JP2992980B2 - 豚丹毒菌の莢膜欠損変異株 ys−1株 - Google Patents

豚丹毒菌の莢膜欠損変異株 ys−1株

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JP2992980B2
JP2992980B2 JP9333767A JP33376797A JP2992980B2 JP 2992980 B2 JP2992980 B2 JP 2992980B2 JP 9333767 A JP9333767 A JP 9333767A JP 33376797 A JP33376797 A JP 33376797A JP 2992980 B2 JP2992980 B2 JP 2992980B2
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康行 森
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、豚丹毒菌莢膜欠損
変異株 YS−1株及び該YS−1株を豚丹毒菌感染症
の生ワクチンとして使用する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】豚丹毒は、豚丹毒菌(Erysipelothrix
rhusiopathiae)に起因する感染症である。現在、豚丹毒
菌感染症の生ワクチンとして、様々な方法で弱毒化した
弱毒菌が用いられているが、その弱毒菌の弱毒化のメカ
ニズムは不明である。また、これらの弱毒生ワクチン株
は、病原性の復帰が危惧されており、接種により逆に感
染させてしまうおそれが払拭できない。したがって、病
原性が安定した弱毒菌、すなわち病原遺伝子を不活化し
たワクチン株の開発が望まれている。
【0003】わが国では、豚の豚丹毒菌感染症のワクチ
ン株として、アクリフラビン色素耐性菌を利用した小金
井株が用いられている。しかしながら、アクリフラビン
耐性度は、マーカーとして用いるアクリフラビン色素製
品のメーカーによって異なることが報告されている。そ
のため、アクリフラビンは、生ワクチンのマーカーとし
ての信頼性は低い。それ故、アクリフラビンに代わる信
頼度の高い遺伝的マーカーを持ったワクチン株の開発が
望まれている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第1の目的
は、病原性復帰のおそれがなく遺伝的に安定した、豚丹
毒菌感染症の生ワクチン株を開発することである。さら
に、本発明の第2の目的は、豚丹毒菌生ワクチンのマー
カーとして、従来用いられていたアクリフラビンに代わ
る、信頼度の高い遺伝的マーカーを持ったワクチン株を
開発することである。
【0005】本発明者らは、既に豚丹毒菌の有する莢膜
が病原性に関与していることを究明すると共に、その莢
膜形成に関与する遺伝子群の塩基配列を決定した(特願
平9−166642号明細書)。本発明者らは、さらに
研究を重ねた結果、莢膜が欠失した変異株を作出するこ
とに成功した。このようにして得られた変異株の遺伝子
の塩基配列を利用してプライマーを設計することによ
り、該変異株と他の豚丹毒菌との鑑別がポリメラーゼ連
鎖反応法(PCR法)により可能になる。また、この変
異株と強毒株とで菌体表層抗原の違いを比較することに
より、表現形質マーカーによる識別が可能である。
【0006】
【課題を解決するための手段】請求項1記載の本発明
は、豚丹毒菌強毒株 Fujisawa-SmR のトランスポゾン変
異株由来で、テトラサイクリン感受性を示す豚丹毒菌莢
膜欠損変異株 YS−1株(FERM P−1646
6)である。請求項2記載の本発明は、上記の豚丹毒菌
莢膜欠損変異株 YS−1株(FERM P−1646
6)を豚丹毒菌感染症の生ワクチンとして使用する方法
である。
【0007】
【発明の実施の態様】以下に本発明について詳しく説明
する。本発明に係る豚丹毒菌莢膜欠損変異株 YS−1
株(FERM P−16466)(以下、単にYS−1
株と略記することがある。)の作出は、以下の手順によ
り行うことができる。
【0008】まず、豚丹毒菌強毒株 Fujisawa-SmR の染
色体上にトランスポゾンTn916を導入する。トラン
スポゾンTn916は、腸球菌(Enterococcus faecal
is)のある株で発見されたテトラサイクリン耐性遺伝子
を保有し、接合伝達により目的とする細菌の染色体に導
入することが可能な転移遺伝子である。トランスポゾン
Tn916の導入方法の概略を述べると、トランスポゾ
Tn916を保有するEnterococcus faecalis CG110
株と豚丹毒菌の親株である Fujisawa-SmR 株をメンブラ
ンフィルター上で培養した後、テトラサイクリンとスト
レプトマイシンの入った培地を用いて、トランスポゾン
Tn916の接合伝達された Fujisawa-SmR 株を選択し
た。
【0009】得られるトランスポゾンTn916挿入変
異株の中から、親株である Fujisawa-SmR 株とコロニー
形態が異なる変異株(33H6株)を選択した。33H
6株は、テトラサイクリン耐性遺伝子であるトランスポ
ゾンTn916が導入されているため、テトラサイクリ
ン感受性を示さない。また、この株は親株である Fujis
awa-SmR 株が有する莢膜の形成能を有していない上、親
株の有する病原性をも失っている。
【0010】Tn916は染色体から脱落すると、その
際に、挿入されていた場所に変異を起こすことが知られ
ている。この性質を利用して、莢膜形成に関与する遺伝
子に変異の起こった変異株を作成した。すなわち、この
33H6株を継代して、コロニー形態が親株である Fuj
isawa-SmR 株と異なり、莢膜形成能を有しておらず、か
つテトラサイクリン感受性を有するようになったものを
選択し、この変異株をYS−1株と命名した。YS−1
株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
おり、その受託番号はFERM P−16466であ
