NO169021B - Fremgangsmaate for fremstilling av vesentlig rent uglykosylert humant interleukin-2-protein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av vesentlig rent uglykosylert humant interleukin-2-protein ved hjelp av genteknikk.

Interleukin-2 (også kalt T-cellevekstfatkor (TCGF); heretter forkortet IL-2) er et lymfokin som fremstilles av T-celler ved stimulering med et lektin eller alloantigen, se for-eksempel (Science, 193, 1007 (1976); Immunological Reviews, 51, 257 (1980)). IL-2 gjør det mulig å ha langtidskulturer av T-celler ved at disse vokser in vitro samtidig som de opprettholder sine funksjoner. Videre er det angitt at IL-2 fremmer mitogenreaksjonen hos thymusceller (kostimulator), gjendanner antistoffproduksjon hos miltceller mot T-celle-avhengig antigener hos pelsløs mus T-celleerstattende faktor) eller fremmer differensieringen og oppformeringen av drepeceller (drepehjelpefaktor) (The Journal of Immunology, 123, 2928 (1979); Immunological Reviews, 51, 257 (1980)).

Drepe-T-cellekloner, hjelpe-T-cellekloner og videre naturlige drepecellekloner har hittil vært fremstilt i stort antall ved å anvende IL-2 (se for eksempel Nature, 268, 154 (1977); the Journal of Immunology, 130, 981 (1983)). I tillegg til en slik direkte anvendelse under T-celle- eller naturlig drepecellekloning, så kan IL-2 brukes ved selektiv dyrking av drepe-T-celler som er spesifikke overfor spesielle antigener, for eksempel vil drepe-T-celler kunne gjenkjenne et svulst-antigen og ødelegge svulsten in vitro. Ved å injisere svulstpesifikke drepe-T-celler som er dyrket på denne måten i et dyr så er det mulig å hemme og hindre svulstvekst (The Journal of Immunology, 125, 1904 (1980)). Det er også kjent at IL-2 induserer fremstillingen av IFN-"y (The Journal of Immunology, 130, 1784 (1983)), og at IL-2 aktiverer naturlige drepeceller (The Journal of Immunology, 130, 1970 (1983)).

De ovennevnte eksperimentelle fakta antyder at IL-2 kan være brukbart som et middel mot svulst. IL-2 er kjent for å kunne gjenskape hjelpe-T-cellefunksjonen hos pelsløse mus som mangler thymusfunksjon (European Journal of Immunology, 10, 719 (1980)) eller gjenskape induksjonen av drepe-T-celler mot homologe celler (Nature, 284, 278 (1980)), og man kan derfor forvente at IL-2 kan "brukes for å behandle immuno-kompromitterte sykdommer.

Produksjon i stor skala av IL-2 har imidlertid hittil vært vanskelig, slik at klinisk anvendelse av stoffet ikke har vært mulig. Det har følgelig vært meget ønskelig å finne en teknikk som gjør det mulig å fremstille høyrent IL-2 i store mengder på enkel, lett og billig mtåe.

Taniguchi et al. klonet humant IL-2-gen ved å bruke IL-2 mRNÅ isolert fra den humane T-celleleukemilinjen Jurkat som utgangsmateriale og rapporterte aminosyresekvensen for humant IL-2-protein slik denne kunne deduseres, og uttrykket genet i C0S-7-celler (Nature, 302, 305 (1983)). Senere rapporterte Devos et al. at genet for humant miltcelleavledet IL-2 hadde blitt klonet og uttrykt i Escherichia coli (Nucleic Åcids Research, 11, 4307 (1983)). Ikke desto mindre så har et nærvær hittil av en IL-2-lignende forbindelse bare blitt bedømt på basis av at man har kunnet påvise TCGF-aktivitet. Det er ingen rapport som angir at man har fremstilt humant IL-2-protein ved en tranformering som bærer med seg en DNA-koding for humant IL-2 og hvor dette er blitt isolert i en renset form.

Man har i foreliggende sammenheng utført et omfattende forskningsarbeid for å kunne utvikle en teknikk ved hjelp av hvilken det forønskede IL-2-protein kan fremstilles ved en kloning av det humane IL-2-gen idet man bruker en genemani-puleringsteknikk. Det rekombinerte DNA-molekylet er bitt ført inn i en vert og uttrykt som et humant IL-2-gen, noe som har gjort det mulig å finne en fremgangsmåte for fremstilling av i alt vesentlig rent uglykosylert humant IL-2-protein. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av vesentlig rent uglykosylert humant interleukin-2-protein med en spesifikk aktivitet på minst IO<4>U/mg og en renhet på minst 99 %, -som oppviser et eneste bånd ved analyse med SDS-polyakrylamidelektroforese under så vel reduserende som ikke-reduserende betingelser og som er vesentlig fritt for endotoksin og pyrogen, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man dyrker en transformant av Escherichia coli som inneholder en DNA med en basesekvens som koder for humant interleukin-2 slik at det bevirkes produksjon og akkumulering av humant interleukin-2 i dyrkningsmediet, og underkaster den således oppnådde humant interleukin-2-holdige oppløsningen en rensingsprosess som utnytter HPL-kromatografi med en reversfasekolonne.

Det DNA som koder for humant IL-2, og som kan brukes i foreliggende oppfinnelse, er for eksempel et DNA (I) som har en basesekvens som defineres ved kodonene 1-133 som vist på fig 2. Nevnte DNA (I) kan eventuelt ha i sin 5'-ende, enten ATG eller en signalsekvens av den type som er vist på fig. 2 ved kodonene S1-S20, og har fortrinnsvis TAA, TGA eller TAG, mest foretrukket TGA, i 3'-enden.

Nevnte DAN (I) er fortrinnsvis tilknyttet etter en promoter, for eksempel tryptofan (trp) promoteren, rec A promoteren eller promoteren, for eksempel trp eller *yPL promoteren.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse vil det mRNA som koder for humant IL-2, være isolert fra en kultur av humane perifere leukocytter stimulert med concanavalin A, for eksempel, hvorved man får syntetisert et enkeltkjedet cDNA ved å bruke revers transkriptase, og videre blir et dobbelttrådet DNA syntetisert. Dette DNA blir så innsatt i et plasmid, og dette rekombinante plasmidet kan så brukes for omdannelse av en stamme av Escherichia coli eller Bacillus Subtilis for eksempel, hvoretter det cDNA-holdige plasmidet blir klonet. På denne måten kan man få fremstilt et dobbeltkjedet DNA som koder for humant IL-2.

