患者可能特别担心胰岛素或胰岛素类似物的原纤维形成。在这种用法当中,胰岛素或胰岛素类似物在泵装置内并非冷冻保存,而胰岛素的原纤维形成可能导致把胰岛素或胰岛素类似物注射入机体所用的导管堵塞,这可能导致无法预测的血糖水平波动,甚至危险的高血糖症。至少一份最新报道指出,赖脯胰岛素(其中残基B28和B29相对于它们在野生型人胰岛素中的位置发生互换的一种类似物;商品名Humalog)可能特别易于发生原纤维形成并导致胰岛素泵导管堵塞。
在可植入胰岛素泵中甚至更担心胰岛素原纤维形成,其中胰岛素以高浓度并于生理温度(即37℃)保持在植入物内达1-3个月,而不是外部泵的环境温度。另外,由正常运动引起的摇动也可能会加快胰岛素的原纤维形成。尽管胰岛素原纤维形成的可能性增加,但是由于这类系统的潜在优势,可植入胰岛素泵仍然是研究工作的课题。这些优势包括胰岛素经腹膜内递送至门脉循环系统,其模拟了胰岛素的正常生理递送,比通过全身性循环系统为患者提供胰岛素的皮下注射更接近正常的生理递送。与可提供从注射部位到其它部位易变化的吸收和降解的皮下注射相比,腹膜内递送提供更快和一致的胰岛素吸收。通过可植入泵给予胰岛素还可增加患者的便利性。虽然防止原纤维形成的努力(例如将表面活性剂加入贮器中)已提供了一些改进,但是除严格监控的临床试验以外,迄今为止这些改进都被视为不足以允许将植入胰岛素泵可靠用于糖尿病患者。
如上所述,发展中世界面临着有关安全贮存、递送和使用药物和疫苗的问题。在缺乏持续电力和冷藏供应的非洲和亚洲地区,这种难题使温度敏感性胰岛素制剂的使用复杂化,在发展中世界悬而未决的糖尿病盛行很可能使问题变得更严峻。在25℃以上的温度下,每增加10℃胰岛素的降解速率提高10倍或更大,准则要求贮存于<30℃的温度,优选冷冻贮存。在较高温度下,胰岛素既进行化学降解(共价结构改变,例如形成异天冬氨酸、二硫键重排和形成共价聚合物)又进行物理降解(非天然聚集和原纤维形成)。
已经披露了在胰岛素中的氨基酸取代稳定了胰岛素蛋白质,但是也增强了其与胰岛素受体(IR)的结合,其也增强了交叉结合同源性胰岛素样生长因子受体(IGFR)而具有致癌风险。HisB10被天冬氨酸取代是本领域已知的一个实例。尽管就稳定性和药代动力学特征而言,AspB10-胰岛素具有有利的药学性质,但是其受体结合特性的提高与Sprague-Dawley大鼠的肿瘤发生有关。尽管在A链或B链中有许多可引入AspB10-胰岛素或相关类似物以降低其结合IR和IGFR至类似于人胰岛素结合IR和IGFR的水平的可能取代,但是这种取代一般破坏胰岛素(或胰岛素类似物)的稳定性,并且增加其对化学降解和物理降解的敏感性。可能需要找出能够“调整”受体结合亲合性同时提高稳定性和对原纤维形成的抗性的修饰胰岛素和胰岛素类似物的方法。这类应用可能需要一套稳定修饰来降低结合IR和IGFR至不同程度以抵消在其受体结合特性中具有超活性的类似物的潜在致癌性。
因此,需要通过掺入含有卤素原子作为非标准官能团同时保持类似物的至少部分生物活性的非标准氨基酸而稳定的胰岛素类似物。
发明概述
因此,本发明的一个方面提供在氨基酸中通过卤素取代而提供较高稳定性的胰岛素类似物,其中所述类似物还保持相应非卤化胰岛素或胰岛素类似物的至少部分生物活性。
总的来说,本发明提供的胰岛素类似物包含在B24、B25或B26位掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽。在一个实施方案中,卤化苯丙氨酸位于B24位。在另一个实施方案中,卤化苯丙氨酸是邻-一氟-苯丙氨酸、邻-一溴-苯丙氨酸或邻-一氯-苯丙氨酸。在另一个实施方案中,胰岛素类似物是哺乳动物胰岛素类似物,例如人胰岛素的类似物。在一些具体的实施方案中,B链多肽包含选自SEQ.ID.NOs.4-8的氨基酸序列及其具有三个以内的其它氨基酸取代的多肽。
本发明还提供编码胰岛素类似物的核酸,所述胰岛素类似物包含在B24、B25或B26位掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽。在一个实例中,卤化苯丙氨酸由终止密码子(例如核酸序列TAG)编码。表达载体可包含这类核酸,而宿主细胞可包含这类表达载体。
本发明还提供一种治疗患者的方法。所述方法包括将生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐给予患者,其中胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有在B24、B25或B26位上掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽。在一个实施方案中,给予患者的胰岛素类似物的卤化苯丙氨酸位于B24位。在另一个实施方案中,卤化苯丙氨酸是邻-一氟-苯丙氨酸、邻-一溴-苯丙氨酸或邻-一氯-苯丙氨酸。在又一个实施方案中,胰岛素类似物是哺乳动物胰岛素类似物,例如人胰岛素的类似物。在一些具体的实施方案中,B链多肽包含选自SEQ.ID.NOs.4-8的氨基酸序列及其具有三个以内的其它氨基酸取代的多肽。
若干附图简述
图1A图示包括A链和B链以及具有邻接二元切割位点(实心圆)和C肽(空心圆)的连接区的人胰岛素原序列。
图1B是由胰岛素样部分和无序连接肽(虚线)组成的胰岛素原的结构模型。
图1C图示人胰岛素序列,示出了残基B24在B链中的位置。
图1D是显示相对于3个二硫键的PheB24芳族残基的胰岛素单体的带状结构模型。显示了LeuB15(箭头)和PheB24的相邻侧链。A链和B链链另外分别以浅灰色和暗灰色表示,半胱氨酸的硫原子用圆示出。
图1E是胰岛素的空间充满模型,显示疏水核心边缘口袋内的PheB24侧链。
图2A图示五氟-苯丙氨酸(F5-Phe)。
图2B图示邻-一氟-苯丙氨酸(2F-Phe)。
图2C图示间-一氟-苯丙氨酸(3F-Phe)。
图2D图示对-一氟-苯丙氨酸(4F-Phe)。
图3是一组4张远紫外波长的圆二色性(CD)谱。A图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和2F-PheB24-DKP-胰岛素(□);B图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和3F-PheB24-DKP-胰岛素(▲);C图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和4F-PheB24-DKP-胰岛素(▼);D图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和F5-PheB24-DKP-胰岛素(●)。
图4是一组4张CD检测的胍变性研究曲线图。A图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和2F-PheB24-DKP-胰岛素(□);B图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和3F-PheB24-DKP-胰岛素(▲);C图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和4F-PheB24-DKP-胰岛素(▼);D图:DKP-胰岛素(实心黑色线)和F5-PheB24-DKP-胰岛素(●)。