る。
【0011】このYS−1株の病原性を調べるために、
マウスに接種して50%致死量(LD50)を求めたとこ
ろ、病原性を失っていることが明らかとなった。そこ
で、YS−1株について、莢膜形成に関与する遺伝子領
域に変化が生じているか否か検討した。本発明者らは、
豚丹毒菌(Fujisawa株) の莢膜形成に関与する遺伝子群
の塩基配列をすでに決定し、特許出願をした(特願平9
−166642号明細書)。該塩基配列に基づきプライ
マーを設計してPCRを行い、Sangerらの方法(DNA se
quencing with chain terminating inhibitors; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,86, 699-703, 1977)に従って変
異が予想される領域の塩基配列を決定した。
【0012】すなわち、豚丹毒菌(Fujisawa株) の莢膜
形成に関与する遺伝子群の塩基配列を基にして作成した
配列表の配列番号1及び2に示すプライマーを用いてP
CRを行った。PCR法の条件は、94℃で1分間、5
5℃で30秒間、72℃で1分間の3ステップを25サ
イクル行った。その結果得られたYS−1株の染色体D
NAの塩基配列の決定は、Sanger, F., Nicksen, S. an
d Coulson, A. R.(1977)DNA sequencing with chain
terminating inhibitors., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 86, 699-703に記載の方法に従い、オリゴヌクレオチ
ドプライマーを作成し、2本鎖の両方向から300〜5
00塩基ずつ決定した。
【0013】33H6株において、トランスポゾンTn
916は、 Fujisawa-SmR 株の莢膜形成遺伝子の塩基配
列の1435番目と1436番目の間に挿入されてい
た。ここで、 Fujisawa-SmR 株の塩基配列は、 Fujisaw
a 株の莢膜形成遺伝子の塩基配列(平成9年特許願第1
66642号明細書参照)と同じである。そこで、この
トランスポゾンTn916挿入部位の遺伝子領域の塩基
配列をYS−1株と Fujisawa 株の塩基配列(平成9年
特許願第166642号明細書参照)とで比較したとこ
ろ、1430番目〜1435番目の6塩基の置換が起き
ていたことが判明した(配列表の配列番号3参照)。こ
のことは、YS−1株の莢膜形成能喪失は、病原性を有
する Fujisawa 株の莢膜形成遺伝子の塩基配列のうちの
6塩基のみが置換されていることに起因することを示す
ものである。
【0014】したがって、この6塩基の置換部分を利用
して設計したプライマーを用いたPCR法により、病原
性を有しないYS−1株を他の菌の中から正確、かつ迅
速に鑑別することが可能である。具体的には、被検菌か
ら常法により抽出したDNAについて、配列表の配列番
号2及び4記載の塩基配列を有するプライマーを用いた
PCR法を行う。PCR法の条件は特に限定されない
が、例えば94℃で1分間、55℃で30秒間、72℃
で1分間の3ステップを25サイクル行えばよい。
【0015】また、YS−1株と Fujisawa-SmR 株の菌
体表層抗原を、モノクローナル抗体を用いて、イムノ・
ブロット法により解析した。その結果、YS−1株は F
ujisawa-SmR 株に見られる17〜27キロダルトンの抗
原を欠失していることが判明した(図2)。このこと
は、この抗原が欠失した株は、生ワクチンとして有効で
ある可能性が高いことを意味している。
【0016】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
る。 実施例1〔YS−1株のマウスに対するワクチン効果〕 7〜9週齢のマウス(メス)60匹を10匹ずつ6区に
わけ、そのうちの5区にYS−1株を第1表に示す量
(約2×108〜2×104個)で皮内接種(免疫)した。
残りの1区については、培地のみを接種し、コントロー
ルとした。その結果、YS−1株を接種した群のマウス
は、いずれも豚丹毒の臨床症状を全く示さなかった。こ
のことから、YS−1株はマウスに対して病原性を有さ
ないことが確認された。
【0017】次に、接種から3週間後、豚丹毒強毒株約
3×103個(約100LD50)による攻撃試験を行い、
攻撃後2週目における生残数を調べ、YS−1株のワク
チン効果を検定した。結果を第1表に示す。
【0018】
【表1】 第1表〔YS−1株のマウスにおける感染防御能〕 ──────────────────────────── 免疫菌量 (cfu) 生残数(匹)/試験数(匹) ──────────────────────────── 2×108 10/10 2×107 10/10 2×106 10/10 2×105 10/10 2×104 10/10 コントロール 0/10 ────────────────────────────
【0019】表から明らかなように、豚丹毒強毒株によ
る攻撃に対し、コントロールのマウスは全てが死亡した
のに対し、YS−1株で免疫されたマウスは全く発病せ
ず、すべて生存した。この結果から、YS−1株のワク
チン効果が証明された。したがって、YS−1株は生ワ
クチン株として有効である。
【0020】実施例2〔PCR法によるYS−1株の鑑
別〕 配列表の配列番号3に示した塩基配列のうち、1430
番目から1435番目の塩基配列を利用して、配列表の
配列番号2及び4に示すPCRのプライマー(それぞれ
プライマーA及びプライマーBとする。)を設計した。
このプライマーを用いてPCR法を行った。供試菌とし
て豚丹毒菌野外株30株を用い、 Galan and Timoney
(1990) の方法あるいはInstaGene (BIO-RAD) に準じた
方法で各菌株からDNAを抽出した。PCR法は、第2
表に示すような組成及び濃度から成る反応液中で、94
℃で1分間、55℃で30秒間、72℃で1分間の3ス
テップを25サイクル実施した。
