ES2888799T3 - Variantes de Protoxina-II y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Una variante de Protoxina-II aislada que inhibe la actividad de Nav1.7 humano, que comprende: una secuencia de aminoácidos YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH (SEQ ID NO: 425), en donde el residuo Y1, S11, E12, K14, E17, G18, M19, y/o L29 se sustituye con un aminoácido no natural, en donde la numeración de residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos tiene una IC50 para la actividad de Nav1.7 humano de aproximadamente 30 x 10-9 o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FET) en presencia de 25x10-6 M de veratroilveracevina en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano y usando bis-(ácido 1,3- dietiltiobarbitúrico) trimetino oxonol como un aceptor de electrones y 8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico como un donante excitando el donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de Protoxina-II y métodos de uso
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a variantes de Protoxina-II, polinucleótidos sintéticos que las codifican y métodos para preparar y usar lo anterior.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC) están presentes en todas las células excitables, incluyendo las células del músculo cardíaco y esquelético y las neuronas centrales y periféricas. En las células neuronales, los canales de sodio son responsables de amplificar las despolarizaciones por debajo del umbral y generar el aumento rápido del potencial de acción. Como tal, los canales de sodio son esenciales para el inicio y propagación de señales eléctricas en el sistema nervioso. Se piensa que la función aberrante del canal de sodio es la base de una variedad de trastornos médicos (Hübner y Jentsch, Hum Mol Genet 11:2435-45, 2002), incluyendo la epilepsia (Yogeeswari et al., Curr Drug Targets 5:589-602, 2004), arritmia (Tfelt-Hansen et al., J Cardiovasc Electrophysiol 21:107-15, 2010), miotonía (Cannon y Bean, J Clin Invest 120:80-3, 2010) y dolor (Cregg et al., J Physiol 588: 1897-904, 2010). Los canales de sodio son típicamente un complejo de varias subunidades, siendo la principal la subunidad alfa formadora de poros, que sola es suficiente para funcionar.
En los humanos existen nueve miembros conocidos de la familia de subunidades alfa de los canales de sodio dependientes de voltaje, Nav1.1-Nav1.9. La subfamilia Nav1.x puede subdividirse farmacológicamente en dos grupos, el sensible a la tetrodotoxina (TTX) y el resistente a TTX. Nav1.7 (también conocido como PN1 o hNE) está codificado por el gen SCN9A, es sensible a TTX y se expresa principalmente en neuronas sensoriales y simpáticas periféricas. Nav1.7 se acumula en las terminaciones de las fibras nerviosas y amplifica las despolarizaciones por debajo del umbral pequeñas y actúa como un canal de umbral que regula la excitabilidad.
La función de Nav1.7 está implicada en varios estados de dolor, incluyendo el dolor agudo, inflamatorio y/o neuropático. En el hombre, las mutaciones de ganancia de función de Nav1.7 se han relacionado con la eritermalgia primaria (PE), una enfermedad caracterizada por dolor ardiente e inflamación de las extremidades (Yang et al., J Med Genet 41:171-4, 2004), y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD) (Fertleman et al., Neuron 52:767-74, 2006). En consistencia con esta observación, los bloqueadores de los canales de sodio no selectivos lidocaína, mexiletina y carbamazepina pueden proporcionar un alivio sintomático en estos trastornos dolorosos (Legroux-Crespel et al., Ann Dermatol Venereol 130:429-33, 2003; Fertleman et al., Neuron 52:767-74, 2006).
Las mutaciones con pérdida de función de Nav1.7 en humanos provocan indiferencia congénita al dolor (CIP), un trastorno autosómico recesivo raro caracterizado por una indiferencia o insensibilidad total a los estímulos dolorosos (CoXet al., Nature 444:894-8, 2006; Goldberg et al., Clin Genet 71:311-9, 2007; Ahmad et al., Hum Mol Genet 16:2114-21,2007).
Los polimorfismos de un solo nucleótido en la región codificante de SCN9A se han asociado con una excitabilidad del nociceptor y sensibilidad al dolor aumentadas. Por ejemplo, un polimorfismo rs6746030 que da como resultado la sustitución de R1150W en Nav1.7 humano se ha asociado con dolor de osteoartritis, dolor de discectomía lumbar, dolor fantasma y dolor por pancreatitis (Reimann et al., Proc Natl Acad Sci USA 107:5148-53, 2010). Las neuronas de DRG que expresan el Nav1.7 mutante R1150W muestran una frecuencia de descarga aumentada en respuesta a la despolarización (Estacion et al., Ann Neurol 66:862-6, 2009). Se ha asociado una forma discapacitante de fibromialgia con el polimorfismo del canal de sodio SCN9A rs6754031, lo que indica que algunos pacientes con fibromialgia grave pueden tener una canalopatía de sodio de los ganglios de la raíz dorsal (Vargas-Alarcon et al., BMC Musculoskelet Disord 13:23, 2012).
En ratones, la deleción del gen SCN9A en neuronas nociceptivas lleva a la reducción de los umbrales de dolor mecánico y térmico y a la reducción o abolición de las respuestas de dolor inflamatorio (Nassar et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:12706-11, 2004). La ablación de SCN9A en todas las neuronas sensoriales abolió el dolor mecánico, el dolor inflamatorio y las respuestas de abstinencia refleja al calor. La eliminación de SCN9A en neuronas sensoriales y simpáticas abolió el dolor mecánico, térmico y neuropático, y recapituló el fenotipo indoloro observado en humanos con mutaciones de pérdida de función de Nav1.7 (Minett et al., Nat Commun 3: 791, 2012). Por tanto, los inhibidores o bloqueadores de Nav1.7 pueden ser útiles en el tratamiento de una amplia variedad de dolores asociados con varios trastornos.
Se sabe que los venenos de araña contienen una gran cantidad de péptidos bloqueadores de los canales de sodio, incluyendo Huwentoxina-IV (HwTx-IV) (Peng et al., J Biol Chem 277:47564-71, 2002), Protoxina-I, Protoxina-II (Middleton et al., Biochemistry 41:14734-47, 2002) y Frixotoxina-III (Bosmans et al., Mol Pharmacol 69:419-29, 2006). La US2013/296247 se refiere a un péptido y análogos del mismo que inhiben selectivamente el canal de sodio de Nav1.7. Hay una necesidad de identificar bloqueadores de Nav1.7 adicionales para el tratamiento de una amplia variedad de indicaciones de dolor. En particular, hay una necesidad de nuevos bloqueadores de Nav1.7 con selectividad para Nav1.7 sobre otras isotermas de canales de sodio dependientes del voltaje.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una variante de Protoxina-II aislada que inhibe la actividad de Nav1.7 humano, que comprende:
una secuencia de aminoácidos YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH (SEQ ID NO: 425), en donde el residuo Y1, S11, E12, K14, E17, G18, M19, y/o L29 se sustituye con un aminoácido no natural, en donde la numeración de residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1,
en donde la secuencia de aminoácidos tiene una IC50 para la actividad de Nav1.7 humano de aproximadamente 30 x 10-9 o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FET) en presencia de 25x10-6 M de veratroilveracevina en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano y usando bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico) trimetino oxonol como un aceptor de electrones y 8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico como un donante excitando el donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.
La invención también proporciona una proteína de fusión aislada que comprende la variante de Protoxina-II como se define en las reivindicaciones conjugada con una fracción que extiende la vida media.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la variante de Protoxina-II, o la proteína de fusión, como se define en las reivindicaciones.
La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido aislado como se define en las reivindicaciones.
La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector como se define en las reivindicaciones.
La invención también proporciona un método para producir una variante de Protoxina-II aislada, o la proteína de fusión, como se define en las reivindicaciones, que comprende cultivar la célula huésped, y recuperar la variante de Protoxina-II producida por la células huésped.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la variante de Protoxina-II aislada o la proteína de fusión, como se define en las reivindicaciones y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona la variante de Protoxina-II o la proteína de fusión, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar el dolor mediado por Nav1.7 en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de la variante de Protoxina-II o la proteína de fusión para tratar el dolor.
La invención también proporciona la variante de Protoxina-II o la proteína de fusión, como se define en las reivindicaciones, para su uso en el tratamiento del dolor de un sujeto con necesidad de ello.
La invención también proporciona una variante de Protoxina-II aislada que comprende por lo menos una de las SEQ ID NO: 644, 663, 667, 672, 673, 680, 684, 686, 687, 694, 708, 710, 711, 724, 725 y 726.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada inhibe la actividad de Nav1.7 humano, en donde la variante de Protoxina-II tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de W7Q y W30L, en donde la numeración de residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
Como se divulga en la presente, algunas veces la variante de Protoxina-II aislaa, inhibe con un valor de IC50 de aproximadamente 1 x 10' 7 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 8 M o menos, aproximadamente 1 X10 ' 9 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 10 M o menos, aproximadamente 1 x 1011 M o menos, o aproximadamente 1 X10 ' 12 M o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 25 x 10' 6 M 3-veratroilveracevina en células HEK293 que expresan establemente Nav1.7 humano, en donde la variante de Protoxina-II tiene una sustitución W7Q y/o W30L, en donde la numeración de residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 30, 40, 44, 52, 56, 59, 65, 78, 109, 110, 111, 114, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143.
144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170.
171, 172, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 189, 190, 193, 195, 197, 199, 206, 207, 208 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 224, 226, 227, 231, 232, 243, 244, 245, 247, 249, 252, 255, 258 261, 263, 264, 265, 266, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 332, 334, 335, 336, 337, 339 340, 341, 342, 346, 351, 358, 359, 364, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510.
511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717.
718, 719, 720, 721, 723, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735 o 736.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia de aminoácidos que es un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 422 (GPYC-GPYCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH); en donde la secuencia de aminoácidos tiene Q en la posición 7 y L en la posición 30, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de género de variantes de Protoxina-II que inhiben Nav1.7 con un valor de IC50 de 30 nM o menos en un ensayo FLIPR Tetra. La numeración de los residuos es de acuerdo con la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1. Género SEQ ID NO: 403.
La Figura 2 muestra los valores de IC50 para la inhibición de Nav1.7 y Nav1.6 en un ensayo QPatch, y la selectividad de cada variante calculada por la proporción de IC50(Nav1.6)/IC50(Nav1.7) obtenida en el ensayo QPatch. SE: error estándar.
La Figura 3 muestra las secuencias y la secuencia de género de las variantes de Protoxina-II que inhiben Nav1.7 con un valor de IC50 de 30 nM o menos en un ensayo de FLIPR Tetra, y son selectivas más de 30 veces más que Nav1.6. La selectividad de cada variante se calculó por la proporción de IC50(Nav1.6)/IC509av1.7) obtenida en el ensayo QPatch. La numeración de residuos está de acuerdo con la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.
La Figura 4A muestra la eficacia de NV1D3034 (NV1D3034-OH) (SEQ ID NO: 78) contra la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, evaluada mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes (pre-CFA) y después de la inyección de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). ***P<0,001 frente a PBS, ANOVA bidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni. La Figura 4B muestra la eficacia de NV1D3034 (NV1D3034-OH) (SEQ ID NO: 78) en la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, expresada como porcentaje de MPE (efecto máximo posible) (m Pe %) a cada dosis el día 1 después de la administración del péptido. *P<0,05 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 5A muestra la eficacia de NV1D3368 (NV1D3368-OH) (SEQ ID NO: 198) contra la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, evaluada mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes (pre-CFA) y después de la inyección de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). **P<0,01 y PBS, ANOVA bidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 4B muestra la eficacia de NV1D3034 (NV1D3034-OH) (SEQ ID NO: 78) en la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, expresada como porcentaje de MPE (efecto máximo posible) (m Pe %) a cada dosis el día 1 después de la administración del péptido. *P<0,05 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 5A muestra la eficacia de NV1D3368 (NV1D3368-OH) (SEQ ID NO: 198) contra la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, evaluada mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes (pre-CFA) y después de la inyección de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). **P<0,01 y ***P<0,0001 frente aPBS, ANOVA bidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 5B muestra la eficacia de NV1D3368 (NV1D3368-OH) (SEQ ID NO: 198) en la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, expresada como porcentaje de MPE (MPE%) a cada dosis el día 1 después de la administración del péptido. *P<0,05 y **P<0,01 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 6A muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) contra la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, evaluada mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes (pre-CFA) y después de la inyección de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA bidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 6B muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) en la hiperalgesia térmica inducida por CFA en ratones, expresada como porcentaje de MPE (MPE%) a cada dosis el día 1 después de la administración del péptido. ***P<0,001 y ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 6C muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) contra la alodinia táctil inducida por CFA en ratones. Umbrales táctiles de la pata trasera antes (pre-CFA) y después de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). ****P<0,0001 frente a p Bs , ANOVA bidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 6D muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) contra la alodinia táctil inducida por CFA en ratones, expresada como porcentaje de MPE (MPE%) el día 1 después del péptido. ***P<0,001 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 7A muestra el curso temporal de la reversión de la hiperalgesia térmica mediada por NV1D2775-OH en el modelo de CFA de ratón evaluado mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes y después de CFA y en varios puntos temporales después de la administración del péptido. **P<0,01 frente a PBS, ANOVA bidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni. Las áreas sombreadas indican el período de administración del compuesto (0-24 h).
La Figura 7B muestra el curso temporal de la inversión de la alodinia táctil mediada por NV1D2775-OH en el modelo de CFA de ratón evaluado mediante la medición del umbral táctil antes y después de CFA y en varios puntos temporales después de la administración del péptido. **P<0,01 frente a p Bs , ANOVA bidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni. Las áreas sombreadas indican el período de administración del compuesto (0-24 h).
La Figura 8 muestra que NV1D2775-OH produjo una analgesia significativa en la prueba de placa calefactora de ratón. La latencia de retirada térmica se evaluó a 50 y 55° C antes y después de la implantación de la bomba. La implantación de la bomba no tuvo ningún impacto sobre la latencia en el grupo de control de PBS. Un día después de la bomba, los ratones tratados con NV1D2775-OH mostraron una latencia prolongada en comparación con el grupo de PBS. *P<0,05 y ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 9 muestra que el pretratamiento con NV1D2775-OH protegió a los animales de la hiperalgesia térmica inducida por carragenano en ratones. Las latencias de retirada de la pata se midieron antes y el día 1 después de la bomba antes de la inyección de carragenano intraplantar. Las latencias se midieron de nuevo a las 2, 3 y 4 horas después de la carragenano.
La Figura 10 muestra la representación de la superficie de la estructura de NMR de la Protoxina-II de tipo salvaje. Una cara hidrófoba que se muestra a la izquierda incluye los residuos W5, M6, W7, L23 y W24. Una cara de selectividad se muestra a la derecha e incluye los residuos S11, E12, K14, E17, G18, L29 y W30. Numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
La Figura 11 muestra la eficacia de la variante de Protoxina-II 63955918 SEQ ID NO: 422) después de una única administración intratecal (IT) en la prueba de movimiento de la cola de rata. Se midió la latencia de retirada de la cola a un estímulo térmico en el momento indicado después de la administración del péptido.
La Figura 11B muestra la eficacia de la variante de Protoxina-II 63955918 SEQ ID NO: 422) en la prueba de movimiento de la cola de rata expresada como porcentaje de área bajo la curva (AUC%) en los primeros 120 minutos después de una única administración intratecal (IT). ***P<0,001 y ****P<0,0001 frente a pBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 11C muestra la eficacia de la variante de Protoxina-II 63955918 SEQ ID NO: 422) después de una única administración intratecal (IT) en la prueba de placa calefactora en ratas (52,5° C). Se midió la latencia de una respuesta nociceptiva en una placa calefactora en el momento indicado después de la administración del péptido.
La Figura 11D muestra la eficacia de la variante de Protoxina-II 63955918 SEQ ID NO: 422) en la prueba de placa calefactora expresada como porcentaje de área bajo la curva (AUC%) en los primeros 120 minutos después de una única administración intratecal (IT). ***P<0,001 y ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 11E muestra la eficacia de la variante de Protoxina-II 63955918 SEQ ID NO: 422) en la prueba de formalina en ratas. La inyección de formalina en la pata trasera de la rata indujo un comportamiento de estremecimiento bifásico. El número total de estremecimientos en la Fase I (0-10 minutos después de la formalina) y la Fase II (11-60 minutos después de la formalina) se midió mediante un dispositivo automatizado. No se realizaron estadísticas en E) debido al pequeño tamaño del grupo.
La Figura 12A muestra la eficacia de NV1D2775-OH después de una única administración intratecal (IT) en la prueba de movimiento de la cola de rata. Se midió la latencia de retirada de la cola a un estímulo térmico en el momento indicado después de la administración del péptido.
La Figura 12B muestra la eficacia de NV1D2775-OH en la prueba de movimiento de la cola de rata expresada como porcentaje de área bajo la curva (AUC%) en los primeros 120 minutos después de una única administración intratecal (IT). *P<0,05 y **P<0,01 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 12C muestra la eficacia de NV1D2775-OH después de una única administración intratecal (IT) en la prueba de placa calefactora en ratas (52,5° C). Se midió la latencia de una respuesta nociceptiva en una placa calefactora en el momento indicado después de la administración del péptido.
