PL212312B1 - Szczepionka zawierajaca atenuowany zywy zarazek przeciwko zapaleniu pluc i oplucnej u swin - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania immunogennego, niehemolitycznego szczepu Actinobacillus pleuropneumoniae, odpowiedniego do przygotowania żywej, atenuowanej szczepionki przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń.

Stan techniki

Actinobacillus pleuropneuraonia (dalej określany jako „App) jest gram-ujemną bakterią, która powoduje zapalenie płuc i opłucnej u świń, rozpowszechnioną na całym świecie chorobę zakaźną odpowiedzialną za znaczące straty ekonomiczne w przemyśle hodowlanym trzody chlewnej.

Najważniejszymi czynnikami wirulencji App są zewnątrzkomórkowe białka mianowicie: egzotoksyny Apx. Te egzotoksyny należą do rodziny tworzących pory toksyn RTX, szeroko rozpowszechnionej wśród patogennych bakterii gram-ujemnych. Głównymi egzotoksynami u App są: ApxI, ApxII, ApxIII i ApxIV.

Egzotoksyny ApxI i ApxII są hemolityczne i cytolityczne. ApxI wykazuje silną aktywność hemolityczną i cytolityczną, a ApxII wykazuje słabą aktywność hemolityczną i umiarkowaną aktywność cytolityczną.

Chociaż wszystkie, do tej pory przebadane, serotypy są zdolne do wytwarzania ApxIV, występuje charakterystyczny rozkład ekspresji pozostałych egzotoksyn Apx w serotypach. Serotypy 1, 5, 9 i 11 wytwarzają egzotoksyny ApxI i ApxII; serotyp 10 wytwarza tylko ApxI; serotypy 7 i 12 wytwarzają tylko ApxII, a serotypy 2, 3, 4, 6, i 8 wytwarzają ApxII i ApxIII.

Geny odpowiadające egzotoksynom ApxI i ApxII są zorganizowane w operony. Operon egzotoksyny ApxI zawiera 4 geny: apxIC, apxIA, apxIB i apxID. Gen apxIA koduje samą egzotoksynę ApxI. Gen apxIC koduje białko aktywatorowe (acylazę), które powoduje posttranslacyjne modyfikacje (acylację) Apx, co umożliwia ApxI osiągnięcie aktywnej konformacji, umożliwiając interakcję ze specyficznymi receptorami komórki gospodarza. Geny apxIB i apxID kodują dwa białka błonowe, które wydzielają dojrzałą egzotoksynę ApxI do środowiska zewnętrznego.

Operon ApxII zawiera tylko gen A (apxIIA) i gen C (apxIIC), który koduje, odpowiednio, ApxII i acylazę odpowiedzialną za uzyskanie przez ApxII aktywnej konformacji. Występuje także niewielki fragment, który wykazuje pewne podobieństwo do genu apxIB, lecz nie powstaje z niego funkcjonalne białko. Eksport dojrzałego ApxII do środowiska zewnętrznego jest zależny od działania białek kodowanych przez geny apxIB i apxID.

Obecne metody szczepienia nie zapewniają całkowitego zabezpieczenia przeciw wszystkim serotypom App.

W zgłoszeniu WO97/16532A1 ujawniono konstrukcję szczepu szczepionkowego, zdolnego do indukcji odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia. Konstrukt obejmuje zmodyfikowany mikroorganizm, który wytwarza, na skutek częściowej delecji, częściowo lub całkowicie inaktywowaną toksynę Apx. Ta delecja spowodowana jest indukowaną mutagenezą strukturalnego genu apxIA i/lub częściową delecją aktywatorowego genu apxIIC. Nie modyfikuje ona obszaru transbłonowego.

W europejskim opisie patentowym nr 810283A2 ujawniono konstrukcję szczepu szczepionkowego App przez modyfikację genu ApxIC w taki sposób, że nie wytwarza on białka aktywatorowego w funkcjonalnej postaci i nie moż e ono aktywować toksyny przez acylację . To takż e nie zmienia obszaru transbłonowego.

Jansen i in. (Infection and Immunity 63:7-37 (1995)) opisali wytwarzanie homologicznych rekombinantów App metodą ukierunkowanej mutagenezy. Te mutanty posiadają gen apxIA, który jest inaktywowany przez insercję genu CMr i/lub gen apxIIA inaktywowany przez insercję genu TETr.

Tascón i in. (Molecular Microbiology 14: 207-216 (1994)) opisali dwa mutanty App. W jednym z nich rozbito gen apxIBD, a w drugim rozbito strukturalny gen apxIA.

Reimer i in.; (Microbial Pathogenesis 18:197-209 (1995)) opisali niezjadliwego mutanta App, który, w wyniku chemicznej mutagenezy, posiada delecje, które wpływają na istotne części operonu apxIABCD. Ten mutant nie syntetyzuje toksyny ApxI, lecz jest zdolny do syntezy ApxII, chociaż nie jest ona wydzielana przez komórkę.

Szczepów, które nie eksprymują egzotoksyn ApxI i ApxII, nie można stosować jako atenuowanych szczepionek, ponieważ nie indukują one ochronnej odpowiedzi immunologicznej, gdyż egzotoksyny ApxI i ApxII są jednymi z najważniejszych determinantów wirulencji App.

PL 212 312 B1

Prideaux (The 16^th International Pig Veterinary Society Congress, Melbourne (Australia) 17-20 września 2000, str. 439-442) opisuje szczepionkę wytworzoną ze szczepu z inaktywowanym genem apxIIC, który wydziela i eksprymuje nieaktywowaną toksynę ApxII która jest zatem niezdolna do przyłączenia się do komórek docelowych.

Z tego powodu żywe, atenuowane szczepionki opisane uprzednio w rozdziale Stan techniki, na bazie szczepów App nie posiadających zdolności do hemolizy, mają słabsze działanie immunoprotekcyjne, ponieważ ich budowa uległa modyfikacjom, co uniemożliwia im przyłączenia się do receptora błonowego komórki docelowej. Ponadto nie mogą one powodować wytwarzania przeciwciał przeciw toksynom ApxI i/lub ApxII, ponieważ nie zostały wydzielone przez komórkę. Frey i in. (Gene 142:97-102 (1994)) opisują sekwencję aminokwasową egzotoksyny ApxIe ze szczepu o serotypie I, a Smiths i in. (Infection and Immunity 59:4497-4504 (1991)) opisują sekwencję aminokwasową egzotoksyny ApxII szczepu o serotypie 9.

Istota wynalazku

Autorzy wynalazku opracowali sposób otrzymywania immunogennego i niehemolitycznego szczepu App z wirulentnego szczepu App, który zmodyfikowano w co najmniej jednym segmencie genu apxIA (SEQ ID nr 1) i ewentualnie w segmencie genu apxIIA (SEQ ID nr 2), który koduje domenę transbłonową cytolitycznej i hemolitycznej egzotoksyny Apx.

Ten szczep nie posiada aktywności hemolitycznej, lecz zachowuje nie zmienioną zdolność immunoprotekcyjną i jest odpowiedni do przygotowania żywej, atenuowanej szczepionki przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń.

Transbłonowe domeny egzotoksyn ApxI i ApxII odgrywają ważną rolę w powstawaniu poru w błonie komórki docelowej. Gdy ten por zostanie utworzony, pojawia się zaburzenie równowagi osmotycznej, które w końcu powoduje lizę komórki docelowej.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że żywa, atenuowana szczepionka wytworzona z zastosowaniem tego zmodyfikowanego szczepu App obejmująca toksyny ApxI i ApxII pozbawione hemolitycznej aktywności, podawana w małych dawkach, zawiera wszystkie antygeny immunologicznie konieczne do wywołania silnej immunogennej odpowiedzi.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunogennego i niehemolitycznego szczepu App z wirulentnego szczepu App zmodyfikowanego w co najmniej jednym segmencie genu apxIA i ewentualnie w segmencie genu apxIIA, który koduje transbłonową domenę hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.

Ponadto, innym aspektem wynalazku są szczepy otrzymywane z zastosowaniem sposobów według wynalazku i wytworzone z nich szczepionki.

W trzecim aspekcie wynalazek dotyczy szczepów App zdeponowanych w Colección Espań ola de Cultivos Tipo o numerach rejestracyjnych: CECT 5985 i CECT 5994.

Opis rysunków

Fig. 1

Fig. 1 przedstawia dopasowanie (alignment) przeprowadzone z zastosowaniem programu ClustalX (Thompson i in.; Nucleic Acid Research 24:4876-4882 (1997) pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi ApxI pochodzącymi ze szczepu o serotypie 1 (Frey i in.; Gene 142: 97-102 (1994) i z ApxII serotypu 9 (Smits i in.; Infection & Immun. 59:4497-4504 (1991). Na tej fig. zamieszczono tylko sekwencję zawartą pomiędzy aminokwasami 1 do 594 ApxI i 1 do 590 ApxII. Na dopasowaniu następujące obszary są przedstawione w ramkach: H1 (aminokwasy 233 do 253), H2 (aminokwasy 296 do 315) i H3 (aminokwasy 369 do 405). Te obszary odpowiadają odpowiednio trzem transbłonowym domenom występującym w obu Apx.

Fig. 2

Fig. 2 przedstawia schemat etapów przeprowadzanych w celu otrzymania hybrydowych plazmidów ρΑρχΙΔΗ2 i ρΑρχΙΙΔΗ2. Najpierw otrzymano plazmid pGP1 przez strawienie plazmidu pGP704 (Miller i Mekalanos; J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988) z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych EcoRI i BglII i późniejszą ligację oligonukleotydów pGP5' i pGP3'. Ten plazmid zawiera wegetatywne miejsce startu replikacji plazmidu R6K (OriR6K) i miejsce startu transferu przez koniugację plazmidu RP4 (OriTP4) i gen oporności na ampicylinę (Bla). Plazmid pGP1 strawiono stosując enzym restrykcyjny PstI i ligowano z fragmentem nośnikowym PstI genu oporności na kanamycynę (Km^r lub Kan), pochodzącym z plazmidu pUC4K w celu uzyskania plazmidu pGP2. Do tego plazmidu, uprzednio zdefosforylowanego i strawionego enzymem restrykcyjnym EcoRI, włączono trzy fragmenty DNA zamplifikowane z zastosowaniem PCR, mianowicie: promotor ptac, region kodujący białka fuzyjnego

PL 212 312 B1 atpE/GFPUV (regionem wiązania rybosomu były E. coli atpE z odmianą U. V. zielonego białka fluorescencyjnego) i terminator transkrypcji rrnB. Uzyskany plazmid nazwano pGP3. Do tego plazmidu wstawiono regiony oskrzydlające 5' i 3' (zamplifikowane z zastosowaniem PCR), które kodują drugą transbłonową helisę genów apxl i apxll z wytworzeniem plazmidów odpowiednio ρΑρχΙΔΗ2 i ρΑρχΙΙΔΗ2.

