CN100435845C

CN100435845C - 抗猪胸膜肺炎的减毒活疫苗

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Publication number: CN100435845C
Application number: CNB2003801036509A
Authority: CN
Inventors: 豪梅·皮尼奥尔里瓦斯; 塞尔吉·布鲁比尔希利; 昂里克·埃斯普纳马索; 恩里克·克罗尔穆里略
Original assignee: Laboratorios Hipra SA
Current assignee: Laboratorios Hipra SA
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2008-11-26
Anticipated expiration: 2023-11-17
Also published as: ES2233145A1; KR20050062662A; BRPI0316395B1; RU2005118761A; ES2381973T3; CN1713921A; BR0316395A; AU2003288088A1; MXPA05005387A; ATE543511T1; PL376527A1; EP1575610A1; JP2006510612A; WO2004045639A1; DK1575610T3; CA2505869C; US7722882B2; PL212312B1; PT1575610E; ES2233145B1

Abstract

本发明提供了一种获得胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)免疫原性非溶血性菌株的方法，所述菌株在编码所述Apx溶血性和溶细胞性外毒素的跨膜结构域的至少一个apxIA基因片段和任选地一个apxIIA基因片段中被修饰。本发明还包括用所述方法获得的菌株和抗猪胸膜肺炎的减毒活疫苗。

Description

抗猪胸膜肺炎的减毒活疫苗

发明领域

本发明涉及获得适于制备抗猪胸膜肺炎的减毒活疫苗的免疫原性、非溶血性的胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)菌株的方法。

发明背景

胸膜肺炎放线杆菌(以下称为“App”)是导致猪胸膜肺炎的革兰氏阴性细菌，猪胸膜肺炎是一种世界范围内分布的传染病，导致生猪业严重的经济损失。

App最重要的毒力因子是胞外蛋白质，即Apx外毒素。这些外毒素属于孔形成RTX毒素家族，在致病性革兰氏阴性细菌中广泛分布。App中的主要外毒素是ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV。

外毒素ApxI和ApxII是溶血性和溶细胞性的。ApxI显示强溶血性和溶细胞活性，ApxII显示弱溶血性和中等溶细胞活性。

尽管目前筛选的所有血清型均能产生ApxIV，但是其它Apx外毒素的表达有特征性分布。血清型1、5、9和11产生外毒素ApxI和ApxII；血清型10仅产生ApxI；血清型7和12仅产生ApxII；血清型2、3、4、6和8产生ApxII和ApxIII。

相应于外毒素ApxI和ApxII的基因组成操纵子。ApxI外毒素的操纵子含有4个基因：apxIC，apxIA，apxIB和apxID。apxIA基因编码ApxI外毒素本身。基因apxIC编码激活蛋白(酰基转移酶)，其在Apx中导入翻译后修饰(酰化)，使得ApxI获得活性构象，从而能够与宿主特异性细胞受体相互作用。apxIB和apxID基因编码两个膜蛋白，其将成熟ApxI外毒素分泌至外部介质中。

ApxII操纵子仅含有基因A(apxIIA)和基因C(apxIIC)，它们分别编码ApxII和负责ApxII获得活性构象的酰基转移酶。还存在一个小片段，其显示与apxIB基因有某些相似性，但是它不产生功能蛋白。成熟ApxII向外部介质的输出是通过apxIB和apxID基因编码的蛋白质的作用进行。

本发明的接种方法不提供抗所有App血清型的完整保护。

专利申请WO97/16532A1描述了能够在动物中诱导免疫应答的疫苗株的构建，其包括一种产生由于部分缺失所致的部分或完全失活的Apx毒素的修饰的微生物。这种缺失通过结构基因apxIA的诱导诱变和/或apxIIC激活物基因的部分缺失所致。其不修饰跨膜区。

专利EP810283A2描述了通过修饰apxIC基因使之不产生功能形式的激活蛋白并且不能通过酰化激活毒素而构建App疫苗株。其也不修饰跨膜区。

Jansen等人(Infection and Immunity 63：7-37(1995))描述了通过定点诱变产生App同源重组体。这些突变体存在通过插入CMr基因而失活的apxIA基因和通过TETr基因插入而失活的apxIIA基因。

Tascon等人(Molecular Microbiology 14：207-216(1994))描述了两个App突变体。它们中的一个在基因apxIBD中有一破坏，另一个在结构基因apxIA中有一破坏。

Reimer等人(Microbial Pathogenesis 18：197-209(1995))描述了一种App无毒突变体，其通过化学诱变具有影响操纵子apxIABCD的重要部分的缺失。这一突变体不合成ApxI毒素，但是能合成ApxII，但不从细胞分泌。

不表达ApxI和ApxII外毒素的菌株不能被用作减毒疫苗，因为它们不诱导保护性免疫应答，这是因为ApxI和ApxII外毒素是App的最重要的毒力决定簇之一。

Prideaux(The 16^th International Pig Veterinary Society Congress，Melbourne(Australia)17-20^th September 2000，pag.439-442)描述了从具有失活apxIIC基因的菌株制备的疫苗，其分泌和表达未激活的ApxII毒素，因此不能附着于靶细胞。

所以，本发明背景中描述的基于不具溶血能力的App菌株的减毒活疫苗的免疫保护性较差，因为它们在其结构中有修饰，使得它们不能附着于靶细胞的膜受体。另外，它们不能产生抗ApxI和/或ApxII毒素的抗体，因为它们不被细胞分泌。Frey等人，(Gene 142：97-102(1994))描述了来自一种血清型I菌株的ApxI外毒素的氨基酸序列，Smith等人(Infection and Immunity 59：4497-4504(1991))描述了血清型9菌株的ApxII外毒素的氨基酸序列。

发明概述

本发明人发现了一种从App毒性菌株获得免疫原性的非溶血性App菌株的方法，该免疫原性非溶血性App菌株在编码Apx溶细胞性和溶血性外毒素的跨膜结构域的apxIA基因的至少一个片段(SEQID NO：1)和任选地在apxIIA基因的一个片段(SEQ ID NO：2)中被修饰。

这一菌株没有溶血性活性，但是其免疫保护活性保持不变，其适于制备抗猪胸膜肺炎的减毒活疫苗。

ApxI和ApxII外毒素的跨膜结构域在靶细胞膜的孔形成中起重要作用。一旦形成了孔，会产生渗透压失衡，最终导致靶细胞的溶解。

令人惊奇地，现在发现可以以低剂量给予用含有不具溶血活性的ApxI和ApxII毒素并含有获得强免疫应答所需的所有抗原的这些App修饰菌株制备的减毒活疫苗。

本发明的目的是提供一种从毒性App菌株获得免疫原性的非溶血性App菌株的方法，所述免疫原性的非溶血性App菌株在编码Apx溶血性和溶细胞性Apx外毒素的跨膜结构域的apxIA基因的至少一个片段和任选地在apxIIA基因的一个片段中被修饰。

另外，本发明的另一方面为用本发明方法获得的菌株以及由其制备的疫苗。

本发明的第三个方面涉及在Colección

de Cultivos Tipo保藏的App菌株，其保藏号为CECT 5985和CECT 5994。

附图描述

图1

图1显示出用ClustalX程序(Thompson et al；Nucleic acidResearch 24：4876-4882(1997))在来自血清型1菌株的ApxI(Frey et al；Gene 142：97-102(1994))和来自血清型9的ApxII(Smits et al；Infection& Immun.59：4497-4504(1991))的氨基酸序列之间进行的对比。在本图中，仅包括了ApxI的第1-594位氨基酸和ApxII的第1-590位氨基酸的序列。在对比中框出了下列区域：H1(第233-253位氨基酸)，H2(第296-315位氨基酸)和H3(第369-405位氨基酸)。这些区域分别相应于两个Apx中存在的3个跨膜结构域。

图2

图2示出了获得杂种质粒pApxIΔH2和pApxIIΔH2的步骤示意图。首先，通过用限制酶EcoRI和BglII酶切质粒pGP704(Miller andMekalanos；J.Bacteriol.170：2575-2583(1988))随后与寡核苷酸pGP5′和pGP3’连接而获得pGP1质粒。这一质粒含有质粒R6K的无性复制起点(OriR6K)和质粒RP4的结合转移起点(OriTP4)以及氨苄青霉素抗性基因(Bla)。质粒pGPl用限制酶PstI酶切并与来自质粒pUC4K的携带卡那霉素抗性基因(Km^r或Kan)的PstI片段连接，产生质粒pGP2。这一质粒先去磷酸化并用限制酶EcoRI消化，之后插入3个PCR扩增片段，即启动子ptac，融合体atpE/GEPUV的编码区(E.coli aptE与绿色荧光蛋白的紫外线变体融合的核糖体编码区)和rrnB转录终止子。所得质粒命名为pGP3。在这一质粒中插入编码apxI和apxII基因的第2个跨膜螺旋的5’和3’侧翼区(经PCR扩增)，分别形成质粒pApxIΔH2和pApxIIΔH2。