La Figura 12D muestra la eficacia de NV1D2775-OH en la prueba de placa calefactora en ratas expresada como porcentaje de área bajo la curva (AUC%) en los primeros 120 minutos después de una única administración intratecal (IT). **P<0,01 y ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 12E muestra la eficacia de NV1D2775-OH en la prueba de formalina. La inyección de formalina en la pata trasera de la rata indujo un comportamiento de estremecimiento bifásico. El número total de estremecimientos en la Fase I (0-10 minutos después de la formalina) y la Fase II (11-60 minutos después de la formalina) se midió mediante un dispositivo automatizado. **P<0,01 frente a PBS, fase I, *P<0,05 frente a PBS, fase II, ANOVA unidireccional seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.
La Figura 13A muestra la eficacia de NV1D3034-OH después de una única administración intratecal (IT) en la prueba de movimiento de la cola de rata. Se midió la latencia de retirada de la cola a un estímulo térmico en el momento indicado después de la administración del péptido.
La Figura 13B muestra la eficacia de NV1D3034-OH en la prueba de movimiento de la cola de rata expresada como porcentaje de área bajo la curva (AUC%) en los primeros 120 minutos después de una única administración intratecal (IT). ***P <0,005 frente a PBS, prueba t.
La Figura 13C muestra la eficacia de NV1D3034-OH después de una única administración intratecal (IT) en la prueba de placa calefactora en ratas (52,5° C). Se midió la latencia de una respuesta nociceptiva en una placa calefactora en el momento indicado después de la administración del péptido.
La Figura 13D muestra la eficacia de NV1D3034-OH en la prueba de placa calefactora en ratas expresada como porcentaje de área bajo la curva (AUC%) en los primeros 120 minutos después de una única administración intratecal (IT). **P<0,01 frente a PBS, prueba t.
La Figura 13E muestra la eficacia de NV1D3034-OH en la prueba de formalina en ratas. La inyección de formalina en la pata trasera de la rata indujo un comportamiento de estremecimiento bifásico. El número total de estremecimientos en la Fase I (0-10 minutos después de la formalina) y la Fase II (11-60 minutos después de la formalina) se midió mediante un dispositivo automatizado. *P<0,05 frente a PBS, fase I, **P<0,01 frente a PBS, fase II, prueba t.
La Figura 14 muestra la alineación de aminoácidos de los péptidos de la toxina del nudo de cisteína de la Familia 3.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece una invención. Aunque en la puesta en práctica o ensayo de la invención puede usarse cualquier composición y método similar o equivalente a los descritos en la presente, en la presente se describen composiciones y métodos ejemplares.
El término "polipéptido" significa una molécula que comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos enlazados por un enlace peptídico para formar un polipéptido. A los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos puede hacerse referencia como "péptidos". A los polipéptidos también puede hacerse referencia como "proteínas".
El término "polinucleótido" significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos enlazada covalentemente por un estructura principal de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y ARN de cadena doble y sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.
El término "secuencia complementaria" significa una segunda secuencia de polinucleótidos aislada que es antiparalela a una primera secuencia de polinucleótidos aislada y que comprende nucleótidos complementarios a los nucleótidos en la primera secuencia de polinucleótidos.
El término "vector" significa un polinucleótido no natural capaz de duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos del vector contienen típicamente un ADNc que codifica una proteína de interés y elementos adicionales, como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, un virus, un animal, una planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estas.
El término "vector de expresión" significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.
El término "variante", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido o un polinucleótido que difiere del polipéptido de Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido que codifica la Protoxina-II de tipo salvaje que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 107 por una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos.
A lo largo de la memoria descriptiva, los residuos que están sustituidos en las variantes de Protoxina-II se numeran de acuerdo con su posición en la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, "Y1A" en la memoria descriptiva se refiere a la sustitución de tirosina en la posición del residuo que corresponde a la posición 1 en la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1 con alanina.
"ADN complementario" o "ADNc" se refiere a un polinucleótido sintético bien conocido que comparte la disposición de los elementos de secuencia encontrada en especies de ARNm maduras nativas con exones contiguos, con los intrones intermedios presentes en el ADN genómico eliminados. Los codones que codifican la metionina iniciadora pueden estar presentes o no en el ADNc. El ADNc puede sintetizarse, por ejemplo, mediante transcripción inversa o ensamblaje de genes sintéticos.
"Sintético" o "no natural", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido o una molécula de polipéptido que no está presente en la naturaleza.
"Nav1.7" (también denominado hNE o PN1) o "hNav1.7" como se usa en la presente se refiere a la bien conocida subunidad alfa de la proteína del canal de sodio humano tipo 9 que tiene una secuencia que se muestra en el número de registro de GenBank NP_002968.1 y en la SEQ.ID NO: 79.
El término "Protoxina-II de tipo salvaje" o "ProTx-II de tipo salvaje" como se usa en la presente se refiere al péptido de la toxina Thrixopelma pruriens de la tarántula (tarántula de terciopelo verde peruana) que tiene la secuencia de aminoácidos YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRL-WCKKKLW-COOH (SEQ ID NO: 1) como se describe en Middleton et al., Biochemistry 41(50):14734-47, 2002.
El término "Protoxina-II recombinante" o “ProTx-II recombinante" como se usa en la presente se refiere a la Protoxina-II recombinante obtenida de la expresión y posterior escisión de una proteína de fusión de Protoxina-II que tiene la secuencia de GPYCQK-WMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-OH como se muestra en la SEQ ID NO: 2. La Protoxina-II recombinante incorpora una extensión N-terminal de dos aminoácidos (residuos G y P) cuando se compara con la Protoxina-II de tipo salvaje.
“Bloquea la actividad de Nav1.7 humano” o “ inhibe la actividad de Nav1.7 humano” como se usa en la presente se refiere a la capacidad de la variante de Protoxina-Ill de la invención para reducir la despolarización de la membrana inducida por veratridina (3-veratroilveracevina) con un valor de IC50 de aproximadamente 1x10' 7 M o menos en un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), donde la despolarización inducida por veratridina se mide como una reducción en la señal de FRET usando DISBAC2(3) ([bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)trimetino oxonol]) como aceptor y PTS18 (8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico) como donante excitando al donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm en una línea celular que expresa de manera estable el Nav1.7 humano. La capacidad de las variantes de Protoxina-III de la invención para bloquear la actividad de Nav1.7 humano también puede medirse usando electrofisiología QPatch a concentraciones de variante de Protoxina-III únicas o varias de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 3. La variante de Protoxina-II de la invención bloquea la actividad de Nav1.7 humano cuando inhibe las corrientes de Nav1.7 medidas usando QPatch en por lo menos aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% cuando se usa el protocolo de ensayo descrito en el Ejemplo 3.
"Ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra", como se usa en la presente, se refiere al ensayo descrito en el Ejemplo 3.
"Ensayo QPatch" o "ensayo electrofisiológico QPatch" como se usa en la presente se refiere al ensayo descrito en el Ejemplo 3.
El término "sustancialmente idéntico" como se usa en la presente significa que las dos secuencias de aminoácidos de variantes de Protoxina-II que se comparan son idénticas o tienen "diferencias insustanciales". Las diferencias insustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la variante de Protoxina-II que no afectan negativamente a las propiedades del péptido. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las variantes de Protoxina-II divulgadas en la presente están dentro del alcance de la solicitud. La identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más alta. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, mediante una alineación por pares usando la configuración predeterminada del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carslbad, CA). Las secuencias de proteínas de la presente invención pueden usarse como una secuencia de consulta para realizar una búsqueda en bases de datos públicas o de patentes, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Los programas ejemplares usados para realizar tales búsquedas son los programas XBLAST o BLASTP (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), o el paquete GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA) usando la configuración predeterminada.
En la Tabla 1a se muestran las abreviaturas de los aminoácidos naturales que se usan en la presente.
Tabla 1.
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La presente invención proporciona polipéptidos variantes de Protoxina-II (ProTx-II) aislados, como se define en las reivindicaciones, que inhiben la actividad de Nav1.7 humano, polinucleótidos que los codifican, vectores, células huésped y métodos para usar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. Los polipéptidos de la invención inhiben la despolarización/corrientes resultantes de la activación de Nav1.7 y, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento de varias afecciones asociadas con el dolor y afecciones asociadas con la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas.
Las variantes de la invención son potentes inhibidores de Nav1.7. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que ciertas sustituciones de residuos en la Protoxina-II mejoran la selectividad, el rendimiento sintético y/o la homogeneidad sin afectar adversamente a la potencia de las variantes de Protoxina-II generadas, específicamente W7 y M19, y adicionalmente los residuos Y1 y S11, y además adicionalmente los residuos E12, R22 y (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, las sustituciones en las posiciones W7 y W30 mejoran el plegamiento de la variante de Protoxina-II y mejoran el rendimiento. Las sustituciones en las posiciones S11, E12, K14, E17, G18, L29 y W30 mejoran la selectividad de las variantes de Protoxina-II resultantes para Nav1.7.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-Il aisladas inhibe la actividad de Nav1.7 humano con una valor de IC50 de aproximadamente 1 x 10' 7 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 8 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 9 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 10 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 11 M o menos, o aproximadamente 1 x 10' 12 M o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 25 x 10' 6 M de 3-veratroilveracevina en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 1 x 10‘ 7 M o menos, aproximadamente 1 x 10‘ 8 M o menos, aproximadamente 1 x 10-9 M o menos, aproximadamente 1 x 10-1 0M o menos, aproximadamente 1 x 10-11 M o menos, o aproximadamente 1 x 10-12 M o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 25 x 10-6 M de 3-veratroilveracevina en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano, en donde la variante de Protoxina-II tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de W7Q y W30L; en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada inhibe la actividad de Nav1.7 humano, en donde la variante de Protoxina-II tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de W7Q y W30L; en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
La variante de Protoxina-II tiene una sustitución W7Q.
La variante de Protoxina-II tiene una sustitución W30L.
La variante de Protoxina-II tiene una sustitución W7Q y W30L.
Como se divulga en la presente, algunas veces la variante de Protoxina-II inhibe la actividad de Nav1.7 en por lo menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% cuando la actividad de Nav1.7 se mide usando el ensayo QPatch de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 3.
Como se divulga en la presente la variante de Protoxina-II tiene una sustitución en una o más posiciones de residuos Y1, W7, S11, E12, K14, E17, G18, R22, L29 y W30, cuando la numeración de residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
Las sustituciones en la posición Y1 mejoran la potencia del Nav1.7 humano.
Las sustituciones en la posición W7 mejoran el plegamiento de la variante de Protoxina-II y el rendimiento de proteínas.
Las sustituciones en la posición S11 mejoran la selectividad para el Nav1.7 humano.
Las sustituciones en la posición E12 mejoran la selectividad para el Nav1.7 humano.
Las sustituciones en la posición K14 mejoran la selectividad para el Nav1.7 humano.
Las sustituciones en la posición E17 mejoran la selectividad para el Nav1.7 humano.
Las sustituciones en la posición G18 mejoran la selectividad para el Nav1.7 humano.
Las sustituciones en la posición L29 mejoran la selectividad para el Nav1.7 humano.
Las sustituciones en la posición W30 mejoran el plegamiento de la variante de Protoxina-II y el rendimiento de proteínas y la selectividad para Nav1.7.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-III aislada comprende la secuencia YCQKWMQTCDSERK-CCEGMVCRLWCKKKLW-COOH (SEQ ID NO: 424); en donde el residuo Y1, S11, E12, K14, E17, G18, L29 y/o W30 está sustituido con cualquier otro aminoácido mostrado en la Tabla 1 o un aminoácido no natural, que opcionalmente tiene una extensión N-terminal o una extensión C-terminal.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia YCQKWMQTCDSERK-CCEGMVCRLWCKKKLL-COOH (SEQ ID NO: 425); en donde el residuo Y1, S11, E12, K14, E17, G18, M19, L29 y/o W30 está sustituido con cualquier otro aminoácido mostrado en la Tabla 1 o un aminoácido no natural, que opcionalmente tiene una extensión N-terminal o una extensión C-terminal.
La variante de Protoxina-II de la invención descrita en la presente contiene por lo menos un aminoácido no natural.
Los aminoácidos no naturales incluyen amino p-alanina (p-Ala) y otros omega-aminoácidos como ácido 3-aminopropiónico (Dap), ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), ácido 4-aminobutírico y demás; ácido a-aminoisobutírico (Aib); ácido £-aminohexanoico (Aha); ácido 5-aminovalérico (Ava); N-metilglicina o sarcosina (MeGly); ornitina (Om); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (MeIle); fenilglicina (Phg); ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle); 2-naftilalanina (2-Nal); 4-clorofenilalanina (Phe (4-Cl)); 2-fluorofenilalanina (Phe (2-F)); 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic); a-2-tienilalanina (Thi); sulfóxido de metionina (MSO); N (omega)-metil-L-arginina; N(omega), N(omega) -dimetil-L-arginina (asimétrica); 4-guanidino-L-fenilalanina; L-Lys (N-épsilon-(N-alfapalmitoil-L-gamma-glutamil); L-asparagil-4-aminobutano; L-glutamil-4-aminobutano; homoarginina (hArg); N-acetil lisina (AcLys); ácido 2,3-diaminobutírico (Dab); ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu); p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); N-metil valina (MeVal); homocisteína (hCys) y homoserina (hSer); 4-bromofenilalanina (Phe(4-Br); 5-bromotrifofano (Trp(5-Br)); 3-clorotirosina (Tyr(3-Cl)) o beta-cloroalanina.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia
X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14X15X16CX17LWCX18KKLX19 (SEQ ID NO: 432),
X I es G, P, A o está eliminado;
X2 es P, A o está eliminado;
X3 es S, Q, A, R o Y;
X4 es Q, R, K, A, S o Y;
X5 es K, S, Q o R;
X6 es M o F;
X7 es T, S, R, K o Q;
X8 es D, T, o asparagilo-4-aminobutano;
X9 es S, A, R, I o V;
X10 es E, R, N, K, T, Q, Y o glutamil-4-aminobutano;
X I I es R o K;
X12 es K, Q, S, A o F;
X13 es E, Q, D, L, N o glutamil-4-aminobutano;
X14 es G, Q o P;
X15 es M o F;
X16 es V o S;
X17 es R, T o N-omega metil-L-arginina; y
X18 es K o R; y
X19 es W o L,
opcionalmente con una extensión N-terminal o una extensión C-terminal.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia X1X2X3CQKWMQTCDX4X5RX6CCX7X8X9VCRLWCKKKX10X11 (SEQ ID NO: 737); en donde
X I es G, P, A o está eliminado;
X2 es P, A o está eliminado;
X3 es S, Q, A, R o Y;
X4 es S, A, R, I o V;
X5 es E, R, N, K, T, Q, Y o glutamil-4-aminobutano;
X6 es K, Q, S, A o F;
X7 es E, Q, D, L, N o glutamil-4-aminobutano;
X8 es G, Q o P;
X9 es M o F;
X10 es L, V; y
X I I es W o L.
Como se divulga en la presente, algunas veces la variante de Protoxina-Il inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 1 x 10' 7 M o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 25x10' 6 M de 3-veratroilveracevina en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano.
Como se divulga en la presente, algunas veces la variante de Protoxina-II inhibe la actividad de Nav1.7 en por lo menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% cuando la actividad de Nav1.7 se mide usando el ensayo QPatch de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 3.
En algunas realizaciones divulgadas en la presente, la extensión N-terminal comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384 o 385.
En algunas realizaciones divulgadas en la presente, la extensión C-terminal comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 374, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396 o 397.
En algunas realizaciones divulgadas en la presente, la extensión N-terminal y/o C-terminal se conjuga con la variante de Protoxina-II a través de un conector.
En algunas realizaciones divulgadas en la presente, el conector comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 383, 392, 398, 399, 400, 401 o 402.
En algunas realizaciones divulgadas en la presente, la extensión N-terminal consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384 o 385.
En algunas realizaciones divulgadas en la presente, la extensión C-terminal consiste de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 374, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396 o 397.
En algunas realizaciones divulgadas en la presente, el conector consiste de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 383, 392, 398, 399, 400, 401 o 402.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14FX15CX16LWCX17KKLW (SEQ ID NO: 403), en donde
X I es G, P, A o está eliminado;
X2 es P, A o está eliminado;
X3 es S, Q, A, R o Y;
X4 es Q, R, K, A o S;
X5 es K, S, Q o R;
X6 es M o F;
X7 es T, S, R, K o Q;
X8 es D o T;
X9 es S, A o R;
X10 es E, R, N, K, T o Q;
X I I es R o K;
X12 es K, Q, S o A;
X13 es E, Q o D;
X14 es G o Q;
X15 es V o S;
X16 es R o T; y
X17 es K o R;
opcionalmente tiene una extensión de N-terminal o una extensión de C-terminal,
en donde el polipéptido inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 1 X10 ' 7 M o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 25x10' 6 M 3-veratroilveracevina en células HEK293 que expresan establemente Nav1.7 humano.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, son potentes inhibidores de Nav1.7. La Protoxina-II recombinante (SEQ ID NO: 2) tiene un valor de IC50 de aproximadamente 4x10' 9 M para Nav1.7 humano en un ensayo de inhibición de la despolarización inducido por veratridina que mide la disminución en FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) en células que expresan de manera estable Nav1.7 usando el instrumento FLIPR® Tetra (Molecular Devices) usando los detalles experimentales descritos en el Ejemplo 3. Una variante de Protoxina-II es un inhibidor de Nav1.7 "potente" cuando el valor de IC50 en el ensayo descrito anteriormente y en el Experimento 3 es de aproximadamente 30 x 10' 9 M o menos, es decir, dentro de 10 veces de la Protoxina-II recombinante. Para mayor claridad, una IC50 de 30 x 10' 9 M es idéntico a una IC50 de 3,0 x 10' 8 M.
