KR101457940B1 - M 세포 특이 표적 펩타이드 cks9 서열이 도입되어 t세포 성장인자 단백질을 분비하는 신규한 형질전환 유산균 및 그의 용도 - Google Patents

M 세포 특이 표적 펩타이드 cks9 서열이 도입되어 t세포 성장인자 단백질을 분비하는 신규한 형질전환 유산균 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 M 세포 특이 펩타이드 CKS9이 도입되어 IL2 단백질을 발현시키는 재조합 발현벡터를 제공하고, 상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 유산균을 제공함으로써 M 세포 특이 펩타이드가 CKS9이 도입된 T세포 성장인자 단백질을 생산하여 장내 Payer’s Patch 표면에 있는 M 세포를 보다 효율적으로 통과한 다음 그 하부에 있는 T 세포에 전달되어 T 세포들을 활성화 시킴으로서 점막 면역반응을 보다 강하게 유도할 수 있는 면역증강용 경구투여 백신을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

M 세포 특이 표적 펩타이드 CKS9 서열이 도입되어 T세포 성장인자 단백질을 분비하는 신규한 형질전환 유산균 및 그의 용도{A novel recombinant Lactococcus lactis for M cell targeting peptide sequence CKS9 conjugated T cell growth factor protein and use of the same}
본 발명은 M 세포 특이 표적 펩타이드 CKS9가 도입되어 T 세포 성장인자 단백질을 분비하는 재조합 유산균 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 경구투여 백신에 관한 것이다.
인간 또는 가축에서 발병하는 질병의 90%는 식품기인성 질환(Food born disease) 및 식음료기인성 질환(Water born disease)과 같은 소화기성 질병인 것으로 알려져 있다. 그러나 상기 질병을 예방하기 위해 접종하는 백신의 형태는 대부분 근육을 통하여 주사하는 방식의 약독화 생백신이다. 상기 약독화 생백신의 단점은 잠재적인 안전성 문제와 장내 점막면역반응을 유도하는 효율이 낮다는 것이다. 이런 단점을 극복할 수 있는 대안으로 장내 점막면역반응과 체액성 면역반응을 동시에 유도할 수 있는 경구투여용 백신의 사용이 거론되고 있으나, 경구투여용 백신의 효율적인 사용을 위해서는 2가지 문제점을 극복해야한다. 첫째는 항원 단백질의 소장으로의 전달효율 및 소장내로의 흡수효율을 증대시켜야 하며, 둘째는 경구 관용(Oral tolerance)이 일어나지 않도록 점막면역시스템을 강하게 자극하도록 하는 것이다. 상기 2가지 문제점을 해결하기 위하여 경구투여용 백신과 장내전달효율과 소장흡수율이 우수한 유산균을 함께 투여하는 방식의 경구투여용 조성물의 개발연구가 활발히 진행중에 있다.
유산균(Lactic Acid Bacteria, LAB)은 대표적인 식품 미생물(GRAS: Generally recognized as safety)로 이미 많은 연구를 통해 그 이용성이나 영양적 가치가 밝혀져 있다. 현재 세계적으로 유산균을 이용하여 단백질계 약물을 장내로 전달하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 유산균을 이용하여 약물을 전달할 때 장점으로는 약물을 보다 안전하게 소장에 전달(Jerry M. Wells et al,. 2008 Nat Reviews immunology)할 수 있고, 유산균이 장내에서 살아남아 서식하면서 약물을 계속적으로 분비하하여 지속적인 효과를 유도할 수 있으며, 주사방식보다 편리하고 투여대상의 스트레스를 최소화하고, 최근에는 유산균이 항원제시세포 (Dendritic cell) 표면의 Toll like recptor 2 신호를 자극하여 면역반응을 촉진시키는 기능이 밝혀져 유산균 자체만으로도 경구투여용 백신 보조제(adjuvant)로서 가능성 있는 소재임이 확인되었다(K Ramirez et al,. 2009 Mucosal immunity).
