TW201708249A - 原毒素－ｉｉ變體及使用方法 - Google Patents

原毒素－ｉｉ變體及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201708249A
TW201708249A TW105110361A TW105110361A TW201708249A TW 201708249 A TW201708249 A TW 201708249A TW 105110361 A TW105110361 A TW 105110361A TW 105110361 A TW105110361 A TW 105110361A TW 201708249 A TW201708249 A TW 201708249A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
artificial sequence
protoxin
variant
pain
prt
Prior art date
Application number
TW105110361A
Other languages
English (en)
Inventor
瑪克 費林斯帕克
艾倫 威肯登
羅斯 斐樂絲
徐晴晧
安德魯 皮耶卡日
Original Assignee
健生生物科技公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 健生生物科技公司 filed Critical 健生生物科技公司
Publication of TW201708249A publication Critical patent/TW201708249A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明關於原毒素-II變體、編碼彼等之聚核苷酸、及製造和使用前述的方法。

Description

原毒素-II變體及使用方法 相關申請案之交互參照
本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張2015年4月2日申請之美國臨時專利申請案第62/142069號的優先權，其所揭露之全文以引用方式併入本文中。
本發明關於原毒素(Protoxin)-II變體、編碼彼等之合成聚核苷酸、及製造和使用前述的方法。
電位門控型鈉離子通道(voltage-gated sodium channel,VGSC)存在所有可興奮細胞中，包括心肌和骨骼肌細胞及中樞和周邊神經元。在神經元細胞中，鈉離子通道負責放大閾下(sub-threshold)去極化並產生動作電位的迅速提升。因此，鈉離子通道對於神經系統中電性信號的啟動和傳播至關重要。異常的鈉離子通道功能被認為會引起多種醫學病症(Hübner and Jentsch,Hum Mol Genet 11：2435-45,2002)，包括癲癇(Yogeeswari等人，Curr Drug Targets 5：589-602,2004)、心律不整(Tfelt-Hansen等人，J Cardiovasc Electrophysiol 21：107-15,2010)、肌強直(Cannon and Bean,J Clin Invest 120：80-3, 2010)、及疼痛(Cregg等人，J Physiol 588：1897-904,2010)。鈉離子通道一般為多個不同次單元的複合物，主要次單元係孔隙形成性α次單元，其單獨便足以發揮作用。
人類中存在九種已知的電位門控型鈉離子通道α次單元家族成員：Nav1.1至Nav1.9。該Nav1.x次家族可在藥理學上再細分為兩組：河豚毒素(TTX)敏感型及TTX不敏感型。由SCN9A基因編碼的Nav1.7(又名PN1或hNE)係TTX敏感型且主要表現於周邊交感神經及感覺神經元。Nav1.7累積在神經纖維末梢並將小的閾下去極化放大，作為調節興奮性的閾值通道。
Nav1.7的功能與各種疼痛狀態有關，包括急性、發炎性及/或神經病變性(neuropathic)疼痛。在人類中，Nav1.7的功能獲得型突變已被發現與原發性肢端紅痛症(PE)(其特徵在於四肢灼痛及發炎)(Yang等人，J Med Genet 41：171-4,2004)以及陣發性劇痛症(paroxysmal extreme pain disorder,PEPD)有關(Fertleman等人，Neuron 52：767-74,2006)。與該觀察一致的是，非選擇性鈉離子通道阻斷劑利多卡因(lidocaine)、墨西律定(mexiletine)及卡巴馬平(carbamazepine)可在這些疼痛病症中提供症狀緩解(Legroux-Crespel等人，Ann Dermatol Venereol 130：429-33,2003；Fertleman等人，Neuron 52：767-74,2006)。
在人類中Nav1.7的功能喪失型突變會造成先天性無痛覺症(congenital indifference to pain,CIP)，其係一種罕見的體染色體隱性病症(autosomal recessive disorder)，特徵在於對疼痛刺激完全無 感或不敏感(Cox等人，Nature 444：894-8,2006；Goldberg et al,Clin Genet 71：311-9,2007；Ahmad等人，Hum Mol Genet 16：2114-21,2007)。
在SCN9A編碼區的單核苷酸多型性已知與增加的痛覺受器興奮性和疼痛敏感性有關。例如，造成人類Nav1.7中之R1150W取代的多型性rs6746030已知與骨關節炎疼痛、腰椎間盤摘除術(lumbar discectomy)疼痛、幻痛(phantom pain)、及胰臟炎疼痛有關(Reimann等人，Proc Natl Acad Sci USA 107：5148-53,2010)。表現該R1150W突變Nav1.7的DRG神經元顯示出回應於去極化而增加的放電頻率(Estacion等人，Ann Neurol 66：862-6,2009)。致殘型纖維肌痛(fibromyalgia)已知與SCN9A鈉離子通道多型性rs6754031有關，這表示一些患有嚴重纖維肌痛的病患可能具有背根神經節鈉離子通道病變(Vargas-Alarcon等人，BMC Musculoskelet Disord 13：23,2012)。
在小鼠中，刪除傷害感受性神經元中的SCN9A基因會導致機械痛閾和熱痛閾降低，及發炎性疼痛反應的減少或廢除(Nassar等人，Proc Natl Acad Sci USA 101：12706-11,2004)。在所有的感覺神經元中剔除SCN9A會廢除機械性疼痛、發炎性疼痛及對熱的縮回反射反應。在感覺和交感神經元中均刪除SCN9A會廢除機械性疼痛、熱痛和神經病變性疼痛，並重現在具有Nav1.7功能喪失型突變的人類中可見之無痛表型(Minett等人，Nat Commun 3：791,2012)。因此，Nav1.7抑制劑或阻斷劑可用於治療與多種病症有關之廣泛疼痛。
已知蜘蛛毒液含有大量的鈉離子通道阻斷肽，包括虎紋捕鳥蛛毒素(Huwentoxin)-IV(HwTx-IV)(Peng等人，J Biol Chem 277：47564-71,2002)、原毒素-I、原毒素-II(Middleton等人，Biochemistry 41：14734-47,2002)及智利粉爆紋捕鳥蛛毒素(Phrixotoxin)-III(Bosmans等人，Mol Pharmacol 69：419-29,2006)。有需要識別其他的Nav1.7阻斷劑以治療廣泛的疼痛適應症。尤其需要新穎的Nav1.7阻斷劑，其對Nav1.7的選擇性高於其他電位門控型鈉離子通道異構體(isoform)。
本發明的一個實施例係一種抑制人類Nav1.7活性的單離的原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體具有至少一個選自由W7Q及W30L所組成之群組的胺基酸取代；其中殘基編號係根據SEQ ID NO：1。
本發明的另一實施例係一種單離的原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體以約1×10-7M或更小、約1×10-8M或更小、約1×10-9M或更小、約1×10-10M或更小、約1×10-11M或更小、或約1×10-12M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量，其中該原毒素-II變體具有W7Q及/或W30L取代，其中殘基編號係根據SEQ ID NO：1。
本發明的另一實施例係一種單離的原毒素-II變體，其包含SEQ ID NO：30、40、44、52、56、56、59、65、78、109、110、111、114、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、178、179、180、182、183、184、185、186、189、190、193、195、197、199、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、224、226、227、231、232、243、244、245、247、249、252、255、258、261、263、264、265、266、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、332、334、335、336、337、339、340、341、342、346、351、358、359、364、366、367、368、369、370、371、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、 448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、 690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、或736之胺基酸序列。
本發明的另一實施例係一種單離的原毒素-II變體，其包含與SEQ ID NO：422(GPYCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH)之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；其中當殘基編號係根據SEQ ID NO：1時，該胺基酸序列在位置7具有Q且在位置30具有L。
本發明的另一實施例係一種單離的融合蛋白，其包含接合至半衰期延長部分的本發明之原毒素-II變體。
本發明的另一實施例係一種單離的聚核苷酸，其編碼本發明之原毒素-II變體。
本發明的另一實施例係一種載體，其包含本發明之單離的聚核苷酸。本發明的另一實施例係一種宿主細胞，其包含本發明之載體。
本發明的另一實施例係一種生產本發明之單離的原毒素-II變體的方法，其包含培養本發明之宿主細胞以及回收由該宿主細胞所生產之原毒素-II變體。
本發明的另一實施例係一種醫藥組成物，其包含本發明之單離的原毒素-II變體或融合蛋白以及醫藥上可接受的賦形劑。
本發明的另一實施例係一種在個體中治療Nav1.7介導的疼痛之方法，其包含向有其需要之個體投予有效量的本發明之原毒素-II變體或融合蛋白以治療該疼痛。
圖1顯示原毒素-II變體的屬胺基酸序列(genus amino acid sequence)，該等原毒素-II變體在FLIPR Tetra檢定中抑制Nav1.7的IC50值為30nM或更小。殘基編號係根據SEQ ID NO：1的野生型原毒素-II。屬(genus)SEQ ID NO：403。
圖2顯示各變體在QPatch檢定中抑制Nav1.7及Nav1.6的IC50值，以及藉由QPatch檢定所獲得之IC50(Nav1.6)/IC50(Nav1.7)比率計算的各個變體之選擇性。SE：標準誤差。
圖3顯示原毒素-II變體的序列及屬序列，該等變體在FLIPR Tetra檢定中抑制Nav1.7的IC50值為30nM或更小，且對Nav1.7的選擇性高出對Nav1.6之選擇性30倍。各變體的選擇性係藉由QPatch檢定法所得之IC50(Nav1.6)/IC50(Nav1.7)比率計算。殘基編號係根據SEQ ID NO：1的野生型原毒素-II。
圖4A顯示NV1D3034(NV1D3034-OH)(SEQ ID NO：78)對CFA誘發的小鼠熱痛覺過敏(thermal hyperalgesia)的效力，其係藉由在Hargreaves測試中於CFA注射前(CFA前)與CFA注射後(0)及 投予肽後1天(1)測量爪縮回潛伏期(paw withdrawal latency)來評估。***P<0.001(相對於PBS)，二因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖4B顯示NV1D3034(NV1D3034-OH)(SEQ ID NO：78)對CFA誘發的小鼠熱痛覺過敏的效力，其係以投予肽後第1天各劑量的MPE(最大可能作用)百分比(MPE%)來表示。*P<0.05(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖5A顯示NV1D3368(NV1D3368-OH)(SEQ ID NO：198)對CFA誘發的小鼠熱痛覺過敏的效力，其係藉由在Hargreaves測試中於CFA注射前(CFA前)與CFA注射後(0)及投予肽後1天(1)測量爪縮回潛伏期來評估。**P<0.01及****P<0.0001(相對於PBS)，二因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖5B顯示NV1D3368(NV1D3368-OH)(SEQ ID NO：198)對CFA誘發的小鼠熱痛覺過敏的效力，其係以投予肽後第1天各劑量的MPE百分比(MPE%)來表示。*P<0.05及**P<0.01(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖6A顯示NV1D2775-OH(SEQ ID NO：56)對CFA誘發的小鼠熱痛覺過敏的效力，其係藉由在Hargreaves測試中於CFA注射前(CFA前)與CFA注射後(0)及投予肽後1天(1)測量爪縮回潛伏期來評估。****P<0.0001(相對於PBS)，二因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖6B顯示NV1D2775-OH(SEQ ID NO：56)對CFA誘發的小鼠熱痛覺過敏的效力，其係以投予肽後第1天各劑量的MPE百分比(MPE%)來表示。***P<0.001及****P<0.0001(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖6C顯示NV1D2775-OH(SEQ ID NO：56)對CFA誘發的小鼠觸摸痛(tactile allodynia)的效力。於CFA注射前(CFA前)與CFA注射後(0)及投予肽後1天(1)的後爪觸覺閾值。****P<0.0001(相對於PBS)，二因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖6D顯示NV1D2775-OH(SEQ ID NO：56)對CFA誘發的小鼠觸摸痛的效力，其係以投予肽後第1天的MPE百分比(MPE%)來表示。***P<0.001(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖7A顯示在小鼠CFA模型中NV1D2775-OH介導的逆轉熱痛覺過敏之時程，如藉由在Hargreaves測試中於CFA注射前與注射後及投予肽後的不同時間點所測量之爪縮回潛伏期來評估。**P<0.01(相對於PBS)，二因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。陰影區域表示化合物遞送期間(0至24小時)。
圖7B顯示在小鼠CFA模型中NV1D2775-OH介導的逆轉觸摸痛之時程，如藉由於CFA注射前與注射後及投予肽後的不同時間點所測量之觸覺閾值來評估。**P<0.01(相對於PBS)，二因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。陰影區域表示化合物遞送期間(0至24小時)。
圖8顯示NV1D2775-OH在小鼠熱板測試(hotplate test)中產生顯著的止痛作用。熱縮回潛伏期係在50及55℃下分別於泵植入前及泵植入後評估。泵植入對於對照PBS組中的潛伏期沒有影響。泵植入後一天，經NV1D2775-OH治療的小鼠相較於PBS組展現出延長的潛伏期。*P<0.05及****P<0.0001(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖9顯示NV1D2775-OH預處理使動物免於發生角叉菜膠(carrageenan)誘發的小鼠熱痛覺過敏。爪縮回潛伏期係於泵植入前及泵植入後第1天足底內注射角叉菜膠之前測量。並在角叉菜膠注射後第2、3及4小時再次測量潛伏期。
圖10顯示野生型原毒素-II的NMR結構之表面代表圖。左側顯示的疏水面包括殘基W5、M6、W7、L23、及W24。右側顯示的選擇性面包括殘基S11、E12、K14、E17、G18、L29、及W30。殘基編號係根據SEQ ID NO：1。
圖11A顯示在大鼠甩尾測試(tail flick test)中單次鞘內(IT)投予原毒素-II變體63955918(SEQ ID NO：422)後的效力。在所指示的投予肽後之時間測量對熱刺激的尾縮回潛伏期。
圖11B顯示在大鼠甩尾測試中單次鞘內(IT)投予原毒素-II變體63955918(SEQ ID NO：422)後前120分鐘內的效力，其係以曲線下面積百分比(AUC%)表示。***P<0.001及****P<0.0001(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖11C顯示在大鼠熱板測試(52.5℃)中單次鞘內(IT)投予原毒素-II變體63955918(SEQ ID NO：422)後的效力。在所指示的投予肽後之時間測量熱板上傷害感受性反應的潛伏期。
圖11D顯示在熱板測試中單次鞘內(IT)投予原毒素-II變體63955918(SEQ ID NO：422)後前120分鐘內的效力，其係以曲線下面積百分比(AUC%)表示。***P<0.001及****P<0.0001(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖11E顯示在大鼠福馬林測試(formalin test)中原毒素-II變體63955918(SEQ ID NO：422)的效力。注射福馬林到大鼠後爪以誘發雙相縮腳行為。透過自動裝置測量在相I(福馬林注射後0至10分鐘)及相II(福馬林注射後11至60分鐘)中的縮腳總次數。由於群組大小過小，因此在E)中未進行統計。
圖12A顯示在大鼠甩尾測試中單次鞘內(IT)投予NV1D2775-OH後的效力。在所指示的投予肽後之時間測量對熱刺激的尾縮回潛伏期。
圖12B顯示在大鼠甩尾測試中單次鞘內(IT)投予NV1D2775-OH後前120分鐘內的效力，其係以曲線下面積百分比(AUC%)表示。 *P<0.05及**P<0.01(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖12C顯示在大鼠熱板測試(52.5℃)中單次鞘內(IT)投予NV1D2775-OH後的效力。在所指示的投予肽後之時間測量熱板上傷害感受性反應的潛伏期。
圖12D顯示在大鼠熱板測試中單次鞘內(IT)投予NV1D2775-OH後前120分鐘內的效力，其係以曲線下面積百分比(AUC%)表示。**P<0.01及****P<0.0001(相對於PBS)，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖12E顯示在福馬林測試中NV1D2775-OH的效力。注射福馬林到大鼠後爪以誘發雙相縮腳行為。透過自動裝置測量在相I(福馬林注射後0至10分鐘)及相II(福馬林注射後11至60分鐘)中的縮腳總次數。**P<0.01(相對於PBS)，相I，*P<0.05(相對於PBS)，相II，單因子變異數分析後進行Bonferroni多重比較。
圖13A顯示在大鼠甩尾測試中單次鞘內(IT)投予NV1D3034-OH後的效力。在所指示的投予肽後之時間測量對熱刺激的尾縮回潛伏期。
圖13B顯示在大鼠甩尾測試中單次鞘內(IT)投予NV1D3034-OH後前120分鐘內的效力，其係以曲線下面積百分比(AUC%)表示。***P<0.005(相對於PBS)，t檢定。
圖13C顯示在大鼠熱板測試(52.5℃)中單次鞘內(IT)投予NV1D3034-OH後的效力。在所指示的投予肽後之時間測量熱板上傷害感受性反應的潛伏期。
圖13D顯示在大鼠熱板測試中單次鞘內(IT)投予NV1D3034-OH後前120分鐘內的效力，其係以曲線下面積百分比(AUC%)表示。**P<0.01(相對於PBS)，t檢定。
圖13E顯示在大鼠福馬林測試中NV1D3034-OH的效力。注射福馬林到大鼠後爪以誘發雙相縮腳行為。透過自動裝置測量在相I(福馬林注射後0至10分鐘)及相II(福馬林注射後11至60分鐘)中的縮腳總次數。*P<0.05(相對於PBS)，相I，**P<0.01(相對於PBS)，相II，t檢定。
圖14顯示家族3半胱胺酸結毒素肽之胺基酸排比。
所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻在此全部併入作為參照。
本文及申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
除非另有定義，本文中所使用之所有技術與科學用語的意義，均與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所一般理解的意義相同。雖然任何類似或等效於本文中所述者之組成物及方法可在本發明的實踐或測試中使用，本文中仍描述例示性組成物及方法。
用語「多肽(polypeptide)」意指包含至少兩個以肽鍵連接之胺基酸殘基以形成多肽的分子。少於50個胺基酸的小型多肽可稱為「肽(peptide)」。多肽亦可稱為「蛋白質(protein)」。
用語「聚核苷酸(polynucleotide)」意指包含以糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學結構所共價連接之核苷酸鏈的分子。雙股及單股DNA及RNA為聚核苷酸的典型實例。
用語「互補序列(complementary sequence)」意指與第一個單離的聚核苷酸序列反向平行之第二個單離的聚核苷酸序列，其包含與第一個聚核苷酸序列中的核苷酸互補的核苷酸。
用語「載體(vector)」意指在生物系統內能夠被複製或者可在此等系統之間移動的非天然聚核苷酸。載體聚核苷酸一般含有編碼感興趣蛋白質的cDNA及其他元件，諸如複製源、多腺核苷酸化信號或選擇標記，其作用為促進這些聚核苷酸在生物系統中的複製或維持。此等生物系統的實例可包括細胞、病毒、動物、植物、及利用能夠複製載體之生物組件的重構生物系統(reconstituted biological system)。包含載體之聚核苷酸可為DNA或RNA分子或這些分子的雜交物。
用語「表現載體(expression vector)」意指可在生物系統或重構生物系統中用以指引多肽轉譯的載體，該多肽係由存在於該表現載體中之聚核苷酸序列所編碼。
本文中使用之用語「變體(variant)」意指與SEQ ID NO：1的野生型原毒素-II多肽或編碼野生型原毒素-II的序列SEQ ID NO：107聚核苷酸有一或多個修飾(例如核苷酸或胺基酸的取代、插入或刪除)之不同的多肽或聚核苷酸。
在整個說明書中，原毒素-II變體中經取代的殘基之編號係對應於其在SEQ ID NO：1的野生型原毒素-II中的位置。例如，說明書中的「Y1A」意指在對應於SEQ ID NO：1的野生型原毒素-II中位置1的殘基位置的酪胺酸被丙胺酸取代。
「互補DNA(Complementary DNA)」或「cDNA」意指習知的合成聚核苷酸，其具有帶有鄰近外顯子之天然成熟mRNA物種中可發現之序列元件排列，且存在於基因組DNA中的間插內含子則被除去。編碼起始子甲硫胺酸的密碼子可存在或不存在於cDNA中。cDNA可藉由例如反轉錄或合成基因總成來合成。
本文中使用之「合成(Synthetic)」或「非天然(non-natural)」意指不存在於自然界之聚核苷酸或多肽分子。
本文中使用之「Nav1.7」(亦稱為hNE或PN1)或「hNav1.7」意指習知的人類鈉離子通道蛋白9型α次單元，其具有顯示於GenBank登錄號NP_002968.1及SEQ ID NO：79的序列。
本文中使用之用語「野生型原毒素-II(wild type Protoxin-II)」或「野生型ProTx-II」意指秘魯綠絲絨狼蛛(Thrixopelma pruriens)的毒素肽，其具有胺基酸序列YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-COOH(SEQ ID NO：1)，如Middleton等人在Biochemistry 41(50)：14734-47,2002中所述。
本文中使用之用語「重組原毒素-II(recombinant Protoxin-II)」或「重組ProTx-II」意指由表現及後續切割原毒素-II融合蛋白所得之重組原毒素-II，其具有如SEQ ID NO：2所示之序列GPYCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-OH。當與野生型原毒素-II相比，重組原毒素-II包含兩個胺基酸N-端延伸(殘基G及P)。
本文中使用之「阻斷人類Nav1.7活性(Blocks human Nav1.7 activity)」或「抑制人類Nav1.7活性(inhibits human Nav1.7 activity)」意指本發明之原毒素-II變體在利用螢光共振能量轉移(FRET)的FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法中，以約1×10-7M或更小之IC50值減少藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)所誘發之細胞膜去極化的能力，其中藜蘆定鹼誘發的去極化係於穩定表現人類Nav1.7的細胞系中以FRET信號的減少來測量，其利用DISBAC2(3)([雙-(1,3-二乙基硫巴比妥酸)三次甲基氧雜菁]([bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol]))作為受體及PTS18(8-十八基氧芘-1,3,6-三磺酸三鈉(trisodium 8-octadecyloxypyrene-1,3,6-trisulfonate))作為供體，且在390至420nm刺激該供體並在515至575nm測量FRET。本發明之原毒素-II變體阻斷人類Nav1.7活性的能力亦可根據實例3中所述之規程在單一或數個原毒素-II變體濃度下使用QPatch電生理法測量。當使用實例3中所述之檢定規程時，若本發明之原毒素-II變體抑制至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之使用QPatch所測量的Nav1.7電流時，其阻斷人類Nav1.7活性。
本文中使用之「FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法(FLIPR® Tetra membrane depolarization assay)」係指實例3中所述之檢定法。
本文中使用之「QPatch檢定法(QPatch assay)」或「QPatch電生理檢定法(QPatch electrophysiology assay)」係指實例3中所述之檢定法。
本文中使用之用語「實質上同一(substantially identical)」意指所比較的兩個原毒素-II變體胺基酸序列係同一或具有「無實質差異(insubstantial differences)」。無實質差異係在原毒素-II變體胺基酸序列中有1、2、3、4、5、6、或7個不會對肽性質產生不利影響的胺基酸取代。與本文揭示之原毒素-II變體實質上同一的胺基酸序列係在本申請案之範圍內。在一些實施例中，該序列同一性可為約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。同一性百分比可例如藉由使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen,Carslbad,CA)之AlignX模組的預設設定進行成對排比來測定。本發明的蛋白質序列可被用作查詢序列(query sequence)來執行針對公開或專利數據庫的檢索以(例如)鑑定相關序列。用來執行該等檢索之例示性程式係XBLAST或BLASTP程式(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)，或使用預設設定的GenomeQuestTM(GenomeQuest,Westborough,MA)套件。