Mer spesielt kan det humane IL-2-kodende mRNA som brukes i foreliggende oppfinnelse, fremstilles ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet av Hinuma et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, 109, 363, (1982)). Ved den således fremstilte humane IL-2 mRNA som en templat, kan man syntetisere et cDNA ved fremgangsmåter som i seg selv er kjente ved å bruke revers transkriptase, hvoretter nevnte cDNA omdannes til et dobbeltkjedet DNA (Maniatis, T. et al., Cell, 8, 163 (1976); Land, H. et al., Nucleic Acids Research, 9, 2251 (1981)). Dette DNA kan så for eksempel innsettes i plasmidet pBR322 ved den såkalte Pstl-restriksjonsendo-nuklease-spaltingsposisjonen ved hjelp av dG-dC-homopolymeri-seringsmetoden (Nelson, T.S., Methods in Enzymology, 68, 41

(1979)). Videre, et oligonukleotid med den basesekvens som tilsvarer aminosyresekvensen i en del av det humane IL-2 blir kjemisk syntetisert og deretter merket med<32>P. Ved å bruke dette nukleotidet som såkalt probe, kan den ønskede klon velges ut fra tetracyklin- eller ampicillinresistente transformanter ved fremgangsmåter som i seg selv er kjente, for eksempel ved kolonihybridiseringsmetoden (Grunstein, M og Hogness, D.S., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975); Alwine, J.C. et al., Methods in Ezymology, 68, 220 (1979)). Nærværet av det humane IL-2-gen kan så bekreftes ved å bestemme basesekvensen i det DNA som er fremstilt fra det klon som reagerer positivt i den ovennevnte hybridiserings-metoden, noe som kan utføres ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet av Maxam-Gilbert (Maxam, A.M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)) eller ved hjelp av en fremgangsmåte hvor man bruker dinukleotidsyntetisk kjede-avslutning ved hjelp av fag M13 (Messing, J. et al., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)). Deretter blir hele eller en del av det humane IL-2-gen tatt ut fra den fremstilte klonen og innsatt i et plasmid etter en passende promoter, og SD

(Shine og Delgarno)-basesekvensen, for en etterfølgende innføring i en passende vert.

Bruken av trp promoteren, blant andre, som s-elve promoteren er meget fordelaktig. Som verten kan man med fordel bruke en stamme av Escherichia coli (for eksempel rase 294, stamme DH1, rase 4830), blant andre.

Stammene Escherichia coli 294 (Beckman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 73, 4174 (1976)), E. coli DH1 (Selson, M.E. et al., Nature, 217, 1110 (1968)) og E. coli N4830 (Cell, 25, 713 (1981)) er kjente stammer.

Omdannelsen av slike verter med nevnte DNA kan utføres ved hjelp av kjente fremgangsmåter (Cohen, S.N. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)). Den således oppnådde verten kan dyrkes i et medium som i seg selv er kjent, for eksempel et glukose- og casaminosyre-holdig M9-medium (Miller, J. Experiments in Molecular Genetics, side 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)). I de tilfeller hvor man bruker trp-promoteren, kan man tilsette et middel som for eksempel 3-p<->indolylakrylsyre for å øke aktiviteten av nevnte promoter. Dyrkingen utføres vanlivis ved temperaturer mellom 15-43°C i et tidsrom fra 3-24 timer med utlufting og/eller røring etter behov.

I de tilfeller hvor man bruker -yPL promoteren, kan dyrkingen fortrinnsvis utføres ved en relativt lav temperatur fra 30" til 36°C for å dyrke transformantene, og så ved ca 37° til 42°C for å inaktivere repressoren i transformantene og derved effektivt uttrykke DNA-kodingen for det humane IL-2.

Det fremstilte humane IL-2 kan bedømmes ved hjelp av en IL-2 avhengig cellelinje. Ettersom humant IL-2 er kjent for å fremme veksten av rotte, mus eller andre IL-2 avhengige celler så vel som humane IL-2 avhengige celler (Immunological Reviews, 51, 257, (1980)), så kan man ikke bare bruke IL-2 avhengige humane cellelinjer, men også rotte- eller mus-IL-2 avhengige cellelinjer (Journal of Immunology, 130, 981 og 988

(1983)).

Spesielt kan mus-IL-2 avhengige cellelinjer holdes i stabil kultur over lange tidsrom, noe som gir meget gode reproduser-bare resultater.

Ved ekstrahering av det humane IL-2 fremstilt ifølge oppfinnelsen fra de dyrkede cellene, så kan disse etter dyrking innhøstes på kjent måte, suspenderes i en oppløsning av et protein-denaturerende middel, for eksempel et mineral-syresalt av guanidin (for eksempel hydroklorid, nitrat eller sulfat), hvoretter suspensjonen røres i avkjølt tilstand og så sentrifugeres, hvorved man får en væske inneholdene nevnte IL-2. De innhøstede cellene kan også suspenderes i en buffer og brytes opp ved hjelp av lydbehandling, lysozymbehandling og/eller frysing og tining, fulgt av en sentrifugering som på samme måte gir en væske inneholdene nevtne IL-2. Man kan også bruke andre passende fremgangsmåter.

Ettersom det humane IL-2-proteinet er meget sterkt hydrofobt, så anvendes høytrykksvæskekromatografi hvor man bruker en reversefasekolonne for å rense nevnte protein. Således kan for eksempel de celler som er oppnådd ved å dyrke en stamme av Escherchia coli som bærer genet som koder for humant IL-2 suspenderes i en oppløsning, fortrinnsvis i en buffer av et proteindenaturerende middel, for eksempel guanidinhydroklorid (i en konsentrasjon fra 2 M til 8 M, fortrinnsivs 6 M til 8 M), hvoretter suspensjonen røres, fortrinnsvis 0-5°C fra en halv til tre timer, hvoretter den sentrifugeres. Superna-tanten tas ut, og vil etter en konsentrasjon ved for eksempel ultrafiltrering, underkastes en dialyse. Det resulterende bunnfallet fjernes ved hjelp av sentrifugering, og super-natanten behandles ved hjelp av anioneutbytningskromatografi hvor man bruker dietylaminoetylcellulose (for eksempel DE 52- cellulose (Whatman, Gt. Britain) kolonne), hvoretter den aktive fraksjonen oppsamles og tas ut.

