DE10047857B4 - Verfahren zur selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen - Google Patents
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Abstract
Verfahren
zur selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen,
dadurch gekennzeichnet, daß als
Biokatalysator eine Peptidase zusammen mit einem nichtaminosäure- oder
nichtpeptidartigem Substratmimetikum eingesetzt wird, wobei als
Acylierungskomponente ein Carbonsäureester verwendet wird, dessen
Acylteil der Modifizierungsgruppe entspricht und dessen Abgangsgruppe
die Spezifitätsdeterminante
der für die
Katalyse eingesetzten Peptidase enthält.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur regiospezifischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen mit Sonden und Reportermolekülen unter der Verwendung von Biokatalysatoren.
- Durch die Sequenzierung der Genome des Menschen und anderer Organismen resultiert eine enorme Flut von Proteinsequenzen, deren biochemische Funktion sehr häufig nur unzureichend oder überhaupt nicht aufgeklärt ist. Die Proteine sind funktionelle Genprodukte und daher für alle Aktivitäten der biologischen Welt verantwortlich. Aus diesem Grunde ist das Verstehen der Proteinstruktur und – funktion eine Notwendigkeit moderner biologischer Forschung (vgl. T.E. Creighton, Proteins. Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co. New York, 1993). Zur Aufklärung sind gezielte, schonende Markierungen mit speziellen Sonden und Reportergruppen essentiell, um die molekularen Prozesse in vitro und in vivo verfolgen zu können. Im Mittelpunkt stehen u.a. die Fluoreszenzmarkierung (vgl. R.P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc., 1996), die Einführung von Spinlabel (W.L. Hubbel, C. Allenbach, Investigations of Structure and Dynamics in Membrane Proteins Using Site-directed Spin Labeling, Curr. Opin. Struct. Biol. 4 (1994) 566–573), Photoaffinitätsmarkierung (D.I. Schuster, W.C. Probst, G.K. Ehrling, G. Singh, Photoaffinity Labeling, Photochemistry and Photobiology 49 (1988) 785–804) sowie die "Biotin-Technik" (M. Wilchek, E.A. Bayer, Avidin-Biotin Technology in Meth. Enzymol. V. 184, Academic Press, 1990).
- Zur Modifizierung von Peptiden und Proteinen spielten – und spielen noch immer – chemische Verfahren (vgl. T. Imoto, H. Yamada, Chemical Modification, in Protein Function. A Practical Approach (T.E. Creighton, ed.) pp. 247–277, IRL Press, 1989; G.E. Means, R.E. Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1971) eine bedeutende Rolle in der Proteinforschung. So ist trotz des schnellen Fortschritts der NMR-Technik, die im letzten Jahrzehnt eine vollständige Signalzuordnung und somit eine Aufklärung der 3D-Strukturen von Proteinen bis zu 150 – 200 Aminosäurebausteinen ermöglichte, die chemische Modifizierung weiterhin auch ein Werkzeug zur Raumstrukturbestimmung in Lösung, da große Proteine der NMR- Strukturanalyse nicht zugänglich sind und die Röntgenstrukturanalyse Proteinkristalle erfordert, die in sehr vielen Fällen nicht erhalten werden können.
