HU204894B - Process for producing polypeptides by enzymatic splitting of fusion proteins - Google Patents

Process for producing polypeptides by enzymatic splitting of fusion proteins Download PDF

Info

Publication number
HU204894B
HU204894B HU885958A HU595888A HU204894B HU 204894 B HU204894 B HU 204894B HU 885958 A HU885958 A HU 885958A HU 595888 A HU595888 A HU 595888A HU 204894 B HU204894 B HU 204894B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
fusion protein
gly
cleavage
fusion proteins
Prior art date
Application number
HU885958A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT50514A (en
Inventor
Michael Doerschug
Gerhard Seipke
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HUT50514A publication Critical patent/HUT50514A/hu
Publication of HU204894B publication Critical patent/HU204894B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Welding Or Cutting Using Electron Beams (AREA)
  • Exhaust Gas After Treatment (AREA)
  • Machines For Manufacturing Corrugated Board In Mechanical Paper-Making Processes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Techniques For Improving Reliability Of Storages (AREA)
  • Fuses (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás polipeptidek vagy proteinek előállítására fúziós proteinek enzimes hasítása útján.
A polipeptidek és proteinek előállításában a rekombinációs DNS-technológia jelentősége egyre nő, és emiatt igény jelentkezik a megváltoztatott kiindulási anyagokhoz idomuló új dúsítási és tisztítási eljárások iránt
Jelenleg számos protein mikroorganizmusokban szintetizálódik fúziós protein formájában, azaz a kívánt polipeptid szekvenciája elé idegen protein szekvenciáját iktatják [F.A.O. Harston, Biochem. J. 240 (1986)-112]. A fúziós proteinek - nehezen oldódó vagy oldhatatlan vegyületek lévén - a sejtben általában zárványtestecskék alakjában kicsapódnak, azaz proteolitikus lebontás nem fenyegeti őket Az ilyen primer géntermékek ezért magas hozamban egyszerű módon kinyerhetők.
A kívánt polipeptid azonban csak úgy nyerhető, hogy a fúziós proteint enzimesen vagy kémiai úton hasítják. A kémiai hasítás elterjedt, mert ez a módszer a legjobban adaptálható a fúziós protein rossz oldékonyságához. Gyakorlatilag minden kémiai hasítás során azonban nem teljes hasítás, valamint az aminosav- oldalláncok irreverzibilis reakciói miatt képződő melléktermékek figyelhetők meg. A polipeptidlánc nem spéci- 25 fikus lebontásának veszélye szintén mindig fennáll [K.-K. Han et al., Int. J. Biochem. 15, (1983) 875884]. A kémiai hasítás alkalmazhatóságát azon tény is korlátozza, hogy a hasítás helyét többnyire egyetlenegy aminosav határozza meg, és ez az aminosav termé- 30 szetesen gyakran a kívánt polipeptidben is szerepel.
Az enzimes fragmentálás (bontás) lényegesen enyhébb körülmények között hajtható végre. Alapvető nehézséget azonban az okozza, hogy a nehezen oldódó fúziós proteint detergensek, karbamid vagy guamdin- 35 hidroklorid segítségével fel kell oldani és oldatban tartani, azaz olyan körülmények között kell dolgozni, amelyek az enzimeket gyakran dezaktiválják. A csak egyetlenegy fajlagos aminosavat felismerő proteázok többnyire azért nem alkalmazhatók, mert ez az egy 40 aminosav a kívánt proteinben is előfordul. Az egészen határozott, ugyanakkor ritkán előforduló aminosav- ’ szekvenciákat bontó proteázok igen ritkák, azaz minden egyes tennék számára az alkalmas bontási módszert külön-külön kell megkeresni. Kívánatos egy 45 olyan bontási módszer, amely csak egészen határozott, ritkán előforduló aminosav-szekvencíákat bont anélkül, hogy a protein károsodna, és amely nehezen oldódó fúziós proteinre is alkalmazható.
Az irodalomból ismert a h’zosztafin nevű sejtfal- 50 bontó enzim, amelyet a Staphylococcus simulans NRRL B-2628 [SIoan et al., Int. J. of Dystematic Bacteriology, Vol. 32, No. 2 (1982) 170-174] kiválaszt a tápközegbe. Ez az enzim gyakorlatilag az összes ismert Staphylococcus fajt lizálja (feloldja), más baktéri- 55 umokat azonban nem. Eddig az volt a feltételezés, hogy a lizosztafín-endoprofeáz csak a Staphylococcus baktérium sejtfalát alkotó murein poliglicinhídjaít bontja igen szelektív módon ftversen és Grov. Eur. J. Biochem. 38 (1973) 293-300]. Emellett rövid, szintetikus glicilpeptideket próbáltak transzpeptidálásnak alávetni, katalizátorként lizosztafint alkalmazva [G.L. SIoan et al., Biochem. J. 167 (1977) 293-296], Meglepő módon azt találtuk, hogy a lizosztafin-endoproteáz i oligo-, illetve poliglicin-szekvenciával rendelkező fúziós proteineket is bont. Az, hogy ez a szekvencia egy bakteriális sejtfal fajlagos térbeli viszonyaiban meg legyen kötve, nyilván nem előfeltétele a bontás szelektivitásának. A fentiek lehetővé teszik, hogy a kívánt ) proteint kíméletesen, irányítottan lehasítsuk a fúziós proteinről.