【0021】
【表2】 第2表〔PCR反応液の組成及び濃度〕 ───────────────────────── 組 成 濃 度 ───────────────────────── KCl 50mM MgCl2 1.0mM Tris−HCl 10mM BSA 10μg/ml dNTP 各0.2mM Triton X-100 0.1% Primer A, B 各1.0μM Taq DNA Polymerase 2.5Units ─────────────────────────
【0022】PCRの結果を図1に示す。図1より、Y
S−1株のDNAのみが目的のサイズに増幅されたのに
対して、他の豚丹毒菌野外株のDNAは増幅されなかっ
たことが分かる。以上の結果から、プライマー設計の基
礎として用いたYS−1株の遺伝子のうち、変異した6
塩基は、YS−1株の生ワクチン遺伝マーカーとして有
効であることが示された。
【0023】実施例3〔YS−1株菌体表層抗原の観
察〕 YS−1株と Fujisawa-SmR 株とを培養後、 Triton X-
100 を用いて菌体表層抗原を可溶化抽出した。その抗原
をSDS−PAGEにより泳動・分離した。その後、常
法によりモノクローナル抗体ER21を用いてイムノ・
ブロット法による抗原解析を行った。結果を図2に示
す。図2より、YS−1株は Fujisawa-SmR 株にみられ
た17〜27キロダルトンの抗原を欠失していることが
分かる。この結果は、この抗原を欠失させた株は生ワク
チン株として有効である可能性が高いことを示唆するも
のである。
【0024】
【発明の効果】本発明に係る豚丹毒菌の莢膜欠損変異株
YS−1株は、病原性が低下しており、しかも病原性
復帰の危惧がなく、遺伝的に安定である。そのため、本
菌は豚丹毒菌感染症に対する生ワクチンとして有効に利
用することが可能である。また、本菌の変異した遺伝子
内の塩基配列を利用してプライマーを設計し、該プライ
マーを用いたPCR法を行うことにより、他の豚丹毒菌
からYS−1株を特異的に鑑別することができる。よっ
て、YS−1株を用いることにより、遺伝学的に病原性
が安定し、かつ信頼度の高い遺伝的マーカーを保有する
豚丹毒菌感染症に対する生ワクチンの実用化を図ること
ができる。
【0025】また、YS−1株が欠損した抗原は、ワク
チン株の表現形質マーカーと成り得ると考えられること
から、この抗原による菌の識別が可能なワクチン株の実
用化が期待される。さらに、YS−1株は、豚丹毒菌感
染症に対する生ワクチンとして利用するばかりでなく、
他の微生物の遺伝子や生理活性物質遺伝子などの外来遺
伝子を組み込んで、他の疾病に対しても免疫効果を付与
するためのベクターとして利用することが可能である。
【0026】
【配列表】
【0027】配列番号:1 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 起源::豚丹毒菌 生物名:Erysipelothrix rhusiopathiae 直接の起源:Erysipelothrix rhusiopathiae Fujisaw
a 株 配列の特徴 特徴を決定した方法:S 配列 TATCTTTGTA GCGGTAGTTG G
【0028】配列番号:2 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 起源::豚丹毒菌 生物名:Erysipelothrix rhusiopathiae 直接の起源:Erysipelothrix rhusiopathiae Fujisaw
a 株 配列の特徴 特徴を決定した方法:S 配列 CAATAAAAGG AAATACCAGT GC
【0029】配列番号:3 配列の長さ:4458 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源:豚丹毒菌 生物名:Erysipelothrix rhusiopathiae 直接の起源:Erysipelothrix rhusiopathiae Fujisaw
a 株 配列の特徴 特徴を表す記号:cps genes 特徴を決定した方法:E 配列 ATC GAT AAA GTG ATT ATT GGT GGT GGT GGC GCA TAT AAT CCC GTA TTG 48 Ile Asp Lys Val Ile Ile Gly Gly Gly Gly Ala Tyr Asn Pro Val Leu 1 5 10 15 CTC GAA GAA ATA CGA ATG ATG TTA CCT GAT GAC ATC ATG GTT TGT ACT 96 Leu Glu Glu Ile Arg Met Met Leu Pro Asp Asp Ile Met Val Cys Thr 20 25 30 CAA GAA GAC CTC GGT TTT TCA AGT GAT GCA AAA GAA GCC ATT GCG TTT 144 Gln Glu Asp Leu Gly Phe Ser Ser Asp Ala Lys Glu Ala Ile Ala Phe 35 40 45 GCA ATA TTG GGT AAT GAA ACA TTG GCG GGC AGG TCA AGT AAT GTG CCA 192 Ala Ile Leu Gly Asn Glu Thr Leu Ala Gly Arg Ser Ser Asn Val Pro 50 55 60 TCT GCA ACA GCT TCG AAA GAA CAT ATG ATC CTT GGT CAA ATC TGC CCA 240 Ser Ala Thr Ala Ser Lys Glu His Met Ile Leu Gly Gln Ile Cys Pro 65 70 75 80 AAC CCG TGG TCA TCA CTA ACA GAA TCA GAT TGA TTCTGTTTTT TTTTATTGTT 293 Asn Pro Trp Ser Ser Leu Thr Glu Ser Asp 85 90 TCTTAACAAT TACTGAAGAC