Etter at man har konsentrert den aktive fraksjonen, for eksempel ved hjelp av en ultrafiltreringsanording, så vil fraksjonen gelfiltreres ved å bruke N,N'-metylenbisakrylamid-tverrbundet allyldekstran, for eksempel en Sephacryl S-200 (Pharmacia, Sverige). Den aktive fraksjonen som er tatt ut, behandles så ved hjelp av ovennevnte høytrykksvæskekromato-grafi. På denne måten får man ifølge oppfinnelsen fremstilt et uglykosylert humant IL-2.

Som reversfasesystem som brukes under nevnte høytrykksvæske-kromatografi, så kan man effektivt bruke en harpiks som er belagt med alkylerte (C-^g) silaner. Som elueringsmiddel kan man med fordel bruke en C^_£, lavere alkanol (for eksempel etanol eller propanol) eller acetonitril, ved en pH mellom 1,5 og 8, fortrinnsvis mellom 1,5 og 4. Elueringshastigheten er fortrinnsvis fra 0,1 til 100 ml pr minutt.

Det fremstilte humane IL-2-protein kan så etter behov opparbeides til et pulver ved hjelp av lyofilisering. Ved en lyofilisering vil man med fordel ofte kunne bruke en stabilisator så som sorbitol, .mannitol, dekstrose, maltose, glyserol eller humant serumalbumin (HSA).

Ved bedømmelse av IL-2 aktivitet når man bruker som indeks det radioaktive thymidinopptaket av IL-2-avhengige muse-celler, så vil humant IL-2-protein fremstilt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse vise en spesifikk aktivitet som er høyere enn 1 x IO<4>U/mg. Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse kan man fremstille et høyrent uglukosylert humant IL-2-protein med en spesifikk aktivitet som er høyere enn 2 xIO<4>U/mg og opp til 4 x IO<4>U/mg.

Som nevnt tidligere kan IL-2 aktiviteten i de angitte enheter (U) beregnes på følgende måte.

En IL-2-holdig prøve ble således tilsatt et medium som inneholdt celler av en musecellelinje som vokser avhengig av konsentrasjonen av IL-2, og hele blandingen ble inkubert ved 37 °C over natten i nærvær av 5 % CO2, hvoretter veksten av nevnte cellelinje ble bestemt ved å bruke radioaktivt thymidin. For å beregne aktiviteten i enheten (TJ) av den undersøkte prøven brukte man alltid en standard IL-2 (1 U/ml) som en sammenligning, og aktiviteten i enheter ble beregnet ut fra aktivitetsforholdet mellom prøven og standarden.

Mer spesielt ble celler av en IL-2 avhengig musecellelinje (NKC3) (Himuna et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, 363 (1982)) holdt i underkultur i et 20 % FCS-tilsatt RPMI 1640 medium tilsatt et IL-2-holdig behandlet medium ved 37°C i nærvær av 5 ^ CO2hvoretter cellene ble vasket to ganger med et serumfritt RPMI 1640 medium og igjen suspendert i 20 % FCS-tilsatt RPMI 1640 medium til en tetthet på 6 x IO<5>celler pr ml.

En IL-2-holdig prøve ble fordelt i 50 pl porsjoner i brønnene i en første rad av 96-brønns flatebunnet mikrotiterplate (Nunc, Danmark). Ved å bruke 50 ml porsjoner av 20 # FCS-tilsatt RPMI 1640-medium utførte man to gangers seriefor-tynning inntil den 12. raden. Deretter ble ovennevnte NKC3-cellesuspensjonen fordelt i 50 pl porsjoner i alle brønnene fulgt av en inkubering ved 37° C i nærvær av 5 ^ CO2i 24 timer. Etter 20 timers inkubering ble 1 jjCi av det radioaktive thymidinet (Amersham, Great Britain) tilsatt hver brønn. Etter fortsatt inkubering i fire timer ble cellene innvunnet på et glassfilter ved hjelp av en cellehøster (Flow, USA), og så målt for opptak av radioaktivt thymidin ved hjelp av en væskescintillasjonsteller. Ved gjennomføring av ovennevnte prøve ble en standard IL-2-prøve underkastet samme fremgangsmåte som de prøver som skulle undersøkes, og opptaket av radioaktivt thymidin ble bestemt.

Beregningen av aktiviteten i enheter (TJ) ble utført ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet i Journal of Immunology, 120, 2027 (1978). Således ble det maksimale opptak i standard IL-2-prøvefortynningsserien tatt som 100 %, og man beregnet prosentvis opptak for hvert fortynningstrinn. De verdier man oppnådde, ble avsatt på et normalt sannsynlig-hetspapir, og man bestemte grafisk den fortynningsfaktor som gir et opptak på 50 #. Også for hver IL-2-holdig prøve beregnet man på sammme måte den f or tynningsf aktor som gir et opptak på 50 #. Som en U/ml definerte man den mengden av IL-2-aktivitet som var kultursupernatanten etter 48 timers inkubering ved 37°C i nærvær av 5 % CO2av en suspensjon av humane perifere blodlymfocytter (5<2>x 10^ celler/ml) i 10 % FCS-tilsatt RPMI 1640 meidum tilsatt 40 jjg/ml av concanavalin A og 15 ng/ml av 12-0-tetradekanoylforbol-13-acetat. IL-2-konsentrasjonen (U/ml) i prøven ble beregnet ved hjelp av følgende forhold.

Fortvnnigsfaktor for prøve ved hvilken man fikk 50 % opptak.

Fortynningsfaktor for standard IL-2-prøve ved hvilken man fikk 50 % opptak.

