KR890003715B1

KR890003715B1 - 신규한 플라스미드 제조방법 및 그를 함유한 균주를 배양하여 인터루킨-2 또는 변이 인터루킨-2를 생산하는 방법

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Publication number: KR890003715B1
Application number: KR1019870006560A
Authority: KR
Inventors: 한문희; 정태화; 나도선; 김지영; 강성만; 김성완; 하현정
Original assignee: 한국과학 기술원; 이정오
Priority date: 1987-06-27
Filing date: 1987-06-27
Publication date: 1989-09-30
Also published as: KR890000662A

Abstract

내용 없음.

Description

신규한 플라스미드 제조방법 및 그를 함유한 균주를 배양하여 인터루킨-2 또는 변이 인터루킨-2를 생산하는 방법

제1도는 인터루킨-2 폴리펩타이드를 코드하는 유전자의 염기서열 및 이를 해석한 아미노산서열.

제2도는 코드화된 이터루킨-2 유전자가 삽입된 재조합체 DNA(pIL7)의 제조과정을 보여주는 계통도.

제3도는 인터루킨-2를 코드하는 유전자가 클론된 재조합 플라스미드 pIL7의 제한효소 지도.

제4도는 인터루킨-2 발현벡터인 pNK1의 제조과정을 보여주는 계통도.

제5도는 인터루킨-2 발현벡터인 pNK2의 제조과정을 보여주는 계통도.

제6도는 인터루킨-2를 E. coli에서 발현하는 재조합체 DNA(pNK1, pNK2)의 유전자 지도.

제7도는 플라스미드 pNK2를 이요하여 인터루킨-2를 생산한 다음 SDS-PAGE 젤로 확인한 전기영동사진.

제8도는 인터루킨-2 유전자를 tac 프로모터 하에서 발현시키는 재조합체 DNA(pNK3)의 제조과정을 보여주는 계통도.

제9도는 pNK3의 유전자 지도.

제10도는 인터루킨-2 펩타이드의 아미노산서열 125위치의 시스테인을 알라니으로 치환하기 위하여 유전자를 변화시킨 실시도.

제11도는 돌연변이가 일어난 인터루킨-2 발현벡터인 pNKM21의 제조과정을 보여주는 계통도.

인터루킨-2는 헬퍼(helper) T-임파구(T-lymphocyte)가 항원에 의하여 활성화될 때 분비되는 림포카인(lymphokine)이며, 특이 항원과 반응하는 리셉터(receptor)를 가진 임파구를 증식시키는 작용을 한다. 인터루킨-2는 면역조절제(immunomodulator)로서 면역 반응계의 여러반응에 대한 활성을 나타낸다. 즉, 임파구 세포를 시험관에서 장기 배양시킬 수 있는 활성을 나타내며(Morgan, D.A., Ruscetti, F.W., and Gallo, R.(1976) Science, 193, 1007), NK-세포(natural killer cell)의 증식인자로 작용하며, T-세포에서 감마 인터페론의 생산을 유도함으로써 NK-세포와 대식세포(macrophage)를 포함하는 여러가지 세포에 영향을 미치며, 항체(antibody)를 생산하는 B-새포에 직접 또는 간접으로 촉진 작용을 한다. (Robb, R.j.(1984) Imunol. Today, 5, 203-209). 또한, 불활성인 임파구 세포를 LAK 세포(lymphokine activated killer cell)로 유도하는 작용을 하는데 이 LAK 세포는 NK 세포에 저항성이 있는 여러가지 종양세포(tumor cell)를 용해(lyse)시키는 활성이 있으므로 암치료에 이용될 가능성이 있다. (Smith, K.A. (1984) Ann. Rev. Innum., 2, 319-333). 로젠버그 그룹(Rosenberg group)에서는 LAK 세포와 인터루킨-2를사용하여 암환자의 치료를 시도한 결과 상당한 치료효과를 관찰하였다고 보고하였다. (Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Eugl. J. Med., 313, 1985).

