JPH01160496A - 融合タンパク質の選択的分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、融合タンパク質の酵素分解によるポリペプチ
ドまたはタンパク質の製造方法に関する。

ポリペプチドおよびタンパク質を取得する上での組換え
ＤＮＡ技術の重要性が増大するに伴い、変化を受けた出
発材料に適した、生成物を濃縮し精製するための新しい
方法の開発が要請されている。

現在、多くのタンパク質が微生物中で融合タンパク質と
して合成されている。すなわち、所望のポリペプチドの
アミノ酸配列の前に異種タンパク質が置かれる（Ｆ、　
Ａ、　Ｏ，Ｈａｒｓｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、２４０（１９８（Ｓ）１〜１２）、一般に、融合タ
ンパク質は難溶性または不溶性であるために、いわゆる
封入体として細胞内に沈殿し、従ってタンパク分解によ
る分解から保護される。これによってこの主たる遺伝子
生産物の高収量および単離しやすさが保証される。

しかしながら、所望のポリはゾチドを得るには、酵素的
または化学的分解によって融合タン／ぞり質からそれを
分離しなければならない。分解には化学的方法がしばし
ば用いられる。何故ならば、融合タンパク質の難溶性に
対して適した方法にすることが至極簡単だからである。

しかしながら、実際上すべての化学的方法の場合：二、
不完全分解や、アミノ酸側鎖の不可逆的誘導体化による
副生物形成がみられる。常に、ポリペプチド鎖が非特異
的に分解する危険が存在している（Ｋ、　−に、　Ｈａ
ｎ　ｅｔ　ａｉ、、　Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１５、（１９８３）８７５〜８８４ン。更に、事の性質
上、所望のポリはプチド中にもしばしば存在する単一の
アミノ酸ζ二より分解特異性が主に決まることから、化
学的方法の使用は制約を受ける。

酵素的分画の方は、相当に緩やかな条件の下に行うこと
ができる。しかしながら、難溶性の融合タンパク質を溶
解し溶液状態に保つには洗剤、尿素または塩酸グアニジ
ン、すなわち酵素がしばしば失活する条件を用いなけれ
ばならないことから、−船釣な問題がこの場合に生じる
。

単一の特定のアミノ酸しか％！！！識しないプロテアー
ゼを用いることは、このアミノ酸が所望のタンノくり質
中にも存在することから、しばしば不可能である。一方
、いくつかのアミノ酸の極めて特定されたまれな配列し
か認識、分解しないプロテアーゼの利用可能性も低い。

従って、各物質口封して特異的な分解方法を見出すこと
が必要となる。そこで、極めて特別なまれなアミノ酸配
列のところでのみタンパク質に損傷を与えることなく分
解し、また難溶性融合タンパク質にも適用できる汎用性
分解方法をもつことができればそれにこしたことはない
。

リゾスタフィン（Ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）は１．ｖｓ
　胞ｙ　ヲ分解し、またスタフィロコッカス・シミュラ
ンス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｌｍｕｌａｎ
ｓ）（ＮＲＲＬ　Ｂ−２６２８；８１ｏａｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
　Ｂａｃｔ−ｅｒｉｏｌｏｇｙ、ＭＯｌ、　　５２．Ａ
２　（１９８２ン１７０〜１７４）により媒質中に分泌
される酵素として文献に開示されている。この酵素は実
質的にすべての既知ノスタフイロコツカス属の種を溶解
するが信組菌種は溶解しない。リゾスタフィンエンドプ
ロテアーゼは、スタフィロコッカス属のムレイン球形嚢
（ｍｕｒｅｉｎ　５ａｃｃｕｌｕｓ）のポリグリシン橋
のみを極めて選択的に分解するものと従来より考えられ
ている（Ｉｖｅｒｓｅｎおよび（）ｒｏｖ、　Ｅｕｒ、
　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、３８（１９７５）２９３〜５００）ｏ
更に、短鎖合成グリシループチドを用いたりシスタフイ
ン触媒作用によるトランスはプチド化実験が開示されて
いる（Ｇ、　Ｌ、　５ｌｏａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。

、Ｔ、１６７（１９７７）２９３〜２９６）。本発明者
らは今般驚くべきことに、リゾスタフィンエンドプロテ
アーゼがオリゴまたはポリグリシン配列を有する融合タ
ンパク質をも分解することを見出した。この分野の選択
性に対しては、この配列を細菌細胞壁の特異的立体関係
に組込むことは明らかに不要である。これによって緩和
な条件下（二融合タンパク質から所望のタンパク質を特
異的に取出すことが可能になる。

