JP2018526001A - 新規なインスリンアナログ及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
vitro)効力が増加したインスリンアナログ及びその用途に関する。
一般式(1)
Xaa1は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa2は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa3は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa4は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa6は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa7は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
Xaa8は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであるか、不在であり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である
(ここで、配列番号1のA鎖及び配列番号2のB鎖を含むペプチドは除く)。
本発明に係るインスリンアナログは、配列番号3のA鎖でXaa4がグルタミン酸であり、配列番号4のB鎖でXaa9がフェニルアラニンであるか;
配列番号3のA鎖でXaa4がアスパラギンであり、配列番号4のB鎖でXaa9がフェニルアラニンであるか、
配列番号3のA鎖でXaa4がグルタミン酸であり、配列番号4のB鎖でXaa9が不在であるか、
配列番号3のA鎖でXaa4がアラニンであり、配列番号4のB鎖でXaa8がグルタミン酸であり、Xaa9が不在であることを特徴とするが、これに限定されない。
a)前記インスリンアナログペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階;
b)前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を収得する段階;
c)前記形質転換体を培養して、インスリンアナログペプチドを発現させる段階;
d)発現されたインスリンアナログペプチドを分離及び精製する段階。
Gly‐Ile‐Val‐Glu‐Gln‐Cys‐Cys‐Thr‐Ser‐Ile‐Cys‐Ser‐Leu‐Tyr‐Gln‐Leu‐Glu‐Asn‐Tyr‐Cys‐Asn(配列番号1)
B鎖:
Phe‐Val‐Asn‐Gln‐His‐Leu‐Cys‐Gly‐Ser‐His‐Leu‐Val‐Glu‐Ala‐Leu‐Tyr‐Leu‐Val‐Cys‐Gly‐Glu‐Arg‐Gly‐Phe‐Phe‐Tyr‐Thr‐Pro‐Lys‐Thr(配列番号2)
一般式(1)
Xaa1は、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa2は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa3は、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa4は、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa6は、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa7は、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
Xaa8は、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであるか、不在であり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である。
前記一般式(1)において、
Xaa1は、グリシンであり、
Xaa2は、グルタミンであり、
Xaa3は、セリンであり、
Xaa4は、アラニン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、ロイシンであり、
Xaa6は、チロシンであり、
Xaa7は、アスパラギンであり、
前記一般式(2)において、
Xaa8は、チロシンまたはグルタミン酸であり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに制限されない。
前記一般式(1)において、
Xaa1は、グリシンであり、
Xaa2は、グルタミンであり、
Xaa3は、セリンであり、
Xaa4は、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5は、ロイシンであり、
Xaa6は、チロシンであり、
Xaa7は、アスパラギンであり、
前記一般式(2)において、
Xaa8は、チロシンであり、
Xaa9は、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10は、トレオニンであり、
Xaa11は、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であるインスリンアナログペプチドであってもよいが、これに制限されない。
a)インスリンアナログをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階;
b)前記組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を収得する段階;
c)前記形質転換体を培養して、インスリンアナログを発現させる段階;及び
d)発現されたインスリンアナログを分離及び精製する段階を含む、インスリンアナログの製造方法を提供する。
d‐2)破砕された細胞溶解物から発現されたインスリンアナログペプチドを回収してリフォールディングする段階;
d‐3)リフォールディングされたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する段階;
d‐4)精製されたインスリンアナログペプチドをトリプシン及びカルボキシぺプチダーゼBで処理する段階;
d‐5)処理されたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーで順次的に精製する段階 。
天然型インスリンのA鎖及び/またはB鎖のアミノ酸を変形させたインスリンアナログを作製するために、その変形が導入されたインスリンアナログの増幅のための正方向及び逆方向プライマーペアを合成した後、プロインスリンcDNAを鋳型としてPCRを行った。このとき、鋳型としては、プロインスリンcDNA(SC128255、OriGene)(参照配列:BC005255.1及びAAH05255)がpET22bベクター(Novagen)にクローニングされたものを用い、インスリンの円滑な組換え発現のためにクローニングされたプロインスリンcDNAのN末端に融合パートナー(N-terminal fusion partner)としてMet Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Argのアミノ酸配列(配列番号24)をコードする配列番号23の塩基配列(ATG GCA ACA ACA TCA ACA GCA ACT ACG CGT)を挿入した。
