KR940011533B1 - 인터로이킨의 증수법 - Google Patents

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Description

단백질의 증수법(增收法)

제1도는 인체 IL-2의 아미노산 서열을 나타낸다.

제2도는 인체 IL-2를 코오딩하는 DNA염기 서열의 예를 나타낸다.

제3도는 인체 IFN-αA의 아미노산 서열을 나타낸다.

제4도는 인체 IFN-γ의 아미노산 서열을 나타낸다.

제5도 및 제6도는 각각 참고예에 설명된 플라스미드 pTF1 및 pTB 285의 제조단계를 나타낸다.

본 발명은 단백질의 증수법에 관한 것이다.

시토킨 및 펩티드 호르몬 등의 생리적으로 활성인 각종 단백질의 존재가 확인된 바 있으며, 최근에는 유전공학 기술에 의해 이러한 생리 활성 단백질의 대량 생산과 임상 응용이 가능해지고 있다.

인터로이킨-2 [이후에는 IL-2로 표기한다 ; 일명 T세포 성장인자(TCGF)로도 불리운다]는 렉틴 또는 동종 항원에 의해 자극된 T세포에 의해 생상되는 림포킨이다[Science, 193, 1007(1976)].

IL-2를 이용함으로써 수많은 킬러 T세포 또는 헬퍼 T세포 및 천연 킬러 세포의 클론까지도 수득하여 왔다[참고 Nature, 268, 154(1977)]. T세포 또는 천연 킬러 세포를 클로닝하는데 직접 이용하는 것 이외에도, IL-2를 이용함으로써 특수한 항원, 예를들어 종양 항원을 인지 및 파괴할 수 있는 항원-특이성 킬러 T세포를 시험관 내에서 선택적으로 증식시킬 수도 있다. 이러한 방법으로 성장시킨 종양-특이성 킬러 T세포를 동물에 도입시킴으로써 종양의 성장을 조절 또는 억제할 수 있다[The Jorunal of Immunology, 125, 1904(1980)].

이러한 실험적인 발견은 IL-2를 항종양제로 사용할 수 있음을 시사하는 것이다. 나아가 IL-2가 흉선기능이 결핍된 나체 생쥐의 헬퍼 T세포 기능을 회복시키며 [European Journal of Immunology, 10, 719(1980)] 동종 유전자 세포에 대한 킬러 T세포의 유도를 회복시킨다는 것이 알려져 있으므로 [Nature, 284, 278(1980)] IL-2가 면역기능이 떨어진 질병의 치료에 유용할 것으로 기대되고 있다.

인터페론-α(이후에는 IFN-α로 표기한다) 및 인터페론-γ(이후에는 IFN-γ로 표기한다)는 비루스-또는 헥산-활성화된 림파구에 의해 생성된 림포킨으로서, 세포에 작용하여 항비루스 상태로 만드는 생물학적 활성을 나타냄으로써 생체 저항계 또는 종양면역계에서 중요한 역할을 한다.

시토킨같은 이런 단백질은 천연 물질로 부터 얻을 수 있긴 하지만 매우 한정된 양이다. 그러나, 최근의 진보된 재조합 DNA기술에 의하여, 상기 단백질의 유전자가 삽입된 형질발현 벡터를 함유하는 에스케리키아 콜리의 배양물로부터 생활성 단백질을 회수하는 것이 가능해졌다[IL-2 : Nature, 302, 305(1983) 및 Nucleic Acids Research, 11, 4307(1983) ; IFN-α : Journal of Interferon Research, 1, 381(1981) ; IFN-γ : Nature, 295, 503(1982)].

진핵 생물이든 원핵 생물이든 관계 없이, 단백질 합성은 메티오닌에 대응하는 mRNA 코오돈 AUG에서 시작되기 때문에, 생성된 단백질은 N-말단에 메티오닌 잔기를 갖는 분자종, 이런 잔기를 갖지 않는 분자종 또는 이 둘의 혼합물일 수 있다. 사실, 예를들어 에스케리키아 콜리의 경우, 많은 세포 단백질의 말단이 메티오닌이며, [Conn & Stumpf : Outlines of Biochemistry, 4th ed., John Wiley & Sons(1976)] 에스케리키아 콜리의 개시인자 IF-3이 N-말단에 메티오닌 잔기를 갖는 분자종과 이런 잔기를 갖지 않는 분자종을 모두 포함한다는 것은 공지의 사실이다[Hoppe-Seyler's Zeitschrift

Physiologische Chemie, 354, 1415(1973)]. 재조합 DNA 기술을 이용하여 에스케리키아 콜리로부터 생산한 단백질에 있어서, IFN-α의 경우 N-말단에 메티오닌 잔기가 결합된 비율이 약 50%이고 [Journal of Interferon Research, 1, 381(1981)] 인체 성장 호르몬의 경우에는 100%에 이른다는 것이 알려져 있다[Nature, 293, 408(1981)].

그러나, 상기한 단백질에서의 메티오닌 잔기 결합 비율을 조절하는 것에 대한 보고는 아직 없었다.

IL-2 유전자가 도입된 에스케리키아 콜리를 이용하여 IL-2 단백질을 생산하는 방법을 연구하던 중에, 본 발명자들은 에스케리키아 콜리에서 생산된 IL-2 단백질이 두 종류의 단백질, 즉 N-말단 메티오닌 잔기가 없는 IL-2, 다시말하면 N-말단 아미노산으로서 알라닌 잔기로부터 시작된 분자종[Ala-IL-2]과 N-말단에 메티오닌이 결합되고 메티오닐-알라닌 잔기로부터 시작된 분자종 [Met-Ala-IL-2]으로 구성되어 있으며, 후자의 함량이 전자의 함량보다 훨씬 많은 것을 발견하였다.

비슷하게, 에스케리키아 콜리에서 생산된 IFN-α 및 IFN-γ도 각각 시스테인 잔기-N 말단의 분자종 [Cys-IFN-α 및 Cys-IFN-γ]과 메티오닐-시스테인 잔기로부터 시작된 메티오닌 잔기-N 말단의 분자종[Met-Cys-IFN-α 및 Met-Cys-IFN-γ]의 혼합물이며, 후자의 함량이 5~50%이다.

N말단에 메티오닌을 갖는 단백질은 생활성 측면에서 볼때 대응하는 천연 단백질과 비슷한 것으로 생각되지만 어느 정도는 다르다. 따라서, 공지의 방법은 천연 단백질 종류의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 생산하는 데에 충분히 만족스럽지 못하다.

