KR920006879B1

KR920006879B1 - 고정제 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR920006879B1
Application number: KR1019840007430A
Authority: KR
Inventors: 고오이찌 가또; 다까오 야마다; 하루오 온다
Original assignee: 다께다야꾸힝고오교가부시끼가이샤; 구라바야시 이꾸시로
Priority date: 1983-11-28
Filing date: 1984-11-27
Publication date: 1992-08-21
Also published as: JPH0542413B2; EP0145390A2; FI81118B; NO844710L; MY103892A; NO169021C; EP0751220A1; ES537994A0; NO169021B; AU592527B2; ES8606489A1; ZA849221B; JPS60115528A; SG46452A1; US5464939A; DK560784D0; FI81118C; EP0145390A3; GR81040B; FI844678A0

Abstract

내용 없음.

Description

고정제 단백질의 제조방법

제1도 및 제2도는 각각 참고예 1(ⅶ)에서 수득된 플라스미드 pILOT135-8의 제한효소 지도 (

는 단일팹티드를 코우딩하는 부분이고,

는 IL-2를 코우딩하는 부분이다). 및 상기 플라스미드이 1차 구조(염기서열)를 나타낸다.

제3도는 본 발명에 따른 비글리코실화 인체 IL-2단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 여기서 X는 Met 또는 수소원자이다.

제4도는 참고예 2에 기재된 형질 발현 플라스미드 pTF4의 형성도식을 나타낸다.

제5도는 실시예 1(ⅴ)(1) 및 (2)에서 수행된 SDS-폴리아크릴아미드 평판 겔 전기 영동의 결과를 나타낸다.

제6도는 실시예 1(ⅴ)(6)에 기재된 트립신 분해 팹티드 지도를 나타낸다.

제7도 및 제8도는 각각 실시예 1(ⅴ)(7)에 기재된 NKC3 세포주 및 인체 세포주에 의한 3중 수소화 티미딘의 흡수에 대한 본 발명에 따른 인체 IL-2 단백질의 효과를 나타낸다.

제9도는 실시예 1(ⅴ)(7)에서 수행된 NKC3 세포주의 장기간 계대 배양결과를 나타낸다.

본 발명은 유전공학기술에 의한 인터로이킨 -2 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

인터로이킨 -2[T 세포성장인자(TCGF)라고도 명명됨 : 이후 IL-2로 약칭함] 는 T세포를 예를들면 렉틴 또는 동종 항원으로 자극함으로써 제조된 림포킨이다.[Science,

, 1007(1976); Immunological Reviews,

, 275(1980)]. IL-2는 T세포의 기능을 유지시키면서 시험관 내에서 성장시킴으로써 T세포의 장기간 배양을 할 수 있게 한다. 또한IL-2는 흉선 세포의 미토겐 반응을 촉진하거나(공 자극제), 나체생쥐에서 T세포-외존 항원에 대한 지라세포의 항체생성을 기억하거나(T세포 대치인자), 킬러세포의 분화 및 중식을 촉진한다 (킬러헬퍼 인자) [The Journal of Immunology,

, 2928(1979(; Immunological Reviews,

, 257(1980)].

킬러 T세포클론, 헬퍼 T세포클론 및 천연킬러 세포클론은 지금까지 IL-2를 이용하여 대다수가 수득되었다[예 Nature,

, 154(1977); The Journal of Immunology,

, 981(1983)]. 이와같이 T세포 또는 천연킬러세포의 클로닝에 직접 사용되는 것과 더불어, IL-2는 특정 항원에 특이한 킬러 T세포, 예를들면 종양 항원을 인지하여 시험관내에서 종양을 파괴하는 킬러 T세포의 선택적 성장에 사용될수 있다. 이 방법으로 성장된 종양- 특이성킬러 T세포를 동물에 주사함으로써 종양의 성장을 방해 및 저해시킬수 있다[The Journal fo Immunology,

, 1904(1980)]. 또한 IL-2는 INF-γ의 생산을 유도하며[The Journal of Immunology,

, 1784(1983)], 천연킬러 세포를 활성화 한다[The Journal of Immunology,

, 1970(1983)].

상술한 실험적 사실들은 IL-2가 항 종양제로 사용될수 있다는 것을 암시하고 있다. IL-2는 흉선기능이 부족한 나체생쥐의 헬퍼 T세포기능을 기억하거나[European Jounal of Immunology,

, 719(1980)], 동종세포에 대한 킬러 T세포의 유도를 기억하므로[Nature,

, 278(1980)], IL-2는 면역절충 질병의 치료에 사용될수도 있다.

그러나, 지금까지 IL-2의 대규모 생산은 곤란하며, 그의 임상적 적용이 불가능하다. 따라서, 대량의 고정제 IL-2를 쉽고 단순한 방법에 의해 저가로 제조할수 있는 기술의 개발이 기대되고 있다.

다니구찌 등은 출발물질인 인체 T세포 백혈병계 주르카트(Jurkat)로부터 분리된 IL-2mRNA를 사용함으로써 인체 IL-2 유전자를 클로닝 하였으며, 그로부터 유도된 인체 IL-2단백질의 아미노산 서열을 보고하였으며, COS-7 세포에 그 유전자를 형질 발현시켰다[Nature,

, 305(1983)], 그후, 데보스 등은 인체 지라세포 유도 IL-2 유전자를 클로닝하고 에스케리키아 콜리에 형질발현 시켰다[Nucleic Acids Research,

, 4307(1983)]. 그럼에도 불구하고, IL-2 유사물질의 존재는 TCGF 활성이 검출되는 것을 기준으로만 평가되고 있다. 인체IL-2를 코우딩한 DNA를 운반하는 형질 전환체에 의해 제조된 인체 IL-2단백질이 실제적으로 정제된 형태로 분리된 보고는 지금까지 없었다.