Los polipéptidos de variantes de Protoxina-II de la invención divulgados en la presente, pueden producirse mediante síntesis química, como síntesis de péptidos en fase sólida, en un sintetizador de péptidos automatizado. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden obtenerse a partir de polinucleótidos que codifican los polipéptidos mediante el uso de sistemas de expresión libres de células como sistemas de expresión basados en lisados de reticulocitos, o mediante sistemas de expresión recombinantes. Los expertos en la técnica reconocerán otras técnicas para obtener los polipéptidos de la invención. En un método ejemplar, las variantes de Protoxina-II de la invención se generan expresándolas como proteínas de fusión de albúmina de suero humano (HSA) utilizando un conector rico en glicina como (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 80) o (GGGGS)6 (SEQ ID NO: 81) acoplado a un conector escindible por proteasa como una secuencia de reconocimiento para la proteasa HRV3C (proteasa recombinante tipo 14 3C de rinovirus humano) LEVLFQGP (conector HRV3C) (SEQ ID NO: 82), y escindiendo las proteínas de fusión expresadas con la proteasa HRV3C para liberar los péptidos variantes de Protoxina-II recombinantes. Puede usarse hexahistidina (SEQ ID NO: 108) u otras etiquetas para facilitar la purificación usando métodos bien conocidos.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, pueden purificarse usando los métodos descritos en la presente. En un método ejemplar, las variantes de Protoxina-II de la invención expresadas como proteínas de fusión HSA y escindidas con proteasa HRV3C pueden purificarse usando extracción en fase sólida (SPE) como se describe en la presente.
La generación de las variantes de Protoxina-II divulgadas en la presente, que tienen opcionalmente extensiones N-terminales y/o C-terminales, y proteínas de fusión variantes de Protoxina-II se logra típicamente a nivel de ácido nucleico. Los polinucleótidos pueden sintetizarse usando síntesis química de genes de acuerdo con los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 6.521.427 y 6.670.127, utilizando oligonucleótidos degenerados para generar las variantes deseadas, o mediante clonación y mutagénesis por PCR estándar. Pueden generarse bibliotecas de variantes mediante técnicas de clonación estándar para clonar los polinucleótidos que codifican las variantes de Protoxina-II en el vector para expresión.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, pueden incorporar aminoácidos N-y/o C-terminales adicionales en comparación con la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo resultando de esquemas de clonación y/o expresión. Por ejemplo, la escisión de HSA después de la expresión de la variante como HSA-conector-péptido escindible de HRV3C-proteína de fusión variante de Protoxina-II puede resultar en la incorporación de dos residuos adicionales al extremo N-terminal de cada variante de Protoxina-II, como G y P.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, se prueban para determinar su capacidad para inhibir el Nav1.7 humano usando los métodos descritos en la presente. Un ensayo ejemplar es un ensayo de inhibición de despolarización inducido por veratridina que mide la disminución de FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) en células que expresan de manera estable Nav1.7. Otro ensayo ejemplar emplea registros electrofisiológicos para medir cambios en las corrientes mediadas por Nav1.7 usando técnicas de fijación en parche bien conocidas y como se describe en la presente.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 ,155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225,226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 35, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368 369, 370, 371, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735 o 736.
Como se divulga en la presente, algunas veces las variantes de Protoxina-II pueden inhibir Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 1 x 10' 7 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 8 M aproximadamente 1 x 10' 9 o menos, aproximadamente 1 x 10' 10 M o menos, aproximadamente 1 x 10' 11 M o menos, o aproximadamente 1 x 10-12 M o menos. Variantes ejemplares que demuestran el intervalo de valores de IC50 son variantes que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 30, 40, 44, 52, 56, 56, 59, 65, 78, 109, 110, 111, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 189, 190, 193, 195, 197, 199, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 224, 226, 227, 231, 232, 243, 244, 245, 247, 249, 252, 255, 258, 261, 263, 264, 265, 266, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 332, 334, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 342, 346, 351, 358, 359, 364, 366, 367, 368, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430 o 431.
Como se divulga en la presente, algunas veces la variante de Protoxina-II inhibe la actividad de Nav1.7 en por lo menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% cuando la actividad de Nav1.7 se mide usando el ensayo QPatch de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 3. Las variantes ejemplares que inhiben la actividad de Nav1.7 en por lo menos un 25% en un ensayo QPatch son variantes que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 109, 133, 408, 409, 410, 412, 419, 420, 421, 422, 423, 423, 424, 425, 426, 427, 427, 428, 429, 430,
431, 431, 434, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 444, 446, 447, 448, 450, 452, 453, 455, 456, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 468, 469, 470, 471, 473, 474, 476, 477, 478, 479, 480, 482, 483, 485, 486, 487, 490, 491, 492, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 502, 504, 505, 507, 508, 510, 511, 512, 514, 516, 517, 518, 519, 521, 522, 523, 524, 526, 529, 531, 532, 533, 537, 546, 554, 557, 559, 560, 561, 562, 563, 566, 571, 579, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 621, 622, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 670, 671,672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684 y 685
La Tabla 2, la Tabla 3, la Tabla 14, la Tabla 18 y la Tabla 2 muestran las secuencias de variantes de Protoxina-II seleccionadas.
Tabla 2
Figure imgf000014_0001
continuación
Figure imgf000015_0001
continuación
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Tabla 3
Figure imgf000016_0002
continuación
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(continuación)
Figure imgf000018_0001
continuación
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continuación
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continuación
Figure imgf000021_0001
(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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continuación
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(continuación)
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(continuación)
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La variante de Protoxina-II aislada inhibe la actividad Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 3 x 10-8 M o menos.
La variante de Protoxina-II aislada inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC50 de entre aproximadamente 3 x 10' 8 M y aproximadamente 1 X10 ' 9 M.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia de aminoácidos GPQCX1X2WX3QX4CX5X6X7X8X9CCX10X11X12X13CX14LWCX15KKLL (SEQ ID NO: 433), en donde
X1 es Q, R, K, A o S;
X2 es K, S, Q o R;
X3 es M o F;
X4 es T, S, R, K o Q;
X5 es D o T;
X6 es S, A o R;
X7 es E, R, N, K, T o Q;
X8 es R o K;
X9 es K, Q, S o A;
X10 es E, Q o D;
X11 es G o Q;
X12 es F o M;
X13 es V o S;
X14 es R o T; y
X15 es K o R.
Las variantes de Protoxina-II ejemplares que inhiben la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 30 x 10-9 M o menos son variantes que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 56, 78, 111, 114, 117, 118, 119, 122, 123, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154 156, 158, 159, 165, 172, 173, 175, 177, 178, 183, 184, 185, 186, 189, 190, 193, 197, 199, 207, 210, 211, 216, 217, 224, 266, 273, 282, 335, 408, 409, 410, 422, 424, 425, 426, 427 y 428.
Como se divulga en la presente, algunas veces la variante de Protoxina-II aislada inhibe selectivamente el Nav1.7 humano. Como se divulga en la presente, algunas veces las variantes de Protoxina-II pueden ser más selectivas hacia Nav1.7 en comparación con la Protoxina-II recombinante (SEQ ID NO: 2). En el ensayo de electrofisiología QPatch, la Protoxina II recombinante tiene una IC50 de aproximadamente 2,2 x 10' 9 M para Nav1.7 y una IC50 de aproximadamente 62 x 10' 9 M para Nav1.6 y, por lo tanto, la proporción de IC50 para Nav1.6 a IC50 para Nav1.7 es de aproximadamente 28 veces. "Selectividad" o "selectiva" o "más selectiva" o "bloquea selectivamente" o "inhibe selectivamente" cuando se usa en la presente se refiere a una variante de Protoxina-II que tiene una proporción de IC50 para Nav1.6 a IC50 para Nav1.7 (IC50 (Nav1.6)/IC50 (Nav1.7)) igual o superior a aproximadamente 30. La IC50 para Nav1.6 puede ensayarse en un ensayo de electrofisiología QPatch usando líneas celulares que expresan de manera estable Nav1.6 usando métodos similares a los descritos para Nav1.7.
Las posiciones de residuos en la Protoxina-II que pueden mutagenizarse para mejorar la selectividad incluyen los residuos 7, 11, 12, 14, 17, 18 y 19, y opcionalmente los residuos 1, 20, 22 y 26 (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1). Las sustituciones ejemplares para mejorar la selectividad son Y1Q, W7Q, S11R, S11A, E12T, M19F, V20S, R22T y K26R. Las variantes de Protoxina-II ejemplares con selectividad mejorada son variantes de las SEQ ID NO: 56, 59, 65, 78, 111, 114, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 129, 130, 133, 150, 190, 217, 281, 324, 325 o 326.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia GPX1CQKWMQX2CDX3X4RKCCX5GFX6CX7LWCX8KKLW (SEQ ID NO: 405); en donde
X1 es Y, Q, A, S o R;
X5 es T o S;
X3 es S, R o A;
X4 es E, T o N;
X5 es E o Q;
X6 es V o S;
X7 es R o T; y
X8 es K o R;
en donde la variantes de Protoxina-II inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 3 x 10' 8 M o menos, e inhibe de manera selectiva Nav1.7 humano.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina II aislada comprende la secuencia GPQCQKWMQX1CDX2X3RKCCX4GFX5CX6LWCX8KKLW (SEQ ID NO: 406); en donde
X1 es T o S;
X5 es S, R o A;
X3 es E, T o N;
X4 es E o Q;
X5 es V o S;
X6 es R o T; y
X7 es K o R.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia de aminoácidos que es un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 422 (GPYC-QKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL-COOH); en donde
la secuencia de aminoácidos tiene Q en la posición 7 y L en la posición 30, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1; y
el polipéptido inhibe la actividad Nav1.7 humano. Las variantes de Protoxina-II que tienen las sustituciones W7Q y W30L tienen plegamiento, rendimiento y selectividad mejoradas en comparación con la Protoxina-II de tipo salvaje.
Como se divulga en la presente, algunas veces una variante de Protoxina-II aislada comprende la secuencia de aminoácidos que es un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 (GPQC-QKWMQTCDRERKCCEGFVCTLWCRKKLW-COOH); en donde
la secuencia de aminoácidos tiene Q en la posición 1, Q en la posición 7 y F en la posición 19, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1;
el polipéptido inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC50 de aproximadamente 30 x 10' 9 M o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 25x10' 6 M de 3-veratroilveracevina en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano; y
el polipéptido inhibe selectivamente Nav1.7.
La variante de Protoxina-II aislada puede tener un grupo ácido carboxílico, amida, metilamida o butilamida en el extremo C-terminal. Las modificaciones C-terminales pueden generarse mediante métodos sintéticos de rutina.
Como se divulga en la presente, algunas veces una proteína de fusión aislada comprende la variante de Protoxina-II de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, '72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 ,155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217 218, 219 , 220 221 , 222 , 223, 224 , 225,226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354 , 355 , 35, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368 369, 370, 371, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710 ,711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734 , 735 o 736. Tales segundos polipéptidos pueden ser secuencias señal líder o secretoras bien conocidas, o secuencias sintéticas resultantes, por ejemplo, de pasos de clonación, o etiquetas como la etiqueta de hexahistidina (SEQ ID NO: 108). Tal segundo polipéptido puede ser una fracción que prolonga la vida media. En una realización, la proteína de fusión aislada comprende la variante de Protoxina-II de la invención conjugada con una fracción que prolonga la vida media.
Las fracciones que prolongan la vida media ejemplares que pueden usarse incluyen albúmina de suero humano bien conocida, transtiretina (TTR), una globulina de unión a tiroxina (TGB), dominios de unión a albúmina o un Fc o fragmentos de los mismos. También pueden usarse polímeros o copolímeros biológicamente adecuados, por ejemplo, moléculas de etilenglicol o polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20000, dextrano, polilisina, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, octano o carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo- o polisacáridos). Las fracciones ejemplares que pueden mejorar la biodistribución incluyen poliaminación (putrescina, espermina o espermidina, etc.), halogenación (cloro, bromo, flúor, yodo) y glicosilación. Estas fracciones pueden ser fusiones directas con los polipéptidos de variantes de Protoxina-II y pueden generarse mediante técnicas estándar de clonación y expresión. Alternativamente, pueden usarse métodos de acoplamiento químico bien conocidos para unir las fracciones a variantes de Protoxina-II producidas recombinantemente de la invención. Alternativamente, las fracciones pueden incorporarse como aminoácidos no codificados durante la síntesis de péptidos en fase sólida.
En otra realización de la invención divulgada en la presente, la fracción que prolonga la vida media de la proteína de fusión de la invención es albúmina de suero humano, variantes de albúmina de suero humano, dominio de unión a albúmina (ABD) o polietilenglicol (PEG).
La fracción que prolonga la vida media puede conjugarse con la variante de Protoxina-II a través de un conector. Los conectores adecuados son bien conocidos e incluyen conectores que tienen la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 80 u 81.
Las proteínas de fusión ejemplares que incorporan variantes de Protoxina-II de la invención son aquellas que tienen la secuencia polipeptídica de las SEQ ID NO: 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 o 103.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, que incorporan fracciones adicionales, pueden compararse en cuanto a funcionalidad mediante varios ensayos bien conocidos. Por ejemplo, las propiedades farmacocinéticas de las variantes de Protoxina-II acopladas a PEG pueden evaluarse en modelos in vivo bien conocidos.
Pueden realizarse sustituciones adicionales a las variantes de Protoxina-II. Las modificaciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones conservadoras que darán como resultado variantes de Protoxina-II con características similares a las de las moléculas originales. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente pueden dividirse en cuatro familias: (1 ) ácidos (aspartato, glutamato); (2 ) básicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); y (4) polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Alternativamente, el repertorio de aminoácidos puede agruparse como (1 ) ácido (aspartato, glutamato); (2 ) básico (lisina, arginina histidina), (3) alifático (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), con la serina y la treonina agrupadas opcionalmente por separado como hidroxilo alifático; (4) aromático (fenilalanina, tirosina, triptófano); (5) amida (asparagina, glutamina); y (6) que contiene azufre (cisteína y metionina) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2a ed. WH Freeman and Co., 1981). Pueden realizarse sustituciones no conservadoras a las variantes de Protoxina-II que implican sustituciones de residuos de aminoácidos entre diferentes clases de aminoácidos para mejorar las propiedades de las variantes de Protoxina-II y proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II. Puede determinarse fácilmente si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o fragmento del mismo da como resultado un homólogo funcional evaluando la capacidad del polipéptido o fragmento modificado para producir una respuesta de una manera similar a la del polipéptido o fragmento no modificado usando los ensayos descritos en la presente. Los péptidos, polipéptidos o proteínas en los que tiene lugar más de un reemplazo pueden probarse fácilmente de la misma manera.
Como se divulga en la presente, algunas veces un péptido de nudo de cisteína de veneno de araña de la familia 3 aislado comprende por lo menos una sustitución en una posición correspondiente a la posición W7 y/o W30 de la SEQ ID NO: 1. Las toxinas de araña de la familia 3 incluyen 14 toxinas con región C-terminal conservada, incluyendo, además de Protoxina-II, K-TRTX-Gr2b, K-TRTX-Gr2c, K-TRTX-Ps1a, K-TRTX-Ps1b, p-TRTX-Gr1b, k-TRTX-Cj2a, K-TRTX-Cj2b, K-TRTX-Ec2c, p-TRTX-Gr1a, K-TRTX-Ec2b, K-TRTX-Ec2a y p/K-TRTX-Cj2a y las que se muestran en la Figura 14. Se espera que las sustituciones en las posiciones W7 y/o W30 mejoren el plegamiento de los péptidos de nudo de cisteína de veneno de araña de la familia 3.
Como se divulga en la presente, algunas veces un polinucleótido sintético aislado comprende un polinucleótido que codifica la variante de Protoxina-II de la invención.
En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos sintéticos ejemplares, sin embargo, otros polinucleótidos sintéticos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, pueden codificar las variantes de Protoxina-II y las proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II de la invención. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente los segmentos de polinucleótidos en las proteínas de fusión que codifican la propia variante de Protoxina-II. Las secuencias de polinucleótidos sintéticos que codifican las variantes de Protoxina-II o proteínas de fusión de la invención pueden enlazarse operativamente a uno o más elementos reguladores, como un promotor y potenciador, que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped pretendida. El polinucleótido sintético puede ser un ADNc.