Fig. 3

Fig. 3 podzielono na trzy panele: panel A przedstawia mapy restrykcyjne w kilobazach (kb) i położenie genów w operonie apxl genomu App. W jasnoszarym kolorze przedstawiono gen apxIA, będący przedmiotem różnych rekombinacji, a w kolorze ciemnoszarym sąsiednie geny apxIC, apxIB i apxID. Różne geny lub obszary plazmidu ρΑρχΙΔΗ2 zaznaczono stosując ukośne kreski. Fragmenty kodujące transbłonowe helisy (H1, H2 i H3) apxIA zaznaczono na czarno. Nazwy i pewne szczegółowe struktury plazmidów na fig. 2 podano skrótowo. Tak więc gfpUV zawiera promotor ptac i gen fuzyjny atpE/GFPUV; OriV oznacza wegetatywne miejsce startu replikacji z R6K, miejsce startu transferu przez koniugację z RP4OriT. Zarówno na (1) jak i (3) przedstawiono mapę restrykcyjną otrzymaną z zastosowaniem enzymu XhoI i przedstawiono położenie genów operonu ApxI genomu App. Na (2) przedstawiono mapę restrykcyjną tego samego operonu po wprowadzeniu do genomu App plazmidu pApxI.\H2. Do tej insercji dochodzi na skutek unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy regionami oskrzydlającymi 5' dla H2 znajdującymi się odpowiednio na plazmidzie pApxI.\H2 i w genomie App.

Panel B fig. 3 przedstawia wyniki hybrydyzacji sondy genowej Apxl z przeniesionym metodą Southern strawionym genomowym DNA, strawionym z zastosowaniem XhoI i otrzymanym z zebrania: 1) HP816 Nr; 2) rekombinanta otrzymanego przez wprowadzenie plazmidu pApxI.\H2 do genomu App wskutek unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy regionami oskrzydlającymi 5' dla H2 (HP816R1); 3) rekombinanta otrzymanego z HP816R1, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu HP816 Nr i 4) rekombinanta otrzymanego z HP816R1, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu HP816 Nr z tym wyjątkiem, że wykazuje on taką samą hemolityczną aktywność jak HP816R1 (AppApxIH2^-).

Panel C przedstawia położenie kolonii wysianych z tych samych kultur, co opisane na panelu B (1, 2, 3 i 4) razem z innymi koloniami pochodzącymi z kultury serotypu 7 App (5). Kolonie wysiano na płytkach Columbia na agarze z krwią uzupełnionym 0,004% NAD (CA) lub na płytkach TSYN z dodatkiem 25 μg/ml kanamycyny (TS) . Na płytkach CA zauważyć można obecność dużych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i małych hemolitycznych stref przejaśnienia otaczających kolonie z kultur 2, 4 i 5. Na TS zauważyć można także brak wzrostu kultur 1, 3, 4 i 5.

Fig. 4

Fig. 4 podzielono na 3 panele: panel A przedstawia mapy restrykcyjne (w kb) i położenie genów w operonie apxll znajdującym się w genomie App. W jasnoszarym kolorze przedstawiono gen apxIIA. Jest on przedmiotem różnych rekombinacji. Sąsiednie geny apxIIC, apxIIB przedstawiono w kolorze ciemnoszarym; różne geny lub obszary plazmidu pApxII.\H2 zaznaczono na rysunku stosując ukośne kreski. Fragmenty kodujące transbłonowe helisy (H1, H2 i H3) apxIIA przedstawiono na czarno. Mapę restrykcyjną otrzymano przy zastosowaniu enzymu EcoRI, a położenie genów w operonie ApxII genomu App przedstawiono na (1) i (3). Mapę restrykcyjną tego samego operonu po wprowadzeniu plazmidu pApxI.\H2 przedstawiono na (2). Insercję tę uzyskano poprzez unikalną homologiczną rekombinację pomiędzy regionami oskrzydlającymi 3' H2 znajdującymi się na plazmidzie pApxIAH2 i w genomie App. Na (4) przedstawiono mapę restrykcyjną operonu po rozdziale na składowe plazmidu wstawionego w (2) po drugiej rekombinacji poprzez regiony oskrzydlające 5' H2 znajdujące się w genomie App.

Panel B przedstawia wyniki hybrydyzacji sondy genowej apxIIA z przeniesionymi metodą Southern genomowymi DNA strawionymi z zastosowaniem EcoRI i otrzymanymi z następujących kultur: 1) HP8816 Nl^r 2) rekombinant otrzymany przez wprowadzenie plazmidu pApxIAH2 do genomu App poprzez unikalną homologiczną rekombinację pomiędzy regionami oskrzydlającymi 5' H2 (HP816R2); 3) rekombinant otrzymany z HP816R2, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu macierzystego szczepu HP816 Nl^r; 4) rekombinant otrzymany z HP816R2, który powrócił do fenotypu takiego samego, jak u macierzystego szczepu HP816 Nl^r z tym wyjątkiem, że wykazuje on taką samą aktywność hemolityczną jak HP816R2 (AppApxI/IIH2^-).

Panel C przedstawia położenie kolonii wysianych z samych kultur opisanych na panelu B (1, 2, i 4). Kolonie wysiano na płytkach Columbia z agarem z krwią uzupełnionym NAD (CA), lub na płytkach TSYN z dodatkiem 25 μ/ml kanamycyny (TS). Można zaobserwować obecność małych hemoliPL 212 312 B1 tycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i brak hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 2 i 4. Widać także brak wzrostu kultur 1, 3 i 4 na TS.

Fig. 5

Fig. 5 przedstawia trzy wykresy krzywych wzrostu różnych kultur, wyznaczone (ciemne symbole) z wartości absorbancji, przy 600 nm, w jednogodzinnych przedziałach czasu (lewa oś y). Jednocześnie, w tych samych odstępach czasu, pobrano kilka próbek z supernatantów tych kultur. Próbki te trzymano w temperaturze 0°C aż do ich rozcieńczenia 1/50 w buforze węglanowym (pH 9,6). Następnie umieszczono je w mikrostudzienkach do ilościowej oceny obecności ApxI i ApxII metodą ELISA z zastosowaniem specyficznego monoklonalnego przeciwciał a dla każ dego Apx. Na podstawie wartości absorbancji przy 405 nm, dla każdej badanej próbki (prawa oś y), narysowano krzywe przedstawiające akumulację każdej z Apx w czasie (jasne symbole). Na (A), hodowla HP816 Nl^r trójkąty i hodowla AppApxIH2^- - koła, jasne symbole przedstawiają akumulację ApxI. Na (B), hodowla HP816 Nl^r - trójkąty i hodowla AppApxI/IIH2^- - koła, jasne symbole przedstawiają akumulację ApxII. Na (C), hodowla HP816RI - trójkąty i hodowla HP816R2 - koła, przedstawiają akumulację ApxI, a jasne koła przedstawiają nagromadzenie ApxII.

Fig. 6

Panel (A) przedstawia barwienie błękitem Coomassie'go denaturującej elektroforezy na żelu poliakrylamidowym próbek supernatantów z kultur pobranych w 5 godzinie z 1) HP816 Nl^r; 2) AppApxIH2^-; 3) kontroli otrzymanej z App serotyp 4 (serotyp 4 App wytwarza i wydziela ApxII o wielkości 105 kD i ApxIII o wielkoś ci 115 kD, lecz nie ApxI); i M) marker masy czą steczkowej (wskazano stosowne prążki 110 i 120 kD). (B) przedstawia Western-blot żelu z próbkami identycznymi z tymi analizowanymi na żelu (A), wykrywanymi za pomocą monoklonalnego przeciwciała swoistego dla ApxI. (C) przedstawia Western-blot żelu z próbkami identycznymi z tymi z żelu (A) za wyjątkiem ścieżki 2, która zawiera próbkę supernatantu znad hodowli AppApxI/IIH2^-. Nie załączono fotografii żelu, ponieważ rozkład prążków jest identyczny z tym, który występuje na żelu (A). Ten transfer uzyskano stosując specyficzne monoklonalne przeciwciało przeciw ApxII. Należy zwrócić uwagę, że prążek 105 kD na ścieżce 3 jest wykrywany tylko na (C).

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania immunogennego i niehemolitycznego szczepu Actinobacillus pleuropneumoniae z wirulentnego App, scharakteryzowanego w następujących etapach:

- określa się transbłonowe domeny hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx.

- modyfikuje się co najmniej jeden fragment genu apxIA i ewentualnie segment genu apxIIA, który koduje transbłonową domenę Apx hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx.

Termin immunogenny oznacza, że szczep App otrzymany z zastosowaniem sposobu według wynalazku zachowuje nie zmienioną zdolność immunoprotekcyjną, co oznacza, że zawiera on wszystkie antygeny immunologicznie konieczne do wywołania silnej immunogennej odpowiedzi w organizmie gospodarza.

Termin niehemolityczny oznacza, że szczep App, otrzymany z zastosowaniem sposobu według wynalazku, nie posiada aktywności hemolitycznej, co sprawia, że jest on niezjadliwy.

Wyboru wirulentnego szczepu App, otrzymanego od zainfekowanych zwierząt cierpiących na tę chorobę, dokonuje się zgodnie ze zwykłymi metodami znanymi fachowcom w dziedzinie.

Pierwszy etap obejmuje identyfikację transbłonowych domen App hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx z zastosowaniem programów TransMem (Aloy i in.; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) lub Helixmem (Eisenbeg i in.; J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)), które analizują sekwencje aminokwasowe hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn Apx, jak opisał dla E. coli Ludwig i in; Mol. Gene. Genet. 226: 198-208 (1991).

Drugi etap obejmuje modyfikację co najmniej jednego segmentu genu apxIA i ewentualnie segmentu genu apxIIA, kodującego transbłonową domenę hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.

Termin „modyfikacja odnosi się do modyfikacji genu albo z zastosowaniem typowych technik rekombinacji DNA, które obejmują: substytucję jednego lub kilku nukleotydów, insercję jednego lub kilku nukleotydów, częściową lub całkowitą delecję genu, albo przez rozbicie przez chemiczną lub wywołaną napromienianiem mutagenezę.

W korzystnym rozwiązaniu modyfikację przeprowadza się przez delecję, w co najmniej jednym segmencie, genu apxIA i ewentualnie w segmencie genu apxIIA, kodującego transbłonową domenę hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.

PL 212 312 B1

Domeny transbłonowe, występujące w genach apxIA i apxIIA hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny, wykrywano stosując wyżej wymienione programy Transmem i Helixmem. Przewidywanie przeprowadzone na podstawie sekwencji aminokwasowych hemolitycznych i cytolitycznych egzotoksyn ApxI i ApxII wskazuje, że domeny transbłonowe, występują w następujących obszarach sekwencji egzotoksyny:

- pierwsza domena transbłonowa H1: pomię dzy aminokwasami 233 i 253 odpowiadająca nukleotydom 697 do 759 apxl.