GTCCTATCAA TATTGAATCT AATACGTCAA AATGATATAA 353 TTGACAAGGA TAAATAGGTT ATCTACTGTG TTTTATACAA AATGATTCCA TTGAAACATG 413 ATTCAACCAC TTCAATGGAA TTTATTGTGA TTACACTTTA TCTATAACGT ATTTGATTAC 473 TAAAAATATA AAAATGTTTC TATATGAAAA CGAATTTGTG TTTTACGAGT AGTAGTTAAT 533 AATTAGGAGA AAAT ATG AGT AAA AAT CTA AAG TCA TTA GTA ATT GTG GCT 583 Met Ser Lys Asn Leu Lys Ser Leu Val Ile Val Ala 91 95 100 CTA AAG GGA TTT ATC TTT GTG TTT TTA GCA GCG GTA TTC TTT TAT CTC 631 Leu Lys Gly Phe Ile Phe Val Phe Leu Ala Ala Val Phe Phe Tyr Leu 105 110 115 TTT GGA AAA GAA AAT ATT GCG CTA CAA AAT TGG TCA AGA ACA GCG GTC 679 Phe Gly Lys Glu Asn Ile Ala Leu Gln Asn Trp Ser Arg Thr Ala Val 120 125 130 ATT ACA GGA TCG ACC TTT ATC TTG ATT GGC ATT TTA ATG CTT AAG GTT 727 Ile Thr Gly Ser Thr Phe Ile Leu Ile Gly Ile Leu Met Leu Lys Val 135 140 145 150 TAC GGA CCT TTT GAA ATT GGT GTA AAA AAG AGC AAA CCA ATT ATT TAT 775 Tyr Gly Pro Phe Glu Ile Gly Val Lys Lys Ser Lys Pro Ile Ile Tyr 155 160 165 AAT TCA ACG ATT GCA ATT ATG TTA ACG GAT TTA GCG ACA TTT TTT CAA 823 Asn Ser Thr Ile Ala Ile Met Leu Thr Asp Leu Ala Thr Phe Phe Gln 170 175 180 TTG ATG GTC ATG AAT ACA AAT CCT AAT AAC AAT CAA TCT TTT AAA ATT 871 Leu Met Val Met Asn Thr Asn Pro Asn Asn Asn Gln Ser Phe Lys Ile 185 190 195 GAG CAA TTG GAT TTA TTA TTC TAT ACC ATA CTC ATT CAG ATT ATT GGG 919 Glu Gln Leu Asp Leu Leu Phe Tyr Thr Ile Leu Ile Gln Ile Ile Gly 200 205 210 ATT GTG ATT TTT GCC TAT TTA GGC AAT TAT ATT TAC TTC AAG ATG TAC 967 Ile Val Ile Phe Ala Tyr Leu Gly Asn Tyr Ile Tyr Phe Lys Met Tyr 215 220 225 230 AAG CCG TCT CGT ACT ATT ATT GTA TAT GAT GAA AAC GAC CAA GTG AGT 1015 Lys Pro Ser Arg Thr Ile Ile Val Tyr Asp Glu Asn Asp Gln Val Ser 235 240 245 TTA GGA AAA GTT AAA CAT TAT TTA GAG CGT TTT AAG CTG CAA TAT GAT 1063 Leu Gly Lys Val Lys His Tyr Leu Glu Arg Phe Lys Leu Gln Tyr Asp 250 255 260 ATT TTA GGA TGC ATT GCT GTT GAT GAT CCG AAT TTG GAA GCA ATG CTT 1111 Ile Leu Gly Cys Ile Ala Val Asp Asp Pro Asn Leu Glu Ala Met Leu 265 270 275 TAC AAT GTT GAT TAT GTT GTA ATC TTA GAA ACA CCT ATA AGT GAG CGA 1159 Tyr Asn Val Asp Tyr Val Val Ile Leu Glu Thr Pro Ile Ser Glu Arg 280 285 290 AAA CGT CTG GTT GAT CTT TGT TAC AAG CAT CAA TTA AAT TTC ATG TTT 1207 Lys Arg Leu Val Asp Leu Cys Tyr Lys His Gln Leu Asn Phe Met Phe 295 300 305 310 GCG CCT TCG ATT TCG GAT ATT GTT GAA TTA TCA GGG TTC TCG ATG GTT 1255 Ala Pro Ser Ile Ser Asp Ile Val Glu Leu Ser Gly Phe Ser Met Val 315 320 325 GTC GAT GAT AAG GCT ATG GTT GAG GTA AAT ATT CAA GGT CTA TCT TTC 1303 Val Asp Asp Lys Ala Met Val Glu Val Asn Ile Gln Gly Leu Ser Phe 330 335 340 GAA CAA CGT GTT TTA AAA CGA ATT CTC GAT ATC TTT GTA GCG GTA GTT 1351 Glu Gln Arg Val Leu Lys Arg Ile Leu