Los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante síntesis química como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas como la duplicación basada en PCR, duplicación basada en vectores o técnicas de manipulación de ADN basadas en enzimas de restricción. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de secuencias conocidas son bien conocidas.
Los polinucleótidos de la invención también pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, como secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación, sitios de unión a ribosomas, secuencias estabilizadoras de ARNm, intrones y señales de poliadenilación. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales. Estas secuencias de polinucleótidos adicionales pueden, por ejemplo, codificar un marcador o secuencias etiqueta bien conocidas como una hexahistidina (SEQ ID NO: 108) o una etiqueta HA que facilitan la purificación de polipéptidos fusionados.
Otra realización de la invención divulgada en la presente, es un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción del polinucleótido de la invención en un organismo o trasfondo genético dado por cualquier medio. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las variantes de Protoxina-II o las proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II de la invención se insertan en un vector de expresión y pueden enlazarse operativamente a secuencias de control en el vector de expresión para asegurar una expresión eficiente, como secuencias señal, promotores (por ejemplo, promotores asociados de manera natural o heterólogos), elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y se eligen para que sean compatibles con la célula huésped elegida para expresar la variante de Protoxina-II o la proteína de fusión de variante de Protoxina-II de la invención. Una vez que el vector se ha incorporado al huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un nivel de expresión alto de las proteínas codificadas por los polinucleótidos incorporados.
Los vectores de expresión adecuados son típicamente replicables en los organismos huésped o como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección como resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
En la técnica se conocen elementos promotores y potenciadores adecuados. Para la expresión en una célula bacteriana, los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Para la expresión en una célula eucariota, los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, elementos promotores y potenciadores del gen de inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada; promotor temprano inmediato de citomegalovirus; promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple; promotores SV40 tempranos y tardíos; promotor presente en repeticiones terminales largas de un retrovirus; promotor de metalotioneína-I de ratón; y varios promotores específicos de tejido conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula de levadura, un promotor adecuado es un promotor constitutivo como un promotor ADH1 PGK1, ENO o PYK1 y similares, o un promotor regulable como un promotor GAL1 o GAL10. La selección del vector y el promotor adecuados está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.
Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados; muchos están disponibles comercialmente para generar constructos recombinantes. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, Px R1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).
Un vector ejemplar para la expresión de las variantes de Protoxina-II o proteínas de fusión variantes de Protoxina-II es un vector que tiene marcador de selección de resistencia a ampicilina, promotor de CMV, intrón de CMV, péptido señal, resistencia a neomicina, origen de replicación f1, señal de poliadenilación de SV40 y ADNc que codifica la variante de Protoxina-II o la proteína de fusión de variantes de Protoxina-II de la invención.
Otra realización de la invención divulgada en la presente, es una célula huésped que comprende el vector de la invención. El término "célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector. Se entiende que el término célula huésped pretende referirse no solo a la célula objeto particular sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie puede no ser idéntica a la célula original, pero todavía están incluidas dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células procariotas, células vegetales o células arqueales.
Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas, como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas, son ejemplos de células huésped procariotas. Otros microbios, como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) y Pichiason ejemplos de células huésped de levadura adecuadas. Las células eucariotas ejemplares pueden ser de origen mamífero, de insecto, aviar u otro animal. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas como hibridomas o líneas celulares de mieloma como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 85110503), líneas celulares murinas FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es la U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, Md ), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.
La introducción de un polinucleótido, como un vector, en una célula huésped puede efectuarse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos ejemplares son transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos y electroporación.
Otra realización de la invención divulgada en la presente, es un método para producir la variante de Protoxina-II de la invención que comprende los pasos de proporcionar una célula huésped de la invención; y cultivar la célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de por lo menos una variante de Protoxina-II de la invención.
Las células huésped pueden cultivarse en cualquier condición adecuada para mantener o propagar un tipo dado de célula huésped y suficiente para expresar un polipéptido. Las condiciones de cultivo, los medios y los métodos relacionados suficientes para la expresión de polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, muchos tipos de células de mamíferos pueden cultivarse aeróbicamente a 37° C usando medios DMEM apropiadamente tamponados mientras que pueden cultivarse bacterias, levaduras y otros tipos de células a 37° C en condiciones atmosféricas apropiadas en medio LB.
En los métodos de la invención divulgada en la presente, la expresión de la variante de Protoxina-II puede confirmarse usando una variedad de métodos bien conocidos. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido puede confirmarse usando reactivos de detección, como usando SDS-PAGE o HPLC.
Un método para modular la actividad de Nav1.7 en un tejido biológico, puede comprender el método poner en contacto el tejido biológico que expresa Nav1.7 con una cantidad moduladora de Nav1.7 de la variante de Protoxina-II de la invención.
USOS DE VARIANTES DE PROTOXINA-II
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, pueden utilizarse en cualquier terapia en la que se desee tratar, reducir o aliviar síntomas de dolor u otros trastornos de disfunción de neuronas sensoriales o simpáticas.
El dolor tratado con las variantes de Protoxina-II de la invención divulgada en la presente, puede ser cualquier tipo de dolor, como dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor asociado con afecciones inflamatorias, dolor postoperatorio, dolor térmico o dolor asociado con enfermedad y degeneración.
El dolor tratado con las variantes de Protoxina-II de la invención divulgada en la presente, puede ser dolor mediado por Nav1.7.
El dolor mediado por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere al dolor que resulta, por lo menos parcialmente, de la actividad del canal Nav1.7 aumentada.
Las variantes de Protoxina-II, o proteínas de fusión, de la invención pueden usarse para tratar a un paciente animal que pertenezca a cualquier clasificación. Los ejemplos de tales animales incluyen mamíferos como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja.
El dolor y/o el dolor mediado por Nav1.7 pueden ser el resultado de una o más causas, como neuropatía periférica, neuropatía central, compresión nerviosa o síndromes de atrapamiento como síndrome del túnel carpiano, síndrome del túnel del tarso, atrapamiento del nervio cubital, radiculopatía por compresión, estenosis espinal lumbar, compresión del nervio ciático, compresión de la raíz espinal, neuralgia intercostal, radiculopatía por compresión y dolor lumbar radicular, lesiones de la raíz espinal, neuritis, enfermedades autoinmunes, inflamación general, afecciones inflamatorias crónicas, artritis, enfermedades reumáticas, lupus, osteoartritis, trastornos gastrointestinales generales, colitis, ulceración gástrica, úlceras duodenales, trastornos inflamatorios del intestino, síndrome del intestino irritable, dolor asociado con diarrea, trastornos inflamatorios oculares, trastornos de la vejiga inflamatorios o inestables, psoriasis, dolencias de la piel con componentes inflamatorios, quemaduras solares, carditis, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedades vasculares del colágeno, dolor inflamatorio e hiperalgesia y alodinia asociadas, dolor neuropático e hiperalgesia y alodinia asociadas, esclerosis múltiple, enfermedades desmielinizantes, diabetes, dolor por neuropatía diabética, causalgia, dolor resultante de amputación o absceso, dolor de miembro fantasma, dolor de fracturas, lesión ósea, trauma directo, infección por VIH, síndrome de inmunodeficiencia adquirida ("SIDA"), infección por viruela, infección por herpes, exposición a toxinas u otras partículas o moléculas extrañas, cáncer invasivo, cáncer, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, quemaduras, defecto congénito, dolor dental, dolor por gota, fibromialgias, encefalitis, alcoholismo crónico, hipotiroidismo, uremia y deficiencias de vitaminas, neuralgia del trigémino, ataque cerebral, síndrome de dolor talámico, cefalea generalizada, migraña, cefalea en racimos, cefalea tensional, síndromes mixtos vasculares y no vasculares, dolor mantenido simpáticamente, síndromes de desaferenciación, asma, daño o disfunción del tejido epitelial, alteraciones de la motilidad visceral en regiones respiratorias, genitourinarias, gastrointestinales o vasculares, heridas, quemaduras, reacciones cutáneas alérgicas, prurito, rinitis vasomotora o alérgica o trastornos bronquiales, dismenorrea, dolor durante el parto y el nacimiento, dispepsia, reflujo gastroesofágico, pancreatitis y visceralgia.
Otros trastornos de la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas que pueden aliviarse con las variantes de Protoxina-II de la invención incluyen picazón, tos y asma. En ratones, la deleción global del gen SCN9A lleva a una insensibilidad completa al prurito inducido por histamina (Gingras et al., American Pain Society Meeting Abstract 2013 y la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2012/0185956). Este descubrimiento sugiere que los bloqueadores del péptido Nav1.7 pueden tener utilidad en el tratamiento del picazón, que puede surgir de varias fuentes, como trastornos dermatológicos o inflamatorios; o trastornos inflamatorios como trastornos renales o hepatobiliares, trastornos inmunológicos, reacciones a medicamentos y afecciones desconocidas/idiopáticas, que incluyen dermatitis, psoriasis, eccema, picadura o mordedura de insecto. Nav1.7 también se expresa en los nervios sensoriales que inervan las vías respiratorias (Muroi et al., J Physiol. Diciembre 2011 1; 589 (Pt 23):5663-76; Muroi et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 10 de abril de 2013), lo que sugiere que los bloqueadores del péptido Nav1.7 pueden ser beneficiosos en el tratamiento de la tos, por ejemplo, tos aguda o crónica, o tos provocada por la irritación de la enfermedad por reflujo gastroesofágico y enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias como el asma y las respuestas inmunes relacionadas con alergias, broncoespasmo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, enfisema e hipo (hipo, singultus). Silenciar Nav1.7 in vivo en ganglios nudosos de cobayas usando ARNhc casi anuló el reflejo de tos inducido por sondeo mecánico (Muroi et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 10 de abril de 2013).
Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden usarse en un método para aliviar o tratar el picor, la tos o el asma en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante de Protoxina-II de la invención divulgada en la presente, a un sujeto con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para aliviar el picor, la tos o el asma.
Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden usarse en un método para aliviar o tratar el picor mediado por Nav1.7, la tos mediada por Nav1.7 o el asma mediada por Nav1.7 en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante de Protoxina II de la invención divulgada en la presente a un sujeto con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para aliviar el picor, la tos o el asma.
El picor mediado por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere al picor resultante, por lo menos parcialmente, de la actividad del canal Nav1.7 aumentada.
La tos mediada por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere a la tos resultante, por lo menos parcialmente, de la actividad del canal Nav1.7 aumentada.
El asma mediada por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere al asma resultante, por lo menos parcialmente, de la actividad del canal Nav1.7 aumentada.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, pueden probarse para determinar su efecto en la reducción o alivio del dolor y/o el dolor mediado por Nav1.7 usando modelos animales descritos en la presente, y modelos como el modelo de ligadura de nervio espinal de rata (SNL) de dolor neuropático, modelo de alodinia inducida por carragenano, modelo de alodinia inducida por adyuvante completo de Freund (CFA), modelo de lesión térmica, modelo de formalina y modelo de Bennett, y otros modelos como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2011/0124711 y la Patente de Estados Unidos N° 7.998.980. La alodinia inducida por carragenano y la alodinia inducida por CFA son modelos de dolor inflamatorio. El modelo de Bennett proporciona un modelo animal para el dolor crónico que incluye dolor posoperatorio, síndrome de dolor regional complejo y distrofia simpática refleja.
Puede usarse cualquiera de los modelos animales anteriores para evaluar la eficacia de las variantes de Protoxina-II del inhibidor de la invención en el tratamiento del dolor y/o el dolor mediado por NAv1.7. La eficacia de las variantes de Protoxina-II de la invención puede compararse con un control sin tratamiento o con placebo. Adicional o alternativamente, la eficacia puede evaluarse en comparación con uno o más medicamentos para aliviar el dolor conocidos.
La presente invención proporciona variantes de Protoxina-II o proteínas de fusión, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar el dolor mediado por Nav1.7 usando las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente. Se ha descubierto en la solicitud pendiente de los inventores (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 61/781.276) que la administración de péptidos bloqueadores de Nav1.7 es eficaz para tratar y/o aliviar el dolor en varios modelos animales de dolor, al contrario de lo que se ha divulgado y sugerido en la bibliografía. Aunque se ha demostrado que los inhibidores peptídicos de Nav1.7 son potentes y/o selectivos hacia Nav1.7 en modelos de cultivo celular in vitro usando Nav1.7 sobreexpresado o en neuronas aisladas en las que la barrera hematoencefálica se subvierte a través de la eliminación de la vaina o inyección de solución salina hipertónica, hasta ahora han demostrado no ser eficaces en modelos animales in vivo de dolor, donde se ha informado que la falta de eficacia es el resultado de la incapacidad de los péptidos para atravesar la barrera hematoencefálica. Varias publicaciones describen la falta de eficacia de los péptidos bloqueadores de Nav1.7 en modelos animales de dolor o en nervios aislados. Por ejemplo, Hackel et al., Proc Natl Acad Sci 109: E2018-27, 2012, describen la incapacidad de ProTx-II para inhibir la activación del potencial de acción en nervios aislados a menos que la barrera perineural, que proporciona una barrera de difusión en este modelo, esté comprometida. ProTx-II no resultó eficaz en modelos de roedores de dolor agudo e inflamatorio; una explicación probable indicaba la incapacidad de ProTx-II para cruzar la barrera hematoencefálica (Schmalhofer et al., Mol Pharmacol 74:1476-1484, 2008). Se ha propuesto que los bloqueadores de toxinas de péptidos de Nav1.7 tienen poca biodisponibilidad oral y son difíciles de administrar a las terminaciones nerviosas, lo que implica que su uso como agentes terapéuticos sigue siendo limitado (Dib-Hajj et al., Nature Rev Neuroscience 14, 49-62, 2013).
Nav1.7 se expresa en el sistema nervioso periférico, por ejemplo, en los ganglios de la raíz dorsal nociceptiva (DRG), más particularmente en las neuronas DRG nociceptivas de diámetro pequeño, en particular en las terminales periféricas de la piel, con poca representación en el cerebro. La distribución de Nav1.7 (por ejemplo, terminación sensorial) y la fisiología la predisponen a un función importante en la transmisión de estímulos dolorosos.
Una realización de la invención es una variante de Protoxina-II o proteína de fusión, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar el dolor mediado por Nav1.7 mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante de Protoxina-II de la invención divulgada en la presente, a un sujeto con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el dolor mediado por Nav1.7.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, pueden utilizarse en cualquier terapia en la que se desee tratar el dolor mediado por Nav1.7 u otros trastornos de la disfunción neuronal sensorial o simpática. Se pretende que "tratar" o "tratamiento" del dolor incluya prevenir, detener, inhibir, reducir o retrasar parcial o completamente la percepción del dolor.
En algunas realizaciones, el dolor mediado por Nav1.7 es dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor posoperatorio, dolor térmico, dolor del miembro fantasma o dolor asociado con afecciones inflamatorias, eritemalgia primaria (EP), trastorno de dolor extremo paraoxístico (PEPD), osteoartritis, artritis reumatoide, discectomía lumbar, pancreatitis, fibromialgia, neuropatía diabética dolorosa (PDN), neuropatía posherpética (PHN), neuralgia del trigémino (NT), lesiones de la médula espinal o esclerosis múltiple, o dolor asociado con enfermedad y degeneración.
El dolor neuropático incluye, por ejemplo, neuropatía diabética dolorosa (PDN), neuropatía postherpética (PHN) o neuralgia del trigémino (NT). Otras causas de dolor neuropático incluyen lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, dolor del miembro fantasma, dolor posterior a ataque cerebral y dolor asociado al VIH. Las afecciones como dolor de espalda crónico, osteoartritis y cáncer también pueden dar como resultado la generación de dolor relacionado con neuropático y, por tanto, son potencialmente adecuadas para el tratamiento con las variantes de Protoxina-II de la invención.
En otra realización, el dolor mediado por Nav1.7 está asociado con eritemalgia primaria (PE), trastorno de dolor extremo paraoxístico (PEPD), osteoartritis, artritis reumatoide, discectomía lumbar, pancreatitis o fibromialgia.
Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden conjugarse con un segundo polipéptido para formar una proteína de fusión. Tales proteínas de fusión son, por ejemplo, las fusiones de Fc bien conocidas o fusiones con albúmina de suero humano para prolongar la vida media de los inhibidores peptídicos. La conjugación puede ser una conjugación directa a través de un conector, como un conector rico en glicina-serina. Tales conectores son bien conocidos en la técnica. Las variantes de Protoxina-II de la invención que incorporan fracciones adicionales pueden compararse por su capacidad de bloqueo de Nav1.7 y su eficacia en el tratamiento o reducción del dolor usando métodos bien conocidos y los descritos en la presente.
Otros trastornos de la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas que pueden tratarse con las variantes de Protoxina-II de la invención incluyen asma, tos, ardor de estómago, picor, dermatitis, inestabilidad de la vejiga y enfermedad de Reynaud.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, pueden formularse en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. Una realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende la variante de Protoxina-II aislada de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de material particulado y pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, como agentes reguladores y tamponantes del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. Los vehículos adecuados y su formulación y envasado se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21a ed., Troy, D. ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2005) Capítulos 40 y 41).
Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden administrarse mediante administración periférica. "Administración periférica" o "administrado periféricamente" significa introducir un agente en un sujeto fuera del sistema nervioso central. La administración periférica abarca cualquier vía de administración distinta de la administración directa a la columna o al cerebro.
La administración periférica puede ser local o sistémica. La administración local puede usarse para concentrar el agente terapéutico en el sitio de acción, como la administración local en articulaciones, heridas quirúrgicas, sitios de lesión/trauma, fibras nerviosas periféricas, varios órganos (GI, urogenital, etc.) o tejidos inflamados. La administración sistémica da como resultado la administración de una composición farmacéutica a esencialmente todo el sistema nervioso periférico del sujeto y también puede dar como resultado la administración al sistema nervioso central dependiendo de las propiedades de la composición.
Las vías de administración periférica abarcan, sin limitación, administración tópica, inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarticular o de otro tipo, y minibombas implantadas u otros dispositivos o formulaciones de liberación prolongada.
Los compuestos también pueden administrarse directamente al sistema nervioso central, por ejemplo, administración intratecal o intracisternal. La administración intratecal continua puede lograrse mediante el uso de bombas espinales de fármacos implantadas.
Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen formulaciones que implican las variantes de Protoxina-II de la invención en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Estas formulaciones pueden lograrse mediante el uso de, por ejemplo, microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, macroemulsiones, compuestos poliméricos (como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico), ácido poliglicólico o copolímeros de etileno acetato de vinilo), perlas o liposomas, ácido hialurónico o dispositivos implantables de administración de fármacos.
Las variantes de Protoxina-II de la invención divulgadas en la presente, pueden prepararse para uso para administración parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa), intracerebral (intraparenquimatosa), intratecal, intraarticular, intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación, o cualquier otra administración, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración bucal o sublingual como en forma de comprimidos o cápsulas; o por vía intranasal como en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; por vía transdérmica en forma de gel, pomada, loción, crema o polvo para espolvorear, suspensión o sistema de administración por parche con potenciadores químicos o para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentración del fármaco en el parche transdérmico, o con agentes que permiten la aplicación de formulaciones que contienen proteínas y péptidos sobre la piel (Publicación de Patente Internacional N° WO98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear vías de transporte transitorias como la electroporación, o para aumentar la movilidad de los fármacos cargados a través de la piel como la iontoforesis, o la aplicación de ultrasonidos como la sonoforesis (Patentes de Estados Unidos N° 4.309.989 y 4.767.402). La composición también puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se haya absorbido o encapsulado la molécula deseada.
Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación programada o administración continua.
La concentración de las variantes de Protoxina-II de la invención u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, por ejemplo de aproximadamente el 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2% o entre el 2% y el 5%, hasta tanto como el 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en peso y se seleccionará principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades y otros factores, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con preparaciones de proteínas convencionales. Las técnicas de liofilización y reconstitución son bien conocidas en la técnica.
Una composición farmacéutica ejemplar de la presente invención puede comprender tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, y puede incluir además sorbitol, sacarosa, Tween-20 y/o un sustituto adecuado de los mismos.
Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis terapéuticamente eficaz apropiada. Una dosis eficaz se refiere a una cantidad o dosificación suficiente para producir un resultado deseado, es decir, para prevenir, detener, inhibir, reducir o retrasar parcial o completamente la percepción del dolor asociado con cualquier afección médica dolorosa. La cantidad eficaz puede variar dependiendo del vehículo específico y las variantes de Protoxina-II de la invención seleccionadas, y también depende de una variedad de factores y afecciones relacionadas con el sujeto a tratar y la gravedad del dolor. Por ejemplo, factores como la edad, el peso y la salud del sujeto al que se administrarán las composiciones farmacéuticas de la invención, así como las curvas de respuesta a la dosis y los datos de toxicidad obtenidos en el trabajo preclínico con animales podrían estar entre los considerados. Una dosis determinada puede repetirse, si es necesario, a intervalos de tiempo apropiados seleccionados según sea apropiado por un médico u otra persona experta en la técnica relevante (por ejemplo, enfermera, veterinario o técnico veterinario) durante el período de tratamiento. La determinación de una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz para un agente dado está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
Por tanto, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular que contenga 1 ml de agua tamponada estéril y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, aproximadamente 50 ng y aproximadamente 30 mg o aproximadamente 5 mg y aproximadamente 25 mg de una variante de Protoxina-II de la invención. De manera similar, podría elaborarse una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa para contener aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril y de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de las variantes de Protoxina-II de la invención. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos y se describen con más detalle en, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science”, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos no limitativos.
Ejemplo 1: Diseño y generación de variantes de Protoxina-II
Se diseñó una biblioteca de selección de sustitución de aminoácidos limitada de posición única de Protoxina-II para evaluar hasta qué grado pueden mejorarse la selectividad, el rendimiento de péptidos y la homogeneidad.
Las variantes de Protoxina II se diseñaron como proteínas de fusión HSA escindibles con proteasa HRV3C en el siguiente formato desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal: 6xHis-HSA-conector-péptido escindible de HRV3C-variante de Protoxina-II ("6xHis" divulgado como la SEQ ID NO: 108); siendo el conector (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 80, HSA teniendo la secuencia de la SEQ ID NO: 106, péptido escindible de HRV3C teniendo la secuencia de la SEQ ID NO: 82). Cada variante de Protoxina-II, después de la escisión de HSA, tenía un GP N-terminal residual del sitio de escisión.
Las variantes se caracterizaron en ensayos de despolarización de membrana usando FLIPR® Tetra como se describe en el ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra del Ejemplo 3, y en experimentos de fijación en parche de células completas usando el ensayo QPatch como se describe en el Ejemplo 3.
Se diseñaron bibliotecas combinatorias para probar los efectos aditivos de aciertos de posición única seleccionados en un intento de generar antagonistas de Nav1.7 con una potencia y un perfil de selectividad mejorados aún más en comparación con el péptido nativo.
Construcción de los vectores de expresión
Los genes de variantes de Protoxina-II diseñados se generaron usando tecnología de ensamblaje de genes sintética como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.521.427. Las secuencias de aminoácidos de las variantes de péptidos diseñadas se retrotradujeron a secuencias de ADN usando codones humanos de alta frecuencia. La secuencia de ADN de cada gen variante, junto con una porción del ADN del vector que incluye los sitios de clonación del ADN, se sintetizó como múltiples oligonucleótidos, algunos de los cuales contenían codones degenerados, y se ensamblaron en fragmentos de ADN de longitud completa. Los fragmentos de ADN ensamblados se amplificaron mediante PCR y los productos de PCR se clonaron posteriormente como un conjunto. Los productos de PCR agrupados se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas y se clonaron en el vector de expresión designado de tal manera que se fusionase cada gen de variante de toxina con el péptido señal y el compañero de fusión (6xHis-HSA-conector-péptido escindible de HRV3C ("6xHis" divulgado como la SEQ ID NO: 108) contenido en el vector. Se usaron técnicas de biología molecular estándar para identificar un clon positivo para cada variante designada. El ADN plasmídico de estos clones positivos se purificó y se confirmó la secuencia antes de expresar las proteínas de fusión de la variante del péptido de Protoxina-II usando métodos estándar.
Expresión de proteínas
Las células HEK 293-F se mantuvieron en medio 293 Freestyle™ (Invitrogen N° de Cat 12338) y se dividieron cuando la concentración de células estaba entre 1,5 y 2,0 x 106 células por ml. Las células se cultivaron en suspensión, agitando a 125 RPM en una incubadora humidificada a 37° C y CO2 al 8%. Las células HEK 293F se transfectaron transitoriamente usando un complejo de ADN/lípido después de que se hubieron diluido a 1,0 x 106 células por ml. Para generar el complejo, se diluyeron 1,25 |jg de ADN por ml de transfección en 1,0 ml de medio OptiPro (Invitrogen N° de Cat12309) y se diluyeron 1,25 ml de reactivo de transfección Freestyle™ Max (Invitrogen N° de Cat 16447) en 1,0 ml de medio OptiPro. El ADN y el reactivo de transfección Mas se mezclaron y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de añadirlos a las células. Las células transfectadas se colocaron en una incubadora humidificada a 37° C y CO2 al 8% durante 4 días agitando a 125 RPM. El sobrenadante se separó de las células mediante centrifugación a 5000 x g durante 10 minutos y se filtró a través de un filtro de 0,2 jm (Corning; N° de Cat 431153), luego se concentró 10 y 50 veces usando un Amicon Ultra Concentrator 10K (N° de Cat UFC901096), y centrifugando durante aproximadamente 10 minutos a 3.750 x g.
Ejemplo 2: Purificación de variantes de la ProtoxinalI
Las variantes de Protoxina-II se expresaron como proteínas de fusión de HSA como se indica en el Ejemplo 1 y los péptidos variantes de Protoxina-II se escindieron con proteasa HRV3C antes de la purificación. Se probaron dos metodologías para la purificación eficaz de las variantes de Protoxina-II.
Purificación de proteínas
Purificación de variantes de Protoxina-II por RP-HPLC
Las proteínas secretadas se purificaron a partir de los sobrenadantes de expresión mediante IMAC usando columnas HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare N° de Cat 17-5247-01). Se realizó el método de cromatografía usando un AKTA Xpress y la proteína se eluyó de la columna usando un gradiente escalonado de imidazol. Las fracciones de los picos se combinaron y se digirieron durante la noche con proteasa HRV 3C (1 |jg de proteasa/150 |jg de fusión).
Los grupos de fusión de péptidos escindidos se purificaron adicionalmente usando un sistema de HPLC DioneXcon una columna Phenomenex Luna de 5 jm C18(2) de fase inversa (N° de Cat 00B-4252-PO-AX). Las muestras se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo al 0-68% (TFA al 0,05%). Las fracciones de elución se combinaron, se liofilizaron durante la noche y se reconstituyeron en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCb 2 mM, MgCb 1 mM).
La Tabla 4 muestra los rendimientos de variantes de Protoxina-II purificadas por RP-HPLC. El rendimiento medio en mg/l fue de 0,01615.
Tabla 4.
Figure imgf000041_0001
Purificación de variantes de la Protoxina II mediante extracción en fase sólida (SPE)
Las proteínas secretadas se purificaron a partir de los sobrenadantes de expresión mediante IMAC usando columnas HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare N° de Cat 17-5247-01). El método de cromatografía se ejecutó usando un AKTA Xpress y la proteína se eluyó de la columna usando un gradiente escalonado de imidazol. Las fracciones de los picos se combinaron y se digirieron durante la noche con proteasa HRV3C (1 |jg de proteasa/150 |jg de fusión). La muestra escindida se cargó en una unidad de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 50 kDa (Millipore UFC805096) y el péptido escindido se recogió en la fracción de filtrado.
Los grupos de péptidos se cargaron en un bloque de extracción en fase sólida de 96 pocillos (Agilent Bond Elut Plexa A3969030) para purificación, desalación y concentración adicionales. Los bloques se usaron junto con un colector de vacío (Whatman). Las muestras de péptidos se cargaron y lavaron en TFA al 0,05% en agua y se eluyeron con un gradiente escalonado de acetonitrilo con TFA al 0,05% en agua. Luego las fracciones de elución se liofilizaron durante la noche y se reconstituyeron en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCb 2 mM, MgCb 1 mM).
Los péptidos se reconstituyeron en solución salina tamponada con HEPES suplementada, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCb 2 mM, MgCb 1 mM) y se midió la absorbancia a 280 nm. A continuación, se calcularon los valores de concentración usando el coeficiente de extinción de cada muestra. Se cargaron 2 jg de cada péptido en un gel de 15 pocillos Invitrogen NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gel y se ejecutaron en tampón MES no reducido.
Las muestras se analizaron en HPLC Agilent 1100 usando acetonitrilo al 4-80% en gradiente lineal de TFA al 0,05% con una columna analítica Phenomenex Luna C18(2) (N° de cat. 00A-4041-B0). Se normalizaron las concentraciones de todos los péptidos y se inyectaron 10 j l de cada uno para un total de 1,3 jg por muestra. Se monitorizó la absorbancia a 220 nm y se analizaron los cromatogramas usando el software Chromeleon.
La Tabla 5 muestra los rendimientos (mg) de variantes de Protoxina-II purificadas por SPE. El rendimiento medio en mg/l fue de 0,05353.
Los beneficios del proceso de purificación SPE son la facilidad y el rendimiento de la purificación, ya que las muestras se procesan en paralelo en un bloque de 96 pocillos en lugar de en serie en RP-HPLC, y la mejora del rendimiento. Hubo, de media, un rendimiento más de 3 veces mayor (mg/l) para las variantes purificadas por SPE frente a RP-HPLC.
Tabla 5.
Figure imgf000042_0001
Ejemplo 3: Caracterización de variantes de Protoxina-II
Se caracterizaron variantes seleccionadas de Protoxina-II en ensayos de despolarización de membrana y de fijación en parche de células completas para evaluar su potencia y selectividad hacia Nav1.7.
Ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra
Se midió la capacidad de los péptidos generados para inhibir la despolarización de la membrana inducida por el agonista de Nav1.7 veratridina (3-Veratroilveracevina; Biomol, N° de Catálogo NA125) con un ensayo FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) en FLIRP Tetra® usando DISBAC2(3) (Invitrogen, K1018) como aceptor de electrones y PTS18 (8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisolfonato trisódico) (Sigma) como donante excitando al donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.
Las células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano se cultivaron en medio DMEM/F-12 (1:1), suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, 400 pg/ml de genetina y 100 pM de NEAA (todos los reactivos de Invitrogen). Se sembraron 50 pl de células recogidas a 25.000 células/pocillo en placas de fondo negro transparente de 384 pocillos revestidas con poli-lisina. Las placas se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 15 min seguido de una incubación durante la noche a 37° C. Todas las incubaciones se realizaron en la oscuridad a menos que se indique lo contrario. Al día siguiente, los pocillos se lavaron 4 veces con tampón de ensayo (NaCl 137 mM, KCl 4 mM, MgCb 2 mM, CaCb 2 mM, Glucosa 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) y se vilvió a suspender en 25 pl de tampón de ensayo. Se preparó 2x de solución madre (6 pM) del colorante PTS18 suspendiendo el colorante en pluronic F127 al 10% en d Ms O a 1:1 (proporción v/v). Se añadieron 25 pl de la solución madre 2x PTS18 a los pocillos y las células se tiñeron durante 30 min a RT, después de lo cual se lavó el colorante con el tampón de ensayo. Los péptidos se suspendieron a 3x su concentración final en el tampón de ensayo que contenía DISBAC2(3) 10 pM y v A b SC-1400 pM para suprimir la fluorescencia de fondo (Sigma, N° de Cat 201987). Se añadieron 25 pl/pocillo de los péptidos suspendidos en cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos a RT. La despolarización se indujo mediante una concentración final de 25 pM de veratridina (añadiendo 25 pl/pocillo de solución madre 75 pM (3x)), y se midió la reducción de la intensidad media de la fluorescencia del colorante FRET 30-100 segundos después de añadir el agonista. Se produjo una dilución de 1,3 veces mayor de cada péptido medido después de añadir la veratridina por convención, se informa la concentración al comienzo del ensayo FLIPR® Tetra.
Se construyeron curvas de concentración-respuesta de Protoxina-II sintética (Peptide International) en cada serie experimental y se usaron como controles. Los recuentos de fluorescencia para cada pocillo se convirtieron en % de respuesta normalizando la señal a la diferencia entre los valores de control negativo (respuesta al agonista veratridina sola) y control positivo (respuesta a veratridina en presencia de tetracaína 10 pM). Para las mediciones, se activaron la "corrección de uniformidad espacial" (todas las trazas de fluorescencia se normalizan a la intensidad de partida inicial medial) y el "valor de desplazamiento de resta" (resta la intensidad de partida inicial de cada traza) en FLIPR® Tetra. Cada punto de datos representó la respuesta en un pocillo individual. Todos los puntos de datos individuales se usaron en un procedimiento de ajuste de mínimos cuadrados no lineales para encontrar el mejor ajuste a una función de Hill usando Origin (Microcal). Se extrajeron los valores de IC50 de la curva ajustada resultante. Se usaron las respuestas medias de los controles positivo (P) y negativo (N) para calcular el % de respuesta en un pocillo de la siguiente manera: % de respuesta = 100*(N-R)/(N-P).
Se aceptaron placas de ensayo si la potencia de los antagonistas de control para ese día estaba dentro de ± 0,5 unidades logarítmicas de su media histórica.
Ensayo QPatch
Se cultivaron células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.5 humana (SEQ ID NO: 105), Nav1.7 (SEQ ID NO: 79) o Nav1.6 (SEQ ID NO: 407) en medio DMEM/F-12 (1:1), suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, 400 pg/ml de Geneticina y NEAA 100 pM (todos los reactivos de Invitrogen). Las células se mantuvieron a 37° C, y en 5% de CO2 y se ensayaron tras alcanzar ~50-90% de confluencia. Se cultivaron células CHO que expresan de manera estable Nav1.6 humano de una manera inducible por tetraciclina (SEQ ID NO: 407) en HAM F12, suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, blasticidina 10 pg/ml y 400 pg/ml de zeocina. Las células se mantuvieron a 37° C y en 5% de CO2, y se analizaron tras alcanzar una confluencia de ~50-90%. La expresión de Nav1.6 se indujo con 1 pg/ml de tetraciclina, 24-48 h antes de un experimento.