图3

图3分为3组：A组显示出千碱基规格的限制酶谱和来自App基因组的操纵子apxI中的基因的分布。apxI基因以浅灰色示出，其是不同重组事件的靶，相邻基因apxIC、apxIB和apxID以深灰色示出。用斜条绘出质粒pApxIΔH2的不同基因或区域。apxIA的跨膜螺旋的编码区(H1、H2和H3)用黑色示出。图2质粒中的名称和一些详细结构已被简化。因此gfpUV包含ptac启动子和atpE/GFPUV融合体；OriV表示R6K无性复制起点，OriT代表RP4的接合转移起点。在(1)和(3)中示出了用酶XhoI获得的限制酶谱和App基因组的操纵子ApxI的基因分布。在(2)中，示出了在将质粒pApxIΔH2插入App基因组后同一操纵子的限制酶谱。这一插入是通过在置于质粒pApxIΔH2中的H2的5’侧翼区与App基因组之间的一独特同源重组事件而发生的。

图3的B组示出ApxI基因探针与用XhoI消化的基因组DNA的southern转移物的杂交结果，该基因组DNA得自以下收集物：1)HP816N1^r；2)通过将质粒pApxIΔH2插入App基因组获得的重组体(HP816R1)，该插入是通过在H2的5’侧翼区之间的一独特同源重组事件而发生的；3)得自HP816R1的重组体，其回复了亲本菌株HP816N1^r的相同表型；4)得自HP816R1的重组体，其回复了亲本菌株HP816N1^r的相同表型，但例外是其显示与HP816R1的相同溶血活性(AppApxIH2^-)。

C组显示了用B组描述的相同培养物(1，2，3和4)接种的菌落与来自血清型7App培养物(5)的另一个菌落。这些菌落接种在补加0.004％NAD的Columbia血琼脂平板(CA)或补加25微克/mL卡那霉素的TSYN平板(TS)上。在CA中可见培养物1和3菌落的周围存在大溶血圈，在培养物2、4和5的菌落周围存在小溶血圈。

图4

图4分为3组：A组示出了限制酶谱(kb)和位于App基因组中的操纵子apxII中的基因的分布。ApxII基因以浅灰色示出，其是不同重组事件的靶，相邻基因apxIIC、apxIIB以深灰色示出。用斜条绘出质粒pApxIIΔH2的不同基因或区域。apxIIA的跨膜螺旋的编码片段(H1、H2和H3)用黑色示出。用酶EcoRI获得的限制酶谱和App基因组的ApxII操纵子基因的分别示于(1)和(3)中。在(2)中，示出了插入质粒pApxIIΔH2后同一操纵子的限制酶谱。这一插入是通过在置于质粒pApxIIΔH2中的H2的3’侧翼区与App基因组之间的一独特同源重组事件而进行的。在(4)中，示出在经过位于App基因组中的H2的5’侧翼区的第2次重组后分离出(2)中插入的质粒后的操纵子的限制酶谱。

B组示出ApxII基因探针与用EcoRI消化的基因组DNA的Southern转移物的杂交结果，该基因组DNA得自以下培养物：1)HP816N1^r；2)通过将质粒pApxIIΔH2插入App基因组获得的重组体(HP816R2)，该插入是通过在H2的5’侧翼区之间的一独特同源重组事件而发生的；3)得自HP816R2的重组体，其回复了亲本菌株HP816N1^r的相同表型；4)得自HP816R2的重组体，其回复了亲本菌株HP816N1^r的相同表型，但例外是其显示与HP816R2的相同溶血活性(AppApxI/IIH2^-)。

C组显示了用B组描述的相同培养物(1，2，3和4)接种的菌落。这些菌落接种在补加NAD的Columbia血琼脂平板(CA)或补加25微克/mL卡那霉素的TSYN平板(TS)上。可见培养物1和3菌落的周围存在小溶血圈，在培养物2和4的菌落周围不存在溶血圈。在TS中，培养物1、3和4的生长不可见。

图5

图5示出3条生长曲线图，黑色符号代表以1小时为间隔的不同培养物在600nm的吸收值(左边y轴)，同时，在相同的时间间隔从培养物上清取若干样品。这些样品保持在0℃，直至其在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中1/50稀释。然后将稀释液置于微孔中，以使用特异于每个Apx的单克隆抗体经ELISA定量ApxI和ApxII的存在。根据每个测试样品在405nm的吸收值(右边y轴)绘制曲线，代表随时间每种Apx的积累(空心符号)。在(A)中，HP816N1^r培养物(三角形)和AppAxpIH2^-培养物(圆形)空心符号代表ApxI积累。在(B)中，HP816N1^r培养物(三角形)和AppAxpI/IIH2^-培养物(圆形)空心符号代表ApxII积累。在(C)中，HP816RI培养物(三角形)和HP816R2培养物(圆形)示出ApxI的积累，空心圆示出ApxII的积累。

图6

(A)组示出具有在5小时从1)HP816N1^r；2)AppApxIH2^-；3)得自App血清型4的对照(App血清型4产生和分泌105kD的ApxII和115kD的ApxIII，但不分泌ApxI)所取的培养物上清样品和4)分子量标记(示出了110kD和120kD的相关条带)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯蓝染色。在(B)中，我们可以观察到用特异于ApxI的单克隆抗体检测的具有与凝胶(A)相同的样品的凝胶的Western印迹。在(C)中，我们可以观察到除了第2道含有AppApxI/IIH2^-培养物上清的样品之外其余与凝胶(A)相同的样品的凝胶的Western印迹。没有示出该凝胶的照片，因为其条带分布与凝胶(A)中显现的一样。用特异于ApxII的单克隆抗体揭示这一转移。观察到第3道的105kD的条带看起来仅在(C)中检测到。

发明的详细描述

本发明涉及一种从毒性App获得免疫原性非溶血性胸膜肺炎放线杆菌菌株的方法，其特征在于如下步骤：

-确定Apx溶血性和溶细胞性外毒素的跨膜结构域；

-修饰编码溶血性和溶细胞性Apx外毒素的跨膜结构域的apxIA基因的至少一个片段和任选地apxIIA基因的一个区段。

术语免疫原性是指用本发明方法获得的App菌株保持其免疫保护能力未变，这意味着其含有在宿主中获得高免疫原性应答而免疫学上所需的所有抗原。

术语非溶血性是指用本发明方法获得的App菌株不具有溶血活性，是无毒菌株。

得自患病的被感染动物的App毒性菌株的选择根据本领域技术人员已知的常规方法进行。

第一步为如Ludwig et al.；Mol.Gene.Genet.226：198-208(1991)针对E.coli所述，鉴别App溶血性和溶细胞性Apx外毒素的跨膜结构域，这使用分析溶血性和溶细胞性Apx外毒素的氨基酸序列的TransMem程序(Aloy et al；Comp.Appl.Biosc.13：213-234(1997))或Helixmem(Eisenbeg et al.；J.Mol.Bio.179：125-142(1984))。

第二步为修饰编码Apx溶血性和溶细胞性外毒素的跨膜结构域的apxIA基因的至少一个区段和任选地apxIIA基因的一个区段。

术语“修饰”是指通过用常规DNA重组技术包括一个或几个核苷酸的取代、一个或几个核苷酸的插入、基因的部分或全部缺失或者通过化学或辐射诱导的诱变的破坏而修饰基因。

在一个优选的实施方案中，修饰是通过在编码溶血性和溶细胞性Apx外毒素的跨膜结构域的apxIA基因的至少一个区段和任选地apxIIA基因的一个区段进行缺失而进行。

存在于apxIA和apxIIA基因中的溶血性和溶细胞性外毒素的跨膜结构域用上述Transmen和Helixmem程序进行检测。基于溶血性和溶细胞性外毒素ApxI和ApxII的氨基酸序列进行的预测表明跨膜结构域在外毒素序列的下列区域中发现：