图5图示胰岛素类似物受体结合研究的结果。相对活性通过竞争结合测定法测定,其中通过增加DKP-胰岛素(■)或其以下类似物的浓度置换受体结合的125I标记的人胰岛素:五氟-PheB24(▲)、2F-PheB24(▼)、3F-PheB24(◆)和4F-PheB24(●)。
图6图示胰岛素类似物受体结合研究的结果。相对活性通过竞争结合测定法测定,其中通过增加KP-胰岛素(■)或其以下类似物的浓度置换受体结合的125I标记的人胰岛素:2Br-PheB24-KP-胰岛素(▲)、2Cl-PheB24-KP-胰岛素(▼)、2F-PheB24-KP-胰岛素(◆)和4F-PheB24-KP-胰岛素(●)。测定应用胰岛素受体的B同种型且125I-TyrA14-人胰岛素用作示踪剂。
图7A图示人胰岛素(实线)、KP-胰岛素(虚线:“母体”)、含有一氟取代的KP-胰岛素类似物2F-PheB24-KP-胰岛素(▲)、3F-PheB24-KP-胰岛素(■)和4F-PheB24-KP-胰岛素(○)的CD检测的胍变性研究。
图7B图示人胰岛素(实线)、KP-胰岛素(虚线;“母体”)、2-Cl-PheB24-KP-胰岛素(▼)和2-Br-PheB24-KP-胰岛素(△)的CD检测的胍变性研究。
图8A图示DKP-胰岛素类似物的1H-NMR谱,DKP-胰岛素类似物相对于DKP-胰岛素在PheB24的2、3和4位含有氟取代,记录:700MHz、32℃和pD 7.0。
图8B图示KP-胰岛素类似物的NMR谱,KP-胰岛素类似物相对于KP-胰岛素在PheB24的2位含有氟取代、溴取代和氯取代,记录:700MHz、32℃和pD 7.0。
发明详述
本发明涉及通过氨基酸的卤素取代而提供更高稳定性的胰岛素类似物,其中所述类似物仍保持相应的非卤化胰岛素或胰岛素类似物的至少部分生物活性。具体地讲,本发明提供通过氨基酸的单一卤素取代而提供更高稳定性的胰岛素类似物,其中所述类似物仍保持相应非卤化胰岛素或胰岛素类似物的至少部分生物活性。在一个实例中,本发明提供通过氨基酸的氟、氯或溴取代而提供更高稳定性的胰岛素类似物,其中所述类似物仍保持相应非卤化胰岛素或胰岛素类似物的至少部分生物活性。一种可能的应用是提高胰岛素类似物的化学和物理稳定性同时保持其部分生物活性;另一种应用是使胰岛素类似物的受体结合特性标准化使得不超过人胰岛素的受体结合特性。为此,本发明提供含有卤化苯丙氨酸(Phe)残基作为在B24、B25或B26位取代的胰岛素类似物。虽然在B24或B25的卤化苯丙氨酸取代不会改变胰岛素或胰岛素类似物的基本氨基酸序列,但是胰岛素B26位上的卤化苯丙氨酸必须取代野生型胰岛素序列中存在的酪氨酸(Tyr)。
然而,本发明不限于人胰岛素及其类似物。还设想这些取代也可在动物胰岛素中进行,以非限制性实例为例,例如猪、牛、马和犬胰岛素。
此外,鉴于人与动物胰岛素之间的相似性,以及以往动物胰岛素在人糖尿病患者中的使用,还预期可将其它微小修饰引入胰岛素的序列中,尤其是被称为“保守”型的取代。例如,氨基酸的其它取代可在具有类似侧链的氨基酸类型中进行而不偏离本发明。这些氨基酸类型包括中性疏水氨基酸:丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样,中性极性氨基酸可在其类型中彼此取代:甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。碱性氨基酸包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸为天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。除非另有说明或从上下文中显而易见,否则本文所述氨基酸应视为L-氨基酸。在一个实例中,除了本发明的卤化Phe取代以外,本发明的胰岛素类似物含有三个以内的保守取代。在另一个实例中,除本发明的卤化Phe取代以外,本发明的胰岛素类似物含有一个保守取代。
如本申请书和随附权利要求书所使用的一样,胰岛素或胰岛素类似物中的不同氨基酸可用所述氨基酸残基接着氨基酸的位置(任选用上标)表示。所述氨基酸的位置包括取代位于其中的胰岛素的A链或B链。因此,PheB24表示在胰岛素B链第24个氨基酸上的苯丙氨酸,而PheB25表示在胰岛素B链第25个氨基酸上的苯丙氨酸,PheB26表示胰岛素B链第26个氨基酸上取代酪氨酸的苯丙氨酸。氟化氨基酸可以用前缀“F-”表示,溴化氨基酸可以用前缀“Br-”表示,而氯化氨基酸可以用前缀“Cl-”表示。因此,氟化苯丙氨酸可以缩写为“F-Phe”,氯化苯丙氨酸可以缩写为“Cl-Phe”,而溴化苯丙氨酸可以缩写为“Br-Phe”。在苯丙氨酸的情况下,苯基侧链上卤素取代基或取代基的位置还可用卤素与之连接的碳的位数表示。因此,邻-一氟-苯丙氨酸(参见图2B)缩写为“2F-Phe”,间-一氟-苯丙氨酸(参见图2C)缩写为“3F-Phe”,而对-一氟-苯丙氨酸(参见图2D)缩写为4F-Phe。五氟-苯丙氨酸(参见图2A)缩写为“F5-Phe”。同样,邻-一溴-苯丙氨酸可缩写为“2Br-Phe”,邻-一氯-苯丙氨酸可缩写为“2Cl-Phe”。
在B24上的苯丙氨酸在功能性胰岛素中是不变的氨基酸并含有芳族侧链。通过PheB24的临床突变(SerB24)引起人糖尿病表明了PheB24在胰岛素中的生物重要性。如图1D和图1E所示,虽然不希望受理论束缚,但PheB24被认为装配在典型的受体结合表面的疏水核心边缘。该模型以晶体原体(2-Zn分子1;蛋白质数据库标记符4INS)为基础。PheB24位于B链的C端β链(残基B24-B28)上,邻接中心α-螺旋(残基B9-B19)。芳环的一面和一边位于由LeuB15和CysB19界定的浅口袋内;另一面和另一边则暴露于溶剂(图1E)。这个口袋部分被主链羰基和酰胺基包围,并由此产生复杂的不对称静电环境。提供接近对称的取代基四氟-苯丙氨酸(F5-PheB24)(其增强总体疏水性和氟芳基-芳基的相互作用)(图2A)与含有一个邻氟取代、间氟取代或对氟取代的“不平衡的”类似物(分别表示为2F-Phe、3F-Phe或4F-Phe,图2B-2D)的取代基对胰岛素稳定性的作用。
一般认为PheB25位于胰岛素单体的表面,而且在溶液中,结构以比PheB24更少的结构性组织凸入溶剂中。其生物重要性同样表现在临床突变(LeuB25)可引起人类糖尿病。TyrB26,像PheB24一样,位于疏水核心边缘,装配在非极性残基IleA2、ValA3和ValB12附近。光交联研究表明,残基B24、B25和B26的侧链各与胰岛素受体接触。在胰岛素残基的二聚体和六聚体中,残基B24-B26和对称相关残基B24’-B26’被认为参与分子间反平行的β-折叠。一般认为这些位置上的芳族侧链稳定这个β-折叠界面上单体之间的装配。
预期本发明的取代可以在许多现有胰岛素类似物的任意一种中进行。例如,除人胰岛素以外,本文提供的卤化苯丙氨酸(X-Phe)取代可以在下列胰岛素类似物或者各种药物制剂中进行:例如赖脯胰岛素(Lispro insulin)、门冬胰岛素(insulin Aspart)、其它修饰胰岛素或胰岛素类似物;例如药物制剂普通胰岛素、NPH胰岛素、慢胰岛素(lenteinsulin)或超慢胰岛素(ultralente insulin)。门冬胰岛素含有AspB28取代并以Novalog销售,而赖脯胰岛素含有LysB28和ProB29取代,销售商品名为Humalog这些类似物可参见美国专利号5,149,777和5,474,978,其公开内容均通过引用结合到本文中。这两种类似物称为速效胰岛素。
