JPS60243021A - システイン含有蛋白質の制御された酸化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は生化学工学に関する。さらに詳しくは、この
発明は、十分に還元された微生物的に生産されたシステ
ィン含有蛋白質を制御された態様において酸化し、該蛋
白質が天然に存在するその対応物と同一のジスルフィド
橋を有するようにする方法に関する。

１個又は複数個のジスルフィド橋を含有する活性蛋白質
が遺伝子工学的手法により微生物的に製造される場合、
との合成蛋白質は微生物にょシジスルフィド橋を欠く還
元された形で、又は制御されないチオール−ジスルフィ
ド相互変換反応により細胞中で形成されるオリゴマーの
形で産生され合成蛋白質がその天然対応物と同一の一次
構造を有することが望ましく又は必要である場合、生化
学技術者は微生物培養物から蛋白質を分離する問題のみ
ならず、オリゴマーを還元しそして／又は天然蛋白質の
一次構造を装う様に、還元された合成蛋白質を酸化する
問題に直面する。微生物的に生産された合成蛋白質の酸
ｆヒは従来、制御されておらず、そして蛋白質を酸化的
条件にゆだねることにより意図的に行われ、又は蛋白質
をそれが酸化される環境に置くことによって偶然的に行
われてきた。制御されない態様における蛋白質の酸化に
より不所望の異性体（正しく力い分子自架＆）又はポリ
マー（分子間架橋）が形成され、過剰酸ｆヒが起こり、
培養物からの蛋白質の分離を複雑化し又は所望の一次構
造を有する蛋白質の収量を減少させる。医療的使用が意
図される蛋白質の場合、精製、製剤化又は投与における
制御され々い酸化が、不活性又は抗原性であるかもしれ
々い異性体及び／又はオリゴマーによシ汚染された不均
一な物質をもたらす。

この発明は、微生物的に製造された蛋白質を、選択的な
、制御された態様において、システィンを選択的に酸化
する酸化剤、好ましくは０−イオドソ安息香酸を用すて
酸化し、所望のジスルフィド結合を高収量で得る方法に
向けられる。これに関して、０−イオドソ安息香酸は天
然蛋白質の近隣のシスティンを選択的に酸化するために
すでに使用されているよく知られたスルヒドリル試薬で
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）（１９４１）６３：２５５１−２
５５２　：Ｃｈｉｎａｒｄ　Ｆ、Ｐ、及びＨｅｌｌｅｒ
ｍａｎ　Ｌ、、メソド・（１９５４）　１　：　１及び
Ｖａｌｌｅｊｏｓ　Ｒ，Ｈ，及びＡｎｄｒｅｓ６１：９
５−９９）。天然蛋白質中のチオール基のための他の酸
化剤がＧｕｚｍａｎ　Ｂａｒｒｏｎ　Ｅ、Ｓ、、アトパ
ンシス・イン・エンチモロギー（Ａｄｖａｎ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　（１９５１）１１　：２２３−２
２６：及びＴｅｈ−（１９７８）Ｖｏｌ　ｍ、２５５−
２６３．アカデミツクプレス、ニューヨークに記載され
ている。出願人が知る限りでは、蛋白質中のスルヒドリ
ル基のための選択的酸ｆヒ剤として０−イオドン安息香
酸及び他の酸化剤が従来使用されているのは、分析方法
のためのみである。出願人は、微生物的に生産された合
成蛋白質の制御された酸化を行うための製造的方法にお
けるこれらの酸化剤の使用に関する先行技術を知らない
。

この発明は、有用蓋内質と実質上同一なアミノ酸配列を
有する十分に還元された微生物的に生産された合成蛋白
質（該アミノ酸配列はシスティン全含有し、このシステ
ィンは前記有用蛋白質中では分子内結合してシスチンを
形成している）を制御された態様において酸化し　こう
することによって最少の過剰酸化と非協調的（ｎｏｎｃ
ｏｎｆｏｒｍｉｎｇ）シスチン基又はオリゴマーの最少
の形成全件って前記システィンを選択的に酸化して前記
シスチンを形成するための製造的方法に関し、この方法
は前記十分に還元された微生物的に生産された合成蛋白
質を、水性媒体中、前記システィンのｐＫａより少なく
とも約０．５ｐＨ単位低い−において、０−イオドソベ
ンゾエートと反応せしめ、この場合において反応混合物
中の合成蛋白質の濃度を約５ｍ９／　ｒｎｌより低くし
セして０−イオドソベンゾエートと蛋白質とのモル比を
少なくとも理論量的にし、但し反応の終点において０−
イオドソベンゾエートが過剰に存在することを特徴とす
る。

この発明はさらに、有用な蛋白質と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有する合成蛋白質の上記の制御された酸化に
よって製造される新規な調製物（前記アミノ酸配列はシ
スティンを含有し、このシスティンは前記の有用な蛋白
質中では分子内結合によシシスチンを形成している）に
関する。好１しくけ、前記蛋白質は後に定義するムティ
ン、又は微生物的に製造されたＩＦＮ−βもしくはＩＬ
−２である。これらの調製物は、（、）天然の対応物と
同じジスルフィド橋金有し、（ｂ）オリコ゛マーを実質
上含有せず、そして（ｃ）天然の対応物と異るジスルフ
ィド橋を有する異性体の含量は約１５％未満である合成
蛋白質金倉んで成る。

この発明により酸化される合成蛋白質は、これらを産生
ずる遺伝子操作された微生物にとって外来性である。こ
れらの蛋白質は有用々蛋白質と実質上同一のアミノ酸配
列”ｒＭし、そして該有用な蛋白質中では分子内結合し
て１個又は複数個のシスチン（被ゾチド内ジスルフィド
橋）部分全形成してｂる複数のシスティン残基金含有す
る。これに関して、「実質−ヒ同一」なる語は、合成蛋
白質及び有用な蛋白質のアミノ酸配列が同一であるか、
あるいは合成蛋白質とその非微生物的に製造された対応
物との間に不都合な機能的相違を生じさせない１又は複
数のアミノ酸の変更（除去、付加、置換）によシ異るこ
とを意味する。この発明の方法により酸比される蛋白質
は十分に還元されている。すなわち、ジスルフィド橋を
欠いている。蛋白質が微生物により酸化形で産生される
場合には、該蛋白質は、酸化にかける前に還元しなけれ
ばならない。還元は、蛋白質を還元剤、例えば２−メル
カゾトエタノール又はジチオスレイトールで処理するこ
とにより達成される。

特に興味ある合成蛋白質は、有用な生物学的活性を有し
且つ該活性のため又は該活性の増強のために必須なジス
ルフィド橋を有する天然蛋白質と実質上同一なアミノ酸
配列を有する蛋白質である。

このような天然蛋白質の例としてリンホカイン、例エバ
インターフェロンーベーター（ＩＦＮ−β）、インター
フェロン−アルファー（ＩＦＮ−α）、イアターｏイキ
、７−２　（Ｉ　Ｌ〜２．）、及ヒコロニー刺激因子−
１が挙げられる。。

