JP5991650B2 - サイトカインを発現する豚丹毒菌及び豚丹毒菌を用いたサイトカインのデリバリー方法 - Google Patents
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さらに、動物サイトカインを効率よく安全に動物体内にデリバリーして、所望の効果を発現させる技術も確立されていない。
(1)豚丹毒菌弱毒株の形質転換体である豚丹毒菌であって、サイトカインをコードする遺伝子を結合させた組換えDNAとして前記組換えDNAがサイトカインをコードする遺伝子を豚丹毒菌のSpaA.1遺伝子の中央部に挟むようにして設計したキメラ遺伝子を有し、前記サイトカインを発現する豚丹毒菌、
(2)サイトカインがインターロイキン、インターフェロン、造血因子、細胞増殖因子及び細胞傷害因子からなる群より選ばれた1種以上である前記(1)記載の豚丹毒菌、
(3)宿主となる豚丹毒菌弱毒株が豚丹毒菌小金井株65−0.15又は莢膜欠損豚丹毒弱毒YS−1株(FERM P−16466)である前記(1)または(2)に記載の豚丹毒菌、
(4)前記(1)〜(3)いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与する工程を含む非ヒト動物の疾患の予防及び/又は治療方法、
(5)前記(1)〜(3)いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物体内へのサイトカインのデリバリー方法、
(6)前記(1)〜(3)いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物におけるワクチンアジュバントとして使用する方法、
(7)前記(1)〜(3)いずれかに記載の豚丹毒菌を含有する非ヒト動物用ワクチン製剤
に関する。
したがって、本発明の豚丹毒菌を用いることで、非ヒト動物の疾患の予防又は治療を簡単に行うことができる。
また、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物の免疫増強を行うことができるため、他のワクチン製剤を併用することで、非ヒト動物における予防又は治療効果を一層得やすくなる。
即ち、前記プラスミドpERc6.1のSpaA.1遺伝子内に2箇所の制限酵素EcoRIサイトが存在しているため、プラスミドpERc6.1を制限酵素EcoRIで処理する。次にサイトカインをコードする遺伝子を含む遺伝子産物(両端に制限酵素EcoRIの切断部位を有する遺伝子断片)と、準備したプラスミドpERc6.1とを、常法により連結させ、大腸菌にトランスフォーメーションし、キメラ遺伝子であるプラスミドを保有する大腸菌を得る。このプラスミドはSpaA.1遺伝子のN末端側にプロモーター配列を含むため、通常使用されるIPTG等の蛋白発現のために添加される薬剤の添加なしに、大腸菌で蛋白を発現することができる。大腸菌の増殖に伴って発現された蛋白をウェスターン・ブロティングで解析することで、発現された蛋白質の分子量と、SpaA.1に対する単クローン抗体とサイトカインに対する単クローン抗体の両抗体の反応を確認することができる。このSpaA.1に対する単クローン抗体は受身感染防御能をもつ抗体となる。この結果から豚丹毒菌SpaA蛋白とサイトカインとが融合したキメラ蛋白の発現が確認でき、さらに合わせて、この蛋白の発現に関わる遺伝子カセットが作製できる。
即ち、キメラ遺伝子であるプラスミドのインサート全体を増幅するための制限酵素ClaIサイトをもつPCRプライマーを5’側に設計し、そのプライマーとT7プライマーを用いてPCRを行う。その増幅産物を制限酵素ClaIで処理し、予め制限酵素ClaIで処理しておいたストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)と大腸菌のシャトルベクターpGA14に連結する。このプラスミドをエレクトロポレーションにより豚丹毒菌弱毒株に導入する。
前記形質転換体の中から、spaA.1遺伝子上下流領域が、導入した遺伝子、すなわちpER6.1/IL18プラスミド上にある相同性領域とダブルクロスオーバーにより置き換わった結果、薬剤耐性を示さなくなった株を選択し、PCR法によりこの株が目的とする遺伝子を保有することを確認する。
なお、前記形質転換法に用いるコンピタントセルの作製法、及び、形質転換に用いたエレクトロポレーション法の条件、形質転換株の選択法は、本発明者である下地らがすでに報告した方法(Infection and Immunity, 70: 226-232, 2002)に準じて行う。
さらに、本発明の豚丹毒菌は、生きている限り、定着している非ヒト動物体内にサイトカインを供給し続けることが可能であるため、一度、豚丹毒菌を投与すれば所望の効果が奏される。