本発明は （Ｙ１・・・Ｙｍ）−（ＧＩＹ）ｐ＋ｑ−（Ｘ１・・・
Ｘｎ）（式中、（Ｙ１・・・Ｙｍ）−（ＧＩＹ）ｐは除
去されるべき配列を表わし、セして（ＧＩＹ）ｑ−（Ｘ
ｌ・・・Ｘｎ）はポリペプチドまたはタンパク質を表わ
し、ＸおよびＹは、相互に独立的（：、天然アミノ酸を
表わし、 ｍおよびｎは、１より大きい数値を表わし、ｐおよびｑ
は各々０より大きい数値を表わし、また ｐｌｑの和は２〜１００の自然数であり、そしてＹｍが
（）ＩＹを表わす場合にあってはｐ＋ｑがく２でありｐ
が０であることもでき、セしてＸ１がＧｌｙを表わす場
合にあってはｐ＋ｑがく２でありｑが０であることもで
きる） で示される配列を有する融合タンパク質を、オリゴまた
はポリグリシン配列に対して特異的なエンドプロテアー
ゼを用いて分解し、そしてこれにより遊離されたポリペ
プチドまたはタンパク質を、適切な場合には更なる化学
的または酵素的処理に付し、あるいは直接それを更に処
理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）することより成る、ポリペ
プチドまたはタンパク質の酵素分解による製造方法に関
する。

指数ｐおよび／またはｑの値に応じて、除去されるべき
配列および／またはポリペプチドまたはタンパク質は、
場合によっては、更なる酵素分解（二付される。

（Ｙ、・・・Ｙｍ）は融合タンパク質の製造に慣用され
る天然のまたは人工のタンパク質配列である。

適当な例は、一般に不溶性生成物を生じるβ−ガラクト
シダーゼ、トリプトファン代謝の酵素、またはこれらタ
ンノ２り質分子の一部、および可溶性発酵生成物の迅速
濃縮を容易化するポリペプチド配列（例えば抗体）など
である。

（Ｘｌ・・・Ｘｎ）は薬理活性ポリはプテドまたはタン
パク質を表わすが、または比較的高ｂ）分子量のプレカ
ーサー（その場合、所望の生物活性型のものは、更なる
処理１例えば正しいジスルフィド橋の生成を伴うフォー
ルディング（ｆｏ　ｌｄｉｎｇ）および／またはポリペ
プチド鎖の特異的分解などによって得られる）を表わす
。この−例としてはインシュリン生産の元となるプレプ
ロインシュリンが挙げられよう。

残基ＸおよびＹは、相互に独立的に、天然アミノ酸を表
わす（例えば、５ｃｈｒ６ｄｅｒ、　Ｌｉ１ｂｋｅ”Ｔ
ｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ″Ｖｏ１．　ｌ　、　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ　１９６５．１５７〜２７０頁およびａｏｕｂ
ｅｎ−Ｗｅｙｌ　”Ｍｅｔｈｏｄｅｎｄｅｒ　ｏｒｇａ
ｎｔｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ″（有機化学の方法ン’
Ｖｏｌ、　１５／１および２（ペプチド合成）　、Ｇｅ
ｏｒｇＴｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｓｔｕｔｔｇａｒ
ｔ　１９７４、Ａｎｎｅｘ参鳥。

次のものを特記することができる：　Ｇｌｙ、　Ａｌａ
、　−８ａｒ、　Ｔｈｒ％Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａ
ｓｐ％Ａｓｎ、　Ｇｌｕ。

Ｇｌｎ、　ＣｙｓｌＭｅｔ、　Ａｒｇ、　Ｌｙｓ、　Ｈ
ｙｌ、Ｏｒｎ、　Ｏｌｔ。

Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ％Ｔｒｐ、Ｈｌｓ、　ＰｒｏおよびＨ
ｙｐ　。

オリゴおよびポリグリシン配列に対して特異的なエンド
プロテアーゼとは、特にリゾスタフィンを示すものと解
されるべきである。（製造元：（Ｒ）　ＳＩＧＭＡ　Ｏ
ｈｅｍｉｅ　ＧｍｂＨ，Ｄｅｉａｅｎｈｏｆｅｎ；Ｒｓ
ｃｓｅｉ　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖｏｌ、８４゜（１９８７）１１２
７〜１１３１も参照）。

所望の生成物（Ｘ１・・・Ｘｎ）は任意の所望のグリシ
ン配列（Ｇ１’７）ｐ＋ｑによりタンパク質（Ｙｌ・・
・ｙｍ）に接続される。好ましい融合タンＡり質は、ｐ
＋ｑの和が２〜１００の自然数を表わすものである。

この関係において、比較的多数の連続グリシン残基は反
応速度に有益な効果を及ぼす。何故ならばその分解部位
はより接近しやすいからである。しかしながら、分解中
に酵素を立体的に障害しない１つ以上の他のアミノ酸な
短鎖オリ−ｆグリシン配列に接続しても同じ効果が達成
される。それ故、接続片の長さは、融合相手の構造特性
に適したものとすべきである。