본 발명자들은 유전자 조작기술을 이용하여 인체 IL-2 유전자를 클로닝하고, 수득된 재조합 DNA 분자를 숙주에 도입하여 인체 IL-2 유전자를 상기 숙주에서 형질 발현시킴으로서 필요한 IL-2단백질을 수득할수 있는 기술을 개발하기 위해 광범위한 연구를 계속하였으며, 그 결과, 실제적으로 고순도의 비글리코실화(non-glycosylated) 인체IL-2단백질의 제조방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 고순도의 비글리코실화 인체 IL-2 단백질, 및 인체 IL-2를 코우딩한 염기서열을 갖는 DNA를 운반하는 형질 전환체를 배양하고, 배양 브로스로부터 상기 단백질을 정제함을 특징으로 하는 인체IL-2 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 인체 IL-2를 코우딩한 DNA는 예를들면 제2도의 코오돈 1-133의 염기서열을 갖는 DNA(Ⅰ)이다. 이 DNA(Ⅰ)는 그의 5'말단에 ATG 또는 제2도의 코오돈 S1-S20으로 표시되는 신호서열을 가지며, 3'말단에 바람직하게는 TAA, TGA 또는 TAG, 더 바람직하게는 TGA를 갖는다.

DNA(Ⅰ)는 프로모터, 예를들면 트립토판(trp)프로모터, rec A 프로모터 또는 A_pL프로모터, 적당하게는 trp 또는 A_PL프로모터로부터 아랫쪽에 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라, 콘카나발린 A에 의해 자극된 인체 말초 백혈구의 배양액으로부터 인체 IL-2를 코우딩한 mRNA를 분리하고, 역전사 효소를 사용하여 단일가닥 cDNA를 합성한 다음, 이중가닥 DNA를 합성한다. DNA를 플라스미드에 삽입하고, 이 재조합 플라스미들르 에스케리키아 콜리 또는 바실루스 서브틸리스 균주의 형질 전환을 위해 사용하며, cDNA-함유 플라스미드를 클로닝한다. 이와같은 방법으로 인체 IL-2를 코우딩한 이중가닥 DNA를 제조할수 있다.

더 특별하게는 본 발명의 실시에 사용된 인체 IL-2 코우딩 mRNA는 히누마 등의 방법[Biochemical and Bio-Physical Research Communications,

, 369(1982)]에 의해 수득될 수 있다. 수득된 인체 IL-2 mRNA를 주형(template)으로 하여 역전사 효소를 사용하여 공지의 방법[Maniatis, T.etal.Cell,

, 163(1976); Land, H.et al., Nucleic Acids Research,

, 2251(1981)]에 의해 cDNA를 합성하고, cDNA를 이중가닥 DNA로 전환시킨다. 이 DNA를 dG-dC동종 중합체 결찰방법[Nelson, T.S., Methods in Enzymology,

, 41(1679)]에 의해 플라스미드 pBR322의

제한 엔도뉴클레아제 절단부위에 삽입한다. 일부 인체 IL-2의 아미노산 서열에 해당하는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 화학적으로 합성하고, 32p로 표지시킨다. 이를 탐침으로 사용하여, 공지의 군락 융합방법[Grunstein, M. 및 Honess, D.S., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A,

, 3961(1975); Alwine, J.C.et al., Methods in Enzymology,

, 220(1979)]에 의해 테트라 시클린-또는 암피실린 저항형질 전환체들 중에서 필요한 클론을 선택한다. 막삼-킬버트 방법[Maxam, A.M.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA,

, 560(1977)] 또는 파아지 M13을 사용한 디뉴클레오티드 합성사슬 종결방법[Messing, J.et al., Nucleic Acids Research,

, 309(1981)에 의해 상기 융합방법에서 양성으로 반응하는 클론으로부터 유도된 DNA의 염기 서열을 결정하여 인체 IL-2 유전자의 존재를 확인한다. 그리고, 전체 또는 일부의 인체 IL-2 유전자를 수득한 클론으로부터 잘라내어, 적당한 프로모터 및 SD(Shine and Dalgarno)염기서열의 아랫쪽 플라스미드에 삽입하고, 이어서 적당한 숙주에 도입한다.

프로모터로는 trp 프로모터를 사용하는 유리하다; 숙주로는 에스케리키아 콜리 균주(예. 군주 294, 균주 DH1, 균주 N4830)을 사용하는 것이 유리하다.

균주 에스케리키아 콜리 294[Beckman et al., Proc.Natl, Acad. Scil USA,

, 4171(1976)], 이 콜리 DH1[Selson, M.E.et al., Nature,

, 1110(1968)] 및 이 콜리 N4830[Cell,

, 173(1983)]은 공지의 균주이다.

상기 숙주를 DNA로 형질 전환시키는 것은 공지의 방법[Cohen, S.N.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA,

, 2110(1972)]에 의해 수행될수 있다. 이렇게 수득된 숙주를 글루코오즈- 및 카스아미노산-함유 M9 배지와 같은 공지의 배지에서 배양한다[Miller, J.Experiments in Molecular Genetics, P 431∼433(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)]. trp 프로모터를 사용하는 경우, 상기 프로모터의 효과를 증가시키기 위해 3-β-인돌릴 아크릴산과 같은 시약을 가할수 있다. 배양은 필요하다면 통기 및/또는 교반하면서, 15∼43℃에서 3∼24시간 동안 수행하는 것이 일반적이다.

A_PL프로모터를 사용하는 경우, 형질 전환체를 성장시키기 위해 약 30∼36℃의 비교적 낮은 온도에서 배양하고 난 다음, 형질 전환체의 리프레서(repressor)를 활성하고 인체 IL-2를 코우딩하는 DNA를 효과적으로 형질 발현하기 위해 약 37∼42℃의 온도에서 배양하는 것이 바람직하다.

이렇게 형성된 인체 IL-2는 IL-2-의존 세포주를 사용하여 분석할수 있다. 인체IL-2는 쥐, 생쥐, 인체IL-2의존세포 및 기타 IL-2-의존세포의 성장을 촉진하기 때문에[Immunological Reviews,

, 257(1980)], IL-2-의존 인체세포주 뿐만 아니라 쥐 또는 생쥐 IL-2-의존세포주도 또한 사용될 수 있다.[Journal of Immunology,

, 981 및 988(1983)].

