PT1575610E - Vacina viva atenuada contra pleuropneumonia porcina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "VACINA VIVA ATENUADA CONTRA PLEUROPNEUMONIA PORCINA"

Domínio da Invenção A invenção presente diz respeito a um método para se obter uma estirpe imunogénica, não hemolítica, de Actinobacillus pleuropneumoniae, adequada para se preparar uma vacina viva atenuada contra a pleuropneumonia porcina.

Estado da técnica anterior à invenção A Actinobacillus pleuropneumoniae (doravante neste documento "App") é uma bactéria Gram-negativa que provoca a pleuropneumonia porcina, uma doença infecciosa distribuída por todo o mundo, responsável por prejuízos económicos importantes para a indústria de suínos.

Os factores de virulência mais importantes de App são proteínas extracelulares, nomeadamente: as exotoxinas Apx. Estas exotoxinas pertencem à família das toxinas RTX formadoras de poros, largamente distribuída pelas bactérias patogénicas Gram-negativas. As principais exotoxinas na App são: Apxl, ApxII, ApxIII e ApxIV. 2

As exotoxinas Apxl e ApxII são hemolíticas e citoliticas. A Apxl denota uma forte actividade hemolítica e citolítica e a ApxII denota uma fraca actividade hemolítica e uma actividade citolítica moderada.

Embora ao longo dos diversos despistes feitos até à data, todos os sorotipos sejam capazes de produzir ApxIV, existe uma distribuição característica por sorotipos para a expressão do resto das exotoxinas Apx. Os sorotipos 1, 5, 9 e 11 produzem as exotoxinas Apxl e ApxII; 0 sorotipo 10 só produz Apxl; Os sorotipos 7 e 12 produzem só ApxII e os sorotipos 2, 3, 4, 6, e 8 produzem ApxII e ApxIII.

Os genes que correspondem às exotoxinas Apxl e ApxII estão organizados com operões. 0 operão da exotoxina Apxl contém 4 genes: apxIC, apxIA, apxIB e apxID. O gene apxIA codifica para a exotoxina Apxl ela própria. O gene apxIC codifica para uma proteína activante (uma acilase) que introduz uma modificação após a tradução (acilação) na Apx, que permite à Apxl adquirir uma conformação activa, tornando-a capaz de interactuar com os receptores específicos da célula hospedeira. Os genes apxIB e apxID codificam para duas proteínas da membrana que segregam a exotoxina Apxl madura para o meio exterior. O operão ApxII só contém o gene A (apxlIA) e o gene C (apxIIC) que codificam, respectivamente, para ApxII e para a acilase responsável pela aquisição de uma conformação active por parte da ApxII. Também existe um 3 pequeno fragmento que denota uma certa semelhança com o gene apxIB, mas que não origina uma proteína funcional. A exportação da ApxII madura para o meio exterior é devida à acção das proteínas codificadas pelos genes apxIB e apxID.

Os métodos de vacinação presentes não proporcionam uma protecção completa contra todos os sorotipos de App. A Patente W097/16.532 AI descreve a construção de uma estirpe para vacina que é capaz de induzir uma reacção imunológica num animal. Isto inclui um micro-organismo modificado que produz uma toxina Apx parcial ou completamente inactivada, devido a uma excisão parcial. Esta excisão, obtida por mutagénese induzida do gene estrutural apxIA e/ou à excisão parcial de um gene activante apxIIC. Ela não modifica a zona transmembranar. A Patente EP 810.283 A2 descreve a construção de uma estirpe para vacina App modificando o gene apxIC de uma tal forma que não seja produzida a proteína activante sob uma forma funcional, não podendo portanto activar a toxina por acilação. Ela também não modifica a zona transmembranar.

Jansen et ai. (Infection and Immunity 63: 7-37 (1995)) descreveram a produção de homólogos de App recombinantes por mutagénese dirigida ao local. Estes mutantes apresentam o gene apxIA que está inactivado por 4 inserção do gene CMr e/ou o apxIIA inactivado por inserção do gene TETr.

Tascón et al. (Molecular Microbiology 14: 207-216 (1994)) descrevem dois mutantes App. Um deles tem uma alteração no gene apxIBD e o outro uma alteração no gene estrutural apxIA.

Reimer et al., (Microbial Pathogenesis 18: 197-209 (1995)) descrevem um mutante App. não virulento que, por mutagénese química, apresenta excisões que afectam partes importantes do operão apxIABCD. Este mutante não sintetiza a toxina Apxl, mas é capaz de sintetizar a ApxII, embora ela não seja segregada para fora da célula.

As estirpes que não expressam as exotoxinas Apxl e ApxII não podem ser utilizadas a título de vacinas atenuadas porque elas não induzem uma reacção imunológica uma vez que as exotoxinas Apxl e ApxII são dos determinantes mais importantes da virulência de App.

Prideaux (The 16th International Pig Veterinary Society Congress, Melbourne (Austrália) 17-20 de Setembro de 2000, págs.439-442)) descreve uma vacina preparada a partir de uma estirpe com um gene apxIIC inactivado que segrega e expressa uma toxina ApxII não activada, incapaz portanto de se ligar às células alvo. 5

Deste modo, as vacinas vivas atenuadas que se descrevem no estado da arte anterior a esta invenção, com base em estirpes App sem capacidade hemolitica, são menos imunoprotectoras porque sofreram modificações estruturais que não lhes permitem ligarem-se aos receptores na membrana das células alvo. Além disso, elas não conseguem gerar anticorpos contra as toxinas Apxl e/ou ApxII, uma vez que estas não são segregadas pela célula. Frey et al. (Gene 142: 97-102 (1994)) descrevem a sequência de aminoácidos da exotoxina Apxl de uma estirpe do sorotipo I e Smits et al.; Infection and Immunity 59: 4497-4504 (1991)) descrevem a sequência de aminoácidos da exotoxina ApxII de uma estirpe do sorotipo 9.

Descrição resumida da invenção

Os autores da invenção presente encontraram um método para se obter uma estirpe App imunogénica e não hemolitica a partir de uma estirpe App virulenta que tenha sido modificada e pelo menos um segmento do gene apxIA, e opcionalmente num segmento do gene apxIIA, que codificam para um domínio transmembranar das exotoxinas Apx citolíticas e hemolíticas.

Esta estirpe não apresenta actividade hemolitica, mas mantém inalterada a sua capacidade imunoprotectora e é adequada para se preparar uma vacina viva atenuada contra a pleuropneumonia porcina. 6

Os domínios transmembranares das exotoxinas Apxl e ApxII desempenham um papel importante na formação do poro na membrana da célula alvo. Uma vez formado este poro, desenvolvem-se desequilíbrios osmóticos que eventualmente provocam a lise da célula alvo.

Verificou-se de uma forma surpreendente que a vacina viva atenuada preparada a partir desta estirpe modificada de App pode ser administrada a uma pequena dosagem, que contém as toxinas Apxl e ApxII sem actividade hemolítica e que contém todos os antigénios imunologicamente necessários para gerar uma forte reacção imunogénica. 0 objecto da invenção presente é desenvolver-se um método para se obter uma estirpe imunogénica e não hemolítica de App a partir de uma estirpe virulenta de App modificada em pelo menos um segmento do gene apxIA e opcionalmente num segmento do gene apxIIA, que codificam para um domínio transmembranar das exotoxinas Apx hemolítica e citolítica.

Além disto, outro aspecto da invenção presente são as estirpes a obter utilizando os métodos objecto da invenção presente, e as vacinas que delas se preparam.

Num terceiro aspecto, a invenção tem como alvo as estirpes App depositadas na Colección Espanola de Cultivos Tipo sob os números de registo: CECT 5985 e CECT 5994. 7

Descrição das figuras Figura 1. A Fig. 1 mostra um alinhamento levado a cabo com o programa ClustalX (Thompson et ai; Nucleic Acid Research 24: 4876-4882 (1997)) entre as sequências de aminoácidos de

Apxl proveniente de uma estirpe do sorotipo 1 (Frey et ai; Gene 142: 97-102 (1994)) e ApxII proveniente do sorotipo 9 (Smits et ai.; Infection & Immun. 59: 4497-4504 (1991)).

Nesta figura só se inclui a sequência contida entre os aminoácidos 1 a 594 de Apxl ela 590 de ApxII. No alinhamento enquadraram-se as seguintes regiões: Hl (aminoácidos 233 a 253), H2 (aminoácidos 296 a 315) e H3 (aminoácidos 369 a 405) . Estas regiões correspondem respectivamente aos três domínios transmembranares presentes em ambas as Apx.