本文中使用的天然胺基酸的縮寫如表1a所示。
本發明提供抑制人類Nav1.7活性的單離原毒素-II(ProTx-II)變體多肽、編碼彼等之聚核苷酸、載體、宿主細胞、及使用本發明之聚核苷酸與多肽的方法。本發明之多肽抑制由Nav1.7活化引起的去極化/電流，因此可用於治療與疼痛相關的各種病況以及與感覺或交感神經元功能異常相關的病況。
本發明之變體係Nav1.7的有效抑制劑。本發明係至少部分地基於以下發現：原毒素-II中的某些殘基取代會增強選擇性、合成產量及/或同質性(homogeneity)，且對所產生的原毒素-II變體之效價無不利影響，特別是W7及M19，以及其他殘基Y1及S11，及進 一步其他殘基E12、R22(殘基編號係根據SEQ ID NO：1)。例如，位置W7及W30的取代增強原毒素-II變體折疊並提高產量。位置S11、E12、K14、E17、G18、L29及W30的取代改善所生成的原毒素-II變體對Nav1.7的選擇性。
在本文中所揭露之本發明的一個實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體以約1×10-7M或更小、約1×10-8M或更小、約1×10-9M或更小、約1×10-10M或更小、約1×10-11M或更小、或約1×10-12M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體以約1×10-7M或更小、約1×10-8M或更小、約1×10-9M或更小、約1×10-10M或更小、約1×10-11M或更小、或約1×10-12M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量，其中該原毒素-II變體具有至少一個選自由W7Q及W30L所組成之群組的胺基酸取代；其中殘基編號係根據SEQ ID NO：1。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種抑制人類Nav1.7活性的單離的原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體具有至少一個選自由W7Q及W30L所組成之群組的胺基酸取代；其中殘基編號係根據SEQ ID NO：1。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該原毒素-II變體具有W7Q取代。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該原毒素-II變體具有W30L取代。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該原毒素-II變體具有W7Q及W30L取代。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，當該Nav1.7活性係根據實例3中所述之規程使用QPatch檢定法測量時，該原毒素-II變體抑制至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的Nav1.7活性。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，當殘基編號係根據SEQ ID NO：1時，該原毒素-II變體在一或多個殘基位置Y1、W7、S11、E12、K14、E17、G18、R22、L29、及W30具有取代。
位置Y1的取代改善對人類Nav1.7的效價。
位置W7的取代改善原毒素-II變體的折疊及蛋白質產量。
位置S11的取代改善對人類Nav1.7的選擇性。
位置E12的取代改善對人類Nav1.7的選擇性。
位置K14的取代改善對人類Nav1.7的選擇性。
位置E17的取代改善對人類Nav1.7的選擇性。
位置G18的取代改善對人類Nav1.7的選擇性。
位置L29的取代改善對人類Nav1.7的選擇性。
位置W30的取代改善原毒素-II變體的折疊及蛋白質產量，以及對Nav1.7的選擇性。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含序列YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-COOH(SEQ ID NO：416)；其中殘基Y1、S11、E12、K14、E17、G18、L29、及/或W30係經表1所示的任何其他胺基酸或非天然胺基酸取代，且可選地具有N-端延伸或C-端延伸。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含序列YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH(SEQ ID NO：422)；其中殘基Y1、S11、E12、K14、E17、G18、M19、L29、及/或W30係經表1所示的任何其他胺基酸或非天然胺基酸取代，且可選地具有N-端延伸或C-端延伸。
在一些實施例中，本文中所述之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)含有至少一個非天然胺基酸。
非天然胺基酸包括胺基β-丙胺酸(β-Ala)及其他ω-胺基酸，諸如3-胺基丙酸(Dap)、2,3-二胺基丙酸(Dpr)、4-胺基丁酸等等；α-胺基異丁酸(Aib)；ε-胺基己酸(Aha)；δ-胺基戊酸(Ava)；N-甲基甘胺酸或肌胺酸(MeGly)；鳥胺酸(Om)；瓜胺酸(Cit)；t-丁基丙胺酸(t-BuA)；t-丁基甘胺酸(t-BuG)；N-甲基異白胺酸(MeIle)；苯基甘胺酸(Phg)；環己基丙胺酸(Cha)；正白胺酸(Nle)；2-萘基丙胺酸(2-NaI)；4-氯苯基丙胺酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙胺酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙胺酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙胺酸(Phe(4-F))；青黴胺(Pen)；1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；α-2-噻吩基丙胺酸(Thi)；甲硫胺酸亞碸(MSO)；N(ω)-甲基-L-精胺酸；N(ω),N(ω)-二甲基-L-精胺酸(非對稱)；4-胍基-L-苯基丙胺酸；L-Lys(N-ε-(N-α-棕櫚醯基-L-γ-麩胺醯基)；L-天冬醯胺醯基-4-胺基丁烷；L-麩胺醯基-4-胺基丁烷；高精胺酸(hArg)；N-乙醯基離胺酸(AcLys)；2,3-二胺基丁酸(Dab)；2,4-二胺基丁酸(Dbu)；p-胺基苯基丙胺酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈胺酸(MeVal)；同半胱胺酸(hCys)及同絲胺酸(hSer)；4-溴苯基丙胺酸(Phe(4-Br))；5-溴色胺酸(Trp(5-Br))；3-氯酪胺酸(Tyr(3-Cl))；或β-氯丙胺酸。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含序列 X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14X15X16CX17LWCX18KKLX19(SEQ ID NO：432)，X1係G、P、A、或經刪除；X2係P、A、或經刪除；X3係S、Q、A、R、或Y；X4係Q、R、K、A、S、或Y；X5係K、S、Q、或R；X6係M或F；X7係T、S、R、K、或Q；X8係D、T、或天冬醯胺醯基-4-胺基丁烷；X9係S、A、R、I、或V；X10係E、R、N、K、T、Q、Y、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X11係R或K；X12係K、Q、S、A、或F；X13係E、Q、D、L、N、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X14係G、Q、或P；X15係M或F；X16係V或S；X17係R、T、或N-ω甲基-L-精胺酸(N-omega methyl-L-arginine)；且X18係K或R；且X19係W或L， 可選地具有N-端延伸或C-端延伸。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含序列X1X2X3CQKWMQTCDX4X5RX6CCX7X8X9VCRLWCKKKX10X11(SEQ ID NO：737)；其中X1係G、P、A、或經刪除；X2係P、A、或經刪除；X3係S、Q、A、R、或Y；X4係S、A、R、I、或V；X5係E、R、N、K、T、Q、Y、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X6係K、Q、S、A、或F；X7係E、Q、D、L、N、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X8係G、Q、或P；X9係M或F；X10係L、V；且X11係W或L。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該原毒素-II變體以約1×10-7M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在 穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，當該Nav1.7活性係根據實例3中所述之規程使用QPatch檢定法測量時，該原毒素-II變體抑制至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的Nav1.7活性。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該N-端延伸包含SEQ ID NO：372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、或385之胺基酸序列。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該C-端延伸包含SEQ ID NO：374、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、或397之胺基酸序列。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該N-端及/或該C-端延伸係透過連接子接合至該原毒素-II變體。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該連接子包含SEQ ID NO：383、392、398、399、400、401、或402之胺基酸序列。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該N-端延伸係由SEQ ID NO：372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、或385之胺基酸序列所組成。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該C-端延伸係由SEQ ID NO：374、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、或397之胺基酸序列所組成。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該連接子係由SEQ ID NO：383、392、398、399、400、401、或402之胺基酸序列所組成。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含序列X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14FX15CX16LWCX17KKLW(SEQ ID NO：403)，其中X1係G、P、A、或經刪除；X2係P、A、或經刪除；X3係S、Q、A、R、或Y；X4係Q、R、K、A、或S；X5係K、S、Q、或R；X6係M或F；X7係T、S、R、K、或Q； X8係D或T；X9係S、A、或R；X10係E、R、N、K、T、或Q；X11係R或K；X12係K、Q、S、或A；X13係E、Q、或D；X14係G或Q；X15係V或S；X16係R或T；且X17係K或R；可選地具有N-端延伸或C-端延伸，其中該多肽以約1×10-7M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)係有效的Nav1.7抑制劑。在藜蘆定鹼誘發的去極化抑制檢定中，重組原毒素-II(SEQ ID NO：2)對人類Nav1.7的IC50值約為4×10-9M，該檢定係在穩定表現Nav1.7的細胞中使用FLIPR® Tetra儀器(Molecular Devices)利用實例3中所述之實驗細節測量FRET(螢光共振能量轉移)的減少。當原毒素-II變體在上述檢定及 實例3中的IC50值係約30×10-9M或更小(亦即在重組原毒素-II的10倍以內)時，該原毒素-II變體係「有效的(potent)」Nav1.7抑制劑。為清楚起見，30×10-9M的IC50係與3.0×10-8M的IC50相同。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體多肽(包括於下列編號實施例中)可在自動肽合成儀上藉由化學合成(諸如固相肽合成法)來生產。或者，本發明之多肽可藉由使用無細胞表現系統(諸如基於網狀紅血球裂解物(reticulocyte lysate)之表現系統)或藉由重組表現系統，由編碼該多肽之聚核苷酸獲得。所屬技術領域中具有通常知識者將知道用於獲得本發明之多肽的其他技術。在一例示性方法中，本發明之原毒素-II變體係藉由將其表現為人血清白蛋白(HSA)融合蛋白來產製，其中該原毒素-II變體利用富含甘胺酸的連接子如(GGGGS)4(SEQ ID NO：80)或(GGGGS)6(SEQ ID NO：81)耦合至蛋白酶可切割的連接子，如HRV3C蛋白酶(來自人類鼻病毒的重組14型3C蛋白酶)的辨識序列LEVLFQGP(HRV3C連接子)(SEQ ID NO：82)，並以該HRV3C蛋白酶切割所表現的融合蛋白以釋放該重組原毒素-II變體肽。可利用習知方法使用六組胺酸(SEQ ID NO：108)或其他標籤來促進純化。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)可使用本文中所述之方法純化。在一例示性方法中，表現為HSA融合蛋白並以HRV3C蛋白酶切割的本發明之原毒素-II變體可使用如本文中所述之固相萃取(SPE)純化。
可選地具有N-端及/或C-端延伸之在本文中所揭露之原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)以及原毒素-II變體融合蛋白的產製一般係在核酸層級實現。該等聚核苷酸可根據美國專利第6,521,427及6,670,127號中所述之方法使用化學基因合成來合成，其利用簡併寡核苷酸以產製所欲變體，或藉由標準PCR選殖及突變誘導(mutagenesis)來合成。變體庫可藉由標準選殖技術，將編碼原毒素-II變體的聚核苷酸選殖進入表現載體來產製。
當與SEQ ID NO：1的野生型原毒素-II相比時，在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)可併入額外之例如由選殖及/或表現方案所導致之N-及/或C-端胺基酸。例如，在將變體表現為HSA-連接子-HRV3C可切割肽-原毒素-II變體融合蛋白後自HSA切割，可能導致各原毒素-II變體的N-端併入額外的兩個殘基，諸如G及P。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)抑制人類Nav1.7的能力係使用本文中所述之方法測試。一例示性檢定法係藜蘆定鹼誘發的去極化抑制檢定法，其係在穩定表現Nav1.7的細胞中測量FRET(螢光共振能量轉移)的減少。另一例示性檢定法採用電生理記錄以測量Nav1.7介導的電流變化，其係使用習知的膜片鉗技術(patch clamp technique)且如本文中所描述。
本發明的另一實施例係一種在本文中所揭露之單離的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)，其包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、 307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、35、357、358、359、360、3661、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、 588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、或736之胺基酸序列。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)以約1×10-7M或更小、約1×10-8M、約1×10-9或更小、約1×10-10M或更小、約1×10-11M或更小、或約1×10-12M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7。展現該IC50值範圍的例示性變體係具有SEQ ID NO：30、40、44、52、56、56、59、65、78、109、110、111、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、 150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、178、179、180、182、183、184、185、186、189、190、193、195、197、199、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、224、226、227、231、232、243、244、245、247、249、252、255、258、261、263、264、265、266、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、332、334、335、336、337、339、340、341、342、346、351、358、359、364、366、367、368、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、或431所示之胺基酸序列的變體。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，當該Nav1.7活性係根據實例3中所述之規程使用QPatch檢定法測量時，該原毒素-II變體抑制至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的Nav1.7活性。於QPatch檢定法中抑制至少25%的Nav1.7活性之 例示性變體係具有如SEQ ID NO：109、133、408、409、410、412、419、420、421、422、423、423、424、425、426、427、427、428、429、430、431、431、434、436、437、438、439、440、441、442、444、446、447、448、450、452、453、455、456、459、460、461、462、463、464、465、466、468、469、470、471、473、474、476、477、478、479、480、482、483、485、486、487、490、491、492、494、495、496、497、498、499、500、502、504、505、507、508、510、511、512、514、516、517、518、519、521、522、523、524、526、529、531、532、533、537、546、554、557、559、560、561、562、563、566、571、579、588、589、590、591、592、53、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、621、622、632、633、634、635、636、637、638、639、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、或685所示之胺基酸序列的變體。
表2、表3、表14、表18、及表2顯示選定原毒素-II變體之序列。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該單離的原毒素-II變體以約3×10-8M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該單離的原毒素-II變體以介於約3×10-8M至約1×10-9M之IC50值抑制人類Nav1.7活性。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含胺基酸序列GPQCX1X2WX3QX4CX5X6X7X8X9CCX10X11X12X13CX14LWCX15KKLL(SEQ ID NO：433)，其中X1係Q、R、K、A、或S；X2係K、S、Q、或R；X3係M或F；X4係T、S、R、K、或Q；X5係D或T；X6係S、A、或R；X7係E、R、N、K、T、或Q；X8係R或K； X9係K、Q、S、或A；X10係E、Q、或D；X11係G或Q；X12係F或M；X13係V或S；X14係R或T；且X15係K或R。
以約30×10-9M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性的例示性原毒素-II變體係包含SEQ ID NO：56、78、111、114、117、118、119、122、123、129、130、131、132、133、134、135、136、138、139、140、141、142、145、146、147、149、150、151、152、153、154、156、158、159、165、172、173、175、177、178、183、184、185、186、189、190、193、197、199、207、210、211、216、217、224、266、273、282、335、408、409、410、422、424、425、426、427、及428之胺基酸序列的變體。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該單離的原毒素-II變體選擇性地抑制人類Nav1.7。當與重組原毒素-II(SEQ ID NO：2)相比時，本發明之原毒素-II變體對Nav1.7可更具選擇性。在QPatch電生理檢定法中，重組原毒素-II對Nav1.7的IC50約為2.2×10-9M且對Nav1.6的IC50約為62×10-9M，因此對Nav1.6的IC50比上對Nav1.7的IC50之比率約為28倍。當在本文中使 用時，「選擇性(Selectivity)」或「選擇性的(selective)」或「更具選擇性(more selective)」或「選擇性地阻斷(selectively blocks)」或「選擇性地抑制(selectively inhibits)」意指原毒素-II變體對Nav1.6的IC50比上對Nav1.7的IC50之比率(IC50(Nav1.6)/IC50(Nav1.7))係等於或超過約30。對Nav1.6的IC50可利用與對Nav1.7相似的方法，使用穩定表現Nav1.6的細胞系在QPatch電生理檢定法中測定。
原毒素-II中可被誘發突變以提高選擇性的殘基位置包括殘基7、11、12、14、17、18、及19，及可選地殘基1、20、22、及26(殘基編號係根據SEQ ID NO：1)。提高選擇性的例示性取代係Y1Q、W7Q、S11R、S11A、E12T、M19F、V20S、R22T、及K26R。具提高選擇性的例示性原毒素-II變體係SEQ ID NO：56、59、65、78、111、114、117、118、119、121、122、123、129、130、133、150、190、217、281、324、325、或326之變體。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含序列GPX1CQKWMQX2CDX3X4RKCCX5GFX6CX7LWCX8KKLW(SEQ ID NO：405)；其中X1係Y、Q、A、S、或R；X2係T或S；X3係S、R、或A；X4係E、T、或N；X5係E或Q； X6係V或S；X7係R或T；且X8係K或R；其中該原毒素-II變體以約3×10-8M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，且選擇性地抑制人類Nav1.7。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該單離的原毒素-II變體包含序列GPQCQKWMQX1CDX2X3RKCCX4GFX5CX6LWCX8KKLW(SEQ ID NO：406)；其中X1係T或S；X2係S、R、或A；X3係E、T、或N；X4係E或Q；X5係V或S；X6係R或T；且X7係K或R。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含與SEQ ID NO：422(GPYCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH)之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；其中 當殘基編號係根據SEQ ID NO：1時，該胺基酸序列在位置7具有Q且在位置30具有L；且該多肽抑制人類Nav1.7活性。
具有W7Q及W30L取代的原毒素-II變體相較於野生型原毒素-II有改善之折疊、產量及選擇性。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的原毒素-II變體，其包含與SEQ ID NO：78(GPQCQKWMQTCDRERKCCEGFVCTLWCRKKLW-COOH)之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；其中當殘基編號係根據SEQ ID NO：1時，該胺基酸序列在位置1具有Q、在位置7具有Q、且在位置19具有F；該多肽以約30×10-9M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylvetacevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量；且該多肽選擇性地抑制Nav1.7。
在本文中所揭露之一些實施例中(包括於下列編號實施例中)，該單離的原毒素-II變體在C-端具有羧酸、醯胺、甲基醯胺、或丁基醯胺基團。C-端修飾可經由常規的合成方法產製。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、209、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、 275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、35、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、 556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、或736之原毒素-II變體。該第二多肽可為習知的先導或分泌信號序列、或例如從選殖步驟產生的合成序列、或標籤例如六組胺酸標籤(SEQ ID NO：108)。該第二多肽可為半衰期延長部分。在一實施例中，該單離的融合蛋白包含接合至半衰期延長部分的本發明之原毒素-II變體。