본 발명은 N-말단에 해독 출발 코오돈 ATG에 대응하는 메티오닌을 함유하지 않는 단백질의 수율을 증가시키기 위하여 (1) 철이온원, 망간 이온원 또는 그 혼합물 및 (2) 천연의 질소원을 함유하는 배지에서 에스케리키아 콜리를 배양함을 특징으로 하는, 해독 출발 코오돈의 하류에 단백질의 구조 유전자를 갖고 있는 형질발현 벡터를 포함하는 에스케리키아 콜리를 배양하여 단백질을 생산하는 개선된 방법을 제공한다.

상술한 단백질로는, 각종 생리 활성 단백질, 예를들어 인터페론(예, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 인터로이킨(예, 인터로이킨-1, IL-2), B세포 성장 인자(BGF), B세포 분화 인자(BDF), 대식 세포 활성 인자(MAF), 림포톡신(LT) 및 종양 괴사인자(TNF) 등의 시토킨 ; 형질전환 성장인자(TGF-α) ; 에리트로포이에틴, 상피 세포 성장 인자, 인슐린 및 인체 성장 호르몬의 펩티드 단백질 호르몬 ; B형 간염 비루스 항원, 인플루엔자 비루스 항원, 구제역(口蹄疫 : foot and mouth disease) 비루스 항원 및 말라리아 기생항원 등의 병원성 미생물의 항원 단백질 ; 펩티다제(예 : 조직 플라스미노겐 활성인자, 유로키나제 및 세라티오펩티다제) 및 리소자임 등의 효소 ; 및 인체 혈청 알부민(HSA) 등의 혈청 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 방법은 특정 에스케리키아 콜리를 배양하여 생산한 IL-2, IFN-α 및 IFN-γ등에 유리하게 적용시킬 수 있다.

명세서의 "IL-2"는 천연 인체 IL-2와 동일한 생활성 또는 면역 활성, 즉 IL-2 수용체 또는 항-IL-2항체와 결합할 수 있는 능력을 갖는 종이다. 따라서 이러한 종은 제1도[폴리펩티드(I)]에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 N 말단으로 부터 한 아미노산[EPC(공개) 91539] 또는 4아미노산이 소실된 폴립펩티드(I)의 단편 [일본국 특허출원 58-235638호(출원일 : 1983. 12. 13) 및 일본국 특허공개 126088/1985호] 또는 C말단의 몇몇 아미노산이 소실된 폴리펩티드(I)의 단편 같은 폴리펩티드(I)의 생활성 또는 면역 활성을 나타내는데 필요한 아미노산 서열을 갖는 단편일 수 있다. 덧붙여 이러한 종은 폴리펩티드(I)의 구성 아미노산 부분이 소실된 상기 폴리펩티드(I) 또는 원래 폴리펩티드(I)에 포함된 아미노산 이외의 아미노산을 하나 이상 포함하는 상기 폴리펩티드(I), 예를들어 125-시스테인 잔기 대신에 세린 잔기를 포함하는 폴리펩티드(I) 유사체 [일본국 특허 공개 93093/1984] 일 수 있다. 상술한 폴리펩티드는 바람직하게는 비글리코실화된 형태이다.

본 발명에서 "IFN-α"는 IFN-α 수용체-결합 활성 또는 항-IFN-α 항체-결합 활성과 같은, 천연 인체 IFN-α와 동일한 생활성 또는 면역활성을 갖는 종을 의미한다. 한 예를들면 제3도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드[폴리펩티드(II)]이다. 덧붙여 상기 종은 IFN-α의 생활성 또는 면역 활성에 필요한 부분적인 아미노산 서열을 갖는 단편, 예를들어 N-말단 부위에 몇몇 아미노산이 부족하거나 C-말단 부위에 몇몇 아미노산이 부족한 폴리펩티드(II)의 단편일 수 있다. 또한 폴리펩티드(II)의 구성 아미노산 부분이 소실되었거나 원래 폴리펩티드(II)에 존재하는 아미노산과 다른 아미노산을 하나 이상 함유하는 상기 폴리펩티드(II)와 동일한 폴리펩티드일 수 있다. 특히 바람직한 것은 IFN-αA이다.

본 발명의 "IFN-γ"은 천연 인체 IFN-γ와 동일한 생활성 또는 면역 활성, 즉 IFN-γ 수용체-결합능력 또는 항-IFN-γ 항체-결합 능력을 갖는 종을 의미한다. 예로는 146 아미노산으로 구성된 제4도의 폴리펩티드(III) 및 폴리펩티드(III)의 각종 단편이다. 이러한 단편의 특별한 예로는 폴리펩티드(III)의 N말단 부위의 4이상이 아미노산이 소실된 N말단-소실 분자종 및 폴리펩티드(III)이 절단되어 생성된 C말단-소실 분자종 또는 131번째 아미노산 잔기의 뒷부분에 N-말단이 소실된 대응 N-말단-소실 분자종을 들 수 있다. 덧붙여 상술한 IFN-γ은 상기 폴리펩티드의 시스테인 잔기가 세린 또는 트레오닌 잔기로 대치된 유사체일 수 있다. 이중에서, 폴리펩티드(III)이 바람직하다.

단백질-코오딩 구조 유전자는 상기 단백질의 아미노산 서열을 코오딩하는 천연 또는 합성 DNA일 수 있다.

따라서, IL-2 DNA로는 제2도에 나타낸 염기 서열을 갖는 DNA[제1도의 아미노산 서열을 코오딩한 DNA(IV) ; IFN-α DNA로는 제3도의 아미노산 서열(IFN-αA)을 코오딩하는 DNA[DNA(V) : 예, 일본국 특허 공개 79897/1982호] ; IFN-γ DNA로는 제4도의 아미노산 서열을 코오딩하는 DNA[DNA(VI) ; 예, 일본국 특허 공개 189197]를 예시할 수 있다.

상술한 구조 유전자(DNA)는 해독 출발 코오돈 ATG로 부터 하류에 존재한다. 상기 유전자는 ATG의 하류쪽에, 직접 연결되어 있거나 형질발현 불가능한 스페이서나 ATG와 상기 유전자 사이에서 발견되는 다른 구조 유전자를 사이에 두고 떨어져서 존재한다. ATG와 구조 유전자가 직접 연결된 것이 특히 바람직하다.

상술한 유전자(DNA)가 그로부터 상류에 프로모터를 갖는 것이 바람직하다. 프로모터는 λ파지의 성장에 참여하는 λ_PL또는 λ_PR프로모터, 트립토판(trp) 프로모터, 락토스(lac) 프로모터, 단백질 사슬 연장 인자(Tu(tuf B) 프로모터 및 rec A 프로모터 등일 수 있다. 본 발명을 실체화하는데 있어서는 λ_PL및 trp 프로모터를 유리하게 사용할 수 있다.