Figura 2. A Figura 2 mostra um esquema com os passos que se seguiram para se obterem os plasmideos híbridos pApxIAH2 e ρΑρχΙΙΔΗ2. Em primeiro lugar, obteve-se o plasmídeo pGPl por digestão do plasmídeo pGP704 (Miller e Mekalanos; J. Bacteriol. 170: 2575-2583 (1988)) com os enzimas de restrição EcoRI e BglII e em seguida ligaram-se os oligonucleótidos pGP5' e pGP3'. Este plasmídeo contém a origem vegetativa da replicação do plasmídeo R6K (OriR6K) e a origem da transferência por conjugação do plasmídeo RP4 (0riTP4) e do gene de resistência à ampicilina (Bla) . Digeriu-se o plasmídeo pGPl com o enzima de restrição PstI e ligou-se a um fragmento veículo PstI de um gene de resistência à canamicina (Kmr ou Kan) que provém do plasmídeo pUC4K, para se dar origem ao plasmídeo pGP2. A este plasmídeo, previamente desfosforilado e digerido com o enzima de restrição EcoRI, adicionaram-se três fragmentos de ADN amplificados por PCR, nomeadamente: o promotor ptac, a região de codificação da fusão em atpE/GFPUV (região de ligação do ribossoma do E. coli atpE à variante U.V. da proteína de florescência verde) e o agente de terminação da transcrição rmB. denominou-se o plasmídeo resultante pGP3. No plasmídeo, inseriram-se as regiões flanqueantes a 5' e 3' (amplificadas por PCR) que codificam para a segunda hélice transmembranar dos genes apxl e apxll para se formarem respectivamente os plasmídeos ρΑρχΐΔΗ2 e ρΑρχΙΙΔ H2 .

Figura 3. enviesadas. A Figura 3 está dividida em três painéis: 0 Painel A mostra os mapas de restrição em quilobases (kb) e a distribuição dos genes pelo operão apxl do genoma de App. Em cinzento claro, representa-se o gene apxIA, que é o alvo dos diversos acontecimentos de recombinação, e na região a cinzento escuro mostram-se os genes adjacentes apxIC, apxIB e apxID. Desenham-se os diferentes genes ou regiões do plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 utilizando barras 9

Apresentam-se em negrito os fragmentos de codificação das hélices transmembranares (Hl, H2 e H3) de apxIA. Simplificaram-se os nomes e algumas estruturas pormenorizadas nos plasmídeos da figura 2. Deste modo, gfpUV inclui o promotor ptac e a fusão atpE/GFPUV; OriV indica a origem vegetativa de replicação de R6K e OriT a origem da transferência de RP4 por conjugação. Mostra-se tanto em (1) como em (3) o mapa de restrição obtido com o enzima Xhol e a distribuição dos genes do operão apxl do genoma de App. Em (2) mostra-se o mapa de restrição deste mesmo operão depois da inserção do plasmideo ρΑρχΙΔΗ2 no genoma de App. Esta inserção ocorre através de um acontecimento único de recombinação homóloga entre as regiões flanqueanteas a 5' de H2 colocadas respectivamente no plasmideo ρΑρχΙΔΗ2 no genoma de App. O Painel B da figura 3 mostra os resultados da hibridização de uma sonda no gene apxl com uma transferência Southern do ADN genómico digerido com Xhol e obtido das colheitas de 1) hep81 6 Nlr; 2) recombinante obtido por inserção do plasmideo pApxIAH2 no genoma de App por um acontecimento único de recombinação homóloga entre as regiões flanqueantes a 5' de H2 (HP816R1); 3) recombinante obtido a partir de HP816R1 que recupera o mesmo fenótipo da estirpe de origem HP816 Nlr, e 4) recombinante obtido de HP816R1 que recupera o mesmo fenótipo da estirpe de origem HP816 Nlr, com a excepção de que não exibe a mesma actividade hemolitica do que o HP816R1 (AppApxIH2~) . 10 O Painel C mostra o aspecto das colónias semeadas a partir das mesmas culturas descritas no painel B (1, 2, 3 e 4) em conjunto com outra colónia proveniente de uma cultura de App do sorotipo 7 (5) . Semearam-se as colónias sobre placas de agar com sangue Columbia com suplemento de 0,004 % de NAD (CA) ou em placas TSYN com suplemento de 25 pg/mL de canamicina (TS) . A presença de auréolas hemoliticas de grandes dimensões em volta das colónias das culturas 1 e 3, e de pequenas auréolas hemoliticas em volta das colónias nas culturas 2, 4 e 5 pode ser observada em CA. Pode também observar-se a ausência de crescimento em TS para as culturas 1, 3, 4 e 5.

Figure 4 A Figura 4 está dividida em 3 painéis: 0 Painel A mostra os mapas de restrição (em kb) e a distribuição dos genes no operão apxll localizado no genoma de App. Representa-se sob fundo cinzento claro o gene apxIlA. Este é o alvo dos diferentes acontecimentos de recombinação. Representam-se os genes adjacentes apxIIC, apxIIB a cinzento escuro; Desenham-se os diferentes genes ou regiões do plasmideo ρΑρχΙΙΔΗ2 utilizando barras enviesadas. Apresentam-se a negrito os fragmentos das hélices transmembranares (Hl, H2 e H3) do apxIIA. O mapa de restrição que se obtém com o enzima EcoRI e a distribuição dos genes do operão apxll do genoma de App são representados em (1) e (3). O mapa de restrição desse mesmo 11 operão depois da inserção do plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 está representado em (2). Esta inserção é levada a cabo através de um acontecimento único de recombinação homóloga entre as regiões flanqueantes a 3' de H2 localizadas no plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 e no genoma de App. Em (4) mostra-se o mapa de restrição do oparão depois da resolução do plasmídeo inserido em (2) após uma segunda recombinação através das regiões flanqueantes a 5’ do H2 localizadas no genoma de App. 0 Painel B mostra os resultados da hibridização de uma sonda do gene apxIIA por transferência Southern os ADN genómicos digeridos com EcoRI e obtidos das seguintes culturas de: 1) HP8816 Nlr 2) Recombinante obtido por inserção do plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 no genoma de App através de um acontecimento único de recombinação homóloga entre as regiões flanqueantes a 5' de H2 (HP816R2); 3) Recombinante obtido de HP816R2 que recupera o mesmo fenótipo da estirpe de origem HP816 Nlr; 4) Recombinante obtido de HP816R2 que recupera o mesmo fenótipo da estirpe de origem HP816 Nlr com a excepção que denota a mesma actividade hemolítica que a HP816R2 (AppApxI/IIH2~) . 0 Painel C mostra o aspecto das colónias semeadas a partir das mesmas culturas descritas no painel B (1, 2, 3 e 4) . Semearam-se as colónias em placas em agar de sangue Columbia com um suplemento de NAD (CA) , ou em placas TSYN com um suplemento de 25 pg/mL de canamicina (TS) . Pode observar-se a presença de auréolas hemolíticas pequenas em 12 volta das colónias das culturas 1 e 3 e a ausência de auréolas hemolíticas em volta de colónias das culturas 2 e 4. Veja-se também, nas TS, a ausência de crescimento das culturas 1, 3 e 4.

Figura 5 e uma cultura de A Figura 5 mostra três gráficos com as curvas de crescimento, representadas (símbolos escuros) a partir dos valores das absorvâncias, a 600 nm, das diversas culturas, a intervalos de uma hora (eixo Y da esquerda). Em simultâneo, tomaram-se diversas amostras dos sobrenadantes das culturas aos mesmos intervalos de tempo. Mantiveram-se estas amostras a 0°C até serem diluídas a 1/50 e tampão carbonato (pH 9,6). Foram então colocadas em micro poços para se quantificar a presença de Apxl e de ApxII por ELISA utilizando um anticorpo monoclonal especifico para cada um destes Apx. A partir dos valores das absorvâncias, a 405 nm, de cada amostra em teste (eixo Y da direita) , desenharam-se as curvas representando a acumulação de cada um dos Apx ao longo do tempo (símbolos claros) . Em (A) representa-se uma cultura de HP816 Nlr - por triângulos - e uma cultura de AppApxIH2~ - por círculos os símbolos a claro mostram a acumulação de Apxl. Em (B) representa-se uma cultura de HP816 Nlr - por triângulos - e uma cultura de AppApxI/IIH2“ - por círculos os símbolos a claro mostram a acumulação de ApxII. Em (C) , representa-se uma cultura de HP816RI - por triângulos - 13 HP816R2 - por círculos - que mostram a acumulação de Apxl e os círculos claros mostram a acumulação de ApxII.

Figura 6 0 Painel (A) mostra uma contrastação com azul de Coomassie de uma electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida com amostras dos sobrenadantes de culturas obtidas a 5 horas, de 1) HP816 Nlr; 2) AppApxIH2“; 3) um controlo obtido de um sorotipo 4 de App (o sorotipo 4 de App produz e segrega uma ApxII com 105 kD e uma ApxlII com 115 kD, mas não a Apxl); e M) marcador de uma massa molecular (as bandas relevantes de 110 e de 120 kD estão indicadas). Em (B) pode observar-se uma transferência Western de um gel com amostras idênticas às analisadas no gel de (A), detectado por intermédio de um anticorpo monoclonal específico para a Apxl. Em (C) pode observar-se uma transferência Western de um gel com amostras idênticas às analisadas no gel de (A), com a excepção da pista 2, que contém uma amostra do sobrenadante de uma cultura de AppApxI/IIH2~. Não se incluiu uma fotografia do gel porque a distribuição de bandas é idêntica à que aparece no gel de (A) . Esta transferência foi revelada utilizando um anticorpo monoclonal específico para ApxII. Observa-se que a banda a 105 kD na pista 3 só é detectada em (C) .

