DE10047857A1 - Verfahren zur selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen - Google Patents
Verfahren zur selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und ProteinenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen. Aufgabe der Erfindung ist die regiospezifische biokatalytische Modifizierung von Peptiden und Proteinen am N-Terminus unter möglichst vollständigem Ausschluß von Nebenreaktionen. DOLLAR A Die Aufgabe wird gelöst, indem als Biokatalysator eine Peptidase in Verbindung mit einem nichtaminosäure- oder nichtpeptidartigen Substratmimetikum eingesetzt wird.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur regiospezifischen Modifizierung von Peptiden
und Proteinen mit Sonden und Reportermolekülen unter der Verwendung von
Biokatalysatoren.
Durch die Sequenzierung der Genome des Menschen und anderer Organismen
resultiert eine enorme Flut von Proteinsequenzen, deren biochemische Funktion sehr
häufig nur unzureichend oder überhaupt nicht aufgeklärt ist. Die Proteine sind
funktionelle Genprodukte und daher für alle Aktivitäten der biologischen Welt
verantwortlich. Aus diesem Grunde ist das Verstehen der Proteinstruktur und
-funktion eine äußerst wichtige Notwendigkeit moderner, biologischer Forschung (vgl.
T. E. Creighton, "Proteins. Structure and Molecular Properties", W. H. Freeman & Co.,
New York, 1993). Zur Aufklärung sind gezielte, schonende Markierungen mit
speziellen Sonden und Reportergruppen essentiell, um die molekularen Prozesse in
vitro und in vivo verfolgen zu können. Im Mittelpunkt stehen u. a. die
Fluoreszenzmarkierung (vgl. R. P. Haugland, "Handbook of Fluorescent Probes and
Research Chemicals", Molecular Probes, Inc., 1996), die Einführung von Spinlabel
(W. L. Hubbel, C. Allenbach, "Investigations of Structure and Dynamics in Membrane
Proteins Using Site-directed Spin Labeling", Curr. Opin. Struct. Biol. 4 (1994), 566-573),
Photoaffinitätsmarkierung (D. I. Schuster, W. C. Probst, G. K. Ehrling, G. Singh,
"Photoaffinity Labeling", Photochemistry and Photobiology, 49 (1988), 785-804) sowie
die "Biotin-Technik" (M. Wilchek, E. A. Bayer, Avidin-Biotin Technology in Meth.
Enzymol., V. 184, Academic Press, 1990).
Zur Modifizierung von Peptiden und Proteinen spielten - und spielen noch immer -
chemische Verfahren (vgl. T. Imoto, H. Yamada, "Chemical Modification in Protein
Function. A Practical Approach" (T. E. Creighton, ed.), pp. 247-277, IRL Press, 1989;
G. E. Means, R. E. Feeney, "Chemical Modification of Proteins", Holden-Day, 1971)
eine bedeutende Rolle in der Proteinforschung. So ist trotz des schnellen Fortschritts
der NMR-Technik, die im letzten Jahrzehnt eine vollständige Signalzuordnung und
somit eine Aufklärung der 3D-Strukturen von Proteinen bis zu 150-200
Aminosäurebausteinen ermöglichte, die chemische Modifizierung weiterhin auch ein
Werkzeug zur Raumstrukturbestimmung in Lösung, da große Proteine der NMR-
Strukturanalyse nicht zugänglich sind und die Röntgenstrukturanalyse Proteinkristalle
erfordert, die in sehr vielen Fällen nicht erhalten werden können.