일반적으로 상기 유전자와 프로모터를 벡터에 삽입하여 형질발현 벡터를 수득한다. 상기 벡터 생산용 플라스미드로는 예를들어 ColEl-유도 pBR 322[Gene, 2, 95(1977)]가 가장 자주 사용되지만, 에스케리키아 콜리에서 복제되어 유지될 수 있는 다른 플라스미드도 또한 사용할 수 있다. 예로는 pBR 313[Gene, 2, 75(1977)], pBR 324 및 pBR 325[Gene, 4, 121(1978)], pBR 327 및 pBR 328[Gene, 9, 297(1980)], pKY 2289 [Gene, 3, 1(1978)], pKY 2700[Seikagaku(Biochemistry), 52, 770(1980)], pACYC 177 및 pACYC 184[Journal of Bacteriology, 134, 1141(1978)], 및 pBK 248, pRK 646 및 pDF 41[Methods in Enzymology, 68, 268(1979)]를 들 수 있다.

박테리오파지-유도 벡터, 예를들어 λgt, λC[Proceeings of the National Academy of Sciences USA, 71, 4579(1974)], λgt, λB[상동, 72, 3416(1975)] 및 λ_Dam[Gene, 1, 255(1977)], 샤론 벡터[Science, 196, 161(1977) : Journal of Virology, 29, 55(1979)] 등의 λ파지-유도 λgt계 벡터 및 필라멘트형 파지-유도 벡터 또한 형질발현 벡터로서 사용할 수 있다.

상술한 형질발현 벡터는 적절한 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다[예, Nature, 302, 305(1983) : Nucleic Acids Research, 11, 4307(1983) ; 일본국 특허 공개 79897/1982호 ; 일본국 특허 공개 189197/1983호].

단백질의 구조 유전자가 삽입된 형질발현 플라스미드를 도입시키게 될 숙주로는 에스케리키아 콜리를 사용하며, 취급과 안전성의 관점에서 볼때 에스케리키아 콜리 K-12-유도된 균주가 특히 바람직하다. 유리하게 사용할 수 있는 상기 에스케리키아 콜리 K-12-유도된 균주의 예는 균주 294, RR-1, DH-1, N4830 및 C-4이다.

균주 294는 공지의 균주이며 [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 73, 4174(1976), 일본국 재단법인 발효 연구소(IFO)에 수탁번호 IFO-14171로 기탁되어 있다.

균주 RR-1, 균주 DH 1 및 균주 N 4830도 문헌에 설명되어 있다[각각 Gene, 2, 75(1977), Nature, 217, 1110(1968) 및 Cell, 25, 713(1981)에 게재되어 있다], 숙주 내에서 온도-민갑성 cI 리프레서를 갖는 것으로는, 형질전환 프로모터로서 λ_PL을 사용하는 경우 균주 N 4830이 특히 유용하며, 이는 파마시아 P-L 생화학(Pharmacia P-L Biochemicals)에서 구입할 수 있다.

균주 C-4는 IFO에 수탁번호 IFO-14421로, 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물공업 기술연구소(FRI)에 수탁번호 BP-966으로, 한국과학 기술원(KAIST)에 수탁번호 KCTC 8181 P로 기탁되어 있다.

본 발명을 실체화하는데 사용되는 에스케리키아 콜리 균주는 문헌[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970), Methods in Enzymology, 68, 253(1979), Gene, 3, 279(1978) 및 Proceedings of the National Academy of Science USA, 69, 2110(1972)]에 기술된 방법에 따라 단백질의 구조 유전자를 포함하는 형질전환 벡터를 이용하여 숙주 에스케리키아 콜리를 형질전환시킴으로써 생산할 수 있다.

본 발명에 따르면, 에스케리키아 콜리 균주를 철이온 원 및/또는 망간이온 원이 보강된 배지에서 배양한다.

배지에 첨가하는 철이온 원 및 망간 이온 원에 있어서 철이온 원은 녹았을때 철 이온을 제공할 수 있는 물질 또는 철이온의 형태로 이용 가능한 물질을 의미한다. 철 염이 그 예이다. 바람직한 것은 2가 또는 3가 철의 무기염(예, 염화 제1철, 염화 제2철, 황산 제1철, 황산 제2철, 인산 제2철, 질산 제2철)이며, 이중에서 3가 철의 무기산염(예, 염화 제2철, 황산 제2철)이 가장 바람직하다.

망간 이온원은 용해시에 망간 이온을 생성할 수 있는 물질 또는 망간이온의 형태로 사용할 수 있는 물질을 뜻한다. 이러한 물질의 예는 망간염, 바람직하게는 망간의 무기염(예, 황산망간, 염화망간, 탄산망간, 인산망간)이고, 가장 바람직하게는 망간의 무기산염(예, 황산망간, 염화망간)이다.

철이온원과 망간 이온원은 단독으로 또는 배합하여 사용할 수 있다. 수용액의 형태로 첨가하는 것이 바람직하다.

철이온원과 망간 이온원은 각각 ℓ당 10^-6~^-3몰, 바람직하게는 2×10^-5~5×10^-4몰씩 첨가한다. 병용할때에는 각각 상기 범위내의 농도를 첨가한다.

상기 에스케리키아 콜리를 배양하는데 사용되는, 천연의 질소원을 보강시킨 배지는 공지의 기초적인 배지를 카사미노산, 펩톤, 효모 추출액 또는 맥아 추출액 등의 천연 물질로부터 수득한 질소원으로 보강시켜 제조한 배지이다. 질소원은 통상적으로 1g/ℓ~50g/ℓ의 농도로 보강된다. 본 발명의 실제화에 적절한 이러한 배지의 몇몇 예를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

본 발명의 방법은 산성 조건하, 특히 형질발현 플라스미드를 함유하며 trp프로모터를 갖는 에스케리키아콜리를 pH 4.8~6.0의 배지에 접종시키고 이 범위를 유지시키면서 배양함으로써 실시할 수 있다. 5.0~5.8의 pH 범위가 보다 바람직하며, 약 5.5의 pH값이 배양에 특히 적절하다.

그러나 충분한 성장이 이루어진 다음에는 배양 조건을 상기한 pH범위밖, 예를들면 보다 상선인 상태로 바꿀 수 있다.

pH는 배지를 제조하고 멸균시키기 전후에 무기염기 또는 무기산을 이용하여 조절한다. 이. 콜리를 배양하는 도중에 pH를 상술한 범위내로 유지시키기 위하여 pH조절이 필요할 수도 있다. 배양중에 보통 pH가 낮아지기 때문에 무기 염기, 예를들어 암모니아, 수산화나트륨, 탄산나트륨을 가하여 pH를 조절한다 : 그러나, 필요하다면 황산같은 무기산을 가할 수도 있다. 이들 중에서 암모니아수가 배지에 필요한 질소원을 포함하고 있기 때문에 특히 바람직하다.

형질발현 플라스미드를 함유하여 trp프로모터를 갖는 형질전환체의 경우, 예를들면 프로모터의 작용을 효과적으로 하기 위하여 시약, 예를들어 3β-인돌릴아크릴산을 가할 수 있다.