- Da N-terminate α-Aminogruppen bevorzugte Ziele von selektiven Modifizierungen sind, erlauben die ε-Aminogruppen ubiquitär in Proteinen und Peptiden vorkommender Lysinreste keine gezielte Einführung von Marker- und Reportergruppen an den N-Terminus. Chemische Acylierungsreaktionen werden mit Anhydriden oder vorrangig mit aktiven Estern, wie z.B. N-Hydroxysuccinimid- oder 4-Nitrophenylestern durchgeführt, womit aber auch andere Seitenkettenfunktionen proteinogener Aminosäurereste reagieren können und damit eine selektive Nα-Modifikation ausschließen. Lediglich der Phenylacetyl-Rest wurde spezifitätsdeterminiert durch die Penicillin-Acylase in Umkehrung der nativen Wirkung als Schutzgruppe für Aminosäuren im Rahmen von Peptidsynthesen enzymatisch eingeführt (R. Didziapetris, B. Drabnig, V. Schellenberger, H.-D. Jakubke, V. Svedas, FEBS Lett. 287 (1991) 31–33) und durch das gleiche Enzym wieder abgespalten (vgl. Review: A. Reidel, H. Waldmann, J. prakt. Chem. 335 (1993) 109–127). Abgesehen von dieser direkten Schutzgruppeneinführung wurden nur solche Methoden beschrieben, die auf einer Übertragung bereits N-terminal markierter Aminosäure- oder Peptidderivate mit peptidasespezifischen Aminosäureresten in der P1-Position unter der Katalyse von Peptidasen beruhen und zwangsläufig keine Irreversibilität aufweisen. Das für CN-Ligationen von Peptid- und Proteinsegmenten entwickelte Substratmimetika-Konzept (F. Bordusa, D. Ullmann, C. Elsner, N.-D. Jakubke, Angew. Chem. 109 (1997) 2583–25–85; Review: F. Bordusa, Braz. J. Med. Biol. Res. 72 (2000) 469–485) hat dagegen den Vorteil der Irreversibilität.
- Die enzymatische Katalyse der Reaktion eines Peptidsubstrates mit Alkylaminen bzw. Arylaminen in Gegenwart einer Carboxypeptidase Y wird in
US-PS 5,985,627 erwähnt. Jedoch unterscheiden sich Zielstellung der Erfindung und Reaktionsablauf der Umsetzung sehr deutlich von der nachfolgend vorgestellten eigenen Lösung. Beschrieben wird ein Verfahren zur Transamidierung eines Peptidsubstrates, das einen P1-Aminosäurerest mit einer positiv geladenen Seitenkette aufweist. Eine Carboxypeptidase Y ist modifiziert mit dem Ziel, eine Aminosäure zu substituieren, die eine negativ geladene Seitenkette in einer S1 [subsite] trägt. Dabei kann die modifizierte Carbopxypeptidase Y substituierte Aminosäurereste enthalten in einer S1', S2 und/oder S3 [subsite], um ein spezifisches Peptidsubstrat zu bilden. - Carboxypeptidase Y wird laut Anal. Biochemistry 248, 141–148 (1997) und WO 92/15 695 zum Einführen von fluorogenen bzw. Affinitätsmarkierungen in Peptide und Proteine angegeben. Es gelingt nicht, die in
I undII der Publikation Anal. Biochem. angegebenen Nebenraktionen zu unterdrücken, so daß Stoffgemische unterschiedlicher Zusammensetzung ohne deutlich präferierten Bestandteil entstehen. - In
DE 198 34 308 beschreiben die Erfinder ein Verfahren zur Herstellung von Säureamiden unter Verwendung von Proteanen als Biokatalysatoren. Unerwartet gelingt die Synthese, obwohl mit proteolytischen Enzymen eine nichtpeptidische Amidknüpfung an sich nicht erwartet werden konnte. Leider wird auf peptidische Edukte nicht eingegangen, so daß hier noch weiterer Forschungsbedarf gegeben ist. - Aufgabe der Erfindung ist die regiospezifische biokatalytische Modifizierung von Peptiden und Proteinen am N-Terminus unter möglichst vollständigem Ausschluß von Nebenreaktionen.
- Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die N-terminale biokatalytische Modifizierung eines Peptids oder Proteins entgegen der vorherrschenden Meinung der Fachwelt mit Peptidasen, wobei durch eine gezielte Manipulation die einzuführende nichtaminosäureartige bzw. nichtpeptidartige Gruppierung in Form eines Esterderivates eine Abgangsgruppe trägt, die die native Spezifität des eingesetzten Enzyms ausschaltet, und dadurch die Katalyse einer irreversiblen Nα- Acylierung ermöglicht. Im Gegensatz zu chemischen Acylierungsreaktionen werden aufgrund der Regiospezifität von Peptidasen reaktionsfähige Seitenkettenfunktionen von trifunktionellen Aminosäurebausteinen in den zu modifizierenden Peptiden und Proteinen nicht acyliert, wodurch eine absolut selektive Einführung von Marker- und Reportergruppen an die Nα-Aminogruppe des entsprechenden Peptids oder Proteins garantiert wird. Weiterhin muß die für die Modifizierung vorgesehene Gruppierung nicht bereits an einem enzymatisch anzuknüpfenden Aminosäure- oder Peptid-Rest gebunden sein, wie es bei einigen literaturbekannten Verfahren eine notwendige Voraussetzung ist und die Gefahr einer reversiblen Spaltung in sich birgt.
- Da nach der auf dem erfindungsgemäßen Wege erfolgten biokatalytischen Einführung der Marker- oder Reportergruppe die eingesetzte Peptidase eine derartig substituierte Amidbindung nicht mehr als Substrat erkennt und somit eine reversible enzymatische Abspaltung ausgeschlossen wird, sind die erfindungsgemäßen Ergebnisse sehr überraschend.
- Vorzugsweise werden für die erfindungsgemäßen biokatalytischen Nα-Acylierungen als Reagenzien organisch-chemische Esterderivate verwendet, deren Acylreste den einzuführenden Marker- oder Reportergruppen entsprechen und deren Abgangsgruppen Spezifitätsdeterminanten ausgewählter Serin- oder Cysteinpeptidasen tragen.
- Die praktizierte Verfahrensweise, d.h. die Auswahl und Synthese der für die enzymatische Nα-Acylierung eingesetzten Substrate in Form von Carbonsäureestern, die Wahl des Puffersystems, der Reaktionszeit u.a. ist verhältnismäßig unkritisch und kann vom Fachmann für enzymatische Transformationen einfach ermittelt werden.
- Erfindungsgemäß werden Nα-selektive Modifikationen von Peptiden und Proteinen bevorzugt erreicht durch Verwendung eines Carbonsäurederivates, dessen in Reaktion tretende Carboxylfunktion als Ester mit einer Spezifitätsdeterminante in der Abgangsgruppe vorliegt, die der eingesetzten Peptidase entspricht, und einem zu markierenden Peptid oder Protein, bei dem die in Reaktion tretende α-Aminofunktion unblockiert ist, in Gegenwart der entsprechenden Peptidase, z.B. Trypsin, V8 Protease oder Chymotrypsin in Lösung bei Raumtemperatur, oder auch im gefrorenen Zustand bzw. bei tiefen Temperaturen.
- Befinden sich in dem zu modifizierenden Peptid oder Protein Peptidbindungen, die der Spezifität der für die Einführung eingesetzten Serin- oder Cysteinpeptidase entsprechen, dann wird entweder eine andere Peptidase mit der entsprechenden Spezifitätsdeterminante in der Abgangsgruppe des nichtpeptidischen Acyldonors eingesetzt, von der keine sensitiven Peptidbindungen in der Zielsequenz gespalten werden können, oder man führt die biokatalytische Modifizierung im gefrorenen Zustand durch (vgl. Review: M. Hänsler, N.-D. Jakubke, J. Peptide Sci. 2 (1996) 279-289), wobei neben hohen Umsatzraten unerwünschte proteolytische Spaltungen ausgeschlossen werden.
- Die modifizierten Peptide und Proteine können mit üblichen Methoden der Proteinchemie separiert und gereinigt werden.
- Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher ausgeführt.
- Beispiel 1 – V8-Protease-katalysierte N-terminate Einführung von 2-Aminobenzoesäure in Peptide
- Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente 2-Aminobenzoesäurecarboxymethylthioester, im folgenden mit 2-ABz-SCm bezeichnet, und als Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly verwendet. 2-ABz-SCm und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmitel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von 2-ABz-SCm durch eine Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 99%igen Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-terminal 2-ABz-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft.