Da N-terminale α-Aminogruppen bevorzugte Ziele von selektiven Modifizierungen
sind, erlauben die ε-Aminogruppen ubiquitär in Proteinen und Peptiden
vorkommender Lysinreste keine gezielte Einführung von Marker- und
Reportergruppen an den N-Terminus. Chemische Acylierungsreaktionen werden mit
Anhydriden oder vorrangig mit aktiven Estern, wie z. B. N-Hydroxysuccinimid- oder 4-
Nitrophenylestern, durchgeführt, womit aber auch andere Seitenkettenfunktionen
proteinogener Aminosäurereste reagieren können und damit eine selektive Nα-
Modifikation ausschließen. Lediglich der Phenylacetyl-Rest wurde
spezifitätsdeterminiert durch die Penicillin-Acylase in Umkehrung der nativen
Wirkung als Schutzgruppe für Aminosäuren im Rahmen von Peptidsynthesen
enzymatisch eingeführt (R. Didziapetris, B. Drabnig, V. Schellenberger, H.-D.
Jakubke, V. Svedas, "FEBS Lett.", 287 (1991), 31-33) und durch das gleiche Enzym
wieder abgespalten (vgl. Review: A. Reidel, H. Waldmann, "J. prakt. Chem.", 335
(1993), 109-127). Abgesehen von dieser direkten Schutzgruppeneinführung wurden
nur solche Methoden beschrieben, die auf einer Übertragung bereits N-terminal
markierter Aminosäure- oder Peptidderivate mit peptidasespezifischen
Aminosäureresten in der P1-Position unter der Katalyse von Peptidasen beruhen und
zwangsläufig keine Irreversibilität aufweisen. Das für CN-Ligationen von Peptid- und
Proteinsegmenten entwickelte Substratmimetika-Konzept (F. Bordusa, D. Ullmann,
C. Elsner, H.-D. Jakubke, "Angew. Chem.", 109 (1997), 2583-25-85; Review: F.
Bordusa, Braz. "J. Med. Biol. Res.", 72 (2000), 469-485) hat dagegen den Vorteil der
Irreversibilität.
Aufgabe der Erfindung ist die regiospezifische, biokatalytische Modifizierung von
Peptiden und Proteinen am N-Terminus unter möglichst vollständigem Ausschluß
von Nebenreaktionen.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die N-terminale, biokatalytische
Modifizierung eines Peptids oder Proteins entgegen der vorherrschenden Meinung
der Fachwelt mit Peptidasen, wobei durch eine gezielte Manipulation die
einzuführende, nichtaminosäureartige bzw. nichtpeptidartige Gruppierung in Form
eines Esterderivates eine Abgangsgruppe trägt, die die native Spezifität des
eingesetzten Enzyms ausschaltet und dadurch die Katalyse einer irreversiblen Nα-
Acylierung ermöglicht. Im Gegensatz zu chemischen Acylierungsreaktionen werden
aufgrund der Regiospezifität von Peptidasen reaktionsfähige Seitenkettenfunktionen
von trifunktionellen Aminosäurebausteinen in den zu modifizierenden Peptiden und
Proteinen nicht acyliert, wodurch eine absolut selektive Einführung von Marker- und
Reportergruppen an die Nα-Aminogruppe des entsprechenden Peptids oder Proteins
garantiert wird. Weiterhin muß die für die Modifizierung vorgesehene Gruppierung
nicht bereits an einem enzymatisch anzuknüpfenden Aminosäure- oder Peptid-Rest
gebunden sein, wie es bei einigen literaturbekannten Verfahren eine notwendige
Voraussetzung ist und die Gefahr einer reversiblen Spaltung in sich birgt.
Da nach der auf dem erfindungsgemäßen Wege erfolgten, biokatalytischen
Einführung der Marker- oder Reportergruppe die eingesetzte Peptidase eine derartig
substituierte Amidbindung nicht mehr als Substrat erkennt und somit eine reversible,
enzymatische Abspaltung ausgeschlossen wird, sind die erfindungsgemäßen
Ergebnisse sehr überraschend.
Vorzugsweise werden für die erfindungsgemäßen, biokatalytischen Nα-Acylierungen
als Reagenzien organisch-chemische Esterderivate verwendet, deren Acylreste den
einzuführenden Marker- oder Reportergruppen entsprechen und deren
Abgangsgruppen Spezifitätsdeterminanten ausgewählter Serin- oder
Cysteinpeptidasen tragen.