M 세포는 파이어스패치(Peyer`s patch; PP, 이하 `PP`로 칭함)의 장의 소낭관련 상피세포(intestinal follicular associated epithelium; FAE)에서 발견되었고, 병원균이 신체로 감염되는 경로이기 때문에 면역시스템에서 중요한 역할을 한다(Siebers, A., et al., M-cell and the pathogenesis of mucosal and systemic infections, Trends Microbiol., 4:22-29, 1996). 또, M 세포는 장 관련 림프 조직으로 항원흡수를 용이하게 하고, 항원을 트랜스사이토시스(transcytosis)를 통해 포켓형 구조에 위치하는 항원 전달세포 및 림프구로 전달하여 항원 특이적 면역반응을 유발시키는 기능을 갖는다(Bye, W. A., et al., Structure, distribution and origin of M-cell in the Peyer`s patches of mouse ileum, gastroenterology, 86;789~801, 1984). 상기 M-세포에서의 항원흡수는 체내에 들어온 항원이 M 세포 특이 펩타이드의 도움을 받아 흡수되어 면역반응을 유발시키고, M 세포에 존재하는 M 세포 특이 펩타이드는 항원의 흡수뿐만 아니라 경구투여용 백신의 흡수 및 전달을 용이하게함으로 경구투여용 백신 보조제로서의 기능이 예상된다.
사이토카인은 면역세포에서 생성되는 단백질 중재자로 외부 항원에 대한 여러 면역세포간의 협력을 중재하므로 이들의 생성과 분비는 면역반응조절에 있어서 매우 중요하다. 이러한 면역반응조절이 가능한 사이토카인은 질병의 예방과 치료를 목적으로 생물공학기술을 적용하여 면역기능을 증진시키기 위한 바이오의약품개발의 중요한 소재로 여겨지고 있다(Young Joo Cho, et al., Potential hypersensitivity of recombinant mouse IL2 as a immunotherapeutic agent of cancer in tumor-bearing BALB/c mice, Yakhak Hoeji,48(6);335-344, 2004). 면역기능 증진용 바이오의약품은 활성화된 면역세포를 체내에 직접 주입하거나, 사이토카인을 발현시킬 수 있는 유전물질을 체내에 주입하거나, 특이 항원을 발현할 수 있는 유전물질을 주입하는 형태로 개발되고 있다.
면역기능증진용 바이오의약품의 유전자원으로 사용되는 사이토카인들은 인터루킨 1(interleukin 1; IL1), 인터루킨 2(interleukin 2; IL2), 인터루킨 6(interleukin 6; IL6) 및 투머네크로시스팩터-a(tomor necrosis factor-α; TNF-α) 등이 있다(Meydani, S. N. Dietary modulation of cytokine production and biologic functions. Nutr. Rev. 48;361-369, 1990).
특히, IL2는 항원이나 마이토젠(mytogene)으로 활성화된 T 세포에서 분비되는 15 ~ 19kDa의 당단백질로 133개의 아미노산으로 이루어져 있고 T 세포의 증식에 필수적인 T 세포성장 인자(T cell growth factor)로 알려져 있으며 그 외에도 자연살해세포(natural killer cell)의 증식 및 B 세포의 항체 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있어 바이오의약품 소재로서의 가능성을 높게 평가받고 있다.
종래의 IL2 유전자를 이용한 바이오의약품개발에 관한 기술로는 대한민국 공개특허 제10-2009-0112404호에서 피그 IL2 유전자만을 유산균에 형질전환시켜 그 형질전환체를 가축의 면역증강용 조성물을 제조하는 방법에 대하여만 개시하고 있다.