Asp Ile Phe Val Ala Val Val 345 350 355 GGT GCC ATT TTA TCA TCA CCA ATT TGG ATT ATC GCA GCA ATT GCT ATC 1399 Gly Ala Ile Leu Ser Ser Pro Ile Trp Ile Ile Ala Ala Ile Ala Ile 360 365 370 AAA CTT AAT GAT GGT GGC TCA ATT CTT TTT GTA TTA AAA AGA GCG ACA 1447 Lys Leu Asn Asp Gly Gly Ser Ile Leu Phe VaL Leu Lys Arg Ala Thr 375 380 385 390 ATT GAC GGA CGC ATT TTC GAT GTT TAT AAA TTC AGA ACA ATG AAA GAA 1495 Ile Asp Gly Asp Ile Phe Asp Val Tyr Lys Phe Arg Thr Met Lys Glu 395 400 405 AAT GTT GAA AAT TAT TCT GCT ACA GAG CAT GAT GAC CGA ATC ACA TCA 1543 Asn Val Glu Asn Tyr Ser Ala Thr Glu His Asp Asp Arg Ile Thr Ser 410 415 420 GTT GGA AAG GTT CTT CGT AAA ATT CGT ATG GAT GAA CTT CCC CAA CTC 1591 Val Gly Lys Val Leu Arg Lys Ile Arg Met Asp Glu Leu Pro Gln Leu 425 430 435 ATC AAT ATA CTT AAA GGT GAA ATG AGC ATT GTA GGT CCT CGT CCT GAA 1639 Ile Asn Ile Leu Lys Gly Glu Met Ser Ile Val Gly Pro Arg Pro Glu 440 445 450 ATG CTT GAA AAT GTC GAT TCT TAT CAA AAA GTG TTG CCC GAA TTT GCT 1687 Met Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Gln Lys Val Leu Pro Glu Phe Ala 455 460 465 470 TAC CGC TTG AAG GTT AAA GCA GGC TTA ACA GGT CTA GCG CAG ATC GAG 1735 Tyr Asp Leu Lys Val Lys Ala Gly Leu Thr Gly Leu Ala Gln Ile Glu 475 480 485 GGT AAG TAC AAT ACA TCT CCA AAA GAT AAA CTT CTT ATG GAT CTT ATG 1783 Gly Lys Tyr Asn Thr Ser Pro Lys Asp Lys Leu Leu Met Asp Leu Met 490 495 500 TAT ATA GAA AAC TAT TCA ATT TGG ACT GAT TTT AAA TTA ATC TTA CGC 1831 Tyr Ile Glu Asn Tyr Ser Ile Trp Thr Asp Phe Lys Leu Ile Leu Asp 505 510 515 ACT GTT GTA GTT ATT TTT AAA AAA GAC AGT ACA GAA GGG TTT TAA 1876 Thr Val Val Val Ile Phe Lys Lys Asp Ser Thr Glu Gly Phe 520 525 530 532 ACTCGTTTAA GTCTTAGGGA ATTTATCTTT AAGACTTATT ATTTTATATT ATTTTATTGG 1936 AGGTAATT ATG TAC TAT TTT GCA CTG GTA TTT CCT TTT ATT GTT AGT TTA 1986 Met Tyr Tyr Phe Ala Leu Val Phe Pro Phe Ile Val Ser Leu 533 535 540 545 TTA CCA AAA TTA ACA AAA AAG CAA AAG TTT TAT TTG GCA ACG GTC CCA 2034 Leu Pro Lys Leu Thr Lys Lys Gln Lys Phe Tyr Leu Ala Thr Val Pro 550 555 560 CTT TTT ATT ATC GTA ATT TTT AGA GTA GGT GTA GGT ACA GAT TAT TTT 2082 Leu Phe Ile Ile Val Ile Phe Arg Val Gly Val Gly Thr Asp Tyr Phe 565 570 575 TCC TAT GAG TAT CTC TAT AAT TTA CAA AAC GTA ACA ACG TTT GGG AAA 2130 Ser Tyr Glu Tyr Leu Tyr Asn Leu Gln Asn Val Thr Thr Phe Gly Lys 580 585 590 ATG TTA GAC CAT CAA AGC AAC ATT GAA CTC GGA TTT CGC ATT TTT ATA 2178 Met Leu Asp His Gln Ser Asn Ile Glu Leu Gly Phe Asp Ile Phe Ile 595 600 605 610 TTT ATA TTT AAA TCC ATT GGT TTA CCA TTC CAA TTT TTT ATT GGT TTT 2226 Phe Ile Phe Lys Ser Ile Gly Leu Pro Phe Gln Phe Phe Ile Gly Phe 615 620 625 TTT GGA GCC GTT ACA CTC GGT TTC TTT GTA AAA TGG ATT GAT GAG ACG 2274 Phe