Det naturlige IL-2 man fikk fra det humane, perifere blod hadde en spesifikk aktivitet på fra 20 til 70.000 U/mg slik dette kunne bestemmes ved hjelp av ovennevnte prøve. Denne aktiviteten er nesten lik aktiviteten for uglykosylert humant IL-2-protein fremstilt som beskrevet i foreliggende oppfinnelse .

Det uglykosylerte humane IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter fortrinnsvis det polypeptid (II) som har den aminosyresekvens som er vist på fig. 3, hvor X er Met eller hydrogen.

Humant IL-2-protein fremstilt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse har følgende egenskaper: 1) Det er homogent i SDSpolykarylamidgelelekt-roforese og har en molekylvekt på 15.000 ± 1.000 dalton slik dette kunne bestemmes ved hjelp av nevnte elektroforese; 2) Det inneholder alanin eller metionin som den aminoav-sluttede aminosyre; 3) Den inneholder treonin som den karboksy-terminale aminosyre; 4) Den har en aktivitet på voksende T-celler eller naturlige drepeceller samtidig som disse opprettholder sine funksjoner.

Humant IL-2-protein fremstilt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse reagerer negativt i limuluslysator-prøven (Haemostasis, 7, 183 (1978)), og har meget lavt innhold av urene proteiner og pyrogene forbindelser, slik at proteinet kan brukes for fremstilling av injeksjoner og så videre.

Det uglykosylerte humane IL-2-proteinet fremstilt i overensstemmelse med foreliggedne oppfinnelse har en aktivitet for å fremme veksten av normale T-celler eller naturlige drepeceller samtidig som disse beholder sine funksjoner. IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan derfor brukes for dyrking av T-celler eller naturlige drepeceller in vitro over lange tidsrom eller for kloning av slike celler. Videre kan denne egenskapen brukes ved måling av human IL-2-aktivitet.

Det fremstilte IL-2-proteinet gjør det videre mulig å dyrke selektivt antigen-spesifikke drepe-T-celler som gjenkjenner og ødelegger svulstantigener eller naturlige drepceller som er istand til å drepe svulstcellene uansett om det har skjedd en antigenisk sensitivering in vitro. Når det humane IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen inokuleres i en levende organisme samtidig med at man tilfører nevnte drepeceller i den levende organismen, så vil det foreliggende proteinet øke antisvulsteffekten av drepe-T-cellene. Proteinet kan følgelig brukes for å hindre eller for å behandle svulster eller ved behandlingen av lidelser eller sykdommer som skyldes for dårlig immunsystem i varmblodige dyr, for eksempel mus, rotte, kanin, hund, katt, svin, hester, sauer, storfe og mennesker.

Det humane IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen er et høyrent produkt, og har liten antigenitet i mennesker og har meget lav toksitet.

Det humane IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen har i alt vesentlig den samme biologiske aktivitet som naturlig humant IL-2-protein, og kan følgelig brukes på samme måte som et naturlig protein. Dets dissosiasjonskonstant i forhold til IL-2-reseptoren i de reagerende celler er meget liten, slik at det i de fleste tilfeller er tilstrekkelig med meget små doser.

For det formål å dyrke T-celler in vitro kan det humane IL-2 proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen tilsettes mediet i en konsentrasjon fra 0,01 til 1 U/ml, fortrinnsvis 0,1 til 0,5 U/ml.

I et eksempel på bruken for det formål å dyrke T-celler in vitro ble IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen tilsatt, i en konsentrasjon på 0,1-0,5 enheter/ml, til en cellesuspensjon som for eksempel inneholdt alloantigen-sensitivierte T-celler fremstilt ved en tre dagers blandet lymfocyttkultur av humane perifere blodavledede T-celler (lx 10^ cller/ml), som var tilsatt B-celletransformanter (1 x 10^ celler/ml) fremstilt ved røntgenbestråling (1500 rad) i RPMI 1640 medium inneholdene 20 % storfefosterserum. Dyrking ble fortsatt i ca 1 måned med repeterende utbytting av mediet ca 1 gang i uken.

Transformanten som er beskrevet i de følgende eksempler, nemlig Escherichia coli DH1/PTF4, er deponert til The Institute for Fermentation, Osaka (IFO) under deponerings-nummeret IFO-14299, og er også deponert ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Minsistry of International Trade and Industry, Japan (FRI) under aksessjonsnr. FERM BP-628 slik dette er angitt i Budapest-avtalen.

I den foreliggende sammenheng og de medfølgende tegninger er basene og aminosyrene når de er angitt ved forkortelser, forkortet i overensstemmelse med reglene i IUPAC-IUB-Kommisjonen for Biokjemisk Nomenklatur eller i overes-stemmelse med vanlig praksis. Eksempler er vist i tabell 1. I de tilfeller hvor det er antitt optiske isomerer, så er alle de angitte aminosyrer i L-formen hvis intet annet er angitt. Fig. 1 og Fig. 2 viser restriksjonsenzymkartet for plasmidet pIL0T135-8 fremstilt som beskrevet i referanseeksempel 1 (vi<i>) (jJJSSS) indikerer den delen som koder for signal-peptidet, og k\\\\ X^ indikerer den delen som koder for IL-2) og den primære strukturen (basesekvensen) i nevnte plasmid, respektivt. Fig. 3 viser aminosyresekvensen i det uglykosylerte, humane IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen, hvor X er Met eller et hydrogenatom. Fig. 4 viser selve konstruksjonsskjemaet for ekspresjonsplasmid pTF4 som angitt i referanseeksempel 2. Fig. 5 viser resultatene av en SDS-polykarylamidgelelektroforese utført som beskrevet i eksempel 1 (v) (1) og (2), fig. 6 viser trypsinnedbrytningspeptid-kartet som er nevnt i eksempel 1 (v) (6), og figurene 7 og 8 viser effektene av det humane IL-2-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen på opptaket av radioaktivt thymidin i en NKC3- cellelinje og en human cellelinje, respektivt, slik dette er angitt i eksempel 1 (v) (7). Fig. 9 viser resultatene av en langvarig dyrking av NKC3-cellelinjen utført som beskrevet i eksempel 1 (v) (7).