- druga domena transbłonowa H2: pomiędzy aminokwasami 296 i 315, odpowiadająca nukleotydom 886 do 945 apxl

- trzecia domena transbł onowa H3: pomię dzy aminokwasami 369 do 405, odpowiadają ca nukleotydom 1105 do 1215 apxl

W korzystnym rozwiązaniu, modyfikację przeprowadza się za pomocą delecji w segmencie genu apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI szczepu App.

Korzystnie, modyfikację przeprowadza się na drodze delecji nukleotydów 886 do 945 genu apxIA, kodującego drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI App.

W innym korzystnym rozwiązaniu, sposób według wynalazku, obejmuje ponadto uzyskanie dodatkowej delecji w segmencie genu apxIIA, kodującego drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII App. Korzystnie, delecji nukleotydów 886 do 945 genu apxIIA, kodującego drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII App.

W korzystnym rozwią zaniu wedł ug wynalazku, które szczegó ł owo opisano w części „przykłady, uzyskano immunogenny niehemolityczny szczepu App stosując proces obejmujący następujące etapy:

A. Wybór wirulentnego szczepu App.

B. Przewidywanie helis alfa domeny transbłonowej białek ApxI i ApxII w celu zaprojektowania kostruktu nukleotydowego, umożliwiającego delecję w drugiej domenie transbłonowej obu białek bez oddziaływania na proces fałdowania i zdolności uzyskanych hemolizyn do interakcji ze specyficznymi receptorami błonowymi.

C. Konstrukcja wektora zdolnego do integracji z genomem App i zawierającego geny markerowe, które umożliwiają efektywny sposób monitorowania integracji takiego wektora.

C.1. Konstrukcja hybrydowego plazmidu pGP3, mającego miejsce startu replikacji RK 6, miejsce startu transferu RP4 i gen oporności na kanamycynę. Ponadto, włączono gen fluorescencyjnego białka GPVUV (dalej nazywany GFP) pod kontrolą promotora ptac i terminatora rrnB. Miejsce wielokrotnego klonowania także zmodyfikowano, aby ułatwić późniejsze wprowadzenie sekwencji DNA.

C.2. Konstrukcja hybrydowego wektora, zawierającego sekwencje oskrzydlające 5' i 3' drugiej transbłonowej helisy, określonej przez gen apxIA. Zatem, w celu wybrania i sklonowania takich fragmentów sąsiadujących z końcami 5' i 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę w genie apxIA skonstruowano hybrydowy plazmid ρΑρχΙΙΔΗ2. Plazmid ten zastosowano jako końcowy wektor do transformacji App.

C. 3. Konstrukcja hybrydowego wektora, zawierającego sekwencje oskrzydlające 5' i 3' drugiej transbłonowej helisy określonej przez gen apxIIA. Zatem, w celu wybrania i sklonowania takich fragmentów przylegających do końców 5' i 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę w genie apxIIA skonstruowano hybrydowy plazmid pAppx^H2. Plazmid ten zastosowano jako końcowy wektor do transformacji App.

D. Konstrukcja zrekombinowanych bakterii, zawierających wprowadzony do genomu plazmid hybrydowy.

D.1. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App nazwanego HP816R1, który włącza hybrydowy plazmid pApxI.\H2 do genomu App w wyniku unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy takim plazmidem i genomem App HP816 Nl^r, który to szczep jest szczepem opornym na kwas nalidyksowy, otrzymanym w wyniku spontanicznej mutacji szczepu App HP816.

D.2. Konstrukcja szczepu AppApxIH2^- z zastosowaniem procedury umożliwiającej, gdy zidentyfikuje się zrekombinowane bakterie otrzymane w etapie 1, oddzielenie zrekombinowanego wektora zintegrowanego z genomem poprzez drugą homologiczną rekombinację, jak również wykrywanie i izolację bakterii, które, z uwagi na tę drugą rekombinację, posiadają częściową delecję genu apxIA.

D.3. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App HP816R2, który włącza hybrydowy plazmid pApxI.\H2 do genomu AppApxIH2^- w wyniku unikalnej homologicznej rekombinacji pomiędzy takim plazmidem i genomem AppApxIH2^-.

PL 212 312 B1

D.4. Konstrukcja szczepu AppApxI/IIH2^- z zastosowaniem procedury umożliwiającej, po zidentyfikowaniu zrekombinowanych bakterii otrzymanych w etapie D.3, oddzielenie zrekombinowanego wektora zintegrowanego z genomem za pomocą drugiej homologicznej rekombinacji, jak również wykrycie i wyizolowanie bakterii, które, na skutek drugiej rekombinacji, nabyły częściową delecję w genie apxIIA.

Zgodnie z wynalazkiem otrzymany mutant AppApxIH2^- jest identyczny z oryginalnym szczepem App typu dzikiego, za wyjątkiem delecji nukleotydów 886 do 945 (obu włącznie) sekwencji kodującej genu apxIA, co wiąże się z brakiem aminokwasów 296 do 315 (obu włącznie) w wytwarzanej ApxI.

Zgodnie z wynalazkiem, otrzymany mutant AppApxI/IIH2^- jest identyczny ze szczepem ApppxIH2 za wyjątkiem delecji nukleotydów 886 do 945 (obu włącznie) sekwencji kodującej genu apxIIA, co wiąże się z brakiem aminokwasów 296 do 315 (obu włącznie) w wytwarzanej ApxII.

W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku jedyną modyfikacją wprowadzaną do genomu App jest delecja 60 par zasad w sekwencjach kodujących genów apxIA i apxIIA oraz substytucja ich przez miejsca restrykcyjne, w tym przypadku odpowiadające odpowiednio miejscom dla enzymów XholI i EcoRI. Do genomu App nie wprowadza się żadnych dodatkowych insercji sekwencji pochodzących od plazmidowego DNA (jak na przykład gen oporności na kanamycynę). Umożliwia to zmodyfikowanie otrzymanego szczepu w tym samym genie lub w innym docelowym genie w dokładnie ten sam sposób, który zastosowano do przeprowadzenia pierwszej modyfikacji. Z drugiej strony, unika się oporności uzyskanego szczep na wiele antybiotyków, co jest cechą pożądaną w szczepie stosowanym jako żywa szczepionka.

Stosowane miejsce restrykcyjne według wynalazku nie jest najważniejsze. Chociaż można zastosować konstrukcję, która nie wprowadza miejsc restrykcyjnych - jej zastosowanie jest korzystne z uwagi na występowanie dodatkowego mechanizmu do wykrywania pożądanych zrekombinowanych klonów i z uwagi na możliwość obserwacji trwałości otrzymanego szczepu lub szczepów. Zatem można posłużyć się dowolnym miejscem, pod warunkiem, że nie wprowadza się kodonu stop syntezy białka i że uzyska się fragmenty restrykcyjne możliwe do zanalizowania metodą elektroforezy (tj. powyżej 100 par zasad) z oskrzydlającymi fragmentami restrykcyjnymi, które mogły uprzednio występować w genomie App.

Wynalazek obejmuje także szczep App otrzymany zgodnie z powyżej opisanym sposobem.

Innym przedmiotem wynalazku jest szczep App charakteryzujący się delecją nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, które kodują drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI, zdeponowany w Colección Espań ola de Cultivos Tipo (Spanish Collection of Type Cultures) pod numerem rejestracyjnym CECT 5985, zgodnie z Traktatem Budapesztańskim z 28 kwietnia 1977, lub jego mutant.

Innym przedmiotem wynalazku jest szczep App charakteryzujący się delecją nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, które kodują drugą transbłonową domenę egzotoksyny ApxI i dodatkowo delecją nukleotydów 886 do 945 w genie apxIIA, które kodują drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII, zdeponowany w Spanish Collection of Type Cultures pod numerem rejestracyjnym CECT 5994, zgodnie z Traktatem Budapesztańskim, lub jego mutant.

Wynalazek dotyczy także szczepionek do ochrony zwierząt przed zapaleniem płuc i opłucnej u ś wiń. Te szczepionki można wytworzyć zgodnie z stosowanymi zwyczajowo sposobami znanymi fachowcom w dziedzinie.

Te szczepionki zawierają bakterie żywego atenuowanego szczepu App w ilości wywołującej odpowiedź immunologiczną, otrzymane zgodnie ze sposobem według wynalazku. Termin „wywołujący odpowiedź immunologiczną oznacza, że bakterie w szczepionce podawane są w ilości wystarczającej do indukcji w organizmie gospodarza skutecznej odpowiedzi immunologicznej na infekcję spowodowaną przez wirulentne formy App.

Stosowane dawkowanie będzie zależeć od wieku i masy szczepionego zwierzęcia oraz postaci podawania.

Szczepionka może zawierać bakterie w dowolnej dawce wystarczającej do indukcji odpowiedzi immunologicznej. Odpowiednie dawkowanie obejmuje zakres pomiędzy 10³ i 10¹⁰.

Szczepionka może ponadto zawierać farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą. Ta substancja pomocnicza może być po prostu wodą, lecz może także obejmować płynne podłoże hodowlane, na którym rosły bakterie lub roztwór o fizjologicznym stężeniu soli.

Inny przykład farmaceutycznie dopuszczalnej substancji pomocniczej, przydatnej według wynalazku obejmuje stabilizatory, węglowodany (tj.: glukozę, sacharozę, mannitol, sorbitol) i bufory (tj.: bufory fosforanowe).

PL 212 312 B1

Ewentualnie, do szczepionki można dodawać inne składniki pomocnicze. Te substancje pomocnicze są niespecyficznymi stymulantami układu immunologicznego, które zwiększają odpowiedź immunologiczną gospodarza na atakujące patogeny. Przykłady środków wspomagających obejmują: witaminę E i olej roślinny.

Szczepionkę można podawać zwierzętom donosowo, doskórnie, podskórnie, jako aerozol lub domięśniowo.

Przemysłowe zastosowanie wynalazku łatwo wywnioskować z opisu. Warto wspomnieć, że zapalenie płuc i opłucnej u świń jest występującą na całym świecie zakaźną chorobą układu oddechowego powodującą poważne straty ekonomiczne w przemyśle hodowlanym świń oraz że sposób według wynalazku otrzymywania immunogennych, niehemolitycznych szczepów App umożliwia wytwarzanie skutecznej szczepionki do zwalczania zapalenia płuc i opłucnej u świń.

Poniższe przykłady zamieszczono w celu dostarczenia fachowcom w dziedzinie dostatecznie obszernego i wyczerpującego objaśnienia wynalazku, lecz nie należy ich traktować jako ograniczania jego zasadniczych aspektów opisanych w poprzedniej części tego opisu.

P r z y k ł a d

Techniki i metody rekombinacji DNA stosowane poniżej opisali szczegółowo Sambrook i Russell (w Molecular Cloning wyd. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001) i Ausubel i in.; Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998)). Wszystkie produkty PCR wklonowano uprzednio do plazmidu pBE przed strawieniem enzymami restrykcyjnymi. Ten plazmid jest pochodną wektora pBluescript SK2 (Stratagene) i posiada miejsce wielokrotnego klonowania zastąpione krótką nukleotydową sekwencją, która wyznacza jedynie miejsce restrykcyjne dla enzymu restrykcyjnego EcoRV.