숙주가 영양 요구성 변이체인 경우에, 필요한 아미노산(예, L-리신, l-아르기닌, L-메티오닌, L-루이신, L-프롤린, L-이소루이신, L-발린, L-트립토판)을 각각 약 10~1,000mg/ℓ의 농도를 첨가한다. 또한 배양중에 필요한 만큼의 클루코스, 카사미노산 및 다른 성분을 부가적으로 보강할 수 있다. 덧붙여 재조합 에스케리키아 콜리 균주를 선택적으로 성장시키기 위하여, 플라스미드가 보유하고 있는 약물 저항성 유전자에 따라 균주가 내성을 갖는 시약, 예를들어 테트라사이클린을 첨가할 수 있다.

상술한 철이온원 또는 망간이온원은 미리 적절한 농도로 대규모 배양배지에 가한다. 이러한 이온원은 종배양 배지에 가할 수도 있다.

배양은 일반적으로 15~45℃에서 실시한다. 예를들어 λPR 또는 λPL 프로모터와 온도 민감성 리프레서를 함유하는 균주는 25~35℃에서 증식시킨 후 42℃로 그 온도를 바꾸는 것이 유전자 형질발현에 유리하다. 다른 프로모터를 함유하는 균주의 경우에는 성장의 처음부터 중간까지는 약 37℃의 온도를 유지하고 증식되기 시작하면서 온도를 내린 다음에 20~30℃로 유지시킨다.

배양은 일반적으로 공기 공급 및 교반하에 실시한다. 배지내의 산소 농도를 약 5%(v/v)의 포화 산소 농도 보다 낮지 않은 수준으로 유지하는 것이 유리한데, 이런 경우에 소망 단백질을 증가된 수율로 얻을 수 있기 때문이다.

이렇게 하여 수득한 단백질은 공지의 방법으로 분석할 수 있다.

예를들어 IL-2를 분석하기 위하여 IL-2-의존 세포주를 사용할 수 있다. 인체 IL-2가 인체 세포주 뿐만 아니라 쥐, 생쥐 및 몇몇 다른 IL-2-의존 세포주의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있기 때문에 [Immunological Reviews, 51, 257(1980)], 인체 IL-2-의존 세포주 뿐만 아니라 쥐 또는 생쥐의 IL-2-의존 세포주를 사용할 수 있다[Journal of Immunology, 130, 981 & 988(1983)].

특히, IL-2-의존 쥐 세포주는 장기간 안정하게 보존할 수 있으며 분석결과도 높은 재생성을 나타낸다.

본 명세서에 주어진 총 IL-2 수율 데이타는 IL-2-의존 세포를 사용하는 방법에 따라 결정한 것이며 방사성 티미딘의 흡수를 지수로 삼는다[Biochemical and Biophysical Research Communication, 109, 363(1983)].

Ala-IL-2의 수율은 7M 구아니딘 히드로클로라이드를 이용하여 세포로부터 IL-2를 추출하고, 추출액을 투석하고, 투석액을 FPLC(fast protein liquid chromatogrphy, 고속 단백질 액체 크로마토그래피) 시켜 Ala-IL-2의 분율을 계산하고 총 IL-2 수율과 이 분율을 곱한다.

FPLC로 분리한 단백질의 흡수치(280nm) 사이의 비율에 기초하여 정제된 시료를 정량한다.

IFNs을 항비루스 분석법[Journal of Virology, 37, 755(1981)] 또는 효소 면역 분석법 [Journal of Immunology, 80, 55(1985)]에 따라 분석한다. 세포에서 추출하고 적절한 방법으로 정제한 IFN단백질, 예를들면 IFN-αA의 정제된 시료를 FPLC하여 N-말단 메티오닌을 갖는 분자종과 N-말단 메티오닌을 갖지 않는 분자종으로 분리하고, 이들의 280nm에서의 흡광도의 비율에 기초하여 계산함으로써, 수득한 전체 IFN에 대한 N-말단 메티오닌 함유 IFN종의 분율을 결정한다. IFN-λ의 경우에는 덴실화(dansylation)법 또는 펩티드 시퀀서(sequenser)를 이용하여 N-말단 메티오닌 함량을 결정함으로써 두 종을 정량한다.

본 발명에 따라 생산한 단백질을 배양 세포로 부터 추출하는데 있어서는, 배양후의 세포를 수확하여 구아니딘 히드로클로라이드 등의 단백질-변성체를 함유하는 완충 용액에 현탁시키고, 냉소에서 교반후에 원심분리하여 단백질-함유 상층액을 수집한다. 또 다른 방법에 따르면, 세포를 완충 용액에 현탁시키고, 초음파 처리, 리소자임 처리 및/또는 동결 및 용해 처리하여 분열시킨 후에 원심분리하여 단백질-포함 상층액을 수집한다. 그외의 다른 적절한 방법을 이용할 수도 있다.

상술한 상층액으로부터 단백질을 분리하고 공지의 분리 및 정제법을 적절하게 배합하여 정제할 수 있다. 이러한 공지의 분리 및 정제법으로는 용해도 차이를 이용한 방법(예, 염석 및 용매 침전) ; 주로 분자량 차이를 이용한 방법(예, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영도) ; 전하차를 이용한 방법(예, 이온교환 크로마토그래피) ; 특정 친화력에 기초를 둔 방법(예, 친화력 크로마토그래피)의 소수성 차이에 기초를 둔 방법(예, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 ; 및 등전점 차이를 이용한 방법(예, 등전점 포커싱)을 예시할 수 있다. 특히 높은 소수성을 갖는 인체 IL-2 단백질은 소수성 컬럼 크로마토그래피, 특히 역상형 컬럼을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 매우 효과적으로 정제할 수 있다. IFN-α 및 IFN-γ의 경우에는, 각각의 IFN종에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론성 항체를 이용한 정제법이 매우 효과적이다.

상기 IL-2 단백질이 Ala-IL-2와 Met-Ala-IL-2의 혼합물인 경우에, 필요에 따라 동 출원인에 의한 출원(PCT/JP 84/00460, 국제 출원일 : 1984. 9. 26.)에서 설명된 등전점 차이를 이용한 분리법에 의해 Ala-IL-2를 분리할 수 있다.

등전점 차이에 기초를 둔 분리법으로는, 등전점이 약 0.01~0.2 차이나는 단백질을 분리하는법, 예를들어 암폴린을 이용한 밀도 구배 등전 포커싱, 겔 등전 포커싱, 등속 전기영동 또는 전기장에서 단백질을 전기 영동하는법, 크로마토포커싱, FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피), pH 구배 DEAE(디에틸아미노에틸) 및 CM(카르복실메틸) 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 또는 pH 구배가 형성된 컬럼내에서 단백질을 용출시키는법 또는 기타의 공지의 방법 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 이러한 분리방법에서 사용되는 시약과 기기는 모두 시판되는 것으로서 쉽게 구입할 수 있다.