이와 같이 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 하는 인터루킨-2 폴리펩타이드를 사람의 혈액이나 세포라인에서 추출할 경우 매우 소량밖에 얻을 수 없으며 또한 생산비가 많이 든다. 그러므로 여러가지 단백질의 제조에 사용된 유전자 재조합 기술에 의하여 인터루킨-2를 생산히는 방법이 여러 학자들에 의하여 시도되었다. 다니구찌(Taniguchi)등은 인터루킨-2를 코드하는 재조합 유전자를 배양 원숭이 세포인 COS세포에 도입하는 방법을 사용하였으며, 데보스(Devos)등은 인터루킨-2 유전자를 대장균에 도입하여 인터루킨-2를 생산하였다(Taniguchi, T., et al. (1983) Nature, 302, 305) (Devos, R., et al. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 4307).

본 발명은 인터루킨-2 유전자를 제조하는 매우 편리한 방법을 발명하여 이렇게 제조된 유전자를 이용하여 인터루킨-2의 생산 수율이 높은 발현벡터를 제조하는 방법을 발명하였다. 또한, 천연의 인터루킨-2를 코드하는 유전자를 사용할 경우의 결점을 극복하기 위하여 인터루킨-2를 변이 단백질로 만드는 방법을 발명하였다. 어떤 단백질의 유전자를 제조하기 위하여는 먼저 목적하는 단백질을 생산하는 세포로 부터 mRNA를 제조한다. 이 mRNA로 부터 cDNA를 만들고 이것을 유전자 운반체인 벡터에 재조합한 다음 미생물에 도입하여 여러종류의 cDNA를 가진 미생물의 집합인 cDNA 라이브러리(library)를 만들고 이 중에서 목적하는 단백질을 코드하는 cDNA를 가진 클론(clone)을 선별하는 방법이 흔히 사용된다. 다니구찌등과 데보스등도 이 방법을 사용하여 인터루킨-2 cDNA를 클론하였다. 본 발명에서는 mRAN로 부터 cDNA를 제조하기 위하여 cDNA 라이브러리를 만드는 대신 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 프라이머(primer)로 사용하여 인터루킨-2를 코드하는 cDNA를 합성하고 이것을 벡터에 재조합시켰다.

본 발명에 의하면, 전체의 mRNA의 cDNA가 얻어지는 대신 인터루킨-2를 코드하는 cDNA가 증폭되어 후속되는 실험인 클론의 선별 과정이 매우 쉬워지는 장점이 있다. mRNA로 부터 단일가닥 cDNA 합성시 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 염기서열은 인터루킨-2 유전자의 3' 말단의 염기서열에 상보적인 염기서열로 결정한다. 유전자의 3' 말단의 염기서열은 이미 알려진 염기서열을 이용하거나 또는 인터루킨-2 폴리펩타이드의 C-말단쪽의 아미노산들의 서열을 알아 내어 이 아미노산들을 코드할 수 있는 모든 가능한 코돈의 집합으로 구성된 염기서열로 부터 결정한다. 일단 염기서열이 결정되면 화학적인 방법에 의해 DNA자동합성기로 올리고 뉴클레오타이드를 합성한다. 두가닥 cDNA를 합성하기 위하여는 많이 사용되는 헤어핀 루프(hairpin loop) 프라이밍(priming)방법이나 (Maniatis, T., et al. (1982) "Molecular Colning", PP 214-216) 또는 RNase H와 DNA 폴리머라제(polymerase) 및 E. coli DNA 리가제(ligase)를 사용하는 방법이 사용되었다. (Gubler, U., Hoffman, B.J. (1983) Gene, 25, 263).

이렇게 만든 cDNA는 (dC)n 테일(tail)을 붙인 후 (dG)n 테일을 붙인 벡터와 아닐링(annealing)후 알맞은 균주를 형질전환시킨다. 이렇게 형질전환하여 얻어진 균체중에서 원하는 유전자를 보유하는 균체를 선별하기 위하여 콜로니 하이브리다이제시션(colony hibridization)방법 (Maniatis, T., et al. (1982)"Molecular Colning", PP 312-319)을 이용한다. 상기 방법으로 제조한 인터루킨-2 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 발현하기 위하여 효율적인 발현벡터를 사용해야 한다. 대장균에서 고등생물의 유전자를 발현시키는 벡터로는 여러 종류가 있는데 본 발명에서는 람다 피.엘.프로모터(λ P_LPromoter)를 가지고 있는 벡터와 tac 프로모터를 가지고 있는 벡터를 사용하였다. 피.엘.프로모터는 클리파아지 람다(coliphage λ)의 프로모터 중의 하나인데 온도감수성(temperature sensitive)의 리프레서(repressor)를 가진 균주를 사용하여 유전자의 전사를 조절한다.

