KR20180097517A - 매우 안정된 인슐린 유사체의 중합체 용융물 내 캡슐화 - Google Patents

매우 안정된 인슐린 유사체의 중합체 용융물 내 캡슐화 Download PDF

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Abstract

인슐린 조성물은 인슐린 유사체 및 중합체 블렌드를 포함한다. 상기 인슐린 유사체는 (시스틴 B4-A10을 형성하기 위한) 위치 B4 및 A10에서의 시스테인 치환, 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적 치환을 포함한다: 인슐린 A 및 B 도메인 사이의 5 내지 11개 아미노산의 연결 도메인; 위치 A8에서의 비-베타-분지형 아미노산 치환; 위치 A14에서의 비-베타-분지형 산성 또는 극성 측쇄; 오르토 위치에서의 PheB24의 할로겐 변형; 및 Glu, Ala, Val, Ile, Leu, 아미노-프로피온산, 아미노-부티르산 또는 노르류신에 의한 B29 위치에서의 리신의 치환. 상기 인슐린 유사체는 90℃ 내지 120℃의 온도 범위에서의 하나 이상의 단계를 포함하는 제조 공정에 적합하다. 캡슐화된 인슐린 유사체는 유리 PEG를 선택적으로 함유하거나 페길레이트될 수 있다. 인슐린 유사체-캡슐화된 중합체 블렌드는 국소 투여용 마이크로 바늘 패치 또는 피하 주사용 마이크로 펠릿으로 주조될 수 있다.

Description

매우 안정된 인슐린 유사체의 중합체 용융물 내 캡슐화
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2015년 12월 23일 출원되어 계속중인 미국 가출원 제62/387,459호의 이익을 주장한다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 허가 번호 DK040949 및 DK074176하에 미국 국립 보건원에 의해 수여된 협력 협정에 의한 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 상온 이상에서 응집 결합된 미스폴딩(misfolding) 및 열세동에 대한 증강된 저항성을 포함한 향상된 열적 및 열역학적 안정성을 나타내는 폴리펩티드 호르몬 유사체의 중합체 캡슐화에 관한 것이다.
상기와 같은 향상된 안정성으로 인해 호르몬 유사체는 90℃ 내지 120℃ 범위의 온도가 필요한 단계를 갖는 제조 공정에 따른 활성을 유지할 수 있게 된다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 두 개의 더 안정화된 성분으로 이루어진 매우 안정된 인슐린 유사체의 중합체 용용물을 이용한 캡슐화에 관한 것으로, 상기 안정화 성분 중의 하나는 잔기 B4 및 A10 사이의 추가적인 이황화 가교이다. 제2 성분은 다음의 것들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 요소로 구성된다: (a) A와 B 도메인 사이의 단축된 연결 (C) 도메인; (b) 알파-나선형 C-CAP A8 위치에서의 비-베타-분지형 아미노산 치환; (c) A14에서의 비-베타-분지형 산성 또는 극성 측쇄; (d) 오르토 위치(고리 위치는 위치 6 중의 2; 불소, 염소 또는 브롬으로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐)에서의 PheB24의 방향족 고리의 할로겐 변형; 및/또는 (e) 아르기닌, 글루탐산, 또는 중성 지방족 측쇄(Ala, Val, Ile 및 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택됨)를 갖는 천연 아미노산 또는 중성 지방족 측쇄(아미노-프로피온산, 아미노-부티르산, 또는 노르류신)를 갖는 인공 아미노산 측쇄에 의한 LysB29의 치환. 선택적으로, 2-사슬 또는 단일-사슬 유사체에서, N-말단 잔기(잔기 B1, 잔기 B1 및 B2, 또는 잔기 B1 내지 B3을 포함)는 B 사슬(또는 B 도메인)로부터 결실될 수 있고, AsnA21은 Asp, Ala, Gly 또는 Ser에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. 기술된 내용에 따르면, 중합체 블렌드에서 보다 균일한 분포를 보장하기 위해서 SCI, A 사슬 또는 B 사슬의 N-말단은 페길화(PEGylation)함으로써 선택적으로 변형될 수 있다(Lee, P. 외, Macromol. Biosci. 15: 1332-7 (2015)).
인슐린 투여는 당뇨병 치료법으로 오랫동안 확립되어 왔다. 당뇨병 환자에 대한 종래 인슐린 보충 요법의 주요 목표는 건강한 인간 피험자의 정상 범위 특성을 초과 또는 미달하여 이탈되지 않도록 혈당 농도를 통제하는 것이다. 정상 범위 미만으로 이탈하는 것은 갑작스런 아드레날린적 또는 신경저혈당적 증상과 관련이 있으며 심한 경우에는 경련, 혼수상태 및 사망을 초래한다. 정상 범위를 초과하여 이탈하는 것은 망막장애, 실명 및 신부전을 포함한 미세혈관 질환에서 장기적인 위험이 증가하는 것과 관련이 있다. 제1형 당뇨병 치료는 기저 인슐린 제형(또는 지속형 인슐린 유사체 제형) 및 식이 인슐린 제형(또는 속효성 인슐린 유사체 제형)을 조합하여 피하 주사로 투여하는 것이 일반적으로 필요한 반면, 대다수의 제2형 당뇨병은 기저 인슐린 제형(또는 지속형 인슐린 유사체 제형)로만 처치할 수 있다. 본 발명은 이러한 기저 인슐린 치료에 관한 것이다.