Descrição pormenorizada da invenção 14 A invenção diz respeito a um método para se obter uma estirpe imunogénica e não hemolitica de Actinobacillus pleuropneumoniae a partir de uma App virulenta, caracterizado pelos seguintes passos: • Determinam-se os domínios transmembranares das exotoxinas hemolitica e citolítica de Apx. • Modifica-se pelo menos um fragmento do gene apxIA e opcionalmente um segmento do gene apxIIA que codifique para um domínio transmembranar das Apx exotoxinas hemolitica e citolítica de Apx. 0 termo imunogénica significa que a estirpe de App obtida pelo método da invenção presente mantém inalterada a sua capacidade imunológica protectora, isto significa que ela contém todos os antigénios imunologicamente necessários para se obter uma reacção imunogénica na hospedeira. 0 termo não hemolitica significa que a estirpe de App, obtida pelo método da invenção presente, não apresenta actividade hemolitica, sendo uma estirpe não virulenta. A selecção de uma estirpe virulenta de App, obtida de animais infectados que sofram da doença, é feita consoante os métodos habituais conhecidos dos especialistas desta técnica. 15 0 primeiro passo consiste na identificação dos domínios transmembranares das exotoxinas hemolítica e citolitica da App utilizando os programas TransMem (Aloy et al.; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) ou Helixmem (Eisenbeg et ai.; J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)) que analisa as sequências de aminoácidos das exotoxinas hemolítica e citolitica da Apx, tal como descritas para E. coli em Ludwig et al.; Mol. Gene. Genet. 226: 198-208 (1991). O segundo passo consiste em se modificar pelo menos um segmento do gene apxIA e opcionalmente um segmento do gene apxIIA que codificam para um domínio transmembranar das exotoxinas hemolítica e citolitica da Apx. O termo "modificar" refere-se à modificação de um gene quer utilizando as técnicas convencionais de ADN recombinante nas quais se incluem a substituição de um ou de diversos nucleótidos, a inserção de um ou de diversos nucleótidos, a excisão parcial ou total de um gene, quer ainda por alteração química ou por radiação provocando mutagénese induzida.

Numa concretização preferida, leva-se a cabo a modificação por excisão de, pelo menos, um segmento do gene apxIA, e opcionalmente de um segmento do gene apxIIA, que codificam para um domínio transmembranar das exotoxinas hemolítica e citolitica de Apx. 16

Os domínios transmembranares, presentes nos genes apxIA e apxIIA das exotoxinas hemolítica e citolítica, foram detectados utilizando os programas Transmem e Helixmem mencionados acima. A previsão levada a cabo das sequências de aminoácidos das exotoxinas hemolítica e citolítica Apxl e ApxII indicam que os domínios transmembranares, também denominados transmembranas, se encontram localizados nas seguintes zonas da sequência das exotoxinas: • Primeiro domínio transmembrana Hl: entre os aminoácidos 233 e 253 correspondendo aos nucleótidos 697 a 759 da apxl. • Segundo domínio transmembrana H2: entre os aminoácidos 296 e 315, correspondendo aos nucleótidos 886 a 945 da apxl. • Terceiro domínio transmembrana H3: entre os aminoácidos 369 e 405, correspondendo aos nucleótidos 1105 a 1215 da apxl.

Numa concretização preferida, a modificação é levada a cabo através de uma excisão no segmento do gene apxIA que codifica para o segundo domínio transmembranar da exotoxina Apxl de App. 17

Leva-se a cabo a modificação, preferivelmente, retirando os nucleótidos 886 a 945 do gene apxIA que codifica para o segundo domínio transmembranar da exotoxina Apxl de App.

Noutra concretização preferida do método, objecto da invenção presente, leva-se aa cabo mais uma excisão no segmento do gene apxIIA que codifica para o segundo domínio transmembranar da exotoxina ApxII de App. Preferivelmente retiram-se os nucleótidos 886 a 945 do gene apxIIA, que codificam para o segundo domínio transmembranar da exotoxina ApxII de App.

Na forma de concretização preferida da invenção presente, que será descrita em pormenor na secção "exemplos", levou-se a cabo a obtenção de uma estirpe imunogénica e não hemolítica de App recorre3ndo a um processo que inclui os seguintes passos: A - Selecção de uma estirpe virulenta de App. B - Previsão das hélices alfa do domínio transmembranar das proteínas Apxl e ApxII para conceber uma construção de nucleótidos que permita uma excisão no segundo domínio transmembranar de ambas as proteínas sem afectar o processo de dobragem e a capacidade das hemolisinas resultantes para interactuarem com os receptores membranares específicos. 18 C - Construção de um vector de clonagem capaz de se integrar no genoma de App e que contenha genes marcadores que permitam monitorizar, de um modo eficiente, a integração de um tal vector.

Cl - Construção do plasmideo híbrido pGP3 que possui uma origem de replicação RK6, a origem de transferência RP4 e um gene de resistência à canamicina. Além disto, o gene da proteína fluorescente GPVUV (doravante GFP) foi incluído, sob o controlo do promotor ptac e do agente de terminação rrnB. Também se modificou o local de clonagem múltipla para facilitar a inserção subsequente das sequências de ADN. C.2 - Construção de um vector de clonagem híbrido que contém as sequências flanqueantes a 5' e a 3' da segunda hélice transmembanar, especificada pelo gene apxIA. Construiu-se portanto o plasmideo híbrido ρΑρχΙΔΗ2 para se seleccionarem e para se clonarem esses fragmentos adjacentes aos terminais 5' e 3' do segmento que codifica para a segunda hélice transmembranar no gene apxIA. Utilizou-se este plasmideo como vector final para a transformação da App. 19 C. 3 - Construção de um vector de clonagem híbrido que contém as sequências de f lanqueamento a 5' e a 3' da segunda hélice transmembranar especificada pelo gene apxIIA. Construiu-se portanto o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΙΔΗ2 para se seleccionarem e se clonarem fragmentos tais como os adjacentes aos terminais 5' e 3' do segmento que codifica para a segunda hélice transmembranar no gene apxIIA. Utilizou-se este plasmídeo a título de vector final para a transformação da App. D. Construção das bactérias recombinantes que resolveram o plasmídeo híbrido inserido no genoma. D.l. Construção da estirpe recombinante de App denominada HP816R1, que incorpora o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΔΗ2 no genoma de App em resultado de um acontecimento recombinante único homólogo entre o plasmídeo referido e o genoma de App HP816 Nlr, que é uma estirpe resistente ao ácido nalidíxico obtida de um mutante espontâneo da estirpe App HP816. D.2 Construção da estirpe AppApxIH2' utilizando um procedimento que permite, uma vez obtidas e identificadas as bactérias recombinantes no passo 1, resolver o vector recombinante 20 integrado no genoma através de um segundo acontecimento recombinante homólogo, bem como detectar e isolar as bactérias que, devido a esta segunda recombinação, conseguiram uma excisão parcial no gene apxIA. D. 3 Construção da estirpe recombinante de App HP816R2, que incorpora o plasmideo híbrido ρΑρχΙΙΔΗ2 no genoma de AppApxIH2~ em resultado de um acontecimento único recombinante homólogo entre o plasmideo referido e o genoma de AppApxIH2“. D. 4 Construção da estirpe AppApxI/IIH2~ utilizando um procedimento que permite, uma vez obtidas no passo D. 3 e identificadas as bactérias recombinantes, resolver o vector recombinante integrado no genoma por intermédio de um segundo acontecimento recombinante homólogo, bem como detectar e isolar as bactérias que, devido à segunda recombinação, conseguiram a excisão parcial no gene apxIIA.

Na invenção presente, o mutante AppApxIH2~ obtido é idêntico à estirpe App original de tipo selvagem, excepto pela falta dos nucleótidos 886 a 945 (incluindo ambos) da sequência de codificação para o gene apxIA que corresponde à ausência dos aminoácidos 296 a 315 (ambos inclusive) na Apxl produzida. 21

Na invenção presente, o mutante AppApxIIH2“ obtido é idêntico à estirpe AppApxIH2~, excepto pela falta dos nucleótidos 886 a 945 (incluindo ambos) da sequência de codificação para o gene apxIIA que corresponde à ausência dos aminoácidos 296 a 315 (ambos inclusive) na ApxII produzida.

Na concretização preferida da invenção presente, as únicas modificações que são produzidas no genoma de App são a excisão de 60 pares de bases nas sequências de codificação dos genes apxIA e apxIIA e a substituição destes por alvos de restrição, neste caso correspondendo respectivamente aos enzimas XholI e EcoRI. Não são feitas inserções adicionais de sequências provenientes do ADN plasmidico (tais como por exemplo o gene de resistência à canamicina) no genoma de App. Isto permite que a estirpe obtida seja modificada no mesmo gene ou noutro gene alvo seguindo exactamente a mesma estratégia que se utilizou para levar a cabo a primeira modificação. Por outro lado, evita-se que a estirpe resultante seja resistente a diversos antibióticos, o que é uma caracteristica desejável numa estirpe que se destina a ser utilizada a título de vacina viva. O alvo de restrição utilizado na invenção presente não é crítico. Embora se pudesse utilizar uma construção que não introduzisse nenhum alvo de restrição, a sua utilização é preferível para se dispor de mais um 22 mecanismo para detectar os clones recombinantes pretendidos, e para se ser capaz de seguir a estabilidade da ou das estirpes obtidas. Pode portanto utilizar-se um alvo qualquer desde que não introduza um codão de paragem da síntese proteica e que origine fragmentos de restrição analisáveis por electrof orese (isto é, mais do que 100 pares de bases) com fragmentos de restrição flanqueantes que possam existir anteriormente no genoma de App. A invenção refere-se também a uma estirpe App obtida de acordo com o método descrito acima.