즉, 30℃에서는 유전자가 발현되지 않으나 42℃에서는 전사가 진행되어 P_L프로모터하에 있는 유전자가 발현된다, pAS1 벡터는 람다 피.엘.프로모터 뿐만 아닐, 에스.디.(SD)염기서열과 전이 시작 코돈(codon)인 ATG코돈을 가지고 있어 고등생물의 유전자를 발현시키는 벡터로서 자주 사용되어 왔다. (Rosenberg, M.,Ho, Y., Shatzman, A., (1983) Methods Enzymol. 101, 123-138) 인터루킨-2 유전자를 발현벡터에서 발현하기 위하여 시작 코돈인 ATG와 인터루킨-2 폴리펩타이드의 N 말단 아미노산인 알라닌의 코돈인 GCA와 바로 연결되도록 조작하거나 (제5도) 또는 두번째 아니노산인 프롤린(proine)의 코돈인 CCT와 바로 연결되도록 조작하였다(제4도).

이렇게 만들어진 재조합 유전자를 온도감수성의 리프레서를 가진 균주에 도입 형질전환한다. 형질전혼된 균주는 28℃에서는 인터루킨-2를 생성하지 않지만 42℃로 배양온도를 전이하면 인터루킨-2 폴리펩타이드를 대량 생산할 수 있다(제7도). 상기 방법처럼 온도변화에 의해서 유전자의 전사를 조절할 수도 있지만 화학물질에 의해서 전사를 조절하는 방법이 있는데 tac 프로모터는 이러한 것들중의 하나이다. 본 발명은 tac 프로모터하에서 인터루킨-2를 발명하는 과정을 연구하였다. 제8도에서와 같이 인터루킨-2가 발현되도록 재조합 유전자를 제조하기 위하여 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 리딩후레임(reading frame)을 맞추었다. 이 재조합 유전자를 lac 리프레서를 초과생산(over production)하는 대장균 균주에 형질전환하여 37℃에서 배양한다. 이때는 lac 리프레서가 초과생산되어 인터루킨-2 유전자가 발현되지 않는다. 초기 지수 성장기에 이르러 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하면 유전자의 전사가 시작되어 인터루킨-2가 생성된다.

상기 방법에서 기술된 화학물질에 의하여 생성물이 유도되는 재조합 유전자 온도 변화에 의해서 생성물이 유도되는 재조합 유전자에 비해서 발효조에서 배양할 때에 생성물의 유도를 조절하기가 용이한 장점이 있다.

변이 단백질(mutein)의 생산방법의 설명

천연의 인터루킨-2 폴리펩타이드는 아미노산서열 58, 105, 125위치에 시스테인(cystein)잔기가 존재한다. 58과 105위치의 시스테인은 단백질의 3차 구조 형성시 디일설파이드(disulfide) 본드를 형성하여 단백질의 안정성을 높여주는데 기여하나 125위치의 시스테인은 단백질의 안정성이나 또는 그 활성에 기여하지 않는다 (Cohen, F. E., Kosen, P.A., Kuntz, I.D., Epstein, L. B., Ciardelli, T.L., Smith, K.A., (1986) Science, 234, 349).

유전공학적인 방법에 의해서 인터루킨-2를 미생물에서 생산할 경우 세포내에 단백질이 축적된 상태인 불용성의 침전물(inclusion body)을 형성하는데 이 단백질을 분리 정제하기 위하여 변성(denaturation)과 재생(renaturation)의 과정을 거치게 된다. 125위치의 시스테인은 변성된 인터루킨-2의 재생 과정을 저해하고 수율을 떨어뜨린다.

그러므로 125위치의 시스테인 잔기를 세린(serine)이나 알라닌(alanine)같은 다른 아미노산으로 대체하는 것이 좋다. 본 발명은 125위치의 아미노산인 시스테인을 알라닌으로 대체하였다. 제10도에서 보는 바와 같이 pIL7 플라스미드를 제한효소 NarI으로 절단하고 또 다른 튜브에서는 이 플라스미드를 제한효소 XbaI과 HindIII로 분해하여 큰 절편을 분리한다. 상기 두 유전자를 섞어 높은 온도에서 변성시킨 후 온도를 낮추고 유전자가 돌연변이 되게 합성한 올리고뉴클레오타이드를 첨가한다. 효소를 이요하여 제10도와 같이 간격을 채우고 형질전환한다. 얻은 균체중에서 돌연변이된 균체를 하이브리다이제이션( hybridization)방법으로 찾는다. 이 돌연변이된 유전자도 앞으로 기술한 바와 같이 발현벡터에 재조합하여 인터루킨-2의 생산에 사용한다.