Szczep E. coli XL1-blue (Stratagene) zastosowano jako gospodarza dla wektorów hybrydowych na bazie plazmidów pUC118 lub pBluescript SK. Jako gospodarza dla wektorów hybrydowych na bazie plazmidu pGP704 użyto szczepu E. coli S17-1 λ pir (Simon i in.; Biotechnology 1:784-791 (1983).

Wszystkie poniżej opisane sekwencje oligonukleotydowe, o ile nie zaznaczono inaczej, pisane są w kierunku 5' do 3'. We wszystkich reakcjach PCR zastosowano termostabilną polimerazę Deep Vent (New England Biolabs), wykazującą aktywność poprawiającą test.

A. Wybór wirulentnego szczepu App

Jako szczep App typu dzikiego wybrano szczep HP816, odpowiadający występującemu w naturze serotypowi typu 1 App, należący do Laboratorios Hipra S.A. (Amer - Girona - Spain).

Szczep HP816Nl^r jest szczepem odpornym na kwas nalidyksowy otrzymanym ze spontanicznego mutanta HP816 typu dzikiego.

B. Identyfikacja domen transbłonowych egzotoksyn ApxI i ApxII

Trzy domeny transbłonowe, które przyjmują strukturę α-helisy zidentyfikowano za pomocą programów TransMem (Aloy i in.; Comp. Appl. Biosc. 13:213-234 (1997) i Helixmem (Eisenbeg i in.; J. Mol. Biol,179: 125-142 (1984) jak opisano dla E. coli (Ludwig i in.; Mol. Gene. Genet. 226:198-208 (1991) stosowanych do sekwencji aminokwasowej ApxI pochodzącej ze szczepu o serotypie 1 (Frey i in.; Gene 142: 97-102 (1994) i ApxII z serotypu typu 9 (Smits i in.; Infection and Immunity 59:44974504 (1991). Te programy wykryły trzy regiony, mogące działać jako transbłonowe helisy w obydwu białkach (fig 1): pierwsza domena transbłonowa znajduje się pomiędzy aminokwasami 233 i 253 (H1); druga domena transbłonowa znajduje się pomiędzy aminokwasami 296 i 315 (H2), a trzecia domena transbłonowa pomiędzy aminokwasami 369 i 405 (H3) białka ApxI.

C. Konstrukcja hybrydowych wektorów, zdolnych do włączenia się do genomu App

Na fig. 2 można zobaczyć mapy plazmidów, które opisano w tej części.

C.1. Konstrukcja zrekombinowanego plazmidu pGP3 Plazmid pGP704 (Miller i Mekalanos; J. Bact. 170:2575- 2583 (1988) przecięto jednocześnie enzymami restrykcyjnymi BglII i EcoRI. Stosując elektroforezę w żelu agarozowym wyizolowano 3,7 kb fragment DNA. Ten fragment inkubowano Iigując razem z oligonukleotydami pGP5' (GAT CGA ATT CAG GAT ATC ACA GAT CT) (SEQ ID nr 3) i pGP3' (ATT TAG ATC TGT GAT ATC GTG AAT TC) (SEQ ID nr 4). Otrzymany zrekombinowany plazmid nazwano pGP1.

Plazmid pGP1 strawiono enzymem restrykcyjnym PstI. Stosując elektroforezę w żelu agarozowym wyizolowano 3,12 kb fragment DNA. Ten fragment zligowano z innym fragmentem o wielkości

1,2 kb otrzymanym przez strawienie plazmidu pUC4K (Pharmacia) enzymem restrykcyjnym PstI.

Tak otrzymany zrekombinowany plazmid nazwano pGP2.

PL 212 312 B1

Stosując plazmid pMAL-p2 (New England Biolabs) sekwencje odpowiadające promotorowi ptac zamplifikowano metodą PCR stosując primery oligonukleotydowe ptac5' (GAA TTC AAT GCT TCT GGC GTC AG) (SEQ ID nr 5) i ptac3' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID nr 6), które zawierają odpowiednie miejsca restrykcyjne dla EcoRI i KpnI na swych końcach 5'. Także z plazmidu pMAL-p2, metodą PCR zamplifikowano sekwencje odpowiadające rho-niezależnemu terminatorowi operonu rrnB stosując primerowe oligonukleotydy rrnB5' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID nr 7) i rrnB3' (GAA TTC AAG AGT TTG TAG AAA CGC) (SEQ ID nr 8), które zawierają miejsca restrykcyjne odpowiednio dla KpnI i EcoRI na swych końcach 5'. Wielkość zamplifikowanego fragmentu DNA wynosiła 278 par zasad (pz).

Z plazmidem pAG408 (Suarez i in.; Gene 196: 69-74 (1997) amplifikowano gen fuzyjny dla białka GFPUV z regionem wiążącym się z rybosomem genu atpE, stosując oligonukleotydy primerowe GFP5' (GGT ACC TAA TTT ACC AAC ACT AC) (SEQ ID nr 9) i GFP3' (GGT ACC TTA TTT GTA GAG CTC ATC) (SEQ ID nr 10), które zawierają miejsce restrykcyjne KpnI na swych końcach 5'. Amplifikowany fragment ma wielkość 830 pz.

Dwa pierwsze fragmenty (promotor ptac i terminator rrnB) strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i EcoRI, podczas gdy ten trzeci (gen fuzyjny atpE-GFPUV) strawiono enzymem restrykcyjnym KpnI. Otrzymane w ten sposób trzy fragmenty następnie zligowano z plazmidem pGP2, który uprzednio zdefosforylowano i przecięto enzymem restrykcyjnym EcoRI. Spośród różnych otrzymanych zrekombinowanych plazmidów wybrano jeden, będący nośnikiem trzech fragmentów umieszczonych zgodnie z fig. 2. Kolonie, które zawierały ten plazmid, wykazywały intensywną fluorescencję w odpowiedzi na ekspozycję na światło ultrafioletowe. Tak otrzymany hybrydowy plazmid nazwano pGP3.

C.2. Konstrukcja hybrydowego plazmidu pApx^H2

Na tym etapie, pierwszym zadaniem było otrzymanie fragmentu DNA przylegającego do końca 5' fragmentu kodującego drugą transbłonową helisę genu apxIA. W tym celu fragment o długości 897 pz zamplifikowano metodą PCR z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816 stosując jako primery oligonukleotydy Apxla5' (GAT ATC ATG GCT AAC TCT CTC AGC TCG ATA G) (SEQ ID nr 11) i Apxla3' (CTC GAG GCC TGC CGC CAC ACG TTG) (SEQ ID nr 12), zawierające miejsca restrykcyjne dla EcoRV i XhoI na swych odpowiednich końcach 5'. Siódma zasada oligonukleotydu Apxla5' (SEQ ID nr 9) odpowiada pierwszej zasadzie kodonu start translacji genu apxIA. Siódma zasada oligonukleotydu Apxla3' (SEQ ID nr 10) jest komplementarna do 885 zasady sekwencji kodującej genu apxIA, przy czym ta ostatnia jest ostatnią zasadą przed początkiem sekwencji dla drugiej transbłonowej helisy.

Drugim zadaniem w tej fazie było otrzymanie fragmentu DNA przylegającego do końca 3' kodującego segmentu drugiej transbłonowej helisy genu apxIA. W tym celu, posługując się metodą PCR zamplifikowano fragment o długości 1042 pz z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816, stosując jako primery oligonukleotydy Apxlb5' (CTC GAG CCG CTT TCG TTC TTA AAT GTT GCG) (SEQ ID nr 13) i Apxlb3' (AGA TCT TCA CCG GCT TTC TGT GCA CTT TG) (SEQ ID nr 14), które zawierają miejsca restrykcyjne XhoI i BglII na odpowiednich końcach 5'. Siódma zasada oligonukleotydu Apxlb5' (SEQ ID nr 13) odpowiada zasadzie 946 sekwencji kodującej genu apxIA, stanowiąc tym samym pierwszą zasadę po końcu sekwencji drugiej transbłonowej helisy. Siódma zasada oligonukleotydu Apxlb3' (SEQ ID nr 14) jest komplementarna do zasady 1975 sekwencji kodującej genu apxIA.

Po otrzymaniu dwóch uprzednio opisanych fragmentów, pierwszy z nich strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRV i XhoI, natomiast drugi strawiono enzymami XhoI i BglII. Oba fragmenty następnie zligowano z wektorem pGP3, który uprzednio przecięto enzymami restrykcyjnymi EcoRV i BglII. Uzyskany hybrydowy plazmid nazwano pApx^H2.

C.3. Konstrukcja hybrydowego plazmidu pApxI^H2

Pierwszym zadaniem, na tym etapie, było otrzymanie fragmentu DNA przyległego do końca 5' segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy genu apxIIA. W tym celu, posługując się metodą PCR zamplifikowano 871 pz fragment z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816, stosując jako primery oligonukleotydy ApxIIa5' (GAT ATC AAA TCG TCC TTA CAA CAA GGA TTG) (SEQ ID nr 15) i ApxIIa3' (GAA TTC ACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC) (SEQ ID nr 16), które zawierają miejsca restrykcyjne EcoRV i EcoRI na odpowiednich końcach 5'. Zasada numer 7 oligonukleotydu ApxIIa5' (SEQ ID nr 15) odpowiada zasadzie 27 sekwencji kodującej genu apxIIA. Siódma zasada oligonukleotydu ApxIIa3' (SEQ ID nr 16) jest komplementarna do zasady 885 sekwencji kodującej genu apxIIA, będąc tym samym ostatnią zasadą przed startem sekwencji dla drugiej transbłonowej helisy.

PL 212 312 B1

Drugim zadaniem tego etapu było otrzymanie fragmentu DNA przyległego do końca 3' segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy genu apxIIA. W tym celu metodą PCR zamplifikowano fragment o długości 952 pz z oczyszczonego genomowego DNA szczepu App HP816, jako primery stosując oligonukleotydy ApxIIb5' (GAA TTC CCT CTT TCA TTC TTA AAT GTA GC) (SEQ ID nr 17) i ApxIIb3' (AGA TCT GCC ATC AAT AAC GGT AGT ACT TG) (SEQ ID nr 18), które zawierają miejsca restrykcyjne dla EcoI i BglII na odpowiednich końcach 5'. Siódma zasada oligonukleotydu ApxIIb5' (SEQ ID nr 17) odpowiada zasadzie 946 sekwencji kodującej genu apxIIA, przy czym ta ostatnia jest pierwszą zasadą za końcem sekwencji drugiej transbłonowej helisy. Siódma zasada oligonukleotydu ApxIIb3' (SEQ ID nr 18) jest komplementarna do zasady 1845 sekwencji kodującej genu apxIIA.