-第一个跨膜结构域H1：在第233-253位氨基酸之间，相应于apxI的第697-759位核苷酸。

-第二个跨膜结构域H2：在第296-315位氨基酸之间，相应于apxI的第886-945位核苷酸。

-第三个跨膜结构域H3：在第369-405位氨基酸之间，相应于apxI的第1105-1215位核苷酸。

在一个优选的实施方案中，所述修饰通过在编码App的外毒素ApxI的第二个跨膜结构域的apxIA基因区段中进行缺失而进行。

优选地，所述修饰通过缺失编码App ApxI外毒素的第二个跨膜结构域的apxIA基因的第886-945位核苷酸而进行。

本发明方法的另一个优选实施方案进一步引入了额外的在编码App的ApxII外毒素的第二个跨膜结构域的apxIIA基因区段中的缺失。优选地缺失编码App ApxII外毒素的第二个跨膜结构域的apxIIA基因的第886-945位核苷酸。

在实施例部分详细描述的本发明的一个优选实施方案中，使用包括如下步骤的方法获得免疫原性非溶血性App菌株：

A-选择App毒性菌株。

B-预测ApxI和ApxII蛋白的跨膜结构域的α螺旋以涉及一种核苷酸构建体，该构建体使得在两个蛋白质的第二个跨膜结构域有缺失但不影响折叠过程以及所产生的溶血宿与膜特异性受体相互作用的能力。

C-构建克隆载体，其能整合进App基因组并含有能以有效方式监控这种载体的整合的标记基因。

C1-构建杂合质粒pGP3，其具有复制起点RK6，RP4转移起点和卡那霉素抗性基因。另外，还包括了在启动子ptac和终止子rrnB的控制下的荧光蛋白GPVUV基因(以下称为GFP)。多克隆位点也被修饰以便于后来DNA序列的插入。

C2.构建杂种克隆载体，其含有apxIA基因编码的第二个跨膜螺旋的5’和3’侧翼序列。因此，构建杂种质粒pApxIΔH2以选择和克隆apxIA基因中与编码第二个跨膜螺旋的区段的5’和3’末端相邻的这种片段。使用这一质粒作为最终载体以转化App。

C3.构建杂种克隆载体，其含有apxIIA基因编码的第二个跨膜螺旋的5’和3’侧翼序列。因此，构建杂种质粒pApxIIΔH2以选择和克隆apxIIA基因中与编码第二个跨膜螺旋的区段的5’和3’末端相邻的这种片段。使用这一质粒作为最终载体以转化App。

D.构建重组细菌，其已经解离了(resolved)插入基因组中的杂种质粒。

D.1构建称为HP816R1的App重组菌株，其中杂种质粒pApxIΔH2通过在所述质粒与App HP816N1^r的基因组之间的一独特同源重组事件而掺入App基因组，所述App HP816 N1^r是一种得自App HP816菌株的自发突变体的抗萘啶酮酸菌株。

D.2使用如下程序构建菌株AppApxIH2^-，该程序使得在鉴别了步骤1中获得的重组细菌后能通过第二次同源重组而解离整合在基因组中的重组载体，并且能检测和分离由于这一第二次重组而实现了apxIA基因部分缺失的菌株。

D.3构建App HP816R2重组菌株，其中杂种质粒pApxIIΔH2通过在所述质粒与AppApxIH2^-基因组之间的一独特同源重组事件而掺入AppApxIH2^-基因组。

D.4使用如下程序构建AppApxI/IIH2^-菌株，该程序使得在鉴别了步骤D.3中获得的重组细菌后能通过第二次同源重组事件而解离整合在基因组中的重组载体，并且能检测和分离由于这一第二次重组而获得了apxIIA基因部分缺失的细菌。

在本发明中，获得的突变体AppApxIH2^-与原始的野生型App菌株相同，除了缺失了apxIA基因的编码序列的第886-945位(包括两个端点)核苷酸，其相应于在产生的ApxI中缺失了第296-315位(包括两个端点)氨基酸。

在本发明中，获得的突变体AppApxI/IIH2^-与菌株AppApxIH2^-相同，除了缺失了apxIIA基因的编码序列的第886-945位(包括两个端点)核苷酸，其相应于在产生的ApxII中缺失了第296-315位(包括两个端点)氨基酸。

在本发明的优选的实施方案中，在App基因组中产生的唯一修饰是在基因apxIA和apxIIA的编码序列内缺失了60个碱基对，并且用限制位点取代这些碱基对，在本例中限制位点分别相应于XhoI和EcoRI。在App基因组中没有额外插入来自质粒的DNA(例如卡那霉素抗性基因)。这使得可以用进行第一次修饰所用的相同策略对所获得的菌株在同一基因继续进行修饰或者在另一个靶基因中进行修饰。另一方面，其避免了所得菌株具有对多种抗生素的抗性，这是用作活疫苗的菌株的一个期望特征。

本发明所用的限制位点不是关键的。尽管可以使用不引入限制位点的构建体，但优选的是应用限制位点，从而有一额外机制来检测希望的重组克隆并能进行所获得菌株的稳定性的跟踪。因此，可以使用任何位点，只要其不引入蛋白质合成的终止密码子，并且产生具有可能先前存在于App基因组中的侧翼限制片段的可经电泳分析的限制片段(即大于100碱基对)。

本发明还涉及经上述方法获得的App菌株。

本发明的另一目的是根据1977年4月28日的布达佩斯条约保藏在Colección

de Cultivos Tipo(西班牙普通微生物保藏中心)的保藏号为CECT5985的一个App菌株或其突变体，所述菌株特征在于其在编码ApxI外毒素的第二个跨膜结构域的apxIA基因的第886-945位核苷酸有缺失。

本发明的另一目的是根据布达佩斯条约保藏在Coleccion Espanolade Cultivos Tipo(西班牙普通微生物保藏中心)的保藏号为CECT5994的一个App菌株或其突变体，所述菌株特征在于其缺失了编码ApxI外毒素的第二个跨膜结构域的apxIA基因的第886-945位核苷酸并且还缺失了编码ApxII外毒素的第二个跨膜结构域的apxIIA基因的第886-945位核苷酸。

本发明还涉及用于保护动物抗猪胸膜肺炎的疫苗。这些疫苗可以根据本领域技术人员已知的常规方法制备。

这些疫苗包含免疫学有效量的根据本发明所述方法获得的活App减毒株细菌。免疫学有效量是指接种给予的细菌量足以在宿主中诱导有效的抗App毒性菌株导致的感染。

所用剂量根据待免疫动物的年龄和体重以及给药形式而确定。

疫苗可以含有足以诱导免疫应答的任何细菌剂量。合适的剂量范围为10³-10¹⁰。

疫苗还可含有药物学可接受的赋形剂。这种赋形剂可以仅仅是水，但其也可包含细菌所生长的培养液或具有生理学浓度的盐溶液。

用于本发明的药物学可接受的赋形剂的另一个例子包括稳定剂，碳水化合物(即葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇)和缓冲液(即磷酸盐缓冲液)。

任选地，疫苗中可加入其它佐剂成分。这些佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，其增强宿主对抗病原性入侵者的免疫应答。佐剂的例子为维生素E和植物油。

疫苗可以通过鼻内、真皮内、皮下、喷雾或肌肉内途径给予动物。

本发明的产业上的应用可以从说明书中容易地推导出。值得提及的是猪胸膜肺炎是世界范围的传染性呼吸道疾病，导致生猪业严重的经济损失，本发明的获得免疫原性非溶血性App菌株的方法使得可以制备有效的疫苗对抗猪胸膜肺炎。

下述实施例意在为本领域技术人员提供足够清楚和完整的对本发明的解释，但是它们不能被认为是对本说明书上述关键方面的限制。

实施例

以下应用的技术和DNA重组方法在Sambrook and Russell(分子克隆实验手册第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2001))和Ausubel等人；Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyand Sons，Inc.(1998)中有详细描述。所有PCR产物均预先克隆在pBE质粒中，之后用限制酶消化。这一质粒是pBluescript SK2(Stratagene)载体的衍生物，其中多克隆位点由一小段核苷酸序列取代，其仅包括限制酶EcoRV的位点。

E.coli XL1-blue菌株(Stratagene)用作基于质粒pUC118或pBluescript SK的杂种载体的宿主。E.coli S17-1λpir菌株(Simon et al；Biotechnology 1：784-791(1983))用作基于质粒pGP704的杂种质粒的宿主。