인슐린은 척추 동물의 신진대사에 있어 중추적인 역할을 하는 작은 구상 단백질이다. 인슐린은 2개의 사슬을 포함하는데, A 사슬은 21개의 잔기를 함유하며 B 사슬은 30개의 잔기를 함유한다. 호르몬은 췌장 β-세포에 Zn2 +안정화된 육량체로 저장되지만 혈류에서는 Zn2 +가 없는 단량체로 작용한다. 인슐린은 단일 사슬 전구체, 즉 프로인슐린의 산물로서, 연결 영역(35 잔기)이 B 사슬(잔기 B30)의 C-말단 잔기를 A 사슬의 N-말단 잔기까지 연결한다(도 1a). 인슐린이 인슐린 유사 코어와 무질서한 연결 펩티드로 구성된다는 것은 다양한 증거에서 나타난다(도 1b). 3개의 특정 이황화 가교(A6-A11, A7-B7, 및 A20-B19; 도 1a 및 도 1b)의 제형은 거친 소포체(ER)에서 프로인슐린의 산화성 폴딩에 결합되는 것으로 간주된다. 프로인슐린은 ER에서 골지체로의 전달(export) 직후에 가용성 Zn2 +배위 육량체를 형성하도록 조립된다. 인슐린으로의 내단백질 분해성(endoproteolytic) 소화 및 변환은 형상 응축(morphological condensation)을 동반하는 미성숙 분비 과립 상태에서 발생한다. 성숙한 저장 과립 내의 아연 인슐린 육량체의 결정 배열을 전자 현미경(EM)을 사용하여 시각화하였다. 도 1c에는 인슐린의 서열이 개략적인 형태로 도시되어 있다. 개별 잔기는 아미노산 식별(통상적으로 표준 3자리 코드를 사용), 사슬 및 서열 위치(통상적으로 위첨자로)로 표시된다. 본 발명은 인간 프로인슐린의 36잔기 야생형 C 도메인의 특징 대신에 6 내지 11개의 잔기 길이를 갖는 신규한 단축 C 도메인에 관한 것이다.
액상 또는 미정질 제형의 인슐린 및 종래 인슐린 유사체는 물리적 분해 및 화학적 분해 모두에 민감하다. 물리적 분해가 원섬유의 형성을 야기하는 반면, 화학적 분해는 분자 내의 원자 재배치의 손실을 수반하는 화학적 결합의 파손과 연관되거나 상이한 인슐린 분자들간의 화학 결합의 형성과 연관된다. 물리적 및 화학적 열화는 상온을 초과하는 경우 현저하게 가속되며 55℃를 초과하면 더욱 가속된다. 이러한 분해는 생물학적 활성을 저해한다. 액상 또는 미정질 제형에서 다양한 분해 형태에 대한 인슐린 및 종래 인슐린 유사체의 민감성으로 인해 90℃ 내지 120℃의 온도 범위에서 하나 이상의 제조 단계를 필요로 하는 중합체 용융물 내에서의 캡슐화가 방지되는 현상이 최근 발생하고 있다. 이러한 중합체 용융물의 예로는 폴리(락트산-코-글리콜산(PL-GA; 50:50을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 분자비)이 있는데, 볼밀 또는 모르타르를 이용해 분말로 분쇄할 수 있고 고체 상태로 동결 건조된 SCI(또는 종래의 2사슬 인슐린 유사체)와 함께 빻아서 혼합할 수 있다. (매우 안정한 인슐린 유사체가 로딩된) 혼합된 분말은 90℃ 내지 120℃의 온도 범위에서 최소 10분 동안 용융 공정에서 압출될 수 있으며 상온에서 고화될 수 있다. 이러한 중합체 용융물는 피부용 마이크로 바늘 및 피하 주사용 마이크로 펠릿을 함유하는 시트를 포함하는 다양한 형태로 주조될 수 있다. PL-GA는 독성이 없으며 체내에서 비독성 분해 생성물에 대한 용해 속도가 느려 다양한 의료 기기 및 약제 전달 시스템에서 사용이 가능하다고 당업계에 알려져 있다(Ahmed, T. (2015); Ortega-Oller, I., 외(2015); 및 Rahimian, S., 외(2015)). 이에, 의료 기기의 용도로 미국 식약청(FDA)의 승인을 받았다.
본 발명은 당뇨병을 치료하기 위한 인슐린 대체 요법의 편의성, 안전성 및 효능을 향상시키기 위해 주 1회, 격월 또는 월 1회 인슐린 유사체의 전달 방법을 위한 기저 조작을 하고자 하는 의학적 및 사회적 수요에 의해 동기 부여를 받은 것이다.
따라서, 본 발명의 일측면에 따르면, 90℃ 내지 120℃의 온도 범위에서 하나 이상의 필수 단계를 포함하는 제조 공정 후에 생물학적 활성을 유지하기에 충분한 열적 및 열역학적 안정성을 갖는 2사슬 또는 단일 사슬 인슐린 유사체의 중합체 용융물을 제공한다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 두 개의 더 안정화된 성분으로 이루어진 매우 안정된 인슐린 유사체의 중합체 용용물을 이용한 캡슐화에 관한 것으로, 상기 안정화 성분 중의 하나는 잔기 B4 및 A10 사이의 추가적인 이황화 가교이다. 제2 성분은 다음의 것들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 요소로 구성된다: (a) A와 B 도메인 사이의 단축된 연결 (C) 도메인; (b) 알파-나선형 C-CAP A8 위치에서의 비-베타-분지형 아미노산 치환; (c) A14에서의 비-베타-분지형 산성 또는 극성 측쇄; (d) 방향족 측쇄의 오르토 위치(고리 위치는 위치 6의 2; 불소, 염소 또는 브롬으로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐)에서의 PheB24의 방향족 고리의 할로겐 변형; 및/또는 (e) 글루탐산, 또는 중성 지방족 측쇄(Ala, Val, Ile 및 Leu의 군으로부터 선택됨)를 갖는 천연 아미노산 또는 중성 지방족 측쇄(아미노-프로피온산, 아미노-부티르산, 또는 노르류신)를 갖는 인공 아미노산 측쇄에 의한 LysB29의 치환. 선택적으로, 2사슬 또는 단일 사슬 유사체에서, 잔기 B1 또는 B2는 B 사슬(또는 B 도메인)로부터 결실될 수 있고, AsnA21은 Asp, Ala, Gly 또는 Ser에 의해 선택적으로 치환될 수도 있다.
본 발명의 유사체는 위치 B10에 히스티딘을 함유하므로, 이 위치에서 산성 치환(아스파르트산 또는 글루탐산)과 관련된 발암성에 관한 우려를 피하게 된다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, IR-A 및 IR-B에 대한 2사슬 또는 단일 사슬 인슐린 유사체의 절대적 체외 유사성이 야생형 인간 인슐린에 비해 5% 내지 150%의 범위에 있기 때문에, 호르몬-수용체 복합체에서 상당히 연장된 체류 시간을 나타날 가능성은 적다.