可使用的例示性半衰期延長部分包括習知的人血清白蛋白、甲狀腺素運送蛋白(transthyretin,TTR)、甲狀腺素結合球蛋白(TGB)、白蛋白結合域、或彼等之Fc或片段。亦可使用生物適合的聚合物或共聚物，例如乙二醇或聚乙二醇(PEG)分子(諸如PEG5000或PEG20000)、葡聚糖、聚離胺酸、不同鏈長之脂肪酸及脂肪酸酯(例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸脂、花生酸酯(arachidate)、二十二酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯(arachidonate)、辛二酸(octanedioic acid)、十四烷二酸(tetradecanedioic acid)、十八烷二酸(octadecanedioic acid)、二十二烷二酸(docosanedioic acid)及類似物)、辛烷、或碳水化合物(葡聚糖、纖維素、寡醣或多醣)。可改善生物分布之例示性部分包括多胺化(polyamination)(腐胺、精胺、或亞精胺等)、鹵化(氯、溴、氟、碘)、及醣基化。這些部分可以直接與原毒素-II變體多肽融合，且可藉由標準選殖及表現技術產製。或者，可使用習知的化學耦合方法，將該等部分連接至重組產生的本發明之原毒素-II變體。或者，部分可在固相肽合成過程中作為非編碼胺基酸而經併入。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例中(包括於下列編號實施例中)，本發明之融合蛋白的半衰期延長部分係人血清白蛋白、人血清白蛋白之變體、白蛋白結合域(ABD)、或聚乙二醇(PEG)。
在本文中所揭露之另一實施例中(包括於下列編號實施例中)，該半衰期延長部分係透過連接子接合至該原毒素-II變體。合 適的連接子係眾所周知的，並且包括具有顯示於SEQ ID NO：80或81之序列的連接子。
包含本發明之原毒素-II變體的例示性融合蛋白係那些具有SEQ ID NO：83、85、87、89、91、93、95、97、99、101或103之多肽序列的融合蛋白。
在本文中所揭露之併入額外部分的本發明之原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)可藉由幾種習知的檢定法就功能性進行比較。例如，耦合至PEG的原毒素-II變體之藥物動力學特性可在習知的體內(in vivo)模型中評估。
其他原毒素-II變體及原毒素-II變體融合蛋白係在本發明的範圍之內。可對本發明之原毒素-II變體做其他取代，只要所生成的變體或融合蛋白與母體肽相比保留相似的特徵。例示性修飾係例如保守型取代，其將導致與母體分子具有相似特徵之原毒素-II變體。保守型取代為發生在側鏈相關之胺基酸家族內之取代。基因編碼胺基酸可區分成四個家族：(1)酸性(天冬胺酸、麩胺酸)；(2)鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)；(3)非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)；及(4)未荷電極性(甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時會共同分類為芳族胺基酸。或者，胺基酸貯庫(repertoire)可分類為(1)酸性(天冬胺酸、麩胺酸)；(2)鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、(3)脂族(甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸)，其中絲胺酸及 蘇胺酸可選地被分開分類為脂族羥基；(4)芳族(苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸)；(5)醯胺(天冬醯胺酸、麩醯胺酸)；及(6)含硫(半胱胺酸及甲硫胺酸)(Stryer(ed.),Biochemistry,2nd ed,WH Freeman and Co.,1981)。可對原毒素-II變體進行非保守型取代，其涉及在不同類別的胺基酸之間的胺基酸殘基取代，以改善原毒素-II變體及原毒素-II變體融合蛋白的特性。多肽或其片段的胺基酸序列改變是否造成功能性同源物可容易地判定，其係利用本文中所述之檢定法，評估該修飾多肽或片段以類似於未修飾多肽或片段的方式產生反應的能力。有一個以上取代發生的肽、多肽或蛋白可容易地以相同方式進行測試。
本發明之另一實施例係一種單離的家族3蜘蛛毒液半胱胺酸結肽，其在對應於SEQ ID NO：1之位置W7及/或W30的位置包含至少一個取代。家族3蜘蛛毒素包括14種具有保守性C-端區域的毒素，除了原毒素-II，包括κ-TRTX-Gr2b、κ-TRTX-Gr2c、κ-TRTX-Ps1a、κ-TRTX-Ps1b、β-TRTX-Gr1b、κ-TRTX-Cj2a、κ-TRTX-Cj2b、κ-TRTX-Ec2c、β-TRTX-Gr1a、κ-TRTX-Ec2b、κ-TRTX-Ec2a及β/κ-TRTX-Cj2a、及該些顯示於圖14者。預期位置W7及/或W30之取代可改善家族3蜘蛛毒液半胱胺酸結肽的折疊。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種單離的合成聚核苷酸，其包含編碼本發明之原毒素-II變體的聚核苷酸。
某些例示性合成聚核苷酸係揭示於本文中，然而考慮到給定表現系統中之基因密碼的簡併性或密碼子偏好，其他編碼本發明 之原毒素-II變體及原毒素-II變體融合蛋白之合成聚核苷酸亦屬於本發明之範疇。例示性合成聚核苷酸係例如顯示於SEQ ID NO：84、86、88、90、92、94、96、98、100、102及104之聚核苷酸序列，其編碼本發明之原毒素-II變體融合蛋白。所屬技術領域中具有通常知識者可容易地識別該等融合蛋白中編碼原毒素-II變體本身之聚核苷酸片段。編碼本發明之原毒素-II變體或融合蛋白之合成聚核苷酸序列可經可操作地連接至一或多個調節元件(諸如啟動子及增強子)，以容許該核苷酸序列在所意欲宿主細胞中之表現。該合成聚核苷酸可為cDNA。
本發明之聚核苷酸可在自動聚核苷酸合成儀上藉由化學合成(諸如固相聚核苷酸合成法)來生產。或者，本發明之聚核苷酸可藉由其他技術生產，諸如基於PCR的複製、基於載體的複製、或基於限制酶的DNA操作技術。用於生產或獲得已知序列的聚核苷酸之技術係眾所周知。
本發明之聚核苷酸亦可包含至少一種非編碼序列，諸如轉錄但不轉譯的序列、終止信號、核糖體結合位點、mRNA穩定序列、內含子及多腺核苷酸化信號。該等聚核苷酸序列亦可包含編碼額外胺基酸的額外序列。該些額外聚核苷酸序列可例如編碼標記或習知的標籤序列，諸如促進融合多肽的純化之六組胺酸(SEQ ID NO：108)或HA標籤。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種載體，其包含本發明之聚核苷酸。此類載體可為 質體載體、病毒載體、用於桿狀病毒表現之載體、基於轉位子(transposon)之載體、或者任何其他適用於以任何手段將本發明之聚核苷酸引入至給定生物或基因背景中的載體。例如，編碼本發明之原毒素-II變體或原毒素-II變體融合蛋白的聚核苷酸係經插入到表現載體中，並且可經可操作地連接至該表現載體中的控制序列以確保有效表現，諸如信號序列、啟動子(例如天然相關或異源性啟動子)、增強子元件、及轉錄終止序列，並且係經選擇以與選定表現本發明之原毒素-II變體或原毒素-II變體融合蛋白的宿主細胞相容。一旦載體已併入到適當的宿主中，即將宿主維持在合適條件下以高度表現由該併入聚核苷酸所編碼的蛋白質。
合適之表現載體一般在宿主生物中可複製作為游離基因體(episome)或宿主染色體DNA的整體部分。常見的是，表現載體含有選擇標記(selection marker)，諸如安比西林抗性、溼球菌素抗性、四環素抗性、康黴素(kanamycin)抗性或新黴素抗性，以允許偵測經所欲DNA序列轉形的該些細胞。
合適啟動子及增強子元件在所屬技術領域中為習知者。關於細菌細胞中的表現，合適的啟動子包括但不限於lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。關於真核細胞中的表現，合適的啟動子包括但不限於輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子和增強子元件；巨細胞病毒立即早期啟動子(cytomegalovirus immediate early promoter)；單純疱疹病毒胸苷激酶啟動子；早期及晚期SV40啟動子；存在於反轉錄病毒之長末端重複的啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；及各種該 領域已知的組織特異性啟動子。關於酵母細胞中的表現，合適的啟動子係組成型啟動子(constitutive promoter)諸如ADH1 PGK1、ENO或PYK1啟動子及類似者，或可受調控之啟動子諸如GAL1或GAL10啟動子。適當載體及啟動子之選擇落於所屬技術領域中之通常知識水準內。
大量的合適載體及啟動子係所屬技術領域中具有通常知識者所習知；許多可在市面購得以用於產製重組建構體。提供下列載體作為示例。細菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(Pharmacia)。
用於表現原毒素-II變體或原毒素-II變體融合蛋白之例示性載體係具有下列之載體：安比西林(ampicillin)抗性選擇標記、CMV啟動子、CMV內含子、信號肽、新黴素抗性、f1複製起點、SV40多腺核苷酸化信號、及編碼本發明之原毒素-II變體或原毒素-II變體融合蛋白的cDNA。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種宿主細胞，其包含本發明之載體。用語「宿主細胞(host cell)」係指經引入載體的細胞。應瞭解到，用語宿主細胞不只意欲指稱特定對象細胞，但亦意欲指此細胞之後裔。由於某些修飾可 能會因為突變或環境影響之任一者而發生於後繼之代中，使得後裔可能與親系細胞不同，但仍涵括於本文中所用之用語「宿主細胞」的範疇中。此類宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、植物細胞或古菌(archeal)細胞。
大腸桿菌(Escherichia coli)、桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)、及其他腸桿菌(enterobacteriaceae)(諸如沙門桿菌(Salmonella)、鋸桿菌(Serratia)))、及各式假單胞菌(Pseudomonas)菌種皆為原核宿主細胞之實例。其他微生物(諸如酵母菌)對於表現亦為有用者。酵母菌(Saccharomyces)(例如釀酒酵母菌(S.cerevisiae))及畢赤酵母菌(Pichia)皆為合適酵母菌宿主細胞之實例。例示性真核細胞可以是哺乳動物、昆蟲、鳥類或其它動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系(immortalized cell line)如融合瘤或骨髓瘤細胞系，諸如SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)及Ag653(ATCC CRL-1580)鼠類細胞系。例示性人類骨髓瘤細胞系為U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他有用之細胞系包括衍生自中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞者，諸如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知之方法，來將聚核苷酸(例如載體)引入至宿主細胞中。例示性方法係磷酸鈣轉 染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、顯微注射、陽離子脂質介導的轉染及電穿孔。
在本文中所揭露之本發明的另一實施例(包括於下列編號實施例中)係一種用於生產本發明之原毒素-II變體的方法，其包含下列步驟：提供本發明之宿主細胞；以及在足以表現至少一種本發明之原毒素-II變體的條件下培養該宿主細胞。
宿主細胞可在任何適合於維持或增殖給定類型的宿主細胞並足以表現多肽的條件下培養。足以表現多肽的培養條件、培養基及相關方法在本領域中係眾所周知。例如，許多哺乳動物細胞類型可利用適當緩衝的DMEM培養基在37℃進行需氧培養，而細菌、酵母菌及其他細胞類型可在適當的大氣條件下於LB培養基中在37℃進行培養。
在本文中所揭露之本發明的方法中(包括於下列編號實施例中)，可使用多種習知方法來確認原毒素-II變體的表現。例如，可使用檢測試劑確認多肽的表現，例如使用SDS-PAGE或HPLC。
本發明的另一個態樣係一種在生物組織中調控Nav1.7活性的方法，該方法包含使表現Nav1.7的生物組織與Nav1.7調控量的本發明之原毒素-II變體接觸。
治療方法
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)可被利用於任何想要治療、減輕或緩解疼痛症狀或其他感覺或交感神經元功能異常病症的治療中。
由本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)治療的疼痛可為任何類型的疼痛，諸如慢性疼痛、急性疼痛、神經病變性疼痛、傷害感受性疼痛(nociceptive pain)、內臟痛、背痛、與發炎病狀相關的疼痛、手術後疼痛、熱痛或與疾病及退化相關的疼痛。
由本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)治療的疼痛可為Nav1.7介導的疼痛。
本文中使用之「Nav1.7介導的疼痛」意指至少部分地由Nav1.7通道活性增加所引起之疼痛。
本發明之方法可用來治療屬於任何分類之動物病患。此等動物之實例包括哺乳動物，諸如人、鼠、犬、貓及農畜(farm animal)。
疼痛及/或Nav1.7介導的疼痛可由一或多種原因引起，諸如周邊神經病變、中樞神經病變、神經受壓或壓迫症候群(nerve compression or entrapment syndrome)如腕隧道症候群、跗骨隧道症候群(tarsus tunnel syndrome)、尺神經壓迫症(ulnar nerve entrapment)、壓迫性神經根病變(compression radiculopathy)、腰椎狹窄(lumbar spinal stenosis)、坐骨神經受壓、脊根受壓、肋間神經痛、壓迫性神經根病變及神經根性下背痛(radicular lower back pain)、脊根病變、 神經炎、自體免疫疾病、一般性發炎、慢性發炎病狀、關節炎、風濕性疾病、狼瘡、骨關節炎、一般性胃腸道病症、結腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disorder)、大腸急躁症(irritable bowel syndrome)、與腹瀉相關的疼痛、發炎性眼部疾病、發炎性或不穩定膀胱疾病、乾癬、帶有發炎要素的皮膚病、曬傷、心臟炎、皮膚炎、肌炎、神經炎、膠原血管疾病、發炎性疼痛及相關的痛覺過敏(hyperalgesia)和痛覺超敏(allodynia)、神經病變性疼痛及相關的痛覺過敏和痛覺超敏、多發性硬化症、髓鞘脫失病、糖尿病、糖尿病神經病變疼痛(diabetic neuropathy pain)、灼熱痛(causalgia)、截肢或膿瘍引起的疼痛、幻肢痛、骨折疼痛、骨損傷、直接外傷、HIV感染、後天性免疫不全症侯群(「AIDS」)、天花感染、皰疹感染、暴露於毒素或其他外來顆粒或分子、侵襲癌、癌症、化學治療、放射治療、激素治療、燒傷、先天性缺陷、牙痛、痛風疼痛、纖維肌痛(fibromyalgias)、腦炎、慢性酒精中毒、甲狀腺功能低下症(hypothyroidism)、尿毒症及維生素缺乏症、三叉神經神經痛、中風、視丘疼痛症候群(thalamic pain syndrome)、一般性頭痛、偏頭痛、叢集性頭痛(cluster headache)、緊張性頭痛(tension headache)、混合血管性及非血管性症候群、交感神經維持的疼痛、傳入神經阻滯症候群(deafferentation syndrome)、氣喘、上皮組織損傷或功能異常、在呼吸道、泌尿生殖、胃腸道或血管區域的內臟能動性紊亂、創傷、燒傷、皮膚過敏反應、瘙癢(pruritis)、血管運動性或過敏性鼻 炎、或支氣管病症、痛經(dysmenorrhoea)、陣痛及分娩時的疼痛、消化不良、胃食道逆流、胰臟炎、及內臟痛(visceralgia)。
其他可經本發明之原毒素-II變體緩解的感覺或交感神經元功能異常病症包括搔癢、咳嗽及氣喘。在小鼠中，SCN9A基因的全面刪除導致對組織胺誘發的搔癢完全不敏感(Gingras等人，American Pain Society Meeting Abstract 2013及美國專利公開案第2012/0185956號)。該發現意味著肽Nav1.7阻斷劑可能對搔癢的治療有效，該搔癢可由各種來源引起，諸如皮膚病或發炎性病症；或發炎性病症諸如腎或肝膽病症、免疫失調、藥物反應及未知/自發性病況，包括皮膚炎、乾癬、濕疹、蚊蟲叮咬。Nav1.7亦表現於分布於氣道的感覺神經中(Muroi等人，J Physiol.2011 Dec 1；589(Pt 23)：5663-76；Muroi等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2013 Apr 10)，其意味著肽Nav1.7阻斷劑可能有益於咳嗽的治療，例如急性或慢性咳嗽、或由胃食道逆流性疾病的刺激所引起的咳嗽、以及氣道的發炎性疾病諸如氣喘和過敏相關的免疫反應、支氣管痙攣、慢性阻塞性肺病、慢性支氣管炎、肺氣腫、及打嗝(打隔(hiccoughs)、呃逆(singultus))。使用shRNA在天竺鼠的核狀神經節(nodose ganglia)中體內靜默Nav1.7，使得由機械性探測所誘發之咳嗽反射幾乎消失(Muroi等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2013 Apr 10)。
本發明的一個態樣係一種在個體中緩解或治療搔癢、咳嗽或氣喘的方法，其係藉由向有其需要之個體投予治療有效量的在本 文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)持續一段足以緩解該搔癢、咳嗽或氣喘的時間。
本發明的另一態樣係一種在個體中緩解或治療Nav1.7介導的搔癢、Nav1.7介導的咳嗽、或Nav1.7介導的氣喘的方法，其係藉由向有其需要之個體投予治療有效量的在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)持續一段足以緩解該搔癢、咳嗽或氣喘的時間。
本文中使用之「Nav1.7介導的搔癢」意指至少部分地由Nav1.7通道活性增加所引起之搔癢。
本文中使用之「Nav1.7介導的咳嗽」意指至少部分地由Nav1.7通道活性增加所引起之咳嗽。
本文中使用之「Nav1.7介導的氣喘」意指至少部分地由Nav1.7通道活性增加所引起之氣喘。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)對於減輕或緩解疼痛及/或Nav1.7介導的疼痛的作用，可利用本文中所述之動物模型、及諸如神經性病變疼痛的大鼠脊神經結紮(SNL)模型、角叉菜膠誘發的痛覺超敏(allodynia)模型、弗氏完全佐劑(CFA)誘發的痛覺超敏模型、熱損傷模型、福馬林模型及貝內特模型(Bennett Model)的模型、以及在美國專利申請案第2011/0124711號及美國專利第7,998,980號中所述之其他模型來測試。角叉菜膠誘發的痛覺超敏及CFA誘發的痛覺超敏係發炎性疼痛的模型。貝內特模型提供了慢性疼痛包括手術後疼痛、複雜性局部疼痛 症候群(complex regional pain syndrome)、及反射性交感神經失養症的動物模型。
可使用任何前述的動物模型來評估本發明之原毒素-II變體抑制劑治療疼痛及/或NAv1.7介導的疼痛的效力。本發明之原毒素-II變體的效力可與不治療或安慰劑對照組比較。另外或替代地，可與一或多種已知的緩解疼痛藥物比較來評估效力。
本發明提供使用在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)治療Nav1.7介導的疼痛之方法。在本發明人的待審申請案(美國專利申請案第61/781,276號)中已發現，在各種疼痛的動物模型中投予Nav1.7阻斷肽可有效治療及/或緩解疼痛，此與文獻中所揭示及建議者相反。雖然Nav1.7的肽抑制劑在使用過度表現Nav1.7的體外細胞培養模型或在單離的神經元(其中血-神經障壁係透過脫鞘(desheath)或高張鹽水注射破壞)已顯示出有效及/或對於Nav1.7具有選擇性，但彼等迄今在疼痛的體內動物模型中仍證實無效，其中效力的缺乏已被報導係起因於該等肽無法通過血-神經障壁。一些出版物描述Nav1.7阻斷肽在疼痛的動物模型或單離的神經中缺乏效力。例如，Hackel等人(Proc Natl Acad Sci 109：E2018-27,2012)描述ProTx-II無法抑制單離神經中的動作電位放電，除非神經周圍的障壁(在此模型中提供擴散障壁)受到損害。ProTx-II被發現在急性和發炎性疼痛的囓齒動物模型中無效；可能的解釋為ProTx-II無法穿過血-神經障壁(Schmalhofer等人，Mol Pharmacol 74：14761484,2008)。已有人提出Nav1.7肽毒素阻斷劑的口服生體可 用率差，且難以遞送至神經末端，這意味著彼等作為治療劑的用途仍然有限(Dib-Hajj等人，Nature Rev Neuroscience 14,49-62,2013)。
Nav1.7係表現於周邊神經系統中，例如傷害感受性背根神經節(DRG)中，最值得注意的是小直徑傷害感受性DRG神經元中，尤其是皮膚中的周邊末端，在腦中則有少量表現。Nav1.7的分布(例如感覺終端(sensory ending))及生理學使其在傳輸疼痛刺激上扮演重要角色。
本發明的一個實施例係一種治療Nav1.7介導的疼痛的方法，其係藉由向有其需要之個體投予治療有效量的在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)持續一段足以治療該Nav1.7介導的疼痛的時間。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)可被利用於任何想要治療Nav1.7介導的疼痛或其他感覺或交感神經元功能異常病症的治療中。疼痛的「治療(treat或treatment)」意指包括部分或完全地預防、中止、抑制、減少、或延緩疼痛知覺。
在一些實施例中，該Nav1.7介導的疼痛係慢性疼痛、急性疼痛、神經病變性疼痛、傷害感受性疼痛、內臟痛、背痛、手術後疼痛、熱痛、幻肢痛、或與發炎狀況、原發性肢端紅痛症(PE)、陣發性劇痛症(paraoxysmal extreme pain disorder,PEPD)、骨關節炎、類風溼性關節炎、腰椎間盤摘除術、胰臟炎、纖維肌痛、糖尿病疼痛性神經病變(painful diabetic neuropathy,PDN)、帶狀疱疹後神經病變 (post-herpetic neuropathy,PHN)、三叉神經神經痛(TN)、脊髓損傷或多發性硬化症相關的疼痛、或與疾病及退化相關的疼痛。
神經病變性疼痛包括例如糖尿病疼痛性神經病變(PDN)、帶狀疱疹後神經病變(PHN)或三叉神經神經痛(TN)。神經病變性疼痛的其它原因包括脊髓損傷、多發性硬化症、幻肢痛、中風後疼痛及HIV相關的疼痛。病況諸如慢性背痛、骨關節炎及癌症亦會導致神經病變性相關疼痛的產生，因此可能適合本發明之原毒素-II變體之治療。
在另一實施例中，Nav1.7介導的疼痛係與原發性肢端紅痛症(PE)、陣發性劇痛症(PEPD)、骨關節炎、類風濕性關節炎、腰椎間盤摘除術、胰臟炎或纖維肌痛有關。
在本發明之方法中，本發明之原毒素-II變體可接合至第二多肽以形成融合蛋白。該等融合蛋白係例如習知的Fc融合或與人血清白蛋白融合，以延長該等肽抑制劑的半衰期。該接合可透過連接子(例如富含甘胺酸-絲胺酸的連接子)直接接合。該等連接子係所屬技術領域中所習知。可使用習知方法及本文中所述之方法來比較包含額外部分的本發明之原毒素-II變體的Nav1.7阻斷能力及治療或減輕疼痛的效力。
其他可用本發明之原毒素-II變體治療之感覺或交感神經元功能異常病症包括氣喘、咳嗽、心口灼熱(heart-burn)、搔癢、皮膚炎、膀胱不穩定(bladder instability)、及雷諾氏病(Reynaud’s disease)。
醫藥組成物
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)可經配製於醫藥上可接受的媒劑或載劑中。本發明的一個實施例係一種醫藥組成物，其包含本發明之單離的原毒素-II變體及醫藥上可接受的賦形劑。
合適的媒劑或載劑可為注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊髓液，其可能添加有其他常見於非經腸投予組成物中之材料。進一步的例示性媒劑係中性緩衝液或與血清白蛋白混合的鹽水。該些溶液係無菌的且通常不含微粒物質，並且可透過常規的、習知的滅菌技術(例如過濾)來滅菌。當需要接近生理條件時，該些組成物可含有醫藥上可接受之賦形劑，諸如pH調節及緩衝劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑及著色劑等等。合適的媒劑及其配方和包裝係描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(21st ed.,Troy,D.ed.,Lippincott Williams & Wilkins,Baltimore,MD(2005)Chapters 40 and 41)中。
在本發明之方法中，本發明之原毒素-II變體可藉由周邊投予給予。「周邊投予(Peripheral administration)」或「經周邊投予(administered peripherally)」意指將藥劑引入個體中非中樞神經系統之處。周邊投予涵蓋任何直接投予至脊柱或腦以外的投予途徑。
周邊投予可為局部性或全身性。可使用局部投予以將治療劑集中在作用部位，諸如局部投予至關節、手術傷口、損傷/創傷部 位、周邊神經纖維、各種器官(GI、泌尿生殖器等等)或發炎組織。全身性投予造成醫藥組成物遞送至該個體的基本上整個周邊神經系統，且亦可能造成遞送至中樞神經系統，其係取決於該組成物的性質。
周邊投予途徑涵蓋但不限於局部投予、靜脈內、皮下、肌肉內、關節內、或其它注射、及植入微型泵(mini-pump)或其它延長釋放裝置或配方。
化合物也可經直接投予至中樞神經系統，例如鞘內或腦池內投予。連續鞘內投予可透過使用植入式脊椎藥物泵來實現。
本發明之醫藥組成物包括涉及在持續遞送或控制遞送配方中的本發明之原毒素-II變體的配方。該些配方可透過使用例如可注射微球、生物可蝕性顆粒(bio-erodible particle)、微乳液、奈米顆粒、奈米膠囊、巨乳液、聚合化合物(諸如聚酯、聚胺基酸、水凝膠、聚(乳酸)、聚乙醇酸或乙烯乙酸乙烯酯共聚物)、珠或脂質體、玻尿酸或可植入的藥物遞送裝置來實現。
在本文中所揭露之本發明的原毒素-II變體(包括於下列編號實施例中)可經製備以用於非經腸(皮下、肌內或靜脈內)、大腦內(腦實質內)、鞘內、關節內、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內、或病灶內途徑；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置、或任何其它投予方式，特別是以液體溶液或懸浮液的形式；用於經頰或舌下投予，例如以片劑或膠囊的形式；或鼻內地，例如以粉劑、鼻滴劑或氣霧劑或某些藥劑的形式；經皮地，以凝膠、軟膏、乳液、乳 膏或塵粉的形式、懸浮液或貼片遞送系統，其含有化學增強劑以修飾皮膚結構或增加經皮貼片的藥物濃度、或含有能使含蛋白質及肽的配方施加到皮膚上的藥劑(國際專利公開案第WO98/53847號)，或施加電場以產生暫時性運輸路徑(例如電穿孔)、或增加帶電藥物穿過皮膚的移動性例如電離子透入法(iontophoresis)，或施加超音波例如超音波導入法(sonophoresis)(美國專利第4,309,989及4,767,402號)。該組成物亦可透過植入其上已吸收或包封所欲分子之膜、海綿或另一適當材料來局部投予。
在某些使用植入裝置的實施例中，該裝置可被植入進任何合適的組織或器官，且所欲分子之遞送可透過擴散、定時釋放單劑(timed-release bolus)、或連續投予進行。