除非特别指出下述所有寡核苷酸均以有义5’至3’顺序表示。在所有PCR反应中，使用具有测试校正活性的Deep Vent热聚合酶(NewEngland Biolabs)。

A.毒性App菌株的选择

选择HP816菌株作为野生型App菌株，该菌株相应于属于Hipra实验室公司(Amer-Girona-Spain)的一种天然1型血清型App。

菌株HP816N1r是得自野生型HP816的一自发突变株的抗萘啶酮酸菌株。

B.外毒素ApxI和ApxII的跨膜结构域的鉴别

如Ludwig et al.；Mol.Gene.Genet.226：198-208(1991)针对E.coli所述，将TransMem程序(Aloy et al；Comp.Appl.Biosc.13：213-234(1997))或Helixmem(Eisenbeg et al.；J.Mol.Bio.179：125-142(1984))应用于来自血清型1菌株(Frey et al；Gene142：97-102(1994))的ApxI和血清型9(Smits et al；Infection andImmunity 59：4497-4504(1991))的ApxII的氨基酸序列而确定采取α-螺旋结构的3个跨膜结构域。这些程序在两个蛋白质中检测到可以作为跨膜螺旋的3个区域(图1)：第1个跨膜区域位于氨基酸233-253之间(H1)；第2个跨膜区位于氨基酸296-315之间(H2)；第3个跨膜区位于氨基酸369-405之间(H3)，它们全部来自ApxI。

C.能够整合进App基因组的杂种克隆载体的构建

图2中，我们可以看见本段落描述的质粒的图谱。

C.1.重组质粒pGP3的构建

用限制酶BglII和EcoRI同时切割质粒pGP704(Miller andMekalanos；J.Bact.170：2575-2583(1988))。用琼脂糖凝胶电泳分离到一个3.7kb DNA片段。这一片段在一连接反应中与寡核苷酸pGP5’(GAT CGA ATT CAG GAT ATC ACA GAT CT)(SEQ ID NO：3)和pGP3’(ATT TAG ATC TGT GAT ATC GTG AAT TC)(SEQ ID NO：4)。获得的重组质粒命名为pGPl。

用限制酶PstI消化质粒pGPl。用琼脂糖凝胶电泳分离3.12kbDNA片段。这一片段与用限制酶PstI消化pUC4K质粒(Pharmacia)而获得的1.2kb片段连接。如此获得的重组质粒命名为pGP2。

使用质粒pMAL-p2(New England Biolabs)，经PCR扩增相应于启动子ptac的序列，PCR使用ptac5’寡核苷酸引物(GAA TTC AATGCT TCT GGC GTC AG)(SEQ ID NO：5)和ptac3’(GGTACC GGATGA GAT AAG ATT TTC)(SEQ ID NO：6)，这两个引物分别在其5’末端含有限制位点EcoRI和KpnI。还是从质粒pMAL-p2经PCR扩增相应于操纵子rrnB的rho不依赖性终止子，PCR使用引物寡核苷酸rrnB5’(GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC)(SEQ ID NO：7)和rrnB3’(GAA TTC AAG AGT TTG TAG AAA CGC)(SEQ ID NO：8)，这两个引物分别在其5’末端含有限制位点KpnI和EcoRI。DNA扩增片段的大小包含278碱基对(bp)。

用质粒pAG408(Suarez et al；Gene 196：69-74(1997))扩增GFPUV蛋白的基与连接于atpE基因的核糖体的一个区域的融合蛋白，扩增使用引物寡核苷酸GFP5’(GGT ACC TAA TTT ACC AAC ACTAC)(SEQ ID NO：9)和GFP3’(GGT ACC TTA TTT GTA GAG CTCATC)(SEQ ID NO：10)，这两个引物在其5’末端含有限制位点KpnI。扩增的片段大小为830bp。

用限制酶KpnI和EcoRI消化前两个片段(启动子ptac和终止子rrnB)，用限制酶KpnI消化第3个片段(融合体atpE-GFPUV)。以此方式获得的3个片段与预先去磷酸化并用限制酶EcoRI切割的质粒pGP2连接。在所获得的不同重组质粒中，选择携带如图2所示排列的3个片段的质粒。携带这一质粒的菌落在曝光于紫外光时显示出强荧光。如此获得的杂种质粒称为pGP3。

C.2-杂种质粒pApxIΔH2的构建

在这一阶段，第一个目的是获得相邻于apxIA基因的第二个跨膜螺旋的编码片段的5’末端的DNA片段。因此，用各自在其5’末端编码限制位点EcoRV和XhoI的ApxIa5’寡核苷酸(GAT ATC ATG GCTAAC TCT CTC AGC TCG ATA G)(SEQ ID NO：11)和ApxIa3’(CTC GAG GCC TGC CGC CAC ACG TTG)(SEQ ID NO：12)作为引物经PCR从App菌株HP816的纯化的基因组DNA扩增897bp的片段。寡核苷酸ApxIa5’(SEQ ID NO：9)的第7个碱基相应于apxIA基因的翻译起始密码子的第1个碱基。寡核苷酸ApxIa3’(SEQ ID NO：10)的第7个碱基互补于apxIA基因编码序列的第885位碱基，后者是第二个跨膜螺旋的序列起始之前的最后一个碱基。

这一阶段的第二个目的是获得相邻于apxIA基因的第二个跨膜螺旋的编码区段的3’末端的DNA片段。因此，用各自在其5’末端包括限制位点XhoI和BglII的寡核苷酸ApxIb5’(CTC GAG CCG CTTTCG TTC TTAAAT GTT GCG)(SEQ ID NO：13)和ApxIb3’(AGA TCTTCA CCG GCT TTC TGT GCA CTT TG)(SEQ ID NO：14)作为引物经PCR从App菌株HP816的纯化的基因组DNA扩增1042bp的片段。寡核苷酸ApxIb5’(SEQ ID NO：13)的第7个碱基相应于apxIA基因的编码序列的第946位碱基，其为第二个跨膜螺旋的序列末端之后的第1个碱基。寡核苷酸ApxIb3’(SEQ ID NO：14)的第7个碱基互补于apxIA基因编码序列的第1975位碱基。

一旦获得上述两个片段后，用限制酶EcoRV和XhoI消化第1个片段，用酶XhoI和BglII消化第2个片段。随后将两个片段与预先用限制酶EcoRV和BglII切割的载体pGP3连接。得到的杂种质粒命名为pApxIΔH2。

C.3-杂种质粒pApxIIΔH2的构建

在这一阶段，第一个目的是获得相邻于apxIIA基因的第二个跨膜螺旋的编码区段的5’末端的DNA片段。因此，用各自在其5’末端编码限制位点EcoRV和EcoRI的寡核苷酸ApxIIa5’(GAT ATC AAATCG TCC TTA CAA CAA GGA TTG)(SEQ ID NO：15)和ApxIIa3’(GAA TTC ACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC)(SEQ ID NO：16)作为引物经PCR从App菌株HP816的纯化的基因组DNA扩增871bp的片段。寡核苷酸ApxIIa5’(SEQ ID NO：15)的第7个碱基相应于apxIIA基因编码序列的第27个碱基。寡核苷酸ApxIIa3’(SEQ IDNO：16)的第7个碱基互补于apxIIA基因编码序列的第885位碱基，其是第二个跨膜螺旋的序列起始之前的最后一个碱基。

这一阶段的第二个目的是获得相邻于apxIIA基因的第二个跨膜螺旋的编码区段的3’末端的DNA片段。因此，用各自在其5’末端包括限制位点EcoRI和BglII的寡核苷酸ApxIIb5’(GAA TTC CCT CTTTCA TTC TTA AAT GTA GC)(SEQ ID NO：17)和ApxIIb3’(AGA TCTGCC ATC AAT AAC GGT AGT ACT TG)(SEQ ID NO：18)作为引物经PCR从App菌株HP816的纯化的基因组DNA扩增952bp的片段。寡核苷酸ApxIIb5’(SEQ ID NO：17)的第7个碱基相应于apxIIA基因的编码序列的第946位碱基，后者为第二个跨膜螺旋的序列末端之后的第1个碱基。寡核苷酸ApxIIb3’(SEQ ID NO：18)的第7个碱基互补于apxIIA基因编码序列的第1845位碱基。