Outro objecto da invenção é uma estirpe de App caracterizada por ter sofrido uma excisão dos nucleótidos 886 a 945 do gene apxIA, que codificam para o segundo domínio transmembranar da exotoxina Apxl, depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo (Colecção Espanhola de Culturas Tipo) sob o número de registo CECT 5985, consoante o Tratado de Budapeste de 28 de Abril de 1977, ou um seu mutante.

Outro objecto da invenção é uma estirpe de App caracterizada por lhe terem sido retirados os nucleótidos 886 a 945 do gene apxIA que codifica para a segunda transmembrana na exotoxina Apxl e além disto lhe terem sido retirados os nucleótidos 886 a 945 do gene apxIIA que codifica para a segunda transmembrana da exotoxina ApxII, depositada na Colecção Espanhola de Culturas Tipo sob o 23 número de registo CECT 5994, consoante o tratado de Budapeste, ou um seu mutante. A invenção também se refere às vacinas para a protecção dos animais contra a pleuropneumonia porcina. Estas vacinas podem ser preparadas consoante os métodos habituais conhecidos pelos especialistas da técnica.

Estas vacinas incluem uma quantidade imunologicamente eficaz de bactérias de uma estirpe App viva atenuada, obtida de acordo com o método descrito na invenção presente. Imunologicamente eficaz significa que a quantidade de bactérias administradas para a vacinação é suficiente para induzir na hospedeira uma reacção imunológica eficaz contra uma infecção provocada por formas virulentas de App. A dosagem a utilizar dependerá da idade e da massa corporal do animal que se pretende vacinar e da forma de administração. A vacina pode conter qualquer dose de bactérias suficiente para induzir uma reacção imunológica. A dosagem o i η adequada está compreendida entre 10 e 10 . A vacina pode conter além disto um excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico. Este excipiente pode ser tão simples como água, mas também pode incluir o 24 fluido de cultura no qual as bactérias são cultivadas ou uma solução com uma concentração fisiológica de sal.

Outros exemplos de excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, úteis na invenção presente, incluem estabilizantes, hidratos de carbono (isto é, glucose, sacarose, manitol, sorbitol) e tampões (isto é, tampões fosfato) .

Opcionalmente podem adicionar-se componentes adjuvantes à vacina. Estes adjuvantes são estimulantes não específicos do sistema imunológico, que aumentam a reacção imunológica do hospedeiro contra o invasor patogénico. São exemplos de adjuvantes a Vitamina E e óleo vegetal.

Pode administrar-se a vacina a animais pelas vias intranasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou por aspersão. A aplicação industrial da invenção é facilmente deduzida da descrição. Vale a pena mencionar que a pleuropneumonia porcina é uma doença inflamatória infecciosa em todo o mundo, responsável por perdas económicas severas para a indústria porcina, e que o método da invenção presente para se obter uma estirpe imunogénica, não hemolítica de App permite a preparação de vacinas eficazes para combater a pleuropneumonia porcina. 25

Os exemplos que se seguem são descritos para proporcionar, ao especialista da técnica, uma explicação suficientemente compreensível e completa da invenção presente, mas eles não devem ser interpretados como constituindo limitações dos aspectos essenciais dela, tal como são descritos na secção desta descrição que precede.

Exemplo

As técnicas e os métodos de ADN recombinante aplicados como se segue, estão descritos em pormenor em Sambrook e Russell (no Molecular Cloning, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) e em Ausubel et al.; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998)). Todos os produtos de PCR foram previamente clonados num plasmideo pBE antes de serem digeridos com enzimas de restrição. Este plasmideo é um derivado do vector pBluescript SK2 (STRATAGENE™) e apresenta o seu local de clonagem múltipla substituído por uma pequena sequência de nucleótidos que especifica apenas o alvo do enzima de restrição EcoRV. A estirpe XLl-blue (STRATAGENE™) de E. coli tem sido utilizada como hospedeira para vectores híbridos com base nos plasmídeos pUC118 ou pBluescript SK. A estirpe S17-1 λ pir de E. coli (Simon et al.; Biotechnology 1: 784-791 (1983)) tem sido utilizada como hospedeira de vectores híbridos com base no plasmideo pGP704. 26

Todas as sequências de oligonucleótidos descritas adiante neste documento são descritas do sentido de 5' para 3' a não ser quando se indicar expressamente o contrário. Em todas as reacções por PCR, utilizou-se a termopolimerase Deep Vent (New England Biolabs), que tem actividade correctora do teste. A. Selecgão de uma estirpe virulenta de App. A estirpe HP816, que corresponde a um sorotipo de App de um tipo 1 natural, pertencente aos Laboratorios Hipra S.A. (Amer - Girona - Espanha), foi escolhida a titulo de estirpe de App de tipo selvagem. A estirpe HP816Nlr é uma estirpe resistente ao ácido nalidixico obtida de um mutante espontâneo da HP816 de tipo selvagem. B. Identificação do domínio transmembranar das exotoxinas Apxl e ApxII.

Os três domínios transmembranares que adoptam uma estrutura de hélice-a foram determinados através da utilização dos programas TransMem (Aloy et al.; Comp. Appl. Biosc. 13: 213-234 (1997)) e Helixmem (Eisenbeg et al.; J.

Mol. Biol. 179: 125-142 (1984)), tal como se descreveu para o E. coli (Ludwig et al. ; Mol. Gene. Genet. 226: 198-208 (1991)), aplicados à sequência de aminoácidos do Apxl proveniente de uma estirpe do sorotipo 1 (Frey et ai.; Gene 27 142: 97-102 (1994)) e do ApxII de um sorotipo do tipo 9 (Smits et al.; Infection and Immunity 59: 4497-4504 (1991)). Estes programas detectaram três regiões que podiam actuar a titulo de hélices transmembranares, em ambas as proteínas (Fig. 1) : a primeira transmembrana está localizada entre os aminoácidos 233 e 253 (Hl); a segunda transmembrana está localizada entre os aminoácidos 296 e 315 (H2) e a terceira transmembrana entre os aminoácidos 369 e 405 (H3), todos eles da Apxl. C. Construção dos vectores de clonagem híbridos que são capazes de se integrar no genoma de App.

Na figura 2 pode ver-se um delineamento com os mapas dos plasmídeos que se descrevem nesta secção. C.I.- Construção do plasmideo recombinante pGP3.

Cortou-se ou plasmideo pGP704 (Miller e Mekalanos; J. Bact. 170: 2575-2583 (1988)) em simultâneo com os enzimas de restrição BglII e EcoRI. Utilizando uma electroforese sobre um gel de agarose isolou-se um fragmento de ADN com 3,7 kb. Incubou-se este fragmento numa reacção de ligação, em conjunto com os oligonucleótidos pGP5' (GAT CGA ATT CAG GAT ATC ACA GAT CT) (SEQ ID NO 1) e pGP3' (ATT TAG ATC TGT GAT ATC GTG AAT TC) (SEQ ID NO 2). Denominou-se pGPl o plasmideo recombinante que se obteve. 28

Digeriu-se o plasmídeo pGPl com o enzima de restrição PstI. Utilizando uma electroforese sobre um gel de agarose isolou-se um fragmento de ADN com 3,12 kb. Ligou-se este fragmento a outro fragmento com 1,2 kb obtido por digestão do plasmídeo pUC4K (Pharmacia) com o enzima de restrição PstI. Denominou-se pGP2 o plasmídeo recombinante que desta forma se obteve.

Partindo do plasmídeo pMAL-p2 (New England Biolabs), amplificaram-se as sequências correspondentes ao promotor ptac por PCR recorrendo aos iniciadores oligonucleotídicos de ptac5’ (GAA TTC AAT GCT TCT GGC GTC AG) (SEQ ID NO 3) e de ptac3’ (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID NO 4), que incluem respectivamente os alvos de restrição EcoRI e Kpnl nas suas extremidades 5'. Também a partir do plasmídeo pMAL-p2, amplificaram-se por PCR as sequências correspondendo ao agente de terminação independente de rho do operão _rz\nB utilizando os oligonucleótidos iniciadores rmB5' (GGT ACC GGA TGA GAT AAG ATT TTC) (SEQ ID NO 5) e rrnB3 ' (GAA TTC AAG AGT TTG TAG AAA CGC) (SEQ ID NO 6) que incluem respectivamente os alvos de restrição Kpnl e EcoRI nas suas extremidades 5'. A dimensão do fragmento de ADN amplificado inclui 278 pares de bases (bp).

Com o plasmídeo pAG408 (Suarez et al.; Gene 196: 69-74 (1997)), amplificou-se uma fusão do gene da proteína GFPUV com a região que se liga ao ribossoma do gene atpE utilizando os oligonucleótidos iniciadores GFP5' (GGT 29 ACC TAA TTT ACC AAC ACT AC) (SEQ ID NO 7) e GFP3 ' (GGT ACC TTA TTT GTA GAG CTC ATC) (SEQ ID NO 8) que incluem a região do alvo de restrição ΚρηI nas suas extremidades 5'. 0 fragmento amplificado tem uma dimensão de 830 bp.