特に興味ある合成蛋白質は生物学的に活性な蛋白質のム
ティンであり、このムティンにおいては、生物学的活性
に必須でなく、生物学的に活性な蛋白質中に存在しそし
てジスルフィド結合を形成することができる少なくとも
１個のシスティンが、分子間架橋形成又は正しく々い分
子内ジスルフィド結合形成のだめの部位を除去するため
に、計画的に除去され又は他のアミノ酸で置き換えられ
ている。

この方法により突然変異的に変えることができる蛋白質
は、生物学的に活性な蛋白質のシスティン含量、並びに
活性及び三次構造に関してシステイン残基が演する役割
に関する入手可能な情報から同定することができる。こ
のような情報が文献から得られない蛋白質については、
該蛋白質のシスティン残基のそれぞれをこの明細書に記
載する方法によシ体系的に変え、そして得られた１１テ
インの生物学的活性及び不所望の分子間ジスルフィド結
合又は分子内ジスルフィド結合を形成するその傾向を試
験することにより前記の情報を得ることができる。従っ
て、この発明１ＩＦＮ−β及びＩＬ−２のムティンにつ
いて特に例示するが、この発明は、蛋白質を不所望のジ
スルフィド結合形成に対して感受性にする機能的に必須
でないシスティン残基金含有する他の任意の生物学的に
活性な蛋白質に適用される。この発明に従う突然変異的
変化の候補であるＩＦＮ−β及びＩＬ−２以外の蛋白質
はリンホトキシン（原動壊死因子）、コロニー刺激因子
−１、及びＩＦＮ−α１である。候補蛋白質は通常奇数
のシスティン残基分有するであろう。

ＩＦＮ−βの場合において、グリコジル化されたＩＦＮ
及び非グリコジル化ヒＩＦ’Ｎの両者が定性的に同等の
比活性を示すこと及び、従ってグリコジル部分はＩＦＮ
−βの生物学的活性に関係せず又は寄与しないことが文
献に報告されている。しかしながら、微生物的に生産さ
れた非グリコジル化ＩＦＮ−βはグリコジル化されてい
る天然ＩＦＮ−βより定量的に低い比活性を一貫して示
す。ＩＦＮ−βは１７位、３１位及び１４１位に３個の
システィン残基分有する。システィン１４１が生物学的
活性のために必須であることが５ｈｅｐａｒｄ等、前掲
、によシ証明されている。４個のシスティン残基金含有
するＩＦＮ−α中には２個の分子内−８−８−結合が存
在し、１つはｃｙｓ　２９とａｙｓ　１３８の間にあり
、そして他方はｃｙｓ　１とａｙｓ　９８の間にある。

ＩＦＮ−βとＩＦＮ−αとの間の相同性に基いて、ＩＦ
Ｎ−βのｃｙｓ、１４１はｅｙｅ　３１との分子内−５
−Ｓ−結合に関与しており、ｅｙｓｌ　７は分子間架橋
を形成し得る状態にあるであろう。ａｙｓ　１７を除去
し又は他のアミノ酸で置換することにより、ｃｙｓ　１
７が生物学的活性に必須であるか否か、及び−８−８−
結合の形成におけるその役割を決定することができる。

Ｃｙｓ　１７が蛋白質の生物学的活性のために必須でな
ければ、ａｙｓ　１７が除去された蛋白質又はａｙｓ　
１７が置換された蛋白質は天然ＩＦＮ−βのそれに近い
比活性を示し、そしておそらく該蛋白質の単離及び精製
が促進されるであろう。ＩＦＮ−β遺伝子のａｙｓ　１
７のコドン全台む領域であって該コドン中の１個又は複
数個の塩基が変化しているものと相補的な合成オリゴＸ
クレオチドプライマーを用いるオリゴヌクレオチド指令
変異誘発法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｂｅ−ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いることに
よシ、選択された任意の他のアミノ酸によるａｙｓ　１
７の置き換えをもたらすデザイナ−遺伝子を調製するこ
とができる。除去するのが好ましい場合、オリゴヌクレ
オチドゾライマーはｃｙｓ　１７のコドンを欠く。ａｙ
ｓ　１７　ｋ：中性アミノ酸、例えばグリシン、ノぐリ
ン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フ
ェニルアラニン、ヒスチジン、）ｌＪ７’トファン、セ
リン、スレオニン又はメチオニンに変えるのが好ましい
方法である。セリン及びスレオニンはシスティンの化学
的類似体であるから、これらが最も好ましい箇換基であ
る。システィンが除去された場合、成熟ムティンは天然
の親衛白質又は微生物的に生産されたＩＦＮ−βよりア
ミノ酸１個だけ短い。

ヒトＩＬ−２は、蛋白質の５８位、１０５位、及び１２
５位に位置する３個のシスティン残基分有することが報
告ざｎている。ＩＦＮ−βの場合と同様に、ＩＬ−２は
細菌細胞から単離された場合年令したオリゴマー形で存
在し、そして細菌抽出物から良好な収量を得るためには
還元剤によシ還元しなければならない。さらに、精製さ
れ還元されたＩＬ−２蛋白質は不安定であり、そして貯
蔵の際に不活性なオリゴマー形に再酸化されやすい。

３個のシスティンの存在は、再酸化に際して３抽知の可
能な分子同ジスルフィド価の１つが不作為的に形成され
、その内の１つのみが天然分子中に存在する正しい架価
であることを意味する。天然ＩＬ−２蛋白質のジスルフ
ィド構造は知られていないから、この発明を用いてＩＬ
−２のコドン５８．１０５及び１２５に変異を形成し、
そしてどのシスティン残基が活性のために゛必要であり
従って天然のジスルフィド橋形成に関連しているらしい
かを同定することができる。おなし考えにそって、遊離
システィン残基の除去又は置き換えによって正しくない
分子内ジスルフィド橋の形成を防止し、そして分子間ジ
スルフィド橋の形成の機会を最少にするように、活性に
必要でないシスティン残基を変えることができる。

酸ｆヒすることができる天然蛋白質の合成対応物（前記
のムティンを包含する）は遺伝子工学的技法で製造され
る。これらの方法は典型的には、天然蛋白質全コードす
る構造遺伝子全同定しそして％機付け、この遺伝子又は
天然蛋白質の機能的に同等なムティンをコードする変異
遺伝子を単離又は合成し、該遺伝子全過当な発現ベクタ
ー中の眩遺伝子の発現全可能にする位置に挿入し、該ベ
クターによりコンピテント微生物を形質転換し、正しい
形質転換体を同定し、そして該形質転換体全適当な増殖
培地中で培養することを含む。蛋白質は典型的には、細
胞を破砕し、破砕物を溶解剤（蛋白質の溶解性に依存し
て）及び１種又は複数種の抽出剤で処理することにより
粗蛋白質を分離し、セして粗蛋白質を種々の調製用クロ
マトグラフ法によって精製することにより回収される。

蛋白質がオリゴマーの形で、又は回収中にオリゴマーを
形成しやすい形で微生物により産生される場合には、こ
の蛋白質は回収工程の適当な段階で還元剤によシ処理さ
れるであろう。