본 발명은 다음 실시예로 보다 상술되며 그로 제한되지는 않는다.

[실시예 1]

1) 인터루킨-2 생산 세포주로는 사람의 임파종양에서 분리되어 세포라인으로 확립된 저켓(jurkat)세포를 사용했다. 배양액은 10% fetal calf serum, 50 ng.ml 가나마이신 설페이트(kanamycin sulfate) 10mM 헤페스(HEPES), 5×10^-5M 2-mercaptoethanol, 및 200 ng/ml 글루타민등이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 이 세포를 5% CO₂를 함유한 습한 배양기 속에 롤러 병(roller bottle)에서 약 10⁶cell/ml 농도까지 성장시킨 다음 Con.A(25ng/ml)과 TPA(5ng/ml)로 유도한 후 6시간 후에 수확하여 RNA를 분리하였다. RNA를 분리하는 방법은 파제등(Pedgett, R.A., Wahl, G. M., Coleman, D. F., and Stark, G. R. (1979) J. Biol. Chem. 254, 974)에 의하여 보고된 방법을 사용하였으며, 이 전체 RNA 부터 올리고 (dT) 셀룰로오즈 컬럼 크로마토 그래피(oligo(dT) cellulose column chromatography)에 의해 폴리(A⁺)(Poly(A⁺))를 포함하는 RNA를 분리하는 방법은 아말릭등(Amalric, F., Merke, C., Gelfand, R., and Attardi, G. (1978) J. Mol. Biol., 118, 1)의 방법을 사용했다.

2) 폴리(A⁺) RNA로부터 cDNA를 합성시 통상적으로 올리고 디.티(oligo(dT)를 프라이머로 사용한다. 본 발명에는 인터루킨-2- 유전자의 3' 쪽과 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드르 프라이머로 사용했다. 이 올리고뉴클레오타이드의 염기서열은 인터루킨-2의 C-말단 아미노산서열을 알아낸 다음 이 아미노산을 코드하는 유전자의 서열을 이용하여 결정한다. 올리고뉴클레오타이드의 서열이 결정되면 자동합성기에 의해 화학적인 방법으로 합성한다.

일차 cDNA를 합성하기 위하여 6㎍ 폴리(A⁺) RNA와 3.7×10^-11mol의 프라이머를 사용하여 흔히 사용되는 반응조건에서 반응시켰다(Manistis, T., et al. (1982) "Molecular Cloning", PP 214-216). 이차 cDNA는 RNase H와 DNA 폴리머라제 및 E. coli DNA 리가제를 사용하는 방법에 의하여 합성하였다(Gubler, U., Hoffman, B. J. (1983) Gene, 25, 263). 이렇게 만들어진 두가닥 cDNA(double stranded cDNA)를 유전자 운반체인 벡터와 재조합하기 위하여 (dC)n 테일을 붙이는 반응을 시행하였다.

다른 한편으로 플라스미드 pUC8을 (dG)n 테일을 붙여서 이것을 유전자 운반체로 사용했다(maniatis, T., et al. (1982) "Molecular Cloning", PP 214-216). 이와 같이 만들어진 테일을 가진 cDNA와 (dG)n 테일을 가진 벡터를 혼합한 다음 대장균에 형질전환하였다. 형질전환하여 얻은 균체중에서 클로니 하이브리다이제이션 방법에 의해 인터루킨-2를 코드하는 유전자를 가진 클론을 선별하였다(pIL7)(KCTC 8262 P) 여러가지 제한효소를 사용하여 제3도와 같은 제한효소 지도를 작성하였으며, 막삼 길버트(Maxam Gilbert)법 및 생거(Sanger)의 방법에 의하여 인터루킨-2를 코드하는 유전자의 염기서열을 결정하였는데 다니구찌등과 데보스등의 결과와 유사하였다. (제1도) (Taniguchi, T., et al. (1983) 302, 305) (Devos, R., et al. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 4307).