따라서, 본 발명에 따르면, 하나 이상의 변형(b-e)을 포함하는 3개의 이황화 가교(천연 가교 B7-A7과 B19-A20, 및 조작된 가교 B4-A10; 및 추가된 A 사슬 내의 시스틴 A6-A11)에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드 사슬(A 및 B로 표시됨)로 이루어진 인슐린 유사체의 중합체 용융물 내의 캡슐화가 예상된다. 추가적으로, 본 발명의 범위에는 4개의 이황화 가교(B4-A10, B7-A7, B19-A20 및 A6-A11)를 함유하는 단일 사슬 인슐린 유사체(SCI)들의 중합체 용융물 캡슐화 및 하나 이상의 변형(a-e)이 포함된다. 상기 SCI는 N-말단의 2개 잔기가 하나 이상의 산성 잔기를 함유하는 5 내지 11개 잔기의 길이를 갖는 단축된 연결 도메인을 포함한다. 본 발명의 중합체 용융물과 함께 함유된 2사슬 또는 단일 사슬 인슐린 유사체는 A 또는 B 도메인 내의 다른 부위에 표준 또는 비표준 아미노산 치환을 선택적으로 함유할 수 있다.
B4 및 A10 위치(야생형 2사슬 인슐린에서 정의된 바와 같음) 사이의 제4 이황화 가교 자체의 가능성은 활성 SCI의 맥락에서는 당업계에 공지되어 있지 않다. 이러한 제4 이황화 가교를 함유하는 인슐린 유사체도 중합체 캡슐화를 위한 목적의 다른 안정화 성분과 관련하여 2사슬 또는 단일 사슬 유사체로서 공지되어 있지 않다.
치료제와 백신을 포함한 비표준 단백질 조작은 광범위한 의학적 및 사회적 이점을 가질 수 있다. 자연 발생하는 단백질은 - 인간, 기타 포유류, 척추 동물, 무척추 생물 또는 진핵 세포의 게놈에 일반적으로 암호화되어 - 다양한 생물학적 활성을 부여하기도 한다. 비표준 단백질의 이점은 생물학적 활성을 잃지 않고 중합체 용융물 내에 캡슐화할 수 있도록 충분한 열적 및 열역학적 안정성을 구현할 수 있다는 것인데, 그 제조 공정에는 90℃ 내지 120℃ 온도 범위에서 하나 이상의 단계를 포함한다. 한편, 사회적 이점의 다른 예로는 중합체 용융물을 함유하는 인슐린 유사체를 사용함으로써 인간 환자 또는 개나 고양이(그러나 이에 국한되지는 않음) 등의 기타 포유 동물의 당뇨병을 치료하기 위한 중합체 용융물의 운송, 분배 및 사용을 용이하게 하는 것이다. 중합체 용융물을 함유하는 상기 인슐린 유사체는 피부에 적용되는 마이크로 바늘 패치로 제조됨으로써, 마이크로 바늘이 느리게 용해되어 적어도 1주일 또는 최대 1개월 동안 피하 인슐린 투여를 위한 장기적인 방법을 제공하게 된다. 또는, 중합체 용융물을 함유하는 인슐린 유사체는 주입 가능한 피하 주사용 용해성 마이크로 펠릿으로 제조될 수 있다; 마찬가지로 피하 공간 내에서 느리게 용해됨으로써 적어도 1주일 또는 최대 1개월 동안 인슐린의 서방성 저장소를 제공하게 된다.
본 발명의 사회적 이점은 발전 및 냉동이 일관되게 이용 곤란한 개발도상 지역에서 특히 두드러질 것이다. 인슐린 및 인슐린 유사체의 액체 및 미정질 제형의 물리적 분해로 인해 제기된 도전 과제는 1930년대에 처음 인지되었다. 이러한 도전 과제의 심각성은 아프리카와 아시아에서 확산된 당뇨병에 의해 지난 10년간 심화되었다. 적어도 하나의 다른 안정화 성분과 결합하여 B4 위치와 A10 위치 사이의 제4 이황화 가교를 함유하는 매우 안정된 2사슬 인슐린 유사체 또는 매우 안정화된 SCI의 중합체 캡슐화는 상기 도전 과제를 갖는 지역에서 인슐린 대체 요법의 안전성 및 효능을 개선할 수 있다.
도 1a는 측면으로 배치된 이염기성 절단 부위(채워진 원) 및 C-펩티드(비어있는 원)로 도시된 A- 및 B- 사슬 및 연결 영역을 포함하는 인간 프로인슐린(서열 번호 1) 염기서열의 개략도이다.
도 1b는 인슐린 유사 모이어티 및 무질서 연결 펩티드(파선)로 구성된 프로인슐린의 구조적인 모델이다.
도 1c는 이황화 가교의 장소 및 B-사슬에서의 B24 잔기의 위치를 표시하는 야생형 인간 인슐린 A-사슬(서열 번호 2) 및 B-사슬(서열 번호 3)의 염기서열을 나타내는 개략도이다.
도 2는 제4 이황화 가교에 의해 안정화된 SCI의 3차원 모델이다. 별표는 B4-A10 이황화 가교를 나타낸다. 2사슬 인슐린 유사체(즉, 2개의 개별 폴리펩티드 사슬에서 B4와 A10 위치 사이)에서 상응하는 조작된 시스틴은 위치 A8, A14, B24 또는 B29에서 하나 이상의 추가적인 안정화 변형과 조합될 수 있다.
도 3A는 제4 이황화 가교 블렌드 스트립을 갖는 SCI를 포함하는 변형된 인슐린의 단백질-중합체 블렌드가 수용된 유리 앰플(vial)의 사진이다(저부의 엄지/손가락은 크기 참조용).
도 3B는 도 3A에 도시된 단백질-중합체 블렌드로부터 제4 이황화 가교를 포함하지 않은 복구된 SCI에 대한 쥐의 혈당 수치를 나타낸 그래프이다.