合成蛋白質を粗生成物の形で、実質上純粋な形で、又は
純粋な形で微生物から回収した後、必要によシこれを還
元し、そして次にこの発明の方法を用いて制御された態
様で酸化する。この発明に従う制御された酸ｆヒによシ
天然対応物中のジスルフィド橋と一致するジスルフィド
橋が合成蛋白質、中に形成され、この場合過剰酸化、及
び非協調的（ｎｏｎｃｏｎｆｏｒｍｉｎｇ　）架橋又は
オリゴマーの形成が伴わず、又はこれらは最少にとどま
る。このような酸化により、天然対応物の構造（ｃｏｎ
ｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）と最も密接に類似する構造の合
成蛋白￥ｉ（を高収量で製造することが可能となシ、こ
れにより合成蛋白質が機能的に天然蛋白質と同等で”あ
る可能性が保証される。

この発明において使用される酸化剤（０−イオドソベン
ゾエート）はシスティン残基金選択的、且つ化学量論的
にＨ（ヒする。ここで、「選択的」なる語は、酸化剤が
（１）システィンをジスルフィドのレベルまで酸化し一
層旨いレベルには］駿化しな因か有意には酸化せず、そ
して（２）還元された蛋白質中で接近して位置する活性
システィンＫｌ先的に酸イヒすることを意味する。酸化
剤と合成蛋白質とのモル比は使用する酸化剤に依存して
広範囲に変えることができる。モル比は少なくとも理論
量比（１：１又はこれより大）であり、そして典型的に
は１：１〜１００：１の範囲である。０−イオドソペン
ゾエートの場合、モル比は通常約１：１〜約５二１の範
囲である。すべての場合に、還元された蛋白質の完全な
酸化全保証するため、反応の終末期間にわたって酸化剤
を過剰に存在せしめる。これらの条件は、反応の全期間
にわたって過剰の酸ｆヒ剤を用いて反応を行うか、又は
反応の大部分の期間にわたっておよそ等モル量の反応体
を用い、そして反応期間の終末近くで過剰の酸化剤ヲ加
えて反応ヲ行うことにより達成することができる。蛋白
質音特にオリゴマー１ヒしやすい場合、酸化剤について
擬イυ−次反応（’５ｅｕｄｏ　ｆｉｒｓｔｏｒｄｅｒ
　ｋｉｎｅｔｉｃｓ）が生ずる割合で反応体を用いるの
が好ましい。このような速度は、酸ｆヒ剤が上記のモル
比の範囲内でわずかに過剰に存在する場合に生ずる。反
応混合物中の蛋白質の濃度は、オリゴマーの形成の可能
性全低下せしめるため、低く維持する。すなわち、約５
　ｒｎｔ）　／　ｍ１１．より低くシ。

通常は約０．１〜約１．５■／　ｍｌであり、そして好
ましくは約０．３〜約０．７　ｍｙ　／　ｍｌである。

反応媒体のＰＨは、酸化されろシスティン残基のｐＫａ
よシ少なくとも０．５ｐＨ単位低いレベルに維持する。

これらのａ数の残基のｐＫａが異る場合、最も低いｐＫ
ａを有するシスティン残基のそれより少なくとも約０．
５　ｐＨ単位低いレベルに維持するのが好寸しい。この
ようにＰＨ全制御することによって非イオン化チオール
の量が制御され、これによって反応速度が制御され、所
望の・ジスルフィド橋の形成に有利にされる。上記の特
定された…より有意に高いＰＨ′！ｆ−使用することに
より不所望の異性体及びオリゴマーの生成が増加する。

本質的に爾い…、すなわち約９よシ高いｐ）ｌによりオ
リゴマーの形成が増加し、従ってこのよう々…はほとん
どの場合において推奨されない。合成ＩＦＮ−βについ
ては、ＰＨを６〜９の範囲、好ましくは６．５〜８０の
範囲に維す、する。合成ＩＬ−２については、ＰＨ全５
．５〜９の範囲、好ましくは７．０〜８．０の範囲に維
持する。

チオールのｐＫａ値は、　Ｉｒｖｉｎｇ　Ｒ，Ｊ’、等
、アク（１９８１）リリ４２５６−４２６６　：及び５
ｎｙｄｅｒ　Ｇ、Ｈ。

等、ビオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（
１９８１）２０：６５０９−６５１９に記載されている
方法により決定することができ、そしてこの決定から所
与の合成ポリペプチドについての望ましい一範囲を計算
する。この方法に代えて、所与の合成蛋白質全酸化する
ための実施可能なそして好ましいｐａｔ実験的に決定す
ることもできる。

酸化反応時間は反応混合物の容積に依存するであろう。

反応温度は臨界的ではなく、通常は２０℃〜２５℃の範
囲であシ、便利には室温である。

酸化反応はＰＨを反応が停止するレベル（約ｐＨ４，５
）に下げることによシ停止することができる。反応に続
いて、残留酸ｆヒ剤、並びに不所望の異性体及びオリゴ
マーをクロマトグラフィーにより除去することができる
。必要によシ、グル沢過、高速液体クロマトグラフィー
、透析等のごとき蛋白質精製法を用いて、酸化された蛋
白質をさらに精製することができる。

酸化された蛋白質のための好ましい精製法の１つにおい
ては、ドデシル硫酸ナトリウム又は〇−イオドソ安息香
酸のごとき小分子量種ヲ、透析よりむしろグル濾過、例
えばセファデックスＧ−２５脱塩カラムを使用して、不
白質プールから除去する。このグル濾過法は一般に精製
のための簡単な、迅速な、確実な、穏和な、高収率の方
法を代表する。インターフェロン−β及びＩ　、Ｌ　−
２ｉ精製するために、Ｇ−２５脱塩力ラム段階を用いて
酸化中に存在する可溶ｆヒ洗剤ＳＤＳ　全除去すること
ができる。ＩＦＮ−βについては、ｐＨ６〜８の中性溶
液中ではインターフェロン−βが溶解しないため、１０
ｍＭ＊酸化ナトリウムのアルカリ性環境が一般に要求さ
れる。透析によればインターフェロンがｐＨ１２のアル
カリ性環境に４〜５時間かけられ、その結果サンプルに
不均一性が導入される。グルｐ過によＪｌ、１４１２で
の全インキュベーション時間が流速に依存して単に２０
〜７０分間に短縮される。さらに、ＰＨ１０，３〜１１
という一層低いｐＨ値においてＧ−２５脱塩カラムを使
用することができる。これら２つの改良により、透析後
のインターフェロン−βに観察される不均一性が除去さ
れる。グル濾過を用いる場合の唯一の欠点である蛋白質
の稀釈は、サンプルの負荷を最適化することにより、そ
して最小の粒子サイズの銘柄を選択することにより調節
することができる。その上、はとんどの方法においてグ
ル濾過は最終段階ではなく、サンプルの濃縮又は一層の
稀釈が生ずる。