특히, 생쥐 IL-2-의존세포주는 장기간 계대 배양하여도 안정하게 유지될수 있으므로, 이를 사용하면 상당한 재생력이 있는 분석결과를 수득할수 있다.

배양된 세포로부터 공지의 방법에 따라 인체 IL-2를 추출하는데 있어서, 배양후의 세포를 공지의 방법으로 수거하여 구아니딘의 무기산염(예, 염산염, 질산염, 황산염)과 같은 단백질 변성제 용액에 현탁시키고 현탁액을 냉각시키면서 교반한 다음, 원심분리하여 IL-2-함유상층액을 수득하거나, 수거된 세포를 완충액에 용해시켜 초음파처리, 라이소자임처리 및/또는 동결 및 용융에 의해 파쇄하고 원심분리하여 IL-2-함유상층액을 수득한다. 또한 다름 적당한 방법이 사용될 수도 있다.

상기 상층액으로부 IL-2의 분리 및 정제는 공지의 분리 및 정제방법을 적당히 배합하여 수행할 수 있다. 공지의 분리 및 정제방법은 예를 들면 염석방법 및 용매 침전방법과 같이 용해도차이를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔 여과 및 SDS- 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동과 같이 분자량차이를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피와 같이 전하차이를 이용하는 방법, 친화 크로마토그래피와 같이 특이한 친화성을 이용하는 방법, 역상 고수율 액체 크로마토 그래피와 같이 소수성 차이를 이용하는 방법, 및 등전 촛점법과 같이 등전점 차이를 이용하는 방법이 있다. 인체 IL-2 단백질은 매우 소수성이기 때문에, 소수성 컬럼 크로마토그래피, 특히 역상 컬럼을 사용한 고수율 액체 크로마토그래피가 상기 단백질을 정제하는데 매우 효과적이다.

그러므로, 예를 들면, 인체 IL-2를 코우딩한 유전자를 운반하는 에스케리키아 콜리의 균주를 배양함으로써 수득된 세포를 용액, 바람직하게는 구아니딘 히드로크클로라이드와 같은 단백질 변성제 완충액(2M∼8M, 바람직하게는 6M∼8M농도)에 현탁시키고, 현탁액을 바람직하게는 0∼5℃에서 0.5∼3시간 동안 교반한다음, 원심분리한다. 이렇게 수직된 상층액을 그 자체로 또는 한외여과장치등을 이용하여 농축한후 투석시킨다. 생성된 침전을 원심분리에 의해 제거하고, 상층액은 디에틸아미노에틸 셀룰로오즈를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피[예. DE52 셀롤로오즈(와트만, 영국)컬럼] 하여, 활성분획을 수거한다.

한외여과장치를 사용하여 농축한 후, 활성분획을 세파크릴 S-200(파마시아, 스웨덴)클럼등과 같은 N, N'-메틸렌 비스아크릴아미드-교차 결합 알릴덱스트란을 사용하여 겔 여과한다. 수거된 활성분획을 상술한 바와같이 고수율액체 크로마토그래피한다. 이와같은 방법으로 본 발명의 비글리코실화 액체 IL-2가 수득될수 있다.

고수율액체 크로마토그래피에 사용된 역상계로는 알킬화(C_1-8)실란으로 피복된 수지가 효과적으로 사용될 수 있다. 용리액으로는 C_1-6저급 알카놀(예. 에탄올, 프로판올)또는 아세토니트릴이 사용될 수 있으며, 용리액의 pH는 15.8, 바람직하게는 1.5∼4이다. 용출속도는 0.1∼100㎖/분이 바람직하다.

수득된 인체 IL-2 단백질을 필요하다면 동결 건조시켜 분말화할수 있다. 동결건조시키는 경우, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로즈, 말토오즈, 글리세롤 또는 인체 형청 알부민(HSA)과 같은 안정제를 가할수 있다.

IL-2-의존 생쥐세포에 의해 방사성 티미딘을사용하여 IL-2 활성을 분석할때, 본 발명에 따라 수득된 인체 IL-2 단백질은 1×10⁴U/㎎이상의 비활성을 나타낸다. 본 발명에 따라, 비활성이 2×10⁴U/㎎이상 및 4×10⁴U/㎎이하인 고순도의 비글리코실화인체 IL-2단백질이 수득될수 있다.

상기에서, IL-2 활성단위(U)는 하기의 방법으로 계산된다.

IL-2- 함유시료를 IL-2농도에 따라 성장하는 생쥐세포주의 세포를 함유한 배지에 가하고, 전체 혼합물을 5% CO₂존재하에 37℃에서 밤새 배양한후, 삼중 수소화티미딘을 사용하여 상기 세포주의 성장을 검사한다. 시료의 활성단위(U)를 계산하기 위해, 비교용으로 표준 IL-2(1U/㎖)를 항상 사용하며, 시료와 표준의 활성비로부터 시료의 활성단위를 계산한다.

더 특별하게는 IL-2-함유 조정배지로 보충된 20% FCS-첨가 RPMI1640 배지에 5% CO₂존재하에 37℃에서 계대 배양함으로써 유지된 IL-2-의존 생쥐세포주(NKC3)의 세포[Hinuam et al., Biochem, Biophys. Res., Commun.,

, 363(1982)]를 혈청이 없는 RPMI1640 배지로 2번 세척하고, 6×10⁵세포/㎖가 되도록 20% FCS-첨가 RPMI1640 배지에 재현탁시킨다.

IL-2-함유시료를 96웰의 평평한 바닥 마이크로 타이터 플레이트(Nunc, 덴마아크)의 제1열 웰에 50μl씩 나누어서 넣는다. 20% FCS-첨가 RPMI1640 배지의 50μl분을 사용하여, 제12열이 될때까지 2배씩 희석해 나간다. 상기의 NKC3 세포 현탁액을 50μl씩 전체웰에 분배하고, 50% CO₂존재하에 37℃에서 24시간 동안 배양한다. 20시간 배양한후, 1μCi의 삼중 수소화 티미딘(Amersham, 영국)을 각 웰에 가한다. 4시간 동안 계속 배양한후, 세포수집기(Flow, 미국)을 사용하여 유리여과기에 세포를 회수하고 액체 섬광 계수기를 사용하여 삼중 수소화 티미딘 흡수를 측정한다. 상기의 분석을 수행하는데 있어, 표준 IL-2시료를 상기 시료에 수행한 과정을 수행하여, 삼중 수소화 티미닌 흡수를 측정한다.