그러나 IL2 단백질과 같은 사이토카인을 경구투여용 백신으로 이용하기 위해서 M 세포 특이 펩타이드를 도입시켜 소장으로의 전달효율 및 흡수효율을 증대시키는 기술에 대한 문헌은 지금까지 공지된 바 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 M 세포 특이 펩타이드 CKS9가 도입되어 IL2 단백질 USP45-IL2-CKS9을 발현시키는 신규한 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 유산균을 제공함으로써 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질을 분비하는 형질전환 유산균을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 경구투여 백신을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은, IL2 유전자 및 M 세포 특이 펩타이드 CKS9 유전자를 각각 클로닝하는 단계와; 상기 클로닝 단계에서 수득한 IL2 유전자 및 M 세포 특이 펩타이드 CKS9 유전자를 발현벡터에 도입하여 M 세포 특이 펩타이드 CKS9, IL2 및 USP45 시그널펩타이드가 퓨전된 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 발현벡터를 제작하는 단계와; 이와 별도로 M 세포 특이 펩타이드 CKS9 유전자가 도입되지 않은 USP45 시그널펩타이드와 IL2가 퓨전된 USP45-IL2 단백질 발현벡터를 제작하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 USP45-IL2 및 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 발현벡터를 유산균에 도입하여 형질전환 유산균을 생산하고 그 형질전환체를 미생물수탁기관에 기탁하는 단계와;상기 형질전환 유산균 생산단계에서 수득한 형질전환체로부터 USP45-IL2 및 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 발현을 확인하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 IL2 단백질과 M 세포 특이 펩타이드 CKS9가 도입된 USP45-IL2-CKS9 단백질을 발현시키는 신규한 재조합 발현벡터와 상기 신규의 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 유산균을 제공하여 장내 Payer’s Patch 표면에 있는 M 세포를 보다 효율적으로 통과하여 점막 면역반응을 보다 강하게 유도할 수 있는 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 분비 형질전환 유산균을 제공함으로써 이를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 경구투여용 백신을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 USP45-IL2(1) 유전자 및 본 발명 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 유전자(2)를 증폭한 PCR 생성물의 전기영동결과를 촬영한 사진도이다
도 2는 USP45-IL2 유전자 및 본 발명 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 유전자의 pIL252 Ptuf.MbmpB 벡터로의 도입을 모식화한 그림이다.
도 3은 USP45-IL2 유전자 및 본 발명 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 유전자 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환대장균의 콜로니 PCR 결과를 전기영동한 결과 사진도이다.
도 4는 USP45-IL2 유전자 및 본 발명 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 유전자가 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환유산균의 IL2 단백질 및 IL2-CKS9 퓨전단백질의 발현량을 웨스턴블롯팅을 통하여 확인한 사진도이다.
도 5는 도 4는 USP45-IL2 유전자 및 본 발명 USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 재조합 발현벡터가 도입된 유산균의 생장곡선과 IL2 및 IL2-CKS9 퓨전단백질의 분비량을 측정한 그래프이다.
본 발명에 있어서, M cell 특이 표적 펩타이드 CKS9와 퓨전되는 T세포 성장인자 단백질은 인터루킨 1(interleukin 1; IL1), 인터루킨 2(interleukin 2; IL2), 인터루킨 7(interleukin 7; IL7), 인터루킨 9(interleukin 9; IL9) 및 투머네크로시스팩터-a(tomor necrosis factor-α; TNF-α)이고, 가장 바람직하게는 IL2이다.
또, 본 발명에 있어서 T세포 성장인자 단백질은 사람(human), 마우스(mouse), 랫트(rat), 돼지(pig), 소(bovine) 또는 말(horse)로 이루어진 군중에서 선택되는 어느 하나의 종 유래 단백질이고, 가장 바람직하게는 마우스 유래 단백질이다.
본 발명 서열번호 1의 유전자 염기서열을 갖는 CKS9 펩타이드가 도입된 T세포 성장인자 단백질은 사람 또는 가축의 경구투여용 백신조성물, 가축 면역증강용 사료첨가제 용도로 사용가능하다.