Po otrzymaniu dwóch uprzednio opisanych fragmentów, pierwszy strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRV i EcoRI, podczas gdy drugi strawiono enzymami EcoRI i BglII. Oba fragmenty następnie zligowano z wektorem pGP3, uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRV i BglII. Powstały hybrydowy plazmid nazwano pApxI^H2.

D. Konstrukcja zrekombinowanych bakterii, które usunęły hybrydowy plazmid wprowadzony do genomu

D.1. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App HP816R1

Transformację App z zastosowaniem hybrydowego plazmidu pApx^H2 przeprowadzono przez koniugację z komórkami E. coli S17-1 λ pir, które są nośnikami tego plazmidu. Szczep HP816Nl^r zastosowano do transformacji z użyciem hybrydowego plazmidu pApx^H2.

Przed przeprowadzeniem koniugacji, otrzymano hodowlę tych bakterii w fazie stacjonarnej. Do hodowli App816Nl^r użyto podłoża hodowlanego TSYN (bulion Soya Tryptic 30 g/l, ekstrakt drożdżowy 6 g/l, jednokrotnie autoklawowany, uzupełniony 0,004% NAD) i kwasu nalidyksowego (50 μg/ml).

Do hodowli E. coli S17-1 λ pir użyto podłoża hodowlanego LB (Trypton 10 g/l, ekstrakt drożdżowy 5g/l, NaCl 10g/l) jednokrotnie autoklawowanego, uzupełnionego 25 μg/ml kanamycyny. Po osiągnięciu stacjonarnej fazy wzrostu, do 1 ml 10 mM roztworu MgSO4 dodano 0,2-0,3 A600 jednostki hodowli App i 0,6-0,8 A600 jednostki hodowli E. coli. Następnie wirowano przez 2 minuty przy 15000 g i tak otrzymany osad ponownie zawieszono w 200 μl 10 mM roztworze MgSO₄. Po otrzymaniu mieszaniny obu kultur, umieszczono ją na 2,5 cm i 0,45 nm filtrze nitrocelulozowym, uprzednio umieszczonym na płytce Petriego zawierającej podłoże TSYN uzupełnione 15 g/l agaru Noble. Po inkubacji przez 6 godzin w temperaturze 37°C filtr z koniugatem umieszczono w probówce zawierającej 2 ml PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM, KCl 2mM pH 7,4). Po energicznym wytrząsaniu, filtr usunięto i zawiesinę komórek wirowano przez 2 minuty przy 15000 g i osad ponownie zawieszono w 500 μl PBS. Tak otrzymaną zawiesinę rozdzielono na płytki Petriego z podłożem TSYN uzupełnionym 15 g/l agaru Noble, 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego, w ilości 100 μl zawiesiny komórek na każdą płytkę Petriego. Uzyskane kultury inkubowano w temperaturze 37°C przez 24-36 godzin. Zgodnie z tą procedurą otrzymano 65 kolonii odpornych na kanamycynę i kwas nalidyksowy, do koniugacji z plazmidem pApxI.\H2, co równa się częstotliwości transformacji 1,3 x 10^-7 dla każdej komórki receptorowej.

Kilka kolonii powtórnie wysiano za pomocą ezy na płytkach Petriego zawierających podłoże LB uzupełnione 15 g/l Noble Agar, 0,004% NAD, 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego. Wszystkie uzyskane kolonie wykazały wyraźną fluorescencję w odpowiedzi na ekspozycję na światło ultrafioletowe, co wskazuje na włączenie plazmidu do genomu App w wyniku unikalnej rekombinacji. Jak pokazano na fig. 3, gdyby zaszła podwójna rekombinacja, ekskoniuganty byłyby niezdolne do wzrostu w podłożu zawierającym kanamycynę. Obecność tego antybiotyku na płytkach umożliwia wzrost tylko tych rekombinantów, które wbudowały cały plazmid do swego genomu. Wskaźnikowy gen GFP umożliwia rozróżnienie, czy którakolwiek z kolonii odpornych na kanamycynę jest produktem mutacji spontanicznej.

Na koniec, uzyskano rekombinanty z homologicznej rekombinacji pomiędzy plazmidem i genem apxIA. Zweryfikowano to przez obserwację hemolitycznej aktywności rekombinantów na płytkach Columbia z agarem z krwią, uzupełnionym 0,004% NAD (fig. 3, panel C). Rekombinanty zawierające plazmid pApx^H2 wykazują drastyczne zmniejszenie średnicy hemolitycznego halo w porównaniu z macierzystym szczepem HP816Nl^r.

Jeden z rekombinantów zawierających plazmid pApxI.\H2 wybrano do późniejszego pasażowania i nazwano HP816R1.

D.2. Konstrukcja szczepu AppApxIH2^-

PL 212 312 B1

Po otrzymaniu rekombinantów zawierających plazmid ρΑρχΙΔΗ2 wbudowany do genomu, ważne jest utrwalenie delecji w genomie App za pomocą drugiej rekombinacji. W tym celu jeden z rekombinantów uzyskanych w poprzednim etapie poddano serii pasażów w podłożu hodowlanym uzupełnionym tylko kwasem nalidyksowym. Podłoże nie zawierające kanamycyny pozwala na przeżycie bakterii, u których wystąpiła druga rekombinacja pomiędzy genomem App i zintegrowanym plazmidem. Ta druga rekombinacja powoduje powstanie dwóch różnych genotypów. W przypadku, gdy występuje ona w tym samym segmencie, w którym zaszła pierwsza rekombinacja, uzyskany genotyp będzie identyczny z macierzystym szczepem użytym w rozdziale D.1. Jeśli ta druga rekombinacja występuje w segmencie, w którym nie wystąpiła pierwsza rekombinacja, uzyskany genotyp będzie wykazywać delecję we fragmencie kodującym drugą transbłonową helisę hemolizyny (fig. 3, panel A). Pojawienie się rekombinantów można monitorować na kilka różnych sposobów: a) obserwując zanik fluorescencji po ekspozycji na światło ultrafioletowe; b) na podstawie wrażliwości na kanamycynę i c) ponowne pojawienie się hemolitycznego halo występującego w przypadku macierzystego szczepu użytego w rozdziale D.1. Dzięki metodom a) i b) wykryć można oba typy rekombinantów. Metoda c) umożliwia odróżnienie tych rekombinantów, które powróciły do macierzystego geneotypu. Jest to spowodowane tym, że w przypadku rekombinantów, które zawierają delecję w segmencie kodującym drugiej transbłonowej helisy genu apxIA, hemolityczną aktywność odpowiedniego macierzystego fenotypu nie jest przywracana.

Z poprzednich pasażów wykonano serię kolejnych pasaży stosując rozcieńczenie poprzedniego pasażu 1/10000, z wyjątkiem pierwszego pasażu, który po prostu składał się z hodowli otrzymanej z kolonii wyizolowanej z HP816R1. Podłożem hodowlanym było LB uzupełnione 0,004% NAD i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego. Do każdego pasażu zastosowano podłoże w objętości 10 ml. Procentowy udział wykrywanych rekombinantów przedstawiono w tablicy 1

T a b l i c a 1

Numer pasażu	% wykrywanych rekombinantów (a)	% wykrywanych rekombinantów (b)
2	0,12%	0,18%
3	0,32%	0,46%
4	7,75%	10,4%
5	18,5%	22,3%

a) procent określony przez zliczenie kolonii, które odzyskały zdolność tworzenia hemolitycznego halo występującego w przypadku szczepu macierzystego.

b) procent określony przez zliczenie kolonii, które nie wykazały fluorescencji po ekspozycji na światło ultrafioletowe.

Jak widać na powyższej tablicy, z każdym pasażem zwiększa się ilość bakterii, które wykazują rozdzielenie plazmidu na skutek drugiej rekombinacji. Procent kolonii nie wykazujących fluorescencji jest tylko nieznacznie większy niż kolonii, które odzyskały hemolityczną aktywność. Ten fakt sugeruje, że druga rekombinacja występuje korzystnie w tym samym segmencie DNA, w którym wystąpiła pierwsza rekombinacja. Jeśli częstotliwość dla każdego typu rekombinatów wynosiła 50%, podwojono liczbę niefluorescencyjnych kolonii z uwzględnieniem tych, które odzyskały hemolityczną aktywność.

Z chwilą, gdy kulturę dostatecznie wzbogaci się w drugie rekombinanty, można rozpocząć etap oczyszczania. W tym celu kilka kolonii nie wykazujących fluorescencji propagowano na agarze Columbia uzupełnionym NAD i agarze LB uzupełnionym NAD, 50 μg/ml, kwasu nalidyksowego i 20 μg/ml kanamycyny (LBNKm). Do późniejszych badań, wybrano kilka kolonii, które nie wykazały wzrostu na LBNKm i które wykazały taką samą hemolityczną aktywność, jak rekombinant HP816R1 otrzymany w wyniku insercji.

D.3. Konstrukcja zrekombinowanego szczepu App HP816R2

Transformację App z zastosowaniem pApxII.\H2 przeprowadzono przez koniugację S17-1 λ pir

E. coli, które są nośnikami tych plazmidów. Do transformacji użyto szczepu AppApxIH2^- z hybrydowym plazmidem pApx^H2. Metody i podłoża hodowlane są identyczne jak opisano w rozdziale D.1. Częstotliwość transformacji plazmidem pApxII.\H2 była podobna do uzyskanej w rozdziale D.1. dla plazmidu pApx^H2.

Kilka kolonii powtórnie wysiano za pomocą ezy na płytkach Petriego z LB uzupełnionym 15 g/l agaru Noble 0,004% NAD, 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml kwasu nalidyksowego. Wszystkie uzyska12

PL 212 312 B1 ne kolonie wykazały wyraźną fluorescencję w odpowiedzi na ekspozycję na światło ultrafioletowe, co wskazuje na wbudowanie plazmidu do genomu App w wyniku jednokrotnej rekombinacji. Jak widać na fig. 4, jeśli wystąpi podwójna rekombinacja, ekskoniuganty będą niezdolne do wzrostu na podłożu zawierającym kanamycynę. Obecność tego antybiotyku na płytkach umożliwia wzrost tylko tych rekombinantów, które mają wbudowany do swego genomu cały plazmid. Wskaźnikowy gen GFP umożliwia rozróżnienie, czy którakolwiek z kolonii, które są odporne na kanamycynę, jest produktem spontanicznej mutacji.

Na koniec, otrzymano rekombinanty z homologicznej rekombinacji pomiędzy plazmidem i odpowiednim genem apxIIA. Dowiedziono tego przez obserwację hemolitycznej aktywności rekombinantów na płytkach Columbia z agarem uzupełnionym 0,004% NAD (fig. 4, panel C). Uzyskane rekombinanty z plazmidem pApxIIH2 wykazują całkowity zanik zdolności do tworzenia hemolitycznego halo.

Jeden spośród rekombinantów otrzymanych z plazmidem pApxII.\H2 wybrano do późniejszego pasażowania i nazwano HP816R2.