활성단위(U)의 계산을 프로비트방법[Journal of Immunology,

, 2027(1978)]에 의해 수행한다. 표준 IL-2시료 희석물중의 최대흡수를 100%로 간주하고, 각 희석단계의 흡수%를 계산한다. 얻어진 수치를 보통 확률지에 플로트하고, 50% 흡수된 희석률을 그래프로 결정한다. 또한 각 IL-2-함유시료에 대해, 50%흡수된 희석률을 같은 방법으로 결정한다. 40㎍/㎖의 콘카나발린 A 및 150㎎/㎖의 12-0-테트라데카노일 포르볼-13-아세테이트로 보충된 10% FCS-첨가 RPMI1640 배지에 인체 말초 혈액 림파구(5×10⁶세포/㎖)를 5% CO₂존재하에 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 배양상층액에 함유된 IL-2 활성량을 1U/㎖로 정의한다.

시료의 IL-2 농도(U/㎖)는 하기식에 의해 계산한다.

인체 말초 혈액으로부 수득된 천연 IL-2는 상기 분석방법에 의해 측정하면 20,000∼70,000U/㎎의 비활성을 갖는다. 이 활성은 본 발명에 따른 비글리코실화 액체 IL-2 단백질의 활성과 거의 같다.

본 발명에 따른 비글리코실화 인체 IL-2 단백질은 제3도에 나타낸 아미노산 서열을 같은 폴리펩티드(Ⅱ)를 함유한다. 여기서 X는 Met 또는 수소이다.

본 발명에 따라 제조된 인체 IL-2 단백질은 하기의 특성을 갖는다.

1) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에서 균일하며, 상기 전기영동에서 측정할 때 15,000±1,000달톤의 분자량을 갖는다.

2) 아미노-말단 아미노산으로서 알라닌 또는 메티오닌을 갖는다.

3) 카르복시-말단 아미노산으로 트레오닌을 갖는다.

4) 그의 기능을 유지하면서 T세포 또는 천연킬러세포를 성장시키는 활성을 갖는다.

본 발명에 따라 제조된 인체 IL-2 단백질은 리뮬루스 라이세이트 시험(limulus lysate test)[Haemostasis,

, 183(1978)]에 음성반응을 나타내며, 불순물 단백질 및 피로겐함량이 매우 낮기 때문에, 주사액 등을 제조하는데 부피물질로 안전하게 사용될수 있다.

본 발명에 따라 수득된 비글리코실화 인체 IL-2단백질은 그의 기능을 유지하면서 정상 T세포 또는 천연킬러세포의 성장을 촉진하는 활성을 갖는다. 그러므로, 본 발명에 따른 IL-2 단백질은 T세포 또는 천연 킬러세포를 시험관에서 장기간 성장 및 계대배양하거나 클로닝하는데 사용될수 있다. 또한, 이 특성은 인체 IL-2활성의 측정에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 인체 IL-2 단백질은 종양 황원을 인지 및 파괴하는 항원 특이성킬러 T세포 또는 실험실에서 항원 감작의 경험존재 또는 부재하에서 종양세포를 죽일수 있는 천연킬러세포를 선택적으로 성장시킬수 있다. 상기 킬러세포를 생체에 도입함과 동시에 생체를 접종할 때, 본 발명의 인체 IL-2는 킬러 T 세포의 항종양 효과를 증가시킨다. 그러므로, 온혈동물(예, 생쥐, 쥐, 토끼, 개 고양이, 돼지, 말, 양, 소 인간)의 종양의 예방 또는 치료 또는 면역결핍증의 치료에 사용될수 있다.

본 발명에 따른 인체 IL-2 단백질은 고순도의 생성물이며, 인체에서 거의 항원성을 갖지 않으며 독성이 적다.

종양의 예방 및 치료제로서, 본 발명의 인체 IL-2 단백질은 예를들면 공지의 담체와 함께 적당히 혼합 또는 희석함으로써 제조된 주사약 또는 캡슐의 형태로 비경구 또는 경구 투여될수 있다.

본 발명의 인체 IL-2단백질은 천연 인체 IL-2와 실제로 같은 생물적 활성을 갖기 때문에, 천연 IL-2와 같은 방법으로 사용될수 있다. 대응 세포의 IL-2 수용기에 대한 그 해리상수는 매우 작아서, 대부분의 경우, 매우 작은 양으로도 충분하다.

시험관에서 T세포를 성장시키기 위해, 본 발명의 인체 IL-2를 약 0.01∼1U/㎖, 바람직하게는 약 0.1∼0.5U/㎖의 농도로 배지에 가할수 있다.

시험관에서 T세포를 성장시키기위해 이용되는 예를 들면 인체 말초 혈액 유도 T세포(1×10⁶세포/㎖)의 림파구 배양액을 X선 조사(1500rads)에 의한 B세포 형질 전환체(1×10⁶세포/㎖)와 3일간 혼합하여 수득된 동종 항원감각 T세포를 함유한 세포 현탁액에 본 발명의 IL-2 단백질은 0.1∼0.5단위/㎖농도로 가하고, 20% 태내송아지 혈청을 함유한 RPMI1640 배지에서 배양한다. 약 1주일 간격으로 배지를 바꾸어주면서 약 1달 동안 배양을 계속한다.

하기의 실시예에 기재된 형질전환체, 즉 에스케리키아 콜리 DH1/pTF4는 일본국재단법인 발효연구소(IFO)에 IFO14299로 기탁되어 있으며, 또한 일본국 통신산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소(FRI)에 FERM BP-628로 부다페스트 협약하 기탁되어 있다. 또한 한국과학기술원(KAIST)에 KAIST 841101-13115로 기탁되어 있다.