根據所選擇的具體投予模式，在該醫藥配方中之本發明之原毒素-II變體或其他Nav1.7的肽抑制劑的濃度可廣泛變化，例如以重量計自約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、或2%至5%之間，高至多達15%、20%、30%、40%、50%、60%或70%，且主要將根據流體體積、黏度和其他因素選擇。本發明之原毒素-II變體可凍乾貯存，並在使用前於合適的媒劑中重構。此技術已顯示可有效用於常規蛋白製劑。凍乾及重構技術係所屬技術領域中所習知。
本發明之例示性醫藥組成物可包含約pH 7.0至8.5的Tris緩衝液、或約pH 4.0至5.5的醋酸鹽緩衝液，並可進一步包括山梨糖醇、蔗糖、吐溫20(Tween-20)、及/或彼等之合適替代品。
適當的治療有效劑量可由所屬技術領域中具有通常知識者容易地判定。有效劑量意指足以產生所欲結果(亦即部分或完全地預防、中止、抑制、減少或延緩與任何疼痛醫學病況有關的疼痛知覺)的量或劑量。該有效量可視所選之特定媒劑與本發明之原毒素-II變體而變化，且亦取決於與要治療的個體有關的各種因素及病況以及疼痛的嚴重性。例如，諸如要投予本發明之醫藥組成物的個體之年齡、體重及健康等因素，以及在臨床前動物研究中所獲得之劑量反應曲線和毒性數據皆可在考慮之中。經決定之劑量若有需要，可在治療期間之經適當選擇的合適時間間隔，由醫生或其他相關領域之技藝人士(例如護士、獸醫、或獸醫技術人員)重複給予。決定給定藥劑之有效量或治療有效量係所屬技術領域中具有通常知識者的能力範圍內。
因此，用於肌肉內注射之本發明之醫藥組成物可經製備而含有1ml無菌緩衝水，以及介於約1ng至約100mg、約50ng至約30mg或約5mg至約25mg之間的本發明之原毒素-II變體。同樣地，用於靜脈內輸注之本發明之醫藥組成物可被作成含有約250ml的無菌林格氏液(Ringer's solution)，以及約1mg至約30mg或約5mg至約25mg的本發明之原毒素-II變體。用於製備可非經腸投予之組成物的實際方法係眾所皆知且詳細描述於例如「Remington's Pharmaceutical Science」，15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA中。
本發明之進一步實施例
以下所提出根據本文中他處揭示的本發明之某些進一步實施例。經描述為與本文中所揭露之本發明相關的來自以上提出之本發明之實施例的特徵亦與這些進一步編號實施例之每一者有關。
1)一種單離的原毒素-II變體，其包含序列X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14FX15CX16LWCX17KKLW(SEQ ID NO：403)，其中X1係G、P、A、或經刪除；X2係P、A、或經刪除；X3係S、Q、A、R、或Y；X4係Q、R、K、A、或S；X5係K、S、Q、或R；X6係M或F；X7係T、S、R、K、或Q；X8係D或T；X9係S、A、或R；X10係E、R、N、K、T、或Q；X11係R或K；X12係K、Q、S、或A； X13係E、Q、或D；X14係G或Q；X15係V或S；X16係R或T；且X17係K或R；可選地具有N-端延伸或C-端延伸，其中該多肽以約1×10-7M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量。
2)如申請專利範圍第1項所述之原毒素-II變體，其中該N-端延伸包含SEQ ID NO：372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、或385之胺基酸序列。
3)如申請專利範圍第1或2項所述之原毒素-II變體，其中該C-端延伸包含SEQ ID NO：374、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、或397之胺基酸序列。
4)如申請專利範圍第2或3項所述之原毒素-II變體，其中該N-端及/或該C-端延伸係透過連接子接合至該原毒素-II變體。
5)如申請專利範圍第4項所述之原毒素-II變體，其中該連接子包含SEQ ID NO：383、392、398、399、400、401或402之胺基酸序列。
6)如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其包含SEQ ID NO：30、40、44、52、56、56、59、65、78、109、110、111、114、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、178、179、180、182、183、184、185、186、189、190、193、195、197、199、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、224、226、227、231、232、243、244、245、247、249、252、255、258、261、263、264、265、266、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、332、334、335、336、337、 339、340、341、342、346、351、358、359、364、366、367、或368之胺基酸序列。
7)如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其以約3×10-8M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性。
8)如申請專利範圍第7項所述之單離的原毒素-II變體，其以介於約3×10-8M至約1×10-9M之間的IC50值抑制人類Nav1.7活性。
9)如申請專利範圍第7或8項所述之單離的原毒素-II變體，其包含胺基酸序列GPQCX1X2WX3QX4CX5X6X7X8X9CCX10X11FX12CX13LWCX14KKLW(SEQ ID NO：404)，其中X1係Q、R、K、A、或S；X2係K、S、Q、或R；X3係M或F；X4係T、S、R、K、或Q；X5係D或T；X6係S、A、或R；X7係E、R、N、K、T、或Q；X8係R或K；X9係K、Q、S、或A；X10係E、Q、或D； X11係G或Q；X12係V或S；X13係R或T；且X14係K或R。
10)如申請專利範圍第9項所述之單離的原毒素-II變體，其包含SEQ ID NO：56、78、111、114、117、118、119、122、123、129、130、131、132、133、134、135、136、138、139、140、141、142、145、146、147、149、150、151、152、153、154、156、158、159、165、172、173、175、177、178、183、184、185、186、189、190、193、197、199、207、210、211、216、217、224、266、273、282、或335之胺基酸序列。
11)如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其中該變體選擇性地抑制人類Nav1.7。
12)如申請專利範圍第11項所述之單離的原毒素-II變體，其包含序列GPX1CQKWMQX2CDX3X4RKCCX5GFX6CX7LWCX8KKLW(SEQ ID NO：405)；其中X1係Y、Q、A、S、或R；X2係T或S；X3係S、R、或A；X4係E、T、或N； X5係E或Q；X6係V或S；X7係R或T；且X8係K或R。
13)如申請專利範圍第12項所述之單離的原毒素-II變體，其包含SEQ ID NO：56、59、65、78、111、114、117、118、119、121、122、123、129、130、133、150、190、217、281、324、325、或326之胺基酸序列。
14)如申請專利範圍第12項所述之單離的原毒素-II變體，其包含序列GPQCQKWMQX1CDX2X3RKCCX4GFX5CX6LWCX8KKLW(SEQ ID NO：406)；其中X1係T或S；X2係S、R、或A；X3係E、T、或N；X4係E或Q；X5係V或S；X6係R或T；且X7係K或R。
15)一種單離的原毒素-II變體，其包含與SEQ ID NO：78(GPQCQKWMQTCDRERKCCEGFVCTLWCRKKLW-COOH)之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、或99%同一性的胺基酸序列，其中a)當殘基編號係根據SEQ ID NO：1時，該胺基酸序列在位置1具有Q、在位置7具有Q、且在位置19具有F；b)該多肽以約30×10-9M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量；且c)該多肽選擇性地抑制Nav1.7。
16)如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其具有游離的C-端羧酸、醯胺、甲基醯胺、或丁基醯胺基團。
17)一種單離的融合蛋白，其包含接合至半衰期延長部分之如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之原毒素-II變體。
18)如申請專利範圍第17項所述之融合蛋白，其中該半衰期延長部分係人血清白蛋白(HSA)、白蛋白結合域(ABD)、Fc、或聚乙二醇(PEG)。
19)一種單離的聚核苷酸，其編碼如申請專利範圍第12或15項所述之原毒素-II變體。
20)一種載體，其包含如申請專利範圍第19項所述之單離的聚核苷酸。
21)一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第20項所述之載體。
22)一種生產單離的原毒素-II變體的方法，其包含培養如申請專利範圍第21項所述之宿主細胞以及回收由該宿主細胞所生產之原毒素-II變體。
23)一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1、6、12、13或15項所述之單離的原毒素-II變體以及醫藥上可接受的賦形劑。
24)一種在個體中治療Nav1.7介導的疼痛之方法，其包含向有其需要之個體投予有效量的如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之原毒素-II變體以治療該疼痛。
25)如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該疼痛係慢性疼痛、急性疼痛、神經病變性疼痛、癌症疼痛、傷害感受性疼痛、內臟痛、背痛、手術後疼痛、熱痛、幻肢痛、或與發炎狀況、原發性肢端紅痛症(PE)、陣發性劇痛症(paraoxysmal extreme pain disorder,PEPD)、骨關節炎、類風溼性關節炎、腰椎間盤摘除術、胰臟炎、纖維肌痛、糖尿病疼痛性神經病變(painful diabetic neuropathy,PDN)、帶狀疱疹後神經病變(post-herpetic neuropathy,PHN)、三叉神經神經痛(TN)、脊髓損傷或多發性硬化症相關的疼痛。
26)如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該原毒素-II變體係經周邊投予。
27)如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該原毒素-II變體係經局部投予至關節、脊髓、手術傷口、損傷或創傷部位、周邊神經纖維、泌尿生殖器官、或發炎組織。
28)如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該個體係人類。
29)一種如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之原毒素-II變體在需要治療疼痛之個體中用於治療疼痛之用途。
30)如申請專利範圍第29項所述之原毒素-II變體的用途，其中該疼痛係慢性疼痛、急性疼痛、神經病變性疼痛、癌症疼痛、傷害感受性疼痛、內臟痛、背痛、手術後疼痛、熱痛、幻肢痛、或與發炎狀況、原發性肢端紅痛症(PE)、陣發性劇痛症(paraoxysmal extreme pain disorder,PEPD)、骨關節炎、類風溼性關節炎、腰椎間盤摘除術、胰臟炎、纖維肌痛、糖尿病疼痛性神經病變(painful diabetic neuropathy,PDN)、帶狀疱疹後神經病變(post-herpetic neuropathy,PHN)、三叉神經神經痛(TN)、脊髓損傷或多發性硬化症相關的疼痛。
31)如申請專利範圍第29或30項所述之原毒素-II變體的用途，其中該原毒素-II變體係經周邊投予。
32)如申請專利範圍第29、30或31項所述之原毒素-II變體的用途，其中該原毒素-II變體係經局部投予至關節、脊髓、手 術傷口、損傷或創傷部位、周邊神經纖維、泌尿生殖器官、或發炎組織。
本發明現將參照下面特定、非限制性實例予以說明。
實例1：原毒素-II變體之設計及產製
原毒素-II單一位置有限胺基酸取代掃描庫(single position limited amino acid substitution scanning library)係經設計以評估選擇性、肽產量、及同質性可以改善到什麼程度。
原毒素-II變體係經設計為HRV3C蛋白酶可切割的HSA融合蛋白，其N-至C-端的形式如下：6xHis-HSA-連接子-HRV3C可切割肽-原毒素-II變體(「6xHis」係揭示如SEQ ID NO：108)；連接子係(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO：80，HSA具有SEQ ID NO：106之序列，HRV3C可切割肽具有SEQ ID NO：82之序列)。各個原毒素-II變體在與HSA切割後，具有來自切割位點之殘留N-端GP。
該變體係於細胞膜去極化檢定法中使用FLIPR® Tetra表徵(如實例3 FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法中所述)，以及於全細胞膜片鉗實驗中使用QPatch檢定法表徵(如實例3中所述)。
組合式庫係經設計以測試選定單一位置命中的相加效應，以試圖產製與天然肽相比具有進一步改善效價及選擇性特性的Nav1.7拮抗劑。
表現載體的建構
使用如美國專利號US6,521,427中所述之合成基因組裝技術產製所設計之原毒素-II變體基因。使用人類高頻密碼子將所設計之肽變體的胺基酸序列反向轉譯成DNA序列。各個變體基因之DNA序列連同一部分載體DNA(包括DNA選殖位點)係經合成為多種寡核苷酸(其中一些含有簡併密碼子)並組裝進全長的DNA片段中。將組裝的DNA片段以PCR擴增，接著將PCR產物以匯集方式選殖。將匯集的PCR產物用合適的限制酶消化，並選殖進所設計之表現載體中，該選殖方式使得各個毒素變體基因得以與該載體中所含之信息肽與融合夥伴(6xHis-HSA-連接子-HRV3C可切割肽，「6xHis」係揭示為SEQ ID NO：108)融合。使用標準分子生物學技術來判定每個經設計變體之陽性殖株。純化來自這些陽性殖株的質體DNA並確認序列後，使用標準方法表現該等原毒素-II肽變體融合蛋白。
蛋白質表現
將HEK 293-F細胞維持在293 FreestyleTM培養基(Invitrogen Cat # 12338)中，並於細胞濃度介於每毫升1.5與2.0×106個細胞之間時分裝(split)。使細胞在設定為37℃及8% CO2的加濕培養箱中以125RPM搖動之懸浮液中生長。將HEK 293F細胞稀釋至每毫升1.0×106個細胞後，使用DNA/脂質複合體過渡性轉染。為了產製該複合體，將每毫升1.25μg的轉染DNA稀釋於1.0ml的OptiPro培養基(Invitrogen Cat # 12309)中，且將1.25ml的 FreestyleTM Max轉染試劑(Invitrogen Cat # 16447)稀釋於1.0ml的OptiPro培養基中。將該DNA與Max轉染試劑混合在一起，在室溫下培養10分鐘後加進細胞中。將轉染細胞置於設定為37℃與8% CO2的加濕培養箱中，以125RPM搖動4天。以5,000×g離心10分鐘自該等細胞分離出上清液並透過0.2μm過濾器(Corning；Cat #431153)過濾，接著使用Amicon Ultra Concentrator 10K(Cat #UFC901096)濃縮10倍及50倍，並以3,750×g離心約10分鐘。
實例2：原毒素-II變體的純化
原毒素-II變體係表現為HSA融合蛋白，如實例1中所示，且該原毒素-II變體肽在純化前係經HRV3C蛋白酶切割。測試兩種方法能否有效純化該等原毒素-II變體。
蛋白質純化
以RP-HPLC純化原毒素-II變體
透過IMAC使用1ml HisTrap HP管柱(GE Healthcare Cat# 17-5247-01)將所分泌之蛋白質從該表現上清液純化。使用AKTA Xpress進行層析法並使用咪唑的階段梯度從該管柱沖提出蛋白質。匯集峰部分(peak fraction)並以HRV 3C蛋白酶消化整夜(1μg蛋白酶/150μg融合)。
使用Dionex HPLC系統以逆相Phenomenex Luna 5μm C18(2)管柱(Cat# 00B-4252-P0-AX)將經切割的肽-融合池進一步純 化。以0至68%乙腈(0.05% TFA)線性梯度從該管柱沖提出樣本。匯集沖提部分(elution fraction)，凍乾整夜，並以pH 7.4的HEPES緩衝鹽水(10mM HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mM葡萄糖、2mM CaCl2、1mM MgCl2)重構。
表4顯示由RP-HPLC純化的原毒素-II變體產量。平均mg產量/L係0.01615。
以固相萃取(SPE)純化原毒素-II變體
透過IMAC使用1ml HisTrap HP管柱(GE Healthcare Cat# 17-5247-01)將所分泌之蛋白質從該表現上清液純化。使用AKTA Xpress進行層析法並使用咪唑的階段梯度從該管柱沖提出蛋白質。匯集峰部分(peak fraction)並以HRV3C蛋白酶消化整夜(1μg蛋白酶/150μg融合)。將經切割的樣本加樣至50kDa截留分子量離心過濾單元(Millipore UFC805096)，並在濾液部分收集經切割肽。
將肽池加樣到96孔固相萃取塊(Agilent Bond Elut Plexa A3969030)以進一步純化、脫鹽、並濃縮。塊體係與真空歧管(Whatman)一起使用。肽樣本係經加樣並以0.05%的水中TFA清洗，並以乙腈與0.05%的水中TFA的階段梯度沖提。接著將沖提部分凍乾整夜，並以pH 7.4的HEPES緩衝鹽水(10mM HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mM葡萄糖、2mM CaCl2、1mM MgCl2)重構。
肽係以經添加的HEPES緩衝鹽水pH 7.4(10mM HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mM葡萄糖、2mM CaCl2、1mM MgCl2)重構，並在280nm測量吸光度。接著使用各樣本的消光係數計算濃度值。2μg的各肽係經加樣到Invitrogen NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gel 15孔凝膠上並在未還原的MES緩衝液中跑膠。
樣本係於Agilent 1100 HPLC上使用4至80%乙腈於0.05% TFA中的線性梯度及Phenomenex Luna C18(2)分析管柱(Cat#00A-4041-B0)分析。所有肽的濃度係經正規化且注入10μl的各 肽使每個樣本總共有1.3μg。監測在220nm的吸光度並用Chromeleon軟體分析層析圖。
表5顯示由SPE純化的原毒素-II變體產量(mg)。平均mg產量/L係0.05353。
SPE純化方法的好處是純化的方便與處理量(因為樣品是在96孔塊上同時處理而不是在RP-HPLC上依序處理)、以及產量的提升。由SPE純化的變體產量比起由RP-HPLC純化的變體產量(mg/L)平均高出3倍。
實例3：原毒素-II變體的表徵
選定原毒素-II變體係於細胞膜去極化及全細胞膜片鉗檢定中表徵，以評估彼等對Nav1.7的效價及選擇性。
FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定
該等經產製之肽抑制由Nav1.7促效劑藜蘆定鹼(3-Veratroylveracevine；Biomol,Catalog# NA125)所誘發之細胞膜去極化的能力，係以FRET(螢光共振能量轉移)檢定在FLIPR® Tetra上測量，其係使用DISBAC2(3)(Invitrogen,K1018)作為電子受體，並使用PTS18(8-十八基氧芘-1,3,6-三磺酸三鈉)(Sigma)作為供體，在390至420nm刺激該供體並在515至575nm測量FRET。
將穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞培養於DMEM/F-12培養基(1：1)中，其係添加有10%胎牛血清、1%青黴素/鏈黴素、400μg/mL遺傳黴素(geneticin)及100μM NEAAs(所有試劑均來自Invitrogen)。將50μL收集到之細胞以每孔25,000個細胞接種在塗布有聚離胺酸的384孔黑色透明底盤中。該等盤係於室溫(RT)下培養15分鐘，接著於37℃培養整夜。所有培養皆在黑暗中進行，除非另有說明。隔天，將該等孔用檢定緩衝液(137mM NaCl、4mM KCl、2mM MgCl2、2mM CaCl2、5mM葡萄糖、10mM HEPES、pH 7.4)清洗4次，並再懸浮於25μL的檢定緩衝液中。PTS18染料的2×儲備液(6μM)係藉由將該染料以1：1(v/v比率)懸浮於10% Pluronic F127於DMSO中來製備。將25μL的2×PTS18儲備液加進孔槽中，在室溫下將細胞染色30分鐘，其後用檢定緩衝液洗掉該染料。肽係以3x最終濃度懸浮於含10μM DISBAC2(3)及400μM用以抑制背景螢光的VABSC-1(Sigma,cat# 201987)之檢定緩衝液中。將 該懸浮肽以25μL/孔加入各孔中，並於室溫培養60分鐘。以25μM最終濃度的藜蘆定鹼(藉由添加25μL/孔的75μM(3×)儲備液)誘發去極化，並在添加該促效劑後30至100秒測量FRET染料螢光平均強度的減少。各個測量肽在依常規添加藜蘆定鹼後發生1.3X稀釋，因此所報導的是在FLIPR® Tetra檢定開始時的濃度。
合成原毒素-II(Peptide International)的濃度-反應曲線係於各個實驗系列中建構並用來作為對照組。將各孔的螢光計數轉換為反應%，其係藉由將信號相對於陰性對照組(對單獨使用促效劑藜蘆定鹼的反應)與陽性對照組(在10μM四卡因(tetracaine)存在下對藜蘆定鹼的反應)數值之間的差異正規化獲得。在測量時，FLIPR® Tetra中的「空間均勻性校正(spatial uniformity correction)」(所有的螢光跡線相對於平均初始啟動強度正規化)及「減去偏差值(subtract bias value)」(從每個跡線減去初始啟動強度)係經打開。每個數據點代表單個孔中的反應。所有單個數據點係用於非線性最小平方擬合程序，以使用Origin(Microcal)找出對Hill函數的最佳擬合。從所生成的擬合曲線計算出IC50值。使用陽性(P)及陰性(N)對照組的平均反應來計算孔槽中的反應%，如下所示：反應%=100*(N-R)/(N-P)。
倘若當天對照拮抗劑的效價係在其歷史平均值的±0.5個對數單位之內，則接受該檢定盤。
QPatch檢定法
穩定表現人類Nav1.5(SEQ ID NO：105)、Nav1.7(SEQ ID NO：79)或Nav1.6(SEQ ID NO：407)的HEK293細胞係培養於DMEM/F-12培養基(1：1)中，該培養基添加有10%胎牛血清、1%青黴素/鏈黴素、400μg/mL遺傳黴素(Geneticin)及100μM NEAAs(所有試劑均來自Invitrogen)。將細胞維持於37℃及5% CO2中，在達到約50至90%長滿後進行檢定。以四環素可誘發的方式穩定表現人類Nav1.6(SEQ ID NO：407)的CHO細胞係培養於添加有10%胎牛血清、1%青黴素/鏈黴素、10μg/mL殺稻瘟菌素及400μg/mL吉歐黴素(Zeocin)的HAMs F12中。將細胞維持於37℃及5% CO2中，在達到約50至90%長滿後進行檢定。在實驗的24至48小時前，以1μg/ml的四環素誘發Nav1.6表現。
於QPatch HT(Sophion)中測試前，先使用0.05%胰蛋白酶將細胞解離(5分鐘於37℃)，使其再懸浮於CHO-S-SFM培養基(Life Technologies)中，並輕輕研磨以打破細胞結塊。以相同培養基將細胞密度調整至1至2×106/mL，接著將細胞轉移至QPatch HT中的細胞「旅館(hotel)」並在實驗中使用數小時。用於千兆歐姆(giga-ohm)密封形成及全細胞膜片鉗記錄之胞外溶液含有137mM NaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、5mM葡萄糖、及10mM HEPES，pH=7.4，且滲透壓=315mOsm。胞內溶液含有135mM CsF、10mM CsCl、5mM EGTA、5mM NaCl、及10mM HEPES，pH=7.3，且滲透壓=290mOsm。該檢定所使用的電位規程如下。先將保持電位為-75mV(Nav1.7)、-60mV(Nav1.6)、或-105mV (Nav1.5)的細胞超極化(hyperpolarize)至-120mV持續2秒，接著去極化至0mV持續5毫秒，之後回到該保持電位。在液體施用期間(見下文)，每60秒重複該規程一次。未執行以上電位規程時，使細胞維持在保持電位。在建立了全細胞記錄組態後，總共施用5次胞外溶液(全部皆含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)且帶有或不帶有測試化合物，但最後一次施用除外，其含有1μM TTX或10mM利多卡因(lidocaine)作為陽性對照組)至將被記錄之細胞。第一次液體施用僅含有對照緩衝液(5μl)。在該次施用後5秒，執行電位規程10次(總期間為10分鐘)。接下來的三次液體施用(各5μl)含有測試化合物(所有三次施用均使用相同濃度的相同化合物)或對照緩衝液(僅用於對照細胞)。在每次施用後五秒，再次執行電位規程10次(一樣每分鐘一次)。最後一次施用含陽性對照(由三次10μl子施用組成，各分隔2秒)，其後五秒執行相同電位規程兩次，以得到基期電流(baseline current)。電流係以25kHz取樣並用8極Bessel濾波器以5kHz過濾。將串聯電阻補償水準(series resistance compensation level)設定為80%。對每個細胞，首先將前四次液體施用中每個電流軌跡在0mV的峰電流振幅自陽性對照存在下之最後一個軌跡之該值減去，並接著相對於第一次(對照緩衝液)施用中最後一個軌跡之該值正規化成抑制%。為了控制電流下降(current rundown)，在測試化合物存在下每個細胞之此(抑制%)值，係進一步相對於相同實驗中對照(一般5至6個)細胞的平均抑制%值正規化。在最後一次化合物施用中最後兩個該等值的平均(亦即各濃度之測試化合物經校正的抑制% 值)係經採用作為每個細胞在所測試的特定化合物濃度下的抑制%值。所有測試細胞在各個化合物濃度下之抑制%值係經平均並用於濃度反應計算。所有實驗均於室溫(約22℃)進行。數據表示為平均值±標準誤差(se)。各實驗中包括野生型原毒素-II作為陽性對照組(positive control)。只有當原毒素-II的效價係在其歷史平均值的±0.5個對數單位之內，才接受數據。
使用FLIPR® Tetra所測得之選定原毒素-II變體對Nav1.7的IC50值係顯示於表6中。
使用QPatch測試選定原毒素-II變體對人類Nav1.5的選擇性。使用QPatch所測得之選定肽對Nav1.7及Nav1.5兩者的IC50值係顯示於表7中。
實例4. 組合式原毒素-II變體的產製及表徵
組合式庫係經設計以測試選定單一位置命中的相加效應，以試圖使用數種方法產製與天然肽相比具有進一步改善效價及選擇性特性的Nav1.7拮抗劑。
在所有非半胱胺酸的原毒素-II位置使用A、D、Q、R、K及S進行有限胺基酸掃描以達多樣化。在這些實驗中，原毒素- II係經表現及測試為單價Fc融合蛋白，如實例1中所述。從該掃描中，識別出取代Y1Q、W7Q、S11A可提昇所生成變體之效價及/或選擇性。
在位置M6及M19亦進行全胺基酸掃描(排除cys及trp)。從該掃描中，識別出M19F取代可提昇所生成變體之效價及/或選擇性。