[실시예 2]

발현벡터 pAS1에 실시예 1에서 얻은 인터루킨-2 유전자를 도입하기 위해서 pAS1을 제4도와 같이 조작하였다. 즉, pAS1을 BamHI 제한 효소로 절단하고 S1 뉴클레아제(S1 unclease)로 BamHI 절단끝을 블런트엔드(blunt end)로 만든 다음 제한효소 Sa1I으로 처리하여 큰 절편을 젤에서 추출한다. 한편으로, 플라스미드 pIL7을 제한효소 HgiAI과 PvuII로 절단하고 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 DNA를 분리하고 인터루킨-2 유전자를 포함하는 절편을 젤에서 추출한다.

여기서 Sa1I 링커(linker)를 라이게이션(ligation)에 의하여 접합시키면 블런트 엔드인 PvuII 제한효소 절단면에 링커가 접합된다. 이것을 S1 뉴클레아제로 처리하여 HgiAI절단면을 블런트 엔드로 만들고 제한효소 Sa1I으로 처리한다. 위에서 만든 발현벡터의 절편과 인터루킨-2 유전자를 포함하는 절편을 라이게이션에 의하여 연결하고 적당한 대장균 균주에 형질전환시킨다. 통상의 방법에의하여 원하는 유전자를 가진 클론을 선별한다(pNK1)

이 클론을 이용하여 인터루킨-2를 생산하기 위하여는 이 유전자를 온도감수성의 리프레서를 가진 균주(M5248)에 도입하고 이 균주(KCTC 8259 P)를 배지에서 28℃에서 OD₆₀₀=0.6이 되도록 배양한 다음 42℃로 온도를 높여서 2-4시간 배양한다. 상기 방법에 의하여 만들어진 인터루킨-2 유전자를 제6도에 나타낸 바와 같이 그 시작이 AGTCCT-로 되어 있는데 이것은 자연계에서 생산되는 인터루킨-2에 비해서 N-말단의 알라닌이 없고, 메티오닌이 N-말단에 들어가도록 조작된 재조합 유전자이다.

[실시예 3]

본 예에서는 실시예 2의 생성물이 천연의 인터루킨-2와 비교하여 N-말단 아미노산인 알라닌이 결여되어 있는 점을 변화시키기 위하여 제5도에 나타낸 바와 같이 일련의 과정을 수행하였다. 즉, 플라스미드 pIL7을 제한효소 HgiAI으로 처리한 다음 S1 뉴클레아제로 처리하여 HgiAI의 절단면을 블런트 엔드로 만든다. 이것은 제한효소 HindIII로 처리하여 DNA 절편들을 아가로스 젤 전기영동으로 분리하고 인터루킨-2의 유전자를 포함하는 절편을 젤에서 추출한다. 프라스미드 pUC8을 제한효소 NarI과 DNA 폴리머라제 클리나우 절편(DNA polymerase Klenow fragment)으로 처리한 다음 제한효소 HindIII로 절단하여 DNA 절편들을 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리한다.

큰 절편을 젤에서 추출하여 상기 인터루킨-2 유전자와 라이게이션에 의해 연결한 다음 E. coli를 형질전환하고 통상의 방법에 의하여 계획된 것과 같은 유전자(pKS1)(KCTC 8264 P)를 가진 클론 선별한다. pKS1은 인터루킨-2 유전자의 5' 말단에 제하효소 BanI 인식부위(GGCGCC)를 가지게 되므로 이효소를 이용하여 쉽게 선별이 가능하며 이 유전자의 염기서열은 그 시작이 GGCGCCT-이 되어 알라닌을 코드하는 염기가 도입되었다. 이렇게 재구성된 인터루킨-2 유전자를 P_L프로모터 하에서 발현시키기 위하여 다음 과정들을 수행하였다. 플라스미드 pKS1을 제한효소 BanI으로 절단하고 DNA 폴리머라제 클리나우 절편으로 처리하여 그 절단면을 블런트 엔드로 만든다. 다음에는 제한효소 Sa1I으로 절단하여 아가로스 젤 전기영동의 의하여 DNA절편들을 분리한 다음 인터루킨-2의 유전자를 포함하는 절편들을 젤로부터 회수 한다. 한편으로 플라스미드 pAS1을 제한효소 BamHI으로 절단하고 S1 뉴클레아제로 처리하여 그 절단면을 블런트 엔드로 만든다. 다음에는 제한효소 Sa1I으로 절단하고 아가로스 젤 전기영동으로 DNA 절편들을 분리한 다음 큰 절편을 젤로부터 회수한다. 여기서 제조된 발현벡터의 절편을 위에서 제조한 인터루킨-2의 유전자를 포함하는 DNA의 절편과 라이게이션에 의하여 접합시키고 E. coli를 형질전환한다. 통상의 방법에 의하여 계획된 유전자를 포함하는 클론을 선별한다. (pNK2)