본 명세서 및 도면에 있어서, 약어로 기재도니 염기 및 아미노산은 생화학 명명법의 IUPAC-IUB의 규칙 또는 이 분야의 관행에 따라 약칭한다. 그예는 표 1에 나타낸다. 광학 이성질체가 있는 경우 아미노산은 특별히 지시하지 않는한 L-형이다.

[표 1]

[참고예 1]

(ⅰ) 인체 IL-롤 코우딩한 mRNA의 분리

인체 말초혈액으로부터 제조된 림파구를 10% 태내송아지 혈청, 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA)(15ng/nl) 및 콘카나발린 A(40㎍/㎖)를 함유한 RPMI 1640배지에서 37℃에서 배양하며 IL-2를 유도한다. 배양 24시간 후, 얻어진 1×10¹⁰인체 림파구를 5M 구아니딘 티오시아네이트, 5% 메르캅토 에탄올, 50mM 트리스, HCl(pH 7.6) 및 10mM EDTA를 함유한 용액에 테프론 균질화기를 사용하여 분쇄 및 변성시키고, 소듐 N-라우로일사르코시네이트를 4% 농도로 가한 다음, 혼합물을 6㎖의 5.7M 염화 세슘 용액(5.7M 염화세슘, 1M EDTA)에 충분리시키고, 베크만 SW28로우터를 사용하여 24,000rpm 및 15℃에서 48시간 동안 원심분리하여 RNA 침전물을 수득한다. 이 RNA 침전물을 0.25% 소듐 N-라우로일사르코시네이트에 용해시키고, 에탄올로 침전시켜 10㎎의 RNA를 수득한다. 이 RNA를 고농도염 용액(0.5M NaCl, 10mM 트리스·HCl pH 7.6 1mM EDTA, 0.3% SDS)을 사용하여 올리고(dT)셀룰로오즈 컬럼에 흡착시킨다. 저 농도 염용액(10mM 트리스·HCl pH 7.6 1mM EDTA, 0.3% SDS)으로 용출시켜 폴리(A)-함유 mRNA 300㎍을 수득한다. 이 mRNA를 에탄올로 더 침전시키고, 0.2㎖의 용액(10mM 트리스·HCl pH 7.6, 2mM EDTA, 0.3% SDS)에 용해시킨후, 65℃에서 2분간 처리하고, 10∼35% 슈크로오즈 밀도 경사 원심분리(베크만 SW 28로우터를 사용하여 20℃ 및 25,000rpm에서 21시간 동안)하여 22분획으로 분획화 한다. 각 분획을 크세노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 난모세포에 주사하고, 합성된 단백질의 IL-2활성을 측정한다. 분획 제11∼15번(침강 계수 8S-15S)는 IL-2활성을 갖는다. 이들 분획은 약 25㎍의 IL-2mRNA를 함유한다.

(ⅱ) 단일가닥 DNA의 합성

상기에 수득된 mRNA 및 역전사 효소를 사용하여, 100μl 의 반응용액(5㎍의 mRNA, 50㎍의 올리고(dT), 100단위의 역전사 효소, 1mM dATP, 1mM dCTP, 1mM dTTP, 8mM MgCl₂, 50mM KCl, 10mM 디티오트레이톨, 50mM 트리스, HCl PH 8.3)에서 42℃로 1시간 동안 배양을 수행한후, 페놀로 탈단백질화하고, 0.1N NaOH로 70℃에서 20분간 처리하여 RNA를 분해제거한다.

(ⅲ) 이중 가닥 DNA의 합성

합성된 단일 가닥 상보 DNA를 50μl의 반응 용액(mRNA 및 올리고(dT)가 없는 것을 제외하고는 상술한 반응 용액과 동일)중에서 42℃로 2시간 동안 처리함으로써 이중 가닥 DNA를 합성한다.

(ⅳ) dC꼬리부의 첨가

상기 이중가닥 DNA를 50μl의 반응용액(이중가닥 DNA, 0.1M 소듐 아세테이트 pH 4.5, 0.25M NaCl, 1.5mM ZnSO₄, 60단위의 S1뉴클레아제)중에서 실온으로 30분간 뉴클레아제 S1으로 처리한후, 페놀로 탈단백화하고, 에탄올로 DNA를 침전시킨다. 이 DNA를 50μl의 반응 용액(이중 가닥 DNA, 0.14M 포타슘카코딜레이트, 0.3M 트리스(염기)pH 7.6, 2mM 디티오트레이톨, 1mM CoCl₂, 0.15mM dCTP, 30단위의 말단전이 효소)중에서 37℃로 3분간 말단 전이 효소를 처리함으로써 이중 가닥 DNA의 양 3'말단에 약 15디옥시시티딘을 확장시킨다. 이런 반응에 의해 약 300ng의 디옥시시티딘 사슬-함유 이중가닥 DNA가 수득된다.

(ⅴ) 에스케리카이 콜리 플라스미드의 절단 및 dG 꼬리부의 첨가

한편, 10㎍의 에스케리키아 콜리 플라스미드 pBR322 DNA를 50μl의 반응용액(10㎍의 DNA, 50mM NaCl, 6mM 트리스, HCl pN 7.4, 6mM MgCl₂, 6mM 2-메르캅토에탄올, 100㎍/㎖소혈청 알부민, 20단위의 Pst Ⅰ)중에서 37℃로 3분간 제한효소 Pst Ⅰ으로 처리하여 pBR 322 DNA의 Pst Ⅰ인지 부위를 절단하고, 페놀로 탈단백질화 한다. 절단된 플라스미드 pBR 322DNA를 50μl 의 반응용액(10㎍의 DNA, 0.14 M 포타슘 카코딜레이트, 0.3M 트리스 염기 pH 7.6, 2mM 디티오트레이톨, 1mM CoCl2, 0.15mM GTP, 30단위의 말단 전이효소)중에서 37℃로 3분간 말단 전이효소를 처리함으로써 양 3'말단에 약 17디옥시구아닌을 확장시킨다.