原毒素-II/虎紋捕鳥蛛毒素(Huwentoxin)-IV單一位置嵌合體係以雙向設計。該庫的目的是為了獲得保有野生型原毒素-II的效價及選擇性特性，並可達成與虎紋捕鳥蛛毒素-IV有關的有益再折疊性質的原毒素-II變體。自該掃描中識別出取代R22T及E12N。
肽NV1G1153係經進一步工程化，其藉由使用R、K、T、A、D、E、Q及S之有限胺基酸掃描以多樣化位置Y1，以及藉由電荷團簇(charge cluster)工程化，其中使該肽的三維結構中之所有帶電殘基組(D10/E12、K4/E17、D10/E12/R13)突變。
將N-及C-端延伸引入選定肽(包括NV1G1153)以改善作用位點的肽分佈並提高肽半衰期而不顯著增加所生成肽的分子量。使用的N-及C-端延伸係分別顯示於表8及表9中，並於下列文獻中描述：Oi等人，Neuroscience Letters 434,266-272,2008；Whitney等人，Nature Biotechnology 2011 29：4,352-356；Sockolosky等人，(2012)109：40,16095-16100。亦使用細胞穿透肽HIV Tat及聚精胺酸。使用各種連接子以耦合該原毒素-II變體及該等N-及/或C-端延伸。使用的連接子係顯示於表10中。
使用實例3中所述之方法測試來自各實驗設計(campaign)的原毒素-II變體對Nav1.7的效價及選擇性。以200nM或更小的IC50值抑制Nav1.7之變體的胺基酸序列係顯示於表3中。表11顯示當與野生型原毒素-II比較時，選定變體中的胺基酸取代，以及在FLIPR Tetra檢定中抑制Nav1.7的IC50值。
在如實例3中所述之FLIPR檢定中，野生型原毒素-II抑制Nav1.7的IC50值約為4nM。保有顯著Nav1.7效價之變體係經進一步表徵。圖1顯示所產製的原毒素-II變體的序列屬(sequence genus)，該等原毒素-II變體抑制Nav1.7的IC50值為30nM或更小。
使用QPatch測試選定原毒素-II變體對Nav1.7的抑制及對人類Nav1.6的選擇性。使用QPatch所測得之選定肽對Nav1.7及Nav1.6兩者的IC50值係顯示於圖2中。該些肽抑制Nav1.7的IC50為30nM或更小，且對Nav1.7的選擇性至少為對Nav1.6的30倍。
圖2所示之肽的胺基酸序列係顯示於圖3中。當與野生型原毒素-II相比時，所有這些肽具有W7Q與M19F取代。
原毒素-II變體係如實例1中所述表現及純化，或藉由標準固相合成方法合成。將該等重組或合成肽的產量與野生型原毒素 II的產量相比。表12顯示選定原毒素-II變體的產量顯著高於原毒素-II的產量，表示該等變體的折疊性質改善。固相合成的規模係0.5mmol。
實例5. 原毒素-II變體在疼痛的體內(in vivo)模型中有效
材料和方法
動物：本研究使用訂購自Charles River並單獨飼養的雄性C57Bl/6小鼠(24至26g)。
行為測試
Von Frey測試：機械(觸覺)閾值係藉由Von Frey毛(hair)按照上下法(Up-Down method)評估(Dixon,1980,Chaplan等人，1994)。使用7級刺激(7 graded stimuli)(von Frey細絲(filament)：0.03、0.07、0.16、0.4、0.6、1、2g；Stoelting,Wood Dale,IL)。Von Frey毛係呈現為垂直於後爪的中央足底區域(隆凸之間)。施加足夠的力以略微彎曲該細絲並保持3秒。根據Chaplan的論文，陽性 反應可為1)急速縮回或2)在移開細絲後立即縮腳。更多細節請見Chaplan等人的論文。在試驗前使小鼠適應測試籠的金屬網30至60分鐘。
Hargreaves測試：使用修改過的Hargreaves箱測量熱爪縮回潛伏期(PWL)(Hargreaves等人，1988,Pain,32：77-88；Dirig等人，1997,J Neurosci.Methods,76：183-191)。該箱係由具有升高玻璃地板的室所組成，該地板被維持在一個恆定的溫度(27℃)。熱傷害感受性刺激源自在該玻璃表面下方的投射燈泡光束。該光束瞄準隆凸之間的區域(足底中心)。「開始」按鈕將打開燈並啟動計時器。受刺激爪的動作(例如突然縮回)會觸發開關以關閉燈光和停止計時器。顯示以秒為單位的潛伏期。如果沒有動作發生，燈泡會在20秒(截止)後關閉，以防止組織損傷。在測量PWL前，允許動物在該玻璃表面上適應30至60分鐘。在整個研究中使用恆定安培數，其導致測試前的爪縮回潛伏期介於8至12秒之間，此為相隔至少5分鐘取得的3至6個讀數之平均值。
MPE%計算：最大可能作用百分比(MPE%)=(T1-T0)/(Tc-T0)×100%。T0：第0天的閥值(CFA後，泵植入前)；T1：泵植入後第1天的閥值；Tc：測試截止點(Hargreaves測試為20秒，Von Frey測試為2g)。
熱板測試：將動物置於被4片Plexiglas牆(高15英寸)包圍的10"×10"金屬板上。將該板維持在50或55℃的溫度。測量反應潛伏期(當動物第一次縮腳或舔牠的後爪、跳起、或發出聲音 的時間)並將動物從板上移開。無顯示反應的動物在40秒(50℃)或20秒(55℃)後從板上移開，以防止任何可能的組織損傷。該試驗係於一天內每15至60分鐘重複2至5次。
發炎性疼痛模型
CFA模型：以異氟烷(4%誘導及2%維持)使動物麻醉，並將20μL的100%弗氏完全佐劑(CFA；Sigma-Aldrich；Saint Louis,MO)注射至一隻後爪的中央足底區域，該注射使用連接50μL Hamilton注射器的27號針頭進行。
角叉菜膠模型：以異氟烷(4%誘導及2%維持)使動物麻醉，並將25μL溶解於生理鹽水中的2% λ-角叉菜膠(Sigma-Aldrich；Saint Louis,MO)注射至後爪的中央足底區域，該注射使用胰島素注射器進行(BD；Franklin Lakes,New Jersey)。
微型泵的植入
根據製造商的指南，將Alzet微滲透微型泵(Durect公司型號1003D及2001D)填充藥劑並預備。以異氟烷使小鼠麻醉(5%誘導；2%維持)。將牠們的背部剃毛，用異丙醇和優碘擦拭，並在肩胛骨之間做一個小切口。用一對鑷子或止血鉗，將皮下結締組織分開以形成小口袋。將泵插進該口袋中，並使流速調節器朝向遠離切口的方向。接著將皮膚切口用7mm縫合釘關閉，使動物在彼等之籠中恢復。
數據分析
數據表示為平均值±s.e.m。使用Prism(Graphpad Software Inc.,La Jolla,CA)進行繪圖及統計分析。在比較隨著時間變化的閾值方面，使用二因子變異數分析(two-way ANOVA)及接著進行Bonferroni多重比較檢定，顯著水準為p<0.05。熱板及MPE%數據係藉由單因子ANOVA及接著進行Bonferroni多重比較檢定來分析。
結果
變體NV1D3034-OH(NV1D3034-COOH)、NV1D3368-OH(NV1D3368-COOH)、及NV1D2775-OH(NV1D2775-COOH)的效力係於常用的發炎性疼痛模型CFA模型中研究。在後爪中注射CFA誘發腳掌水腫(未顯示)以及對熱刺激的過敏(熱痛覺過敏)，如第0天經注射爪的熱潛伏期降低所示(圖6A)。當以皮下滲透性微型泵投予NV1D3034-OH 684及1824μg/天時，熱痛覺過敏被完全反轉(圖4A及圖4B)。
NV1D3368-OH 684及1824μg/天完全反轉CFA誘發的熱痛覺過敏(圖5A及圖5B)。NV1D2775-OH在CFA模型中展現出強大效力。投予NV1D2775之後，熱潛伏期達到接近截止之值(圖6A及圖6B，1824μg/天)，顯示在抗痛覺過敏作用以外還有強大止痛作用。此外，NV1D2775-OH反轉了CFA誘發的觸摸痛(tactile allodynia)(圖6C及圖6D，1824μg/天)。NV1D2775-OH的抗痛覺 過敏作用早在泵植入後4小時可見(圖7A)。在熱及觸覺測試中，該作用皆於8小時達到最大(圖7A及圖7B)且於24小時仍維持。泵植入後48小時(預測泵已空的約24小時後)，熱潛伏期及觸覺閾值返回到對照水準(圖7A及圖7B)。
CFA誘發的熱痛覺過敏可藉由兩個額外肽：NV1D3368-醯胺(NV1D3368-NH2)及NV1D3034-N-甲基醯胺(NV1D3034-NHMe)輕易地反轉。實驗之熱MPE%係概述於表13中。
在熱板測試中NV1D2775-OH亦展現出強大的劑量依賴性效力(圖8)。投予1824μg/天後，在50及55℃的潛伏期達到接近截止之值。與PBS對照組相比，228μg/天的NV1D2775-OH產生中度但顯著的熱潛伏期增加。
在另一個發炎性疼痛模型(角叉菜膠模型)中評估NV1D2775-OH的效力。將NV1D2775-OH或PBS泵植入動物中。在泵植入前及泵植入後第1天測量熱縮回潛伏期。將λ-角叉菜膠注射至 後爪，並在角叉菜膠注射後第2、3及4小時再次測量熱潛伏期。1824μg/天的NV1D2775-OH產生顯著的止痛作用(圖9)。在後爪中注射λ-角叉菜膠誘發發炎(未顯示)並降低4小時測試期間內Hargreaves測試之熱爪縮回潛伏期(圖9，PBS組)。以1824μg/天的NV1D2775-OH預先處理之動物係充分免於角叉菜膠誘發的痛覺過敏。
實例6. 組合式原毒素-II變體的產製及表徵
原毒素-II之胺基酸掃描庫係經產製。在原毒素-II中每一個非半胱胺酸位置(Tyr1、Gln3、Lys4、Trp5、Met6、Trp7、Thr8、Asp10、Ser11、Glu12、Arg13、Lys14、Glu17、Gly18、Met19、Val20、Arg22、Leu23、Trp24、Lys26、Lys27、Lys28、Leu29及Trp30)之天然殘基係經以下殘基取代：Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、及Tyr。
突變肽係如實例1中所述經表現為與人血清白蛋白的重組融合，並使用HRV3C進行位點特異性酶切割以產製原毒素-II變體。各個原毒素-II變體在與HSA切割後，具有來自切割位點之殘留N-端GP。各個原毒素-II變體對人類Nav1.7的IC50值係根據實例3中所述之規程使用FLIPR Tetra或Qpatch來測量。使用Qpatch電生理法，將對人類Nav1.7展現出IC50 100nM的變體反篩選(counter-screen)對其他hNav通道的選擇性。識別選擇性命中(hits)並將其用於 設計組合式肽庫，該等庫係使用重組表現及固相肽合成來產生。使用如上詳述之相同策略來篩選組合式變體。
基於該等結果，可經突變以增進選擇性的位置包括Gln3、Ser11、Glu12、Lys14、Glu17、Gly18、Leu29及Trp30(殘基編號係根據SEQ ID NO：1)。
原毒素-II的溶解結構係藉由NMR測定，並顯示於圖10中為表面代表圖。該圖的左手邊顯示先前描述(Park等人，J.Med.Chem.2014,57：6623-6631)的圍繞M6之Trp殘基(W5/W7/W24)環。在該分子的另一邊，同時使用突變誘導和NMR結構，在此原毒素-II的研究中識別具有選擇性的面，其係由多個胺基酸位置組成，該些胺基酸位置可經突變以增進對hNav1.7相較於對其他鈉離子通道異構體的選擇性。位於該選擇性面的殘基包括殘基Ser11、Glu12、Lys14、Glu17、Gly18、Leu29及Trp30(殘基編號係根據SEQ ID NO：1)。該選擇性面及其中負責對Nav1.7選擇性的多個位置之識別先前未曾描述過。
Ser11經取代的原毒素II變體具有增進的選擇性係出乎意料的，因為先前的研究顯示Ser11的突變會影響多個Nav通道的活性，因此認定該殘基在原毒素-II對Nav1.7的選擇性上不起作用(Park等人，J.Med.Chem.2014,57：6623-6631)。
合成生產原毒素-II變體的關鍵步驟係線型肽的氧化再折疊，其中二硫配對係經形成。再折疊後的天然原毒素-II純化之RP- HPLC跡線在不同的滯留時間顯示多個峰，其具有正確質量但表現出不同程度的活性，表示這是肽的適當和不當折疊異構體之混合物。
原毒素-II的各種位置可經取代以改進RP-HPLC主峰的相對豐度，因而改進正確折疊肽的相對豐度。Trp7或Trp30的突變改善了所生成之原毒素-II變體的折疊。Trp7與Trp30兩者的組合突變進一步改善了所生成之原毒素-II變體的折疊，並可救援難以再折疊之原毒素-II變體的折疊。
生產具有一或多個改善選擇性的取代(Gln3、Ser11、Glu12、Lys14、Glu17、Gly18、及Leu29)以及Trp7與Trp30之突變的組合式突變肽，導致同時具有改善選擇性及改善再折疊性質之肽。原毒素-II屬於抑制性半胱胺酸結肽之家族3(Klint et.al.,Toxicon 60：478-491,2012)。Trp7在所有的家族3成員中係經保留，此位置之取代以及在敬釗纓毛蛛毒素(Jingzhaotoxin)-V(另一種家族3抑制性半胱胺酸結肽)中Trp5與Met6之取代導致效價喪失，表示在敬釗纓毛蛛毒素-V中位置5、6及7的疏水性殘基對敬釗纓毛蛛毒素-V的Nav1.7抑制效價至關重要(國際專利公開案第2014/165277號)。Trp5/Met6/Trp7亦經保留在原毒素-II中，因此並未預期在Trp7的極性取代可在不喪失原毒素-II活性且顯著改善再折疊性質之情況下進行。在Trp30之取代顯示出會同時改善該變體肽之Nav1.7選擇性及再折疊性質，且其係出乎意料的，因為個別有利的取代一般僅改善單一參數。
表13顯示所選定產製之原毒素-II變體的胺基酸序列。
如實例3中所述，使用FLIPR Tetra或Qpatch表徵選定變體對Nav1.7的抑制。表15顯示所得之IC50值。僅記錄一些變體以單一濃度(10nM或30nM)於Qpatch中之抑制%(% blk，相較於對照之阻斷百分比)。
測試選定變體對各種人類Nav1.x通道之作用。表16顯示該些實驗的結果。使用QPatch測量對每個通道的IC50值。
原毒素-II變體係如實例1中所述表現及純化，或藉由標準固相合成方法合成。將該等重組或合成肽的產量與野生型原毒素II的產量相比。表17顯示選定原毒素-II變體的產量顯著高於原毒素-II的產量，表示該等變體的折疊性質改善。固相合成的規模係0.1mmol。
實例7. 鞘內投予原毒素-II變體在疼痛的體內(in vivo)模型中有效
評估選定原毒素-II變體於鞘內投予後減少疼痛的效力。
在該等研究中使用肽NV1D2775-OH、NV1D3034、及63955918。使用測量急性熱痛之動物模型(甩尾及熱板)及損傷誘發疼痛之動物模型(福馬林縮腳)。
甩尾測試：將動物置於甩尾裝置(Ugo Basile)上。該裝置具有焦點紅外光加熱區(直徑5mm)。將該動物的尾巴(距末端1/3至1/2處)置於該焦點加熱區。將熱源的溫度調整至以媒劑處理的動物在10秒內會誘發甩尾。使用15秒的截止時間以防止組織傷害，如同文獻中之標準。測試組從熱刺激開始到任何迴避反應之間經過的時間係經自動測量及記錄。
熱板測試：將動物置於被4片Plexiglas牆(高15英寸)包圍的10"×10"金屬板上。將該板維持在52.5℃的溫度。測量反應潛伏期(當動物第一次縮腳或舔牠的後爪、跳起、或發出聲音的時間)並將動物從板上移開。無顯示反應的動物在30秒後從板上移開，以防止任何可能的組織損傷。
福馬林縮腳：使用由UCSD製造的自動化「縮腳反應」測量裝置測量福馬林所誘發的疼痛行為(亦即縮爪)。該裝置使用安裝在裝置地板下方的運動感測器來偵測黏在動物的一隻後爪上的金屬帶的任何突然移動。於福馬林注射前半小時至一小時，使用一小滴氰基丙烯酸酯將小金屬帶黏附到一隻後爪的足底表面，並將該動物置於要使其適應的測試室中。將福馬林(2.5%,50μL)皮下注射到黏附金屬帶的爪之背側。在足底內注射福馬林後，立即將該動物置於訂做的圓柱體(25×10×20cm,San Diego Instrument)內。縮爪會被自動記錄。
於急性熱痛模型中，單次鞘內投予原毒素-II變體63955918後產生強效且持久的止痛作用，如甩尾測試(圖11A及圖 11B)及熱板測試(圖11C、圖11D)中潛伏期增加所示。該止痛作用的顯著性及持續時間係劑量依賴性。
後爪福馬林注射係損傷誘發疼痛常用的模型。該注射誘發特有的雙相縮腳行為，其表示試驗動物疼痛。如圖11E中所示，以鞘內注射原毒素-II變體63955918預處理的動物在福馬林測試中顯示較少縮腳，其意味著抑制損傷誘發疼痛。
同樣的，肽NV1D2775-OH及NV1D3034於單次鞘內投予後，在甩尾、熱板及福馬林測試中展現出顯著效力(圖12A、圖12B、圖12C、圖12D、圖12E、圖13A、圖13B、圖13C、圖13D、圖13E)。
實例8. 其他原毒素-II變體的表徵
其他原毒素-II變體係使用如實例6中所述之策略及方法設計及表現，並根據如實例3中所述之規程於FLPR Tetra及/或Qpatch中表徵。
表18顯示所選定產製之原毒素-II變體的胺基酸序列。
如實例3中所述，使用FLIPR Tetra或Qpatch表徵選定變體對Nav1.7的抑制。表19顯示所得之IC50值。僅記錄一些變體 以單一濃度(10nM或30nM)於Qpatch中之抑制%(% blk，相較於對照之阻斷百分比)。se；標準誤差。
實例9. 63955918之變體的產製
原毒素-II變體63955918相較於野生型原毒素-II具有W7Q及W30L取代。如實例6中所述，單獨或組合發生的二個突變Trp7及Trp30改善了所生成之原毒素-II變體的折疊，並可救援難以再折疊之原毒素-II變體的折疊。
其他變體係經產製於63955918主鏈上，以評估進一步改善該分子之特徵的可能性。一些變體亦如實例6及7中所述。
所產製的變體及其序列係顯示於表20。
該等變體如上述所表徵。表21顯示IC50值及/或阻斷百分比(% blk)(相較於對照樣本的電流抑制%)。Se：標準誤差。
表21
實例10. 63955918之變體的產製
其他63955918之變體係經產製，以改善所生成的肽之生物分布。
W7及W30取代也經設計於各種家族3抑制性半胱胺酸結肽上，以評估由那些突變所授予之改善的選擇性及改善的再折疊性質是否延伸於Protoxin-II之外至其他高度同源性肽序列。如Klint等人(Toxicon 60：478-491,2012)所定義之抑制Nav通道的家族3蜘蛛毒素(NaSpTx)係經選擇為用於在位置7併入Q及在位置30併入L(編號基於Seq ID 1)之支架。這些序列包含β-捕鳥蛛毒素(theraphotoxin)-Gr1c、β-捕鳥蛛毒素-Gr1e、β/κ-捕鳥蛛毒素-Cg2a、κ-捕鳥蛛毒素-Ps1a、κ-捕鳥蛛毒素-Ps1b、κ-捕鳥蛛毒素-Gr2b、κ-捕鳥蛛毒素-Gr2c、κ-捕鳥蛛毒素-Gr2d、κ-捕鳥蛛毒素-Cg2a、κ-捕鳥蛛毒素-Cg2b、κ-捕鳥蛛毒素-Ec2c、β-捕鳥蛛毒素-Gr1d、β/κ-捕鳥蛛毒素-Pm2a、κ-捕鳥蛛毒素-Ec2a、及κ-捕鳥蛛毒素-Ec2b。
其他用於突變的家族3 NaSpTx支架係經識別於Arachnoserver(http：//__www_arachnoserver_org/__mainMenu_html)。家族3毒素之排比係顯示於圖14。
表22顯示所設計的變體之序列。
表22
併入非天然胺基酸所生成的變體係藉由標準固相肽合成及氧化再折疊產製。
具有附接peg基團的變體係經由標準化學接合方法產製。
所生成的變體係在如實例3所述之FLIPR Tetra及QPatch檢定法中測試其抑制Nav1.7的能力。
所產製的變體係使用如實例3所述之方法測試其選擇性。
<110> 健生生物科技公司(JANSSEN BIOTECH,INC.)
<120> 原毒素-II變體及使用方法
<130> JBI5065USPSP
<140>
<141>
<160> 407
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 1
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 3
<210> 4
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 4
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 5
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 6
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 7
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 8
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 9
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 10
<210> 11
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 11
<210> 12
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 12
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 13
<210> 14
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 14
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 15
<210> 16
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 16
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 17
<210> 18
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 18
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 19
<210> 20
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 20
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 21
<210> 22
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 22
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 23
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 24
<210> 25
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 25
<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 26
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 27
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 28
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 29
<210> 30
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 30
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 31
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 32
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 33
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 34
<210> 35
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 35
<210> 36
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 36
<210> 37
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 37
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 38
<210> 39
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 39
<210> 40
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 40
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 41
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 42
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 43
<210> 44
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 44
<210> 45
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 45
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 46
<210> 47
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 47
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 48
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 49
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 50
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 51
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 52
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 53
<210> 54
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 54
<210> 55
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 55
<210> 56
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 56
<210> 57
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 57
<210> 58
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 58
<210> 59
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 59
<210> 60
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 60
<210> 61
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 61
<210> 62
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 62
<210> 63
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 63
<210> 64
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 64
<210> 65
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 65
<210> 66
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 66
<210> 67
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 67
<210> 68
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 68