D. 4. Konstrukcja szczepu AppApxI/IIH2^-

Po otrzymaniu rekombinantów z plazmidem pApxI^H2 wbudowanym do genomu ważne jest utrwalenie delecji w genomie App za pomocą drugiej rekombinacji. W tym celu, rekombinanty otrzymane w poprzednim etapie poddano serii pasaży w podłożu hodowlanym uzupełnionym tylko kwasem nalidyksowym jak opisano w D.2. Wartości procentowe wykrywanych rekombinantów z drugiego pasażu są podobne do uzyskanych w D.2.

Po dostatecznym wzbogaceniu hodowli w drugorzędowe rekombinanty, przeprowadza się etap oczyszczania. Mając to na uwadze, kilka kolonii nie wykazujących fluorescencji namnożono na agarze Columbia uzupełnionym NAD i agarze LB uzupełnionym NAD, 50 μg/ml kwasu nalidyksowego i kanamycyną 20 μg/ml (LBNKm). Do późniejszych badań wybrano kilka kolonii, które nie wykazywały wzrostu na LBNKm i wykazywały taką samą hemolityczną aktywność jak rekombinant HP816R2 uzyskany w wyniku insercji.

E. Analiza DNA oczyszczonego z kolonii wyizolowanych w poprzednim pasażu, w celu sprawdzenia jednorodności kultur i obecności delecji w genach apxIA i apxIIA

Rekombinanty z poprzednich pasaży D.2 i D.4 hodowano w 10 ml podłoża TSYN uzupełnionego 50 μg/ml kwasu nalidyksowego aż do osiągnięcia stacjonarnej fazy wzrostu. Następnie przeprowadzono ekstrakcję DNA każdego z nich.

E.1. Analiza rekombinantów apxIH2^-

Próbki genomowego DNA odpowiadające każdej z kultur drugich rekombinantów otrzymanych z plazmidem pApx^H2 strawiono enzymem restrykcyjnym XhoI. Próbki z tego trawienia, razem z innymi otrzymanymi z ekstrakcji DNA odpowiednio z kultur szczepu HP816Nl^r i HPB816R1, zanalizowano metodą Southern-blot stosując fragment DNA o długości 1927 pz pochodzący z trawienia plazmidu pAApx1H2^- enzymami restrykcyjnymi EcoRV i BglII jako sondą. Wyniki tych hybrydyzacji przedstawiono na fig. 3B. Wyniki hybrydyzacji szczepu kontrolnego HP816Nl^r wskazują na obecność miejsca restrykcyjnego dla XhoI umieszczonego w odległości około 20 kb od miejsca stwierdzonego wewnątrz operonu apxl. Analiza rekombinanta z wprowadzonym plazmidem pApxI.\H2, wskazuje na pojawienie się dwóch nowych prążków o wielkości 1,1 i 4,3 kb i nieznaczne zwiększenie wcześniej istniejącego prążka o wielkości 20 kb o około 1 kb. Wielkość nowych prążków i powiększenie wcześniej istniejącego, są takie jak się spodziewano na podstawie wprowadzenia hybrydowego plazmidu pΑpxΔΗ2 do regionu oskrzydlającego 5' kodującego fragmentu drugiej transbłonowej helisy genu apxIA genomu App (fig. 3A, szkic 2). Analiza rekombinanta z usuniętym plazmidem z drugiej rekombinacji w tym samym regionie 5', gdzie zaszła pierwsza, wskazuje na zanik dwóch prążków o mniejszej masie cząsteczkowej i nieznaczne zmniejszenie mobilności poprzedniego prążka 21 kb, który obecnie pojawia się na takim samym poziomie jak w szczepie macierzystym. To, wraz z faktem, że hemolityczną aktywność jest identyczna do wykazywanej przez macierzysty szczep HP816Nl^r, sugeruje, że podczas wszystkich tych procesów nie wprowadzono do genomu App żadnych dodatkowych modyfikacji (fig. 3, A i C).

Wreszcie analiza rekombinanta zawierającego usunięty plazmid z drugiej rekombinacji w regionie oskrzydlającym 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę, wskazuje zniknięcie prążka 4,3 kb, utrzymanie prążka 1,1 kb, który już zaobserwowano u rekombinanta uzyskanego w wyniku insercji i nieznaczne zmniejszenie prążka 20 kb. Ten rozkład prążków jest taki jak się spodziewano po zniknięciu kodującego segmentu drugiej transbłonowej helisy i jego zamianie na miejsce restrykcyjne dla XhoI. To nowe miejsce restrykcyjne, wprowadzone do genomu App, powoduje powstanie

PL 212 312 B1 fragmentu 1,1 kb i co za tym idzie zmniejszenie o 1,1 kb prążka o długości 20 kb, który obserwuje się w szczepie 816 Nl^r (fig. 3A i B). Należy zauważyć obecność na podłożu CA dużych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i małych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 2, 4 i 5. Należy także dostrzec brak wzrostu na podłożu TS kultur 1, 3, 4 i 5. Ten rekombinant wykazuje bardzo obniżoną hemolityczną aktywność w porównaniu z macierzystym szczepem HP816 Nl^r i taką samą hemolityczną aktywność jak App serotypu 7, który posiada tylko hemolizynę ApxII (fig. 3C). Ten wynik wskazuje, że delecją w drugiej transbłonowej helisie eliminuje lub znacznie obniża hemolityczną aktywność App ApxIA. App zmodyfikowany przez wprowadzenie opisanej delecji nazwany będzie od tego momentu ApxIAH2^-.

Tak otrzymanego rekombinanta, charakteryzującego się delecjami nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI, nazwano AppApxIH2^-. W dniu 10 stycznia 2002 zdeponowano go w Colección Espańola de Cultivos Tipo pod numerem rejestracyjnym CECT 5985, zgodnie z warunkami ustalonymi w Traktacie Budapesztańskim.

E. 2. Analiza rekombinantów apx/IIH2^-

Próbki genomowego DNA odpowiadające rekombinantowi HP816R2 otrzymanemu w wyniku insercji i drugiemu rekombinantowi otrzymanemu z plazmidem pApxIAH2 strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI. Próbki z tego trawienia razem z innymi uzyskanymi w wyniku ekstrakcji DNA z hodowli szczepu HP816Nl^r, zanalizowano z zastosowaniem metody Southern-blot. Jako sondy użyto dwóch fragmentów DNA zamplifikowanych za pomocą PCR. Odpowiadały one regionom oskrzydlającym 5' i 3' segmentu DNA, który koduje drugą transbłonową helisę ApxII (rozdział B). Wyniki tych hybrydyzacji przedstawiono na fig. 4B. Wyniki hybrydyzacji kontrolnego szczepu HP816 Nl^r wskazują na obecność dwóch miejsc restrykcyjnych dla EcoRI odległych od siebie o 15,7 kb, które ograniczają fragment, w którym zawarty jest operon apxll. Analiza rekombinanta uzyskanego w wyniku wprowadzenia plazmidu pApxIAH2 wykazała zanik prążka 15,7 kb i pojawienie się 3 nowych prążków o wielkości 8,2, 7,5, i 0,9 kb. Wielkość nowych prążków jest wielkością spodziewaną w wyniku wprowadzenia hybrydowego plazmidu pApxIAH2 do regionu oskrzydlającego 3' segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy genu apxIIA genomu App (fig. 4A). Analiza rekombinanta z plazmidem usuniętym wyniku drugiej rekombinacji w tym samym regionie 3', w którym miała miejsce pierwsza, wykazuje ponowne pojawienie się pojedynczego prążka 15,7 kb, który jest zgodny z tym występującym w przypadku szczepu kontrolnego (fig. 4B). Hemolityczną aktywność jest identyczna z wykazywaną przez macierzysty szczep AppApxIH2^- (fig. 4C). Wreszcie analiza rekombinanta z plazmidem usuniętym w wyniku drugiej rekombinacji przez region oskrzydlający 3' segmentu, który koduje drugą transbłonową helisę, wskazuje na zniknięcie prążków 13,5 i 0,9 kb i pojawienie się nowego fragmentu 7,5 kb (fig. 4B). Ten rozkład prążków jest spodziewanym, w wyniku zniknięcia segmentu kodującego drugiej transbłonowej helisy i jego zastąpienia przez miejsce restrykcyjne EcoRI (fig. 4A). To nowe miejsce restrykcyjne wstawione do genomu App powoduje rozszczepienie 15,7 kb fragmentu EcoRI, który zawierał operon apxll w macierzystym szczepie, na dwa fragmenty 8,2 i 7,5 kb (fig 4A i B). Ten rekombinant jest właściwie niehemolityczny (fig. 4C). Ten wynik wskazuje, że delecją w drugiej domenie transbłonowej usuwa lub praktycznie zmniejsza całkowicie hemolityczną aktywność ApxIIA App. ApxIIA zmodyfikowany przez przeprowadzenie opisanej delecji będzie od tej chwili nazywany ApxIIAH2^-. Należy zauważyć obecność na podłożu CA obecność małych hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 1 i 3 i brak hemolitycznych stref przejaśnienia wokół kolonii kultur 2 i 4. Należy także zauważyć brak wzrostu kultur 1, 3 i 4 na podłożu TS.

Tak otrzymanemu zrekombinowanemu szczepowi nadano nową nazwę AppApxI/IIH2^-. Charakteryzuje się on delecjami nukleotydów 886 do 945 w genie apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI i ponadto delecją nukleotydów 886 do 945 genu apxIIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII. Ten szczep zdeponowano w Coleccion Espańola de Cultivos Tipo w dniu 12 czerwca 2002 pod numerem rejestracyjnym CECT 5994 jak wskazano w warunkach Traktatu Budapesztańskiego dla opisów patentowych.

F. Analiza wytwarzania ApxIAH2^- i ApxIIAH2^- przez otrzymane szczepy rekombinantów

W celu określenia czy uzyskane zrekombinowane szczepy wciąż produkowały ApxH2^- określono jej stężenie w podłożu LB. Produkcję Apx wykrywano posługując się monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi względem Apx I i Apx II stosując testy immunologiczne i Western-blot. Jak przedstawiono na fig. 5 (A i B) produkcja i wydzielanie do podłoża ApxIAH2^- i ApxIIAH2^- przez zrekombinowane szczepy następuje zgodnie z tym samym wzorem czasowym jak w przypadku niezmodyfikowanej Apx przez macierzysty szczep typu dzikiego HP816Nl^r. Wszystkie hemolizyny (zmodyfikowane lub

PL 212 312 B1 nie) pojawiają się w podłożu hodowlanym około drugiej połowy fazy wzrostu wykładniczego i osiągają maksymalne stężenie na początku fazy stacjonarnej. Od tego momentu, stężenie wszystkich hemolizyn pozostaje stałe lub nieznacznie maleje. Jak widać na tej samej fig., ApxIAH2^- i ApxIIAH2^-akumulują się aż do osiągnięcie poziomów podobnych do poziomu odpowiedniej niezmodyfikowanej Apx wytwarzanej przez macierzysty szczep typu dzikiego HP816Nl^r. Z drugiej strony wprowadzona delecją jest bardzo mała (18 aminokwasów) i spodziewane jest zmniejszenie masy cząsteczkowej dwóch ApxH2 tylko o 2 kD. Biorąc pod uwagę, że 2 hemolizyny typu dzikiego mają obserwowaną masę cząsteczkową w przybliżeniu 105 kDa, zmniejszenie ich mas cząsteczkowych o 2 kDa jest niezauważalne na żelach poliakrylamidowych i odpowiadających im Western-blotach (fig. 6). Na koniec należy zaznaczyć, że na tej samej fig. nie pojawią się skrócone lub niewłaściwie procesowane produkty polipeptydowe. Należy zauważyć, że 105 kDa na ścieżce 3 wydaje się być wykrywany tylko w (C). Wszystkie te dane wskazują, że mała delecją wprowadzona w obu Apx nie przeszkadza w ich pełnej syntezie i wydzieleniu do podłoża hodowlanego. Po uwolnieniu do podłoża hodowlanego, ApxH2^- wykazuje trwałość podobną do wykazywanej przez odpowiednią nie zmodyfikowaną Apx.