(ⅵ) cDNA의 어닐링 및 에스케리키아 콜리의 형질전환 상기에서 수득된 합성 이중가닥 DNA(0.1㎍) 및 0.5㎍의 상술한 플라스미드 pBR322를 0.1M NaCl, 50mM 트리스, HCl pH 7.6 및 1mM EDTA를 함유한 용액중에서 65℃에서 2분간 및 45℃에서 2시간 동안 가열하고 점차 냉각시켜 어닐링한 다음, 그 생성물을 에니아등의 방법[J.Mol. Biol.,

, 495(1975)]에 따라 에스케리 카아 콜리 MM294의 형질전환에 사용한다.

(ⅶ)cDNA-함유 플라스미드의 분리

이 방법으로, 약 20,000 테트라 시클린-저항 형질 전환체를 분리한다. 이들 각 DNA를 니트로 셀룰로오즈 여과기에 고정시킨다. 다니구찌 등이 보고한[Nature,

, 305(1983)] IL-2의 아미노산 서열을 기준으로, 각각 아미노산 번호 74∼78(Lys-His-Leu-Gln-Cys)및 아미노산 번호 122∼126(Thr-Phe-Met-Cys-Glu)에 해당하는 염기 서열(5'AAA CAT CTT CAG TGT3' 및 5' ACA TTC ATG TGT GAA3') 의 상보 올리고 뉴클레오티드를 포스포트리에스테르 방법[Crea, R. et al., NaTl.Acad.Sci.USA,

, 5766(1978)]에 의해 화학적 합성한다.

이들 올리고 뉴클레오티드를 50μl의 반응용액(0,20㎍의 올리고 뉴클레오티드, 50mM 트리스 HCl pH 8.0 10mM MgCl2, 10mM 2-메르캅토 에탄올, 50μCi의 γ-³²P ATP, 3단위의 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제)중에서 37℃에서 1시간 동안 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제로 처리함으로써 5'말단에³²P로 표지시킨다. 이들 표지된 올리고 뉴클레오티드를 탐침으로 사용하여 로운 등의 방법[Nucleic Acids Res., 9, 6103(1981)]에 의해 니트롤셀롤로오즈 여과기에 고정된 상술한 DNA로 어닐링시킨다. 상기 두 올리고 뉴클레오티드 탐침에 반응성인 4형질변환체를 방사선 사진에 의해 검출해낸다. 이들 각 형질 변환체의 세포로부터 비른보임-돌리 알칼리 방법[Birn-boim, H.C. ＆ Doly, J., Nucleic Acids Res.,

, 1513(1979)]에 의해 플라스미드 DNA를 분리한다. 제한효소

Ⅰ을 사용하여 플라스미드 DNA의 삽입물을 절단해낸다. 가장 긴 삽입 단편을 포함한 것을 절단해낸다. 가장 긴 삽입 단편을 포함한 것을 선택하여 pILOT 135-8이라 명명한다. 이 플라스미드의 제한 효소 지도는 제1도에 나타낸다.

이 pILOT 135-8에 삽입된 cDNA의 1차 구조(염기서열)은 디디옥시 뉴클레오티드 방법 및 막삼-길버트방법에 의해 결정한다. 결정된 1차 구조는 제2도에 나타낸다. 이 염기 서열에 의해 정의된 팹티드는 합성 출발 시그날(No. 64-66ATG)로 출발하여 153 아미노산으로 구성된다. 이들 중에서, N-말단으로부터 20아미노산은 시그날 펩티드를 구성한다. 상기 1차 구조는 이들 플라스미드가 인체 IL-2단백질을 코우딩한 전체 염기 서열을 갖는다는 것을 나타낸다. 이런 사실로부터 상기 플라스미드에 삽입된 유전자를 적당한 형질 발현 플라스미드에 삽입하면 IL-2단백질의 임의 폴리 펩티드 부분을 생산할수 있다는 것이 확인된다.

[참고예 2]

참고예 1에서 수득된 플라스미드 pILOT 135-8을 제한 효소

Al으로 전달한다. 수득된 IL-2유전자를 함유한 1294 bp DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하고, 알라닌의 코오돈 GCA와 메티오닌의 코오돈 ATG를 함유한

Ⅰ링커 CGATA ATG GCA와 연결한후, 생성물을

Ⅰ 및

Ⅰ으로 처리하고,

Ⅰ-

Ⅰ부위의 ptrp 771에 삽입한다. 수득된 형질발현 플라스미드를 pTF4라 명명한다(제4도).

[참고예 3]

에스케리키아 콜리 DH1을 코헨등의 방법[Proc. Natl. Acad.Sci.USA,

, 2110(1972)]에 따라 참고예 2에서 수득된 플라스미드 pTF4으로 형질 전환시켜, 상기 플라스미드를 운반하는 형질 전환체(에스케리키아 콜리 DH1/pTF4)를 수득한다.

[실시예 1]

(ⅰ) 1%박토트립톤(Difco 실험실, USA), 0.5% 박토이스트 추출물(Difco 실험실, USA), 0.5% 염화나트륨 및 7㎍/㎖ 테트라시클린을 함유한 액체 배지(pH 7.0) 50㎖를 250㎖ 엘렌메이어 플라스크에 넣고 이 콜리 DH1/pTF4(참고예 3에서 제조)로 접종시킨다. 37℃에서 밤새 회전자에 배양한 후, 배양 배지를 0.5% 카스아미노산, 0.5% 글루코오즈 및 7㎍/㎖ 테트라시클린을 함유한 M9 배지 2.5l가 들어있는 5l들이 병 발효기에 옮긴다. 통기 및 교반하면서 4시간 동안 배양하고, 3-β-인돌릴 아크릴산(25㎍/㎖)을 가한 후, 4시간 동안 더 배양한다. 얻어진 2.5l 배양 브로스를 원심분리하여 세포를 수거하고, -80℃에서 동결시켜 저장한다.

(ⅱ) 실시예1 (ⅰ)에서 수득된 동결 저장세포(12.1g)를 7M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.1M 트리스. HCl을 함유한 추출용매(pH 7.0) 100㎖에 현탁시키고, 현탁액을 4℃에서 1시간 교반한후, 가수분해물을 28,000xg에서 20분간 원심 분리하여 상층액 93㎖를 수득한다.