したがって、本発明は、精製したサイトカインを必要となるたびに投与する必要がない点で、簡便でしかも安全な、非ヒト動物へのサイトカインのデリバリー方法である。
したがって、非ヒト動物に豚丹毒菌を投与することで、感染症等の疾患に罹患し難くしたり、症状を軽減したり、さらに他のワクチン製剤を併用することでより早期に疾患を完治することができる。また、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物用のワクチンと混合した場合でも、大きな影響はないと考えられることから、例えば、本発明の豚丹毒菌を非ヒト動物用ワクチン製剤に含有させることができる。
特開2002−119285号公報に記載の方法に準じて、導入する外来遺伝子としてマイコプラズマ・ハイオニューモニエの付着蛋白質であるP97アドヘジン遺伝子に替えて豚インターロイキン18(poIL−18)遺伝子を導入した莢膜欠損豚丹毒菌弱毒YS−1株(YS−1/IL18株)の作製を行った。
なお、図1に、豚丹毒菌YS−1/IL18株の作製の手順を示す。
前記培養上清及び前記菌体破砕遠心上清のOD450nmにおける吸光度を特開2001−103967号公報に記載の方法に準じて測定し、これらの上清中に含まれるpoIL−18の濃度を測定した。
また、対照として、形質転換を行っていないYS−1株(親株)の培養上清と菌体破砕遠心上清についても調べた。これらの結果を図2に示す。
図2に示す結果より、YS−1株(親株)では、培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもpoIL−18がほとんどみられないのに対して、YS−1/IL18株では培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもpoIL−18が顕著に発現されていることがわかる。
宿主細胞として、莢膜欠損豚丹毒菌弱毒YS−1株に替えて豚丹毒菌小金井65−0.15株を用いた以外は実施例1と同様にして、poIL−18遺伝子を導入した豚丹毒菌小金井65−0.15株(KO/IL18株)の作製を行った。なお、poIL−18遺伝子としては、実施例1と同じDNA断片を用いた。
培養上清及び菌体破砕遠心上清のOD450nmにおける吸光度を測定して、これらの上清中に含まれるpoIL−18の濃度を測定した。
また、対照として、形質転換を行っていない小金井65−0.15株(親株)の培養上清と菌体破砕遠心上清についても調べた。これらの結果を図3に示す。
図3に示す結果より、小金井65−0.15株(親株)では、培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもpoIL−18がほとんどみられないのに対して、KO/IL18株では培養上清と菌体破砕遠心上清のいずれにもpoIL−18が顕著に発現されていることがわかる。
マウス(10週齢)2匹から脾細胞を取り出し、10%牛胎児血清を添加したRPMI−1640培地(Invitrogen社)にて2×106/ml個に調整後、この細胞浮遊液100μlに実施例1で得られたYS−1/IL18株の培養上清の2倍希釈液100μlを加えて2晩37℃で培養し、マウスIFN−γ ELISAキット(Invitrogen社)により、IFN−γの産生量を調べた。また、対照として、YS−1株(親株)の培養上清を用いて、同様にIFN−γの産生量を調べた。結果を図4に示す。
図4に示す結果より、YS−1株(親株)の培養上清ではIFN−γの産生が検出限界以下であるのに対して、YS−1/IL18株の培養上清では、IFN−γの産生が確認された。
図5の結果から、YS−1/IL18株は、マウスの体内にYS−1/IL18株が定着してIL18が供給されることによって、YS−1株(親株)と比べて、マウスにおいて有意にIFN−γの産生を促進することがわかる。
マウス(7週齢)32匹に、実施例1で得られたYS−1/IL18株を1.3×107CFU/匹の菌を含むBHI培地を腹腔内投与した。また、対照として、同数のマウスにYS−1株(親株)1.0×107CFU/匹を腹腔内接種した。菌を投与後、5日目、1週間目、2週間目、3週間目に、各菌投与群のマウス、それぞれ8匹ずつを安楽殺し、マウスの腹腔から採取したマクロファージを用いて、Salmonella Typhimurium(ST)に対する貪食能を調べた。貪食能は、貪食1時間後のマクロファージを培地に滴下し,出現した菌のコロニーをカウントすることにより測定した。結果を図6に示す。
図6に示す結果より、YS−1/IL18株を投与したマウスの腹腔マクロファージは、YS−1株(親株)を接種したマウスのマクロファージに比較し、菌を投与後1週目及び2週目において、STに対する貪食能が亢進していることが確認された。