分解条件は、極めて広い幅にわたって変えることができ
る。従って融合タンノぞり質の性質に適したものとする
ことができる。従って酵素／基質比を例えば１：１〜１
：１．ＯＯＯ，［］ＯＯとすることができ、また反応は
、６〜９、好ましくは７〜８の一範囲で、好ましくは２
０〜６０℃、特に３２〜４２℃、の温度で行うことがで
きる。適切な場合には、融合タン・ぞり質の難溶度に応
じて、その融合タンパク質を溶液状態に保つ助剤、例え
ば尿素、洗剤または塩酸グアニジンを添加することもで
きる。変性剤を添加することなく融合タンパク質の実質
的に完全な溶解を達成できる場合に分解が最も迅速に行
われるのであるが、リゾスタフィンエンドプロテアーゼ
は尿素の存在によって失活されることはなく、単に酵素
反応が遅くなるだけである。このことは、特に難溶性の
融合タンパク質の分解に利用することができる。一方、
原則的に、単に懸垂された封入体の断片化を（相応する
反応時間増大を伴って）うまく行うこともできる。（変
性剤を用いまたは用いない）融合タンパク質の溶液の場
合には、担体に結合した形のりシスタフインエンドプロ
テアーゼ（固定化酵素）を有利に用いそしてそれを再使
用のために回収することもできる。適当な酵素担体の例
は、無機担体例えばアルミニウムシリケート、およびポ
リマー有機担体例えばアガロース、例えば（Ｒ）Ａｆｆ
１・・・Ｇｅ１１０（阻〇−Ｒａｄ社）、セルロース、
アミノまた・はヒドロキシル基を有する変性ポリアクリ
ルアミドゲル、あるいは、アクリルアミド、メタクリレ
ート。

またはメタクリルアミドおよび無水マレイン酸の有機コ
ポリマーなどである。適切な担体結合酵素の製造は、例
えばＨａｌｗａｃｈｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ−ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ　Ｘ■（１９７７）１６６７〜１６７７（アルミニ
ウムシリケートへの固定）または西独特許出願公開第２
，９２ス５３４号（セルロースへの固定）などに記載さ
−れてｌ／する。

本発明による方法は融合タンパク質の選択的分解に適し
ているだけでなく一般に、適宜のポリペプチドに対して
も適用できる。

以下の実施例は、本発明の例示に役立つものではあるが
、本発明はそれらに限定するものではない。

これらのうち、実施例３および４は、実施例１および２
で得られた融合タンパク質分解がポリグリシン配列の取
り込みによるものであって（Ｘｌ・・・Ｘｎ）または（
ｙｌ・・・Ｙｍ）の分解によるものではないことを実証
するためのものである。

実施例　１ ポリグリシン含有融合タンパク質の分解β−ガラクトシ
ダーゼのセグメントが（Ｇｌｙ）、。

−ｏプチドおよび合成へキサペプチドを介してプロイン
シュリンに連結されている構築物を用いる。プロインシ
ュリンは融合タンパク質のカルボキシル端を形成する。

タンパ々り質を約４゜チ程度にまで濃縮する。

このタンパク質を緩衝液（８Ｍ尿素；５０ｍＭＴｒｉｓ
／ＨＣ／　；　ｐ！（７，５）　Ｈ２０Ｑ／−濃度とな
るよう溶解し、そして５０ｍＭ　Ｔｒｙｓ／ＨＣｊｌ、
　ｐＨ７５、および８Ｍ尿素、ｐＨ７，５、を用いて徐
々に希釈することにより各種尿素濃度（第１表参照）お
よび２Ｑ　／　ｒｎｔまたは１０Ｒｇ／−のタンパク質
濃度に調節する。リゾスタフィン（（Ｒ）　ＳＩＣ）Ｍ
Ａ　）を、各場合についてわずかに濁っていて３７Ｃに
保たれた溶液に酵素／基質の比が１＝１００または１：
１ｏｏＯで添加する。所定の時間にサンプル採取し、Ｓ
ＤＳ電気泳動により分析する。ポリグリシン配列（二お
ける融合タンパク質の選択的分解は、融合タンパクズバ
ンドの減少、および約１０，０００ダルトンだけ低い分
子量を有するガラクトシダーゼ断片の新しいバンドの形
成から明らかである。