制御された酸化により製造された調製物は、その天然対
応物のジスルフィド橋を有する合成蛋白質から本質上成
る。このものはオリゴマーを実質上含有せず（約１重ｆ
ｔ％未満）、そして天然対応物と異るジスルフィド橋を
有する異性体を１５重量％未満含有する。異性体の形成
の可能性を除去するために設計されている合成蛋白質（
例えは、１２５位のシスティンがセリンに変えられてい
るＩＬ−２、又は１７位のシスティンがセリンに変えら
れているＩＦＮ−β）は、葛°うまでもなく異性体を含
有しない。これに対して、制御されない酸化により製造
された調製物は、典形的には有意量のオリゴマー（５〜
１０チ）及び非常に多量の不所望の異性体を含有する。

ＩＬ−２及びＩＦＮ−βの場合、酸ｆヒされた蛋白質は
還元されたものより水溶性である。従って、溶解剤（例
えば５ＤＳ）’ｔ−調製物から実質上除去することがで
き、精製された生成物は十分に水溶性であって、常用の
水性非経口担体と共に製剤化することができる。

制御された酸ｆヒにより製造された調製物は、制御され
ない酸ｆヒによ抄製造された調製物に比べて一層多くの
目的生成物及び一層少ない汚染物を含有するため、これ
らは抗原性が少なく、そして一般に一層活性が強いであ
ろう。医療用蛋白質の調製物は、医療的に有効な量の蛋
白質を医薬として許容される担体と共に含んで成る。Ｉ
ＦＮ−β及びＩＬ−２の場合、調製物は一般に水性担体
、例えば蒸留水、リンダル液、バンク液、及び生理的食
塩水中で非経口投与剤として製剤化される。ＩＦＮ−β
は一般にヒトに対して１×１０〜４×１０　ユニットの
範囲の投与量で投与され、ＩＬ−２は一般に約Ｉ　Ｘ　
１０’〜２×１０８ユニツトで投与されるであろう。

次に、例によっ−ここの発明をさらに具体的に説明する
。但し、これによってこの発明の範囲を限定するもので
はない。これらの例において、温度・　は特にことわら
ない限υ℃で示す。

例１．　ＩＦＮ−βｓｅｒ　１７の樹御された酸化ＩＦ
Ｎ−βＢＱｒ　１７はＩＦＮ−βの微生物的に製造され
たムティンであり、アミノ酸位置１７のシスティン残基
がセリン残基により置き換えられている。

ＩＦＮ−β５ｅｒ１７ｕ２個の維持されたシスティン残
基金、一方は３１位に、そして他方は１４１位に有する
。天然ＩＦＮ−βにおいては、３１位及び１４１位のシ
スティンが相互反応してジスルフィドａを形成する。工
ＦＮ−β８ｅｒ１７　’ｆｃ製造するためにこの例にお
いて使用される遺伝子操作されたＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏ
目）株は、アメリカン・タイプ・カルチーア・コレクシ
ョン、１２３０１パークラウンドライブ、ロックビル、
メリーランド２０８５２．米国に、１９８３年１１月１
８日に１１０．３９，５１７として寄託された。

遺伝子操作したＥ、コリ金欠の培地に増殖せしめた。

、シン下ダ５ｒ：１ Ｎａｓシトレート・２Ｈ２０３ｍＭ ＫＩ（２ＰＯ４３０ｍＭ （ＮＨ４）２８０４７４ｍＭ Ｍｇ　ＳＯ４・７Ｈ２０３ｍＭ ＭｎＳＯ４”Ｈ２Ｏ４６ｔｔＭ ＺｎＳＯ４−７Ｈ２０４６μＭ ＣｕＳ０４’　５Ｈ２０１−２ｔｔＭ Ｌ−）リットファン　３５０μＭ ＦｅＳＯ４’７Ｈ２０７４μＭ チアミン・ＨＣｌ　Ｏ，００２％ グルコース　０．５チ ダウコ一ニングアンチホームＢ２５％溶液、グルコース
５０％ｍ液、及び５ＮのＫＯＨ’ｉ必要によシ加えた。

温度を３７±１℃に、ｐＨｆ　ＮａＯＨにより６．５±
０．１に、セして溶存酸素を３０％の空気飽和にそれぞ
れ維持した。光学両度及び残留グルコースの測定を１４
時間目、及びその後約１時間の間隔で行つた。グルコー
スの消費量が４０±６１／ｌ　（６８０ｎＭにおける０
Ｄ＝１０〜１１）に達した時に培養物を得た。これを加
圧下でミクロポーラスクロスフローフィルターを通して
循環させることにより約３倍に濃縮した。収得物が４〜
５倍に濃縮されるまで、譲縮細胞を脱イオン水に対して
透析した。

次に、４．１〜５゜Ｉ　Ｘ　１０４Ｋｐａにて細胞’ｊ
ｉ７Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーを通す
ことによシ破砕した。最初の通過の後、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ　）−燐酸ナトリウム緩衝液ｆｃ２％
ＳＤＳ、０．０８Ｍ燐酸ナトリウムとなるように加え、
そしてホモジナイズヲ感らに１時間続けた。次に固体ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ　）　ｉ終旋度が５０ｍＭと
なるように加え、そしてホモシネ−ＦｉｌＯ分間９０±
５℃に加熱した。得られた細胞懸濁液を、２−ブタノー
ルを用いて、２−ブタノールとＮ濁液との容積比全１：
１として静置ミキサー中で抽出した。次に混合物全遠心
し、そして２−ブタノール高含有相金集めた。

２−ブタノール高含有相を、燐酸緩衝ｆヒ塩浴敢（ＰＢ
Ｓ　）中０．１％ＳＤＳ　２．５容量と混合した。固体
ＤＴＴを最終濃度が１ｍＲＩＩになるように加えた。混
合物のＰ”ａ＝、氷酢酸を用いて６．２±０１に調節し
、そしてこの混合物を遠心した。得られたペーストを集
め、そしてＰＢＳ＋１０％ＳＤＳに再懸濁しｌＮＮａ０
Ｈｉ用いてｐｉ４を８．５±０．１に調整した。固体Ｄ
ＴＴ　’ｉ最終龜度が１００ｍＭとなるように加え、そ
して懸濁液を１０分間９０±５℃に加熱した。

次に、懸濁液を約２５℃に冷却し、そして氷酢酸を用い
てＰＨ全５．５±０．１に調整し、そして浴液孕ｐ遇し
た。

次に、浴液を七フアクリルＳ−２００前カラムに適用し
、そして産品のインターフェロン活性を有する両分をプ
ールし、セして１０　ｋｄａ１分子箪カット−オフの限
外沖過により濃縮した。

０−イオドソ安息香酸を水中で混合し、この混合物を約
５分間超音波処理し、そして次に攪拌し。

２％ＮａＯＨｆ徐々に加えて最終ｐｔｉ２８．２±０．
２とする（塩基を加える代りに追加の超音波処理を行う
こともできる）ことにより１　ｍＭ　ｏ−イオドソ安息
香酸溶液を調製した。

Ｎａ４Ｆ２０７”１ＯＨ２０全水１ｃ２ｍＭの濃度に溶
解することにより反応綴部媒体をｊｊｉ’４ｊ製した。

この浴液（７）　ｐＨを、】０９Ｓ酢酸を加えることに
より９．０に調製した。ＳＤＳを０１％に、エチレンソ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）　”ｃ　Ｏ，１ｍＭに、ナ
して０−イオドソ安息香酸溶液ｋ　１５　Ｘ　１０−６
Ｍとなるように前記溶液に加えた。