도 3C는 도 3A에 도시된 단백질-중합체 블렌드로부터 제4 이황화 가교를 포함하는 복구된 변형 SCI에 대한 쥐의 혈당 수치를 나타낸 그래프이다.
도 4는 인산염 완충 식염수(pH 7.4 및 37℃)에서 PLGA 중합체(50%-50%)로부터 매우 안정된 단일 사슬 유사체(SCI)의 용출을 나타내는 그래프이다. 가로축은 침지 시간을 의미한다. 세로축은 난백 리소자임을 함유하거나(밝은 회색 사각형) 단백질이 없는(진한 회색 다이아몬드) 대조군 중합체에서의 인슐린 유사체(어두운 회색 삼각형) 또는 상대적인 Bradford 활성 물질의 나노그램을 의미한다. 후자는 비 단백질 물질로 인한 Bradford 분석에서 배경 신호를 나타낸다. 10일 내지 15일에서의 수평한 상태는 중합체에서 단백질이 더 이상 용출되지 않음을 나타낸다. 1일 내지 10일 사이의 SCI 용출에 대한 거의 선형의 비율을 최적화하기 위해 5% PEG(평균 분자량 8 kDa)로 시료를 제조하였다. 일부 재료의 즉각적 버스트 방출은 도시되지 않았다.
도 5는 당뇨 걸린 수컷 루이스쥐에 피하 주사한 후 시간 경과에 따른 (잔기 B4와 A10 사이의) 제4 이황화 가교가 존재하거나(사각형; 서열 번호 15) 존재하지 않는(회색 다이아몬드; 서열 번호 16) 57mer SCI에 대한 시간 경과에 따른 혈당 수치를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 열적 및 열역학적 안정성의 증가가 현저하게 나타나는 2사슬 또는 단일 사슬 인슐린 유사체의 중합체 용융물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 적어도 10분간 90℃ 내지 120℃의 온도 범위에서 (a) 진피 내에서 또는 포유 동물의 피하 공간 내에서 중합체의 용해에 대한 생물학적 활성의 손실없이, 또는 (b) 37℃에서 천천히 교반하면서 배양할 때 생체 내 완충액이나 희석된 산성 용액에 대한 또는 생리 완충액 내의 체외(in vitro) 중합체의 용해에 대한 생물학적 활성의 손실 없이 중합체 용융물 공정을 거칠 수 있다.
본 발명의 특징은, 인슐린 유사체의 등전점이 (i) 중성 pH에서 용액으로서 용해성 제조 중간체를 허용하도록 3.0 내지 6.0의 범위에 있거나, (ii) 산성 조건(pH 3.0 내지 5.5)에서 용해성 제형을 수득할 수 있도록 6.5 내지 8.0의 범위에 있다는 것이다. 후자의 유사체가 체내에서 중합체 용융물로부터 방출될 때, pH가 중성에 가까워짐으로 인해 피하 저장소에서 등전 침전을 겪을 것으로 예상된다. 이러한 침전은 하나 이상의 마이크로 바늘 또는 마이크로 펠릿이 모체 중합체 용융물의 벌크 성질에 따라 예상보다 갑자기 또는 그보다 더 빠르게 용해된다는 점에서 중합체 장치의 안전성을 향상시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 중합체는 폴리(락트산-코-글리콜산; PLGA), 폴리(카프로락톤), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(히드록시부티르산), 키토산, 폴리(세바신산), 폴리 무수물, 폴리포스파젠, 폴리(오르토에스테르), 폴리(락트산-코-카프로락톤), 폴리(히드록시 낙산염-발레르산염) 및 이들의 혼합물 및 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 폴리에틸렌 글리콜, NaCl, 및/또는 당과 같은 포로겐이 선택적으로 존재하여 중합체 조성물로부터 인슐린의 방출 속도를 조절할 수 있다.
중합체 분자량은 인슐린의 특정 용도 및 원하는 방출 속도에 대한 필요에 따라 선택될 수 있다. 일 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 등의 중합체 분자량은 그 평균 분자량이 200 달톤 미만, 200~1000 달톤, 1000~4500 달톤, 4500~9000 달톤, 9000~15000 달톤, 15000~25000 달톤, 또는 25000 달톤 초과일 수 있다. 특정 일 실시예에서, 약 8000 달톤의 PEG가 사용될 수 있다.
단일 사슬 또는 2사슬 인슐린 유사체는 비한정적인 예로서 돼지, 소, 말 및 개 인슐린과 같은 동물성 인슐린 유래의 A- 및 B- 사슬 염기서열로 제조될 수 있다고 보여진다. 추가적으로 또는 선택적으로, 본 발명의 인슐린 유사체는 잔기 B1, 잔기 B1-B2, 또는 잔기 B1-B3의 결실을 포함할 수 있으며, 또는, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisciae) 또는 기타 효모 발현종 또는 균주에서의 효모 생합성에서 전구체 폴리펩티드의 Lys-유도된 단백질 가수분해를 회피하도록 리신이 결핍된 변이체 B 사슬과 결합될 수 있다. 이론에 의해 제약되는 것을 바라지 않지만, A8 위치에서의 비-베타-분지된 치환은 알파-나선 내에서 및/또는 알파-나선의 C-말단 위치에서 2사슬 인슐린 유사체 및 SCI의 더욱 최적화된 특성으로 인한 물리적 및 화학적 분해로부터 2사슬 인슐린 유사체 및 SCI를 보호할 것으로 예상된다. 안정화 A8 치환의 예에는 아르기닌, 글루탐산 및 히스티딘이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이론에 의해 제약되는 것을 바라지 않지만, 위치 A14에서 하전되거나 극성을 갖는 비-베타-분지된 치환은 야생형 인간 인슐린에서 TyrA14의 용매 노출과 관련된 역-소수성 효과의 감소로 인한 물리적 및 화학적 분해로부터 2사슬 인슐린 유사체 및 SCI를 보호할 것으로 예상된다. 