在B24、B25和/或B26上的卤化-Phe取代还可引入人胰岛素的类似物中,虽然之前未在临床上使用但在实验中仍是有益的,例如DKP胰岛素(下面将更详细地介绍)或小型胰岛素原(miniproinsulin),小型胰岛素原是一种在胰岛素A链和B链部分之间含有二肽(Ala-Lys)接头替换B链C端残基和A链N端残基之间正常的35个氨基酸连接区的胰岛素原类似物。DKP-胰岛素(或含有AspB10或具有高于人胰岛素的受体结合亲合力的其它胰岛素类似物)中在B24、B25或B26上掺入卤化芳族残基可降低其受体结合亲合力至类似于或低于人胰岛素的受体结合亲合力,从而可能用于临床。按这种方式,还可降低所述胰岛素类似物与促有丝分裂的IGFR的交叉结合。
提供人胰岛素原的氨基酸序列SEQ.ID.NO.1用于比较目的。
SEQ.ID.NO.1(胰岛素原)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
提供人胰岛素A链的氨基酸序列SEQ.ID.NO.2。
SEQ.ID.NO.2(A链)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
提供人胰岛素B链的氨基酸序列SEQ.ID.NO.3。
SEQ.ID.NO.3(B链)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
人胰岛素B链的氨基酸序列可以用卤化-Phe在B24、B25或B26位上的取代来进行修饰。这样的序列的实例之一为SEQ.ID.NO.4,其中Xaa可以为Tyr或Phe。在这些取代的任何一个中使用的卤素可以为例如氟、氯或溴。
SEQ.ID.NO.4
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Pro-Lys-Thr
[Xaa为Tyr或Phe]
其它取代的进一步组合也属于本发明的范围。还预期本发明的取代还可与之前已知的胰岛素类似物的取代组合。例如,含有赖脯胰岛素(Humalog)的LysB28ProB29取代的人胰岛素B链的类似物的氨基酸序列,其中还可引入一个卤化Phe取代,以SEQ.ID.NO.5提供。同样,含有门冬胰岛素的AspB28取代的人胰岛素B链类似物的氨基酸序列,其中还可引入F-PheB24取代,以SEQ.ID.NO.6提供。
SEQ.ID.NO.5
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Lys-Pro-Thr
[Xaa为Tyr或Phe]
SEQ.ID.NO.6
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-V al-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Asp-Lys-Thr
[Xaa为Tyr或Phe]
还可与其它胰岛素类似物取代(例如在残基A4、A8和/或B1中含有His取代的人胰岛素类似物,更多详情可参见同时待审的国际申请号PCT/US07/00320和美国申请顺序号12/160,187,其公开内容均通过引用结合到本文中)组合引入F-PheB24取代。例如,F-PheB24取代可与具有SEQ.ID.NO.7所表示的氨基酸序列的胰岛素类似物或胰岛素原类似物的[HisA4、HisA8]和/或HisB1取代一起存在。
SEQ.ID.NO.7
R1-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-R2-Thr-R3-R4-Thr-Xaa0-35-Gly-Ile-Val-R5-Gln-Cys-Cys-R6-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn;
其中R1为His或Phe;其中R2为Tyr或Phe,R3为Pro、Lys或Asp;其中R4为Lys或Pro;其中R5为His或Glu;其中R6为His或Thr;且其中Xaa0-35为0-35个任何氨基酸或氨基酸链中断;
且还存在其中选自以下氨基酸取代的至少一个取代:
R1为His;和
R6为His;和
R5和R6同为His。
卤化-Phe在B24、B25或B26位上的取代还可引入公开于同时待审的美国临时专利申请号60/828,153(其公开内容通过引用结合到本文中)的单链胰岛素类似物。
已将氟取代引入称为DKP-胰岛素的工程改造的高活性胰岛素单体中,其含有取代AspB10(D)、LysB28(K)和ProB29(P)。B链表面上的这三个取代被认为会阻碍二聚体和六聚体的形成。使用工程改造的单体避免了自组装对稳定性测定法的混淆效应。DKP-胰岛素的结构非常类似于晶体原体。DKP胰岛素B链多肽的序列以SEQ.ID.NO.8提供,其中Xaa为Tyr或Phe。
SEQ.ID.NO.8(DKP B链序列)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Xaa-Thr-Lys-Pro-Thr
DKP-胰岛素的类似物通过胰蛋白酶催化的半合成并用高效液相色谱法纯化来制备(Mirmira,R.G.和Tager,H.S.,1989.J.Biol.Chem.264:6349-6354)。这个方案应用(i)表示残基(N)-GF*FYTKPT的合成八肽(包括修饰残基(F*)和“KP”取代(下划线);SEQ.ID.NO.9)和(ii)截短类似物脱八肽[B23-B30]-AspB10-胰岛素(SEQ.ID.NO.16)。由于八肽因通过ProB28和LysB29(斜体字)互换而不同于野生型B23-B30序列(GFFYTT;SEQ.ID.NO.10),所以在胰蛋白酶处理期间不需要保护赖氨酸ε-氨基。简而言之,将脱八肽(15mg)和八肽(15mg)溶于含有10mM乙酸钙和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)(35∶35∶30,体积/体积,0.4mL)的二甲基乙酰胺/1,4-丁二醇/0.2M Tris乙酸盐(pH 8)的混合物中。用10μL N-甲基吗啉调节最终pH至7.0。使溶液冷却至12℃,加入1.5mg TPCK-胰蛋白酶,于12℃温育2天。24小时后再加入1.5mg胰蛋白酶。反应物用0.1%三氟乙酸酸化,并用制备型反相HPLC纯化(C4)。采用基质辅助激光解析/电离飞行时间的质谱法(MALDI-TOF;Applied Biosystems,Foster City,CA)在每种情况下得到预期值(未显示)。固相合成的通用方法可参见Merrifield等,1982.Biochemistry 21:5020-5031。9-芴-9-基-甲氧基-羰基(F-moc)保护的苯丙氨酸类似物购自Chem-Impex International(Wood Dale,IL)。
应用Aviv分光偏振计于4℃和25℃获得圆二色性(CD)谱(Weiss等,Biochemistry 39:15429-15440)。样品含有约25μM DKP-胰岛素或类似物的50mM磷酸钾溶液(pH 7.4);将样品于25℃稀释至5μM用于胍诱导的变性研究。为了求出解折叠的自由能,通过非线性最小二乘将变性转换拟合至二态模型,参见Sosnick等,Methods Enzymol.317:393-409。简而言之,按照以下方程式,通过非线性最小二乘程序将CD数据θ(x)(其中x表示变性剂的浓度)拟合:
其中x为胍的浓度,且其中θA和θB为天然状态和解折叠状态的基线值。通过转换前和转换后曲线求出基线近似值和在拟合变体解折叠转换中得到的m值低于在拟合野生型解折叠曲线中得到的m值。为了测定这种差异和ΔGu的表观变化是否因无法测定得自完全解折叠状态的CD信号而产生,进行了其中将数据外推至较高胍浓度下的平稳期CD值的模拟;得到基本相同的ΔGu和m的估算值。
相对活性的定义是置换50%特异性结合的125I-人胰岛素所需要的类似物与野生型人胰岛素的比率。如本领域已知的一样,使用含有胰岛素受体(IR)的人胎盘膜制备物。在选定浓度的未标记类似物存在下,将膜碎片(0.025mg蛋白质/管)与125I标记的胰岛素(约30,000cpm)在最终体积为0.25ml的0.05M Tris-HCl和0.25%(重量/体积)牛血清白蛋白(pH 8)中于4℃温育18小时。温育后,将混合物用1ml冰冷的缓冲液稀释,于4℃离心(10,000g)5分钟。然后通过吸出除去上清液,统计膜沉淀的放射性。对数据做非特异性结合(在1μM人胰岛素存在下相关的放射性残余膜的量)的校正。在所有测定中,在缺乏竞争性配体时结合示踪剂的百分比小于15%以避免配体消耗假象。使用本领域已知的微量滴定板抗体俘获,再进行胰岛素受体结合测定法以监测胰岛素类似物于37℃温育期间活性的改变。将Microtiter strip plates(NuncMaxisorb)于4℃与AU5 IgG一起温育过夜(100μl/孔40mg/ml的磷酸缓冲盐溶液)。通过二部位序贯模型(two-site sequential model)对结合数据进行了分析。采用使用IGF I型受体的相应微量测定板抗体测定法评价了与该同源受体的交叉结合。
单氟化类似物的远紫外圆二色性(CD)谱基本上与母体类似物的相同(图3);在F5-PheB24类似物的圆二色性谱中观察到轻微的偏离(图3,D图)。类似物的稳定性和受体结合活性见表1。在DKP-胰岛素的情况下引入修饰的B24残基。所显示的活性值以激素-受体解离常数与人胰岛素的比率计;因此按定义人胰岛素的活性为1.0。活性值的标准误差一般低于25%。于25℃解折叠的自由能(ΔGu)根据推算成零变性剂浓度的二态模型估算。滞后时间表示在无锌磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)中于37℃轻轻摇动时开始蛋白质原纤维形成所需要的时间(天)。
表1
胰岛素类似物的活性和稳定性
于25℃,由F5-Phe取代PheB24提高DKP-胰岛素的稳定性达0.8±0.1kcal/摩尔(图4,D图)。尽管对稳定性的这种有利作用,但类似物的活性极小(与母体类似物相比<1%受体结合亲合力;表1和图5)。这种减少比通常在标准单一氨基酸取代观察到的更加显著。相比之下,单一取代的类似物每个都保持显著活性:邻位取代类似物(人胰岛素的37%)、间位取代类似物(100%)和对位取代类似物(43%)。这种活性每个都超过一般预测治疗功效的阈值的10%(相当于激素-受体解离常数<1nM)。此外,虽然3F-PheB24和4F-PheB24胰岛素类似物不比母体类似物更稳定(而是可能略微更不稳定)(图4和表1),但是2F-PheB24-DKP-胰岛素至少与F5-Phe类似物一样稳定(ΔΔGu 0.9±0.1kcal/摩尔)。在60μM磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH 7.4)中于37℃温育并轻轻摇动,对一式三份类似物的物理稳定性进行评价。观察样品20天,或者直到观察到玻璃小瓶出现沉淀或起霜迹象。F5-PheB24-DKP-胰岛素类似物、2F-PheB24-DKP-胰岛素类似物和3F-PheB24-DKP-胰岛素类似物(但非4F-PheB24-DKP-胰岛素)开始蛋白质原纤维形成之前的滞后时间均增加(与母体类似物相比)(表1)。因此,单氟原子的取代能够提高单体胰岛素类似物的稳定性同时保持降低但临床上仍显著的活性;所述修饰还可延长在pH 7.4和37℃轻轻摇动下开始蛋白质原纤维形成之前的滞后时间。
虽然F5-PheB24取代极为稳定,但是这种胰岛素类似物基本上没有生物活性。显然,区域专一性修饰的2F-PheB24同样稳定,而同时保持对胰岛素受体基本(尽管降低)的亲合力。
基本上如前所述,还引入了氟取代,只是在赖脯胰岛素(即还含有取代LysB28、ProB29的胰岛素类似物(以Humalog的名称销售))的B24、B25和B26位引入邻氟化苯丙氨酸、间氟化苯丙氨酸、对氟化苯丙氨酸和五氟化苯丙氨酸。在B24位含有邻氟化苯丙氨酸、间氟化苯丙氨酸、对氟化苯丙氨酸和五氟化苯丙氨酸取代的类似物分别称为2F-PheB24-KP-胰岛素、3F-PheB24-KP-胰岛素、4F-PheB24-KP-胰岛素、F5-PheB24-KP-胰岛素。在B25位含有邻氟化苯丙氨酸、间氟化苯丙氨酸、对氟化苯丙氨酸和五氟化苯丙氨酸取代的类似物分别称为2F-PheB25-KP-胰岛素、3F-PheB25-KP-胰岛素、4F-PheB25-KP-胰岛素、F5-PheB25-KP-胰岛素。在B26位上含有邻氟化苯丙氨酸、间氟化苯丙氨酸、对氟化苯丙氨酸和五氟化苯丙氨酸取代(取代酪氨酸)的类似物分别称为2F-PheB26-KP-胰岛素、3F-PheB26-KP-胰岛素、4F-PheB26-KP-胰岛素、F5-PheB26-KP-胰岛素。另外,还将邻溴苯丙氨酸和邻氯苯丙氨酸在B24位取代入赖脯胰岛素中。这些类似物分别称为2Br-PheB24-KP-胰岛素和2Cl-PheB24-KP-胰岛素。KP-胰岛素和DKP-胰岛素的相应类似物的命名在各表和图中缩写为KP和DKP,为简明起见略去“胰岛素”。
更准确地讲,对于B24上的卤化苯丙氨酸取代,使用表示残基(N)-GF*FYTKPT(表示为“F*”的卤化苯丙氨酸残基和“KP”取代(下划线);SEQ ID NO.9)的合成八肽和截短类似物脱八肽[B23-B30]-胰岛素(在B10位上为野生型,SEQ ID NO.17)。对于B25上的氟化苯丙氨酸取代,使用表示残基(N)-GFF*YTKPT(也表示为“F*”的氟化苯丙氨酸和“KP”取代(下划线);SEQ ID NO.9)的合成八肽和截短类似物脱八肽[B23-B30]-胰岛素(在B10位上为野生型;SEQ.ID.NO.17)。对于B26上的氟化苯丙氨酸取代,使用表示残基(N)-GFFF*TKPT(也表示为“F*”的氟化苯丙氨酸和“KP”取代(下划线);SEQ ID NO.18)的合成八肽和截短类似物脱八肽[B23-B30]-胰岛素(在B10位上为野生型;SEQ.ID.NO.17)。同样,对于B24位的氯苯丙氨酸取代和溴苯丙氨酸取代(2Cl和2Br),使用表示残基(N)-GF*FYTKPT(表示为“F*”的卤化苯丙氨酸残基和“KP”取代(下划线);SEQ ID NO.9)的合成八肽和截短类似物脱八肽[B23-B30]-胰岛素(在B10位上为野生型,SEQ ID NO.17)。通常,将脱八肽(15mg)和八肽(15mg)溶于含有10mM乙酸钙和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)(35∶35∶30,体积/体积,0.4mL)的二甲基乙酰胺/1,4-丁二醇/0.2M Tris乙酸盐(pH 8)的混合物中。用10μL N-甲基吗啉调节最终pH至7.0。使溶液冷却至12℃,加入1.5mg TPCK-胰蛋白酶,并于12℃温育2天。24小时后,再加入1.5mg胰蛋白酶。反应物用0.1%三氟乙酸酸化,并用制备型反相HPLC纯化(C4)。在每种情况下采用基质辅助激光解析/电离飞行时间的质谱法(MALDI-TOF;Applied Biosystems,Foster City,CA)得到预期值。如上所述测定相对活性和解离常数。