一旦获得上述两个片段后，用限制酶EcoRV和EcoRI消化第1个片段，用酶EcoRI和BglII消化第2个片段。随后将两个片段与预先用限制酶EcoRV和BglII消化的载体pGP3连接。得到的杂种质粒命名为pApxIIΔH2。

D.解离了插入基因组中的杂种质粒的重组细菌的构建

D.1App重组菌株HP816R1的构建

用杂种质粒pApxIΔH2转化App是通过与携带这一质粒的E.coliS17-1λpir细胞的接合而进行。用杂种质粒pApxIΔH2转化菌株HP816N1^r。

在进行接合前，获得这些细菌的静止期培养物。用培养基TSYN(Soya Tryptic broth 30g/L，酵母膏6g/L，灭菌后补加0.004％NAD)和萘啶酮酸(50微克/mL)培养HP816N1^r。

培养基LB(胰胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L)灭菌后补加25微克/mL卡那霉素，用于培养E.coli S17-1λpir。达到静止期后，将0.2-0.3 A₆₀₀单位的App培养物和0.6-0.8 A₆₀₀单位的E.coli培养物加入到10mM MgSO₄溶液中。接着以15,000g离心2分钟，如此获得的沉淀重悬于200微升10mM MgSO₄溶液中。两个培养物混合完毕后，将其加到预先置于含有补加15g/L Noble琼脂的TSYN培养基的Petri培养皿上的2.5cm×0.45μm硝酸纤维素滤膜上。在37℃保温6小时后，具有接合子的滤膜置于含有2mL PBS(Na₂HPO₄ 10mM。KH₂PO₄ 1mM，NaCl 137mM，KCl 2mM pH7.4)的试管中，剧烈振荡后，取出滤膜，细胞悬液在15,000g下离心2分钟，沉淀重悬于500微升PBS中。如此获得的悬液分配进含有补加15g/L Noble琼脂、50微克/mL卡那霉素和50微克/mL萘啶酮酸的TSYN培养基的Petri培养皿中，每个Petri培养皿加入100微升细胞悬液。得到的培养物在37℃保温24-36小时。经这一程序，用质粒pApxIΔH2接合获得65个抗卡那霉素和萘啶酮酸的菌落，相当于转化频率为1.3×10^-7/受体细胞。

将几个菌落通过接种环划线(exhaustion of the loop)而重新接种在含有补加15g/L Noble琼脂、0.004％NAD、50微克/毫升卡那霉素和50微克/毫升萘啶酮酸的LP的Petri培养皿中。所有产生的菌落在暴露于紫外光时均显示明显程度的荧光，这表明在一个独特的重组事件中质粒整合进App基因组中。如图3所示，如果发生二次重组，接合后体将不能在含卡那霉素的培养基中生长。在平板中存在这一抗生素使得只有在其基因组中整合完整质粒的重组体能够生长。指示基因GFP使得能够区分抗卡那霉素的菌落是否是自发突变的产物。

最后，获得的重组体来自质粒和apxIA基因之间的同源重组，这通过在补加0.004％NAD的Columbia血琼脂板中观察到重组体的溶血活性而证实(图3，C组)。用质粒pApxIΔH2获得的重组体显示出与亲本菌株HP816N1^r相比降低许多的溶血圈直径。

选择一个用质粒pApxIΔH2获得的重组体进行后续传代并称为HP816R1。

D.2菌株AppApxIH2^-的构建

一旦获得了质粒pApxIΔH2整合进基因组中的重组体，重要的是通过第二次重组固定App基因组中的缺失。因此，将前阶段获得的一个重组体在仅补加萘啶酮酸的培养基中进行系列传代。不含卡那霉素的培养基使得当App基因组和整合的质粒之间发生第二次重组时，所得的细菌能够存活。这一第二次重组事件产生两种不同的基因型显现。当重组发生在第一次重组所发生的相同区段中时，获得的基因型将与D.1段中使用的亲本菌株相同。如果第二次重组发生在不是发生第一次重组的区段中时，所得基因型将显示在编码溶血素的第2个跨膜螺旋的片段中的缺失(图3，A组)。重组体的表观可以以不同方式进行监测：a)当菌落暴露于紫外光时荧光消失；b)对卡那霉素敏感；和c)回复D.1段落中所用的亲本菌株呈现的溶血圈。方法c)使得能区分回复了亲本基因型的重组体。这是由于在apxIA基因的第二个跨膜螺旋的编码区段中显示有缺失的重组体中，相应亲本表现的溶血活性没有重建。

用前一代的1/10000稀释液从前代进行系列稀释，例外是第一代简单地由得自从HP816R1分离的菌落的培养物构成。培养基是补加0.004％NAD和50微克/毫升萘啶酮酸的LB。对于每一代，使用10mL体积的培养基。检测到的重组体百分比如表1所示。

表1

代次	％检测到的重组体(a)	％检测到的重组体(b)
代次	％检测到的重组体(a)	％检测到的重组体(b)	2	0.12％	0.18％
3	0.32％	0.46％	2	0.12％	0.18％
3	0.32％	0.46％	4	7.75％	10.4％
5	18.5％	22.3％	4	7.75％	10.4％

a)通过计数回复了亲本菌株所呈现的溶血圈的菌落而确定的百分比

b)通过计数当暴露于紫外光时不显示荧光的菌落而确定的百分比

如上表所观察到的，在每一代中显示出由于第二次重组而解离质粒的细菌数均有增加。无荧光菌落的百分比仅比回复溶血活性的菌落的百分比略高，这一事实提示第二次重组优选在发生第一次重组的同一DNA区段中发生。如果每个重组类型的频率为50％，则无荧光菌落数是回复溶血活性的菌落数的一倍。

一旦培养物中富集了足够的第二次重组体，则可以开始纯化步骤。为此，将几个无荧光菌落在补加NAD的Columbia琼脂和补加NAD，50微克/毫升萘啶酮酸和20微克/毫升的卡那霉素的LB琼脂(LBNKm)上培养。选择在LBNKm上不生长以及显示插入重组体HP816R1相同溶血活性的几个菌落。

D.3App HP816R2重组体的构建

用pApxIIΔH2转化App是通过与携带这一质粒的E.coli S17-1λpir接合而进行。将菌株AppApxIH2^-用杂种质粒pApxIIΔH2进行转化。程序和培养基与D.1段所述相同。质粒pApxIIΔH2的转化频率与D.1中所获得的质粒pApxIΔH2的转化频率类似。

将几个菌落通过接种环划线而重新接种在含有补加15g/L Noble琼脂、0.004％NAD、50微克/毫升卡那霉素和50微克/毫升萘啶酮酸的LB的Petri培养皿中。所有产生的菌落在暴露于紫外光时均显示明显程度的荧光，这表明在一个独特的重组事件中质粒整合进App基因组中。如图4所示，如果发生双重组，接合后体将不能在含卡那霉素的培养基中生长。在平板中存在这一抗生素使得只有在其基因组中整合完整质粒的重组体能够生长。指示基因GFP使得能够区分抗卡那霉素的菌落是否是自发突变的产物。

最后，获得的重组体来自质粒和apxIIA基因之间的同源重组，这通过在补加0.004％NAD的Columbia血琼脂板中观察到重组体的溶血活性而证实(图4，C组)。用质粒pApxIIΔH2获得的重组体显示出溶血圈完全消失。

选择一个用质粒pApxIIΔH2获得的重组体进行后续传代并称为HP816R2。

D.4菌株AppApxI/IIH2^-的构建

一旦获得了质粒pApxIIΔH2整合进基因组中的重组体，重要的是通过第二次重组固定App基因组中的缺失。因此，如D.2中所述将前阶段获得的一个重组体在仅补加萘啶酮酸的培养基中进行系列传代。从第2代检测的重组体百分比与D.2中获得的类似。

一旦培养物中富集了足够的第二次重组体，则可以开始纯化步骤。为此，将几个无荧光菌落在补加NAD的Columbia琼脂和补加NAD，50微克/毫升萘啶酮酸和20微克/毫升的卡那霉素的LB琼脂(LBNKm)上培养。选择在LBNKm上不生长以及显示插入重组体HP816R2相同溶血活性的几个菌落进行后续研究。