금지된 안정화 성분들의 세트 중에서, PheB24의 2 고리 위치에서의 할로겐 변형(즉, 오르토-F-PheB24,오르토-Cl-PheB24,또는 오르토-Br-PheB24;세동에 대한 열역학적 안정성 및 저항성을 높이기 위함)은 화학적 분해 및 물리적 분해로부터 보호하는 분자 메커니즘을 제공할 것으로 예상된다. 마찬가지로, (LysB29에 의해 제공된) B29 위치에서의 자연 발생 양전하를 제거하는 것은 상승된 온도에서의 세동에 대한 시스틴 B4-A10을 함유하는 2사슬 인슐린 유사체 또는 시스틴 B4-A10을 함유하는 SCI의 저항성을 점진적으로 향상시킬 것으로 예상된다. B29 치환은 글루탐산 또는 중성 지방족 표준 또는 비표준 아미노산일 수 있다. 표준 중성 지방족 잔기는 Ala, Val, Ile 또는 Leu로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 비표준 잔기는 아미노-프로피온산, 아미노-부티르산 또는 노르류신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 인간 인슐린과 동물성 인슐린 간에 유사성이 있고 종래 당뇨병 환자에게 동물성 인슐린을 사용했다는 관점에서, 인슐린의 염기서열에 대한 기타 부차적인 변형이 도입될 수 있으며, 특히, 이러한 치환은 "보수적인(conservative)" 것으로 간주된다. 예컨대, 아미노산의 추가적인 치환은 본 발명의 범주 내에서는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹으로 이루어질 수 있다. 이들은 중성의 소수성 아미노산을 포함한다: Alanine(Ala 또는 A), 발린(Val 또는 V), 류신(Leu 또는 L), 이소류신(Ile 또는 I), 프롤린(Pro 또는 P), 트립토판(Trp 또는 W), 페닐알라닌(Phe 또는 F) 및 메티오닌(Met 또는 M). 마찬가지로, 중성의 극성 아미노산은 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 티로신(Tyr 또는 Y), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Glu 또는 Q) 및 아스파라긴(Asn 또는 N) 중에서 서로 치환될 수 있다. 염기성 아미노산은 리신(Lys 또는 K), 아르기닌(Arg 또는 R) 및 히스티딘(His 또는 H)을 포함하는 것으로 간주된다. 산성 아미노산은 아스파르트산(Asp 또는 D) 및 글루타민산(Glu 또는 E)이다. 별도로 언급하지 않는 한 또는 문맥상 명백한 경우를 제외하고는 본 명세서에 언급된 아미노산은 L-아미노산으로 간주되어야 한다. 표준 아미노산은 동일한 화학적 분류에 속하는 비표준 아미노산으로 대체될 수도 있다. 비한정적인 예로서, 염기 측쇄 Lys는 더 짧은 측쇄 길이를 갖는 염기성 아미노산(오르니틴, 디아미노 부티르산 또는 디아미노 프로피온산)으로 대체될 수 있다. Lys는 중성 지방족 동배체 노르루신(Nle)으로 대체 될 수도 있으며, 이는 더 짧은 지방족 측쇄를 함유하는 유사체(아미노 부티르산 또는 아미노 프로피온산)에 의해 교대로 대체될 수 있다.
예컨대, 단백질-PG-LA 중합체 블렌드는 인슐린 lispro(서열 번호 2 및 13), CysA10,CysB4치환을 추가로 함유하는 lispro 인슐린 유사체(LysB28,ProB29;인간 인슐린)(서열 번호 2 및 14), 59 아미노산 잔기의 SCI(서열 번호 9), 및 잔기 B4 및 A10 사이의 제4 이황화 가교를 함유하는 CysA10,CysB4치환으로 변형된 상응하는 59mer SCI(서열 번호 10)를 포함하여 제공된다. 이들 SCI는 서열 EEGSRRSR의 C 도메인을 포함한다. A 도메인은 트레오닌 대신 아르기닌을 함유하도록 A8에서 변형되었다. B 도메인은 효모 피키아 파스토리스에서의 프로테아제 소화를 회피하기 위해서 리신 대신 아르기진을 함유하도록 변형되었다. 따라서, 이러한 SCI의 등전점은 6.5 내지 7.5의 범위 내에 있지만 pH 2 내지 pH 4 범위에서 쉽게 용해된다. 인슐린 수용체의 A- 및 B- 이형(isoform)에 대한 친화성은 야생형 인간 인슐린에 비해 10% 내지 150%의 범위 내에 있는 반면, 제1형 IGF 수용체에 대한 친화성은 야생형 인슐린보다 10배 낮다. 도 2에는 SCI의 3차원 모델 및 시스테인 B4-A10의 예상 위치가 도시되어 있다.
상기 3종의 중합체 블렌드를 스트립 형태로 주조하였다(도 3A). 중합체를 20℃에서 0.01% 트리플루오로 아세트산에 2일 동안 용해시켜 기능성 호르몬의 잠재적 회복을 평가하였다. 활성 lispro가 전혀 회복되지 않은 반면, 쥐 시험에서는 SCI가 40%까지 회복되었고(도 3B), 제4 이황화 가교를 함유한 기능적으로 변형된 SCI가 근본적으로 완전히 회복되었다(도 3C). 고온 단백질-중합체 블렌드 압출에 대한 상기 "극도로 안정된" 인슐린 유사체의 강건성은 당뇨병의 치료를 위해 장기간 용해 가능한 치료용 중합체 블렌드를 제공하는 기술로서 탁월한 가능성을 갖는다. 상기 예시에서 약 pH 7.4의 등전점을 나타내는 단일 사슬 인슐린 유사체를 사용함을 유의해야 한다. 이는 기저 PK/PD 특성을 미래의 안전 메커니즘으로 이용할 수 있음을 의미한다. 즉, 마이크로 바늘이 뭉개져 급속하게 피하에 용해되면 방출된 유사체가 급성 저혈당을 회피하면서 침전하게 된다.