Referanseeksempel 1

(i) Isolering av mRNA som koder for humant IL-2.

Lymfocytter fremstilt fra humant perifert blod ble inkubert i RPMI 1640 medium tilsatt 10 <& f osterstorf eserum, 12-0-tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA) (15 ng/nl) og concanavalin A (40 jjg/ml) ved 37°C, hvorved man induserte dannelse av IL-2. Etter 24 timers inkubering ble de fremstilte 1 x lO<1>^ humane lymfocytter brudt i stykker, og denaturert i en oppløsning inneholdene 5 M guanidintiocyanat, 5 % merkaptoetanol, 50 nM Tris.GCl (pH 7,6) og 10 mM EDTA ved å bruke en teflonhomogenisator, hvoretter man tilsatte natruim N-lauroylsarkonsinat til en konsentrasjon på 4 S^, hvoretter blandingen etter homogenisering ble lagt over 6 ml 5,7 M cesiumkloridoppløsning (5,7 M cesiumklorid, 1 M EDTA) og sentrifugert ved hjelp av en Beckman SW28 rotor ved 24.000 omdr. pr min ved 15° C i 48 timer, hvorved man fikk et RNA-bunnfall. Dette ble oppløst i 0,25 % natrium N-lauroylsarko-cynat og utfelt med etanol, noe som ga 10 mg RNA. I en høykonsentrert saltoppløsning (0,5 M NaCl, 10 mM Tris.ECl pH 7,6 1 mM EDTA, 0,3 % SDS) ble dette RNA absorbert på en oligo(dT)cellulosekolonne. Eluering med en lavkonsentrert saltoppløsning (10 mM Tris.HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3 % SDS) ga 300 pg poly(A)-holdig mRNA. Dette mRNA ble så igjen utfelt med etanol, oppløst i 0,2 ml av en oppløsning (10 mM Tris. HC1.HC1 pH 7,6 2 mM EDTA, 0,3 % SDS), behandlet ved 65'C i to minutter og så fraksjonert ved en sentrifugering på en 10-35 io sukrosetetthetsgradient (ved 20° C 25.000 omdr. pr min i 21 timer i en Beckman SW28 rotor), noe som ga 22 fraksjoner. En porsjon av hver fraksjon ble injisert inn i oocytter av Xenopus laevis, og man fikk på denne måten målt IL-2 aktiviteten i de fremstilte proteiner. Fraksjonene 11-15 (sedimentasjonskoeffisient 8S-15S) viste seg å ha IL-2 aktivitet. Ca 25 pg av IL-2-mRNA forefantes i disse fraksjoner.

(i i ) Syntese av enkel tk. 1 edet DNA

Ved å bruke det mRNA hvis fremstilling er beskrevet ovenfor, og en revers transkriptase, ble inkubering utført i 100 pl av en reaksjonsoppløsning (5 pg mRNA, 50 pg olige(dT), 100 enheter revers transkriptase, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 8 mM MgCl2, 50 mM KC1, 10 mM ditiotretiol, 50 mM Tris.HCl pH 8,3) ved 42 "C i en time fulgt av en deproteinisering med fenol og behandling med 0,1 N NaOH ved 70°C i 20 minutter for fjerning av RNA ved dekomponering.

(ili) Syntese av dobbeltkjedet DNA

Et dobbelttrådet DNA ble syntetisert ved å behandle det således syntetiserte enkeltkjedete komplementære DNA i 50 pl av en reaksjonsoppløsning (den samme som nevnt ovenfor bortsett fra at mRNA og oligo(dT) var fraværende) ved 42°C i to timer.

(iv) Tilføring av dC- ende

Dette dobbel tkj edete DNA ble behandlet med nuklease Sl i 50 pl av en reaksjonsoppløsning (dobbeltkjedet DNA, 0,1 M natriumacetat pH 4,5, 0,25 M NaCl, 1,5 mM ZnSC>4, 60 enheter 51 nuklease) ved romtemperatur i 30 minutter, fulgt av en deproteinisering med fenol og en DNA-utfelling med etanol. Nevnte DNA ble behandlet med terminal transferase i 50 pl av en reaksjonsoppløsning (dobbeltkjedet DNA, 0,14 M kalium-cacodylat, 0,3 M Tris (base) pH 7,6, 2 mM ditiotreitol, 1 mM C0CI2, 0,15 mM dCTP, 30 enheter terminal transferase) ved 37°C i 3 minutter, hvorved man fikk en forlengelse av nevnte dobbeltkjedet DNA med ca 15 desoksycytidingrupper i begge 3'- endene. Denne serien av reaksjoner ga ca 300 ng av et desoksycytidinkjede-holdig dobbeltkjedet DNA.

(v) Spalting av Escherichia coli plasmid- og addis. ion av

dG- ende

Separat ble 10'pg Escherichia coli plasmid pBR322 DNA behandlet med restriksjonsenzymet Pstl i 50 pl av en reaksjonsoppløsning (10 pg DNA, 50 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl, pH 7,4, 6 mM MgClg, 6 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/ml av storfeserumalbumin, 20 enheter Pstl) ved 37° C i 3 timer, hvorved man spaltet en av de PstI-gjenkjennende posisjoner som forekommer i nevnte pBR322 DNA, fulgt av en deproteinisering med fenol. Det spaltede plasmid pBR322 DNA ble forlenget med ca 17 deoksyguaninenheter i begge 3'^-endene ved behandling med terminal transferese i 50 pl av en reaksjons-oppløsning (10 pg DNA, 0,14 M kaliumkakodylat, 0,3 M Tris base pH 7,6, 2 mM ditiotreitol, 1 mM CoCl2, 0,15 mM GTP, 30 enheter terminal transferase) ved 37"C i 3 minutter.

(vi) Sammenføyning av cDNA og transformering av

Escherichia coli

Den således fremstilte syntetiske dobbeltkjedete DNA (o,l pg) og 0,5 pg av det ovennevnte plasmid pBR322 ble sammenføyet ved oppvarming i en oppløsning inneholdene 1,1 M NaCL, 50 mM Tris.HCl pH 7,6 og 1 mM EDTA ved 65°C i 2 minutter, og så ved 45°C i 2 timer fulgt av en gradvis avkjøling, hvoretter produktet ble brukt for transformering av Escherichia coli MM294 i overensstemmelse med den fremgangsmåte som er beskrevet av Enea et al. (J. Mol. Biol., 96, 495 (1975)).