E.分析从前一代分离的菌落中纯化的DNA以测试培养物的均一性和基因apxIA和apxIIA中缺失的存在

D.2和D.4中前几代的重组体在10mL补加50微克/毫升萘啶酮酸的TSYN培养基中培养直至到达静止期。稍后，提取每个重组体的DNA。

E.1-apxIH2^-重组体的分析

相应于每一个从质粒pApxIΔH2获得的第二次重组体的培养物的基因组DNA样品用限制酶XhoI消化。这些消化物与其它在分别从菌株HP816Nl^r和HPB816R1的培养物提取的DNA上进行的消化物用Southern印迹进行分析，分析使用来自用限制酶EcoRV和BglII消化质粒pΔApxIH2^-获得的1927bp DNA片段作为探针。这些杂交的结果如图3B所示。对照菌株HP816N1^r的杂交结果显示存在相距操纵子apxI中发现的XhoI位点约20kb的一个限制位点XhoI。对插入了质粒pApxIΔH2的重组体的分析表明出现1.1和4.3kb的两条新条带以及20kb预先存在带略微增加1kb。新条带的大小以及预先存在带的增加与杂种质粒pApxIΔH2插入App基因组的apxIA基因的第二个跨膜螺旋编码片段的5’侧翼区所预料到的一致(图3A，第2幅)。对具有由于在发生第一次重组的相同5’区域进行第二次重组而解离的质粒的重组体进行分析显示较小分子量的两条带没有出现，并且先前21kb条带迁移率略微降低，其现在与亲本菌株呈现相同水平。这一点与溶血活性与亲本菌株HP816N^r呈现的溶血活性相同这一事实综合在一起提示在这一方法全程中App基因组中没有引入额外的修饰(图3A和C)。

最后，对具有由于在编码第二个跨膜螺旋的区段的3’侧翼区域发生第二次重组而解离的质粒的重组体进行分析显示4.3kb条带没有出现，保持了在插入重组体中观察到的1.1kb的条带，20kb条带略微降低。这一条带是所预期的，因为第二个跨膜螺旋的编码区段消失，并且其用XhoI位点取代。插入App基因组中的这一新位点导致产生1.1kb片段，以及20kb条带降低了1.1kb，这在菌株816N1^r中观察到(图3A和B)。注意到在CA中，在培养物1和3菌落周围存在大溶血圈，在培养物2、4和5菌落周围存在小溶血圈。还观察到培养物1、3、4和5在TS中不生长。这一重组体显示与亲本菌株HP816N1^r相比溶血活性降低很多，而与仅具有ApxII溶血素的血清型7App的溶血活性相同(图3C)。这一结果表明第二个跨膜螺旋中的缺失消除或明显降低了App ApxIA的溶血活性。通过所述缺失修饰的App命名为ApxIAH2^-。

如此获得的、特征在于编码ApxI外毒素的第二个跨膜结构域的apxIA基因中核苷酸886-945缺失的重组体被命名为ApxIAH2^-。这一重组体于2002年1月10日根据布达佩斯条约保藏于西班牙普通微生物保藏中心，保藏号为CECT 5985。

E.2-apx/IIH2^-重组体的分析

相应于插入重组体HP816R2和得自质粒pApxIIΔH2^-的第二次重组体的基因组DNA样品用限制酶EcoRI消化。这些消化物与提取自菌株HP816N1^r培养物的DNA的消化物用Southern印迹进行分析。使用经PCR扩增的两个DNA片段作为探针，它们相应于编码ApxII的第二个跨膜螺旋的DNA区段5’和3’侧翼区(见段落B)。这些杂交的结果如图4B所示。对照菌株HP816N1^r的杂交结果显示存在相距15.7kb的两个EcoRI限制位点，它们限定了-个包括操纵子apxII的片段。对插入质粒pApxIIΔH2得到的重组体的分析显示15.7kb条带消失，出现3个新条带，大小分别为8.2、7.5和0.9kb。从杂种质粒pApxIIΔH2插入编码App基因组的基因apxIIA的第二个跨膜螺旋编码区段的3’侧翼区可以预期这些新条带的大小(图4A)。对具有由于在发生第一次重组的相同3’区域发生第二次重组而解离的质粒的重组体进行分析显示15.7kb单条带重新出现，其与对照菌株所示相符合(图4B)。溶血活性与AppApxIH2^-亲本菌株所示相同(图4C)。最后，对具有由于在编码第二个跨膜螺旋的区段的3’侧翼区域发生第二次重组而解离的质粒的重组体进行分析显示13.5和0.9kb条带消失，出现一新的7.5kb片段(图4B)。这一条带分布是所预期的，因为第二个跨膜螺旋的编码区段消失，并且其用EcoRI位点取代(图4A)。插入到App基因组中的这一新位点导致包括亲本菌株中的操纵子apxII的15.7kb EcoRI片段分裂成两个片段，分别为8.2和7.5kb片段(图4A和B)。这一重组体完全无溶血活性(图4C)。这一结果表明第二个跨膜螺旋中的缺失消除了或实质上降低了App ApxIIA的溶血活性。通过携带所述缺失而修饰的ApxIIA现重命名为ApxIIAH2^-。注意到在CA中，在培养物1和3菌落周围存在小溶血圈，在培养物2和4菌落周围不存在溶血圈。还观察到培养物1、3、和4在TS中不生长。

如此获得的、特征在于编码ApxI外毒素的第二个跨膜结构域的apxIA基因中核苷酸886-945缺失以及编码ApxII外毒素的第二个跨膜结构域的apxIIA基因中核苷酸886-945缺失的重组体被重命名为ApxI/IIAH2^-。这一菌株于2002年6月12日根据布达佩斯条约保藏于西班牙普通微生物保藏中心，保藏号为CECT 5994。

F.-通过获得的重组菌株产生ApxIAH2 ^- 和ApxIIAH2 ^- 的分析

为确定是否所获得的重组菌株仍产生ApxH2^-，测定LB培养基中ApxH2^-的浓度。用特异于ApxI和ApxII的单克隆抗体经免疫测定和Western印迹检测所产生的Apx。如图5(A和B)所示，重组菌株产生ApxIAH2^-和ApxIIAH2^-并将它们分泌至培养基中与来自亲本野生型菌株HP816N1^r的未修饰Apx具有相同的时间模式。所有溶血素(修饰的或未修饰的)均在指数生长期的下半程出现在培养基中，并且在静止期开始时达到最大浓度。从这一刻起，所有溶血素的浓度保持稳定或者轻微降低。如在同一幅图中所观察到的，ApxIAH2^-和ApxIIAH2^-持续积累直至达到类似于由野生型菌株HP816N1^r产生的相应未修饰Apx所示的水平。另一方面，导入的缺失非常小(18个氨基酸)，预期两种ApxH2^-的分子量仅降低2kD。考虑到2种野生型溶血素的表观分子量约为105kDa，因此其分子量降低2kDa在聚丙烯酰胺凝胶及相应的Western印迹(图6)中是显示不出的。最后，我们必须强调指出在这一图中没有出现截短的或未正确加工的多肽产物。注意到第3道中的105kDa仅在(C)中检测到。所有数据表明在两种Apx中导入了小缺失不影响其以完全方式被合成并被输出到培养基中。一旦它们被释放到培养基中，ApxH2^-显示出类似于相应的未修饰的Apx的稳定性。

G.一所获得的菌株的减毒有效性

为测试两个构建的重组菌株的减毒程度，使用3月龄雄性和雌性LWxLD杂种猪。4份重复的猪用于不同试验中。通过气管内注射将每种菌株以在5mL PBS中的10⁸cfu的剂量给予前3组的每只动物。这一剂量先前被确定为野生型菌株HP816N1^r在这一年龄猪中的LD50。第4组动物仅接种1剂5mL PBS。在试验的7天内每天记录临床迹象，结果如表2所示。

表2

(a)警觉行为和对看管人的存在作出反应的能力受损的动物数(受影响的动物数/动物总数)

(b)具有被干扰的呼吸频率和/或呼吸困难的动物数(受影响的动物数/动物总数)