Digeriram-se os dois primeiros fragmentos (o promotor ptac e o agente de terminação rrnB) com os enzimas de restrição Κρη I e EcoRI, enquanto o terceiro (fusão de atpE-GFPUV) foi digerido com o enzima de restrição Kpnl. Ligaram-se então os três fragmentos obtidos deste modo com o plasmideo pGP2 que previamente se desfosforilou e cortou com o enzima de restrição AcoRI. Entre os diferentes plasmideos recombinantes obtidos, um deles, que era veiculo dos três fragmentos posicionados de acordo com a Figura 2, foi seleccionado. As colónias portadoras deste plasmideo exibiam uma fluorescência intensa quando eram expostas a luz ultravioleta. O plasmideo híbrido que deste modo se obteve foi denominado pGP3. C.2 - Construção do plasmideo híbrido pApxIMI2

Neste passo, o primeiro objectivo era o de se obter um fragmento de ADN contíguo ao terminal 5' do fragmento de codificação para a segunda hélice transmembranar do gene apxIA. Amplificou-se portanto um fragmento com 8 97 bp por PCR a partir do ADN genómico purificado da estirpe HP816 de v utilizando como iniciadores os oligonucleótidos Apxla5' (GAT ATC ATG GCT

AAC TCT CTC AGC TCG ATA G) (SEQ ID NO 9) e Apxla3' (CTC 30 GAG GCC TGC CGC CAC ACG TTG) (SEQ ID NO 10), que incluem os alvos de restrição EcoRV e Xho I nos seus terminais 5' respectivos. A 7a base do oligonucleótido Apxla5' (SEQ ID NO 9) corresponde à primeira base do codão de iniciação da tradução do gene apxIA. A sétima base do oligonucleótido Apxla3' (SEQ ID NO 10) é complementar da base 885 da sequência de codificação do gene apxIA, sendo esta última a última base antes da iniciação da sequência para a segunda hélice transmembranar. O segundo objectivo nesta fase era o de se obter um fragmento de ADN contíguo ao terminal 3' do segmento de codificação da segunda hélice transmembranar do gene apxIA. Portanto, utilizando PCR, amplificou-se um fragmento com 1042 bp de ADN genómico purificado da estirpe HP816 de App utilizando como iniciadores os oligonucleótidos Apxlb5' (CTC GAG CCG CTT TCG TTC TTA AAT GTT GCG) (SEQ ID NO 11) e Apxlb3' (AGA TCT TCA CCG GCT TTC TGT GCA CTT TG) (SEQ ID NO 12) que incluem os alvos de restrição Xhol e BglII nos seus terminais 5' respectivos. A 7a base do oligonucleótido Apxlb5' (SEQ ID NO 11) corresponde à base 946 da sequência de codificação do gene apxIA, sendo esta a primeira base depois do final da sequência para a segunda hélice transmembranar. A sétima base do oligonucleótido Apxlb3' (SEQ ID NO 12) é complementar da base 1975 da sequência de codificação para o gene apxIA.

Dos dois fragmentos previamente descritos que foram obtidos, o primeiro foi digerido com os enzimas de 31 restrição EcoRV e XhoI, enquanto o segundo foi digerido com os enzimas XhoI e BglII. Ambos os fragmentos foram então ligados com o vector pGP3 que se havia anteriormente cortado com os enzimas de restrição EcoRV e Bglll. Denominou-se o plasmideo híbrido que se obteve ρΑρχΙΔΗ2. C.3.- Construção do plasmideo hibrido ρΑρχΙΙΔΗ2 0 primeiro objectivo, neste passo, era o de obter um fragmento de ADN contíguo ao terminal 5' do segmento de codificação da segunda hélice transmembranar do gene apxIIA. Portanto, por PCR, amplificou-se um fragmento de 871 bp do ADN genómico purificado da estirpe HP816 de App utilizando como iniciadores os oligonucleótidos ApxIIa5' (GAT ATC AAA TCG TCC TTA CAA CAA GGA TTG) (SEQ ID NO 13) e

ApxlIa3' (GAA TTCACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC) (SEQ ID NO 14) que incluem os alvos de restrição EcoRV e EcoRI nos seus terminais 5' respectivos. A base número 7 do oligonucleótido ApxIIa5' (SEQ ID NO 13) corresponde à base 27 da sequência de codificação do gene apxIIA. A sétima base do oligonucleótido ApxIIa3' (SEQ ID NO 14) é complementar da base 885 da sequência de codificação do gene apxIIA, esta última sendo a última base antes do início da sequência da segunda hélice transmembranar. 0 segundo objectivo deste passo era obter um fragmento de ADN contíguo ao terminal 3 do segmento de codificação para a segunda hélice transmembranar do gene apxIIA. Amplificou-se portanto um fragmento com 952 bp por 32 PCR, a partir do ADN genómico purificado da estirpe HP816 de App utilizando-se como iniciadores os oligonucleótidos ApxlIb5' (GAA TTC CCT CTT TCA TTC TTA AAT GTA GC) (SEQ ID NO 15) e ApxlIb3' (AGA TCT GCC ATC AAT AAC GGT AGT ACT TG) (SEQ ID NO 16) , que incluem os alvos de restrição EcoI e Bg/II nos seus terminais 5' respectivos. A 7a base do oligonucleótido ApxIIb5' (SEQ ID NO 15) é igual à base 946 da sequência de codificação para o gene apxIIA, sendo esta última a primeira base após o final da sequência de codificação para a segunda hélice transmembranar. A sétima base do oligonucleótido ApxIIb3' (SEQ ID NO 16) é complementar da base 1845 da sequência de codificação para o gene apxlIA.

Uma vez obtidos os dois fragmentos descritos anteriormente, digeriu-se o primeiro com os enzimas de restrição EcoRV e EcoRI, e digeriu-se o segundo com os enzimas EcoRI e BglII. Ambos os fragmentos foram então ligados com o vector pGP3 anteriormente digerido com os enzimas de restrição EcoRV e BglII. Denominou-se o plasmideo híbrido resultante ρΑρχΙΙΔΗ2. D. - Construção das bactérias recombinantes contendo resolvido o plasmideo híbrido inserido no seu genoma. D.l. Construção da estirpe recombinante HP816R1 de App. 33 A transformação do App com o plasmideo híbrido pApxIMI2 foi conseguida por conjugação a partir de células de E. coli S17-1 λ pir que são portadoras deste plasmideo. Utilizou-se a estirpe HP816Nlr para a transformação com o plasmideo híbrido ρΑρχΙΔΗ2.

Antes de se levar a cabo a conjugação, obteve-se uma cultura em fase estacionária para estas bactérias. Utilizou-se o meio de cultura TSYN (Caldo de Soja com Tripsina a 30 g/L, extracto de leveduras a 6 g/L, autoclavado uma vez e suplementado com 0, 00 4% de NAD) e ácido nalidíxico (a 50 pg/mL), para o crescimento da App816Nlr.

Utilizou-se o meio de cultura LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de leveduras, 10 g/L de NaCl) autoclavado uma vez, suplementado com 25 pg/mL de canamicina, para o crescimento de E. coli S17-1 À pir. Uma vez conseguida a fase estacionária, adicionaram-se 0,2-0,3 unidades A6oo da cultura de App e 0,6-0,8 unidades A6oo da cultura de E. coli a 1 mL de uma solução 10 mM de MgS04. Em seguida centrifugou-se durante 2 minutos a 15.000 g e voltou a suspender-se a pérola resultante em 200 pL de uma solução 10 mM de MgS04. Uma vez conseguida a mistura das culturas, colocou-se sobre um filtro em nitrocelulose com 2,5 cm de diâmetro e 0,45 pm de espessura, previamente colocado sobre uma placa de Petri contendo meio TSYN com um suplemento de 15 g/L de agar Noble. Depois de se incubar durante 6 horas a 37°C, colocou-se o filtro com a 34 conjugação num tubo contendo 2 mL de PBS (Na2HP04 10 irM, KH2 PO4 1 mM, NaCl 137 mM, KC1 2 mM, pH 7.4) . Depois de uma agitação vigorosa, removeu-se o filtro e centrifugou-se a suspensão de células durante 2 minutos a 15.000 g, voltando a suspender-se a pastilha em 500 pL de PBS. Distribuiu-se a suspensão que deste modo se obteve por placas de Petri contendo meio TSYN com um suplemento de 15 g/L de Agar Noble, com 50 pg/mL de canamicina e com 50 pg/mL de ácido nalidixico, a uma taxa de 100 pL de suspensão de células em cada placa de Petri. Incubaram-se as culturas obtidas a 37°C durante 24-36 horas. Com este processo obtiveram-se 65 colónias resistentes a canamicina e a ácido nalidixico, para a conjugação com o plasmideo ρΑρχΙΔΗ2, o que corresponde a uma frequência de transformação de l,3xl0“7 para cada célula receptora.

Voltaram a semear-se diversas colónias por exaustão do laço nas placas de Petri contendo LP suplementado com 15 g/L de Agar Noble, 0, 004 % de NAD, 50 pg/mL de canamicina e 50 pg/mL de ácido nalidixico. Todas as colónias resultantes exibiam graus distintos de fluorescência quando expostas a luz ultravioleta, o que indicava a integração do plasmideo no genoma de App num único acontecimento de recombinação. Tal como se ilustra na figura 3, se houvesse ocorrido uma dupla recombinação, os exconjugados seriam incapazes de crescer num meio contendo canamicina. A presença deste antibiótico nas placas permite apenas o crescimento daqueles recombinantes em cujo genoma esteja integrado todo o plasmideo. O gene indicador GFP 35 permite discriminar se algumas das colónias que são resistentes à canamicina é resultante de uma mutação espontânea.