Antes de la prueba en QPatch HT (Sophion), las células se disociaron primero usando tripsina al 0,05% (5 min a 37° C), se volvieron a suspender en medio CHO-S-SFM (Life Technologies) y se trituraron suavemente para separar los grumos de células. La densidad celular se ajustó a 1-2x106/ml con el mismo medio y las células se transfirieron a un "hotel" celular en QPatch HT y se usaron en experimentos durante varias horas. Para la formación de sellos de giga-ohmios y el registro de fijación en parche de células completas, la solución extracelular contenía NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCb 1 mM , CaCb 2 mM, glucosa 5 mM y HEPES 10 mM, pH = 7,4 y osmolaridad = 315 mOsm. La solución intracelular contenía CsF 135 mM, CsCI 10 mM, EGTA 5 mM, NaCI 5 mM y HEPES 10 mM, pH = 7,3 y osmolaridad = 290 mOsm. El protocolo de voltaje usado en el ensayo fue el siguiente. A partir de un potencial de retención de -75 mV (Nav1.7), -60 mV (Nav1.6) o -105 mV (Nav1.5), las células se hiperpolarizaron primero a -120 mV durante 2 segundos y luego se despolarizaron a 0 mV durante 5 ms antes de volver al potencial de retención. Este protocolo se repitió una vez cada 60 segundos durante las aplicaciones líquidas (ver más abajo). Por lo demás, las células se mantuvieron en el potencial de retención cuando no se ejecutó el protocolo de voltaje anterior. Una vez establecida la configuración de registro de células completas, se realizaron un total de cinco aplicaciones de la solución extracelular (todas conteniendo un 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) con o sin compuesto de prueba, a excepción de la última aplicación, que contenía TTX1 pM o lidocaína 10 mM como control positivo) en las células que se estaban registrando. La primera aplicación líquida contenía solo el tampón de control (5 |jl). El protocolo de voltaje se ejecutó 10 veces (durante una duración total de 10 min) cinco segundos después de la aplicación. Las siguientes tres aplicaciones líquidas (5 pl cada una) contenían un compuesto de prueba (el mismo compuesto a la misma concentración para las tres aplicaciones) o tampón de control (solo para células de control). Cinco segundos después de cada una de estas aplicaciones, se volvió a ejecutar el protocolo de voltaje 10 veces (también una vez por minuto). La última aplicación contenía positivo (compuesto por tres subaplicaciones de 10 jl, cada una separada por 2 segundos), cinco segundos después de lo cual se ejecutó dos veces el mismo protocolo de voltaje para obtener la corriente de referencia. Las corrientes se muestrearon a 25 kHz y se filtraron a 5 kHz con un filtro Bessle de 8 polos. El nivel de compensación de resistencia en serie se fijó en el 80%. Para cada célula, la amplitud de corriente máxima a 0 mV para cada traza de corriente en las primeras cuatro aplicaciones de líquido se restó primero de la última traza en presencia de control positivo y luego se normalizó a la de la última traza en la primera (control tampón) aplicación como % de inhibición. Para controlar la disminución de la corriente, este valor (% de inhibición) para cada célula en presencia de un compuesto de prueba se normalizó adicionalmente al valor de % de inhibición medio para las células de control (típicamente 5-6) en el mismo experimento. La media de los dos últimos valores en la última aplicación de compuesto (es decir, el % de valor de inhibición corregido para cada concentración de un compuesto de prueba) se tomó como el % de valor de inhibición para cada célula a la concentración de compuesto particular probada. Se promediaron los valores de % de inhibición para todas las células probadas a cada concentración de compuesto y se usaron en los cálculos de respuesta a la concentración. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (22° C). Los datos se expresan como media ± se. Se incluyó Protoxina-II de tipo salvaje en cada experimento como control positivo. Los datos se aceptaron solo si la potencia de la Protoxina-Il estaba dentro de ± 0,5 unidades logarítmicas de su media histórica.
Los valores de IC50 para Nav1.7 para variantes de Protoxina-II seleccionadas obtenidos usando el FLIPR® Tetra se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6.
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continuación
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Se probaron variantes seleccionadas de Protoxina-II para determinar su selectividad frente a Nav1.5 humano usando QPatch. En la Tabla 7 se muestran los valores de IC50 tanto para Nav1.7 y Nav1.5 para péptidos seleccionados obtenidos usando QPatch.
Tabla 7.
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Ejemplo 4. Generación y caracterización de variantes combinatorias de Protoxina II
Se diseñaron bibliotecas combinatorias para probar los efectos aditivos de los aciertos de posiciones individuales seleccionadas en un intento de generar antagonistas de Nav1.7 con una potencia y un perfil de selectividad mejorados en comparación con el péptido nativo usando varios enfoques.
Se realizó una exploración de aminoácidos limitada en todas las posiciones de Protoxina-II distintas de cisteína usando A, D, Q, R, K y S para la diversificación. En estos experimentos, la Protoxina-II se expresó y probó como proteína de fusión Fc monovalente como se describe en el Ejemplo 1. A partir de esta exploración, se identificaron las sustituciones Y1Q, W7Q, S11A que mejoraban la potencia y/o selectividad de las variantes resultantes.
También se realizó una exploración completa de aminoácidos (excluyendo cys y trp) en las posiciones M6 y M19. A partir de esta exploración se identificó que la sustitución de M19F mejoró la potencia y/o la selectividad de las variantes resultantes.
Las quimeras de posición única de Protoxina-II/Huwentoxina-IV se diseñaron bidireccionalmente. El propósito de esta biblioteca era obtener variantes de Protoxina-II que retuvieran el perfil de potencia y selectividad de la Protoxina-II de tipo salvaje y lograrían propiedades de replegamiento beneficiosas asociadas con Huwentoxina-IV. Las sustituciones R22T y E12N se identificaron a partir de esta exploración.
El péptido NV1G1153 se modificó adicionalmente diversificando la posición Y1 mediante un escaneo de aminoácidos limitado usando R, K, T, A, D, E, Q y S, y mediante modificación de agrupaciones de carga, donde todos los conjuntos de residuos cargados en la estructura tridimensional del péptido (D10/E12, K4/E17, D10/E12/R13) se mutaron.
Se introdujeron extensiones N- y C-terminales para seleccionar péptidos, incluyendo NV1G1153 con el propósito de mejorar la distribución de péptidos al sitio de acción y de mejorar la vida media de los péptidos sin aumentar significativamente el peso molecular del péptido resultante. Las extensiones N- y C-terminales que se usaron se muestran en la Tabla 8 y 9, respectivamente, y se describen en Oi et. al., Neuroscience Letters 434, 266­ 272, 2008; Whitney et. al., Nature Biotechnology 2011 29:4, 352-356; Sockolosky et. al., (2012) 109: 40, 16095­ 16100. También se usaron péptidos de penetración celular Tat de VIH y poliarginina. Se usaron varios conectores para acoplar la variante de Protoxina-II a las extensiones N- y/o C-terminales. Los conectores usados se muestran en la Tabla 10.
Las variantes de Protoxina-II de cada campaña se probaron para determinar su potencia y selectividad para Nav1.7 usando los métodos descritos en el Ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las variantes que inhibieron Nav1.7 con un valor de IC50 de 200 nM o menos se muestran en la Tabla 3. La Tabla 11 muestra la sustituciones de aminoácidos en la variante seleccionada en comparación con la Protoxina-Il de tipo salvaje, y los valores de IC50 para la inhibición Nav1.7 en el ensayo FLIPR Tetra.
Tabla 8.
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continuación
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Tabla 9.
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Tabla 10.
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Tabla 11.
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La Protoxina-II de tipo salvaje inhibe Nav1.7 con un valor de IC50 de aproximadamente 4 nM en el ensayo FLIPR como se describe en el Ejemplo 3. Las variantes que retienen potencia de Nav1.7 significativa se caracterizaron adicionalmente. La Figura 1 muestra el género secuencia de variantes de Protoxina-II generadas que inhiben Nav1.7 con un valor de IC50 de 30 nM o menos.
Se probaron variantes seleccionadas de Protoxina-II para determinar su inhibición de Nav1.7 y su selectividad frente a Nav1.6 humano usando QPatch. En la Figura 2 se muestran Los valores de IC50 tanto para Nav1.7 como Nav1.6 para péptidos seleccionados obtenidos usando QPatch. Estos péptidos inhibieron Nav1.7 con una IC50 de 30 nM o menos, y fueron por lo menos 30 veces más selectivos sobre Nav1.7 cuando se compara con Nav1.6.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos mostrados en la Figura 2 se muestran en la Figura 3. Todos estos péptidos tenían sustituciones W7Q y M19F en comparación con la Protoxina-II de tipo salvaje.
Las variantes de Protoxina-II se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1, o se sintetizaron mediante métodos estándar de síntesis en fase sólida. Los rendimientos de los péptidos recombinantes o sintéticos se compararon con los rendimientos de la Protoxina-II de tipo salvaje. La Tabla 12 muestra que los rendimientos de las variantes de Protoxina-II seleccionadas fueron significativamente más altos que los de Protoxina-II, lo que indica propiedades de plegamiento mejoradas de las variantes. La escala de la síntesis en fase sólida fue de 0,5 mmol.
Tabla 12.
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Ejemplo 5. Las variantes de Protoxina-II son eficaces en modelos de dolor in vivo
Materiales y métodos
Animales Para este estudio se usaron ratones macho C57B1/6 (24-26 g), pedidos a Charles River y alojados individualmente.
Pruebas de comportamiento
Prueba de Von Frey: Se evaluó el umbral mecánico (táctil) por Von Frey Hairs siguiendo el método Up-Down (Dixon, 1980, Chaplan et al., 1994). Se usaron 7 estímulos graduados (filamentos de von Frey: 0,03, 0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2 g; Stoelting, Wood Dale, IL). Los pelos de Von Frey se presentaron perpendicularmente contra el área plantar central (entre toris) en una pata trasera. Se aplicó suficiente fuerza para doblar ligeramente el filamento y se mantuvo durante 3 segundos. Según el artículo de Chaplan, una respuesta positiva puede ser 1 ) una retirada brusca o 2) un retroceso inmediato tras retirar el filamento. Ver Chaplan et al para obtener más detalles. Los ratones se aclimataron a la malla de alambre en la cámara de prueba durante 30-60 minutos antes de la prueba.
Prueba de Hargreaves: Se usó una caja de Hargreaves modificada para medir la latencia de retirada térmica de la pata (PWL) (Hargreaves et al., 1988, Pain, 32: 77-88; Dirig et al., 1997, J Neurosci. Methods, 76:183-191). Esta caja consiste de una cámara con suelo elevado de vidrio mantenido a temperatura constante (27° C). El estímulo nociceptivo térmico se origina a partir de un haz de luz de bombilla de proyección debajo de la superficie del vidrio. El haz de luz se dirige al área entre el toris (centro plantar). El botón de "inicio" encenderá la luz y pondrá en marcha el cronómetro. Los movimientos (como una retirada brusca) de la pata estimulada activarán el interruptor para apagar la luz y detener el cronómetro. Se muestra la latencia en segundos. Si no se produce ningún movimiento, la bombilla se apagará después de 20 segundos (corte) para evitar lesiones en los tejidos. Se dejó que los animales se habituaran a la superficie del vidrio durante 30-60 minutos antes de la medición de PWL. Se usó un amperaje constante durante todo el estudio, lo que dio como resultado latencias de retirada de la pata antes de la prueba de entre 8 y 12 segundos cuando se promediaron entre 3 y 6 lecturas tomadas con por lo menos 5 minutos de diferencia.
Cálculo de % de MPE: Porcentaje de efecto máximo posible (MPE%) = (Ti-T0)/(Tc-T0) x 100%. T0: umbral el día 0 (post-CFA, prebomba); T1: umbral el día 1 después de la implantación de la bomba; Tc: corte de la prueba (20 s para la prueba de Hargreaves y 2 g para la prueba de Von Frey)
Prueba de placa calefactora: Los animales se colocaron en una placa de metal de 10" x 10" rodeada por 4 paredes de plexiglás (15 pulgadas de alto). La placa se mantuvo a una temperatura de 50 o 55° C. Se midió la latencia de respuesta (tiempo cuando el animal se estremece o se lame por primera vez la pata trasera, salta o vocaliza) y se retiró el animal de la placa. Los animales que no mostraron respuesta se retiraron de la placa después de 40 s (50° C) o 20 s (55° C) para evitar cualquier daño tisular posible. Esta prueba se repitió de 2 a 5 veces cada 15-60 minutos en un día.
Modelos de dolor inflamatorio
Modelo de CFA: Los animales se anestesiaron con isoflurano (4% de inducción y 2% de mantenimiento) y se inyectaron 20 pl de adyuvante de Freund completo al 100% (CFA; Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO) en el área plantar central de una pata trasera usando una aguja de calibre 27 conectada a una jeringuilla Hamilton de 50 pl. Modelo de carragenano: se anestesió a los animales con isoflurano (4% de inducción y 2% de mantenimiento) y se inyectaron 25 pl de A-carragenano al 2% (Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO) disuelta en solución salina normal en el área central plantar de las patas traseras con una jeringuilla de insulina (BD; Franklin Lakes, Nueva Jersey).
Implantación de minibombas
Se llenaron y cebaron minibombas microosmóticas Alzet (Durect Corporation Model 1003D y 2001D) según la guía del fabricante. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (inducción al 5%; mantenimiento al 2%). Se les afeitó la espalda, se les limpió con alcohol isopropílico y povidona yodada y se les hizo una pequeña incisión entre las escápulas. Usando un par de fórceps o pinzas hemostáticas, se formó una pequeña bolsa separando los tejidos conectivos subcutáneos. La bomba se insertó en la bolsa con el moderador de flujo apuntando en dirección opuesta a la incisión. Luego, se cerró la incisión en la piel usando grapas de 7 mm y se dejó que los animales se recuperaran en sus jaulas de origen.
Análisis de datos
Los datos se representan como media ± sem. Se usó Prism (Graphpad Software Inc., La Jolla, CA) para la representación gráfica y el análisis estadístico. Para la comparación de los valores umbral a lo largo del tiempo, se usó un ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni con un nivel de significancia de p<0,05. Los datos de la placa calefactora y el % de m Pe se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni.
Resultados
Se estudió la eficacia de las variantes NV1D3034-OH (NV1D3034-COOH), NV1D3368-OH (NV1D3368-COOH) y NV1D2775-OH (NV1D2775-COOH) en el modelo CfA, un modelo de dolor inflamatorio comúnmente utilizado. La inyección de CFA en la pata trasera indujo edema de la pata (no mostrado) e hipersensibilidad a los estímulos térmicos (hiperalgesia térmica), como lo indica la latencia térmica reducida en la pata inyectada el día 0 (Figura 6A). La hiperalgesia térmica se revirtió completamente con NV1D3034-OH a 684 y 1824 pg/día, cuando se administró mediante una minibomba osmótica subcutánea (Figuras 4A y 4B).
El NV1D3368-OH revertió completamente la hiperalgesia térmica inducida por CFA a 684 y 1824 pg/día (Figura 5A y 5B). NV1D2775-OH demostró una gran eficacia en el modelo de CFA. Las latencias térmicas alcanzaron valores cercanos al límite después de la administración de NV1D2775 (Figura 6A y 6B, 1824 pg/día), lo que sugiere un fuerte efecto analgésico además del efecto antihiperalgesia. Además, NV1D2775-OH revertió la alodinia táctil inducida por CFA (Figura 6C y 6D, 1824 pg/día). El efecto antihiperalgésico de NV1D2775-OH se observó tan pronto como 4 horas después de la implantación de la bomba (Figura 7A). El efecto alcanzó el máximo a las 8 h tanto en las pruebas térmicas como táctiles (Figura 7A y 7B), que se mantuvo a las 24 h. La latencia térmica y el umbral táctil devolvieron el nivel de control 48 h después de la implantación de la bomba (aproximadamente 24 h después de que se predijese que se vaciarían las bombas) (Figura 7A y 7B).
La hiperalgesia térmica inducida por CFA fue fácilmente revertida por dos péptidos adicionales, NV1D3368-amida (NV1D3368-NH2) y NV1D3034-N-metilamida (NV1D3034-NHMe). El % de MPE térmico de los experimentos se resume en la Tabla 13.
Tabla 13.
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NV1D2775-OH también mostró una fuerte eficacia dependiente de la dosis en la prueba de la placa calefactora (Figura 8). Las latencias a 50 y 55° C alcanzaron valores cercanos al punto de corte tras la administración de 1824 pg/día. A 228 pg/día, NV1D2775-OH produjo un aumento modesto pero significativo en la latencia térmica, en comparación con el control de PBS.