<210> 69
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 69
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 70
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 71
<210> 72
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 72
<210> 73
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 73
<210> 74
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 74
<210> 75
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 75
<210> 76
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 76
<210> 77
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 77
<210> 78
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 78
<210> 79
<211> 1977
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 79
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 80
<210> 81
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 81
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 82
<210> 83
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 83
<210> 84
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 84
<210> 85
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 85
<210> 86
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 86
<210> 87
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 87
<210> 88
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 88
<210> 89
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 89
<210> 90
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 90
<210> 91
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 91
<210> 92
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 92
<210> 93
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 93
<210> 94
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 94
<210> 95
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 95
<210> 96
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 96
<210> 97
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成G
<400> 97
<210> 98
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 98
<210> 99
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 99
<210> 100
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 100
<210> 101
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 101
<210> 102
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 102
<210> 103
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 103
<210> 104
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成聚核苷酸
<400> 104
<210> 105
<211> 2016
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 105
<210> 106
<211> 612
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 106
<210> 107
<211> 93
<212> DNA
<213> 秘魯綠絲絨狼蛛(Thrixopelma pruriens)
<400> 107
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成6xHis標籤
<400> 108
<210> 109
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 109
<210> 110
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 110
<210> 111
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 111
<210> 112
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 112
<210> 113
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 113
<210> 114
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 114
<210> 115
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 115
<210> 116
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 116
<210> 117
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 117
<210> 118
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 118
<210> 119
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 119
<210> 120
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 120
<210> 121
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 121
<210> 122
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 122
<210> 123
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 123
<210> 124
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 124
<210> 125
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 125
<210> 126
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 126
<210> 127
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 127
<210> 128
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 128
<210> 129
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 129
<210> 130
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 130
<210> 131
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 131
<210> 132
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 132
<210> 133
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 133
<210> 134
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 134
<210> 135
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 135
<210> 136
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 136
<210> 137
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 137
<210> 138
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 138
<210> 139
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 139
<210> 140
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 140
<210> 141
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 141
<210> 142
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 142
<210> 143
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 143
<210> 144
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 144
<210> 145
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 145
<210> 146
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 146
<210> 147
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 147
<210> 148
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 148
<210> 149
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 149
<210> 150
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 150
<210> 151
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 151
<210> 152
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 152
<210> 153
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 153
<210> 154
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 154
<210> 155
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 155
<210> 156
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 156
<210> 157
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 157
<210> 158
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 158
<210> 159
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 159
<210> 160
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 160
<210> 161
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 161
<210> 162
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 162
<210> 163
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 163
<210> 164
<211> 37
<212> PRRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 164
<210> 165
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 165
<210> 166
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 166
<210> 167
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 167
<210> 168
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 168
<210> 169
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 169
<210> 170
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 170
<210> 171
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 171
<210> 172
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 172
<210> 173
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 173
<210> 174
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 174
<210> 175
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 175
<210> 176
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 176
<210> 177
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 177
<210> 178
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 178
<210> 179
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 179
<210> 180
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 180
<210> 181
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 181
<210> 182
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 182
<210> 183
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 183
<210> 184
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 184
<210> 185
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 185
<210> 186
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 186
<210> 187
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 187
<210> 188
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 188
<210> 189
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 189
<210> 190
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 190
<210> 191
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 191
<210> 192
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 192
<210> 193
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 193
<210> 194
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 194
<210> 195
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 195
<210> 196
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 196
<210> 197
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 197
<210> 198
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 198
<210> 199
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 199
<210> 200
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 200
<210> 201
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 201
<210> 202
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 202
<210> 203
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 203
<210> 204
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 204
<210> 205
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 205
<210> 206
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 206
<210> 207
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 207
<210> 208
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 208
<210> 209
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 209
<210> 210
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 210
<210> 211
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 211
<210> 212
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 212
<210> 213
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 213
<210> 214
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 214
<210> 215
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 215
<210> 216
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 216
<210> 217
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 217
<210> 218
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 218
<210> 219
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 219
<210> 220
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 220
<210> 221
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 221
<210> 222
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 222
<210> 223
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 223
<210> 224
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 224
<210> 225
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 225
<210> 226
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 226
<210> 227
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 227
<210> 228
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 228
<210> 229
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 229
<210> 230
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 230
<210> 231
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 231
<210> 232
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 232
<210> 233
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 233
<210> 234
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 234
<210> 235
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 235
<210> 236
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 236
<210> 237
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 237
<210> 238
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 238
<210> 239
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 239
<210> 240
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 240
<210> 241
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 241
<210> 242
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 242
<210> 243
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 243
<210> 244
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 244
<210> 245
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 245
<210> 246
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 246
<210> 247
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 247
<210> 248
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 248
<210> 249
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 249
<210> 250
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 250
<210> 251
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 251
<210> 252
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 252
<210> 253
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 253