接种7天后，杀死动物，记录在呼吸器官中观察到的肉眼可见的损害。在尸体解剖时也进行了细菌学检查。

这一试验中获得的结果见表3。

表3

菌株	动物数	剂量App(cfu)	死亡率	具有肺损害的动物数	平均肺损害指数	分离到App的动物数
菌株	动物数	剂量App(cfu)	死亡率	具有肺损害的动物数	平均肺损害指数	分离到App的动物数	HP816N1<sup>r</sup>	5	10<sup>8</sup>	2/5	4	11.6±2.1	3
AppApxIH2<sup>-</sup>	10	10<sup>8</sup>	0	7	3.2±4.6	3	HP816N1<sup>r</sup>	5	10<sup>8</sup>	2/5	4	11.6±2.1	3
AppApxIH2<sup>-</sup>	10	10<sup>8</sup>	0	7	3.2±4.6	3	AppApxI/IIH2<sup>-</sup>	10	10<sup>8</sup>	0	0	0	8
对照(PBS)	5	N.A.	0	0	0	0	AppApxI/IIH2<sup>-</sup>	10	10<sup>8</sup>	0	0	0	8

在这一期间这一组内的5只动物中有2只死亡。在尸体解剖时，5只动物中有4只显示肺损害。用菌株AppApxIH2^-接种的动物还显示出其行为改变，但这些症状从接种后第4天开始下降。临床症状较轻并且仅在50％猪中观察到。尽管这组动物中无一动物在试验期间死亡，但是在尸体解剖时70％动物显示损害，但它们全部比前一组轻。第3组用菌株AppApxI/IIH2^-接种。尽管4只动物显示轻微改变的行为，但是它们在接种后48小时开始下降。显示有限临床症状的2只动物也在接种后48小时内恢复。在尸体解剖时没有观察到肺损害。肺损害的评价根据Hannan et al；(Research in Veterinary Science33：76-88(1982))进行。所显示的值是每组算术平均值和标准差。根据这些结果，AppApxI/IIH2^-菌株是无毒的并且可以安全用作活疫苗。需着重强调的是接种的App菌株在接种后7天从这一组80％猪中回收到。这一结果表明在实验感染中AppApxI/IIH2^-菌株的存活率没有改变，尽管其溶血活性丧失。这一事实是重要的，因为我们能想到微生物保持存活很重要，因为这样可以产生并释放Apx外毒素。如果不产生Apx外毒素，那么减毒菌株不能被用作活疫苗，因为它们不能诱导免疫应答来保护动物抗未来的感染(Reimer et al；MicrobialPathogenesis 18：197-209(1995))。在所有试验中，均实现了强免疫应答。

序列表

<110>西班牙海博乐生物大药厂

<120>抗猪胸膜肺炎的减毒活疫苗

<130>4467WO334HIP

<140>PCT/EP03/12839

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<210>1

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<212>DNA

<213>Actinobacillus pleuropneumoniae

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<308>NCBI/X68595

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<313>(1)..(3072)

<400>1

atggctaact ctcagctcga tagagtcaaa ggattgattg attcacttaa tcaacataca 60

aaaagtgcag ctaaatcagg tgccggcgca ttaaaaaatg gtttgggaca ggtgaagcaa 120

gcagggcaga aattaatttt atatattccg aaagattatc aagctagtac cggctcaagt 180

cttaatgatt tagtgaaagc ggcggaggct ttagggatcg aagtacatcg ctcggaaaaa 240

aacggtaccg cactagcgaa agaattattc ggtacaacgg aaaaactatt aggtttctcg 300

gaacgaggca tcgcattatt tgcacctcag tttgataagt tactgaataa gaaccaaaaa 360

ttaagtaaat cgctcggcgg ttcatcggaa gcattaggac aacgtttaaa taaaacgcaa 420

acggcacttt cagccttaca aagtttctta ggtacggcta ttgcgggtat ggatcttgat 480

agcctgcttc gtcgccgtag aaacggtgag gacgtcagtg gttcggaatt agctaaagca 540

ggtgtggatc tagccgctca gttagtggat aacattgcaa gtgcaacggg tacggtggat 600

gcgtttgccg aacaattagg taaattggca atgccttatc taacactcgc cttaagcggt 660

ttagcaagta agttaaataa ccttccagat ttaagccttg caggacctgg gtttgatgcc 720

gtatcaggta tcttatctgt tgtttcggct tcattcattt taagtaataa agatgccgat 780

gcaggtacaa aagcggcggc aggtattgaa atctcaacta aaatcttagg caatatcggt 840

aaagcggttt ctcaatatat tattgcgcaa cgtgtggcgg caggcttatc cacaactgcg 900

gcaaccggtg gtttaatcgg ttcggtcgta gcattagcga ttagcccgct ttcgttctta 960

aatgttgcgg ataagtttga acgtgcgaaa cagcttgaac aatattcgga gcgctttaaa 1020

aagttcggtt atgaaggtga tagtttatta gcttcattct accgtgaaac cggtgcgatt 1080

gaagcggcat taaccacgat taacagtgtg ttaagtgcgc gttccgcagg tgttggggct 1140

gctgcaaccg gctcattagt cggtgcgccg gtagcagctt tagttagtgc aatcaccggt 1200

attatttcag gtattttaga tgcttctaaa caggcaatct tcgaacgagt tgcaacgaaa 1260

ttagcgaata agattgacga atgggagaaa aaacacggta aaaactattt tgaaaacggt 1320

tatgacgccc gccattccgc attcttagaa gatacctttg aattgttatc acaatacaat 1380

aaagagtatt cggtagagcg tgtcgttgct attacgcaac agcgttggga tgtcaatatc 1440

ggtgaacttg ccggcattac tcgcaaaggt tctgatacga aaagcggtaa agcttacgtt 1500

gatttctttg aagaaggaaa acttttagag aaagaaccgg atcgttttga taaaaaagtg 1560

tttgatccgc ttgaaggtaa aatcgacctt tcttcaatta acaaaaccac tttattgaaa 1620

tttgttacgc cggtctttac cgcaggtgaa gagattcgtg agcgtaagca aaccggtaaa 1680

taccaatata tgaccgaatt attcgttaaa ggtaaagaaa aatgggtggt aaccggtgtg 1740

cagtcacata atgcgattta tgactatacg aatcttatcc aattagcgat agataaaaaa 1800

ggtgaaaaac gtcaagtgac cattgaatct catttgggtg agaaaaatga tcgtatatat 1860

ctttcatccg gttcatctat cgtatatgcg ggtaacggac atgatgtagc atattacgat 1920

aaaaccgata caggttactt aacatttgac ggacaaagtg cacagaaagc cggtgaatat 1980

attgtcacta aagaacttaa agctgatgta aaagttttaa aagaagtggt taaaactcag 2040

gatatttcag ttggaaaaac gtgcagtgaa aaattagaat atcgtgatta tgagttaagc 2100

ccattcgaac ttgggaacgg tatcagagct aaagatgaat tacattctgt tgaagaaatt 2160

atcggtagta atcgtaaaga caaattcttt ggtagtcgct ttaccgatat tttccatggt 2220

gcgaaaggcg atgatgaaat ctacggtaat gacggccacg atatcttata cggagacgac 2280

ggtaatgatg taatccatgg cggtgacggt aacgaccatc ttgttggtgg taacggaaac 2340

gaccgattaa tcggcggaaa aggtaataat ttccttaatg gcggtgatgg tgacgatgag 2400

ttgcaggtct ttgagggtca atacaacgta ttattaggtg gtgcgggtaa tgacattctg 2460

tatggcagcg atggtactaa cttatttgac ggtggtgtag gcaatgacaa aatctacggt 2520

ggtttaggta aggatattta tcgctacagt aaggagtacg gtcgtcatat cattattgag 2580

aaaggcggtg atgatgatac gttattgtta tcggatctta gttttaaaga tgtaggattt 2640

atcagaatcg gtgatgatct tcttgtgaat aaaagaatcg gaggaacact gtattaccat 2700

gaagattaca atgggaatgc gctcacgatt aaagattggt tcaaggaagg taaagaagga 2760

caaaataata aaattgaaaa aatcgttgat aaagatggag cttatgtttt aagccaatat 2820

ctgactgaac tgacagctcc tggaagaggt atcaattact ttaatgggtt agaagaaaaa 2880

ttgtattatg gagaaggata taatgcactt cctcaactca gaaaagatat tgaacaaatc 2940

atttcatcta cgggtgcatt taccggtgat cacggaaaag tatctgtagg ctcaggcgga 3000

ccgttagtct ataataactc agctaacaat gtagcaaatt ctttgagtta ttctttagca 3060

caagcagctt aa 3072

<210>2

<211>2871

<212>DNA

<213>Actinobacillus pleuropneumoniae

<300>

<308>NCBI/X61111

<309>1993-01-21

<313>(1)..(2871)