Por último, os recombinantes obtidos provinham de uma recombinação homóloga entre um plasmídeo e o gene apxIA. Isto foi verificado observando a actividade hemolitica dos recombinantes em placas Columbia de agar de sangue suplementado com 0,004 % de NAD (Figura 3, painel C). Os recombinantes obtidos contendo o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 exibem uma diminuição marcada do diâmetro da auréola hemolitica em comparação com a da estirpe de origem HP816Nlr.

Um dos recombinantes obtidos com o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 foi seleccionado para as passagens ulteriores, e passou a referir-se como HP816R1. D.2 Construção da estirpe AppApxIH2“ resultantes sej am

Uma vez integrados os recombinantes com o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 no genoma com sucesso, é essencial fixar a excisão no genoma de App através de um segundo acontecimento recombinante. Portanto submeteu-se um dos recombinantes do passo anterior a passagens em série num meio de cultura suplementado apenas com ácido nalidíxico. Um meio sem canamicina permite que, num caso em que ocorra uma segunda recombinação entre o genoma de App e o plasmídeo integrado, as bactérias nJ J 36 viáveis. Este segundo acontecimento de recombinação dá origem ao aparecimento de dois genótipos diferentes. Caso isto ocorra no mesmo segmento em que a primeira recombinação ocorreu, o genótipo resultante será idêntico à estirpe de origem utilizada na secção D.l. Caso esta segunda recombinação ocorra num segmento em que a primeira recombinação não ocorreu, o genótipo resultante denotará uma excisão no fragmento que codifica para a segunda hélice transmembranar da hemolisina (Figura 3, painel A) . 0 aparecimento dos recombinantes pode ser monitorizado de diversos modos diferentes: a) pelo desaparecimento da fluorescência quando as colónias são expostas a luz ultravioleta; b) pela sensibilidade à canamicina; e c) pela recuperação da auréola hemolítica exibida pela estirpe de origem utilizada na secção D.l. Os métodos a) e b) detectam ambos os tipos recombinantes. 0 método c) torna possível distinguir os recombinantes que recuperaram o genótipo de origem. Isto deve-se ao facto de os recombinantes que mostram a excisão no segmento de codificação para a segunda hélice transmembranar do gene apxlA, a actividade hemolítica do fenótipo de origem correspondente não voltar a ser estabelecida.

As passagens em série foram levadas a cabo a partir de passagens anteriores utilizando diluições a 1/10.000 da passagem anterior, com excepção da primeira passagem que utilizou simplesmente uma cultura obtida a partir de uma colónia isolada de HP816R1. O meio de cultura era LB com suplementos de 0, 004 % de NAD e de 50 pg/mL de 37 ácido nalidixico. Para cada passagem, utilizou-se um volume de 10 mL de meio. As percentagens de recombinantes detectados estão listadas na tabela 1. 37 Tabela 1 Número da l % de recombinantes j % de recombinantes i Passagem detectados (a) detectados (b) 2 1 0,12 % 0,18 % 3 | 0,32 % 1 0,46% 4 | 7,75 % | 10,4 % 5 18,! 22,3 % | i| (a) percentagem determinada por contagem de colónias! Iique recuperaram a auréola hemolitica exibida pelai i;estirpe de origem I lj (b) percentagem determinada por contagem das colónias! iique não exibiam fluorescência quando expostas a 1 uz| iulrrav i olet.a . |

Tal como se observa na tabela acima, a cada passagem o número de bactérias que mostram um plasmideo resolvido devido a uma segunda recombinação aumenta. A percentagem de colónias não fluorescentes é apenas ligeiramente maior do que a das colónias que recuperam a actividade hemolitica. Este facto sugere que a segunda recombinação ocorre preferivelmente no mesmo segmento de ADN em que ocorrera a primeira recombinação. Se a frequência de cada tipo de recombinante fosse de 50 %, o número de colónias não fluorescentes seria o dobro do daquelas que recuperavam a actividade hemolitica. 38

Uma vez suficientemente enriquecida a cultura em segundos recombinantes, pode iniciar-se o passo de purificação. Atento este objectivo, propagaram-se diversas colónias não fluorescentes em agar Columbia com suplemento de NAD e em agar LB com suplementos de NAD, de 50 pg/mL, de ácido nalidixico e de 20 pg/mL de canamicina (LBNKm) . para estudos ulteriores, seleccionaram-se diversas colónias que não logravam crescer em LBNKm e que exibiam a mesma actividade hemolitica que a recombinante obtida por inserção de HP816R1. D. 3 Construção da estirpe recombinante de App, HP816R2.

Levou-se a cabo a transformação de App com o ρΑρχΙΙΔΗ2 por conjugação de E. coli S17-1 λ pir que são os veículos destes plasmídeos. Utilizou-se a estirpe AppApxIH2~ para a transformação com o plasmídeo híbrido ρΑρχΙΙΔΗ2. Os procedimentos e meios de cultura são idênticos aos descritos na secção D.l. A frequência de transformação com o plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 era semelhante à obtida na secção D.l. para o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2.

Voltaram a semear-se diversas colónias por exaustão do laço em placas de Petri contendo LB com suplementos de 15g/L de agar Noble e 0,004 % de NAD, com 50 pg/mL de canamicina e 50 pg/mL de ácido nalidixico. Todas as colónias resultantes exibiam graus diferentes de fluorescência quando expostas a luz ultravioleta, o que 39 indica a integração do plasmídeo no genoma de App num acontecimento único de recombinação. Tal como se observa na fig. 4, quando ocorre uma dupla recombinação, os exconjugados serão incapazes de crescer num meio contendo canamicina. A presença deste antibiótico nas placas permite apenas o crescimento daqueles recombinantes que contenham integrado no seu genoma o plasmídeo completo. O gene indicador GFP permite a discriminação de quaisquer colónias que são resistentes à canamicina, são resultantes de uma mutação espontânea.

Por último, os recombinantes obtidos provêm de uma recombinação homóloga entre o plasmídeo e o respectivo gene apxIIA. Provou-se isto observando a actividade hemolítica dos recombinantes em placas com agar Columbia com um suplementado de 0, 004 % de NAD (fig. 4, painel C) . Os recombinantes obtidos com o plasmídeo pApxIIH2 mostram que a auréola hemolítica desapareceu por completo.

Um dos recombinantes obtidos com o plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 foi seleccionado para as passagens ulteriores e foi denominado HP816R2. D.4 Construção da estirpe AppApxl/lIH2“.

Uma vez obtidos os recombinantes contendo o plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 integrado no seu genoma era essencial fixar-se a excisão no genoma de App por intermédio de uma segunda recombinação. Portanto, os recombinantes obtidos no 40 passo anterior foram submetidos a passagens em série em meio de cultura com suplemento de apenas ácido nalidixico, tal como se descreveu em D. 2. Os valores das percentagens dos recombinantes detectados da segunda passagem são semelhantes aos obtidos na D.2.

Quando a cultura estiver suficientemente enriquecida em recombinantes secundários, pode continuar-se o seu passo de purificação. Atento este objectivo, multiplicaram-se diversas colónias não fluorescentes em agar Columbia com suplemento de NAD e em agar LB com suplementos de NAD, 50 pg/mL de ácido nalidixico e canamicina a 20 pg/mL (LBNKm). Seleccionaram-se diversas colónias para estudos complementares, de entre as que não cresciam em meio LBNKm e mostravam a mesma actividade hemolitica que o recombinante por inserção HP816R2. E.- Análise do ADN purificado das colónias, isolado na passagem anterior, para se testar a homogeneidade das culturas e a presença da excisão nos genes apxIA e apxIIA.

Cultivaram-se os recombinantes das passagens D. 2 e D.4 anteriores em 10 mL de meio TSYN com um suplemento de 50 pg/mL de ácido nalidixico, até se chegar à fase estacionária. Mais tarde levou-se a cabo a extracção do ADN de cada uma delas. E.I.- Análise dos recombinantes ApxIH2 . 41

Digeriram-se as amostras do ADN genómico correspondendo a cada uma das culturas dos segundos recombinantes obtidos com o plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 com o enzima de restrição XhoI. Estas digestões, em conjunto com outras levadas a cabo a partir do ADN extraído respectivamente das culturas das estirpes HP816Nlr e HPB816R1, foram analisadas por transferência Southern utilizando o fragmento de ADN com 1927 bp proveniente da digestão do plasmídeo ρΔΑρχ1Η2^ com os enzimas de restrição EcoRV e BglII como sonda. Os resultados destas hibridizações estão ilustrados na figura 3B. Os resultados da hibridização da estirpe de controlo HP816Nlr mostram a presença de um alvo de restrição Xhol colocado a cerca de 20 kb do que se encontrou dentro do operão apxI. A análise do recombinante com a inserção do plasmídeo ρΑρχΙΔΗ2 mostra aparecerem duas novas bandas com 1,1 e com 4,3 kb, e um pequeno aumento de cerca de 1 kb da banda previamente existente a 2 0 kb. O tamanho das novas bandas e o aumento da banda previamente existente, são acontecimentos expectáveis da inserção do plasmídeo híbrido ρΑρχΔΗ2 na região flanqueando a 5' o fragmento de codificação da segunda hélice transmembranar do gene apxIA do genoma de App (Figura 3A, delineamento 2) . A análise do recombinante com o plasmídeo resolvido da segunda recombinação na mesma região 5' em que a primeira teve lugar, mostra o desaparecimento das duas bandas com menor massa molecular e uma pequena diminuição da mobilidade da banda previamente a 21 que agora aprece ao mesmo nível que a da estipe de origem. Isto, em conjunto com o facto que a 42 actividade hemolítica é idêntica à exibida pela estirpe original HP816Nlr, sugere que não são introduzidas nenhumas modificações adicionais no genoma de App durante todo este processo (Figura 3, A, e C).