G. Skuteczność atenuacji uzyskanych szczepów

W celu sprawdzenia stopnia atenuacji dwóch skonstruowanych zrekombinowanyxh szczepów, użyto trzymiesięcznych samców i samic świni hybrydowej LWxLD. W różnych doświadczeniach użyto czterech grup świń. Każdy szczep podawano w dawce 10⁸ cfu w 5 ml PBS, każdemu zwierzęciu z 3 pierwszych grup, przez iniekcję dotchawiczą. Wcześniej tę dawkę szczepu typu dzikiego HP816Nl^r dla świni w tym wieku uznano za LD50. Zwierzętom w czwartej grupie podano tylko PBS w pojedynczej dawce 5 ml. Kliniczne objawy notowano codziennie przez okres 7 dni trwania doświadczenia. Wyniki przedstawiono w tablicy 2:

T a b l i c a 2

Szczep	Liczba zwierząt	Dawka App (cfu)	Śmiertel- ność	Dni z zaburzeniami zachowania	Dni z oddechowymi objawami klinicznymi (b)
				0-2	3-4	5-6	0-2	3-4	5-6
HP816Nlr	5	108	2/5	5/5	3/3	3/3	5/5	1/3	0/3
AppApxIH2-	10	108	0	10/10	9/10	4/10	5/10	3/10	3/10
AppApxI/IIH2-	10	108	0	4/10	0/10	0/10	2/10	0/10	0/10
Kontrola (PBS)	5	N. A.	0	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5

(a) Zwierzęta z zaburzeniami uwagi i zdolności do reakcji w obecności opiekuna (dotknięte tą przypadłością/wszystkie) (b) Zwierzęta z zakłóceniami rytmu oddechowego i/lub dusznością (dotknięte tą przypadłością/wszystkie).

Siedem dni po szczepieniu zwierzęta uśmiercono i rejestrowano zaobserwowane makroskopowo uszkodzenia narządów oddechowych. Podczas sekcji przeprowadzono także badania bakteriologiczne.

Wyniki uzyskane w tym doświadczeniu podano w tablicy 3

T a b l i c a 3

Szczep	Liczba zwierząt	Dawka App (cfu)	Śmiertelność	Zwierzęta z uszkodzeniami płuc	Średni indeks uszkodzeń płucnych	Zwierzęta od których wyizolowano App
HP816Nlr	5	108	2/5	4	11,6 ± 2,1	3
AppApxIH2-	10	108	0	7	3,2 ± 4,6	3
AppApxI/IIH2-	10	108	0	0	0	8
Kontrola (PBS)	5	N. A.	0	0	0	0

W trakcie trwania doświadczenia dwa z 5 zwierząt w tej grupie zdechło. Sekcja u czterech na pięć zwierząt wykazała poważne uszkodzenia płuc. U zwierząt, które zaszczepiono szczepem AppA

-pxIH2^- także obserwowano zmianę zachowania, chociaż te objawy zmniejszyły się począwszy od czwartego dnia szczepienia. Objawy kliniczne były łagodniejsze i zaobserwowano je tylko u 50% świń.

PL 212 312 B1

Chociaż żadne ze zwierząt w tej grupie nie zdechło podczas próby, u 70% z nich w czasie sekcji wykazano uszkodzenia, chociaż wszystkie te uszkodzenia okazały się mniejsze niż w poprzedniej grupie. Trzecią grupę szczepiono szczepem AppApx/IIH2^-. Chociaż u czterech zwierząt obserwowano łagodne zmiany zachowania, zmniejszyły się one począwszy od 48 godziny po szczepieniu. Dwa zwierzęta, które wykazały umiarkowane objawy kliniczne także wyzdrowiały w przeciągu 48 godzin po szczepieniu. W sekcji u żadnego ze zwierząt nie zaobserwowano uszkodzeń płuc. Ocenę uszkodzeń płuc przeprowadzono w oparciu o publikację Hannan'a i in.; (Research in Veterinary Science 33:76-88 (1982). Przedstawione wartości są średnimi arytmetycznymi dla każdej grupy podanymi wraz z odchyleniem standardowym. Zgodnie z tymi wynikami, szczep AppApxI/IIH2^- jest niezjadliwy i można go stosować bezpiecznie jako żywą szczepionkę. Ważne jest zaznaczenie, że szczep App wykryto u 80% świń w grupie, którą nim szczepiono, siedem dni po jego podaniu. Ten wynik wskazuje, że żywotność szczepu AppApxI/IIH2^- w doświadczalnej infekcji nie jest zmodyfikowana mimo, że jest on pozbawiony aktywności hemolitycznej. Jest to ważny fakt jeśli, weźmiemy pod uwagę, że istotne jest, by mikroorganizm pozostawał zdolny do życia tak, aby egzotoksyny Apx mogły być wytwarzane i uwalniane. Bez produkcji egzotoksyn Apx, atenuowanego szczepu nie można stosować jako żywej szczepionki, ponieważ byłby on niezdolny do indukowania odpowiedzi immunologicznej, która chroniłaby zwierzę przed przyszłymi infekcjami (Reimer i in.; Microbial Pathogenesis 18:197-209 (1995)). We wszystkich doświadczeniach uzyskano silne działanie immunogenne.

PL 212 312 B1

Lista sekwencji <110> Laboratorios Hipra SA <120> Żywa, atenuowana szczepionka przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń <130> 4467WO334HIP <140> PCT/EP03/12839 <141> 2003-11-17 <150> ES P 200202663 <151> 2002-11-20 <160> 18 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 3072 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <300>

<308> ΝΟΒΙ/Χ68595

<309> 1994-	-06-23
<313> (1)	(3072)
<400> 1
atggctaact	ctcagctcga	tagagtcaaa	ggattgattg	attcacttaa	tcaacataca	60
aaaagtgoag	ctaaatcagg	tgccggcgca	ttaaaaaatg	gtttgggaca	ggtgaagcaa	120
gcagggcaga	aattaatttt	atatattccg	aaagattatc	aagctagtac	cggctcaagt	180
cttaatgatt	tagtgaaagc	ggcggaggct	ttagggatcg	aagtacatcg	ctcggaaaaa	240

aacggtaccg cactagcgaa agaattattc ggtacaacgg aaaaactatt aggtttctcg 300 gaacgaggca tcgcattatt tgcacctcag tttgataagt tactgaataa gaaccaaaaa 360 ttaagtaaat cgctcggcgg ttcatcggaa gcattaggac aacgtttaaa taaaacgcaa 420 acggcacttt cagccttaca aagtttctta ggtacggcta ttgcgggtat ggatcttgat 480 agcctgcttc gtcgccgtag aaacggtgag gacgtcagtg gttcggaatt agctaaagca 540 ggtgtggatc tagccgctca gttagtggat aacattgcaa gtgcaacggg tacggtggat 600 gcgtttgccg aacaattagg taaattggca atgccttatc taacactcgc cttaagcggt 660 ttagcaagta agttaaataa ccttccagat ttaagccttg caggacctgg gtttgatgcc 720 gtatcaggta tcttatctgt tgtttcggct tcattcattt taagtaataa agatgccgat 780 gcaggtacaa aagcggcggc aggtattgaa atctcaacta aaatcttagg caatatcggt 840 aaagcggttt ctcaatatat tattgcgcaa cgtgtggcgg caggcttatc cacaactgcg 900 gcaaccggtg gtttaatcgg ttcggtcgta gcattagcga ttagcccgct ttcgttctta 960 aatgttgcgg ataagtttga acgtgcgaaa cagcttgaac aatattcgga gcgctttaaa 1020 aagttcggtt atgaaggtga tagtttatta gcttcattct accgtgaaac cggtgcgatt 1080 gaagcggcat taaccacgat taacagtgtg ttaagtgcgc gttccgcagg tgttggggct 1140 gctgcaaccg gctcattagt cggtgcgccg gtagcagctt tagttagtgc aatcaccggt 1200 attatttcag gtattttaga tgcttctaaa caggcaatct tcgaacgagt tgcaacgaaa 1260 ttagcgaata agattgacga atgggagaaa aaacacggta aaaactattt tgaaaacggt 1320 tatgacgccc gccattccgc attcttagaa gatacctttg aattgttatc acaatacaat 1380 aaagagtatt cggtagagcg tgtcgttgct attacgcaac agcgttggga tgtcaatatc 1440 ggtgaacttg ccggcattac tcgcaaaggt tctgatacga aaagcggtaa agcttacgtt 1500