A találmány tárgya tehát eljárás (Yi...Ym)-(Gly)p és (GIy)q-(Xi...Xn) általános képletű polipeptidek előállítására - e képletekben > XésY egymástól függetlenül természetes aminosavat jelent, m és n 1-nél nagyobb számot és p, ill. q nullánál nagyobb számot jelent, és p+q összege 2-től 100-ig terjedő természetes f számot jelent, illetve Ym=Gly esetén p+q
Összege 2-nél kisebb és p=0 is lehet, illetve Xi=Gly esetén p+q összege 2-nél kisebb és q-0 is lehetszelektív enzimes bontás útján. Itt (Yi...Yn)-(Gly)p Iehasítandő szekvenciát és (Gly)p-(Xi...Xn) az elkülöníteni kívánt polipeptidet vagy proteint jelent. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy (Y1...Yffl)-(Gly)p«1-(X1...Xn) _ általános képletű fúziós proteint - e képletben X, Y, p és q jelentése a fent megadott - lizosztafinnal hasítunk.
Ap, illetve q mutató számértékétől függően a lehasítani kívánt felesleg, illetve a polipeptid vagy protein további enzimes hasadásokat szenvedhet.
(Yí...Ym) jelentése olyan természetes vagy mesterséges proteinszekvencia, amilyet általában használnak fúziós proteinek előállításához. Számításba jöhetnek pélául a β-galaktozidáz, a triptofán-anyagcsere enzimjei vagy ezen proteinmolekulák általában oldhatatlan termékeket eredményező részei, továbbá oldható fermentációs tennék gyors feldúsulását megkönnyítő anyagok (például antitestek).
(Xi...Xn) jelentése fannakolőgiailag hatásos polipeptid vagy protein vagy nagyobb móltömegű prekurzor, amelyből a kívánt, biológiailag hatásos forma további műveletek, így szabályos diszulfidhidak létesítése közben végrehajtott ősszehajtogatás éstvagy a polipeptidIáncok irányított hasítása útján nyerhető ki. Példa erre a preproinzulin, amelyből inzulin keletkezik.
Az X és Y maradékok egymástól függetlenül természetesen előforduló aminosavakat jelentenek [Schröder, Lübke „The Peptides”, Vol. I, New York 1965. 137-270. old.; HoubenWeyl „Methoden dér organischen Chemie” Bd. 15/1 és 2 (Synthese von Pepiiden), Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974. melléklet]. Különösen az alábbikat nevezzük meg: Gly, Alá, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, Hyl, Om, Cit, Tyr, Phe, Trp, His, Pro és Hyp.
A lizosztafint ®SIGMA Chemie GmbH, Deisenhofen; lásd még: Recsei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84 (1987), 1127-1131 gyártja.
HU 204 894 Β
A kívánt terméket (Xi...X„) és a proteint (Yi...Ym) tetszőleges glicinszekvencia (Gly)p+q köti össze. Előnyben részesítjük az olyan fúziós proteineket, amelyekben p+q összege 2-től 30-ig terjedő természetes szám. Ha az egymást követő glicincsoportok száma nagy, a vágóhely jobban hozzáférhető, ami előnyösen befolyásolhatja a reakció sebességét. Azonos effektus azonban úgy is elérhető, ha rövid oligoglicin-szekvencia mellett egy vagy több olyan aminosav helyezkedik el, amely hasítás közben az enzimet szférikusán nem gátolja. Az Összekötő darab hosszúságát ezek szerint a fúziós partnerek szerkezeti tulajdonságainak függvényében kell megválasztani.
A hasítás körülményei igen tág kereten belül variálhatók, a fúziós protein tulajdonságaihoz idomíthatok. Az enzim/szubsztrátum arány például 1:1 és 1:1 000 000 között változhat, és a hasítást 6 és 9 közötti, előnyösen 7 és 8 közötti pH mellett, 20-60 °C hőmérsékleten, előnyösen 32-42 °C-on végezhetjük. Szükség esetén, azaz a fúziós protein oldékonyságától függően segédanyagot, például karbamidot, detergenst vagy guanidin-hidrokloridot adagolhatunk, amely a proteint oldatban tartja. A reakció akkor zajlik le a laggyorsabban ugyan, ha denaturáló adalék nélkül a fúziós protein majdnem teljes oldódása érhető el, azonban a karbamid a lizosztafin-endoproteázt nem dezaktiválja, csak lassítja az enzimes reakciót. Ez a tény különösen nehezen oldódó fúziós proteinek hasításához hasznosítható. A reakcióidő megfelelő hoszszabbításával elvileg a csupán szuszpenzióban jelen lévő zárványrészecskék fragmentálása is megoldható; ha azonban a fúziós protein oldatával (denaturáló szerrel vagy enélkül) dolgozunk, a lizosztafin-endoproteázt hordozóhoz kapcsolt (immobilizált) formában is alkalmazhatjuk, majd újbóli felhasználás céljából visszanyerhetjük. Hordozóként például szervetlen hordozóanyag, így alumínium-szilikát, továbbá polimer szerves hordozók, így agaróz [például ®Affi-Gel 10 (gyártja: Bio Rád)], cellulóz, amino- vagy hidroxilcsoportokat hordozó módosított poliakrilamid-gél, akrilamid és metakrilátok, illetve metakrilamid és maleinsavanhidrid kopolimerizátumai kerülnek alkalmazásra. Az ilyen hordozóhoz kötött enzimek előállítását például az alábbi irodalom tárgyalja: Halwachs et al., Biotechnology and Bioengineering XIX (1977) 1667-1677 (rögzítés alumínium-szilikáthoz), vagy 29 27 534 számú NSZK-beli közrebocsátási irat (rögzítés cellulózhoz).