このことから、YS−1/IL18株を投与されたマウスではマクロファージの貪食能が亢進したことからも分かるように、マウスの体内にYS−1/IL18株が定着してIL18が供給されることによって、非特異的に免疫能が賦活されていることがわかる。
なお、上記の実験中、マウスの飼育は、常法に従い温度、湿度がコントロールされた部屋にて行い、食餌と水は自由に与えた。
実施例1で得られたYS−1/IL18株をマウス(10週齢)5匹に1.3×107CFU/匹の菌を含むBHI培地を腹腔内投与した後、5日目にSTを1.0×109CFU/headの菌を含むLuria−Bertani培地(BD社)を経口接種させ、19日目にマウスを安楽殺して、脾臓、腸管膜リンパ節、パイエル板を常法により取り出し、それぞれの器官に存在するST数を、組織のホモジネートを培地に滴下し,出現した菌のコロニーをカウントすることにより測定した。
また、対照として、YS−1株(親株)1.2×107CFU/匹を用いて、同様に各器官におけるST数を測定した。結果を図7に示す。
図7に示す結果より、前記3種類の器官におけるサルモネラ菌の存在数は、YS−1/IL18株を接種した場合の方が、YS−1株(親株)を用いた場合に比べて有意に低かった。特に腸管膜リンパ節及びパイエル板におけるサルモネラ菌の存在数は顕著に低かったことから、YS−1/IL18株を投与されたマウスでは、その体内にYS−1/IL18株が定着してIL18が供給されることによって、免疫が賦活された結果、サルモネラ菌の排除能が亢進していることがわかる。
したがって、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物であるマウスの疾患の予防及び/又は治療に有効であることがわかる。
なお、上記の実験中、マウスの飼育は、実施例4と同様にして行った。
実施例2で得られたKO/IL18株を無菌豚(動衛研にて作出)2頭に7×1010CFU/頭となるように添加した人口ミルクを経口投与した。菌投与後、13日目に、SpaA.1抗原に対するIgA及びIgGの抗体濃度を測定した。
また、対照として、KO株(親株)を投与した無菌豚2頭を用いて、同様にSpaA.1抗原に対する抗体濃度をELISAにより測定した。結果を図8に示す。
図8に示す結果より、KO/IL18株を経口投与した豚では、KO株(親株)を経口接種した対照ブタに比べ、血清及び気管支肺胞洗浄液(BALF)中の豚丹毒菌抗原SpaA.1(IgA、IgG)に対する抗体価が上昇していた。
このことから、KO/IL18株を経口投与された豚では、体内にKO/IL18株が定着してIL18が供給されることによって、豚の免疫が賦活された結果、抗体産生能が亢進しており、アジュバント効果があることがわかる。
したがって、本発明の豚丹毒菌は、非ヒト動物におけるワクチンアジュバントとして使用することが可能である。この場合、ワクチン製剤において、アジュバントのかわりに本発明の豚丹毒菌を使用することで、非ヒト動物用ワクチン製剤を調製することができる。
また、本発明の豚丹毒菌を単独で使用した場合でも、非ヒト動物である豚の疾患の予防及び/又は治療に有効であることがわかる。
なお、上記の実験中、豚の飼育は常法に従い温度、湿度がコントロールされた部屋にて行い、水は自由に与えたが、食餌は一日一回必要量を与えた。
Claims (7)
- 豚丹毒菌弱毒株の形質転換体である豚丹毒菌であって、サイトカインをコードする遺伝子を結合させた組換えDNAとして前記組換えDNAがサイトカインをコードする遺伝子を豚丹毒菌のSpaA.1遺伝子の中央部に挟むようにして設計したキメラ遺伝子を有し、前記サイトカインを発現する豚丹毒菌。
- サイトカインがインターロイキン、インターフェロン、造血因子、細胞増殖因子及び細胞傷害因子からなる群より選ばれた1種以上である請求項1に記載の豚丹毒菌。
- 宿主となる豚丹毒菌弱毒株が豚丹毒菌小金井株65−0.15又は莢膜欠損豚丹毒弱毒YS−1株(FERM P−16466)である請求項1または2に記載の豚丹毒菌。
- 請求項1〜3いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与する工程を含む非ヒト動物の疾患の予防及び/又は治療方法。
- 請求項1〜3いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物体内へのサイトカインのデリバリー方法。
- 請求項1〜3いずれかに記載の豚丹毒菌を非ヒト動物におけるワクチンアジュバントとして使用する方法。
- 請求項1〜3いずれかに記載の豚丹毒菌を含有する非ヒト動物用ワクチン製剤。
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