pH 7.4의 인산 완충 식염수(PBS)에서 중합체 용융물로부터 인슐린 유사 단백질이 용출되는 것도 확인되었다. 잔기 B4와 A10 사이의 제4 이황화 가교에 의해 안정화된 25 중량/중량 퍼센트의 단일 사슬 인슐린(SCI) 유사체를 함유하는 50%-50% PLGA로 시험 원통형 중합체를 제조하였다. 유사체(4SS-81-06; 서열 번호 12로 표시됨)는 서열 EEGPRR의 6-잔기 링커, A 도메인에서의 2개의 치환(His에 의한 ThrA8의 치환 및 Glu에 의한 TyrA14의 치환) 및 B 도메인에서의 1개의 치환(Glu에 의한 LysB29의 치환)을 포함한다. 혼합 분말을 섭씨 95도까지 10분 동안 가열한 후 특수 사출기를 사용하여 신속히 가압하여 압출시켰다. 0%, 5% 또는 10%의 폴리에틸렌 글리콜(PEG; 평균 분자량 8 kDa)을 함유하는 PL, GA 및 SCI 분말의 혼합물을 사용하여, 압출된 중합체 실린더(직경 1 mm 및 길이 8 mm; 10 mg)를 제조하였다. 상기 중합체로부터 SCI의 방출 속도에 대한 유리 PEG 분자의 효과를 시험하기 위해, 완충액을 매일 교체하면서 부드럽게 흔들면서 pH 7.4 및 37℃의 인산 완충 식염수에 실린더를 위치시켰다. 매일 500 마이크로 리터의 용액을 수집하였고 (0.1%의) 아지드화 나트륨과 함께 500 uL의 신선한 PBS로 대체하였다. 0일차 오후에 중합체를 용액에 넣고 대략 24 시간마다 시료를 수집했다. 0일차 시료는 중합체가 용액에서 침지된 직후(5분 미만) 수집했다.
작은 단백질이 10일 동안의 과정에서 PEG 없이(0%) 방출되는 반면, PEG 10% 첨가시 1일 내지 2일 동안의 실질적인 방출로 이어진다. PEG 5% 첨가시 10일 동안 로딩된 단백질의 절반 정도를 거의 선형으로 방출하였다(도 4의 삼각형: ELISA로 보정된 Bradford 분석으로 측정한 인슐린 유사체 함량). 인슐린 유사체를 대신하여 난백 리소자임을 함유하는 유사 공중합체의 대조군 연구에서 유사한 용출 프로파일이 관찰되었다(도 4의 사각형; 임의 단위). 두 경우 모두 수평한 상태가 10일 내지 15일간 관찰되었으며, 중합체로부터 더 이상 단백질이 방출되지 않았다. 또한, 방출된 단백질의 누적량은 아래의 표 1에 제시되어 있다. 이 표에서 Bradford 분석에 대응되는 인슐린의 마이크로그램은 ELISA에 의해 입증된 반면에, 리소자임에 대한 판독은 독립적인 분석에 의해 보정되지 않았다.
일차 A (순 PLGA) B ( Lysozyme + 5%PEG) C (8106-4SS + 5%PEG)
0 0.0104 0.0432 0.024
1 -0.0071 0.135 0.1766
2 0.0036 0.2289 0.2504
3 0.0127 0.2759 0.2896
4 0.0213 0.3104 0.3184
5 0.0365 0.3383 0.3574
6 0.0546 0.3978 0.4316
7 0.0482 0.3987 0.455
8 0.0574 0.44 0.5197
9 0.0679 0.5212 0.6054
10 0.0809 0.6783 0.7418
11 0.0828 0.7366 0.7452
12 0.0795 0.7297 0.7185
13 0.0802 0.7556 0.7246
14 0.0802 0.7556 0.7246
15 0.0915 0.7718 0.7387
단백질 방출 일간 누적량
(5% PEG로 제조된 중합체 용융물에서의) 방출된 SCI 호르몬 유사체의 생물학적 활성을 당뇨병 수컷 루이스쥐(평균 체중 약 300 g; 약 400 mg/dl의 평균 혈당을 갖는 스트렙토조토신에 의해 당뇨병화 됨)에서 실험하였다; 버진 SCI의 혈당 저하 활성을 1일 및 5일 후에 용출된 단백질의 활성과 비교하였다. 이러한 3가지 시료들의 생물학적 활성은 상호간에 불분명했는데, 이는 체온상의 생리 완충액에서 열용융 압출 및 방출하는 공정이 효능 손실과 무관함을 입증하고 있다.
인슐린 처음 30분 동안의 시간당 델타값 SE 처음 1시간 동안의 시간당 델타값 SE 동물의 수
C-1 (PLGA + 25% 4SS-81-06 + 5% PEG; 20㎍) -320.10 48.90 -315.11 6.96 2
C-5 (PLGA + 25% 4SS-81-06 + 5% PEG; 5㎍) -312.60 22.20 -224.36 2.36 2
인슐린 30분에서의 기준선 백분율 SE 60분에서의 기준선 백분율 SE 동물의 수
C-1 (PLGA + 25% 4SS-81-06 + 5% PEG; 20㎍) 0.6296 0.0504 0.2964 0.0014 2
C-5 (PLGA + 25% 4SS-81-06 + 5% PEG; 5㎍) 0.950 0.005 0.814 0.043 2
57mer SCI (81-04로 표기; 서열 번호 16) 및 제4 이황화 가교를 포함하는 그 유도체(4SS 81-04; 서열 번호 15)의 생물학적 활성을 비교하였다. 300g 쥐 1마리당 20 마이크로그램을 투여할 때 생물학적 활성은 본질적으로 동일하다(도 5 참조). 81-04의 염기서열은 CysA10,CysB4가 없는 경우를 제외하고는 서열 번호 12의 염기서열과 유사하다; 또한, 잔기 B28은 아스파르트산이고 잔기 B29는 프롤린이다. 이는 단일 사슬 인슐린 유사체 분자에 제4 이황화 가교를 도입해도 SCI의 근본적인 생물학적 활성이 변경되지 않는다는 것을 나타낸다. 이는 2사슬 유사체에서 제4 이황화 가교가 도입될 때 약역학 반응이 현저하게 연장된다는 종래 기술의 관점에 있어서 주목할만 한 것이다.유사체 81-04 및 유사체 4SS 81-04의 수용체-결합 친화성도 판단되었다. 인슐린 수용체의 A 이형에 대한 4SS 81-04의 친화성은 인간 인슐린에 비해 120 ± 20%인 것으로 판단되었다(오차를 고려하면 야생형 인간 인슐린과 실제로 동일할 수 있다; 데이터 미도시). 인슐린 수용체의 B 이형에 대한 그 친화성은 야생형 인간 인슐린에 비해 5 배 내지 10 배 감소한다. A 이형에 대한 선호도는 81-04 모체 유사체의 선호도와 유사하다. 게다가, 미토겐의 IGF 제1형 수용체(IGF-1R)에 대한 4SS 81-04의 친화성은 야생형 인간 인슐린에 비해 5배 내지 10배 감소한다(데이터 미도시). 상기와 같은 IGF-1R에 대한 손상된 결합은 장기간 사용시의 잠재적 발암성이라는 관점에서 바람직한 것이다.