이 유전자를 실시예 2에서와 같이 온도감수성이 리프레서를 가진 균주(M 5248)에 도입하고 이 균주(KCTC 8260 P)를 28℃에서 OD₆₀₀=0.6이 되도록 배양한 다음 42℃로 온도를 높여서 2-4시간 배양한다. 이 균주로 부터 생성된 인터루킨-2의 활성을 검사하기 위하여 다음의 과정을 수행하였다. 세포배양후 원심분리하여 세포를 수확하고 이것을 RPMI 1640 배지에 녹이고 소니케이션(sonication)으로 세포를 파괴시킨다. 다시 원심분리한 다음 상등액중의 인터루킨-2의 활성을 검정하고 침전물을 SDS 폴라아크릴아마이드 젤(SDS polyacrylamide gel) 전기영동으로 폴리펩타이드들을 분리한다(제7도).

전기영동 후에 분자량 15,000위치의 폴리펩타이드를 젤로부터 회수하여 인터루킨-2의 활성을 검정한다. 인터루킨-2의 활성을 검장하는 방법은 인터루킨-2의 존재하에서만 배양이 가능한 세포주인 MTL 세포주를 이용하여 Gillis등의 방법에 따랐다(Gillis, S., Ferm, M.M., Ou, W. & Smith, K. A. (1978) J. Immun. 120 2027-2032).

[실시예 4]

본 예에서는 인터루킨-2 유전자가 tac 프로모터 하에서 발현되도록 제8도에 표시한 바와 같은 일련의 실험을 수행하였다. 실시예 3에서 제조한 플라스미드 pKS1을 제한효소 BanI과 HindIII로 절단하고 DNA절편들을 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리하여 크기가 약 450 염기쌍인 절편을 젤로부터 회수한다.

염기서열이

인 DNA 절편을 자동합성기에 의해 화학적인 방법으로 합성한 후 5' 끝에 카이네이션(Kination)에 의해 포스페이트(phosphate)를 붙인다. 플라스미드 pUC8을 제한효소 NarI으로 절단후 DNA 폴리머라제 클리나우 절편으로 처리하여 블런트 엔드를 만든 다음 제한효소 HindIII로 절단한다. DNA 절편들을 아가로스 젤 전기영동으로 분리하고 큰 절편을 젤로부터 회수한다. 이 DNA 절편과 위에서 제조한 약 450 염기쌍인 절편 및 합성에 의하여 제조한 절편을 한데 섞어 라이게이션 시키고 적당한 균주에 형질전환한다. 통상의 방법에 의하여 원하는 유전자를 가지고 있는 클론을 선별한다(pKS2)(KCTC 8265 P)

플라스미드 pKS2를 제한효소 EcoRI와 BamHI으로 절단하고 DNA 폴리머라제 클리나우 절편을 사용하여 그 절단면을 블런트 엔드로 만든 다음 아가로스 젤 전기영동에 의해 절편들을 분리하고 크기가 약 500 염기쌍인 절편을 젤로부터 회수한다. 프라스미드 ptac12를 제한효소 PvuII로 절단하고 위에서 제조한 DNA 절편과 라이게이션에 의해 접합시키고 적당한 균주를 형질전환한다. 통상의 방법에 의하여 원하는 유전자를 가지고 있는 클론은 선별한다(pNK3)

플라스미드 pNK3을 대장균 JM109 균주에 도입하여 이 균주(KCTC 8261 P)를 배양한다. 초기 지수 성장기에 이르러 IPTG를 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하고 2시간 동안 더 배양한 후 세포를 회수한다. 실시예 3에서와 같은 방법으로 인터루킨-2의 활성을 검정한다.