对于在胰岛素B24位的氟化苯丙氨酸取代,所得数据参见表2。为了比较起见,在相同条件下于37℃测定了野生型胰岛素和2F-PheB24-DKP-胰岛素。于37℃测定的数据见下表3。在B24、B25和B26位的氟化苯丙氨酸取代以及赖脯胰岛素类似物背景中的溴取代苯丙氨酸和氯取代苯丙氨酸的数据可参见下表4。
表2
PheB24-DKP的稳定性和活性
表3
胰岛素和PheB24-DKP-胰岛素的稳定性和活性[37℃]
表4
赖脯胰岛素的卤化-Phe类似物的稳定性和活性
通过竞争性置换的赖脯胰岛素类似物的受体结合数据也可参见图6。该测定法采用胰岛素受体的B同种型和125I-TyrA14-人胰岛素作为示踪剂。
测定了与非卤化赖脯(KP)胰岛素相比B24上含有氯取代苯丙氨酸或溴取代苯丙氨酸的赖脯胰岛素类似物(分别为2Cl-PheB24-KP-胰岛素和2Br-PheB24-KP-胰岛素)降低糖尿病大鼠的血糖的能力。用链脲佐菌素致使雄性Lewis大鼠(约250g体重)患糖尿病。赖脯胰岛素类似物、2Cl-PheB24-KP-胰岛素和2Br-PheB24-KP-胰岛素用HPLC纯化,干燥成粉,并溶于胰岛素稀释剂(Eli Lilly Corp)中。在时间=0时,给大鼠皮下注射20μg或6.7μg胰岛素类似物的100μl稀释剂。在0时间和每10分钟间隔直到90分钟从剪切的尾尖获取血液。使用HypoguardAdvance Micro-Draw计测定血糖。血糖浓度变化(毫克(mg)/十升(dL)/小时(h))见表5和表6(这些研究用不同组的大鼠进行,使得显示相对于对照注射的KP-胰岛素的基础药效动力学反应差异(各表第一行))。
表5
响应赖脯胰岛素的卤化类似物的血糖水平
表6
响应卤化胰岛素类似物的血糖水平
如表5和表6中所见,除2F-PheB24-KP-胰岛素以外,含有卤化苯丙氨酸的胰岛素类似物的功效等于或大于赖脯(Humalog)胰岛素的功效。通过在2F-PheB24-DKP-胰岛素类似物中加入AspB10取代,可使2F-PheB24胰岛素类似物的功效恢复到KP-胰岛素的功效(表6第2行)。另外,B24位上存在卤化苯丙氨酸增加原纤维形成滞后时间达3倍和4倍之间;因此,虽然在上述实验条件下KP-胰岛素的滞后时间约为3天,但是用2F-PheB24、2Cl-PheB24或2Br-PheB24取代PheB24延长滞后时间至10-12天。这些修饰还提高热力学稳定性(通过胍变性探测)达0.5kcal/mol和1kcal/mol之间(表4)。
按照Whittaker和Whittaker所述方法(2005.J.Biol.Chem.280:20932-20936),使用125I-TyrA14-胰岛素(由Novo-Nordisk友情提供)以及在少许改动的微量测定板抗体俘获测定法中纯化和增溶的胰岛素受体(同种型B),通过竞争性置换测定法测定解离常数(Kd);转染受体通过重复3次的FLAG表位(DYKDDDDK;SEQ.ID.NO.11)在其C端加上标签,微量滴定板用抗FLAG M2单克隆抗体(Sigma)包被。在竞争性配体不存在时结合示踪剂的百分比小于15%以避免配体消耗假象。采用异源竞争模型(heterologous competition model)(Wang,1995,FEBSLett.360:111-114),通过非线性回归分析结合数据,得到解离常数。
表7
胰岛素类似物与IGF受体的交叉结合
选定胰岛素类似物与IGF受体的交叉结合的测定值概括于表7中。在这些条件下人胰岛素结合IGFR的牢固程度比结合IGF-I的小260倍。AspB10-胰岛素的交叉结合增加2倍,而临床上广泛使用的类似物ArgB31-胰岛素、ArgB32-胰岛素、GlyA21-胰岛素(甘精胰岛素(insulinglargineTM);LantusTM)的交叉结合增加3倍。IGFR交叉结合的这种增加是不需要的,因为Sprague-Dawley大鼠用AspB10-胰岛素治疗与乳腺肿瘤发生率增加有关,而最新临床研究表明,人使用Lantus可能使各种癌症风险呈剂量依赖性增加。(IGF-I的序列在B10位含有Glu,负电荷与AspB10类似。虽然不希望受理论束缚,但认为Lantus的交叉结合因B链C端的两个碱性残基而增加。因为IGF-I还含有B28位的Lys和B29位的Pro,有可能KP-胰岛素的交叉结合可能增加较少,但上述数据不足以准确地确立这一点)。DKP-胰岛素在IGFR交叉结合中增加6倍。值得注意的是,这种增加被B24上的邻一氟取代抵消:2F-PheB24-DKP-胰岛素具有与野生型人胰岛素一样低的交叉结合水平。其在糖尿病大鼠中的低血糖功效同样与人胰岛素的一样(表6)。由于2F-PheB24-DKP-胰岛素甚至在蛋白质浓度>0.5mM时还是单体,因此,该类似物具有作为临床使用的超快起效和超稳定胰岛素制剂的潜在效用。2Cl-PheB24-KP-胰岛素和2Br-PheB24-KP-胰岛素的交叉结合亲合力同样处于类似于人胰岛素的低水平。这些类似物在糖尿病大鼠中也具有充分活性(表5)。
如上所述,测定了人胰岛素、KP-胰岛素(lispro)和卤化PheB24胰岛素类似物的CD谱。图7A和图7B提供随盐酸胍浓度变化的CD检测的蛋白质变性。图7A提供人胰岛素(实线)和KP-胰岛素(虚线;“母体”)与在PheB242、3或4位含有一氟取代的KP-胰岛素类似物(分别为实心三角形、实心正方形和空心圆)的比较。图7B提供人胰岛素(实线)和KP-胰岛素(虚线;“母体”)与含有2-Cl或2-Br修饰的PheB24的类似物(分别为实心倒三角形和空心三角形)的比较。推测的热力学参数见上表4。通过于222nm、25℃的平均残基椭圆率监测部分解折叠。
已获得选定胰岛素类似物的NMR结构以表明胰岛素很好地容纳卤素取代且不会引起传递的构象干扰。1H-NMR谱参见图8A和图8B。因此,2Cl-PheB24-KP-胰岛素作为溶液中的单体的NMR结构类似于KP-胰岛素的NMR结构;同样,2F-PheB24-DKP-胰岛素(同样作为溶液中的单体)的NMR结构也类似于DKP-胰岛素的NMR结构。2F-PheB24-KP-胰岛素和2Br-PheB24-KP-胰岛素的NMR谱定性分析同样显示天然样结构。
已测定了在防腐剂苯酚存在下作为锌稳定化六聚体的2F-PheB24-KP-胰岛素和4F-PheB24-KP-胰岛素的晶体结构(数据未显示)。所述结构类似于之前报道的在苯酚存在下作为锌稳定化六聚体的KP-胰岛素的结构。在每种情况下,六聚体的构象是含有2个中轴锌离子和3个结合苯酚分子的T3Rf 3。容易观察到卤素原子的电子密度。在卤化类似物中保存了二聚体形成表面和三聚体形成表面的结构,这就表明可以获得与用于KP-胰岛素和其它速效胰岛素类似物的药物制剂类似的药物制剂。