Cys-IFN-α 및 Met-Cys-IFN-α의 혼합물도 필요에 따라 성분의 상호분리법과 동일한 방법으로 처리할 수 있다.

해독 출발 코오돈 ATG에 대응하는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하지 않는 정제된 단백질은 대응하는 공지의 단백질, 예를들어 대응하는 천연단백질과 동일한 생리 활성을 가지므로 약제로 사용할 수 있다.

공지의 IL-2종과 마찬가지로 Ala-IL-2단백질도 시험관 내에서 종양 항원을 인지 및 파괴할 수 있는 항원-특이 킬러 T세포 또는 항원 감작의 경험없이 독립적으로 종양을 죽일 수 있는 천연 킬러 세포를 선택적으로 성장시킬 수 있다.

상기 IL-2를 접종하고 동시에 상기 킬러 세포를 생체에 도입시키면 킬러 세포의 항종양 활성이 증가되기 때문에, 상기 단백질을 온혈 동물(예, 생쥐, 쥐, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 말, 양, 소, 인간)내에서 종양의 예방 및 치료 또는 면역 저하 질병의 치료에 사용할 수 있다.

상기 Ala-IL-2 단백질을 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위해서, 상기 단백질을 공지의 담체로 희석하여 예를들어 주사 또는 캡슐의 형태로 비경구 또는 경구 투여할 수 있다. 또한, 이를 상술한 대로 시험관내에서 성장시킨 킬러 T세포 또는 천연 킬러 세포와 조합하거나 단독으로 사용할 수 있다.

상술한 Ala-IL-2 단백질은 공지의 천연 인체 IL-2와 동일한 생물학적 활성을 갖기 때문에 천연 인체 IL-2와 동일한 방법으로 사용할 수 있다. 세포성 IL-2 수용체로 부터의 해리 상수가 매우 작기 때문에, 상기 단백질의 투여는 매우 적은 복용량으로도 충분하다.

항비루스, 항종양, 세포 증식 억제, 면역 상승 등의 활성을 갖는 IFN은 포유동물(예, 인간, 소, 말, 돼지, 생쥐, 쥐)에서의 비루스 감염, 종양의 치료에 이용할 수 있다. 상기 IFN을 항비루스제, 항종양제, 세포 증식 억제제 또는 면역 상승제로 사용하는 경우에는, 공지의 방법으로 상기 IFN을 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합하여, 예를들면 비경구 주사제의 형태로 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 투여한다. 정상적인 사람에 있어서는, 1일 복용량은 1×10⁵~1×10⁸단위, 바람직하게는 1×10⁶~5×10⁷단위이다. 사람이외의 포유 동물에서, 복용량은 2×10³~2×10⁶단위/kg/1일, 바람직하게는 약 2×10⁴~1×10⁶단위/kg/1일이다.

[실시예]

하기의 실시예 및 참고예는 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

실시예에 게재되어 있는 형질 전환체는 일본국 통상 산업상 공업기술원 미생물 공업기술 연구소(FRI), 일본국 재단법인 발효 연구소(IFO) 및 한국과학기술원(KAIST)에 기탁되어 있으며, 표 2에 수탁번호와 기탁일을 나타내었다.

[표 2]

[실시예 1]

50ml/ℓ의 소듐 암피실린 및 15mg/ℓ의 테트라사이클린 히드로클로라이드를 L배지(10g/ℓ의 박토트립톤, 5g/ℓ의 박토-효모 추출액, 5g/ℓ의 염화나트륨)에 가하여 제조한 배지의 50ml에 참고예 1(ii)에서 수득한 에스케리키아 콜리 N 4830 pTB 285를 접종시키고 회전 및 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양한다. 배양 브로스를 표 3에 나타낸 하나 또는 그 이상의 염으로 보강시킨 개질 M-9 배지 2.5ℓ를 함유하는 5ℓ들이 자르(jar) 발효기로 옮기고, 2.5ℓ/분의 공기 공급율, 1000rpm의 교반속도 및 30℃의 온도에서 배양을 시작한다. 배양 도중에, 성장이 1,000클레트 단위에 이르면 온도를 42℃로 상승시키고 4시간동안 계속 배양한 후에 세포를 수확하여 동결시킨다. 각각의 배양 브로스에 있어서, 동결 세포의 Ala-IL-2 생산성을 검사한다. 결과를 표 3에 나타낸다.

[표 3]

각종 금속 이온 첨가의 효과

*1 : 금속이온은 각각 하기 화합물의 형태로 첨가한다 : MnSO₄·4-6H₂O, FeCl₃·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, ZnSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O 및 CoCl₂·6H₂O.

*2 : 금속이온을 전혀 첨가하지 않았을 때의 생산성을 100으로 한 상대 값이다.

표 3에 나타난 바와 같이, Mn⁺⁺및/또는 Fe⁺⁺를 첨가하면 Ala-IL-2 생산성이 현저하게 증가되는 반면 다음 이온원(Cu⁺⁺, Zn⁺⁺, Cu⁺⁺, Co⁺⁺)은 전혀 생산성을 개선하지 못한다.

[실시예 2]

각각 다른 농도의 Mn 이온을 보강시킨 M-33 배지 내에서 실시예 1과 동일한 방법으로 에스케리키아 콜리 N 4830/pTB 285 균주를 성장시키고 얻은 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

망간 이온 첨가의 효과

* 금속염을 첨가하지 않은 배지의 생산성을 100으로 한다.

[실시예 3]

각각 다른 농도의 Fe 이온을 보강시킨 M-33 배지 내에서 실시예 1과 동일한 방법으로 에스케리키아 콜리 N 4830/pTB 285 균주를 성장시키고, 결과를 표 5에 나타낸다.

[표 5]

철이온 첨가의 효과

* 금속염을 가하지 않은 배지의 생산성을 100으로 한다.

[실시예 4]

L 배지에 7mg/ℓ의 테트라사이클린 히드로클로라이드를 가하여 제조한 액체 배지(pH 7.0)의 50ml에 형질전환체 에스케리키아 콜리 DH 1/pTF 4[일본국 특허출원 225079/1983(출원인 : 1983. 11. 28.), 일본국 특허 공개 115528/1985 ; 실시예 3]를 접종시키고, 회전 및 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양한다. 배양 브로스를 개질 M-9 배지, 또는 4×10^-4몰의 FeCl₃·6H₂O 및 4×10^-5몰의 MnSO₄·4~6H₂O를 보강시킨 동일배지 2.5ℓ를 포함하는 5ℓ들이 자르 발효기에 접종시키고, 2.5/ℓ분의 공기 공급율, 1,000rpm의 교반 속도 및 37℃의 온도에서 배양을 시작한다. 배양 도중에, 성장이 약 500클레트 단위에 이르면 온도를 30℃로 변화시키고, 성장이 약 1,000클레트 단위에 이르면 25℃로 변화시킨다. 24시간 배양후에 세포를 수확하여 동결시키고, 세포로부터 IL-2를 추출함으로써 Ala-IL-2 생산성을 검사하고 결과를 표 6에 나타낸다.