A találmány szerinti eljárás nemcsak fúziós proteinek szelektív hatására, hanem általánosan a megfelelő polipeptidek esetében alkalmazható.
Az alábbi kiviteli példák a találmányt ismertetik, de nem korlátozzák. A 3. és 4. példa azt mutatja, hogy az
1. és 2. példa szerint zajlott proteinhasítás nem az (X]...Xn), illetve az (Y]...Ym) szekvenciák, hanem a poliglicin-szekvencia bontásán alapul.
Az alábbi példákban alkalmazott kiindulási fúziós proteinek a 286 956 sz. publikált európai szabadalmi leírás szerint állíthatók elő.
1. példa
Poliglicintartalmú fúziós protein hasítása
Olyan szerkezetet alkalmazunk, amelyben a β-galaktozidáz egyik szegmense (Gly)i8-peptiden és szintetikus hexapeptiden keresztül proinzulinhoz kapcslódik. A proinzulin a fúziós protein karboxilterminálisát alkotja. A protein mintegy 40%-ig van feldúsítva.
A proteinből pufferrel (8 M karbamid; 50 mM Tris/HCl; pH=7,5) 20 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk, amelyet 50 mmólos Tris/HCl-pufferrel (pH=7,5) és 8 mólos karbamidoldattal (pH=7,5) különböző karbamidkoncentrációkra, valamint 2 mg/ml, illetve 10 mg/ml proteinkoncentrációra hígítunk (lásd
1. táblázat). Az enyhén zavaros oldatokhoz lizosztafint (®SIGMA) adunk 1:100, illetve 1:1000 enzim/szubsztrátum arány batartása mellett, és az elegyeket 37 °C hőmérsékleten tartjuk. Időközönként mintákat veszünk és SDS-elektroforézissel elemezzük. A fúziós proteinnek a poliglicin-szekvencián történő szelektív bontása a fúziós proteinre jellemző sáv csökkenésében és egy új sáv megjelenésében mutatkozik meg (az új sáv a galaktozidáz- fragmensé, amelynek móltömege 10 000 daltonnal kisebb).
1. táblázat
Protein koncent- rációja (mg/ml) Enzim/ szubsztrátum arány Karbamid- Reakcióidő (óra) -koncentráció a fúziós protein M sávjának 95%-os csökkenéséig
2 1:100 4 20
2 1:100 3 20
2 1:100 2 5
2 1:100 1 2
10 1:100 2 20
Az 1. táblázatban azt az időt adtuk meg, amely alatt - az SDS-elektroforézis denzitometrikus kiértékelése szerint - az eredeti fúziós sáv területe a kiindulási érték 5%-a alá süllyedt. Ez az idő 1 és 20 óra közötti, a karbamid koncentrációjától és az enzim/szubsztrátum aránytól függően. A fúziós protein jobb oldódása érdekében adagolt redukálószer, például ditioeritritol (DTE, Cleland féle reagens) jelenléte az enzim aktivitására szignifikáns befolyást nem gyakorol.
2. példa
Szuszpendált fúziós protein hasítása
Az 1. példa szerinti szerkezetet használjuk, de nem elkülönített, szárított formában, hanem olyan szuszpenzió alakjában, amilyen a zárványrészecskék kinyerésekor keletkezni szokott; a szuszpenzió szárazanyagtartalma körülbelül 200 g/liter, ebből 90% a protein, és körülbelül 50 g/liter a fúziós protein.
ml szuszpenziót 7,5 pH-jú 50 mM Tris/HCl pufferrel 200 ml térfogatra hígítunk, és 20 mg lizosztafint (SIGMA) adunk hozzá. Az elegyet 37 °C hőmérsékleten 20 órán át inkubáljuk. Utána az SDS-gélelektrofo3
HU 204894 Β rézis a kiindulási (nem fragmentált) fúziós proteint már csak csekély nyomokban mutatja ki.
3. példa
Proinzulin és Iizosztafin együttes inkubálása
Humán proinzulinból 50 mM Tris/HCl pufferrel (pH=7,5) 1 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk, és 1:100 enzim/szubsztrát arány mellett Iizosztafínt adunk hozzá. Az oldatot 37 ’C hőmérsékleten inkubáljük, mintát véve az 1., 3., 5. és 20. óra után. A mintákat megfordított fázisú HPLC segítségével elemezzük; semmi jel nem mutat arra, hogy a Iizosztafin a proinzulint lebontaná.
4. példa
Hasítási kísérlet poliglicin-szekvencia nélküli fúziós proteinnel
Olyan szekezetet alkalmazunk, amelyben a β-gaIaktozidáz egyik szegmense szintetikus hexapeptiden keresztül proinzulinhoz kapcsolódik. A fúziós protein karboxilteiminálisát a proinzulin alkotja. A fúziós protein mintegy 80%-ig van feldúsítva. A proteinből pufferrel (8 M karbamid; 50 mM Tris/HCl; pH-7,5) 20 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk, amelyet pufferrel (50 mM Tris/HCl; pH-7,5) lassan 2 mg/ml koncentrációra hígítunk. Az enyhén zavaros oldathoz 1:100 enzim/szubsztrátum arány betartása mellett lizosztafint (SIGMA) adunk, és az elegyet 37 ’C hőmérsékleten tartjuk. A vett minták SDS-elektroforetikusan végzett elemzése még 20 óra inkubálás után sem mutat proteinbontást.