Por último, a análise do recombinante com o plasmideo resolvido de uma segunda recombinação na região flanqueando a 3' o segmento que codifica para a segunda hélice transmembranar, mostra o desaparecimento da banda a 4,3 kb, a manutenção da banda a 1,1 kb que já se tinha observado no recombinante por inserção e uma pequena diminuição da banda a 20 kb. Esta distribuição de bandas é a expectável, devido ao desaparecimento do segmento de codificação para a segunda hélice transmembranar e a sua substituição por um alvo de XhoI. Este novo alvo, inserido no genoma de App, origina o fragmento de 1,1 kb e a diminuição consecutiva de 1,1 kb na banda de 20 kb, que se observam na estirpe HP816 Nlr (Figura 3A e B) . Note-se em CA a presença de grandes auréolas hemoliticas em volta das colónias das culturas 1 e 3 e de pequenas auréolas hemoliticas em volta das colónias das culturas 2, 4 e 5. Veja-se também a ausência de crescimento em TS das culturas 1, 3, 4 e 5. Este recombinante mostra uma actividade hemolítica muito diminuída em comparação com a estirpe de origem HP816 Nlr e a mesma actividade hemolítica que um App do sorotipo 7 que apenas possui a hemolisina ApxII (Figura 3C) . Este resultado indica que a excisão na segunda hélice transmembranar elimina ou diminui consideravelmente a 43 actividade hemolítica do ApxIA de App. Denominar-se-á, doravante a App modificada pela excisão descrita, ApxIAH2~. 0 recombinante que desta forma se obteve, caracterizado pela existência de uma excisão dos nucleótidos 886 a 945 no gene apxIA que codifica para o segundo domínio transmembranar da exotoxina Apxl, foi denominado AppApxIH2~. A 10 de Janeiro de 2002 ele foi depositado na Colección Espanola de Cultivos Tipo sob o número de registo CECT 5985, de acordo com as condições estipuladas no tratado de Budapeste. E.2.- Análise dos recombinantes apx/HH2_.

Digeriram-se amostras de ADN genómico correspondente ao recombinante por inserção HP816R2 e aos segundos recombinantes obtidos a partir do plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2“ com o enzima de restrição EcoRI. Estas digestões, em conjunto com outra levada a cabo sobre um ADN extraído de uma cultura da estirpe HP816Nlr, foram analisadas por transferência Southern. A título de sonda, utilizaram-se os dois fragmentos de ADN amplificados por PCR. Estes correspondem às regiões flanqueantes a 5' e a 3' do segmento de ADN que codifica para a segunda hélice transmembranar do ApxII (Secção B). Mostram-se na figura 4B os resultados destas hibridizações. Os resultados da hibridização da estirpe de controlo HP816 Nlr mostram a presença de dois alvos de restrição de EcoRI distantes um do outro em 15,7 kb, que delimitam um fragmento no qual se 44 inclui o operão apxll. A análise do recombinante por inserção de plasmídeo ρΑρχΙΙΔΗ2 mostra o desaparecimento da banda com 15,7 kb e o aparecimento de três novas bandas com 8,2, 7,5, e 0,9 kb. A dimensão destas novas bandas é a esperada da inserção do plasmídeo híbrido ρΑρχΙΙΔΗ2 na região flanqueante a 3' do segmento que codifica para a segunda hélice transmembranar do gene apxIIA do genoma de App (Figura 4A). A análise do recombinante com o plasmídeo resolvido da segunda recombinação na mesma região 3' em que ocorreu a primeira, mostra que volta a aparecer uma única banda com 15,7 kb que coincide com a banda proveniente da estirpe de controlo (Figura 4B). A actividade hemolítica é idêntica àquela que é manifestada pela estirpe de origem AppApxIH2~ (Figura 4C) . Por último, a análise do recombinante com o plasmídeo resolvido proveniente de uma segunda recombinação pela região flanqueante a 3' do segmento que codifica para a segunda hélice transmembranar mostra o desaparecimento das bandas com 13,5 e 0,9 kb e o aparecimento de um novo fragmento com 7,5 kb (Figura 4B) . Esta distribuição de bandas é aquela que se esperava, do desaparecimento do segmento de codificação para a segunda hélice transmembranar e da sua substituição por um alvo de FcoRI (Figura 4A). Este novo alvo inserido no genoma de App origina o fragmento com 15,7 kb de EcoRI, que inclui o operão apxll na estirpe de origem, e se quebra em dois fragmentos com 8,2 e 7,5 kb (Figs. 4A e 4B). Este recombinante é virtualmente não hemolítico (Figura 4C) . Este resultado indica que a excisão na segunda transmembrana apaga ou diminui praticamente por completo, a 45 actividade hemolítica do ApxIIA de App. 0 ApxIIA modificado levando a cabo a excisão referida será designado doravante como ApxIIAH2“. Note-se em CA a presença de pequenas auréolas hemoliticas em torno das colónias das culturas 1 e 3 e a ausência de auréolas hemoliticas em torno das colónias 2 e 4. Note-se também a ausência de crescimento das culturas 1, 3 e 4 em TS.

Alterou-se o nome da estirpe recombinante que deste modo se obteve para AppApxI/IIH2“. Ela é caracterizada por apresentar uma excisão doa nucleótidos 886 a 945 no gene apxIA que codificam para um segundo domínio transmembranar da exotoxina Apxl e além disso pela excisão dos nucleótidos 886 a 945 do gene apxIIA, que codifica para o segundo domínio transmembranar da exotoxina ApxII. Esta estirpe foi depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo, a 12 de Junho de 2002, sob o número de registo CECT 5994, tal como especificado nas condições do Tratado de Budapeste sobre patentes. F.- Análise da produção de ApxIAH2~ e de ApxIIkH2~ pelas estirpes recombinantes obtidas.

Para se determinar se as estirpes recombinantes obtidas ainda produziam a ApxH2“, determinou-se a sua concentração no meio LB. Detectaram-se as quantidades de Apx produzidas utilizando anticorpos monoclonais específicos contra Apx I e contra Apx II por imunoensaios e transferência Western. Tal como se ilustra na figura 5 (A e 46 Β) , a produção e a excreção para o meio de ApxIAH2“ e de ApxIIAH2~ pelas estirpes recombinantes segue o mesmo perfil ao longo do tempo que a de Apx não modificado por parte da estirpe selvagem não modificada HP816Nlr. Todas as hemolisinas (modificadas ou não) aparecem no meio de cultura na altura da segunda metade da fase de crescimento exponencial e atingem uma concentração máxima no inicio da fase estacionária. Deste momento em diante, a concentração de todas as hemolisinas mantém-se estável ou diminui ligeiramente. Tal como se observa na mesma figura, ApxIAH2~ e ApxIIAH2^ vão-se acumulando até atingirem teores semelhantes aos denotados pela Apx não modificada respectiva produzida pela estirpe semelhante de tipo selvagem HP816Nlr. Por outro lado, a excisão introduzida é muito pequena (18 aminoácidos) e só se espera uma diminuição de 2 kD da massa molecular de ambos os ApxH2~. Levando em conta que as 2 hemolisinas de tipo selvagem apresentam massa molecular aparente de cerca de 105 kDa, uma diminuição de 2 kDa da sua massa molecular passa desapercebida nos geles de poliacrilamida e nas correspondentes transferências Western (figura 6) . Por último, deve sublinhar-se que nesta mesma figura não aparecem produtos polipeptídicos truncados ou impropriamente processados. Repare-se que a mancha a 105 kDa na pista 3 só aparece detectada em (C) . Todos estes dados indicam que a pequena excisão levada a cabo em ambas as Apx não impedem que elas sejam sintetizadas de um modo completo e exportadas para o meio de cultura. Uma vez libertada para o meio de cultura, a ApxH2~ exibe uma 47 estabilidade semelhante à manifestada pela Apx respectiva não modificada. G.- Eficácia da atenuação das estirpes obtidas.

Para se testar o grau de atenuação das duas estirpes recombinantes construídas, utilizaram-se suínos híbridos LWxLD machos e fêmeas, com três meses de idade.