<210> 254
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 254
<210> 255
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 255
<210> 256
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 256
<210> 257
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 257
<210> 258
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 258
<210> 259
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 259
<210> 260
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 260
<210> 261
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 261
<210> 262
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 262
<210> 263
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 263
<210> 264
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 264
<210> 265
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 265
<210> 266
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 266
<210> 267
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 267
<210> 268
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 268
<210> 269
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 269
<210> 270
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 270
<210> 271
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 271
<210> 272
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 272
<210> 273
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 273
<210> 274
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 274
<210> 275
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 275
<210> 276
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 276
<210> 277
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 277
<210> 278
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 278
<210> 279
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 279
<210> 280
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 280
<210> 281
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 281
<210> 282
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 282
<210> 283
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 283
<210> 284
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 284
<210> 285
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 285
<210> 286
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 286
<210> 287
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 287
<210> 288
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 288
<210> 289
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 289
<210> 290
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 290
<210> 291
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 291
<210> 292
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 292
<210> 293
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 293
<210> 294
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 294
<210> 295
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 295
<210> 296
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 296
<210> 297
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 297
<210> 298
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 298
<210> 299
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 299
<210> 300
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 300
<210> 301
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 301
<210> 302
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 302
<210> 303
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 303
<210> 304
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 304
<210> 305
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 305
<210> 306
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 306
<210> 307
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 307
<210> 308
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 308
<210> 309
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 309
<210> 310
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 310
<210> 311
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 311
<210> 312
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 312
<210> 313
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 313
<210> 314
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 314
<210> 315
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 315
<210> 316
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 316
<210> 317
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 317
<210> 318
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 318
<210> 319
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 319
<210> 320
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 320
<210> 321
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 321
<210> 322
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 322
<210> 323
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 323
<210> 324
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 324
<210> 325
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 325
<210> 326
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 326
<210> 327
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 327
<210> 328
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 328
<210> 329
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 329
<210> 330
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 330
<210> 331
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 331
<210> 332
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 332
<210> 333
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 333
<210> 334
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 334
<210> 335
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 335
<210> 336
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 336
<210> 337
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 337
<210> 338
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 338
<210> 339
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 339
<210> 340
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 340
<210> 341
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 341
<210> 342
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 342
<210> 343
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 343
<210> 344
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 344
<210> 345
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 345
<210> 346
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 346
<210> 347
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 347
<210> 348
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 348
<210> 349
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 349
<210> 350
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 350
<210> 351
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 351
<210> 352
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 352
<210> 353
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 353
<210> 354
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 354
<210> 355
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 355
<210> 356
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 356
<210> 357
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 357
<210> 358
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 358
<210> 359
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 359
<210> 360
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 360
<210> 361
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 361
<210> 362
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 362
<210> 363
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 363
<210> 364
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 364
<210> 365
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 365
<210> 366
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 366
<210> 367
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 367
<210> 368
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 368
<210> 369
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 369
<210> 370
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 370
<210> 371
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 371
<210> 372
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 372
<210> 373
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 373
<210> 374
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 374
<210> 375
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 375
<210> 376
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 376
<210> 377
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 377
<210> 378
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 378
<210> 379
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 379
<210> 380
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 380
<210> 381
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 381
<210> 382
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 382
<210> 383
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 383
<210> 384
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 384
<210> 385
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 385
<210> 386
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 386
<210> 387
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 387
<210> 388
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 388
<210> 389
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 389
<210> 390
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 390
<210> 391
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 391
<210> 392
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 392
<210> 393
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 393
<210> 394
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 394
<210> 395
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 395
<210> 396
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 396
<210> 397
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 397
<210> 398
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 398
<210> 399
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 399
<210> 400
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 400
<210> 401
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 401
<210> 402
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成肽
<400> 402
<210> 403
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /取代="Pro"或"Ala"或" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /取代="Ala"或" "
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> /取代="Gln"或"Ala"或"Arg"或"Tyr"
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> /取代="Arg"或"Lys"或"Ala"或"Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> /取代="Ser"或"Gln"或"Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> /取代="Phe"
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /取代="Ser"或"Arg"或"Lys"或"Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> /取代="Thr"
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> /取代="Ala"或"Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> /取代="Arg"或"Asn"或"Lys"或"Thr"或"Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> /取代="Lys"
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> /取代="Gln"或"Ser"或"Ala"
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> /取代="Gln"或"Asp"
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> /取代="Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> /取代="Thr"
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> /取代="Arg"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> /注意="序列中給定之變體殘基對於變體位置 註解中之殘基並無偏好"
<400> 403
<210> 404
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> /取代="Arg"或"Lys"或"Ala"或"Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> /取代="Ser"或"Gln"或"Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> /取代="Phe"
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /取代="Ser"或"Arg"或"Lys"或"Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> /取代="Thr"
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> /取代="Ala"或"Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> /取代="Arg"或"Asn"或"Lys"或"Thr"或"Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> /取代="Lys"
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> /取代="Gln"或"Ser"或"Ala"
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> /取代="Gln"或"Asp"
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> /取代="Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> /取代="Thr"
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> /取代="Arg"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> /注意="序列中給定之變體殘基對於變體位置 註解中之殘基並無偏好"
<400> 404
<210> 405
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> /取代="Gln"或"Ala"或"Ser"或"Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> /取代="Arg"或"Ala"