用于治疗患者的方法包括给予患者卤素取代的胰岛素类似物。在一个实例中,卤素取代的胰岛素类似物是含有卤素取代的苯丙氨酸(例如氟-、氯-或溴取代的苯丙氨酸)的胰岛素类似物。在一个具体实例中,卤素取代的苯丙氨酸是2F-PheB24、2F-PheB25或2F-PheB26。在另一个实例中,卤素取代的胰岛素类似物另外在胰岛素分子的其它部位含有一个或多个取代,从而改变类似物在体内的作用速率。在又一个实例中,通过外部胰岛素泵或可植入胰岛素泵给予胰岛素类似物。本发明的胰岛素类似物还可含有其它修饰,例如B链C端与A链N端之间的连接区或系链(tether),更多详情可参见同时待审的国际申请号PCT/US07/080467,其公开内容通过引用结合到本文中。
药物组合物可包含这类胰岛素类似物,且其可任选包括锌。这类组合物可包含锌离子的摩尔比率水平介于每胰岛素类似物六聚体2.2和3.0之间。在这类制剂中,胰岛素类似物的浓度通常可介于约0.1mM和约3mM之间;至多3mM的浓度可用于胰岛素泵贮器中。餐时胰岛素类似物的改良产品可按照以下制剂所述方法配制:(a)HumulinTM(Eli Lilly and Co.)、HumalogTM(Eli Lilly and Co.)、NovalinTM(Novo-Nordisk)和NovalogTM(Novo-Nordisk)和目前获准用于人的其它速效胰岛素制剂的“普通”制剂,(b)上述制剂和其它胰岛素类似物的“NPH”制剂,和(c)这类制剂的混合物。
赋形剂可包括甘油、甘氨酸、其它缓冲剂和盐以及抗微生物防腐剂,例如苯酚和间甲酚;已知后一防腐剂提高胰岛素六聚体的稳定性。可通过将生理学上有效量的组合物给予患者,而将这类药物组合物用于治疗患有糖尿病或其它病症的患者。
还预期包含编码多肽胰岛素类似物的序列的核酸,其含有编码至少一个胰岛素B链的序列,所述B链在B24、B25或B26位上具有氟化苯丙氨酸。如前所述(Furter,1998,Protein Sci.7:419-426;Xie等,2005,Methods.36:227-238),这可通过引入B24位上的终止密码子(例如琥珀密码子,TAG)结合阻抑型tRNA(使用琥珀密码子时的一种琥珀抑制子)和相应的tRNA合成酶来实现,其在响应终止密码子时将非标准氨基酸掺入多肽。具体序列可取决于核酸序列将引入其中的物种的优选密码子选择。所述核酸还可编码野生型胰岛素的其它修饰。所述核酸序列可编码在所述多肽或者修饰的胰岛素原类似物的其它位置含有无关取代或延伸的修饰A链或B链序列。核酸还可以是表达载体的组成部分,且可将该载体插入宿主细胞内,例如原核宿主细胞(像大肠杆菌(E.coli)细胞系)或真核细胞系(例如酿酒酵母(S.cereviciae)或巴斯德毕赤酵母(Pischia pastoris)菌株或细胞系。
例如,预期可以进行合成基因的合成以指导B链多肽在巴斯德毕赤酵母(Piscia pastoris)和其它微生物中表达。在B24位使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽的核苷酸序列可以是下列序列或其变体之一:
(a)具有人密码子优选:
TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCT
CTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTAGTTCTACACACCCAAGA
CC(SEQ.ID.NO.12)
(b)具有毕赤酵母(Pichia)密码子优选:
TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTG
TACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTAGTTTTACACTCCAAAGAC
T(SEQ.ID.NO.13)
同样,具有人密码子优选和B24位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸的全长胰岛素原cDNA可具有SEQ.ID.NO.14的序列。
TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG
CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT AGTTCTACAC
ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG
CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC
AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT
TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG
CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (SEQ.ID.NO.14)
同样,B24位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸并具有巴斯德毕赤酵母优选的密码子的全长人胰岛素原cDNA可具有SEQ.ID.NO.15的序列。
TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG
CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT AGTTTTACAC
TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT
CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC
AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT
TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA
TTGGAAAACT ACTGTAACTA A (SEQ.ID.NO.15)
同样,B25位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽的核苷酸序列可以是下列序列或其变体之一:
(a)具有人密码子优选:
TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCT
CTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTAGTACACACCCAAGA
CC (SEQ.ID.NO.19)
(b)具有毕赤酵母密码子优选:
TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTG
TACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTTTAGTACACTCCAAAGAC
T (SEQ.ID.NO.20)
具有人密码子优选和B25位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸(例如氟化苯丙氨酸)的全长胰岛素原cDNA可具有SEQ.ID.NO.21的序列。
TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG
CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTAGTACAC
ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG
CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC
AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT
TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG
CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (SEQ.ID.NO.21)
同样,B25位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸(例如氟化苯丙氨酸)并具有巴斯德毕赤酵母优选的密码子的全长人胰岛素原cDNA可具有SEQ.ID.NO.22的序列。
TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG
CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT TTTAGTACAC
TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT
CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC
AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT
TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA
TTGGAAAACT ACTGTAACTA A (SEQ.ID.NO.22)
同样,B26位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽的核苷酸序列可以是下列序列或其变体之一:
(a)具有人密码子优选:
TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCT
CTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTAGACACCCAAGA
CC (SEQ.ID.NO.23)
(b)具有毕赤酵母密码子优选:
TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTG
TACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTTTTTTAGACTCCAAAGACT
(SEQ.ID.NO.24)
具有人密码子优选和B26位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸的全长胰岛素原cDNA可具有SEQ.ID.NO.25的序列。
TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG
CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTTCTAGAC
ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG
CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC
AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT
TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG
CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (SEQ.ID.NO.25)
同样,B26位上使用终止密码子以便在该位置掺入卤化苯丙氨酸并具有巴斯德毕赤酵母优选的密码子的全长人胰岛素原cDNA可具有SEQ.ID.NO.26的序列。
TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG
CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT TTTTTTAGAC
TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT
CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC
AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT
TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA
TTGGAAAACT ACTGTAACTA A (SEQ.ID.NO.26)
编码相同多肽序列的这些序列的其它变体是可能存在的,前提是遗传密码同义。
基于上述公开内容,卤素取代的胰岛素类似物将实现上文所述的目标是显而易见的。也就是说,这些胰岛素类似物具有提高热力学稳定性、提高对原纤维形成的抗性和降低血糖水平的功效。含有卤素取代的苯丙氨酸的胰岛素类似物还降低了与胰岛素样生长因子(IGFR)的交叉反应性。因此,要理解的是,任何明显的变化都属于要求保护的发明的范围内,因此,可以确定具体组成要素的选择而又不偏离本文公开和描述的本发明的精神。
引用下列文献以表明本文所述测试和测定方法应为本领域普通技术人员所了解。
Furter,R.,1998.Expansion of the genetic code:Site-directedp-fluoro-phenylalanine incorporation in Escherichia coli(遗传密码的扩展:将对氟苯丙氨酸位点定向地掺入大肠杆菌).Protein Sci.7:419-426。
Merrifield,R.B.,Vizioli,L.D.和Boman,H.G.1982.Synthesis of theantibacterial peptide cecropin A(1-33)(抗菌肽杀菌肽A(1-33)的合成).Biochemistry 21:5020-5031。
Mirmira,R.G.和Tager,H.S.1989.Role of the phenylalanine B24side chain in directing insulin interaction with its receptor:Importance ofmain chain conformation(苯丙氨酸B24侧链在指导胰岛素与其受体相互作用中的作用:主链构象的重要性).J.Biol.Chem.264:6349-6354。