Gly Ala Val Thr Leu Gly Phe Phe Val Lys Trp Ile Asp Glu Thr 630 635 640 ACG GAT TCA TCA CTC GTT TCG CTG ATT CTC TTT ATT GGT ATG TTT TTC 2322 Thr Asp Ser Ser Leu Val Ser Leu Ile Leu Phe Ile Gly Met Phe Phe 645 650 655 TTT GTT TGG AAT TTA AGT GCA ATT CGT CAA GGT CTT GTT ATG GCA GTT 2370 Phe Val Trp Asn Leu Ser Ala Ile Arg Gln Gly Leu Val Met Ala Val 660 665 670 GCG TCC TAT TAC TTC TTT AAT CCT CAA AAA AAT CTA TCC AAA AAG CAA 2418 Ala Ser Tyr Tyr Phe Phe Asn Pro Gln Lys Asn Leu Ser Lys Lys Gln 675 680 685 690 TCA ATC TTA CTT GTA GCA GCA CTT GCG CTA TTC CAT ATT TCT GTA TTA 2466 Ser Ile Leu Leu Val Ala Ala Leu Ala Leu Phe His Ile Ser Val Leu 695 700 705 TTC TAC CTA CCG ATT ATA TTC TTA GCA CGC AAC GTT AAA TGG AAT AAA 2514 Phe Tyr Leu Pro Ile Ile Phe Leu Ala Asp Asn Val Lys Trp Asn Lys 710 715 720 AAA ACA CTG ATC ATT GTT CTT GGT ATT TCT TTT GTT TTT GCA TTC ATT 2562 Lys Thr Leu Ile Ile Val Leu Gly Ile Ser Phe Val Phe Ala Phe Ile 725 730 735 CCA TGG CAA CGC GTA CTC ACA CAC CTT CCA TTT ATT CCA GGA TCT AAG 2610 Pro Trp Gln Asp Val Leu Thr His Leu Pro Phe Ile Pro Gly Ser Lys 740 745 750 AAA ATA ATG GGA TAT ATT GAT GCG AAG ACA CAA GTC TTG AAC TTT GCA 2658 Lys Ile Met Gly Tyr Ile Asp Ala Lys Thr Gln Val Leu Asn Phe Ala 755 760 765 770 GGA ATT GTC CGT ATT GCA TTC GCT ACA GTA ATT CTT TAT CAC TAC GAT 2706 Gly Ile Val Arg Ile Ala Phe Ala Thr Val Ile Leu Tyr His Tyr Asp 775 780 785 AAA ATC ACG GAT TCC GTA TTT AAG AAA TTC ATC GTT GAT TCG ACT TTA 2754 Lys Ile Thr Asp Ser Val Phe Lys Lys Phe Ile Val Asp Ser Thr Leu 790 795 800 CTT GGA TTT GCA GTT TAC TTT TGT TTG AAA TTC TCA GAA TTA ATT GCT 2802 Leu Gly Phe Ala Val Tyr Phe Cys Leu Lys Phe Ser Glu Leu Ile Ala 805 810 815 GGT CGA ACA ACG ATT TAT ACG TTT ATT CTC TGC ATC GTC GTA TTC AAA 2850 Gly Arg Thr Thr Ile Tyr Thr Phe Ile Leu Cys Ile Val Val Phe Lys 820 825 830 TAT ATA CTT GAC CAC TAT TTC TTA AAA GAC TCA AAA GTT CTA AAT GGA 2898 Tyr Ile Leu Asp His Tyr Phe Leu Lys Asp Ser Lys Val Leu Asn Gly 835 840 845 850 TTA ATC TAT ACA GGA CTC GCA TGT TTT ACA GGT TTG TTT CTC TAC AAA 2946 Leu Ile Tyr Thr Gly Leu Ala Cys Phe Thr Gly Leu Phe Leu Tyr Lys 855 860 865 GAT ATT AAT GCC TAC ATG CAC CAA TCT AAT TAT CGT GGA CCA AAC AAG 2994 Asp Ile Asn Ala Tyr Met His Gln Ser Asn Tyr Arg Gly Pro Asn Lys 870 875 880 CTA TTA CGA TTT AAC ACA ATT TTC AAT CGT CCG AGC TAT GAT GAT TAT 3042 Leu Leu Arg Phe Asn Thr Ile Phe Asn Arg Pro Ser Tyr Asp Asp Tyr 885 890 895 GAC AAT CGT TTT GCA TAT CTA ACA GTT CGA CGT AAT TGT AAT GAT GAG 3090 Asp Asn Arg Phe Ala Tyr Leu Thr Val Arg Arg Asn Cys Asn Asp Glu 900 905 910 CGC GAT GAG CTT TTA GAT TCT CAA GCC GCG TTA CCT TCA TCT TCA AAG 3138 Asp Asp Glu Leu Leu Asp Ser Gln Ala Ala Leu Pro Ser