Die praktizierte Verfahrensweise, d. h. die Auswahl und Synthese der für die
enzymatische Nα-Acylierung eingesetzten Substrate in Form von Carbonsäureestern,
die Wahl des Puffersystems, der Reaktionszeit u. a. ist verhältnismäßig unkritisch und
kann vom Fachmann für enzymatische Transformationen einfach ermittelt werden.
Erfindungsgemäß werden Nα-selektive Modifikationen von Peptiden und Proteinen
bevorzugt erreicht durch Verwendung eines Carbonsäurederivates, dessen in
Reaktion tretende Carboxylfunktion als Ester mit einer Spezifitätsdeterminante in der
Abgangsgruppe vorliegt, die der eingesetzten Peptidase entspricht, und einem zu
markierenden Peptid oder Protein, bei dem die in Reaktion tretende α-Aminofunktion
unblockiert ist, in Gegenwart der entsprechenden Peptidase, z. B. Trypsin, V8-
Protease oder Chymotrypsin in Lösung bei Raumtemperatur, oder auch im
gefrorenen Zustand bzw. bei tiefen Temperaturen.
Befinden sich in dem zu modifizierenden Peptid oder Protein Peptidbindungen, die
der Spezifität der für die Einführung eingesetzten Serin- oder Cysteinpeptidase
entsprechen, dann wird entweder eine andere Peptidase mit der entsprechenden
Spezifitätsdeterminante in der Abgangsgruppe des nichtpeptidischen Acyldonors
eingesetzt, von der keine sensitiven Peptidbindungen in der Zielsequenz gespalten
werden können, oder man führt die biokatalytische Modifizierung im gefrorenen
Zustand durch (vgl. Review: M. Hänsler, H.-D. Jakubke, "J. Peptide Sci.", 2 (1996), 279-289),
wobei neben hohen Umsatzraten unerwünschte, proteolytische Spaltungen
ausgeschlossen werden.
Die modifizierten Peptide und Proteine können mit üblichen Methoden der
Proteinchemie separiert und gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher
ausgeführt.
Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente 2-Aminobenzoesäure
carboxymethylthioester, im folgenden mit 2-ABz-SCm bezeichnet, und als
Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly
verwendet. 2-ABz-SCm und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1
in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein
wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel.
Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch
vollständigem Umsatz von 2-ABz-SCm durch eine Inaktivierung des Enzyms
beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch
chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 99%igen
Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-
terminal 2-ABz-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde
durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft.
Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente Phloretyl
carboxymethylthioester, im folgenden mit Phloretyl-SCm bezeichnet, und als
Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly
verwendet. Phloretyl-SCm und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1
in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente
ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem
Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach
praktisch vollständigem Umsatz von Phloretyl-SCm durch eine Inaktivierung des
Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch
chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 99.7%igen
Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-
terminal Phloretyl-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde
durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft. Die Reaktion führte
weder zu einer Nε-Modifizierung des in der Aminokomponente befindlichen Lysins,
noch zu einer detektierbaren, proteolytischen Spaltung nach Asparaginsäure.
Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente 2-Aminobenzoesäure-4-
guanidinophenylester, im folgenden mit 2-ABz-OGp bezeichnet, und als
Aminokomponente das Oligopeptid Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-
Ala-Gly-Ala-Tyr verwendet. 2-ABz-OGp und Aminokomponente wurden in einem
Verhältnis von 2 : 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als
Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an
organischem Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms
gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von 2-ABz-OGp durch eine
Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion
erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer
98,8%igen Umwandlung von Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-
Gly-Ala-Tyr in das entsprechend N-terminal 2-ABz-modifizierte Analoga. Die Identität
des Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen
Chemie überprüft. Die Reaktion führte weder zu einer Modifizierung trifunktioneller
Seitenketten, noch zu einer detektierbaren, proteolytischen Spaltung.
Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente Phloretyl-4-
guanidinophenylester, im folgenden mit Phloretyl-OGp bezeichnet, und als
Aminokomponente das Oligopeptid Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-
Ala-Gly-Ala-Tyr verwendet. Phloretyl-OGp und Aminokomponente wurden in einem
Verhältnis von 2 : 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als
Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an
organischem Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms
gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von Phloretyl-OGp durch eine
Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion
erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer
99.3%igen Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly in das
entsprechend N-terminal Phloretyl-modifizierte Analoga. Die Identität des
Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie
überprüft. Die Reaktion führte weder zu einer Modifizierung trifunktioneller
Seitenketten, noch zu einer detektierbaren, proteolytischen Spaltung.
Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente 2-Aminobenzoesäure-4-
guanidinophenylester, im folgenden mit 2-ABz-OGp bezeichnet, und als
Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly
verwendet. 2-ABz-OGp und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1
in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein
wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel.
Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch
vollständigem Umsatz von 2-ABz-OGp durch eine Inaktivierung des Enzyms
beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch
chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 94,4%igen
Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-
terminal 2-ABz-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde
durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft.
Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente Phloretyl-4-
guanidinophenylester, im folgenden mit Phloretyl-OGp bezeichnet, und als
Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly
verwendet. Phloretyl-OGp und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1
in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente
ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem
Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach
praktisch vollständigem Umsatz von Phloretyl-OGp durch eine Inaktivierung des
Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch
chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer quantitativen
Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-
terminal Phloretyl-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde
durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft.
Der nomenklaturgerechte Terminus Peptidasen wurde anstelle von Proteasen
durchgehend verwendet mit Ausnahme der V8-Protease, weil die Bezeichnung in
diesem Fall einen Handelsnamen darstellt.
Claims (7)
1. Verfahren zur selektiven, biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen,
dadurch gekennzeichnet, dass
als Biokatalysator eine Peptidase in Verbindung mit einem nichtaminosäure- oder
nichtpeptidartigen Substratmimetikum eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
als Acylierungskomponente ein Carbonsäureester verwendet wird, dessen Acylteil der
Modifizierungsgruppe entspricht und dessen Abgangsgruppe die Spezifitätsdetermi
nante der für die Katalyse eingesetzten Peptidase enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
die Reaktion in einem wäßrigen Medium bei Raumtemperatur oder in einem gefrore
nen, wäßrigen System oder bei tiefen Temperaturen zwischen -5 und -20°C durch
geführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass als Peptidasen Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease, Glu-spezifische Endopepti
dase aus Bacillus licheniformis, Subtilisin u. a. bzw. Mutanten dieser Enzyme oder
Enzyme mit ähnlichen Spezifitätsdeterminanten eingesetzt werden
5. Verwendung von Peptidasen,
dadurch gekennzeichnet, dass
sie zum biokatalytischen Einführen von Marker- und Reportergruppen in Peptide und
Proteine eingesetzt werden.
6. Verwendung von Peptidasen nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass
sie zum biokatalytischen Einführen von Marker- und Reportergruppen in Peptide und
Proteine unter Vermeiden derer reversiblen, enzymatischen Abspaltung eingesetzt
werden,
indem die einzuführende Marker- oder Reportergruppe ein Esterderivat als Abgangs
gruppe trägt, welche die native Spezifität des eingesetzten Enzyms ausschaltet.
7. Verwendung von Peptidasen nach Anspruch 5 und 6,
dadurch gekennzeichnet, dass als Peptidasen Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease,
Glu-spezifische Endopeptidase aus Bacillus licheniformis, Subtilisin oder Mutanten
dieser Enzyme oder Enzyme mit ähnlichen Spezifitätsdeterminanten eingesetzt
werden.
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