본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 염기서열은 아래와 같이 제공된다. 비교 목적상, 인간 프로인슐린의 아미노산 염기서열은 서열 번호 1로 제공된다.
서열 번호: 1(인간 프로인슐린)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 A 사슬의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 제공된다.
서열 번호 2(인간 A 사슬)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 제공된다.
서열 번호 3(인간 B 사슬)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
본 발명의 단일 사슬 인슐린 유사체의 아미노산 서열이 위치 B4 및 A10의 제4 시스테인을 함유하며 길이 56, 57, 58, 59, 60, 61 및 62의 폴리 펩타이드에 대응되는 서열 번호 4에 주어짐으로써, 상기 지시된 위치들 중 하나 이상에서 SCI는 다른 안정화 변형을 적어도 하나 포함하게 된다.
서열 번호 4
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-[단축된 C 도메인]-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa3-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Xaa4-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa5
이때, Xaa1은 오르토 또는 2-고리 위치의 할로겐 원자(F, Cl 또는 Br)에 의한 Phe 또는 Phe 변형을 나타낸다; Xaa2는 Glu, Ala, Ile, Leu, Val, 노르류신, 아미노-프로피온산 또는 아미노-부티르산을 나타낸다; Xaa3은 His, Glu, Lys, Arg, 또는 기타 비-베타-분지형 극성 또는 하전된 아미노산이다; Xaa4는 Tyr(야생형 인슐린에서처럼), Glu 또는 기타 비-베타-분지형 극성 또는 하전된 아미노산이다; 그리고 선택적으로, Xaa5는 Gly, Ala, Asp 또는 Ser이다. "단축된 C 도메인"이라는 괄호 안의 용어는 제1(N-말단) 또는 제2 펩티드 위치에서의 산성 잔기를 포함하는 길이 5-11 잔기의 연결 펩티드 도메인을 지칭한다(즉, 단일 사슬 인슐린 유사체의 31 또는 32 잔기). 선택적으로, des-B1 유사체를 생성하기 위해 PheB1이 결실되거나, des-[B1, B2] 유사체를 생성하기 위해 PheB1 및 ValB2 모두가 생략될 수 있다.
본 발명의 2사슬 인슐린 유사체의 아미노산 서열은 위치 B4(서열 번호 5, 7 및 8)에서의 시스테인을 함유하는 B 사슬 및 A10(서열 번호 6)에서의 시스테인을 함유하는 A 사슬에 해당되는 서열 번호 5 내지 8에 주어짐으로써, 온전한 인슐린 유사체는 위치 B4 및 A10 사이의 제4 이황화 가교 및 지정된 위치에서의 하나 이상의 기타 안정화 변형을 포함한다.
서열 번호 5(변이체 B 사슬)
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
이때, Xaa1은 오르토 또는 2-고리 위치의 할로겐 원자(F, Cl 또는 Br)에 의한 Phe 또는 Phe 변형을 나타낸다; Xaa2는 Glu, Ala, Ile, Leu, Val, 노르류신, 아미노-프로피온산 또는 아미노-부티르산을 나타낸다.
서열 번호 6(변이체 A 사슬)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa3-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Xaa4-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa5
Xaa3은 His, Glu, Lys, Arg, 또는 기타 비-베타-분지형 극성 또는 하전된 아미노산이다; Xaa4는 Tyr(야생형 인슐린에서처럼), Glu 또는 기타 비-베타-분지형 극성 또는 하전된 아미노산이다; 그리고 선택적으로, Xaa5는 Gly, Ala, Asp 또는 Ser이다.
서열 번호 7(변이체 des-[B1]-B 사슬)
Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
이때, Xaa1은 오르토 또는 2-고리 위치의 할로겐 원자(F, Cl 또는 Br)에 의한 Phe 또는 Phe 변형을 나타낸다; Xaa2는 Glu, Ala, Ile, Leu, Val, 노르류신, 아미노-프로피온산 또는 아미노-부티르산을 나타낸다.
서열 번호 8(변이체 des-[B1, B2]-B 사슬)
Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
이때, Xaa1은 오르토 또는 2-고리 위치의 할로겐 원자(F, Cl 또는 Br)에 의한 Phe 또는 Phe 변형을 나타낸다; Xaa2는 Glu, Ala, Ile, Leu, Val, 노르류신, 아미노-프로피온산 또는 아미노-부티르산을 나타낸다. 단일 사슬 인슐린(SCI) 유사체는 서열 번호 9-12, 15 및 16으로 제공된다.
서열 번호 9
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Arg-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Arg-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 10
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Arg-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Arg-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 11
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 12(81-066-4SS)
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 13(인간 B 사슬, KP)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 14(인간 B 사슬, Cys B4, KP)
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 15(4SS 81-04; 57mer)
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 16(81-04; 57mer)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
상기 개시된 바에 의하면, 제공된 단일 사슬 인슐린 유사체가 전술한 목적을 수행할 것이라는 점은 명백하다. 즉, 이들 인슐린 유사체는 (연장된 작용을 부여하는) 바람직한 약동학 및 약역학 특성을 유지하고 야생형 인슐린의 생물학적 활성의 적어도 일부분을 유지하면서, 세동에 대한 향상된 저항성을 나타낸다. 그러므로, 어떠한 변형된 증거도 청구된 본 발명의 범위 내에 있는 것이며, 따라서 특정 구성 요소의 선택은 본 명세서에 개시되고 설명된 본 발명에 사상을 벗어나지 않는 범위에서 결정될 수 있는 것으로 이해되어야 할 것이다.