緩衝媒体を、マグネチックスターラー及び９．０にセッ
トされたＰＨ電電極製装着た反応器に入れた。

ＩＦＮ−β５ｅｒｊ７調製物及び０−イオドソ安息香酸
溶液を、ＩＦＮと叡化剤の等モル量を導入するように調
製されたベリヌタルポンｆ−１１用いて、保持タンクか
ら反応混合物に加えた。必要な場合に０．２５Ｍ　Ｎａ
ＯＨ全ペリスタルポンｆを介して５　ｍｌ　７時で加え
ることによシ反応混合物のｐｌ−１ｉ９．ＯＫ調節した
。ＩＦＮ−β溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液中５ｍ９／ｍｌ
　、　ｐｌ４５．５　）　’ｒ　２ｍノ／時（７，０マ
イクロモル／時）の流速で約５時間にわたって加え、０
−イオドソ安息香酸溶液ｆ　７　ｍｌｌ　７時（７マイ
クロモル／時）で同じ時間にわたって加えた。その後、
酸溶液の添加を、１０〜１５モルの最終過剰量となるま
で続けた。逆相ＨＰＬＣにかけ、そしてＩＦＮ−β８ｅ
ｒ　１７の残留チオール含量ｉＥ１１ｍａｎ法により測
定することにより反応を追跡した。６．５時間後、反応
混合物に１０チ酢酸を加えて、Ｈを５．５にすることに
よシ反芯を停止した。

結果 反応の最初２〜３時間の間、オリゴマーは形成きれず又
は低いレベル（〈１％）のみのオリゴマーが形成された
。反応の後の段階においてオリゴマーのレベルが実質上
低下した。酸化生成物は遊離チオール全含有せず、そし
て９６％を超える収率で目的酸化生成物を得た。

比較として、０−イオドソ安息香酸（２■／ｒｎｌ）を
反応混合物に５ミリモルの濃度に１度に加えることによ
りＩＦＮ−β５ｅｒ１７の酸化を行った。この酸化によ
り１０〜１５％のオリゴマーが生成し、そして目的の叡
（ヒＩＦＮが中程度の収率（８０％）でのみ得られた。

た酸化 十分に還元された形のＩＦＮ−βｓｅｒ　１７゜浴液を
調製するため、最終前−カラム段階を除き例１に記載し
た方法を用いた。ＤＴＴ中１〜２ｍノ／ｒｎｌの溶液す
べて１ｓ−２００カラムに通し、そして酢酸ナトリウム
緩衝液（５０ｍＭ　、　ｐＨ５，５、０，１％　５ＤＳ
）で溶出した。Ｓ　−２Ｑ　ＯＩＦＮ−βゾールを、燐
酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７，５、０，１％　ＳＤＳ　
）を加えることにより０．１　ｍｆｊ／ｍｌ　（５８Ｍ
　ＩＦＮ−β）に稀釈した。溶液のｐＨを７．５に調製
した１、酸ｆヒ剤であるイオドソ安息香酸（２ｍｙ　／
　ｌｕｌ　）をＩＦＮ−β浴数に加え、最終濃度を４０
μＭとした。このＩＦＮ−酸化剤溶液を、室温にて空気
中で穏やかに攪拌しながら３時間保持した。２，２′−
ジチオゾビリジンを用いて蛋白質浴液のチオール含量を
監視することによシ酸化を追跡した。アミコンセルを用
いてＩＦＮ−βｙ５．１０ｍ９／ｍに謎縮し、そしてＳ
−２００カラムのために使用したのと同じ緩衝液を使用
しながらＧ−７５カラムを通し゛た。最終ＩＦＮ−β濃
度は２〜３　ｍｅ）／　ｍｌであった。

充填レシーバ−（ｉ＋有する２、６Ｘ７０ｃｒｎのガラ
スカラム（ファルマシア）にセファデックスＧ−２５０
微細銘柄）のあらかじめ膨潤したグル浴液６００ｍ１を
充填した。

前段階からの全量１　ｏｍｌ（１，４４ｍｙ／ｒｎｌ＞
）ＩＦＮ−β全カラムに導入し、そしてｌ　ｍＭ　Ｎａ
ＯＨ爵液（ｐＨ１０，８）を用いて溶出した。流速は２
５０ｍｙ／時となった。約９８優の蛋白質ピークを一緒
にし、そして蛋白質訣度、ＳＤＳ及び生物学的活性につ
めて分析した。さらに、逆相ＨＰＬＣ３び５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥダルを得た。

３、逆相ＨＰＬＣ法 カラムから集められた蛋白質サンプルを、濃トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ　）　ｅ添加することによってＰＬ１２
〜３に酸性化した。アクアポア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）カ
ラムに２０〜２００μＡｋ注入することによりＨＰＬＣ
追跡を行った。サンプルの溶出は２１４ｎｍで追跡し、
２溶剤系及び溶剤Ｂの４５〜６０％グ２ジエント（溶剤
Ｂはアセトニトリル中０．１ｑ６ＴＦＡであり、溶剤Ａ
は水中０．１１　ＴＦＡ　テあル）ヲ用いて行った。流
速ｆ　２ｒｕｌ　７分とし、チャートスピードｉ０．５
ｃｒｎ／分とじた。ピークの面積をめるためにＨｅｗｌ
ｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ積分器を用いた。

４、ＳＤＳの決定 アクリジンオレンジ測定によりＳＤＳの決定を行った。

１３Ｘ１００ｍのディスポーザブルねじぶた試験管にＩ
ＦＮ−βサンプル（０，５ｍ１）を入れ、次にＮａＨ８
Ｏ４（０，１ｍｌ、１．７５　Ｍ　）　、アクリジンオ
レンジ（０，１ｍｌ　、　Ｉ　Ｗ／Ｖ％）及び最後にト
ルエン（ｘ、５−）ｋ入れた。試験管を密閉し、そして
２〜３分間渦流攪拌した。試験管を５〜１０分間遠心し
た。相分離の後有機相を石英キュビットに移し、そして
ブランク（０，５ｍｌの水）に対して５００　ｎｍにお
ける吸収を測定した。

−βの製剤化 ＮＳＡを用いるＩＦＮ−βの製剤化に′おいてまず最終
容積ファクター（Ｆ、Ｖ、）　’！に計算して製剤化に
必要なＮＳＡ容積、デキストロース容積及び水容積をめ
た。