インスリンアナログ2は、配列番号1で表される天然型インスリンのA鎖アミノ酸配列で14番目のアミノ酸であるチロシンのアスパラギンへの置換を含むものであり、
インスリンアナログ3は、配列番号1で表される天然型インスリンのA鎖アミノ酸配列で14番目のアミノ酸であるチロシンのグルタミン酸への置換と配列番号2で表される天然型インスリンのB鎖アミノ酸配列で25番目のアミノ酸であるフェニルアラニンの欠失を含むものである。
T7プロモーターの調節下で、本発明に係るインスリンアナログの組換え発現を下記のように行った。前記実施例1で製造されたそれぞれのインスリンアナログ発現ベクターに大腸菌BL21‐DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3)(Novagen, USA)を形質転換した。形質転換は、前記大腸菌BL21‐DE3のメーカーであるNovagenで推奨する方法に従って行われた。インスリンアナログ発現ベクターが形質転換された個々の単一コロニーをとり、50μg/mlのアンピシリン含有2×LB(Luria Broth、LB)培地に接種した後、37℃で15時間培養した。組換え菌株の培養液と30%グリセロールを含む2xLB培地を1:1(v/v)の割合で混合して、各1mlずつクライオチューブ(cryo-tube)に分注して、-140℃で保管した。これを本発明に係るインスリンアナログの組換え生産のための細胞ストック(cell stock)として用いた。
前記実施例2で形質転換体から発現させた組換えインスリンアナログを分離、精製するために、まず不溶性封入体形態で発現されたインスリンアナログを可溶性形態に変えるため、下記のように細胞を破砕してリフォールディングを行った。
具体的に、細胞ペレット100g(wet weight)を1Lの溶解緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 9.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl及び0.5%トリトンX-100)に再浮遊した後、微細溶液化(microfluidizer)プロセッサーM-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)を用いて15,000psiの圧力を加えて細胞を破砕した。破砕された細胞溶解物を7,000rpmで4℃で20分間遠心分離して上澄液を捨て、3Lの洗浄緩衝液(0.5%トリトンX-100及び50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl、1mM EDTA)に再浮遊した。7,000rpmで4℃で20分間遠心分離してペレットを蒸留水に再浮遊した後、同様の方法で遠心分離した。このことからペレットをとり、400mlの緩衝液(1M グリシン、3.78g システイン-HCl、pH 10.6)に再浮遊した後、常温で1時間攪拌した。再浮遊された遺伝子組換えインスリンアナログを回収するために、400mlの8M尿素を追加した後、40℃で1時間撹拌した。可溶化された組換えインスリンアナログのリフォールディング(refolding)のために7,000rpmで4℃で30分間遠心分離した後、上澄液を取り、ここで7.2Lの蒸留水を連動ポンプ(peristaltic pump)を用いて、1000ml/時間の流速で添加し、4℃で16時間攪拌した。
45%エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)で平衡化された陽イオン交換カラム(Source S、GE Healthcare社)に、前記実施例<3−1>でリフォールディングが終結した試料をローディングして結合させた。続いて塩化カリウム0.5Mと45%エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)を用いて濃度が0%→100%になるように10xカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
前記実施例<3−2>で脱塩カラム(Desalting column)で溶出された試料から塩を除去し、緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 8.0)に交換した。得られた試料のタンパク質の量の1000モル比に該当するトリプシン(trypsin)と2000モル比に該当するカルボペプチダーゼ(carboxypeptidase)Bを添加した後、16℃で16時間攪拌した。1Mクエン酸ナトリウム(pH2.0)を用いてpHを3.5に下げて反応を終結した。
前記実施例<3−3>で反応が終結した試料を45%エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)で平衡化された陽イオン交換カラム(Source S、GE Healthcare社)に再びローディングして結合させた。続いて塩化カリウム0.5Mと45%エタノールを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.0)を用いて濃度が0%→100%になるように10xカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
前記実施例<3−4>で脱塩カラムで溶出された試料から塩を除去し、緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.5)に交換した。これから収得された試料で純粋なインスリンアナログを分離するために、10mMトリス緩衝液(pH7.5)で平衡化された陰イオン交換カラム(Source Q、GE Healthcare社)にローディングして結合させた。続いて、0.5M塩化ナトリウムを含む10mMトリス緩衝液(pH7.5)を用いて濃度が0%→100%になるように10xカラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログのタンパク質をカラムから溶出した。
前記実施例3で分離、精製されたインスリンアナログのインビトロ効力を測定するために、脂肪細胞に分化させたマウス由来の3T3‐L1細胞株を用いたグルコース吸収能(glucose uptake、または脂質合成能)試験を実施した。3T3‐L1細胞株(ATCC、CL-173)を10%NBCS(新生仔牛血清)を含むDMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium、Gibco、Cat.No、12430)培地を用いて、週2〜3回継代培養し維持した。3T3‐L1細胞株を分化用培地(10%FBSを含むDMEM)に懸濁した後、48ウェルプレートにウェル当たり5×104細胞となるように接種した後、37℃で48時間培養した。脂肪細胞への分化のために分化用培地に1μg/mlのヒトインスリン(Sigma, Cat. No. I9278)、0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879)、1μMデキサメタゾン(Dexamethasone、Sigma, Cat. No. D4902)を混合し、既存の培地を除去した後、ウェル当たり250μlずつ添加した。48時間後、分化用培地に1μg/mlのヒトインスリンのみを添加した培地に再度交換した。以後、48時間ごとに1μg/mlのヒトインスリンを添加した分化用培地に交換しながら7〜9日間、脂肪細胞への分化が誘導されることを確認した。