[표 6]

* 금속염을 가하지 않은 배지의 생산성을 100으로 한다.

[실시예 5]

각각 250ml들이 에를렌마이어 플라스크에 들어 있는, 50mg/ℓ의 소듐 암피실린을 함유하는 L-배지(액체 배지, pH 6.0)의 50ml 여섯개에 에스케리키아 콜리 N 4830/pTB 285를 접종시키고, 30℃에서 회전 및 진탕하에 밤새 교반한다. 배양 브로스를 125ml씩, 50mg/ℓ의 소듐 암피실린을 함유하는 M-33 배지 2.5ℓ[배지(A)] 및 50mg/ℓ의 소듐 임피실린, 8×10^-5몰의 MnSO₄·4~6H₂O 및 4×10^-4몰의 FeCl₃·6H₂O를 함유하는 M-33 배지 2.5ℓ[배지(B)]에 접종시키고, 2.5ℓ/분의 공기 공급율, 1,000rpm의 교반속도 및 30℃의 온도에서 배양을 시작하되 수성 암모니아를 이용하여 배양의 pH를 6.5로 유지시킨다. 글루코스 농도가 0.5% 이하로 떨어질때마다 각각 1%에 해당하는 글루코스와 카사미노산을 첨가한다. 덧붙여 성장이 1,000클레트 단위에 이르면 온도를 42℃로 상승시킨다. 이 온도에서 4시간동안 배양하여 배양이 완결되면, 각각의 배양 브로스를 원심분리하여 세포를 수확하여 -80℃로 동결시키고 보존한다.

배양브로스의 동결세포 12g을 7M 구아니딘 히드로클로라이드와 0.1M 트리스-HCl 완충용액을 함유하는 추출용매(pH 7.0) 100ml에 균일하게 현탁시킨다. 4℃에서 1시간동안 교반한 후에, 현탁액을 28,000×g에서 20분간 원심분리하여 상충액을 수득한다.

각각의 상층액을 0.01M 트리스-HCl 완충용액(pH 8.5)으로 투석하고 19,000×g으로 10분간 원심분리한다. 0.01M 트리스-HCl 완충용액(pH 8.5)으로 평형시킨 DE 52(DEAE-셀룰로스, 화르만, 영국) 컬럼(50ml 부피)에 상층액을 통과시켜 단백질이 흡착되도록 한다. NaCl 농도 구배를 직선형이 되도록 하여(0~0.15M의 NaCl, 1ℓ) IL-2를 용출시킴으로써 유효분획을 수득한다.

YM-5막(아미콘, 미합중국)을 이용하여 상기의 각각의 유효 분획을 약 5ml로 농축시키고, 농축액을 0.1M 트리스-HCl(pH 8.0)-1M NaCl 완충 용액으로 평형시킨 세파크릴 S-200(Sephacryl S-200, 파마시아, 스웨덴) 컬럼(500ml 부피)을 이용하여 겔 여과한다. 약 30ml 되는 각각의 유효분획을 YM-5막을 이용하여 농축함으로써 약 2.5ml로 되도록 한다. 농축물을 울트라포어 RPSC(알텍스, 미합중국) 컬럼에 공급하여 흡착되도록한 후에, 트리플루오로아세트산-아세토니트릴계를 용리액으로 사용하여 고성능 액체크로마토그래피한다. 컬럼, 울트라포어 RPSC(4.6×75mm) ; 컬럼온도 : 30℃ ; 용리액 A, 0.1% 트리플루오로 아세트산-99.9% 물 ; 용리액 B, 0.1% 트리플루오로아세트산-99.9% 아세토니트릴 : 용출 프로그램, 0분(68% A+32% B)-25분(55%, A+45% B) -35분(45% A-55% B) -45(30% A+70% B)-48분(100% B) ; 용출속도, 0.8ml/분 : 검출파장, 230nm.

약 39분간의 체류시간 후에 용출시키면, 상기 조건하에서는 각각의 배양물에서 약 10ml의 유효분획이 수집된다.

Ala-IL-2와 Met-IL-2의 혼합물을 함유하는 상기 수득된 각각의 액체를 동결 건조하고, 동결 건조물을 5ml의 0.005M의 아세테이트 완충용액(pH 5.0)에 용해시키고, 0.025M 디에탄올아민 히드로클로라이드 완충용액(pH 9.4)으로 평형시킨 FPLC용 모노 p 컬럼(0.5×20cm, 파마시아)에 공급한 후에 모노 p 컬럼에 흡착된 단백질을 1%(v/v) 파마라이트(8~10.5)-5.2%(v/v) 폴리버퍼(Polybuffer) 96 히드로클로라이드 버퍼(pH 8.0)로 용출시킨다. FPLC를 실온 및 30ml/시간의 유출속도에서 실시한다. 각각의 배양물에서 17~19ml의 유효 용출 분획을 수집하고, 폴리버퍼를 제거하기 위한 용리액으로서 트리플루오로 아세트산-아세토니트릴계를 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피한다. 컬럼, 울트라포어 RPSC(1.0×25cm, 알랙스) ; 컬럼 온도, 용리액 A 및 용리액 B는 상기와 동일 ; 용출 프로그램, 0분(55% A+45% B)-4분(55% A+45% B)-28분(42% A+58% B)-38분(34% A+66% B)-43분(20% A+80% B)-44분(55% A-45% B) ; 용출속도, 3.0ml/분.

수득한 각각의 Ala-IL-2 분획을 동결건조하여 흰색분말을 수득한다.

금속염을 전혀 첨가하지 않은 배지(A)에서 수득한 상기 분말의 중량은 1.53mg인 반면, 금속염을 첨가한 배지(B)에서는 6.31mg의 분말이 얻어진다.

이들 두 시료를 갖고 자동 에드만 분해법에 따라 기체상 단백질 시퀀서(Applide Biosystems model 470A)를 이용하여 N-말단아미노산을 확인함으로써 Ala이 98% 이상임을 확인한다. 동시에 기타의 단백질 화학 특성(C-말단 아미노산, 아미노산 조성분석, 펩티드 맵핑)이 동일함이 확인된다.