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> /取代="Thr"或"Asn"
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> /取代="Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> /取代="Thr"
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> /取代="Arg"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> /注意="序列中給定之變體殘基對於變體位置 註解中之殘基並無偏好"
<400> 405
<210> 406
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> /取代="Arg"或"Ala"
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> /取代="Thr"或"Asn"
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> /取代="Gln"
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> /取代="Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (24)..(24)
<223> /取代="Thr"
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> /取代="Arg"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> /注意="序列中給定之變體殘基對於變體位置 註解中之殘基並無偏好"
<400> 406
<210> 407
<211> 1980
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 407

Claims (34)

  1. 一種抑制人類Nav1.7活性之單離的原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體具有至少一個選自由W7Q及W30L所組成之群組的胺基酸取代；其中殘基編號係根據SEQ ID NO：1。
  2. 一種單離的原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體以約1×10-7M或更小、約1×10-8M或更小、約1×10-9M或更小、約1×10-10M或更小、約1×10-11M或更小、或約1×10-12M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量，其中該原毒素-II變體具有W7Q及/或W30L取代，其中殘基編號係根據SEQ ID NO：1。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之單離的原毒素-II變體，其包含序列X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14X15X16CX17LWCX18KKLX19(SEQ ID NO：432)，X1係G、P、A、或經刪除；X2係P、A、或經刪除；X3係S、Q、A、R、或Y；X4係Q、R、K、A、S、或Y；X5係K、S、Q、或R；X6係M或F； X7係T、S、R、K、或Q；X8係D、T、或天冬醯胺醯基-4-胺基丁烷；X9係S、A、R、I、或V；X10係E、R、N、K、T、Q、Y、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X11係R或K；X12係K、Q、S、A、或F；X13係E、Q、D、L、N、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X14係G、Q、或P；X15係M或F；X16係V或S；X17係R、T、或N-ω甲基-L-精胺酸(N-omega methyl-L-arginine)；且X18係K或R；且X19係W或L，可選地具有N-端延伸或C-端延伸。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之原毒素-II變體，其中當殘基編號係根據SEQ ID NO：1時，該變體在一或多個殘基位置Y1、W7、S11、E12、K14、E17、G18、R22、L29、及W30具有取代。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之原毒素-II變體，其包含序列YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-COOH(SEQ ID NO：416)；其中殘基Y1、S11、E12、K14、E17、G18、 L29、及/或W30係經以下取代a)顯示於表1之任何其他胺基酸；或b)非天然胺基酸。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之原毒素-II變體，其包含序列YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH(SEQ ID NO：422)；其中殘基Y1、S11、E12、K14、E17、G18、M19、L29、及/或W30係經以下取代a)顯示於表1之任何其他胺基酸；或b)非天然胺基酸。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之原毒素-II變體，其包含與SEQ ID NO：422(GPYCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH)之胺基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；其中當殘基編號係根據SEQ ID NO：1時，該原毒素-II變體在位置7具有Q且在位置30具有L。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之原毒素-II變體，其包含序列如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之原毒素-II變體，其包含序列X1X2X3CQKWMQTCDX4X5RX6CCX7X8X9VCRLWCKKKX10X11(SEQ ID NO：737)；其中 X1係G、P、A、或經刪除；X2係P、A、或經刪除；X3係S、Q、A、R、或Y；X4係S、A、R、I、或V；X5係E、R、N、K、T、Q、Y、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X6係K、Q、S、A、或F；X7係E、Q、D、L、N、或麩胺醯基-4-胺基丁烷；X8係G、Q、或P；X9係M或F；X10係L、V；且X11係W或L。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之原毒素-II變體，其中該N-端延伸包含SEQ ID NO：372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、或385之胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之原毒素-II變體，其中該C-端延伸包含SEQ ID NO：374、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、或397之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之原毒素-II變體，其中該N-端及/或該C-端延伸係透過連接子接合至該原毒素-II變體。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之原毒素-II變體，其中該連接子包含SEQ ID NO：383、392、398、399、400、401、或402之胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，該單離的原毒素-II變體以約3×10-8M或更小之IC50值抑制人類Nav1.7活性，當該IC50值係其中該IC50值係使用FLIPR® Tetra細胞膜去極化檢定法，於存在25×10-6M藜蘆定鹼(3-veratroylveracevine)的情況下，在穩定表現人類Nav1.7的HEK293細胞中利用螢光共振能量轉移(FRET)測量。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之單離的原毒素-II變體，其以介於約3×10-8M至約1×10-9M之間的IC50值抑制人類Nav1.7活性。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其中當該Nav1.7活性係根據實例3中所述之規程使用QPatch檢定法測量時，該變體抑制至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的Nav1.7活性。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其包含胺基酸序列GPQCX1X2WX3QX4CX5X6X7X8X9CCX10X11FX12CX13LWCX14KKLL(SEQ ID NO：433)，其中X1係Q、R、K、A、或S；X2係K、S、Q、或R；X3係M或F；X4係T、S、R、K、或Q； X5係D或T；X6係S、A、或R；X7係E、R、N、K、T、或Q；X8係R或K；X9係K、Q、S、或A；X10係E、Q、或D；X11係G或Q；X12係V或S；X13係R或T；且X14係K或R。
  17. 如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其包含SEQ ID NO：30、40、44、52、56、56、59、65、78、109、110、111、114、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、178、179、180、182、183、184、185、186、189、190、193、195、197、199、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、224、226、227、231、232、243、244、245、247、249、252、255、258、261、263、264、265、266、269、270、271、272、 273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、332、334、335、336、337、339、340、341、342、346、351、358、359、364、366、367、368、369、370、371、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、 578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735或736之胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述之單離的原毒素-II變體，其具有游離的C-端羧酸、醯胺、甲基醯胺、或丁基醯胺基團。
  19. 一種單離的融合蛋白，其包含接合至半衰期延長部分之如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之原毒素-II變體。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之融合蛋白，其中該半衰期延長部分係人血清白蛋白(HSA)、白蛋白結合域(ABD)、Fc、或聚乙二醇 (PEG)。
  21. 一種單離的聚核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之原毒素-II變體。
  22. 一種載體，其包含如申請專利範圍第21項所述之單離的聚核苷酸。
  23. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第22項所述之載體。
  24. 一種生產單離的原毒素-II變體的方法，其包含培養如申請專利範圍第23項所述之宿主細胞以及回收由該宿主細胞所生產之原毒素-II變體。
  25. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至20項中任一項所述之單離的原毒素-II變體或融合蛋白以及醫藥上可接受的賦形劑。
  26. 一種如申請專利範圍第1至20項中任一項所述之原毒素-II變體或融合蛋白用於製造在個體中治療Nav1.7介導的疼痛的藥劑之用途。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之用途，其中該疼痛係慢性疼痛、急性疼痛、神經病變性疼痛、癌症疼痛、傷害感受性疼痛、內臟痛、背痛、手術後疼痛、熱痛、幻肢痛、或與發炎狀況、原發性肢端紅痛症(PE)、陣發性劇痛症(paraoxysmal extreme pain disorder,PEPD)、骨關節炎、類風溼性關節炎、腰椎間盤摘除術、胰臟炎、纖維肌痛、糖尿病疼痛性神經病變(painful diabetic neuropathy,PDN)、帶狀疱疹後神經病變(post-herpetic neuropathy,PHN)、三 叉神經神經痛(TN)、脊髓損傷或多發性硬化症相關的疼痛。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之用途，其中該原毒素-II變體係經周邊投予。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之用途，其中該原毒素-II變體係經局部投予至關節、脊髓、手術傷口、損傷或創傷部位、周邊神經纖維、泌尿生殖器官、或發炎組織。
  30. 如申請專利範圍第26至29項中任一項所述之用途，其中該個體係人類。
  31. 如申請專利範圍第1至20項中任一項所述之原毒素-II變體或融合蛋白，其用於在需要治療疼痛之個體中用於治療疼痛。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之原毒素-II變體，其中該疼痛係慢性疼痛、急性疼痛、神經病變性疼痛、癌症疼痛、傷害感受性疼痛、內臟痛、背痛、手術後疼痛、熱痛、幻肢痛、或與發炎狀況、原發性肢端紅痛症(PE)、陣發性劇痛症(paraoxysmal extreme pain disorder,PEPD)、骨關節炎、類風溼性關節炎、腰椎間盤摘除術、胰臟炎、纖維肌痛、糖尿病疼痛性神經病變(painful diabetic neuropathy,PDN)、帶狀疱疹後神經病變(post-herpetic neuropathy,PHN)、三叉神經神經痛(TN)、脊髓損傷或多發性硬化症相關的疼痛。
  33. 如申請專利範圍第31或32項所述之原毒素-II變體，其中該原毒素-II變體係經周邊投予。
  34. 如申請專利範圍第31至33項中任一項所述之原毒素-II變體，其 中該原毒素-II變體係經局部投予至關節、脊髓、手術傷口、損傷或創傷部位、周邊神經纖維、泌尿生殖器官、或發炎組織。
TW105110361A 2015-04-02 2016-03-31 原毒素－ｉｉ變體及使用方法 TW201708249A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562142069P 2015-04-02 2015-04-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201708249A true TW201708249A (zh) 2017-03-01

Family

ID=57006450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105110361A TW201708249A (zh) 2015-04-02 2016-03-31 原毒素－ｉｉ變體及使用方法

Country Status (17)

Country Link
US (3) US10463714B2 (zh)
EP (2) EP3277304B1 (zh)
JP (2) JP6985151B2 (zh)
KR (1) KR20170134542A (zh)
CN (1) CN107921089A (zh)
AR (1) AR104173A1 (zh)
AU (2) AU2016242905B2 (zh)
BR (1) BR112017020896A2 (zh)
CA (1) CA2981336A1 (zh)
ES (1) ES2888799T3 (zh)
HK (1) HK1250476A1 (zh)
IL (2) IL254599B (zh)
MA (1) MA41864A (zh)
MX (1) MX2017012654A (zh)
TW (1) TW201708249A (zh)
UY (1) UY36602A (zh)
WO (1) WO2016161100A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10414808B2 (en) 2012-05-18 2019-09-17 Janssen Biotech, Inc. Huwentoxin-IV variants and methods of use
US9624280B2 (en) 2013-10-03 2017-04-18 Janssen Biotech, Inc. Protoxin-II variants and methods of use
MA41642A (fr) 2015-03-03 2018-01-09 Janssen Biotech Inc Variants de protoxine ii et méthodes d'utilisation
EP3277304B1 (en) 2015-04-02 2021-08-04 Janssen Biotech, Inc. Protoxin-ii variants and methods of use
TWI724392B (zh) 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法
CN109369784B (zh) * 2018-11-14 2019-08-30 青海芬陀利华生物科技有限公司 PaTx-1毒素及其应用
US20230241259A1 (en) * 2020-06-10 2023-08-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center IMAGING COMPOUNDS SELECTIVE FOR NaV1.7

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
ES2375330T3 (es) 1997-04-16 2012-02-28 Unigene Laboratories, Inc. Expresión directa de péptidos en medios de cultivo.
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
ES2340857T3 (es) 1997-09-16 2010-06-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Metodo para la sintesis quimica completa y emsamblaje de genes y genomas.
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
US20030148273A1 (en) * 2000-08-26 2003-08-07 Shoulian Dong Target enrichment and amplification
EP1348466A3 (en) 2002-02-01 2003-10-29 Inspire Pharmaceuticals, Inc. Method for treating pain with adenosine-tetraphosphates
US7659082B2 (en) 2002-02-19 2010-02-09 Xenon Pharmaceuticals Inc. Methods for identifying analgesic agents
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
EP1942948A4 (en) 2005-11-04 2010-03-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF THE NAV1.8 GENE
WO2007109324A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 Xenon Pharmaceuticals, Inc. Potent and selective nav 1.7 sodium channel blockers
EP2059524A4 (en) 2006-09-08 2009-11-25 Mayo Foundation AQUARETICAL AND NATRIURETIC POLYPEPTIDES WITHOUT VASCULAR EXPANSION ACTIVITY
US7998980B2 (en) 2006-09-15 2011-08-16 Hydra Biosciences, Inc. Compounds for modulating TRPV3 function
US7820623B2 (en) 2006-10-25 2010-10-26 Amgen Inc. Conjugated toxin peptide therapeutic agents
CN102202677A (zh) 2008-09-03 2011-09-28 阿尔伯维塔公司 治疗疼痛的活性剂和方法
WO2010104115A1 (ja) 2009-03-10 2010-09-16 独立行政法人産業技術総合研究所 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法
SG179101A1 (en) 2009-09-15 2012-05-30 Alomone Preclinical Ltd Novel peptides isolated from spider venom, and uses thereof
DK2545189T3 (en) * 2010-03-08 2018-04-23 Dana Farber Cancer Inst Inc COMPLETE COLD-PCR ENRICHMENT WITH REFERENCE BLOCKING SEQUENCE
WO2012004664A2 (en) 2010-07-07 2012-01-12 Purdue Pharma L.P. Analogs of sodium channel peptide toxin
CN101979411A (zh) 2010-10-21 2011-02-23 湖南师范大学 虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂
US20120185956A1 (en) 2011-01-18 2012-07-19 Gingras Jacinthe Global nav1.7 knockout mice and uses
EP3382039B1 (en) 2011-05-04 2023-09-13 Biocept, Inc. Methods for detecting nucleic acid sequence variants
US9102751B2 (en) 2012-05-18 2015-08-11 Janssen Biotech, Inc. Huwentoxin-IV variants and methods of use
US10414808B2 (en) 2012-05-18 2019-09-17 Janssen Biotech, Inc. Huwentoxin-IV variants and methods of use
CN110041420A (zh) 2012-05-18 2019-07-23 詹森生物科技公司 虎纹捕鸟蛛毒素-iv变体及其使用方法
US9718865B2 (en) 2012-07-27 2017-08-01 Purdue Pharma L.P. Sodium channel blocking peptides and the use thereof
EP2970408B1 (en) 2013-03-12 2018-01-10 Amgen Inc. Potent and selective inhibitors of nav1.7
CN104065367B (zh) 2013-03-20 2017-11-07 江苏多维科技有限公司 一种低功耗磁电阻开关传感器
US9624280B2 (en) 2013-10-03 2017-04-18 Janssen Biotech, Inc. Protoxin-II variants and methods of use
MA41642A (fr) * 2015-03-03 2018-01-09 Janssen Biotech Inc Variants de protoxine ii et méthodes d'utilisation
EP3277304B1 (en) 2015-04-02 2021-08-04 Janssen Biotech, Inc. Protoxin-ii variants and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
AR104173A1 (es) 2017-07-05
US10463714B2 (en) 2019-11-05
US20220054590A1 (en) 2022-02-24
CN107921089A (zh) 2018-04-17
CA2981336A1 (en) 2016-10-06
IL254599A0 (en) 2017-11-30
EP3960757A1 (en) 2022-03-02
HK1250476A1 (zh) 2018-12-21
US20160287666A1 (en) 2016-10-06
US20200054712A1 (en) 2020-02-20
UY36602A (es) 2016-09-30
JP2018511326A (ja) 2018-04-26
MX2017012654A (es) 2018-01-09
JP6985151B2 (ja) 2021-12-22
AU2016242905A1 (en) 2017-10-12
KR20170134542A (ko) 2017-12-06
BR112017020896A2 (pt) 2018-07-10
IL282508A (en) 2021-06-30
EP3277304B1 (en) 2021-08-04
AU2021266345A1 (en) 2021-12-09
JP2022008474A (ja) 2022-01-13
MA41864A (fr) 2021-03-24
IL254599B (en) 2021-05-31
EP3277304A1 (en) 2018-02-07
ES2888799T3 (es) 2022-01-07
AU2016242905B2 (en) 2021-08-12
EP3277304A4 (en) 2018-12-19
US11083776B2 (en) 2021-08-10
WO2016161100A1 (en) 2016-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210363204A1 (en) Protoxin-ii variants and methods of use
US11083776B2 (en) Protoxin-II variants and methods of use
JP6940636B2 (ja) プロトキシン−ｉｉ変異体及びその使用方法