본 발명에 있어서, USP45-IL2-CKS9는 시그널 펩타이드 유전자와 CKS9 펩타이드 유전자가 도입된 서열번호 5의 재조합 유전자를 나타낸 것이며, IL2-CKS9는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 USP45-IL2-CKS9 재조합 유전자가 단백질로 발현된 후 시그널 펩타이드가 분해된 CKS9 펩타이드가 도입된 IL2 퓨전단백질(서열번호 6)을 나타낸다. 단, 시그널 펩타이드 아미노산염기서열 중(서열번호 4)에서 C말단의 아스파틱에시드(aspartic acid; Asp) 및 트레오닌(threonine; Thr)은 CKS9 펩타이드 N말단에 도입되어 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> IL2 및 IL2-CKS9 유전자 클로닝
본 실시예에서는 마우스 IL2 유전자 서열을 기반으로 유산균에 대한 Codon optimization을 진행한 다음 하기 표 1에 나타낸 프라이머를 디자인(oligomer design)하고 assembly PCR에 필요한 IL2를 구성하는 oligomer를 M-biotech사에 의뢰하여 제작하였다. Oligomer annealing 방법을 통하여 IL2 유전자 클로닝 산물인 USP45-IL2와 IL2와 CKS9 퓨전 유전자 클로닝 산물인 USP45-IL2-CKS9을 성공적으로 클로닝했다(도 1참조).
본 발명 USP45-IL2-CKS9 및 USP45-IL2 클로닝용 프라이머
NO 프라이머 명칭 염기서열(5`~3`) Tm (℃) GC 함량
(%)		 크기(bp)
1 USP45-IL2 F TCATATGAAGAAGAAAATCATCTCCGCAAT 55.3 36 29
2 USP45-IL2 R ACTCGAGTCATTGTGGGGAGGTGGAGA 58.5 58 27
3 USP45-IL2-CKS9 F TCATATGAAGAAGAAAATCATCTCCGCAAT 55.3 36 29
4 USP45-IL2-CKS9 R ACTCGAGTCAACCACAAGAGAGTGGATGG 58.2 52 29
CATATG: Nde I 제한효소 인식 염기서열
CTCGAG: Xho I 제한효소 인식 염기서열
< 실시예 2> 본 발명 IL2 - CKS9 퓨전단백질 발현백터 제작
본 발명에 있어서 재조합 발현벡터 제작은 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질의 발현효율과 효과를 비교검정하기 위하여 서열번호 2의 아미노산 염기서열을 갖는 CKS9 펩타이드가 도입되지 않은 IL2 단백질이 단독으로 발현되는 발현벡터도 함께 제작하였다.
본 발명에 있어서 서열번호 3의 염기서열을 갖는 USP45 시그널 펩타이드 유전자는 형질전환 유산균에서의 본 발명 IL2-CSK9 퓨전단백질 및 CKS9 펩타이드가 도입되지 않은 IL2 단백질 분비를 위하여 IL2-CSK9 및 IL2 유전자에 각각 도입하였고 USP45 시그널 펩타이드의 아미노산 염기서열은 서열번호 4에 나타냈다.
본 발명에 있어서 IL2 및 IL2-CKS9 퓨전단백질 발현은 BmpB가 삽입된 pIL252 pTuf-MbmpB를 이용하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 발현하고자 하는 USP45-IL2와 USP45-IL2-CKS9 재조합 유전자를 NdeI과 XhoI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 BmpB와 교환하는 방식으로 발현벡터를 각각 구축을 하였다. CKS9 펩타이드가 도입되지 않은 USP45-IL2 재조합유전자와 서열번호 5의 염기서열을 갖는 본 발명 CKS9 펩타이드가 도입된 USP45-IL2-CKS9 재조합 유전자가 각각 도입된 벡터를 E.coli에 형질전환한 다음, 콜로니 PCR을 통하여 삽입하고자 하는 유전자가 벡터에 도입되었는지는 콜로니 PCR결과를 전기영동하여 확인하였다.
실험결과, CKS9 펩타이드가 도입되지 않은 USP45-IL2 또는 본 발명 USP45-IL2-CKS9 재조합 유전자가 도입된 것으로 나타난 콜로니는 도 3에 나타난 바와 같이 각각 1개씩 확인이 되어 이들 2개의 콜로니를 각각 배양하고 이들 배양균주로부터 단백질 발현 여부를 검증하였다.