[실시예 5]

인터루킨-2 폴리펩타이드의 아미노산서열 125위치의 시스테인을 알라닌으로 치환하기 위하여 다음과 같은 과정을 수행하였다(제10도). 플라스미드 pIL7을 제한효소 NarI으로 처리한다. 다른 한편으로 플라스미드 pIL7을 제한효소 XbaI과 HindIII로 절단한 다음 아가로스 젤 전기영동에 의해 DNA 절편들을 분리하고 큰 절편을 젤로부터 회수한다. 이와 같이 각각 다른 효소로 절단된 플라스미드를 섞어서 100℃에서 4분 가열하여 변성시킨 후 온도를 내려서 아닐링(annealing)시킨다. 돌연변이가 생긴 올리고 뉴클레오타이드를 자동합성기로 합성한 다음 이것을 프라이머로 하고 DNA 폴리머라제 클리나우 절편 효소를 사용하여 아닐링에 의하여 생긴한줄 DNA를 이중가락 DNA로 만든 다음 대장균에 도입한다. 돌연변이된 유전자를 가진 클론을 선별하기 위하여 클로니 하이브리다이제이션 방법을 사용하였으며, 이때 위의 반응에서 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오 타이드를 프로브(probe)로 사용한다. 양성반응을 보이는 클로니를 배양하여 플라스미드를 분리하고 DNA의 염기서열을 결정하여 아미노산서열 125위치에 돌연변이가 일어났음을 확인하였다(pILM7)(KCTC 8263 P). 돌연변이가 일어난 유전자를 사용하여 인터루킨-2를 생산하기 위하여 다음의 과정을 수행하였다(제11도).

플라스미드 pILM7을 제한효소 XbaI과 PvuII로 절단하고 아가로스 젤 전기영동에 의하여 DNA 절편들을 분리한 다음 크기가 약 300 염기쌍인 절편을 젤로부터 회수한다. 프라스미드 pNK2를 제한효소 XbaI과 PvuII로 절단하고 아가로스 젤 전기영동에 의하여 DNA 절편들을 분리한 다음 크기가 약 4500 염기쌍인 절편을 젤로부터 회수한다. 위에서 제조한 두 절편들을 한데 섞어 라이게이션에 의하여 접합시키고 적당한 균주에 도입시킨다. 통상의 방법에 의하여 원하는 균주를 가진 클론을 선별하였다(pNKM21).

플라스미드 pNKM21을 적당한 균주(M5248)에 도입, 이균주(KCTC 8258 P)를 실시예 3에서와 같이 배양하여 인터루킨-2의 아미노산서열 125위치의 시스테인이 세린으로 치완된 변이 인터루킨-2를 얻었다.