Sosnick,T.R.,Fang,X.和Shelton,V.M.2000.Application of circulardichroism to study RNA folding transitions(研究RNA折叠转换的圆二色性的应用).Methods Enzymol.317:393-409。
Wang,Z.X.1995.An exact mathematical expression for describingcompetitive biding of two different ligands to a protein molecule(用于描述两种不同配体与蛋白质分子竞争结合的准确数学表达式)FEBS Lett.360:111-114。
Weiss,M.A.,Hua,Q.X.,Jia,W.,Chu,Y.C.,Wang,R.Y.和Katsoyannis,P.G.2000.Hierarchiacal protein ″un-design″:insulin′sintrachain disulfide bridge tethers a recognition α-helix(等级蛋白质“设计解析”:胰岛素链内二硫键系链识别α-螺旋).Biochemistry 39:15429-15440。
Whittaker,J.和Whittaker,L.2005.Characterization of the functionalinsulin binding epitopes of the full length insulin receptor(全长胰岛素受体的功能性胰岛素结合表位的表征).J.Biol.Chem.280:20932-20936。
Xie,J.和Schultz,P.G.2005.An expanding genetic code(扩展遗传密码).Methods.36:227-238。
Claims (1)
1.一种胰岛素,其包含在B24位通过取代掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽。
2. 权利要求1的胰岛素,其中所述卤化苯丙氨酸是邻-一氟-苯丙氨酸、邻-一溴-苯丙氨酸或邻-一氯-苯丙氨酸。
3. 权利要求1-2中任一项的胰岛素,其中所述胰岛素是哺乳动物胰岛素。
4. 权利要求3的胰岛素,其中所述胰岛素是人胰岛素。
5. 权利要求3的胰岛素,其中所述B链多肽包含选自SEQ. ID. NOs. 4-8的氨基酸序列。
6. 一种核酸,其编码权利要求1-5任一项的胰岛素。
7. 权利要求6的核酸,其中所述卤化苯丙氨酸由终止密码子编码。
8. 权利要求7的核酸,其中所述终止密码子是核酸序列TAG。
9. 一种表达载体,其包含权利要求6、7或8的核酸序列。
10. 一种宿主细胞,其用权利要求9的表达载体转化。
11. 胰岛素或其生理学上可接受的盐在制备药物中的用途,其中所述胰岛素或其生理学上可接受的盐含有在B24位通过取代掺入卤化苯丙氨酸的B链多肽。
12. 权利要求11的用途,其中所述卤化苯丙氨酸是邻-一氟-苯丙氨酸、邻-一溴-苯丙氨酸或邻-一氯-苯丙氨酸。
13. 权利要求12的用途,其中所述B链多肽包含选自SEQ. ID. NOs. 4-8的氨基酸序列。
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NZ781774A (en) | 2019-03-08 | 2023-03-31 | Taro Pharma Ind | Stable topical compositions of fenoldopam |
WO2022226197A1 (en) * | 2021-04-22 | 2022-10-27 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human insulin c-alpha-peptides and methods of use |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6686177B1 (en) * | 1998-06-06 | 2004-02-03 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Insulin analogs with enhanced zinc binding |
US7316999B2 (en) * | 2000-06-02 | 2008-01-08 | Novo Nordisk A/S | Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5149777A (en) | 1988-07-20 | 1992-09-22 | Novo Nordisk A/S | Human insulin analogs and preparations containing them |
US5474978A (en) | 1994-06-16 | 1995-12-12 | Eli Lilly And Company | Insulin analog formulations |
RU2204411C2 (ru) * | 1996-06-20 | 2003-05-20 | Ново Нордиск А/С | Инсулиновые препараты, содержащие углеводы |
US20050014679A1 (en) * | 2001-12-20 | 2005-01-20 | Beals John Michael | Insulin molecule having protracted time action |
WO2007081824A2 (en) | 2006-01-06 | 2007-07-19 | Case Western Reserve University | Fibrillation resistant proteins |
EP2074140B8 (en) | 2006-10-04 | 2015-10-28 | Case Western Reserve University | Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues |
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US6686177B1 (en) * | 1998-06-06 | 2004-02-03 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Insulin analogs with enhanced zinc binding |
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Non-Patent Citations (1)
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Helix Propensity of Highly Fluorinated Amino Acids;Hsien-Po Chiu等;<J. AM. CHEM. SOC.>;20061115;第15556-15557 * |
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