< 실시예 3> 본 발명 USP45 - IL2 - CKS9 유전자가 도입된 형질전환 유산균 제작
상기 실시예 2에 따라 구축된 CKS9 펩타이드가 도입되지 않은 USP45-IL2와 본 발명 CKS9 펩타이드가 도입된 USP45-IL2-CKS9 재조합 유전자 발현벡터를 L.lactis IL1403 균주에 도입하여 형질전환(transformation)을 시켜 L.lactis IL1403 IL2-CKS9균주를 제작하고 이를 미생물기탁기관에 기탁하였다. 상기 형질전환체 및 신규한 유산균주에 대하여 IL2 단백질 또는 서열번호 6의 아미노산서열을 갖는 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질의 발현 및 분비 여부를 웨스턴블롯팅(Western blotting)을 이용하여 확인하였다.
먼저, 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질 또는 IL2 단백질을 발현하는 형질전환 유산균주를 12시간 동안 배양하고 M17 broth에 글루코스 5%(w/v)가 첨가된 M17G 배지에 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 배양하고 그 배양액을 원심분리하여 배양세포와 상층액으로 분리한 다음 배양세포 또는 상층액으로부터 단백질을 추출하여 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질의 발현 및 분비를 확인하였다.
실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이 형질전환하지 않은 L.lactis IL1403 균주에서는 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질 또는 IL2 단백질의 발현이 확인되지 않았으나, 상기 실시예 2에 따라 제작된 본 발명 IL1403 pTuf-USP45-IL2-CKS9 퓨전단백질 발현벡터가 도입된 L.lactis IL1403 균주에서는 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질의 발현이 세포질 및 상층액에서 확인되었고 상기 IL2-CKS9 퓨전단백질의 발현이 확인된 형질전환 균주를 한국생명공학연구원에 2012. 10. 19자로 미생물기탁하여 수탁번호 KCTC12294BP를 수여받았다.
< 실시예 4> 본 발명 USP45-IL2 - CKS9 유전자가 도입된 형질전환 유산균의 생장검정
상기 실시예 3에 따라 생산된 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질을 생산하는 신규한 형질전환 유산균의 생장을 검정하기 위해서 형질전환하지 않은 L.lactis IL1403 균주와 CKS9 펩타이드가 도입되지 않은 IL2 단백질을 생산하는 형질전환 L.lactis IL1403 균주의 생장을 비교검정 하였다.
실험결과,도 5에 나타난 바와 같이 본 발명에 따라 생산된 IL2-CKS9 퓨전단백질을 발현시키는 본 발명 신규한 형질전환 유산균은 형질전환하지 않은 L.lactis IL1403 균주와 유사한 패턴으로 생장하는 것을 확인하였고 따라서, 본 발명 USP45-IL2-CKS9 재조합 발현벡터가 도입된 유산균의 생장이 형질전환에 의해 영향을 받지 않았음을 확인하였다.
본 발명 형질전환 유산균을 12시간 배양하고 그 배양액의 IL2 단백질 및 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질의 분비량을 배양을 시작한 다음 2시간 간격으로 상층액을 2mL씩 취하여 냉동보관한 후 그 배양액의 IL2 단백질 및 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질의 분비량을 마우스 IL2 ELISA kit(Thermo)를 이용하여 UV 450nm에서 흡광도를 측정하여 IL2 농도를 환산하였다.
분석결과, USP45-IL2는 약 45ng/mL, USP45-IL2-CKS9은 약 29ng/mL 씩 각각 분비하는 것으로 나타났다.
본 발명자들은 경구투여용 백신의 효율을 증진시키고자 유산균 사이토카인 보조제 (cytokine adjuvant) 즉 M cell 특이 펩타이드 CKS9이 도입된 IL2 퓨전단백질을 분비하는 재조합 유산균을 개발하였고, 본 발명에 따르면 재조합 유산균은 상층액으로 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질을 분비하였다.
따라서, 본 발명 IL2-CKS9 퓨전단백질을 분비하는 신규한 형질전환유산균은 경구투여용 백신 또는 유산균 면역증강제로 활용 가능한 것으로 판단되었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 M 세포 특이 펩타이드 CKS9이 도입된 IL2 퓨전단백질을 발현시키는 재조합 발현벡터를 제공하는 효과가 있고, 상기 재조합 발현벡터가 도입된 신규한 형질전환 유산균을 제공함으로써 경구투여백신 보조제용 유산균 면역증강제를 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명이다.