La eficacia de NV1D2775-OH se evaluó en otro modelo de dolor inflamatorio, el modelo de carragenano. A los animales se les implantaron bombas NV1D2775-OH o PBS. Las latencias de retirada térmica se midieron antes y el día 1 después de la bomba. Se inyectó A-carragenano en las patas traseras y se midieron de nuevo las latencias térmicas 2, 3 y 4 horas después del carragenano. NV1D2775-OH a 1824 pg/día produjo analgesia significativa (Figura 9). La inyección de A-carragenano en las patas traseras indujo inflamación (no mostrada) y redujo la latencia de retirada térmica de la pata en la prueba de Hargreaves durante el período de prueba de 4 horas (Figura 9, Grupo de PBS). Los animales tratados previamente con NV1D2775-OH a 1824 pg/día estaban completamente protegidos de la hiperalgesia inducida por carragenano.
Ejemplo 6. Generación y caracterización de variantes de Protoxina II combinatorias
Se generó una biblioteca de exploración de aminoácidos para la Protoxina-II. En cada posición sin cisteína en la Protoxina-II (Tyr1, Gln3, Lys4, Trp5, Met6, Trp7, Thr8, Asp10, Ser11, Glu12, Arg13, Lys14, Glu17, Gly18, Met19, Val20, Arg22, Leu23, Trp24, Lys26, Lys27, Lys28, Leu29 y Trp30) se sustituyeron los siguientes residuos en lugar del residuo nativo: Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val y Tyr.
Los péptidos mutantes se expresaron como fusiones recombinantes con albúmina de suero humano y se escindieron enzimáticamente en un sitio específico usando HRV3C para generar variantes de Protoxina-II como se describe en el Ejemplo 1. Cada variante de Protoxina-II, después de la escisión de HSA, tenía un GP N-terminal residual del sitio de escisión. Para cada variante de Protoxina-Il, se midieron los valores de IC50 contra Nav1.7 humano usando FLIPR Tetra o Qpatch de acuerdo con los protocolos descritos en el Ejemplo 3. Las variantes que d e m o s tra ro n u n a IC so ^ ü : 10 0 nM p a ra N a v 1 . 7 h u m a n o fu e ro n c o n t r a -s e le c c io n a d a s p a ra s e le c t iv id a d fre n te a c a n a le s d e h N a v a d ic io n a le s u s a n d o e le c t ro f is io lo g ía Q p a tc h . S e id e n tif ic a ro n y u s a ro n a c ie r t o s s e le c t iv o s e n el d is e ñ o d e b ib lio t e c a s d e p é p tid o s c o m b in a t o r ia s q u e s e p ro d u je ro n u s a n d o tan to la e x p r e s ió n re c o m b in a n te c o m o la s ín t e s is d e p é p tid o s e n f a s e s ó lid a . L a s v a r ia n t e s c o m b in a t o r ia s s e s e le c c io n a r o n u s a n d o la m is m a e s t r a t e g ia q u e s e h a d e ta lla d o c o n a n te r io r id a d .
E n b a s e a lo s re s u lta d o s , la s p o s ic io n e s q u e p u e d e n m u ta rs e p a ra m e jo r a r la s e le c t iv id a d in c lu y e n G ln 3 , S e r 1 1 , G l u 1 2 , L y s 1 4 , G lu 1 7 , G l y 1 8 , L e u 2 9 y T r p 30 (n u m e r a c ió n d e r e s id u o s d e a c u e r d o c o n la S E Q ID N O : 1 ).
L a e s tru c tu ra d e la s o lu c ió n d e P ro to x in a -II s e d e te rm in ó p o r N M R y s e m u e s tra e n la F ig u r a 10 c o m o u n a re p r e s e n t a c ió n d e s u p e rf ic ie . E l la d o iz q u ie r d o d e la F ig u r a m u e s tra e l a n illo d e r e s id u o s d e T r p d e sc r ito a n te r io rm e n te ( P a r k et a l., J . M ed . C h e m . 2 0 1 4 , 5 7 :6 6 2 3 - 6 6 3 1 ), W 5 / W 7 /W 2 4 , q u e ro d e a a M 6. E n e l la d o o p u e s to d e la m o lé c u la , u s a n d o tan to m u t a g é n e s is c o m o e s tru c tu ra d e N M R , s e id e n tific ó u n a c a r a d e s e le c t iv id a d e n e s te e s tu d io s o b re la P ro to x in a -II q u e c o n s is t e d e m ú lt ip le s p o s ic io n e s d e a m in o á c id o s q u e s e p u e d e n m u ta r p a ra m e jo ra r la s e le c t iv id a d p o r h N a v 1 . 7 s o b re o tra s is o fo rm a s d e l c a n a l d e so d io . L o s r e s id u o s q u e re s id e n e n la c a r a d e s e le c t iv id a d in c lu y e n lo s r e s id u o s S e r 1 1 , G lu 1 2 , L y s 1 4 , G l u 1 7 , G l y 1 8 , L e u 2 9 y T r p 30 (n u m e r a c ió n d e r e s id u o s d e a c u e r d o c o n la S E Q ID N O : 1 ). L a id e n t if ic a c ió n d e la c a r a d e s e le c t iv id a d y la s m ú lt ip le s p o s ic io n e s d en tro r e s p o n s a b le s d e la s e le c t iv id a d h a c ia N a v 1 . 7 no s e h a n d e s c r ito c o n a n te r io r id a d .
L a s e le c t iv id a d m e jo ra d a d e la s v a r ia n t e s d e P ro to x in a II c o n s u s t itu c ió n e n S e r 11 e s in e s p e r a d a , y a q u e s e h a d e m o s tra d o c o n a n te r io r id a d q u e la m u ta c ió n d e S e r 11 a fe c ta a la a c t iv id a d en m ú lt ip le s c a n a le s d e N a v y, p o r lo tan to, s e c o n c lu y ó q u e e l re s id u o no d e s e m p e ñ a un p a p e l e n la s e le c t iv id a d d e P ro to x in a -II N a v 1 . 7 ( P a r k et a l., J . M ed . C h e m . 2 0 1 4 , 5 7 : 6 6 2 3 - 6 6 3 1 ).
U n p a s o c la v e e n la p ro d u c c ió n s in té t ic a d e v a r ia n t e s d e P ro to x in a -II e s e l re p le g a m ie n to o x id a t iv o d e l p é p tid o lin e a l, d o n d e s e fo rm a n lo s e m p a r e ja m ie n t o s d e d is u lfu ro . L a t r a z a d e R P - H P L C p a ra la p u r if ic a c ió n d e P ro to x in a -II n a t iv a d e s p u é s d e l re p le g a m ie n to re v e ló m ú lt ip le s p ic o s e n d ife re n te s t ie m p o s d e re te n c ió n q u e te n ñ ia n la m a s a c o rre c ta p e ro d e m o s tra ro n d ife re n te s n iv e le s d e a c t iv id a d , in d ic a t iv o d e u n a m e z c la d e is ó m e r o s d e l p é p tid o p le g a d o s d e fo rm a a d e c u a d a e in a d e c u a d a .
L a a b u n d a n c ia re la t iv a d e l p ic o p r in c ip a l d e R P - H P L C y, p o r lo tan to, la a b u n d a n c ia re la t iv a d e p é p tid o c o rre c ta m e n te p le g a d o p o d ría m e jo r a r s e h a c ie n d o s u s t itu c io n e s e n v a r ia s p o s ic io n e s d e la P ro to x in a -II. L a m u ta c ió n d e T r p 7 o T r p 30 m e jo ró e l p le g a m ie n to d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II re s u lta n te . L a m u ta c ió n d e ta n to T r p 7 c o m o T r p 30 e n c o m b in a c ió n m e jo ró a ú n m á s e l p le g a m ie n to d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II re s u lta n te y p o d r ía r e s c a t a r el p le g a d o d e v a r ia n t e s d e P ro to x in a -II d if íc ile s d e re p le g a r .
L a p ro d u c c ió n d e p é p tid o s m u ta n te s c o m b in a to r io s q u e t ie n e n u n a o m á s s u s t itu c io n e s q u e m e jo ra ro n la s e le c t iv id a d ( G ln 3 , S e r 1 1 , G l u 1 2 , L y s 1 4 , G lu 1 7 , G l y 18 y L e u 2 9 ) a s í c o m o m u t a c io n e s e n T r p 7 y T r p 30 d ie ro n c o m o re s u lta d o p é p tid o s c o n s e le c t iv id a d m e jo ra d a y p r o p ie d a d e s d e re p le g a m ie n to m e jo r a d a s . L a P ro to x in a -II p e r te n e c e a u n a fa m ilia 3 d e p é p tid o s d e n u d o s d e c is t e ín a in h ib id o re s (K lin t et. A l., T o x ic o n 6 0 :4 7 8 - 4 9 1 , 2012 ) . T r p 7 s e c o n s e r v a en to d o s lo s m ie m b ro s d e la f a m ilia 3 , y la s s u s t itu c io n e s e n e s t a p o s ic ió n , a s í c o m o e n T r p 5 y M et6 en J in g z h a o t o x in a -V , otro p é p tid o d e n u d o d e c is t e ín a in h ib id o r d e la fa m ilia 3 , d ie ro n c o m o re s u lta d o u n a p é r d id a d e p o te n c ia , lo q u e in d ic a q u e lo s r e s id u o s h id ró fo b o s e n la s p o s ic io n e s 5 , 6 y 7 e n J in g z h a o t o x in a -V s o n e s e n c ia le s p a ra la p o te n c ia in h ib id o ra d e J in g z h a o t o x in a -V N a v 1 . 7 ( P u b lic a c ió n d e P a te n te In te r n a c io n a l N ° 2 0 1 4 / 1 6 5 2 7 7 ). T r p 5 /M e t6 /T r p 7 ta m b ié n s e c o n s e r v a en la P ro to x in a -II, y, p o r lo tan to, fu e in e s p e r a d o q u e s e p u d ie s e n r e a liz a r s u s t itu c io n e s p o la r e s e n T r p 7 s in p é r d id a d e a c t iv id a d d e P ro to x in a -II c o n p r o p ie d a d e s d e re p le g a m ie n to s ig n if ic a t iv a m e n t e m e jo r a d a s . S e d e m o s tró q u e la s s u s t itu c io n e s e n T r p 30 m e jo ra n s im u lt á n e a m e n t e la s e le c t iv id a d d e N a v 1 . 7 y la s p r o p ie d a d e s d e re p le g a m ie n to d e l p é p tid o v a r ia n t e y fu e ro n in e s p e r a d a s y a q u e la s s u s t itu c io n e s v e n t a jo s a s in d iv id u a le s t íp ic a m e n t e s o lo m e jo ra n un ú n ic o p a rá m e tro .
L a T a b la 13 m u e s tra la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e la s v a r ia n t e s d e P ro to x in a -II g e n e r a d a s s e le c c io n a d a s .
Tabla 14.
Figure imgf000063_0001
(continuación)
Figure imgf000064_0001
Las variantes seleccionadas se caracterizan por su inhibición de Nav1.7 usando i FLIPR Tetra o Qpatch como se describe en el Ejemplo 3. La Tabla 15 muestra los valores de IC50 obtenidos. Para algunas variantes, sólo se registró el % de inhibición (% blk; porcentaje de bloqueo de control) a una concentración única (10 nM o 30 nM) para Qpatch.
Tabla 15.
Figure imgf000064_0002
continuación
Figure imgf000065_0002
Se probaron variantes seleccionadas frente a varios canales de Nav1.x humanos. La Tabla 16 muestra los resultados de esos experimentos. Los valores de IC50 para cada canal se midieron usando QPatch.
Tabla 16.
Figure imgf000065_0001
continuación
Figure imgf000066_0001
Las variantes de la Protoxina-II se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1, o se sintetizaron mediante métodos estándar de síntesis en fase sólida. Los rendimientos de los péptidos recombinantes o sintéticos se compararon con los rendimientos de la Protoxina-II de tipo salvaje. La Tabla 17 muestra que los rendimientos de las variantes de Protoxina-II seleccionadas fueron significativamente más altos que los de la Protoxina-II, lo que indica propiedades de plegamiento mejoradas de las variantes. La escala de la síntesis en fase sólida fue de 0,1 mmol.
Tabla 17.
Figure imgf000066_0002
Ejemplo 7. Las variantes de la Protoxina II son eficaces en modelos in vivo de dolor después de la administración intratecal
Se evaluó la eficacia de variantes de Protoxina-II seleccionadas para reducir el dolor después de la administración intratecal.
En los estudios se usaron los péptidos NV1D2775-OH, NV1D3034 y 63955918. Se usaron modelos animales que miden el dolor térmico agudo (movimiento de la cola y placa calefactora) y el dolor inducido por lesiones (estremecimiento con formalina).
Prueba de movimiento de cola: Los animales se colocaron en un dispositivo de movimiento de la cola (Ugo Basile). El dispositivo tiene un área de calentamiento de luz infrarroja focal (diámetro-5 mm). La cola (distancia entre 1/3-1/2 del extremo distal) del animal se colocó en el área de calentamiento focal. La temperatura de la fuente de calor se ajustó para provocar un movimiento de la cola en el plazo de 10 segundos en los animales tratados con vehículo. Se usó un tiempo de corte de 15 segundos para prevenir el daño tisular, como es estándar en la bibliografía. El tiempo transcurrido entre el inicio del estímulo de calor y cualquier respuesta de evitación se midió automáticamente y se registró para los grupos de prueba.
Prueba de placa calefactora: Los animales se colocaron en una placa de metal de 10" x 10" rodeada por 4 paredes de plexiglás (15 pulgadas de alto). La placa se mantuvo a una temperatura de 52,5°C. Se midió la latencia de respuesta (tiempo en que el animal se estremece o se lame por primera vez la pata trasera, salta o vocaliza) y se retira al animal de la placa. Los animales que no mostraron respuesta se retiraron de la placa después de 30 s para evitar cualquier posible daño tisular.
Estremecimiento con formalina: Se midió el comportamiento de dolor inducido por formalina (es decir, e s t r e m e c im ie n t o s d e la s p a ta s ) u s a n d o un d is p o s it iv o d e m e d ic ió n d e " r e s p u e s t a d e e s t re m e c im ie n to " a u to m a t iz a d o fa b r ic a d o p o r U C S D . E l d is p o s it iv o d e te c ta c u a lq u ie r m o v im ie n to re p e n tin o d e u n a b a n d a d e m e ta l p e g a d a a u n a p a ta t r a s e r a d e l a n im a l u s a n d o un s e n s o r d e m o v im ie n to in s ta la d o p o r d e b a jo d e l s u e lo d e l d is p o s it iv o . D e m e d ia h o ra a u n a h o ra a n t e s d e la in y e c c ió n d e fo rm a lin a , s e u n ió u n a p e q u e ñ a b a n d a d e m e ta l a la s u p e r f ic ie p la n ta r d e u n a p a ta t r a s e r a u s a n d o u n a p e q u e ñ a g o ta d e c ia n o a c r ila t o y s e c o lo c ó a l a n im a l e n la c á m a r a d e p r u e b a p a ra a c lim a ta r lo . S e in y e c tó fo rm a lin a ( 2 , 5 % , 50 j l ) p o r v ía s u b c u t á n e a e n e l d o rs o d e la p a ta co n la b a n d a d e m e ta l. E l a n im a l s e c o lo c ó e n e l c ilin d ro p e r s o n a liz a d o ( 25 x 10 x 20 cm , S a n D ie g o In s tru m e n t) in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la in y e c c ió n d e fo rm a lin a in tra p la n ta r. L o s e s t r e m e c im ie n t o s d e la s p a t a s s e re g is tra ro n a u to m á t ic a m e n te .
E n lo s m o d e lo s d e d o lo r té rm ic o a g u d o , la v a r ia n t e d e P ro to x in a II 63955918 p ro d u jo u n a a n a lg e s ia p o te n te y p r o lo n g a d a c o m o lo in d ic a la la t e n c ia e le v a d a en la p r u e b a d e m o v im ie n to d e la c o la ( F ig u r a 1 1 A y F ig u r a 11 B ) y la p r u e b a d e p la c a c a le fa c t o r a ( F ig u r a 11 C , F ig u r a 11 D ) d e s p u é s d e u n a ú n ic a a d m in is t r a c ió n in tra te c a l. L a im p o rta n c ia y la d u ra c ió n d e la a n a lg e s ia d e p e n d ie ro n d e la d o s is .
L a in y e c c ió n d e fo rm a lin a e n la s p a t a s t r a s e r a s e s un m o d e lo u s a d o c o m ú n m e n te p a ra el d o lo r in d u c id o po r le s io n e s . L a in y e c c ió n in d u c e un c o m p o rta m ie n to d e e s t r e m e c im ie n to b ifá s ic o c a r a c t e r ís t ic o , q u e in d ic a d o lo r e n lo s a n im a le s d e p ru e b a . C o m o s e m u e s tra en la F ig u r a 11 E , lo s a n im a le s t ra ta d o s p r e v ia m e n te c o n in y e c c ió n in tra te c a l d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II 63955918 d e m o s tra ro n m e n o s e s t r e m e c im ie n t o s e n la p r u e b a d e fo rm a lin a , lo q u e s u g ie r e u n a in h ib ic ió n d e l d o lo r in d u c id o p o r la le s ió n .