Utilizaram-se quatro réplicas de suíno dos diversos ensaios. Administrou-se cada uma das estirpes a uma dose de 108 cfu em 5 mL de PBS, a cada um dos animais dos 3 primeiros grupos, por injecção intratraqueal. Previamente havia-se determinado esta dose como sendo a LD50 para a estirpe de tipo selvagem HP816Nlr em suínos com esta idade. Inocularam-se os animais do quarto grupo com apenas uma dose de 5 mL de PBS. Registaram-se os sinais clínicos diariamente durante um período de 7 dias de duração do ensaio. Mostram-se os resultados na tabela 2:

Tabela 2 ::Est i rpe | Número ijDosagelMortalida 1 ÍDias com; iDias com sinais |de |m de: |An i mai iApp §s j: (cfu) ide a 1 t.erações doJclínicos compo rtament.o|respiratór i c | (b) 0-2 §3-4 §5-6 §0-2 §3-4 >S 5-6 :!:HP816Nlr P §io8 Í2/5 i i5/5 §3/3 §3/3 ! Í5/5 §1/3 0/3 jjlAppApx 1112 lio iiio8 io..............................i h 0/Ί io §9/1 §0 §4/1 lo 15/10 §3/10 3/1 0 |AppApxI/II 1112 |io ido8 0 :4/10 §0/1 1° §0/1 i 1° i 12/10 §0/10 0/1 io jjjCont rolo |(PBS) §5.................. |n.à. Io i io/b §0/5 §0/3 ÍO/5 §0/5 Í0/5 |(a) Animais com comportamento de consciência e capacidade dej: | resposta na presença do tratador defeituosos::: (Afectados/total) 48 jiEstirpe |Número|Dosage|Mortalida ÍDias com|Dias com sinais

Ide im delde jalrerações do|clinicos comportamento|respiratórios ...............................................]|„(b)............................................ ÍO—2' !3'-4 IÍ5'-6"II0-2 Í3-4 ]:5-6

Animai|App s | (cfu) (b) Animais com ritmo respiratório e/ou dispneia (Afectados/ii Total) .

Sete dias depois da inoculação sacrificaram-se os animais e registaram-se as lesões macroscópicas observadas, nos órgãos respiratórios. Levaram-se também a cabo exames bacteriológicos durante a necropsia.

Resumiram-se os resultados obtidos neste ensaio na Tabela 3

Tabela 3

Estirpe Número !; de animais ijDosagem: i; de App : ii (cfu) : iMortalidade; : Animais : com lesão pulmonar : índice : médio de : lesões ipulmonares i; Animais dos i; quais ;i se ;i isolou 1......ApP...... HP816Nlr 1 5 1 Ϊ08 2/5 4 : 11,6± 2.1 3 AppApxIH2- 1 10 108 : 1................0'..... !...........7............: i 3,2 ± 4.6 1.........3......... AppApxI/IIH2 1........10......... 108 i 0 ............õ...........i |..............õ............... 8 Controlo (PBS) 1 5 N.A. i õ 0 j Ò 0

Dois de 5 animais deste grupo morreram durante este período de tempo. Na necropsia, quatro dos cinco animais denotavam lesões pulmonares severas. Os animais que haviam sido inoculados com a estirpe AppApxIH2“ denotavam também uma modificação do seu comportamento, embora estes sinais se tivessem tornado mais lentos a partir do quarto dia de inoculação. Os sinais clínicos eram mais suaves e 49 apenas foram observados em 50 % dos porcos. Embora nenhum dos animais deste grupo tenha morrido durante o ensaio, 70 % deles denotavam lesões na necropsia, embora estas fossem menos pronunciadas do que as do grupo anterior. O terceiro grupo foi inoculado com a estirpe AppApxI/IIH2~.

Embora quatro dos animais tivessem denotado comportamento ligeiramente alterado, estas alterações tornaram-se menores a partir da 48a hora após a inoculação. Os dois animais que haviam evidenciado sinais clínicos limitados também recuperaram 48 horas depois da inoculação. Não se observaram lesões pulmonares em nenhum dos animais durante a necropsia. A avaliação das lesões pulmonares foi feita consoante Hannan et al.; (Research in Veterinary Science 33: 76-88 (1982)). Os valores tabelados são médias aritméticas para cada grupo, em conjunto com o desvio padrão. De acordo com estes resultados, a estirpe AppApxI/IIH2- é não virulenta e pode ser utilizada com segurança a título de vacina viva. É importante sublinhar-se que a estirpe de App inoculada foi recuperada em 80 % dos porcos deste grupo, sete dias depois da sua administração. Este resultado indica que a viabilidade da estirpe AppApxI/IIH2- numa infecção experimental não é modificada apesar do facto de ela ser isenta de actividade hemolítica. Este facto é importante quando se leva em conta que é essencial que o micro-organismo permaneça viável para que as exotoxinas Apx possam ser geradas e libertadas. Sem a produção das exotoxinas Apx, e estirpe atenuada não poderia ser utilizada a título de vacina viva uma vez que 50 ela seria incapaz de gerar uma reacção imunológica que protegesse o animal contra infecções futuras (Reimer et al.; Microbial Pathogenesis 18: 197-209 (1995)). Em todos os ensaios conseguiu-se uma reacção imunogénica forte.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> LABORATORIOS HIPRA, S.A. <12 0> Vacina viva atenuada contra pleuropneumonia porcina <130> 44 67W0334HIP <150> ES P 200202663 <151> 2002-11-20 <160> 16 <17 0> Patente na Versão 3.1 <210> 1 <211> 26

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> iniciadores de PCR 51 <4 Ο 0> 1 gatcgaattc aggatatcac agatct 26

<210> 2 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <400> 2 atttagatct gtgatatcgt gaattc 26

<210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <400> 3 gaattcaatg cttctggcgt cag 23

<210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial 52 <22 0> <223> iniciadores de PCR <400> 4 ggtaccggat gagataagat tttc 24

<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <400> 5 ggtaccggat gagataagat tttc 24

<210> 6 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <400> 6 gaattcaaga gtttgtagaa acgc 24 53

<210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <400> 7 ggtacctaat ttaccaacac tac 23

<210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <400> 8 ggtaccttat ttgtagagct catc 24

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> iniciadores de PCR 54 <4 Ο 0> 9 gatatcatgg ctaactctct cagctcgata 30

<210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <4 0 0> 10 ctcgaggcct gccgccacac gttg 24

<210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> iniciadores de PCR <400> 11 ctcgagccgc tttcgttctt aaatgttgcg 30 <210> 12 <211> 29

<212> ADN 55 <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <4 0 0> 12 agatcttcac cggctttctg tgcactttg 29

<210> 13 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <4 0 0> 13 gatatcaaat cgtccttaca acaaggattg 30

<210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <4 0 0> 14 27 gaattcacct gaagcgactc gttgggc 56

<210> 15 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <4 0 0> 15 29 gaattccctc tttcattctt aaatgtagc

<210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciadores de PCR <4 0 0> 16 agatctgcca tcaataacgg tagtacttg

Lisboa, 5 de Março de 2012. 29

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método de obter uma estirpe imunogénica, não hemolitica, de Actinobacillus pleuropneumoniae a partir de uma estirpe virulenta de App caracterizado por incluir o passo de se modificar pelo menos um segmento que codifica para um domínio transmembranar, do gene apxIA, e opcionalmente um segmento que codifica para um domínio transmembranar, do gene apxIIA, em que o segmento do gene apxIA corresponda aos nucleótidos 697 a 759, ou aos nucleótidos 886 a 945, ou aos nucleótidos 1105 a 1215, em que o segmento do gene apxIIA corresponda aos nucleótidos 697 a 759, ou aos nucleótidos 886 a 945, ou aos nucleótidos 1105 a 1215, em que o segmento do gene que codifica para um domínio transmembranar seja modificado por substituição ou por inserção de um ou de diversos nucleótidos, ou por ser parcial ou totalmente retirado o segmento do gene, ou por uma alteração química ou por mutagénese induzida por irradiação, e em que a modificação não exceda os domínios transmembranares dos genes apxIA e apxIIA. 2
2. 2. Um método consoante a reivindicação 1, caracterizado por se efectuar uma excisão de pelo menos um segmento do gene apxIA, e opcionalmente de um segmento do gene apxIIA, que codificam para um domínio transmembranar das exotoxinas hemolítica e citolítica Apx, tal como se definiram na reivindicação 1.
3. 3. Um método consoante a reivindicação 2, caracterizado por se efectuar uma excisão no segmento do gene apxIA, que codifica para um segundo domínio transmembranar da exotoxina Apxl de App, correspondendo aos nucleótidos 886 a 945.
4. 4. Um método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se efectuar uma excisão dos nucleótidos 886 a 945 do gene apxIA, que codifica para o segundo domínio transmembranar da exotoxina Apxl de App.
5. 5. Um método consoante qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado por se efectuar além disto uma excisão no segmento do gene apxIIA, que codifica para o segundo domínio transmembranar da exotoxina ApxII de App, correspondendo aos nucleótidos 886 a 945.
6. 6. Um método consoante a reivindicação 5, caracterizado por de efectuar uma excisão dos nucleótidos 886 a 945 do gene apxIIA, que codificam para o segundo domínio transmembranar da exotoxina ApxII de App. 3
7. 7. Uma estirpe de Actinobacillus pleuropneumoniae obtida de acordo com o método descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Uma vacina contra a pleuropneumonia porcina, caracterizado por incluir uma estirpe de Actinobacillus pleuropneumoniae obtida utilizando o método descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
9. 9. A estirpe imunogénica e não hemolitica de Actifiobacillus pleuropneumoniae depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo sob o número de registo CECT 5985.
10. 10. Uma vacina contra a pleuropneumonia porcina caracterizada por incluir a estirpe de Actinobacillus pleuropneumoniae consoante a reivindicação 9.
11. 11. A estirpe imunogénica e não hemolitica de Actinobacillus pleuropneumoniae depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo sob o número de registo CECT 5994 .
12. 12. Uma vacina contra a pleuropneumonia porcina caracterizada por incluir a estirpe de Actinobacillus pleuropneumoniae consoante a reivindicação 11. Lisboa, 5 de Março de 2012.