Ser Ser Lys 915 920 925 930 TAT CAA GAG AAT CTT TCC TAT TAT GCA ATG TGG GAT CAT GAA TCA GAA 3186 Tyr Gln Glu Asn Leu Ser Tyr Tyr Ala Met Trp Asp His Glu Ser Glu 935 940 945 CTG TAT GGA ATT TTA GGA ACC GAT CGA ACT TGG ATT GTA GAA CCG ACC 3234 Leu Tyr Gly Ile Leu Gly Thr Asp Arg Thr Trp Ile Val Glu Pro Thr 950 955 960 TTT AAA CGT AAA CCA ACA GTC TAT GGT TCG CTG GTT GCA TTT ACT CCT 3282 Phe Lys Arg Lys Pro Thr Val Tyr Gly Ser Leu Val Ala Phe Thr Pro 965 970 975 AAT GAT GAC TTA AAA CAA GCT TTT AAA TCT ACA GAG TAT CTT GAT TTA 3330 Asn Asp Asp Leu Lys Gln Ala Phe Lys Ser Thr Glu Tyr Leu Asp Leu 980 985 990 TCG GGT AAA GAA GTC ACC GAA GAA CAC ATT CAA GAA GCT TTA AGC AAG 3378 Ser Gly Lys Glu Val Thr Glu Glu His Ile Gln Glu Ala Leu Ser Lys 995 1000 1005 1010 GAT TCA CTT GAA CGT CAA GAA ATC ACA ACA CAA GCA CTT GAT GTC AAA 3426 Asp Ser Leu Glu Arg Gln Glu Ile Thr Thr Gln Ala Leu Asp Val Lys 1015 1020 1025 TCT TAC GAT GTT GAG AAA CTT CCT GAA AGC ATT GTT AAT ATG TTT CCT 3474 Ser Tyr Asp Val Glu Lys Leu Pro Glu Ser Ile Val Asn Met Phe Pro 1030 1035 1040 TAT AAA GAT GAA ATC ATA AGT GCA AAA TAT GTT GAA TTC AAC AAA CCT 3522 Tyr Lys Asp Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Val Glu Phe Asn Lys Pro 1045 1050 1055 TAT GCC TAC AAG ATT CTA GAT CTT GAA TAC ATT GAT TAT CAT TTC TTT 3570 Tyr Ala Tyr Lys Ile Leu Asp Leu Glu Tyr Ile Asp Tyr His Phe Phe 1060 1065 1070 ATT TAT GTA GAT GAG TCA TTT GAA CCC ATT GTA CCT GTT TTA AGT AAT 3618 Ile Tyr Val Asp Glu Ser Phe Glu Pro Ile Val Pro Val Leu Ser Asn 1075 1080 1085 1090 GAT TTT TAT CGG ATT GCA CCG GAT GGT GTT ATC ACT GTA GAT ACA TAT 3666 Asp Phe Tyr Arg Ile Ala Pro Asp Gly Val Ile Thr Val Asp Thr Tyr 1095 1100 1105 TGT CGT CAA CGC CTT TAC AAT AAA GAT GGT TCT TTA TTG TGG CAA TAT 3714 Cys Arg Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Leu Leu Trp Gln Tyr 1110 1115 1120 1122 TAA GGAGGTCCT ATG AAA GTA CTT TAT TTA AGT TCA ACA AAT TCA GGG ATG 3765 Met Lys Val Leu Tyr Leu Ser Ser Thr Asn Ser Gly Met 1123 1125 1130 1135 CAT CGT CAC AGT ATT TAC TTT GAT CTA CTT TCT GAA TTT CAG AAA AAA 3813 His Arg His Ser Ile Tyr Phe Asp Leu Leu Ser Glu Phe Gln Lys Lys 1140 1145 1150 GGA CAT GAT GTT ACG ATT GCA TAT GCT CGT GAA AAA CGT TTA GGC CAA 3861 Gly His Asp Val Thr Ile Ala Tyr Ala Arg Glu Lys Arg Leu Gly Gln 1155 1160 1165 GAA ACA GAG TAT TAT GAA CAA TTT GGC ATG CAC TAT CTT GGC ATT AAA 3909 Glu Thr Glu Tyr Tyr Glu Gln Phe Gly Met His Tyr Leu Gly Ile Lys 1170 1175 1180 ACT GGA AAT TTA ACG AAA AAT AGT AAT TTA ATT GAT AAA GGC ATC GCA 3957 Thr Gly Asn Leu Thr Lys Asn Ser Asn Leu Ile Asp Lys Gly Ile Ala 1185 1190 1195 ACA CTT CGA ATT GAT TCA CAA TTC AAG AAT GCG CTG AAA AAA CAT CTG 4005 Thr Leu Arg Ile Asp