(vii) Isolering av cDNA- holdig plasmid

På denne måten isolerte man ca 20.000 tetracyklin-resistente transformanter. DNA i hver enkelt av disse ble fiksert på et nitrocellulosefilter. Basert på aminosyresekvensen i IL-2 slik denne er angitt av Taniguchi et al. (Nature, 302, 305

(1983)), syntetiserte man de komplementære oligonukleotider for de basesekvenser (<5>' AAÅ CAT STT CAG TGT3' og<5>' ACA TTC ATG TGT GAA<3>') som tilsvarer aminosyrene nr -74-78 (Lys-His-Leu-Gln-Cys) og aminosyrene nr 122-126 (Thr-Phe-Met-Cys-Glu), respektivt, ved hjelp av fosfortriestermetoden (Crea, R. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, 5765 (1978)).

Disse oligonukleotider ble merket med<32>P ved 5'-enden ved behandling med T4 polynukleotidkinase i 50 pl av en reak-sjonsoppløsning (20 pg oligonukleotid, 50 mM Tris.HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 50 pCi av -y-<3>2P ATP, 3 enheter T4 polynukleotidkinase) ved 37°C i 1 time. Disse merkede oligonukleotider, som prober, ble sammenføyet med ovennevnte DNA som var fiksert på nitrosefilteret, ved hjelp av fremgangsmåten til Lawn et al. (Nucleis Acids Res., 9, 6103 (1981)). Fire transformanter som var reaktive i forhold til de to ovennevnte oligonukleotidprober ble påvist ved autoradiografi. Plasmid DNA ble isolert fra cellene i hver av disse transformantene ved hjelp av Birnboim-Doly alkali-metoden (Birnboim, H.C. & Doly, J., Nucleis Acids Res., 7, 1513 (1979)). Det innførte stykket i plasmid DNA ble så tatt ut ved hjelp av restriksjonsenzymet Pstl. Blant de isolerte plasmidene valgte man ut det ene som inneholdt det lengste innførte fragmentet, og kalte dette pILOT 135-8. Restrik-sjonsenzymskjemaet for dette plasmidet er vist på fig. 1.

Den primære strukturen (basesekvensen) i det cDNA som var innsatt i nevnte pILOT 135-8 ble bestemt ved hjelp av didesoksynukleotidmetoden og Maxam-Gilbert metoden. Den således bestemte primære struktur er vist på fig. 2. Peptidet som er definert ved denne basesekvensen, består av 153 aminosyrer, og starter med syntesestartsignalet (nr 64-66 ATG). Av disse anses de 20 aminosyrene fra den N-terminale enden å være et signalpeptid. Den ovennevnte primære struktur har vist at dette plasmidet har hele den basesekvens som koder for det humane IL-2-proteinet. Dette faktum indikerer at innføring av nevnte genedel i nevnte plasmid kan føre til produksjon av en eventuell polypeptiddel av IL-2-proteinet.

Referanseeksempel 2

Plasmidet pILOT 135-8 fremstilt som beskrevet i referanseeksempel 1, ble spaltet med restriksjonsenzymet HgiAl. Det således fremstilte 1294 bp DNA fragment inneholdene IL-2-genet, ble behandlet med T4 DNA polymerase, forbundet med Clal linkeren CGATA ATG GCA, som inneholdt kodonet GCA for alanin og kodonet ATG for metionon, hvoretter produktet ble behandlet med Clal og Pstl fulgt av en innføring i ptrp 771 i Clal-Pstl-posisjonen. Den således fremstilte ekspresjons-plasmidet ble betegnet pTF4 (fig. 4).

Referanseeksempel 3

Escherichia coli DH1 ble transformert med plasmidet pTF4 fremstilt som beskrevet i referanseeksempel 2, i overensstemmelse med fremgangsmåten til Cohen et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110, 1972)), hvorved man fikk fremstilt en transformant (Escherichia coli DHl/pTF4 med nevnte plasmid.

EKSEMPEL 1

(i) E. coli DHl/pTF4 (fremstilt som beskrevet i referanseeksempel 3) ble inokulert i 50 ml av et flytende medium (pH 7,0) inneholdene 1 % Bactotrypton, 0,5 # Bacto gjær-ekstrakt, 0,5 % natriumklorid og 7 jjg/ml av tetracyklin, og blandingen ble plassert i en 250 ml erlenmeyer-kolbe. Etter inkubering ved 37"C over natten i en rotor, ble kulturmediet overført til et 5 liters fermenteringskar inneholdene 2,5 liter M9 medium inneholdene 0,5 # kasaminosyre, 0,5 # glukose og 7 pg/ml tetracyklin. Inkubering ble så utført med gjennomluf tning og røring ved 37° C i 4 timer, og etter tilsetning av 3-p<->indolyl-akrylsyre (25 pg/ml), i ytterligere

4 timer. Cellene ble innhøstet fra de nenvte 2,5 liter medium ved sentrifugering, deretter frosset ved -80°C og så lagret. (ii) De fryselagrede celler (12,1 g) - fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (i) ble suspendert i 100 ml av et ekstraksjonsmiddel (pH 7,0) inneholdene 7 M guanidinhydroklorid og 0,1 M Tris.HCl, hvoretter suspensjonen ble rørt ved 4°C i 1 time og lysatet ble sentrifugert ved 28.000 x g i 20 minutter, hvorved man fikk 93 ml supernatant. (iii) Separat ble forskjellige fremgangsmåter utført for å ekstrahere IL-2 fra de transformante E. coli DHl/pTF4-cellene fremstilt som beskrevet under eksempel 1 (i) for derved å kunne sammenligne effekten av de forskjellige ekstraksjons-metoder.