PL 212 312 B1 gatttctttg aagaaggaaa acttttagag aaagaaccgg atcgttttga taaaaaagtg 1560 tttgatccgc ttgaaggtaa aatcgacctt tcttcaatta acaaaaccac tttattgaaa 1620 tttgttacgc cggtctttac cgcaggtgaa gagattcgtg agcgtaagca aaccggtaaa 1680 taccaatata tgaccgaatt attcgttaaa ggtaaagaaa aatgggtggt aaccggtgtg 1740 cagtcacata atgcgattta tgactatacg aatcttatcc aattagcgat agataaaaaa 1800 ggtgaaaaac gtcaagtgac cattgaatct catttgggtg agaaaaatga tcgtatatat 1860 ctttcatccg gttcatctat cgtatatgcg ggtaacggac atgatgtagc atattacgat 1920 aaaaccgata caggttactt aacatttgac ggacaaagtg cacagaaagc cggtgaatat 1980 attgtcacta aagaacttaa agctgatgta aaagttttaa aagaagtggt taaaactcag 2040 gatatttcag ttggaaaaac gtgcagtgaa aaattagaat atcgtgatta tgagttaagc 2100 ccattcgaac ttgggaacgg tatcagagct aaagatgaat tacattctgt tgaagaaatt 2160 atcggtagta atcgtaaaga caaattcttt ggtagtcgct ttaccgatat tttccatggt 2220 gcgaaaggcg atgatgaaat ctacggtaat gacggccacg atatcttata cggagacgac 2280 ggtaatgatg taatccatgg cggtgacggt aacgaccatc ttgttggtgg taacggaaac 2340 gaccgattaa tcggcggaaa aggtaataat ttccttaatg gcggtgatgg tgacgatgag 2400 ttgcaggtct ttgagggtca atacaacgta ttattaggtg gtgcgggtaa tgacattctg 2460 tatggcagcg atggtactaa cttatttgac ggtggtgtag gcaatgacaa aatctacggt 2520 ggtttaggta aggatattta tcgctacagt aaggagtacg gtcgtcatat cattattgag 2580 aaaggcggtg atgatgatac gttattgtta tcggatctta gttttaaaga tgtaggattt 2640 atcagaatcg gtgatgatct tcttgtgaat aaaagaatcg gaggaacact gtattaccat 2700 gaagattaca atgggaatgc gctcacgatt aaagattggt tcaaggaagg taaagaagga 2760 caaaataata aaattgaaaa aatcgttgat aaagatggag cttatgtttt aagccaatat 2820 ctgactgaac tgacagctcc tggaagaggt atcaattact ttaatgggtt agaagaaaaa 2880 ttgtattatg gagaaggata taatgcactt cctcaactca gaaaagatat tgaacaaatc 2940 atttcatcta cgggtgcatt taccggtgat cacggaaaag tatctgtagg ctcaggcgga 3000 ccgttagtct ataataactc agctaacaat gtagcaaatt ctttgagtta ttctttagca 3060 caagcagctt aa 3072 <210> 2 <211> 2871 <212> DNA <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <300>

<308> NCBI/X61111 <309> 1993-01-21 <313> (1) (2871) <400> 2 atgtcaaaaa tcactttgtc atcattaaaa tcgtccttac aacaaggatt gaaaaatggg 60 aaaaacaagt taaatcaagc aggtacaaca ctgaagaatg gtttaactca aactggtcat 120 tctctacaga atggggctaa aaaattaatc ttatatattc ctcaaggcta tgattcgggt 180 caaggaaatg gagttcaaga tttagttaaa gctgctaatg atttaggtat tgaagtatgg 240 cgagaagaac gcagcaattt ggacattgca aaaactagct ttgatacaac tcagaaaatt 300 ctaggtttta ctgatagagg aattgtatta tttgcacctc agctagataa tttattaaag 360 aagaatccta aaattggcaa tacattagga agtgcttcta gcatctcaca aaatataggt 420 aaagccaata ctgtattagg tggtattcaa tctattttag gatctgtttt atctggagta 480 aatctgaatg aattacttca aaataaagat cctaatcaat tagaacttgc aaaagcaggg 540

PL 212 312 B1

ctagaactga	ctaatgaatt	agttggtaat	attgctagct	cggtgcaaac	tgtagatgca	600
tttgcagaac	aaatatctaa	actaggttca	catttacaga	atgtgaaagg	attaggagga	660
ttgagtaata	aattacaaaa	tctaccagat	ctaggaaaag	caagtttagg	tttggacatt	720
atctctggtt	tactttctgg	agcatctgca	ggtctcattt	tagcagataa	agaggcttca	780
acagaaaaga	aagctgccgc	aggtgtagaa	tttgctaacc	aaattatagg	taatgtaaca	840
aaagcggtct	catcttacat	tcttgcccaa	cgagtcgctt	caggtttgtc	ttcaactggt	900
cctgtcgctg	cattaatcgc	atctacagtt	gcactagctg	ttagccctct	ttcattctta	960
aatgtagctg	ataagtttaa	acaagctgat	ttaatcaaat	catattctga	acgcttccaa	1020
aaattaggat	atgatggaga	tcgtttatta	gctgattttc	accgtgagac	aggaactatt	1080
gatgcttctg	taacaacaat	taacactgct	ttagcagcta	tctccggtgg	agttggagct	1140
gcaagcgcgg	gttctctagt	cggagctcca	gttgcgttac	tcgttgctgg	tgttacggga	1200
cttattacaa	ctattctaga	atattctaaa	caagccatgt	ttgaacatgt	tgcaaataag	1260
gttcatgaca	gaatagttga	atgggagaaa	aaacataata	aaaactattt	tgagcaaggt	1320
tatgattctc	gtcatttagc	tgatttacaa	gacaatatga	agtttcttat	caatttaaat	1380
aaagaacttc	aggctgaacg	cgtagtagct	attacccaac	aaagatggga	taaccaaatt	1440
ggagacctag	cggcaattag	ccgtagaacg	gataaaattt	ccagtggaaa	agcttatgtg	1500
gatgcttttg	aggaggggca	acaccagtcc	tacgattcat	ccgtacagct	agataacaaa	1560
aacggtatta	ttaatattag	taatacaaat	agaaagacac	aaagtgtttt	attcagaact	1620
ccattactaa	ctccaggtga	agagaatcgg	gaacgtattc	aggaaggtaa	aaattcttat	1680
attacaaaat	tacatataca	aagagttgac	agttggactg	taacagatgg	tgatgctagc	1740
tcaagcgtag	atttcactaa	tgtagtacaa	cgaatcgctg	tgaaatttga	tgatgcaggt	1800
aacattatag	aatctaaaga	tactaaaatt	atcgcaaatt	taggtgctgg	taacgataat	1860
gtatttgttg	ggtcaagtac	taccgttatt	gatggcgggg	acggacatga	tcgagttcac	1920
tacagtagag	gagaatatgg	cgcattagtt	attgatgcta	cagccgagac	agaaaaaggc	1980
tcatattcag	taaaacgcta	tgtcggagac	agtaaagcat	tacatgaaac	aattgccacc	2040
caccaaacaa	atgttggtaa	tcgtgaagaa	aaaattgaat	atcgtcgtga	agatgatcgt	2100
tttcatactg	gttatactgt	gacggactca	ctcaaatcag	ttgaagagat	cattggttca	2160
caatttaatg	atattttcaa	aggaagccaa	tttgatgatg	tgttccatgg	tggtaatggt	2220
gtagacacta	ttgatggtaa	cgatggtgac	gatcatttat	ttggtggcgc	aggcgatgat	2280
gttatcgatg	gaggaaacgg	taacaatttc	cttgttggag	gaaccggtaa	tgatattatc	2340
tcgggaggta	aagataatga	tatttatgtc	cataaaacag	gcgatggaaa	tgattctatt	2400
acagactctg	gcggacaaga	taaactggca	ttttcggatg	taaatcttaa	agacctcacc	2460
tttaagaaag	tagattcttc	tctcgaaatc	attaatcaaa	aaggagaaaa	agttcgtatt	2520
gggaattggt	tcttagaaga	tgatttggct	agcacagttg	ctaactataa	agctacgaat	2580
gaccgaaaaa	ttgaggaaat	tattggtaaa	ggaggagaac	gtattacatc	agaacaagtt	2640
gataaactga	ttaaggaggg	taacaatcaa	atctctgcag	aagcattatc	caaagttgtg	2700
aatgattaca	atacgagtaa	agatagacag	aacgtatcta	atagcttagc	aaaattgatt	2760
tcttcagtcg	ggagctttac	gtcttcctca	gactttagga	ataatttagg	aacatatgtt	2820
ccttcatcaa	tagatgtctc	gaataatatt	caattagcta	gagccgctta	a	2871

<210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 3 gatcgaattc aggatatcac agatct 26

PL 212 312 B1

<210>	4
<211>	26
<212>	DNA
<213>	Syntetyczny
<400>	4

aattagatct gtgatatcgt gaattc 26 <210> 5

<211>	23
<212>	DNA
<213>	Syntetyczny
<400>	5

gaattcaatg cttctggcgt cag 23 <210> 6

<211>	24
<212>	DNA
<213>	Syntetyczny
<400>	6

ggtaccggat gagataagat tttc 24 <210> 7

<211>	24
<212>	DNA
<213>	Syntetyczny
<400>	7

ggtaccggat gagataagat tttc 24 <210> 8

<211>	24
<212>	DNA
<213>	Syntetyczny
<400>	8

gaattcaaga gtttgtagaa acgc 24 <210> 9

<211>	23
<212>	DNA
<213>	Syntetyczny
<400>	9

ggtacctaat ttaccaacac tac 23 <210> 10

<211>	24
<212>	DNA
<213>	Syntetyczny
<400>	10

ggtaccttat ttgtagagct catc 24 <210> 11 <211> 31 <212> DNA

PL 212 312 B1 <213> Syntetyczny <400> 11 gatatcatgg ctaactctct cagctcgata g <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 12 ctcgaggcct gccgccacac gttg <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 13 ctcgagccgc tttcgttctt aaatgttgcg <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 14 agatcttcac cggctttctg tgcactttg <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 15 gatatcaaat cgtccttaca acaaggattg <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 16 gaattcacct gaagcgactc gttgggc <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 17 gaattccctc tttcattctt aaatgtagc <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Syntetyczny <400> 18 agatctgcca tcaataacgg tagtacttg

Claims (12)

1. Sposób wytwarzania immunogennego, niehemolitycznego szczepu Actinobacilllus pleuropneumoniae z wirulentnego szczepu App, znamienny tym, że w etapach:

identyfikuje się transbłonowe domeny hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx, modyfikuje się co najmniej jeden segment genu apxIA i ewentualnie segment genu apxIIA, który koduje domenę transbłonową hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.

2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskuje się delecję w co najmniej jednym segmencie genu apxIA i ewentualnie w segmencie genu apxIIA, który koduje domenę transbłonową hemolitycznej i cytolitycznej egzotoksyny Apx.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że uzyskuje się delecję w segmencie genu apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI App.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że uzyskuje się delecję nukleotydów 886 do 945 genu apxIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxI App.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że uzyskuje się ponadto delecję w segmencie genu apxIIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII App.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że uzyskuje się delecję nukleotydów 886 do 945 genu apxIIA, który koduje drugą domenę transbłonową egzotoksyny ApxII App.

7. Szczep Actinobacillus pleoropneumoniae otrzymany zgodnie ze sposobem z któregokolwiek z zastrz. 1-6.

8. Szczepionka przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń zawierająca szczep Actinobacillus pleuropneumoniae otrzymany z zastosowaniem sposobu z któregokolwiek z zastrz. 1-6.

9. Immunogenny i niehemolityczny szczep Actinobacillus pleuropneumonia zdeponowany w Colección Espańola de Cultivos Tipo pod numerem rejestracyjnym CECT 5985 lub jego mutant.

10. Szczepionka przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń zawierająca szczep Actinobacillus pleuropneumoniae z zastrz. 9.

11. Immunogenny i niehemolityczny szczep Actinobacillus pleuropneumoniae zdeponowany w Colección Espańola de Cultivos Tipo pod numerem rejestracyjnym CECT 5994 lub jego mutant.

12. Szczepionka przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej u świń zawierająca szczep Actinobacillus pleuropneumoniae z zastrz. 11.