最終容積（Ｆ、Ｖ）　＝　ＩＦＮ−β１０．２５ＮＳＡ
容積〔Ｖ（ＮＳＡ））＝１．２５／２５ＸＦ、Ｖ。

デキストロース容積［Ｖ（Ｄｅｘｔ）］＝１．２５１５
０ＸＦ、Ｖ。

水容積＝　Ｆ、Ｖ−〔ｖ（ＩＦＮ−β）＋Ｖ（ＮＳＡ）
　＋Ｖ（Ｄｅｘｔ　）　＋Ｖ（ｎｅｕｔ）） 典型的々方法によシ、ＮＳＡ　（３，９ｄ　、　トラペ
ノールから得られた２５チ溶液）ｉ４ｓ＋＋＋Ｊの水と
混合した。ＮａＯＨ（２，５Ｎ　）溶液を用−てｐＨ’
ｉ１２に上げ、そして電極により監視した。ＩＦＮ−β
溶液（２０＃＋７り２加え、そして混合物を１５分間声
１２に保持した。ＨＣｌ　（２，５Ｎ又は０．２５Ｎ）
溶液を用いてＰＨを徐々に７．２３に下けた。声調整に
約１０〜１５分間を要した。水（２ｒＩＬｌ）及びガキ
ストロース（１，９Ｍ、５０％）を加えた。最終ＩＦＮ
−β濃度を０２５η／ｄとした。最終的に製剤化された
溶液’！ｒ０．２ミクロンのＮａ１ｇｅ殺菌フィルター
に通し、そして濾過された溶液をバイアルに充填する（
各バイアルに１ｒｎｌずつ）。バイアルを凍結乾燥し、
そ［２て蓋をした。ｐｔｉ　ｋ　７．３に下げた後オリ
を生じず透明なままであった。

６、生物学的活性 ＩＦＮ−処理細胞からのウィルス収率の直接測定である
収率減少測定法により生物学的活性を決定に記載されて
いるＳｔｅｗａｒｔ及びＬＯｃｋｈａｒｔの方法によっ
た。

７、結果 ５ＤＳ−ＰＡＧＥグル及び逆相ＨＰＬＣ追跡の結果は、
酸化されたＩＦＮ−β調製物が均一であり、そして基本
的に純粋であることを示した。第１表に吸約する酸化さ
れた物質についての２試行の結果は、酸化されたＩＦＮ
−βのゾールを脱塩してＳＤＳを許容レベルにするため
にグル濾過Ｇ−２５カラムが効果的であることを示して
ｂる。ＳＤＳのレベルはアナリティカル・ビオケミスト
リー（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、　）　Ｖｏｌ　１１８
．　１３８−１４１頁（１９８１）に記載されているア
クリジンオレンジ法により、容積及び声レベルをわずか
に変えて測定したものである。カラムにおける全時間は
、ＳＤＳ除去効率に影響を与えることなく３０分間と短
かくすることができた。Ｇ−２５プール中のＤＴＴレベ
ルはほとんど検出され彦かった。カラムからのＩＦＮ−
βの回収は本質的に定量的であシ、そして稀釈ファクタ
ーは２未満である。逆相ＨＰＬＣ追跡は、ｉ　ｍＭＮａ
ＯＨｔＰｐＨ１０，８での酸化された形のＩＦＮ−βの
インキュベーションによシ、少なくともＨＰＬＣ法で測
定した場合にはＩＦＮ−β調製物中に不均一性が導入さ
れないことを示している。ＨＰＬＣ追跡はさらに、ＮＳ
Ａで製剤化されそして濾過されたＩＦＮ−βは５日後で
も変化しないことを示している。

Ｇ−２５脱塩蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ還元グルはさら
に、単一蛋白質が得られたことを示している。

蛋白質の生物学的活性はこの変法の全段階を通して本質
上同一に維持され、酸化されたＩＦＮ−βけケ°ル沖過
段階にわたりて本質上変化しないで維持されることが示
された。

第１表 緩衝液　１　ｍＭ　ＮａＯＨ１ｍＭ　Ｎａ０Ｈｐｌ（１
ｏ、ｓ　１ｏ、５ ＩＦＮ−β溶液の容積（ｍｌ）　ｔｏ　ｔ。

ＩＦＮ−β濃度（ｍｉｍＡ）　１　１．４４Ｇ−２５プ
ールの容積（ｍｌ）　２８　３０回収率（％）　９９　
９９ 流速（ｍ／ｈｒ、）　３００　２５０ 力ラム中全時間（分）　３２　３７ ＳＤ８レベル（μｇΔを）　２１　２１生物学的活性（
Ｕ膚）　９．ｌＸ１０　９．２Ｘ１０７ゾラスミドＩ）
ＬＷＩによシ形質転換されたＥ、コリに−１２ＭＭ　２
９４株（アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクシ
ョンに、Ｉ　９８　’３年８月４日付でＡＴＣＣＡ　３
９　、４０５として寄託された）からＩＬ−２ｉ次のよ
うにして回収した。

遺伝子操作されたＥ、コリを、発酵槽中で次の増殖培地
を用いて増殖せしめた。

（ＮＨ４）２ＳＯ４７２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４２１，６ｍＭ Ｎａ３シトレート　１．５　ｍＭ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０６０ｎｉＭ ＭｎＳＯ４ＱＨ２０６０ｍｙｉ ｃｕｓｏ４−５ａ２ｏ　２　ｍＭ オートクレーブ処理した２、　５　Ｎ　ＮａＯＨによシ
ＰＨを６．５０に調整。

無菌的添加（オートクレーブ処理後） ＭｇＳ０４・７Ｈ２０７Ｈ２ Ｏ３Ｓｏ　、ａ　１００　μＭ Ｌ−）リゾトファン　７０　ＷＪ／ｌ チアミン−ＨＣｌ　２０１ｆｌｆ？／１３グルコース　
５１１／１３ テトラサイクリン　５　ｍ９／ｌｌ エタノール（場合によシ加える）　２％カザミノ酸　２
％ 必要があればダウコーニングアンチホームＢ２０チ溶液
、グルコース５０チ溶液及び５ＮのＮａＯＨを加えた。

発酵槽のｐｆ（’ｅ　５　Ｎ　ＫＯＨにより６．８に維
持した。

残留グルコースを５〜１０ｇ／ｌの間に、溶存酸素を４
０％に、そして温度ｆ！：３７±１℃に保持した。０Ｄ
６８ｏが約１０〜１５となったときカザミノ酸（２０％
ストック溶液）を加えた。エタノール添加の２時間後に
収得した。カザミノ酸濃厚液全添加して３時間後にエタ
ノール（９５％）を最終濃度が２％となるように加えた
。

クロス−フロー限外ｐ過ユニット中で細胞Ｋｌ縮した。

細胞全洗浄し、そして次にＭａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ
ホモジナイザー中で破砕した。細胞破砕物を遠心分離し
た。ペーストを４Ｍ尿素中に再懸濁しそして１５〜３０
分間放置した。尿素洗浄した断片を遠心し、Ｔｒ　ｌ　
５−ＨＣ６緩衝液（ＰＨ８，０）に再懸濁した。断片を
可溶化するため、固体ＳＤＳを５％ＳＤＳのレベルまで
加えた。