Ser Gln Phe Lys Asn Ala Leu Lys Lys His Leu 1200 1205 1210 1215 GGA CAT GAA TCG TTT GAT CTT ATT CTG TAT TCA ACG CCC CCT ATA ACA 4053 Gly His Glu Ser Phe Asp Leu Ile Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr 1220 1225 1230 CTA CTA AAA ACC GTT AAT TAT CTT AAA ACA AAG AAT CCA AAC GCG TTA 4101 Leu Leu Lys Thr Val Asn Tyr Leu Lys Thr Lys Asn Pro Asn Ala Leu 1235 1240 1245 CTC TAC TTA ATG CTC AAG GAT ATC TTT CCG CAA AAT GCC GTT GAT CTT 4149 Leu Tyr Leu Met Leu Lys Asp Ile Phe Pro Gln Asn Ala Val Asp Leu 1250 1255 1260 GGA TTT ATG AAA GAA ATG GGT TTG ATT CAT CGT TTC TTC TCT CAT AAA 4197 Gly Phe Met Lys Glu Met Gly Leu Ile His Arg Phe Phe Ser His Lys 1265 1270 1275 GAA AAA GCA CTC TAC AAA ATG TTT GAT GTG ATT GGC ACG ATG TCG CCT 4245 Glu Lys Ala Leu Tyr Lys Met Phe Asp Val Ile Gly Thr Met Ser Pro 1280 1285 1290 1295 GCG AAC CTA AAC TAT ATG GAA AAA CAT CAT CCA TCT ACC GTA GGA CGA 4293 Ala Asn Leu Asn Tyr Met Glu Lys His His Pro Ser Thr Val Gly Arg 1300 1305 1310 CTC GAA ATC TTA CCA AAC GCA TTA GAT ATT AAC GAA AAC AAT ACG GCT 4341 Leu Glu Ile Leu Pro Asn Ala Leu Asp Ile Asn Glu Asn Asn Thr Ala 1315 1320 1325 CAT GAC AGC ATT TCC ATT CGT GAG ACG TAT TCC ATT CGT GAT GAC CAA 4389 His Asp Ser Ile Ser Ile Arg Glu Thr Tyr Ser Ile Arg Asp Asp Gln 1330 1335 1340 ACG ATT CTT CTC TAT GGC GGT AAC TTA GGG GCA CCA CAG GCA ATT CCA 4437 Thr Ile Leu Leu Tyr Gly Gly Asn Leu Gly Ala Pro Gln Ala Ile Pro 1345 1350 TTT GTG ATC GAA TGT ATC GAT 4458 Phe Val Ile Glu Cys Ile Asp 1360 1365
【0030】配列番号:4 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 起源::豚丹毒菌 生物名:Erysipelothrix rhusiopathiae 直接の起源:Erysipelothrix rhusiopathiae YS-1株 配列の特徴 特徴を決定した方法:E 配列 GTGGCTCAAT TCTTTTTGTA TT
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例2の結果を示す電気泳動写真である。
【符号の説明】
上部のWild type E. rhusiopathiae strains 及びYS-1
は、それぞれ豚丹毒菌野外株、豚丹毒菌莢膜欠損変異株
YS−1株を示す。また、両端のMはサイズマーカー
(単位:kb)を示し、右下部の矢印は、豚丹毒菌莢膜
欠損変異株 YS−1株のDNA増幅産物の存在を示
す。
【図2】 実施例3の結果を示す電気泳動写真である。
【符号の説明】
上部の数字1、2はレーン1、レーン2を示す。Mはマ
ーカーを示す。レーン1及びレーン2は、それぞれ豚丹
毒菌莢膜欠損変異株 YS−1株及び豚丹毒菌強毒株
Fujisawa-SmR株の菌体表層抗原の解析結果を示す。ま
た、左部の数字は分子量標準(単位:キロダルトン)を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 597169328 新井 啓五 茨城県稲敷郡茎崎町桜が丘18−1 (72)発明者 下地 善弘 茨城県つくば市吾妻4−209−601 (72)発明者 森 康行 茨城県つくば市吾妻2−809−101 (72)発明者 関崎 勉 茨城県つくば市吾妻1−405−202 (72)発明者 新井 啓五 茨城県稲敷郡茎崎町桜が丘18−1 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 39/00 - 39/44 C12N 1/00 - 1/38 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 豚丹毒菌強毒株 Fujisawa-SmR のトラン
    スポゾン変異株に由来し、テトラサイクリン感受性を示
    す豚丹毒菌莢膜欠損変異株 YS−1株(FERM P
    −16466)。
  2. 【請求項2】 請求項1記載の豚丹毒菌莢膜欠損変異株
    YS−1株(FERM P−16466)を豚丹毒菌
    感染症の生ワクチンとして使用する方法。
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