第１表 ２　　　　１：１００　　　　　４　　　　　　　＞２
０２　　　　１：１００　　　　　５　　　　　　　　
２０２　　　　１：１００　　　　　２　　　　　　　
　　５２　　　　１：１００　　　　　　１　　　　　
　　　　　２１０　　　１：１００　　　　　２　　　
　　　　２０第１表は、　ＳＤＳ電気泳動のｖ！！１度
測定法（ｄｅｎ−ｓｉ　ｔｏｍｅｔｒｙ）によって評価
される、もとの融合バンド領域が５チを下回るまでの時
間を列挙したものである。得られた値は、尿素濃度およ
び酵素／基質比に応じて１〜２０時間である。融合タン
パク質の溶解に有益な還元剤、例えばジｔオニリスリド
−／Ｌ／　（ＤＴＥ、０１ｅｌａｎｄ試薬）の存在は酵
素の活性に対して顕著な影響を及ぼさない。

実施例　２ 懸濁液中の融合タンパク質の分解 実施例１と同じ構築物を用いるが、単離され乾燥した形
ではない。逆に、封入体を取得する際に慣用的に作られ
るような、約５０　ｆ／ｌ融合タンパク質を約２００？
／ｌ乾燥物（９０％タンパク質）で含有する懸濁液を用
いる。１０−のこの懸濁液を５０　ｍＭ　Ｔｒ　１ｓｌ
ＨＣ１１ｍ　７．５、を用いて２００−に希釈し、そし
て２０叩のりシスタフイン（（Ｒ）　ＳＩＧＭＡ）を添
加する。３７℃で２０時間後、ＳＤＳゲル電気泳動は非
断片化融合タン・ξり質をほんのわずかの残留痕跡しか
示さない。

実施例　６ プロインシュリンとりシスタフインとのインキュ（−ジ
ョン （ヒト）プロインシュリンを５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１
（ＣＩ！ｐＨ７，５に１ｘｗ７’ｉ濃度となるよう溶解
し、そしてリゾスタフィンを酵素／基質比１：１００で
添加する。溶液を３７℃に保つ。１．３．５および２０
時間後サンプルを採取し、そして逆相ＨＰＬＯＨより分
析する。これ（こよりリゾスタフィンによるプロインシ
ュリフ分解の証拠が全くないことがわかる。

実施例　４ ポリグリシン配列のない融合タンパク質の分解実験 β−ガラクトシダーゼのセグメントが合成へキサペプチ
ドを介してプロインシュリンに結合されている構築物を
用いる。プロインシュリンは融合タンパク質のカルボキ
シル端を形成する。

その融合タンツク質な約８０％程度まで濃縮する。この
タンパク質を緩衝液（８Ｍ尿素Ｈ５０ｍＭＴｒｉｓ／Ｈ
Ｏｌ；　ｐＨ７，５）に２０１９７−濃度となるよつに
溶解し、そして５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｈｏｌ、　ｐＨ
７，５、を用いて徐々に希釈することにより、　　２Ｑ
／ｍｌのりンパク質濃度となるように調節する。酵素／
基質比１：１００の９シスタフイン（（Ｒ＞　８Ｉ（）
ＭＡ）をやや濁りのある３７℃に保たれた溶液に添加す
る。

サンプルを８ＤＳ電気泳動分析しても、２０時間後でさ
え融合タン・ぞり質の分解はみられない。

特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（Ｙ＿１・・・Ｙ＿ｍ）−（Ｇｌｙ）＿ｐ＿＋＿ｑ
   −（Ｘ＿１・・・Ｘ＿ｎ）（式中、（Ｙ＿１・・・Ｙ＿
   ｍ）−（Ｇｌｙ）＿ｐは除去されるべき配列を表わし、
   そして（Ｇｌｙ）＿ｑ−（Ｘ＿１・・・Ｘ＿ｎ）はポリ
   ペプチドまたはタンパク質を表わし、 ＸおよびＹは、相互に独立的に、天然アミノ酸を表わし
   、 ｍおよびｎは、１より大きい数値を表わし、ｐおよびｑ
   は各々０より大きい数値を表わし、また ｐ＋ｑの和は２〜１００の自然数を表わし、そしてＹ＿
   ｍがＧｌｙを表わす場合にあつてはｐ＋ｑが＜２であり
   ｐが０であることもでき、そ してＸ＿１がＧｌｙを表わす場合にあつてはｐ＋ｑが＜
   ２でありｑが０であることもできる） で示される配列を有する融合タンパク質を、オリゴまた
   はポリグリシン配列に対して特異的なエンドプロテアー
   ゼを用いて分解し、そしてこれにより遊離されたポリペ
   プチドまたはタンパク質を、適切な場合には更なる化学
   的または酵素的処理に付し、あるいは直接それを更に処
   理することより成る、ポリペプチドまたはタンパク質の
   酵素分解による製造方法。 ２）リゾスタフインがエンドプロテアーゼとして用いら
   れる請求項１記載の方法。 ３）ｐ＋ｑの和が２〜５０の整数を表わす請求項１記載
   の方法。 ４）請求項１記載の融合タンパク質の、薬理活性ポリペ
   プチド製造への使用。