[실시예 6]

제3도에 나타낸 아미노산 서열을 코오딩하는 인체 IFN-αA 유전자가 삽입된 형질 발현 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜리 294(ATCC 31446)/pLeIF-A-trp 25 균주[참고. EPC(공개) 43980호의 실시예 1]를, L 배지에 5mg/ℓ의 테트라사이클린 히드로클로라이드를 첨가하여 제조한 배지 50ml에 접종하고, 회전 및 진탕하에 37℃에서 밤새 배양한다. 표 7에 나타낸 하나 또는 두 종류의 금속염을 보강한 변형된 M-9 배지 2.5ℓ를 포함하는 5ℓ들이 자르 발효기에 배양 브로스를 옮긴다. 2.5ℓ/분의 공기 공급율, 1,000rpm의 교반속도 및 37℃의 온도에서 배양을 시작한다. 성장이 500클래트 단위에 이르면 온도를 30℃로 낮추고, 1,000클래트 단위에서는 25℃로 낮춘다. 이런 방법으로 24시간동안 배양한다. 배양중에 글루코스 농도가 0.2% 이하로 되면 각각 1%의 양이 글루코스를 첨가한다. 배양 후에 각각의 배양 브로스를 원심분리하여 세포를 수확하고, 10% 수크로스, 0.2M NaCl, 10mM 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 10mM 스페르미딘, 2mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 및 0.2mg/ml의 리소자임을 함유하는 100ml의 50mM 트리스-HCl(pH 7.6)에 현탁시킨다. 4℃에서 1시간동안 교반한 후, 현탁액을 5분간 37℃로 데우고 소니케이터(알텍스, 미합중국)내에서 0℃에서 40초간 처리한다. 생성된 분해물을 11,300×g에서 1시간동안 원심분리하여 95ml의 상층액을 수득한다.

상층액(95ml)을 1mM EDTA 및 0.15M NaCl(TEN)을 함유하는 300ml의 20mM 트리스-HCl(pH 7.6)로 희석하고, 희석액을 항 IFN-αA 항체컬럼(20ml)에 공급한다.

컬럼을 TEN으로 충분히 세척한 후에, 0.1% 트윈 20(Wako Pure Chemical Industries)을 함유하는 0.2M 아세트산으로 IFN-αA를 용출시키고, 유효 분획의 pH를 4.5로 조절하고 CM 셀룰로스 컬럼에 넣어 흡착시킨다. 컬럼을 충분히 세척한 후에, 0.15M NaCl을 함유하는 0.025M 암모늄 아세테이트 완충용액(pH 5.0)으로 용출시킨다. 유효 분획을 다시 동결 건조하여 하기 표에 나타낸 양만큼의 액체 백혈구 IFN-αA 분말을 수득한다.

수득한 각각의 시료는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에서 단일 밴드를 나타내며, 분자량은 19,000±1,000이고, 항비루스 활성은 2~3×10⁸U/mg이다. 수득한 시료를 pH 6.7~pH 5.5의 폴리버퍼 및 크로마토포커싱용 모노 p 컬럼을 이용하여 FPLC 시킴으로써, N-말단 메티오닌을 갖는 분자종과 이런 메티오닌을 갖지 않는 분자종의 분율을 결정한다. 결과를 표 7에 나타낸다. 따라서 망간 및/또는 철이온을 첨가하면 N-말단 메티오닌-함유 분자종을 실질적으로 함유하지 않는 IFN-αA가 생산된다.

[표 7]

[실시예 7]

일본국 특허 공개 189197/1983호의 실시예 8에 설명한 방법에 따라 제4도에 나타낸 아미노산 서열을 코오딩하는 인체 IFN-γ 유전자를 삽입시킨 형질전환 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜리 RR-1(pRK248 cIts, pRC231/IFN-900)를, 50mg/ℓ의 소듐 암피실린 및 10mg/ℓ의 테트라사이클린 히드로클로라이드를 첨가하여 제조한 배지 50ml에 접종시키고 회전시키면서 30℃에서 밤새 배양한다. 배양 브로스를 표 8에 나타낸 하나 또는 두 종류의 금속염으로 보강한 M-33 배지 2.5ℓ를 포함하는 5ℓ들이 자르 발효기에 옮긴다. 2.5ℓ/분의 공기 공급율, 1,000rpm의 교반율 및 30℃의 온도에서 배양을 시작한다. 로그적 단계에서 성장이 약 700클래트 단위에 이르면 글루코스와 카사미노산을 1%의 농도에 해당하는 양만큼씩 가해주고 동시에 배양온도를 30℃~42℃까지 상승시킨 후, 4시간동안 계속 배양한다. 글루코스 농도가 0.2% 이하로 떨어질때마다, 글루코스와 카사미노산을 1% 농도에 해당하는 양만큼씩 가한다.

배양을 완결한 후, 배양 브로스를 원심 분리하여 세포를 수집하고 동결시켜 보존한다.

각각의 배양물의 100g의 동결건조 세포를 7M 구아니딘 히드로클로라이드를 포함하는 300ml의 100mM 트리스-히드로클로라이드 완충용액(pH 7.0)으로 추출한 후 동결건조하여 상층액을 수득한다. 137mM 인산 일칼륨을 함유하는 완충용액(이후에는 P.B.S.로 표기한다)을 이용하여 상층액을 희석하고, 다시 원심 분리하여 맑고 투명한 상층액을 수득한다. 이 상층액을 단클론성 항체[γ2-11.1MoAb ; 일본국 특허 공개 80646/84호] 컬럼(50ml)에 넣고, 충분히 세척한 후 2M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 20mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 용출시킨다. 유효 분획을 수집하여 세파크릴 S-200(파마시아) 컬럼에 넣고 그후에 다시 세파덱스 G-25 컬럼에 넣어, 각각의 컬럼에서 유효성분을 수집함으로써 정제된 IFN-γ 시료를 수득한다. 각각의 배지에서의 수율은 표 8에서와 같다.

얻어진 각각의 시료는 95% 이상의 IFN-γ 순도 및 3~4×10⁶IU/mg의 항비루스 활성을 나타낸다. 시료를 댄실화하고 댄실 메티오닌을 분리하여 HPLC로 정량한다. 이렇게 하여 총 분자중에 대한 N-말단 메티오닌-함유 분자종의 분율을 결정하고 데이타를 표 8에 나타낸다.

[표 8]

따라서, 철 및 망간 이온의 첨가는 실질적으로 N-말단 메티오닌-함유 분자종을 포함하지 않는 IFN-γ을 성공적으로 생산하게 한다.