Claims (21)
- 下記一般式(1)で表される配列番号3のA鎖と下記一般式(2)で表される配列番号4のB鎖を含むインスリンアナログペプチド:
一般式(1)
Xaa1が、アラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa2が、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa3が、アラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa4が、アラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり、
Xaa5が、アラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギンであり、
Xaa6が、アラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジンまたはアスパラギンであり、
Xaa7が、アスパラギン、グリシン、ヒスチジンまたはアラニンである。
一般式(2)
Xaa8が、チロシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在であり、
Xaa9が、フェニルアラニンであるか、不在であり、
Xaa10が、トレオニンであるか、不在であり、
Xaa11が、プロリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸であるか、不在である
(ここで、配列番号1のA鎖及び配列番号2のB鎖を含むペプチドは除く)。 - 前記配列番号4のB鎖において、Xaa8がチロシンであり、Xaa9が不在であり、Xaa10がトレオニンである、請求項1に記載のインスリンアナログペプチド。
- 前記配列番号4のB鎖において、Xaa8がチロシンであり、Xaa9がフェニルアラニンであり、Xaa10が不在である、請求項1に記載のインスリンアナログペプチド。
- 前記配列番号3のA鎖において、Xaa1がグリシンであり、Xaa2がグルタミンであり、Xaa3がセリンであり、Xaa4がグルタミン酸であり、Xaa5がロイシンであり、Xaa6がチロシンであり、Xaa7がアスパラギンであり、
前記配列番号4のB鎖において、Xaa8がチロシンであり、Xaa9がフェニルアラニンであり、Xaa10がトレオニンであり、Xaa11がプロリンである、請求項1に記載のインスリンアナログペプチド。 - 前記ペプチドが、配列番号16で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項4に記載のインスリンアナログペプチド。
- 前記配列番号3のA鎖において、Xaa1がグリシンであり、Xaa2がグルタミンであり、Xaa3がセリンであり、Xaa4がアスパラギンであり、Xaa5がロイシンであり、Xaa6がチロシンであり、Xaa7がアスパラギンであり、
前記配列番号4のB鎖において、Xaa8がチロシンであり、Xaa9がフェニルアラニンであり、Xaa10がトレオニンであり、Xaa11がプロリンである、請求項1に記載のインスリンアナログペプチド。 - 前記ペプチドが、配列番号18で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項6に記載のインスリンアナログペプチド。
- 前記配列番号3のA鎖において、Xaa1がグリシンであり、Xaa2がグルタミンであり、Xaa3がセリンであり、Xaa4がグルタミン酸であり、Xaa5がロイシンであり、Xaa6がチロシンであり、Xaa7がアスパラギンであり、
前記配列番号4のB鎖において、Xaa8がチロシンであり、Xaa9が不在であり、Xaa10がトレオニンであり、Xaa11がプロリンである、請求項1に記載のインスリンアナログペプチド。 - 前記ペプチドが、配列番号20で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項8に記載のインスリンアナログペプチド。
- 前記配列番号3のA鎖において、Xaa1がグリシンであり、Xaa2がグルタミンであり、Xaa3がセリンであり、Xaa4がアラニンであり、Xaa5がロイシンであり、Xaa6がチロシンであり、Xaa7がアスパラギンであり、
前記配列番号4のB鎖において、Xaa8がグルタミン酸であり、Xaa9が不在であり、Xaa10がトレオニンであり、Xaa11がプロリンである、請求項1に記載のインスリンアナログペプチド。 - 前記ペプチドが、配列番号22で記載されるアミノ酸配列を含むものである、請求項10に記載のインスリンアナログペプチド。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のインスリンアナログペプチドをコードする、核酸。
- 前記核酸が、配列番号15、17、19及び21からなる群から選択される塩基配列を有するものである、請求項12に記載の核酸。
- 請求項12に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項14に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、形質転換体。
- 前記形質転換体が、大腸菌である、請求項15に記載の形質転換体。
- 下記段階を含む請求項1に記載のインスリンアナログペプチドを製造する方法:
a)請求項1に記載のインスリンアナログペプチドをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを製造する段階;
b)前記組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を収得する段階;
c)前記形質転換体を培養してインスリンアナログペプチドを発現させる段階;及び
d)発現されたインスリンアナログペプチドを分離及び精製する段階。 - 前記核酸が、配列番号15、17、19及び21からなる群から選択される塩基配列を有するものである、請求項17に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、大腸菌である、請求項17に記載の方法。
- 前記分離及び精製が、
d‐1)培養液から形質転換体細胞を収穫して破砕する段階;
d‐2)破砕された細胞溶解物から前記発現されたインスリンアナログペプチドを回収してリフォールディングする段階;
d‐3)リフォールディングされたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する段階;
d‐4)精製されたインスリンアナログペプチドをトリプシン及びカルボキシぺプチダーゼBで処理する段階;及び
d‐5)処理されたインスリンアナログペプチドを陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーで順次的に精製する段階を含むものである、請求項17に記載の方法。 - 有効成分として請求項1〜11のいずれか一項に記載のインスリンアナログペプチドと、薬剤学的に許容可能な担体を含む、糖尿病治療用薬学的組成物。
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