하기 문헌은 본 명세서에 기술된 시험 및 분석 방법을 당업자가 이해할 수 있도록 인용되었다.
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Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 4 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Phe or an ortho halogenated Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Glu, Ala, Ile, Leu, Val, Norleucine, amino propionic acid or amino butryic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(41) <223> Xaa is 5 11 of any amino acid with the provison that the Xaa at 31 or 32 contains an acidic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is His, Glu, Lys, Arg, or another non beta branched polar or charged amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Tyr, Glu or another non beta branched polar or charged amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa is Asn, Gly, Ala, Asp or Ser <400> 4 Phe Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 35 40 45 Xaa Ser Cys Cys Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 50 55 60 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is Phe or an ortho halogenated Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Glu, Ala, Ile, Leu, Val, Norleucine, amino propionic acid or amino butryic acid <400> 5 Phe Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 20 25 30 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is His, Glu, Lys, Arg, or another non beta branched polar or charged amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is Tyr, Glu or another non beta branched polar or charged amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Asn, Gly, Ala, Asp or Ser <400> 6 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Cys Cys Ser Leu Xaa Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Phe or an ortho halogenated Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Glu, Ala, Ile, Leu, Val, Norleucine, amino propionic acid or amino butryic acid <400> 7 Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 20 25 <210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is Phe or an ortho halogenated Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Glu, Ala, Ile, Leu, Val, Norleucine, amino propionic acid or amino butryic acid <400> 8 Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 20 25 <210> 9 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Arg Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Arg Ser Ile 35 40 45 Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 10 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Phe Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Arg Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Arg Ser Cys 35 40 45 Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 11 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Phe Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Cys Cys Ser 35 40 45 Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 12 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Phe Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Cys Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Phe Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 15 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Phe Val Asn Cys His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Cys Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 <210> 16 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Pro Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Pro Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55

Claims (19)

  1. 인슐린 유사체 및 중합체 블렌드를 포함하며,
    상기 인슐린 유사체는 야생형 인슐린에 대하여 잔기 B4 및 A10에 대응되는 위치에서의 시스테인 치환, 및
    (a) 상기 인슐린 유사체의 A 및 B 도메인 사이의 5 내지 11개 아미노산의 연결 도메인;
    (b) 야생형 인슐린의 A8 위치에 대응되는 위치에서의 비-베타-분지형 아미노산 치환;
    (c) 야생형 인슐린의 A14 위치에 대응되는 위치에서의 비-베타-분지형 산성 또는 극성 측쇄;
    (d) 방향족 측쇄의 오르토 위치의 야생형 인슐린의 위치 B24에 대응되는 위치에서의 Phe의 방향족 고리의 할로겐 변형; 및
    (e) 아르기닌, 글루탐산, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 아미노-프로피온산, 아미노-부티르산, 또는 노르류신에 의한 야생형 인슐린의 위치 B29에 대응되는 위치에서의 리신의 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적 치환을 포함하고,
    상기 인슐린 유사체는 90℃ 내지 120℃의 온도 범위에서의 하나 이상의 단계를 포함하는 제조 공정에 적합한 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리머는 폴리(락트산-코-글리콜산(PL-GA))으로 구성되는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 폴리머는 PL의 백분율이 25% 내지 75%가 되는 폴리(락트산-코-글리콜산(PL-GA))로 구성되는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 중합체는 PL의 백분율이 50%가 되는 폴리(락트산-코-글리콜산(PL-GA))로 구성되는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    폴리에틸렌 글리콜을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 야생형 인슐린의 A8 위치에 대응되는 위치에서의 알라닌, 히스티딘, 글루탐산 또는 아르기닌 치환, 및 야생형 인슐린의 A14 위치에 대응되는 위치에서의 알라닌, 글루탐산 또는 아르기닌 치환 중의 하나 이상을 함유하는 단일 사슬 인슐린 유사체인 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 연결 도메인(C 도메인)의 처음 두 위치 중 적어도 하나에서 글루탐산을 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 서열 번호 10, 12 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 서열 번호 5를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    서열 번호 6을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 2사슬 인슐린 유사체인 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    국소용 마이크로 바늘 패치로 제조되는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    피하주사용 마이크로 비즈의 현탁액으로 제조되는 것을 특징으로 하는 인슐린 조성물.
  14. 인슐린 유사체 및 중합체 블렌드를 포함하는 인슐린 조성물을 투여하는 것을 포함하며
    상기 인슐린 유사체는 야생형 인슐린에 대하여 잔기 B4 및 A10에 대응되는 위치에서의 시스테인 치환, 및
    (a) 상기 인슐린 유사체의 A 및 B 도메인 사이의 5 내지 11개 아미노산의 연결 도메인;
    (b) 야생형 인슐린의 A8 위치에 대응되는 위치에서의 비-베타-분지형 아미노산 치환;
    (c) 야생형 인슐린의 A14 위치에 대응되는 위치에서의 비-베타-분지형 산성 또는 극성 측쇄;
    (d) 방향족 측쇄의 오르토 위치의 야생형 인슐린의 위치 B24에 대응되는 위치에서의 Phe의 방향족 고리의 할로겐 변형; 및
    (e) 아르기닌, 글루탐산, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 아미노-프로피온산, 아미노-부티르산, 또는 노르류신에 의한 야생형 인슐린의 위치 B29에 대응되는 위치에서의 리신의 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적 치환을 포함하며,
    상기 인슐린 유사체는 90℃ 내지 120℃의 온도 범위에서의 하나 이상의 단계를 포함하는 제조 공정에 적합한 것을 특징으로 하는 인간 환자 또는 포유 동물의 당뇨병을 치료하기 위한 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 인슐린 조성물은 피부에 부착된 장치에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인간 환자 또는 포유 동물의 당뇨병을 치료하기 위한 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 인슐린 조성물은 피하 주사 또는 이식에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인간 환자 또는 포유 동물의 당뇨병을 치료하기 위한 방법.
  17. 약제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 인슐린 유사체.
  18. 인간 환자 또는 기타 포유 동물에서 당뇨병을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 인슐린 유사체의 사용방법.
  19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    당뇨병을 치료하기 위한 인슐린 유사체.
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