한국생명공학연구원 KCTC12294BP 20121019
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> A novel recombinant Lactococcus lactis for M cell targeting peptide sequence CKS9 conjugated T cell growth factor protein and use of the same <130> P5235 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial CKS9 <400> 1 tccggtggtg gcggtgcatg taaatccacc catccactct cttgtggt 48 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial CKS9 <400> 2 Ser Gly Gly Gly Gly Ala Cys Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial USP45 <400> 3 aagaagaaaa tcatctccgc aatcctgatg tctaccgtaa ttctgagcgc agcggcaccg 60 ctgtctggtg tttatgctga tact 84 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial USP45 <400> 4 Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Asp Thr 20 25 <210> 5 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial USP45-IL2-CKS9 <400> 5 aagaagaaaa tcatctccgc aatcctgatg tctaccgtaa ttctgagcgc agcggcaccg 60 ctgtctggtg tttatgctga tactgctcca acttctagct ccactagctc tagcaccgct 120 gaagctcagc aacaacagca gcagcagcag cagcagcagc agcatctgga gcagctcctg 180 atggacctcc aagaactgct cagccgtatg gagaattacc gtaacctcaa gctcccgcgt 240 atgctgacct tcaagttcta cctcccgaag caggcaaccg aactcaaaga cctgcaatgt 300 ctggaagatg aactcggtcc gctccgccac gttctcgatc tcacccagag caaatctttt 360 cagctggagg acgcggagaa cttcatttcc aatattcgcg taaccgtagt aaagctgaag 420 ggcagcgaca ataccttcga gtgtcagttt gacgacgaaa gcgctactgt agtagacttt 480 ctgcgccgtt ggatcgcgtt ctgccaaagc atcatctcca cctccccaca atccggtggt 540 ggcggtgcat gtaaatccac ccatccactc tcttgtggt 579 <210> 6 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial USP45-IL2-CKS9 <400> 6 Asp Thr Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala 1 5 10 15 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln 20 25 30 Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg 35 40 45 Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys 50 55 60 Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly 65 70 75 80 Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu 85 90 95 Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys 100 105 110 Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser 115 120 125 Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser 130 135 140 Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ala Cys Lys Ser 145 150 155 160 Thr His Pro Leu Ser Cys Gly 165

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 M 세포 특이 펩타이드 CKS9 유전자가 도입된 것이 특징인 T 세포 성장인자 퓨전단백질 발현용 재조합벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 T 세포 성장인자 단백질은 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-7, 인터루킨-9 또는 투머네크로시스팩터-알파 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 특징인 퓨전단백질 발현용 재조합벡터.
  3. 제 1항 또는 제 2항 기재의 퓨전단백질 발현용 재조합벡터가 도입된 것이 특징인 형질전환 유산균.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 M 세포 특이 펩타이드 CKS9 유전자가 도입된 IL2 퓨전단백질 발현용 재조합벡터.
  7. 제 6항 기재의 퓨전단백질 발현용 재조합벡터가 도입된 것이 특징인 기탁번호 KCTC12294BP인 형질전환 유산균.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 7항 기재의 형질전환 유산균이 생산한 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 M 세포 특이 펩타이드 CKS9이 도입된 IL2 퓨전단백질.
  11. 삭제
  12. 삭제
KR1020120135294A 2012-11-27 2012-11-27 M 세포 특이 표적 펩타이드 cks9 서열이 도입되어 t세포 성장인자 단백질을 분비하는 신규한 형질전환 유산균 및 그의 용도 KR101457940B1 (ko)

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KR890003715B1 (ko) * 1987-06-27 1989-09-30 한국과학 기술원 신규한 플라스미드 제조방법 및 그를 함유한 균주를 배양하여 인터루킨-2 또는 변이 인터루킨-2를 생산하는 방법
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KR20100122225A (ko) * 2009-05-12 2010-11-22 서울대학교산학협력단 Ｍ 세포 표적 펩타이드 고정 키토산 나노입자

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