(ⅲ) 별도로, 실시예 1(ⅰ)의 방법에 의해 수득된 형질 전환체 이 콜리 DH1/pTF4 세포로부터 각종 공정을 거쳐 추출물 IL-2를 수득하고 각각 추출 효율을 비교한다.

리소짐-EDTA방법에서는, 실시예 1(ⅰ)에서 수득된 이 콜리 DH1/pTF4 세포 2g을 0.1M 트리스-HCl, 10mM DETA 및 250㎎/l 리소짐을 함유한 용액 16㎖와 혼합하고, 혼합물을 4℃에서 1시간 및 37℃에서 5분간 교반한후, 가수분해물을 28.000xg에서 20분간 원심분리한다.

음파 파쇄방법에서는, 상술한 세포 2g을 0.1M 트리스-HCl을 함유한 용액(pH 7.0) 16㎖에 현탁시키고, 현탁액을 0℃에서 5분간 음파 파쇄한후, 가수분해물을 28,000xg에서 20분간 원심분리한다.

구아니딘-HCl방법에서는, 상술한 세포 2g을 0.1 트리스-HCl 및 2M, 4M 또는 7M 구아니딘-HCl을 함유한 용액(pH 7.0) 16㎖와 혼합하고, 혼합물을 4℃에서 1시간 교반한후, 가수분해물을 28,000xg에서 20분간 원심분리한다. 수득된 상충용액을 단백질 농도 및 IL-2 활성의 측정에 사용한다. 결과는 표 2에 요약한다.

[표 2]

IL-2의 추출

Gu. HCl : 구아니딘 히드로클로라이드.

(ⅳ) 실시예 1(ⅱ)에서 수득된 상층 용액을 0.01 M 트리스. HCl 완충액(pH 8.5)에 투석하고, 19,000xg에서 10분간 원심분리하여 94㎖의 투석 상층액을 수득한다.

이용액을 0.01 M트리스. HCl완충액(pH 8.5)로 평형된 DE52(DEAE-셀룰로오즈, 와트만, 영국) 컬럼(50㎖부피)에 넣어 단백질을 흡착시킨다. 선형 NaCl 농도 경사(0∼0.15M NaCl, 1l)로 단백질을 용출시킨다.

YM-5막(아미콘, USA)을 사용하여 활성 분획(53㎖)을 4.8㎖로 농축하고, 0.1M 트리스. HCl(pH 8.0)-1M NaCl 완충액으로 평형된 세파크릴 S-200(파마시아, 스웨덴) 컬럼(500㎖ 부피)을 사용하여 겔 여과한다.

수득된 활성 분획(28㎖)를 YM-5막을 사용하여 2.5㎖로 농축한다. 농축물을 울트라포어 RPSC(알텍스, USA)컬럼에 넣고 흡착시키고, 이동상으로 트리플루오로 아세트산-아세토니트릴계를 사용하여 고수율 액체 크로마토그래피한다.

조건 : 컬럼, 울트라포어 RPSC(4.6×75㎜); 컬럼 온도, 30℃; 용매 A, 0.1% 트리플루오로 아세트산 -99.9% 물; 용매 B, 0.1% 트리플루오로아세트산- 99,9% 아세토니트릴; 용출 프로그램, 0분(68% A+32% B)-25분 (55% A+45% B)-35분(45% A+55% B)-45분(30% A+70% B)-48분(100% B); 용출속도, 0.8㎖분; 검사파장, 230nm, 약 39분의 체류시간에서 활성분획을 수거한다. 0.53㎎의 비글리코실화 인체 IL-2 단백질을 함유한 용액 100㎖를 수득한다[비활성, 30,000U/㎎; 출발 물질로부터 활성회수, 30.6%; 단백질의 순도 99%(SDS-폴리아크릴아미드 겔 일렉트로포레포그램에 밀도계로 측정)].

상기 용액을 동결 건고시켜 백색 분말을 수득한다. 분말은 26,000U/㎎의 활성을 갖는다.

(ⅴ) 실시예 1(ⅵ)에서 수득된 인체 IL-2 단백질에 대해 하기의 특성을 시험한다:

(1) 균질성 :

코마시 브릴리언트 블루 염색하고, 라엠리 등의 방법[Nature,

, 680(1970)]에 따라 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하면 상기 인체 IL-2단백질의 단일 밴드만이 나타난다(제5도 참고). 환원조건하 및 비환원 조건하 밴드의 위치는 변하지 않고 남아 있다.

(2)분자량 :

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동의 결과, 상기 인체 IL-2단백질의 분자량은 약 15,000달톤이다(제5도 참고)

(3)아미노산 조성:

상기 인체 IL-2단백질 20㎍부분을 가수분해용 유리 시험관에 넣고, 4% 티오글리콜산을 함유한 일정하게 비등시킨 염산을 가한후, 시험관을 진공밀봉하고, 110℃에서 24,48 또는 72시간동안 가수분해한다. 가수분해후, 시험관을 열어 염산을 감압하게 제거하고, 잔류물을 0.02N 염산에 용해시킨후, 히다찌 모델 835 아미노산 분석기를 사용하여 아미노산 분석한다. 시스틴과 시스테인의 결정을 위해, 상기 인체 IL-2단백질을 히어스의 방법[Methods in Enzymol.,

, 197(1967)]에 의해 과포름산으로 산화하고, 일정하게 비등된 염산 중에서 24시간 동안 감압하 가수분해시킨다. 아미노산 분석기를 사용하여 가수분해물의 시스테인산 검출을 수행한다. 상기의 아미노산분석에 의해 수득된 결과는 표 3에 나타낸다. 분석치에서, 세린과 트레오닌은 0시간에서 가수분해한 것을 외삽법에 의해 결정한 것이며, 나머지는 24,48 및 72시간 가수분해한 후 수득된 각 값을 평균한 것이다.

[표 3]

(4) N-말단 아미노산 서열 ; 상기 인체 IL-2단백질 34㎍을 기체상 단백질 서열 분석기(Model 470A, Applied Biosystems, USA)를 사용한 자동 에드만 분해 방법에 의해 N-말단 아미노산 서열을 분석한다. 마이크로팍-SP컬럼(바리안, USA)을 사용한 고수율 액체 크로마토그래피에 의해 페닐히단토인-아미노산(PTH-아미노산)이 확인된다. 각 단계에서 검출된 PTH-아미노산을 표 4에 나타낸다.