尿素洗浄溶液（２００ｍｌ）ｉ、ＤＴＴ　（１０ｍＭ　
）によシ、ＥＤＴＡ　（２，５ｍＭ　）の存在下ｐｌ（
８，０，６０℃にて３０分間還元した。懸濁液を３５Ｋ
にて２時間遠心した。上清液（３５ｍＡりをＳ−２００
（ｘ＜　−５０）カラムに負荷し、そして緩衝液Ｅ〔酢
酸塩ｐＨ５，５、ＤＴＴ　（２ｍＭ　）　、　ＥＤＴＡ
（１ｍＭ）及びＳＤＳ　（ｏ１％　）　）によｌ）１．
５ｍ１１分の流速で溶出した。Ｓ−２００プール（２７
０ＷＬｌ、Ａ２８ｏ−１，７７）はＨＰＬＣで測定した
場合約３３％の純度を有する。

Ｓ−２００７’−ル（３５ｄ）の部分をトリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ　）によシｐＨ２，０に酸性ｆヒし、そして
２．５　ｒｎｌ　７分の流速で新しく調製した半一調製
用Ｃ−３Ｖｙｄａｃカラム（１，３ｃｍ）に負荷した。

３５ｄずつ負荷してこれを３回行った。この半一調製用
精製に使用した溶剤はアセトニトリル（０１チＴＦＡ　
、緩衝液Ｂ）であシ、０〜４５チの緩衝液Ｂによる１５
分間のグラジェント及びこれに続く４５〜７５％の緩衝
液Ｂによる２００分間のグラジェントを行った。ＩＬ−
２７’−ルはＡ２８０　＝０．３２６ｙ有する７６ｍ１
（３試行）として得られ、これは約２５１ｎｇのＩＬ−
２、約１５チの収率に相当する。このＨＰＬＣ流出物ｆ
ｆ１１６０（１／！のＮａ２ＳＯ４緩衝液（０，Ｉ　Ｍ
　、　ｐ）（’ｙ、ｏ　、　０．１％ＳＤＳ　）中に稀
釈し、そして次に７６ｍｍＰＭ−１０メンプランを装着
したアミコンセルを用いて５０ｍ１Ｋ濃縮した。

この濃縮物を、０．１％のＳＤＳを含有するＮａ２Ｐ０
４（ｓ　ｏ　ｍＭ　）　ＰＨ７緩衝液５０ｍＪずつで３
回洗浄した。

最終容量は４３ｍｌ　、　Ａ２８ｏ＝　０．６５であっ
た。

制御された酸化を行うまえに蛋白質溶液の全チオール含
ｉｉ　２　、２’−ノチオジビリジンにより測定した。

この測定は、完全なｅ（ヒ全行うためにＩＬ−２溶液に
加えなければならない０−イオドソ安息香酸の最少理論
量を計算するために必要であった。０−イオドン安息香
酸（１３，４ｍ９）’！ｒ４５ｍノの水に入れ、この混
合物を数分間超音波処理し、そして次に攪拌しそしてＮ
ａ０Ｈ（ＩＮ）’ｔゆりくり加えて酸を溶解することに
より該酸の溶液（１ｍＭ、５０ｍ１＞を調製した。アル
′カリ溶液を加えて最終ｐｉ−１２ｓ、ｏ〜８．５にし
た。酸ｆヒ剤溶液の容量を最終容量５　Ｑ　ｍｌに調製
した。完全酸化に必要なｅ（ヒ剤の全量を決定するため
にスルヒドリル基の測定を行った。これは全チオール濃
度の２分の１＋１５マイクロモル過剰の酸化剤に相当す
る。

Ｉ　Ｌ　−２溶液（５０ｍＭＮａ２Ｐｏ４．ＰＩ（７又
は７．５）に０−イオドソ安、け香酸溶液ｉ　０．５　
ｍｌ／時の流速で加えることにより制御された酸ｒヒ全
行った。酸化の程度全逆相ＨＰＬＣによシ監視した。績
酢酸を用いて溶液のｐＨ’ｉ５．５に下げることにより
酸化全停止した。酸化生成物のＩ（ＰＬＣ分析によシ、
この生成物が約８０％の目的とする酸化されたＩＬ−２
、約１３％の不所望の異性体（異性体ケ集め、ＩＬ−２
活性について測定し、そして不活性であることが見出さ
れり）、及び約６チの還元された（酸化でれていない）
ＩＬ−２’ｉ含んで成ることが示された。

ｐｌ（７，５において行われた同様の酸化は、目的生成
物への有意に低い転換（５４％）をもたらした。

還元されたＩＬ−２の精製について記載したのと本質的
に同じ方法によ、り酸化きれた精製物を精製した。１３
ｃｒｎのカラムに２回の負荷（各２Ｑ　ｒｎｌ　）を行
った。個々の両分を分析用逆相ＨＰＬＣカラムで分析す
ることにより前記）（ＰＬＣのプール全決定した。２回
のＩＦ（ＰＬＣ流出液の全容量は１８ｍ１゜Ａ２８ｏ＝
０．２６６に相当し、これは酸ｆヒされＨＰＬＣネ゛製
さＡ７（ＩＬ−２約４．８ｍ９である。

５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ　ｆ用いて有機溶剤を除去した。試
験管を乾燥して有機溶剤を完全に除去した後、燐酸塩緩
衝液（０，１Ｍ　、　ｐＨ７，０）　ｆ加え、次に０１
ｄのＳＤＳ　（１％）′（ｉ−加え、そして完全に溶解
するために超音波処理した。全容量（３ｍｇ）をＧ−２
５（中間）カラム（１，５Ｘ　２３ｃＩｎ）に負荷し、
そして燐酸ナトリウム緩衝液（２ｍＭ　、ｐＨ７，５）
　ｋ用いて４５＃Ｌｌ／時で溶出した。得られた最終容
積は５、１　ｍｌ（’　０．６　ａｌ　／　ｍｌのＩＬ
−２含有）であった。

蛋白質濃度Ｉｔ　Ｌｏｗｒｙ法によシ測定した。硫酸ア
ル硫酸アルキルの全残量はＩ　Ｌ　−２１Ｑ当り約４２
μ９であった。

この精辺きれ酸化されたＩＬ−２のｐＨ７，５，５℃及
び室温における貯蔵安定性試験は、この物質が長時間安
定であることを示した（すなわち、Ｉ　Ｌ−２活性が変
化しないで維持された）。

酸化 Ｄｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２ａｅｒ１２５は、最初のＮ−
末端アラニン残基を欠込ておシそして１２５位のシステ
ィンがセリンによシ置き換えられて因ることにより天然
ヒトＩＬ−２と異るアミノ酸配列を有するＩＬ−２であ
る。この例において使用するＤｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２
ｓｅｒ１２５生産菌Ｅ、コリは１９８４年３月６日にＡ
ＴＣＣＡ　３９６２　’６として寄託されている。

ｚ伝子操作しりＤｅｓ−ａｌａ　ＩＬ−２ｓｅｒ１２ｓ
生産望−コ、、、！Ｊ　’に増殖せしめ、細胞を破砕し
、そして例２の一般的方法を用いて破砕物から細胞片を
回収した。