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (Yi...Ym)-(Gly)p és (Gly),-<Xi~X«,) általános képletű polipeptidek előállítására - e képletekben 10 XésY egymástól függetlenül természetes aminosavat jelent, m és n 1-nél nagyobb számot és p, ill. q nullánál nagyobb számot jelent, és p+q összege 2-től 100-ig terjedő természetes szám, 15 illetve Ym=Gly esetén p+q összege 2-néI kisebb és p=0 is lehet, illetve Xi=Gly esetén p+q összege 2-nél kisebb és q=0 is lehetszelektív enzimes bontás útján, azzal jellemezve, hogy
    20 (Yl...Y„)-(Gly)p«rCX1..X) általános képletú fúziós proteint - e képletben X, Y, p és q jelentése a táigyi kőiben megadott - lizosztafínnal hasítunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
    25 hogy olyan fúziós proteint hasítunk, amelyben p és q összege 2-től 30-ig terjedő szám.
HU885958A 1987-11-20 1988-11-18 Process for producing polypeptides by enzymatic splitting of fusion proteins HU204894B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873739347 DE3739347A1 (de) 1987-11-20 1987-11-20 Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT50514A HUT50514A (en) 1990-02-28
HU204894B true HU204894B (en) 1992-02-28

Family

ID=6340882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU885958A HU204894B (en) 1987-11-20 1988-11-18 Process for producing polypeptides by enzymatic splitting of fusion proteins