Claims

사람의 임파종양에서 분리한 저켓 세포를 배양한 다음 mRNA를 분리하고, 이 mRA를 올리고뉴크레오타이드를 프라이머로 사용하여 일차 cDNA를 합성하고, RNase H와 DNA 폴리머라제 및 E. coli DNA 리가제를 사용하여 이차 cDNA를 제조하여 이 두가닥 cDNA에 (dC)n 테일을 붙여 플라스미드 벡터와 재조합시키고 이 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시켜 형질전환 균체 중에서 인터루킨-2를 코드하는 유전자를 가진 클론을 선별하는 신규한 플라스미드 pIL7(KCTC 8262 P)의 제조방법.
플라스미드 pIL7을 제한효소 HgiAI과 PvuII로 절단하고, PvuII 절단면에 Sa1I 링커를 접합시키고 HgiAI 절단면을 S1 뉴클레아제를 사용하여 블런트 엔드로 만들어 제한효소 Sa1I으로 절단한 절편을, 플라스미드 pAS1을 제한효소 BamHI으로 절단하고 S1 뉴클레아제로 처리하여 절단면을 블런트 엔드로 만들고 제한효소 Sa1I으로 절단한 벡터와 라이게이션에 의하여 접합시켜 신규한 플라스미드 pNK1(KCTC 8259 P)을 제조하는 방법.
플라스미드 pNK1를 온도감수성 리프레서를 가진 균주에 도입 이 균주(KCTC 8259 P)를 LB 배지에서 28℃에서 OD₆₀₀=0.6이 되도록 배양한 다음 42℃로 온도를 높여서 2-4시간 더 배양하여 N-말단의 알라닌이 없는 변이 인터루킨-2를 제조하는 방법.
프라스미드 pIL7을 제한효소 HgiAI으로 절단한 다음 S1 뉴클레아제로 처리하여 HgiAI의 절단면을 블런트 엔드로 만들고 이것을 제한효소 HindIII로 절단하여 엔터루킨-2의 유전자를 포함하는 절편을, 플라스미드 pUC8을 제한효소 NarI으로 절단하고 DNA 폴리머라제 클리나우 절편 효소 반응에 의해 블런트 엔드로 만든 다음 제한효소 HindIII로 절단한 벡터와 라이게이션에 의하여 접합시켜서 신규한 플라스미드 pKS1(KCTC 8264 P)을 제조하는 방법.
플라스미드 pKS1을 제한효소 BanI으로 절단하고 클리나우 절편효소 반응에 의해 블런트 엔드로 만든 다음 제한효소 Sa1I으로 절단하여 인터루킨-2의 유전자를 포함하는 절편을 플라스미드 pAS1을 BamHI으로 절단하고 S1 뉴클레아제로 처리하여 절단면을 블런트 엔드로 만든 다음 제한효소 Sa1I으로 절단한 벡터와 라이게이션에 의하여 접삽시켜 신규한 플라스미드 pNK2(KCTC 8260 P)을 제조하는 방법.
플라스미드 pNK2를 적당한 균주에 도입 이 균주(KCTC 8260 P)를 LB 배지에서 28℃에서 OD₆₀₀=0.6이 되도록 배양한 다음 42℃로 온도를 높여서 2-4시간 더 배양하여 인터루킨-2를 생산하는 방법.
플라스미드 pKS1을 제한효소 BamHI과 HindIII로 절단한 절편을 염기서열이
인 절편과 라이게이션에 의하여 접합시키고 이것을, 플라스미드 pUC8을 제한효소 NarI으로 절단하고 그 절단면을 클리나우 절편 효소 반응에 의해 블런트 엔드로 만든 다음 제한효소 HindIII로 절단한 벡터와 라이게이션에 의하여 접합시켜서 신규한 플라스미드 pNK2(KCTC 8265 P)을 제조하는 방법.
플라스미드 pKS2를 제한효소 EcoRI과 BamHI으로 절단한 다음 그 절단면들을 클리니우 절편 효소 반응에 의해 블런트 엔드로 만든 DNA 절편을, 플라스미드 ptac12를 PvuII로 절단한 벡터와 라이게이션에 의하여 접삽시켜서 신규한 플라스미드 pNK3(KCTC 8261 P)를 제조하는 방법.
플라스미드 pNK3를 함유하는 대장균 JM109 균주를 LB 배지에서 37℃에서 배양한 후 초기 지수 성장기에 이르러 IPTG를 최종 노도가 1mM이 되도록 첨가하고 2시간 동안 더 배양하여 인터루킨-2를 생산하는 방법.
플라스미드 pIL7을 제한효소 NarI으로 절단하고, 다른 한편으로 pIL7을 제한효소 XbaI과 HindIII로 절단하여 아가로스젤 전기영동에 의하여 DNA 절편들을 분리한 다음 큰 절편을 젤로부터 회수하고, 이 두 DNA 절편을 한데 섞어서 100℃로 4분간 가열한 후 냉각시키고 여기서 합성된 올리고뉴클레오타이드를 가하여 클리나우 절편효소 반응에 의하여 인터루킨-2의 아미노산서열 125위치의 시스테인 코돈이 세린 코돈으로 치환된 신규한 플라스미드 pIL7(KCTC 8263 P) 제조 방법.
플라스미드 pILM7을 제한효소 XbaI과 PvuII로 절단한 절편과 플라스미드 pNK2를 XbaI과 PvuII로 절단한 벡터를 라이게이션에 의하여 접합시켜서 신규한 플라스미드 pNKM21(KCTC 8258 P)을 제조하는 방법.
플라스미드 pNKM21을 적당한 균주(M 5248)에 도입 이 균주(KCTC 8258 P)를 LB 배지에서 28℃에서 OD₆₀₀=0.6이 되도록 배양한 다음 42℃로 온도를 높여서 2-4시간 더 배양하여 인터루킨-2의 아미노산서열 125위치의 시스테인의 세린으로 치환된 변이 인터루킨-2를 생산하는 방법.