I lyozym-EDTA metoden, ble 2 g av E. coli DHl/pTF4-celler fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (i) blandet med 16 ml av oppløsningen (ph 7,0) inneholdene 0,1 M Tris.HCl, 10 mM EDTA og 250 mg/l lysozym, hvoretter blandingen ble rørt ved 4°C i 1 time og så ved ved 37°C i 5 minutter, hvoretter lysatet ble sentrifugert ved 28.000 x g i 20 minutter.

Under lydbehandlingsmetoden ble 2 g av de ovennevnte celler suspendert i 16 ml av oppløsningen (pH 7,0) inneholdene 0,1 M Tris.HCl, hvoretter suspensjonen ble underkastet lydned-brytning ved 0"C i 55 minutter, hvorpå lysatet ble sentrifugert ved 28.000 x g i 20 minutter.

I guanidin-HCl metoden ble 2 g av de ovennevnte celler blandet med 16 ml av oppløsninger (pH 7,0) inneholdene 0,1 M Tris.HCl og 2 M, 4 M eller 7 M guanidin-HCl. Blandingen ble rørt ved 4°C i 1 time, hvoretter lysatene ble sentrifugert ved 28.000 x g i 20 minutter. Supernatantvæskene ble brukt for målinger av proteinkonsentrasjonen og IL-2 aktivitet. Resultatene er gitt i tabell 2. (iv) Supernatantvæsken fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (ii) ble dialysert mot 0,1 M Tris.HCl buffer (pH 8,5) og så sentrifugert ved 19.000 x g i 10 minutter, noe som ga 94 ml av en dialysert supernatantvæske. Denne ble påsatt en DE 52 (DEAE-cellulose, Whatman) kolonne (50 ml i volum) ekvilibrert med 0,01 M Tris.HCl buffer (pH 8,5) for proteinabsorbsjon. Proteinene ble eluert med lineær NaCl-konsentrasjonsgradient (0-0,15 M NaCl, 1 liter). De aktive fraksjoner på 53 ml ble konsentrert til 4,8 ml ved hjelp av en YM-5 membran (Amicon) og så gelfiltrert ved hjelp av Sephacryl S-200 (Pharmacia) kolonne (500 ml i volum) ekvilibrert med 0,1 M Tris.HCl (pH 8,0)-l M NaCl buffer. De aktive fraksjoner på 28 ml ble konsentrert til 2,5 ml ved hjelp av en YM-5 membran. Konsentratet ble påsatt en ultrapore RPSC (Altex) kolonne for adsorbsjon, og høytrykksvæskekromatografi ble utført ved hjelp av et trifluoreddiksyre-acetonitril-system som den mobile fase.

Følgende betingelser ble anvendt: Kolonne, ultrapore RPSC (4,6 x75 mm); kolonnetemperatur, 30°C; oppløsningsmiddel A, 0,156 trif luoreddiksyre-99 ,99é vann; oppløsningsmiddel B, 0,1$ trifluoreddiksyre-99,956 acetonitril; elueringsprogram, minutt 0 (6856 A + 325é B) - minutt 25 ( 5556 A + 4556 B) - minutt 35 (45$ A + 5556 B) - minutt 45 (3056 A + 7056 B) - minutt 48 (10056 B), elueringsmengde, 0,8 ml/min.; bølgelengde for påvisning, 230 nm. Man oppsamlet en aktiv frakson etter en oppholdstid på ca 39 min. Man oppnådde således 10 ml av en oppløsning inneholdende 0,53 mg uglykosylert humant IL-2 protein [spesifikk aktivitet 30.000 U/mg); aktivitetsutvinning ut fra utgangsmaterialet, 30,656, renhet på protein 9956 (bestemt ved densiometri på et SDS-polyakrylamidgelelektroforfogram)].

Lyofilisering av den ovennevnte oppløsning ga et hvitt pulver. Pulveret hadde en spesifikk aktivitet på 26.000 U/mg. (v) Det humane IL-2 proteinet fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (iv) ble undersøkt for følgende egenskaper:

(1) Homogenitet:

Farging med Coomassie Brilliant Blue etter en SDS-polyakryl-amidgelelektrofosere slik det er beskrevet av Laemmli et al.

[Nature, 227, 680 (1970)] viste bare et enkelt bånd i nevnte humane IL-2 protein (kfr. fig. 5). Plasseringen av båndet forble uforandret under reduserende betingelser så vel som under ikke-reduserende betingelser.

(2) Molekylvekt:

Molekylvekten på nevnte humane IL-2 protein ble beregnet til ca 15.000 dalton basert på resultater av en SDS-poly-akrylamidgelelektrof orese (kfr. fig. 5).

(3) Aminosyresammensetning:

En 20 pm porsjon av nevnte human IL-2 protein ble plassert i et glassprøverør for hydrolyse, hvoretter man tilsatte konstant kokende saltsyre inneholdende 456 tioglykolsyre, hvoretter røret ble forseglet i vakuum, og det ble utført en hydrolyse ved 100°C 1 24, 48 eller 72 timer. Etter hydrolysen ble røret åpnet, saltsyren ble fjernet under redusert trykk, hvoretter resten ble oppløst i 0,02 N saltsyre og underkastet en aminosyreanalyse ved å bruke en Hitachi modell 835 aminosyreanalysator. For bestemmelse av cystin og cystein, ble nevnte humane IL-2 protein oksydert ved hjelp sv permaur-syre ved hjelp av fremgangsmåten til Hirs [Methods in Enzymol.; 11, 197 (1967)] fulgt av en hydrolyse i konstant kokende saltsyre under redusert trykk i 24 timer. Hydrolys-atet ble underkastet en cysteinsyrebestemmelse ved hjelp av en aminosyreanalysator. De oppnådde resultater av nevnte aminosyreanalyse er vist i tabell 3. Verdiene er i hvert enkelt tilfelle middelet av tre verdier som henholdsvis ble oppnådd etter 24, 48 og 72 timers hydrolyse, bortsett fra verdiene for serin og treonin som ble bestemt ved ekstra-polering til et tidspunkt null av hydrolysen.