<400>2

atgtcaaaaa tcactttgtc atcattaaaa tcgtccttac aacaaggatt gaaaaatggg 60

aaaaacaagt taaatcaagc aggtacaaca ctgaagaatg gtttaactca aactggtcat 120

tctctacaga atggggctaa aaaattaatc ttatatattc ctcaaggcta tgattcgggt 180

caaggaaatg gagttcaaga tttagttaaa gctgctaatg atttaggtat tgaagtatgg 240

cgagaagaac gcagcaattt ggacattgca aaaactagct ttgatacaac tcagaaaatt 300

ctaggtttta ctgatagagg aattgtatta tttgcacctc agctagataa tttattaaag 360

aagaatccta aaattggcaa tacattagga agtgcttcta gcatctcaca aaatataggt 420

aaagccaata ctgtattagg tggtattcaa tctattttag gatctgtttt atctggagta 480

aatctgaatg aattacttca aaataaagat cctaatcaat tagaacttgc aaaagcaggg 540

ctagaactga ctaatgaatt agttggtaat attgctagct cggtgcaaac tgtagatgca 600

tttgcagaac aaatatctaa actaggttca catttacaga atgtgaaagg attaggagga 660

ttgagtaata aattacaaaa tctaccagat ctaggaaaag caagtttagg tttggacatt 720

atctctggtt tactttctgg agcatctgca ggtctcattt tagcagataa agaggcttca 780

acagaaaaga aagctgccgc aggtgtagaa tttgctaacc aaattatagg taatgtaaca 840

aaagcggtct catcttacat tcttgcccaa cgagtcgctt caggtttgtc ttcaactggt 900

cctgtcgctg cattaatcgc atctacagtt gcactagctg ttagccctct ttcattctta 960

aatgtagctg ataagtttaa acaagctgat ttaatcaaat catattctga acgcttccaa 1020

aaattaggat atgatggaga tcgtttatta gctgattttc accgtgagac aggaactatt 1080

gatgcttctg taacaacaat taacactgct ttagcagcta tctccggtgg agttggagct 1140

gcaagcgcgg gttctctagt cggagctcca gttgcgttac tcgttgctgg tgttacggga 1200

cttattacaa ctattctaga atattctaaa caagccatgt ttgaacatgt tgcaaataag 1260

gttcatgaca gaatagttga atgggagaaa aaacataata aaaactattt tgagcaaggt 1320

tatgattctc gtcatttagc tgatttacaa gacaatatga agtttcttat caatttaaat 1380

aaagaacttc aggctgaacg cgtagtagct attacccaac aaagatggga taaccaaatt 1440

ggagacctag cggcaattag ccgtagaacg gataaaattt ccagtggaaa agcttatgtg 1500

gatgcttttg aggaggggca acaccagtcc tacgattcat ccgtacagct agataacaaa 1560

aacggtatta ttaatattag taatacaaat agaaagacac aaagtgtttt attcagaact 1620

ccattactaa ctccaggtga agagaatcgg gaacgtattc aggaaggtaa aaattcttat 1680

attacaaaat tacatataca aagagttgac agttggactg taacagatgg tgatgctagc 1740

tcaagcgtag atttcactaa tgtagtacaa cgaatcgctg tgaaatttga tgatgcaggt 1800

aacattatag aatctaaaga tactaaaatt atcgcaaatt taggtgctgg taacgataat 1860

gtatttgttg ggtcaagtac taccgttatt gatggcgggg acggacatga tcgagttcac 1920

tacagtagag gagaatatgg cgcattagtt attgatgcta cagccgagac agaaaaaggc 1980

tcatattcag taaaacgcta tgtcggagac agtaaagcat tacatgaaac aattgccacc 2040

caccaaacaa atgttggtaa tcgtgaagaa aaaattgaat atcgtcgtga agatgatcgt 2100

tttcatactg gttatactgt gacggactca ctcaaatcag ttgaagagat cattggttca 2160

caatttaatg atattttcaa aggaagccaa tttgatgatg tgttccatgg tggtaatggt 2220

gtagacacta ttgatggtaa cgatggtgac gatcatttat ttggtggcgc aggcgatgat 2280

gttatcgatg gaggaaacgg taacaatttc cttgttggag gaaccggtaa tgatattatc 2340

tcgggaggta aagataatga tatttatgtc cataaaacag gcgatggaaa tgattctatt 2400

acagactctg gcggacaaga taaactggca ttttcggatg taaatcttaa agacctcacc 2460

tttaagaaag tagattcttc tctcgaaatc attaatcaaa aaggagaaaa agttcgtatt 2520

gggaattggt tcttagaaga tgatttggct agcacagttg ctaactataa agctacgaat 2580

gaccgaaaaa ttgaggaaat tattggtaaa ggaggagaac gtattacatc agaacaagtt 2640

gataaactga ttaaggaggg taacaatcaa atctctgcag aagcattatc caaagttgtg 2700

aatgattaca atacgagtaa agatagacag aacgtatcta atagcttagc aaaattgatt 2760

tcttcagtcg ggagctttac gtcttcctca gactttagga ataatttagg aacatatgtt 2820

ccttcatcaa tagatgtctc gaataatatt caattagcta gagccgctta a 2871

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>3

gatcgaattc aggatatcac agatct 26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>4

aattagatct gtgatatcgt gaattc 26

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>5

gaattcaatg cttctggcgt cag 23

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>6

ggtaccggat gagataagat tttc 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>7

ggtaccggat gagataagat tttc 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>8

gaattcaaga gtttgtagaa acgc 24

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>9

ggtacctaat ttaccaacac tac 23

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>10

ggtaccttat ttgtagagct catc 24

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>11

gatatcatgg ctaactctct cagctcgata g 31

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>12

ctcgaggcct gccgccacac gttg 24

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>13

ctcgagccgc tttcgttctt aaatgttgcg 30

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>14

agatcttcac cggctttctg tgcactttg 29

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>15

gatatcaaat cgtccttaca acaaggattg 30

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>16

gaattcacct gaagcgactc gttgggc 27

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>17

gaattccctc tttcattctt aaatgtagc 29

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>Synthetic

<400>18

agatctgcca tcaataacgg tagtacttg 29

Claims

1、一种从毒性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneunoniae)菌株获得免疫原性、非溶血性胸膜肺炎放线杆菌菌株的方法，其特征在于包括如下步骤：

-鉴别Apx溶血性和溶细胞性外毒素的跨膜结构域；

-修饰编码所述溶血性和溶细胞性Apx外毒素的跨膜结构域的至少一个apxIA基因片段。

2、权利要求1的方法，其特征在于进一步修饰编码所述溶血性和溶细胞性Apx外毒素的跨膜结构域的一个apxIIA基因片段。

3、权利要求1的方法，其特征在于在编码所述Apx溶血性和溶细胞性外毒素的跨膜结构域的至少一个apxIA基因片段中引入缺失。

4、权利要求3的方法，其特征在于进一步在编码所述Apx溶血性和溶细胞性外毒素的跨膜结构域的一个apxIIA基因片段中引入缺失。

5、权利要求1-4任一项的方法，其特征在于在编码App ApxI外毒素的第二个跨膜结构域的apxIA基因片段中引入缺失。

6、权利要求5的方法，其特征在于引入编码App ApxI外毒素的第二个跨膜结构域的apxIA基因的核苷酸886-945的缺失。

7、权利要求6的方法，其特征在于进一步在编码App ApxII外毒素的第二个跨膜结构域的apxIIA基因片段中引入缺失。

8、权利要求7的方法，其特征在于引入编码App ApxII外毒素的第二个跨膜结构域的apxIIA基因的核苷酸886-945的缺失。

9、根据权利要求1-8任一项的方法获得的胸膜肺炎放线杆菌菌株。

10、抗猪胸膜肺炎的疫苗，其特征在于包含根据权利要求1-8任一项的方法获得的胸膜肺炎放线杆菌菌株。

11、保藏于西班牙普通微生物保藏中心、保藏号为CECT 5985的免疫原性和非溶血性胸膜肺炎放线杆菌菌株。

12、抗猪胸膜肺炎的疫苗，其特征在于包含权利要求11的胸膜肺炎放线杆菌菌株。

13、保藏于西班牙普通微生物保藏中心、保藏号为CECT 5994的免疫原性和非溶血性胸膜肺炎放线杆菌菌株。

14、抗猪胸膜肺炎的疫苗，其特征在于包含权利要求13的胸膜肺炎放线杆菌菌株。