例２と同様にして４Ｍ尿素を用いて細胞片全抽出した。

得られた硬−ストを水性緩衝液に再懸濁し、そしてＳＤ
Ｓを用いて可溶化した。ＤＴＴ　、１５０　ｍＭを溶液
に加え、そして−８，５にて４０℃に加熱することによ
りＩＬ−２全還元した。混合物を冷却し、そしてそのｐ
ｉ（全５．０に調整した。次に、溶液を室温において、
１　ｍＭ　ＤＴＴ　を含有する２−ブタノールによシ１
：１の容量比で抽出した。有機抽出液１ｓ−２００カラ
ム上でクロマトグラフ処理（例２と同様にして）し、そ
して次に緩衝液Ｅを用いてＧ−２５カラム上で処理した
。

Ｇ−２５プールを、例２の一般的方法によシ酸化した。

酸化の後、Ｖｙｄａｃ　ＴＰ２１４　ノ母ｙキング、及
びＩＭ酢酸中プロノ４ノールの溶剤系（３５〜６０チゾ
ロパノールグラジエント、２００分間）を用いて酸化生
成物全精製した。次に、回収したＩＬ＼−２’１５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液、　ｐｔ（５，５、６ｍＭ　ＦｙｒＡＯ，
１チＳＤＳ中に稀釈し、そして２　ｍＭ燐酸ナトリウム
、　ＰＨ７，ｓ緩衝液を用いるＧ−２５カラムグル濾過
によシＳＤＳを除去した。得られた、酸化され精製され
た生成物は非経口投与用製剤を形成するために適当であ
る。製剤化された組成物は貯蔵のために凍結乾燥するこ
とができる。

特許出願人 シタス　コーポレイション 特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　楯 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 手続補正書 昭和６０年　６月２Ｚ日 特許庁長官　志　賀　学殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願　第０６２１９７号 ２、発明の名称 ７ステイン含有蛋白質の制御された酸化方法３、補正を
する者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 （外４　名） ５、？＄正の対象 明卸ｊ七ｃｂ　ｒ　！ｌ：ｊ１許請牙゛の範囲」の欄６
　補正の内容 特許請求の範囲を別紙の通りに補正する０７、添付書類
の目録 補正特許請求の範囲　１通 ２、特許請求の範囲 有用蛋白質と実質上同一のアミノ醒配列？有する微生物
的に生産寧れ７ζ合成蛋白質（前記シスディンは前記有
用蛋白質中では分子同結合してシスチンを形成している
）を′１ＩＪ１１＃さｆ１７こ因様において酸比し、こ
うすることＶＣニーて過剰１：装出と正しくない架橋の
シスチン基又はオリゴマーの形成ｒ最少１／Ｃとどめな
がら前記システィン牙選択的に酸ＩＬシて前記シスチン
ケ形成する罠めの製造的方法において、前記十分＆Ｃ還
元され罠微生物的に生産された合成蛋白賃金、水性媒体
中、前記シスディンのｐｋａニジ少なくとも約０．５ｐ
Ｈ単位低いｐＨｖｃおいて、０−イオドソベ／ゾエ−１
・と反応せしめ、この場合において反応混合物中のせ成
缶白賀の旋度會約５■／　ｍｌニジ低くしそして０−イ
オドソベンゾエートと蛋白質とのモル比を少なくとも理
論景的にし、但し反応の終点において０−イオドソベン
ゾエートが過剰に存在する、ことケ特徴とする方法。

２　前記有用な蛋白質が有用な生物学的活性を有する天
然蛋白質であムそして前”記分子内結合が該生物学的活
性に必須であシ又は該生物学的活性を増強する特許請求
の範囲第１項記載の方法。

３、前記蛋白質がＩＦＮ−β又はＩＬ−２である特許請
求の範囲第１項又は第２項のいずれか１項に記載の方法
。

蛋白質が （ｉ）　天然有用蛋白質と同一のジスルフィド橋を有し
； ５　約１係エク少ないオリゴマーケ含有すると物。

橋を有し； を有する異性体の含有量が約１５重量係より少々い；製
物。

ＩＦＮ−βが、 （ｉ）　天然ヒトＩＦＮ−βと同一のジスルフィド橋を
有し； ない； こと全特徴とする特許請求の範囲鎮４項記載の調製物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　有用蛋白質と実質上同一のアミノ酸配列を有する十
   分に還元された微生物的に生産された合成蛋白質（該ア
   ミノ酸配列はシスティンを含有し、このシスティンは前
   記有用蛋白質中では分子内結合してシスチンを形成して
   いる）を制御された態様において酸化し、こうすること
   によって最少の過剰酸化と非協調的シスチン基又はオリ
   ゴマーの最少の形成を伴って前記システィンを選択的に
   酸化して前記シスチンを形成するための製造的方法にお
   いて、前記十分に還元された微生物的に生産された合成
   蛋白質を、水性媒体中、前記システィンのｐＫａよシ少
   なくとも約０．５　ｐｉ（単位低１．−ｘ　ＰＨにおい
   て、θ−イオドソベンゾエートと反応せしめ、この場合
   において反応混合物中の合成蛋白質の濃度を約５■／　
   ｍｌより低くしそして。−イオドソベンゾエートと蛋白
   質とのモル比を少なくとも理論量的にし、但し反応の終
   点において０−イオドソペンゾエートが鍋剰に存在する
   、ことを特徴とする方法。 ２、前記有用な蛋白質が有用な生物学的活性を有する天
   然近白質であり、そして前記分子内結合が該生物学的活
   性に必須であり又は該生物学的活性を増強する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、前記蛋白質がＩＦＮ−β又はＩＬ−２であ′る特許
   請求の範囲第１項又は第２項のいずれか１頓に記載の方
   法。 ４、前記ＰＨが５．５と９の間である特許請求の範囲第
   １項〜第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５、前記合成蛋白質の濃度が約０３〜約０．７　ｍ’：
   １／ｒｒＬｌの範囲である特許請求の範囲第１項〜第４
   頓のいずれか１項に記載の方法、。 ６、前記酸化の後に酸化生成物をダル沖適法によシ精製
   する特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記
   載の方法。 ７、有用蛋白質と実質上同一なアミノ酸配列を有する合
   成蛋白質（該アミノ酸配列はシスティンを含有し、この
   システィンは前記有用蛋白質中では分子内結合してシス
   チンを形成してｂる）の酸化調製物であって、中前記天
   然有用蛋白質と同じジスルフィド架橋を有し、（１１）
   オリゴマーを実質上含有せず、そしてＧｉＤ前記天然有
   用蛋白質と異るジスルフィド橋を有する異性体の含量が
   約１５重量％未満であることを特徴とする調製物。 ８、オリゴマ〜の含量が約１ｍ８％未満である特許請求
   の範囲第７項記瞳の調製物。 ９、前記合成蛋白質が、生物学的に活性な蛋白質（この
   蛋白質は、ジスルフィド結合を形成することができそし
   て前記生物学的活性のために必須でない少なくとも１個
   のシスティン残基含有する）の合成ムティンであり、該
   ムティンにおいては前記システィン残基の少なくとも１
   個が除去されておシ又は他のアミノ酸によって置き換え
   られていることを特徴とする特許請求の範囲第７項又は
   第８項のいずれか１項に記載の調製物。 １０、前記合成ムティンがＩＦＮ−β又はＩＬ−２であ
   る特許請求の範囲第７項〜第９項のいずれか１項に記載
   の調製物。