(4) N-terminalaminosyresekvens:

En 34 jjg porsjon av nevnte humane IL-2 protein ble analysert for den N-terminale aminosyresekvensen ved hjelp av den autotiske Edman nedbrytningsmetoden, idet man brukte en gassfaseproteinsekvensanalysator (modell 470A). Fenyltio-hydantoin-aminosyrene (PTH-aminosyrene) ble identifisert ved høytrykksvæskekromatografi ved å bruke en Micropak-SP-kolonne (Vårian). Den eller de PTE-aminosyrer som ble påvist i hvert enkelt trinn, er vist i tabell 4.

(5) C-terminal aminosyre:

En 33 pg porsjon av nevnte humane IL-2 protein ble plassert i et glassprøverør for hydrazinnedbrytning, hvoretter man tilsatte 0,05 ml vannfritt hydrazin og lukket røret i vakuum og holdt det på 100°C i 60 timer. Det hydrazinnedbrutte produktet ble lyofilisert og oppløst i destillert vann. Benzaldehyd ble tilsatt oppløsningen, hvoretter blandingen ble rørt ved romtemperatur i en time og så sentrifugert. Det fremstilte vandige lag ble lyofilisert og underkastet en aminosyreanalyse ved hjelp av en Hitachi modell 835 aminosyreanalysator. Man påviste utelukkende treonin.

(6) Tryptinpeptid-diagram

En 15 pg porsjon av nevnte IL-2 prøve ble nedbrutt ved hjelp av 0,4 pg trypsin i 120 pl 0,02 M natriumhydrogenkarbonat ved 37°C i 18 timer. Deretter tilsatte man 5 pl 2-merkaptoetanol, og reaksjonen ble fortsatt ved 37°C i ytterligere 2 timer. Deretter ble reaksjonen avsluttet ved å tilsette 75 pl 156 trifluoreddiksyre. Høytrykksvæskekromatografi av reaksjons-blandingen som ble utført under de betingelser som er angitt nedenfor, ga et diagram som er vist på fig. 6.

Kolonne: Ultrasphere-Octyl (5pm, 4,6 x 250 mm; Kolonnetemperatur: 30°C

Mobil fase:

Oppløsningsmiddel Å, 0,0256 trif luoreddiksyre-99, 9856 vann;

Oppløsningsmiddel B, 0, 02% trifluoreddiksyre-99, 9856 acetonitril;

Minutt 0 (9556 oppløsningsmiddel A + 556 opp-løsningsmiddel B - minutt 40 (3-056 oppløsnings-middel A + 7056 oppløsningsmiddel B); Gjennomstrømningshastighet: 1,0 ml pr. minutt;

Påvisning: Fluorescensmetode [Analytical Biochem., 67, 438,

(1975)] ved å bruke fluorescamin (Roche, USA).

(7) Aktivitet mot IL-2-avhengige cellelinjer

En undersøkelse av det uglykosylerte humane IL-2 protein fremstilt ifølge oppfinnelsen ved hjelp av dens fremgangsmåte, som er beskrevet i Biochem. Biophys. res. Commun., 109, 363 (1982) viste at nevnte protein hadde en aktivitet som fremmet opptak av radioaktivt tymidin i en IL-2-avhengig musecellelinje (NKC3, kfr. fig. 7), så vel som i en IL-2-avhengig human cellelinje (kfr. fig. 8).

Videre ble nevnte IL-2 protein oppløst i 2056 FCS-tilsatt RPMI-1640 medium til en konsentrasjon på 0,5 U/ml, hvoretter 2 x IO<5>celler/ml av nevnte NKC3 cellelinje ble suspendert i mediet. Dyrkingen ble fortsatt på en Linbro multi-skål (Flow) ved 37"C i nærvær av 556 COg mens man gjentatte ganger tellet levende celler og resuspenderte kulturen i nytt friskt medium med 2 til 3 døgns mellomrom. Som et resultat av dette fant man at nevnte IL-s protein hadde en aktivitet som opprett-holdt veksten av NKC3 cellelinjen over et lengre tidsrom, noe som er vist på fig. 9.

Eksempel 2 (preparat for injeksjon)

Den uglykosylerte human IL-2 proteinholdige oppløsningen fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (iv) ble påsatt en CM Toyopearl (Toyo Soda) kolonne ekvilibrert med 0,025 M ammoniumacetatbuffer (pH 5,0) under aseptiske betingelser for adsorpsjon, fulgt av eluering med ovennevnte buffer inne holdende 0,15 M NaCl. Eluatet ble fortynnet ved å tilsette en passende mengde 0,15 M NaCl, hvoretter HSA ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,5$, og blandingen ble så filtrert gjennom et membranfilter (0,22 pm i porediameter).- Filtratet ble fordelt aseptisk i 1 ml porsjoner i ampuller etter lyofilisering. Det således fremstilte IL-2 preparatet for injeksjon kan oppløses i 1 ml destillert vann for injeksjon før bruk.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av vesentlig rent uglukosylert humant interleukin-2-protein med en spesifikk aktivitet på minst IO<4>U/mg og en renhet på minst 99%, som oppviser et eneste bånd ved analyse med SDS-polyakrylamidelektroforese under såvel reduserende som ikke-reduserende betingelser og som er vesentlig fritt for endotoksin og pyrogen,karakterisert vedat man dyrker en transformant av Escherichia coli som inneholder en DNA med en basesekvens som koder for humant interleukin-2 slik at det bevirkes produksjon og akkumulering av humant interleukin-2 i dyrkningsmediet, og underkaster den således oppnådde humant interleukin-2-holdige oppløsningen en renseprosess som utnytter HPLCkromatografi med en reversfasekolonne.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at kromatografien utføres ved anvendelse av et elu eringsmiddel med pH 1,5 - 8.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at kromatografien utføres med en strømningshastighet på 0,1 - 100 ml/min.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at humant interleukin-2 produseres og akkumuleres i voksende transformantceller og at nevnte human interleukin-2 ekstraheres fra cellene hvorved det oppnås en væske som inneholder humant interleukin-2.

5.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at nevnte humane interleukin-2 ekstraheres med en oppløsning som inneholder proteindenaturerende materiale.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisertved at nevnte humane interleukin-2 ekstraheres med en oppløsning av et guanidinsalt med en konsentrasjon på 2 - 8 M.