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0316748B1 (hu)
JP (1) JPH01160496A (hu)
KR (1) KR890008166A (hu)
CN (1) CN1033184A (hu)
AT (1) ATE78873T1 (hu)
AU (1) AU618035B2 (hu)
CA (1) CA1337283C (hu)
DE (2) DE3739347A1 (hu)
DK (1) DK645588A (hu)
ES (1) ES2051816T3 (hu)
FI (1) FI885328A (hu)
GR (1) GR3006045T3 (hu)
HU (1) HU204894B (hu)
IE (1) IE62228B1 (hu)
IL (1) IL88413A (hu)
NO (1) NO173194C (hu)
NZ (1) NZ226998A (hu)
PT (1) PT89019B (hu)
ZA (1) ZA888650B (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837516A (en) * 1995-03-03 1998-11-17 Genentech, Inc. Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing basic residues
US5780285A (en) * 1995-03-03 1998-07-14 Genentech, Inc. Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing dibasic residues
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
US6265204B1 (en) 1997-01-17 2001-07-24 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
WO2003082926A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-09 Biosynexus Incorporated Antimicrobial polymer conjugates
CN101717449B (zh) * 2008-10-09 2013-06-19 重庆富进生物医药有限公司 重组TRAIL-Fc融合蛋白及其制备和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3523701A1 (de) * 1985-07-03 1987-01-08 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden

Also Published As

Publication number Publication date
CA1337283C (en) 1995-10-10
NZ226998A (en) 1991-06-25
IL88413A (en) 1993-07-08
EP0316748A2 (de) 1989-05-24
CN1033184A (zh) 1989-05-31
FI885328A (fi) 1989-05-21
PT89019A (pt) 1988-12-01
ATE78873T1 (de) 1992-08-15
NO173194C (no) 1993-11-10
KR890008166A (ko) 1989-07-10
NO885154D0 (no) 1988-11-18
NO885154L (no) 1989-05-22
DK645588A (da) 1989-05-21
IL88413A0 (en) 1989-06-30
NO173194B (no) 1993-08-02
EP0316748B1 (de) 1992-07-29
IE62228B1 (en) 1995-01-11
DE3739347A1 (de) 1989-06-01
PT89019B (pt) 1993-02-26
DK645588D0 (da) 1988-11-18
GR3006045T3 (hu) 1993-06-21
EP0316748A3 (en) 1990-08-29
ZA888650B (en) 1989-07-26
FI885328A0 (fi) 1988-11-17
IE883462L (en) 1989-05-20
JPH01160496A (ja) 1989-06-23
HUT50514A (en) 1990-02-28
AU618035B2 (en) 1991-12-12
DE3873273D1 (de) 1992-09-03
ES2051816T3 (es) 1994-07-01
AU2569588A (en) 1989-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5270176A (en) Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin
US5707826A (en) Enzymatic method for modification of recombinant polypeptides
EP0112849A1 (en) PROCESS FOR THE PREPARATION OF CHYMOSINE.
EP0020290A1 (de) Verfahren zur spezifischen Abspaltung von Proteinsequenzen aus Proteinen
Gutte A synthetic 70-amino acid residue analog of ribonuclease S-protein with enzymic activity.
Nagasawa et al. Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli
DE10240098B4 (de) Verfahren zur Synthese und selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden, Peptidmimetika und Proteinen
HU204894B (en) Process for producing polypeptides by enzymatic splitting of fusion proteins
Nagai et al. Substrate specificity of vertebrate collagenase
US6461834B1 (en) Clostripain catalyzed amidation of peptides
US5905032A (en) Electrosynthetic method of modifying biomolecules in particular enzymes
Muranova et al. Structural investigations and identification of the extracellular bacteriolytic endopeptidase L1 from Lysobacter sp. XL1
Lampen et al. Bacillus licheniformis β-lactamases: multiple forms and their roles
HUT57794A (en) Enzymatic process for producing immunomodulatory pentapeptides and intermediates usable in the process
EP0505921B1 (en) Process for the preparation of mature polypeptides by enzymatic cleavage with factor XA
Ferjancic-Biagini et al. Papain-catalyzed hydrolysis of and amino acid incorporation into BSA and zein substrates in low water organic media
Kempe et al. Enzymatic synthesis of dipeptide units of the d‐d‐configuration in aqueous media
WO2003047743A2 (de) Verfahren zur synthese von all-d-peptide und peptidnukleinsäuren
KR0132003B1 (ko) 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법
DE10047857A1 (de) Verfahren zur selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen
Kitaguchi Peptide synthesis
DE10156274A1 (de) Verfahren zur Synthese von all-D-Polypeptiden
JP3353052B2 (ja) 酵素を用いるペプチド合成方法
JPS63254994A (ja) Ｎ置換ロイシンエンケフアリンアミドの製造方法
JPH0790000A (ja) ペプチドの単離方法