[표 4]

* 아직 확인되지 않음.

(5) C-말단 아미노산 : 상기 인체 IL-2 단백질 33㎍을 히드라진 분해용 유리시험관에 넣고, 0.05㎖의 무수 히드라진을 가한후, 시험관을 진공 밀봉하고, 100℃에서 6시간 동안 가열한다. 수득된 히드라진 분해 생성물을 동결 건조시키고, 증류수에 용해시킨다. 벤즈 알데히드를 용액에 가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한후, 원심분리한다. 수득된 수층을 동결건조시키고, 히다찌 모델 835 아미노산 분석기를 사용하여 아미노산 분석한다. 트레오닌 만이 검출된다.

(6) 트립신 분해 펩티드 지도 : 상기 IL-2 시료 15㎍을 120μl의 0,02M 탄산수소 나트륨 중에서 37℃에서 18시간 동안 0.4㎍의 트립신(와싱톤, USA)로 분해시킨다. 5μl의 2-메르캅토 에탄올을 가하고, 37℃에서 2시간 동안 반응을 더 계속한다. 75μl의 1% 트리플루오로 아세트산을 가하여 반응을 종결한다. 반응 혼합물을 하기의 조건하에 고수율 액체크로마토그래피하여 제6도에 나타낸 지도를 얻는다.

컬럼 : 울트라스페어-옥틸(5㎛, 4.6×250㎜ : 알렉스, USA)

컬럼온도 : 30℃

이동상 : 용매A, 0.02% 트리플루오로아세트산-99.98%몰

용매B, 0.02% 트리플루오로아세트산-99.98% 아세토니트릴

0분(95% 용매A+5% 용매B)-40분(30% 용매A+70% 용매B)

유속 : 1.0㎖/분

검출 : 플루오레스카민(Roche, USA)을 사용한 형광방법[Analytical Biochem., 67, 438(1975)]

(7) IL-2-의존 세포주에 대한 활성: 본 발명에 따른 비글리코실화 인체 IL-2 단백질을 문헌에 기재된 방법[Biochem. Biophys.Res.Commun., 109.363(1982)]에 따라 분석하면, 상기 IL-2 단백질은 IL-2-의존 생쥐 세포주(NKC3 : 제7도 참고( 및 IL-2-의존 인체 세포수(제8도 참고)에서 삼중 수소화 티미딘 흡수를 촉진하는 활성을 갖는 것이 확인된다.

그리고, 상기 IL-2 단백질을 0.5U/㎖농도가 되도록 20% FCS-첨가 RPMI-1640 배지에 용해시키고, 2×10⁵세포/㎖의 NKC3 세포주를 배지에 현탁시킨다. 생존 세포의 수를 세면서 2-또는 3-일간격으로 새로운 배지에 배양액을 재현탁시키면서 5% CO₂존재하에 37℃에서 린브로 멀티 디시(Flow, USA)에 계대 배양을 계속한다. 결과로서, 상기 IL-2 단백질은 제9도에 나타난 바와같이 장기간 동안 NKC3 세포주의 성장을 유지하는 활성을 갖는다는 것이 발견된다.

[실시예 2(주사용 제제)]

실시예 1(ⅳ)에서 수득된 비글리코실화 인체 IL-2 단백질-함유 용액을 뮤균 조건하 0.025M 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5.0)으로 평형된 CM 도요펄(도오요소다, 일본)컬럼에 흡착시키고, 0.15M NaCl을 함유한 상기 완충액으로 용출시킨다. 용출액에 적당량의 0.15M NaCl을 가하여 희석하고, HSA를 0.5% 농도로 가한후, 혼합물을 막 여과기(공극 직경 0.22㎛)에 여과시킨다. 여과물을 1㎖씩 바이알에 무균분배하고, 동결건조시킨다. 사용하기전에, 각 바이알의 주사용 인체 IL-2제제를 1㎖ 증류수에 용해시킨다.

Claims

인체 인토로이킨-2를 코우딩한 염기서열을 갖는 DNA를 운반하는 형질 전환체를 성장시켜 배양 브로스에 인체 인터로이킨-2를 생성 및 축적시키고, 수득된 인체 인터로이킨-2-함유액체를 소수성 컬럼크로마토그래피에 의해 정제함을 특징으로 하는, 10⁴U/㎎이상의 비활성을 갖는 실제로 순수한 비글리코실화 인체 인터로이킨-2단백질의 제조방법.
제1항에 있어서, 단백질이 하기 일반식의 아미노산 서열을 갖는 방법.

X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Ans Gly Ile Asn Ans Tyr Lys Asn Pro Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ser Thr Leu Thr(식중 X는 Met 또는 수소이다.)
제1항에 있어서, 단백질이 동결건조된 형태인 방법.
제1항에 있어서, 소수성컬럼 크로마토그래피가 역상컬럼을 사용한 고수율액체 크로마토그래피인 방법.
제4항에 있어서, 크로마토그래피 pH 1.5∼8의 용리액을 사용함으로써 수행되는 방법.
제4항에 있어서, 크로마토그래피가 0.1∼100㎖/분의 유속으로 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 인체 인터로이킨-2를 성장된 형질 변형체 세포에 생성 및 축적시키고, 이인체 인터로이킨-2를 세포로부터 추출하여 인체 인터로이킨-2-함유액체를 수득하는 방법.
제7항에 있어서, 인체 인터로이킨-2를 단백질 변성제용액으로 추출하는 방법.
제8항에 있어서, 인체 인터로이킨-2를 2∼8M 농도의 구아니딘염 용액으로 추출하는 방법.
10⁴U/㎎이상의 비활성을 갖는 실제로 순수한 비클리코실화 인체 인터로이킨-2 단백질을 약학적으로 수용할수 있는 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합함을 특징으로 하는, 상기 단백질을 함유한 약학적 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서, 조성물이 주사용 제제인 방법.