D e m a n e r a s im ila r , lo s p é p tid o s N V 1 D 2775 - O H y N V 1 D 3034 d e m o s tra ro n u n a e f ic a c ia s ig n if ic a t iv a en la p r u e b a d e m o v im ie n to d e la c o la , p la c a c a le fa c t o r a y fo rm a lin a ( F ig u r a 12 A , F ig u r a 12 B , F ig u r a 12 C , F ig u r a 12 D , F ig u r a 12 E , F ig u r a 13 A , F ig u r a 13 B , F ig u r a 13 C , F ig u r a 13 D , F ig u r a 13 E ) t r a s u n a ú n ic a a d m in is t r a c ió n in tra te c a l.
Ejemplo 8. Caracterización de variantes adicionales de Protoxina-II
S e d is e ñ a r o n y e x p r e s a r o n v a r ia n t e s d e P ro to x in a -II a d ic io n a le s u s a n d o la s e s t r a t e g ia s y m é to d o s d e s c r it o s e n e l E je m p lo 6, y s e c a r a c t e r iz a r o n e n F L P R T e t r a y /o Q p a tc h d e a c u e r d o c o n lo s p ro to c o lo s d e s c r it o s en el E je m p lo 3.
L a T a b la 18 m u e s tra la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s v a r ia n t e s d e P ro to x in a -II g e n e r a d a s s e le c c io n a d a s .
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
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Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
L a s v a r ia n t e s s e le c c io n a d a s s e c a r a c t e r iz a n p o r s u in h ib ic ió n d e N a v 1.7 u s a n d o F L I P R T e t r a o Q p a tc h c o m o s e d e s c r ib e e n el E je m p lo 3. L a T a b la 19 m u e s tra lo s v a lo r e s d e I C 50 o b te n id o s . P a r a a lg u n a s v a r ia n t e s , s o lo s e re g is tró el % d e in h ib ic ió n ( % blk; p o rc e n ta je d e b lo q u e o d e co n tro l) a u n a ú n ic a c o n c e n t ra c ió n ( 10 nM o 30 nM ) p a ra Q p a tc h . s e ; E r r o r e s tá n d a r .
T a b la 19.
Figure imgf000088_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000089_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000090_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000091_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000092_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000093_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000094_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000095_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000096_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000097_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000098_0001
Ejemplo 9. Generación de variantes de 63955918
La variante de Protoxina-II 63955918 tiene sustituciones W7Q y W30L en comparación con la Protoxina-II de tipo salvaje. Como se describe en el Ejemplo 6, la mutación de tanto Trp7 como Trp30 solas o en combinación mejora el plegamiento de las variantes de Protoxina-II resultantes y podría rescatar el plegamiento de variantes de Protoxina-II difíciles de replegar.
Se generaron variantes adicionales en la estructura principal de 63955918 para evaluar la posibilidad de mejorar adicionalmente las características de la molécula. Algunas variantes también se describen en los Ejemplos 6 y 7.
Las variantes generadas y sus secuencias se muestran en la Tabla 20.
Tabla 20.
Figure imgf000099_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000100_0001
L a s v a r ia n t e s s e c a r a c t e r iz a r o n c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te . L a T a b la 21 m u e s tra lo s v a lo r e s d e I C 50 y /o b lo q u e d e p o rc e n ta je ( % b lk) ( % d e in h ib ic ió n d e la s c o rr ie n te s e n c o m p a r a c ió n c o n u n a m u e s tra d e co ntro l). S e : e rro r e s tá n d a r .
T a b la 21.
Figure imgf000100_0002
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000101_0001
Ejemplo 10. Generación de variantes de 63955918
S e d is e ñ a r o n v a r ia n t e s a d ic io n a le s d e 63955918 p a ra m e jo r a r la b io d is tr ib u c ió n d e lo s p é p tid o s re s u lta n te s .
L a s s u s t itu c io n e s W 7 y W 30 ta m b ié n s e d is e ñ a r o n e n u n a v a r ie d a d d e p é p tid o s d e n u d o d e c is t e ín a in h ib id o re s d e la fa m ilia 3 p a ra e v a lu a r s i la s e le c t iv id a d m e jo ra d a y la s p r o p ie d a d e s m e jo r a d a s d e re p le g a m ie n to c o n fe r id a s p o r e s a s m u t a c io n e s s e e x te n d ía n m á s a llá d e la P ro to x in a -II a o tra s s e c u e n c ia s d e p é p tid o s a lta m e n te h o m ó lo g a s . S e e lig ie ro n t o x in a s d e a r a ñ a d e la fa m ilia 3 q u e in h ib e n lo s c a n a le s N a v ( N a S p T x ) s e g ú n la d e fin ic ió n d e K lin t et. A l. (T o x ic o n 60 :478 -491, 2012 ) , c o m o a n d a m ia je s p a ra la in c o r p o ra c ió n d e Q e n la p o s ic ió n 7 y L e n la p o s ic ió n 30 ( n u m e r a c ió n b a s a d a e n la S e q ID 1) , e in c lu y e n ) . E s t a s s e c u e n c ia s in c lu y e n b e t a -te r a p e o t o x in a -G r lc , b e t a -te r a p e o t o x in a -G r le , b e t a /k a p p a -t e r a p e o t o x in a -C g 2 a , k a p p a -t e r a p e o t o x in a -P s Ia , k a p p a -t e r a p e o to x in a -P s Ib , k a p p a -t e r a p e o t o x in a -G r 2 b , k a p p a -t e r a p e u t a o t o x in a -G r 2 c , k a p p a -t e r a p o t o x in a -G r 2 c , k a p p a -t e r a p o t o x in a -G r 2 d , k k a p p a -t e r a p o t o x in a -C g 2 a , k a p p a -t e r a p o t o x in a -C g 2 b , k a p p a -t e r a p o t o x in a -E c 2 c , b e ta - t e r a p e o t o x in a -G r ld , b e t a /k a p p a -t e r a p e o t o x in a -P m 21, k a p p a -t e r a p e o t o x in a -E c 2 a y k a p p a -t e r a p e o t o x in a -E c 2 b .
S e id e n t if ic a ro n a n d a m ia je s a d ic io n a le s d e la f a m ilia 3 N a S p T x p a ra la m u ta c ió n en A r a c h n o s e r v e r ( h ttp ://w w w .a r a c h n o s e r v e r _ o r g /_ m a in M e n u htm ll. L a a lin e a c ió n d e la s t o x in a s d e la fa m ilia 3 s e m u e s tra e n F I G . 14.
L a T a b la 22 m u e s tra la s s e c u e n c ia s d e la s v a r ia n t e s d is e ñ a d a s .
Figure imgf000103_0001
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Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. U n a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a is la d a q u e in h ib e la a c t iv id a d d e N a v 1.7 h u m a n o , q u e c o m p re n d e :
u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s Y C Q K W M Q T C D S E R K C C E G M V C R L W C K K K L L - C O O H ( S E Q ID N O : 425 ) , en d o n d e e l re s id u o Y 1, S 11, E 12 , K 14 , E 17 , G 18 , M 19 , y /o L 29 s e s u s t itu y e co n un a m in o á c id o no n a tu ra l, en d o n d e la n u m e r a c ió n d e r e s id u o s e s d e a c u e r d o co n la S E Q ID N O : 1,
e n d o n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s t ie n e u n a I C 50 p a ra la a c t iv id a d d e N a v 1.7 h u m a n o d e a p ro x im a d a m e n t e 30 x 10 -9 o m e n o s , e n d o n d e e l v a lo r d e I C 50 s e m id e u s a n d o un e n s a y o d e d e s p o la r iz a c ió n d e m e m b ra n a u s a n d o t r a n s f e r e n c ia d e e n e r g ía d e r e s o n a n c ia d e f lu o r e s c e n c ia ( F E T ) e n p r e s e n c ia d e 25 x 10 -6 M de v e r a t r o ilv e r a c e v in a e n c é lu la s H E K 293 q u e e x p r e s a n d e m a n e r a e s t a b le N a v 1.7 h u m a n o y u s a n d o b is -( á c id o 1, 3 -d ie t ilt io b a rb itú ric o ) trim e tin o o x o n o l c o m o un a c e p to r d e e le c t r o n e s y 8 -o c t a d e c ilo x ip ir e n o -1,3 ,6 -t r is u lf o n a t o tr is ó d ic o c o m o un d o n a n te e x c ita n d o e l d o n a n te a 390 -420 n m y m id ie n d o F R E T a 515 - 575 nm .
2. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II d e la r e iv in d ic a c ió n 1, q u e c o m p re n d e p o r lo m e n o s u n a d e ( 1 ) u n a e x te n s ió n N -te rm in a l q u e c o m p r e n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s S E Q ID N O : 372 , 373 , 374 , 375 , 376 , 377 , 378 , 379 , 380 , 381, 382 , 383 , 384 o 385 ; y (2 ) u n a e x te n s ió n C -t e r m in a l q u e c o m p r e n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s S E Q ID N O : 374 , 386 , 387 , 388 , 389 , 390 , 391, 392 , 393 , 394 , 395 , 396 o 397.
3. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II d e la re iv in d ic a c ió n 2 , e n d o n d e la e x te n s ió n N -te rm in a l y /o la e x te n s ió n C -t e r m in a l s e c o n ju g a c o n la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a t r a v é s d e un c o n e cto r.
4. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II d e la r e iv in d ic a c ió n 3, en d o n d e e l c o n e c to r c o m p r e n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s S E Q ID N O : 383 , 392 , 398 , 399 , 400 o 402.
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6 . L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a is la d a d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 5 , e n d o n d e la v a r ia n t e t ie n e un g ru p o á c id o c a r b o x ílic o , a m id a , m e t ila m id a o b u t ila m id a C -t e r m in a l.
7. U n a p ro te ín a d e fu s ió n a is la d a q u e c o m p r e n d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 6 c o n ju g a d a c o n u n a fra c c ió n d e e x te n s ió n d e la v id a m e d ia .
8. L a p ro te ín a d e fu s ió n a is la d a d e la r e iv in d ic a c ió n 7 , e n d o n d e la fra c c ió n d e e x te n s ió n d e la v id a m e d ia e s a lb ú m in a d e s u e r o h u m a n a ( H S A ) , d o m in io d e u n ió n a a lb ú m in a ( A B D ) , F c o p o lie t ile n g lic o l ( P E G ) .
9. U n p o lin u c le ó tid o a is la d o q u e c o d if ic a la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 6 o la p r o te ín a d e fu s ió n d e la r e iv in d ic a c ió n 7 u 8.
10. U n v e c t o r q u e c o m p re n d e e l p o lin u c le ó tid o a is la d o d e la r e iv in d ic a c ió n 9.
11. U n a c é lu la h u é s p e d q u e c o m p re n d e e l v e c t o r d e la re iv in d ic a c ió n 10.
12. U n m é to d o p a r a p r o d u c ir la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a is la d a d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 6 o la p r o te ín a d e fu s ió n d e la r e iv in d ic a c ió n 7 u 8, q u e c o m p re n d e c u lt iv a r la c é lu la h u é s p e d d e la re iv in d ic a c ió n 11 y r e c u p e r a r la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II p r o d u c id a p o r la c é lu la h u é s p e d .
13. U n a c o m p o s ic ió n f a r m a c é u t ic a q u e c o m p re n d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a is la d a d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 6 o la p ro te ín a d e fu s ió n d e la re iv in d ic a c ió n 7 u 8 y un e x c ip ie n te fa r m a c é u t ic a m e n t e a c e p ta b le .
14. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 6 o la p ro te ín a d e fu s ió n d e la r e iv in d ic a c ió n 7 u 8, p a ra s u u s o en un m é to d o p a ra tra ta r e l d o lo r m e d ia d o p o r N a v 1.7 e n un s u je to , q u e c o m p r e n d e a d m in is t r a r a un s u je to c o n n e c e s id a d d e e llo u n a c a n t id a d e f ic a z d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II o la p ro te ín a d e fu s ió n p a r a tra ta r el d olor.
15. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II p a ra s u u s o d e a c u e r d o co n la r e iv in d ic a c ió n 14 , en d o n d e e l d o lo r e s d o lo r c ró n ico , d o lo r a g u d o , d o lo r n e u ro p á t ic o , d o lo r n o c ic e p tiv o , d o lo r v is c e r a l, d o lo r d e e s p a ld a , d o lo r p o s o p e ra to r io , d o lo r té rm ic o , d o lo r d e l m ie m b ro f a n ta s m a o d o lo r a s o c ia d o co n a f e c c io n e s in f la m a to ria s , e r it e m a lg ia p r im a r ia ( E P ) , t ra sto rn o d e d o lo r e x tre m o p a r a o x ís t ic o ( P E P D ) , o s te o a rtr it is , artrit is re u m a to id e , d is c e c t o m ía lu m b a r, p a n c re a t it is , f ib ro m ia lg ia , n e u r o p a t ía d ia b é t ic a d o lo r o s a ( P D N ) , n e u ro p a t ía p o s h e r p é t ic a ( P H N ) , n e u r a lg ia d e l t r ig é m in o (N T ), le s io n e s d e la m é d u la e s p in a l o e s c le r o s is m ú ltip le .
16. L a v a r ia n t e d e P
s e a d m in is t r a p e r ifé r
17. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II p a ra s u u s o d e a c u e r d o co n la re iv in d ic a c ió n 16 , a d m in is t r a d a lo c a lm e n te a u n a a rt ic u la c ió n , m é d u la e s p in a l, h e r id a q u ir ú rg ic a , s ito s d e le s ió n o tra u m a , f ib ra s n e r v io s a s p e r ifé r ic a s , ó r g a n o s u r o g e n ita le s , o te jid o s in fla m a d o s .
18. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 6 o la p ro te ín a d e fu s ió n d e la r e iv in d ic a c ió n 7 u 8, p a ra s u u s o e n e l tra ta m ie n to d e l d o lo r e n un s u je to co n n e c e s id a d d e e llo .
19. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II p a ra s u u s o d e a c u e r d o co n la r e iv in d ic a c ió n 18 , en d o n d e e l d o lo r e s d o lo r c ró n ico , d o lo r a g u d o , d o lo r n e u ro p á t ic o , d o lo r n o c ic e p tiv o , d o lo r v is c e r a l, d o lo r d e e s p a ld a , d o lo r p o s o p e ra to r io , d o lo r té rm ic o , d o lo r d e l m ie m b ro f a n ta s m a o d o lo r a s o c ia d o co n a f e c c io n e s in f la m a to ria s , e r it e m a lg ia p r im a r ia ( E P ) , t ra sto rn o d e d o lo r e x tre m o p a r a o x ís t ic o ( P E P D ) , o s te o a rtr it is , artrit is re u m a to id e , d is c e c t o m ía lu m b a r, p a n c re a t it is , f ib ro m ia lg ia , n e u r o p a t ía d ia b é t ic a d o lo r o s a ( P D N ) , n e u ro p a t ía p o s h e r p é t ic a ( P H N ) , n e u r a lg ia d e l t r ig é m in o (N T ), le s io n e s d e la m é d u la e s p in a l o e s c le r o s is m ú ltip le .
20. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II p a ra s u u s o d e a c u e r d o c o n la re iv in d ic a c ió n 18 o 19 , e n d o n d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II s e a d m in is t r a p e r ifé r ic a m e n te .
21. L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II p a ra s u u s o d e a c u e r d o co n la r e iv in d ic a c ió n 20 , e n d o n d e la v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a d m in is t r a d a lo c a lm e n te a u n a a rt ic u la c ió n , m é d u la e s p in a l, h e r id a q u ir ú rg ic a , s ito s d e le s ió n o tra u m a , f ib ra s n e r v io s a s p e r ifé r ic a s , ó r g a n o s u r o g e n ita le s , o t e jid o s in fla m a d o s .
22. U n a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a is la d a q u e c o m p re n d e p o r lo m e n o s u n a d e la s S E Q ID N O : 664 , 665 , 666 , 668 , 669 , 670 , 671, 674 , 676 , 677 , 678 , 683 , 685 , 688 , 689 , 690 , 691, 692 , 695 , 696 , 709 , 712 , 713 , 714 , 715 , 716 , 717 , 718 , 719 , 720 , 721, 722 , 723 o 732.
23. U n a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a is la d a q u e c o m p re n d e p o r lo m e n o s u n a d e la s S E Q ID N O : 644 , 663 , 667 , 672 , 673 , 680 , 684 , 686 , 687 , 694 , 708 , 710 , 711, 724 , 725 y 726.
24 . L a v a r ia n t e d e P ro to x in a -II a is la d a d e c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 5 , e n d o n d e la v a r ia n t e in h ib e la a c t iv id a d d e N a v 1.7 e n p o r lo m e n o s un 25 % , 30 % , 35 % , 45 % , 50 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 85 % , 90 % , 91 % , 92 % , 9 3 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o 100 % c u a n d o la a c t iv id a d d e N a v 1.7 s e m id e u s a n d o e l e n s a y o Q P a t c h d e a c u e r d o c o n e l p ro to co lo d e s c r ito e n e l E je m p lo 3.
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