[실시예 8]

L 배지에 5mg/ℓ의 테트라사이클린 히드로클로라이드를 가하여 제조한 배지에, 참고예 2에서 제조한 에스케리키아 콜리 C-4/pTF 4를 접종하고 37℃에서 회전 및 진탕(200rpm)하며 16.5시간동안 배양한다. 125ml의 배양 브로스를 (1) pH 5.5로 조절한 M-0.3 배지 및 (2) 20mg/ℓ의 FeCl₃·6H₂O 및 10mg/ℓ의 MnSO₄·4~6H₂O로 보강한 M-0.3 배지 각각 2.5ℓ가 들어 있는 5ℓ들이 자르 발효기에 접종하고, 34.5℃의 온도, 2.5ℓ/분의 공기 공급율 및 14% 수성 암모니아와 5N 황산으로 유지시킨 5.5의 pH 하에서 교반하며 배양한다. 배양도중에 성장이 약 500클레트 단위에 이르면 온도를 27.5℃로 변화시키고, 성장이 약 1,000클래트 단위에 이르면 22.5℃로 변화시킨다. 매 6시간마다 2g/ℓ의 글루코스 및 2g/ℓ의 카사미노산을 가한다. 24시간동안 배양한 후 배양 브로스로부터 Ala-IL-2의 생산성을 검사하고 결과를 표 9에 나타낸다.

배양 브로스로부터 세포를 수확하고, 각각의 12g의 동결 세포로부터 IL-2를 추출하고, 실시예 5와 동일한 방법으로 Ala-IL-2를 정제한다. 배지 (1) 및 배지(2)에서 성장시킨 세포로부터 각각 2.1mg 및 10.0mg의 Ala-IL-2를 수득한다.

[표 9]

[참고예 1]

인체 IL-2-생산 형질 전환체의 생산(I)

(i) 인체 IL-2 유전자-함유 플라스미드 pILOT 135-8[일본국 특허출원 225079/1983호(출원일 : 1983. 11. 28.) 및 일본국 특허공개 115528/1985호 ; 실시예 1(vii) 참고]을 제한 효소 HgiA I로 절단한다. 수득한 1294bp DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제를 이용하여 무딘 말단이 되게한 후, T4 DNA 리가아제를 이용하여 EcoR I 링커 dTGCCATGAATTCATGGCA와 결찰시킨다. 얻어진 DNA를 EcoR I로 분해하여 해독 출발 코오돈 ATG와 인체 IL-2 유전자를 갖는 DNA 단편을 수득한다.

사전에 EcoR I-Pst I 위치를 분해한 플라스미드 ptrp 781[Nucleic Acids Research, 11, 3077(1983)]에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 상기 DNA 단편을 삽입한다. 이렇게하여 수득한 형질전환 플라스미드 pTF1은 trp 프로모터 하류에 해독 출발 코오돈 및 인체 IL-2 유전자를 갖는다(제5도).

제한 효소 Stu I를 이용하여 플라스미드 pTF1을 절단하고 BamH I 링커와 결찰시킨다. 생성된 플라스미드 DNA를 제한 효소 BamH I 및 EcoR I으로 처리하고, EcoR I-BamH I 단편을 λPL 프로모터-함유 플라스미드 pTB 281에 삽입한다. 수득한 형질전환 플라스미드를 pTB285로 명명한다(제6도).

(ii) 상기에서 수득한 플라스미드 pTB 285를 이용하여 코헨 등의 방법[Cohen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 미합중국, 69, 2110(1972)]에 따라 에스케리키아 콜리 N 4830을 형질전환시킴으로써 형질전환체 에스케리키아 콜리 N 4830/pTB285를 수득한다.

[참고예 2]

인체 IL-2-생산 형질 전환체의 생산(II)

비른보임 등의 방법[Birnboim, H. C. et al., Nucleic Acids Research, 7, 1513(1979)]에 따라 이. 콜리 DH1/pTF4로부터 인체 IL-2 구조 유전자-함유 형질 전환 플라스미드 pTF4를 분리한다. 상기 플라스미드를 이용하여 코헨 등의 방법[Cohen, S.N. et al., Proceedings of the National Academy of Sceiece, 미합중국, 69, 2110(1972)]에 따라 이. 콜리 PR 13[J. Bacteriology, 97, 1522(1969)]를 형질 전환시킨다. 200ml들이 원추형 플라스크내의 1% 박토-트립톤(Difco Laboratories, 미합중국), 0.5% 박토-효모 추출액(상동), 0.5% 염화나트륨 및 5mg/ℓ 테트라사이클린 히르도클로라이드를 함유하는 배지(50ml, pH 7.0)에 상기 형질 전환체 세포를 접종하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양한다. 개질된 M-9 배지에 1mg/ℓ의 비타민 B₁히드로클로라이드를 가하여 제조한 배지(30ml)가 포함된, 구멍을 갖는 200ml들이 원추형 플라스크에 각각의 생성된 배양액을 접종하고, 37℃에서 4시간동안, 30℃에서 4시간동안 및 25℃에서 10시간동안 연속적으로 배양한다 : 매우 높은 IL-2 생산성을 갖는 균주, 즉 이. 콜리 C-4/pTF4를 선택한다.

Claims (18)

1. 해독 개시 코돈 ATG의 하류에 인터로이킨의 구조 유전자를 함유하는 형질 발현 벡터를 갖는 에스케리키아 콜리를 배양함으로써 인터로이킨을 제조하는 방법에 있어서, (1) 철 이온원, 망간 이온원 또는 그의 혼합물 및 (2) 천연물 유래의 질소원을 함유하는 배지에서 배양함을 특징으로 하는 N 말단의 해독 개시 코돈 ATG에 대응하는 메티오닌 잔기가 없는 인터로이킨의 증수법.
2. 제1항에 있어서, 인터로이킨이 인터로이킨-2-임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 형질 발현 벡터가 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 프로모터가 λPL 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항에 있어서, 프로모터가 트립토판 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 철 이온원이 철의 염임을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 철의 염이 3가 철의 무기산염임을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 망간 이온원이 망간염임을 특징으로 하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 망간염이 무기산염임을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 배지가 10^-6~10^-3몰 농도의 철 이온원을 함유함을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 배지가 10^-6~10^-3몰 농도의 망간 이온원을 함유함을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 배지가 10^-6~10^-3몰 농도의 철 이온원 및 망간 이온원의 혼합물을 함유함을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 천연물 유래의 질소원이 카사미노산, 펩톤, 효모 추출액 및 맥아 추출액으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 질소원이 카사미노산임을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 배지가 1g/ℓ~50h/ℓ 농도의 질소원을 함유함을 특징으로 하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 배양을 산성 조건하에 실시함을 특징으로 하는 방법.
17. 제4항에 있어서, 배양을 증식중에는 25~35℃에서 실시하고 그후에 42℃ 근처로 변화시켜 실시함을 특징으로 하는 방법.
18. 제6항에 있어서, 생육의 중간 단계까지는 37℃ 근처의 온도를 유지한 채 생육을 실시하고 그후에는 증식 상태에 비례하여 20~30℃로 낮춤을 특징으로 하는 방법.

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