- Beispiel 2 – V8-Protease-katalysierte N-terminale Einführung der Phloretyl-Gruppe in Peptide
- Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente Phloretylcarboxymethylthioester, im folgenden mit Phloretyl-SCm bezeichnet, und als Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly verwendet. Phloretyl-SCm und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von Phloretyl-SCm durch eine Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 99.7%igen Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-terminal Phloretyl-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft. Die Reaktion führte weder zu einer Nε-Modifizierung des in der Aminokomponente befindlichen Lysins, noch zu einer detektierbaren proteolytischen Spaltung nach Asparaginsäure.
- Beispiel 3 – α-Chymotrypsin-katalysierte N-terminale Einführung von 2-Aminobenzoesäure in Peptide
- Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente 2-Aminobenzoesäure-4-guanidinophenylester, im folgenden mit 2-ABz-OGp bezeichnet, und als Aminokomponente das Oligopeptid Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr verwendet. 2-ABz-OGp und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von 2-ABz-OGp durch eine Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 98,8%igen Umwandlung von Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr in das entsprechend N-terminal 2-ABz-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft. Die Reaktion führte weder zu einer Modifizierung trifunktioneller Seitenketten, noch zu einer detektierbaren proteolytischen Spaltung.
- Beispiel 4 – α-Chymotrypsin-katalysierte N-terminale Einführung der Phloretyl-Gruppe in Peptide
- Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente Phloretyl-4-guanidinophenylester, im folgenden mit Phloretyl-OGp bezeichnet, und als Aminokomponente das Oligopeptid Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr verwendet. Phloretyl-OGp und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von Phloretyl-OGp durch eine Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 99.3%igen Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-terminal Phloretyl-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft. Die Reaktion führte weder zu einer Modifizierung trifunktioneller Seitenketten, noch zu einer detektierbaren proteolytischen Spaltung.
- Beispiel 5 – Trypsin-katalysierte N-terminale Einführung von 2-Aminobenzoesäure in Peptide
- Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente 2-Aminobenzoesäure-4-guanidinophenylester, im folgenden mit 2-ABz-OGp bezeichnet, und als Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly verwendet. 2-ABz-OGp und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 : 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von 2-ABz-OGp durch eine Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer 94,4%igen Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N- terminal 2-ABz-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft.
- Beispiel 6 – Trypsin-katalysierte N-terminale Einführung der Phloretyl-Gruppe in Peptide
- Für die Modellreaktion wurde als Carboxykomponente Phloretyl-4-guanidinophenylester, im folgenden mit Phloretyl-OGp bezeichnet, und als Aminokomponente das Decapeptid Leu-Ala-Leu-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala-Phe-Gly verwendet. Phloretyl-OGp und Aminokomponente wurden in einem Verhältnis von 2 1 in einer Konzentration von 4 mM bzw. 2 mM eingesetzt. Als Lösungsmittel diente ein wässriges Puffersystem mit einem geringen Anteil an organischem Lösungsmittel. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach praktisch vollständigem Umsatz von Phloretyl-OGp durch eine Inaktivierung des Enzyms beendet. Die Analyse und Quantifizierung der Reaktion erfolgte durch chromatographische Methoden. Die Enzymkatalyse führte zu einer quantitativen Umwandlung von Leu-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asp-Ala-Phe-Gly in das entsprechend N-terminal Phloretyl-modifizierte Analoga. Die Identität des Syntheseproduktes wurde durch die üblichen Methoden der Organischen Chemie überprüft.
Claims (5)
- Verfahren zur selektiven biokatalytischen Modifizierung von Peptiden und Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysator eine Peptidase zusammen mit einem nichtaminosäure- oder nichtpeptidartigem Substratmimetikum eingesetzt wird, wobei als Acylierungskomponente ein Carbonsäureester verwendet wird, dessen Acylteil der Modifizierungsgruppe entspricht und dessen Abgangsgruppe die Spezifitätsdeterminante der für die Katalyse eingesetzten Peptidase enthält.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem wäßrigen Medium bei Raumtemperatur oder in einem gefrorenen wäßrigen System oder bei tiefen Temperaturen zwischen – 5 und – 20° C durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidasen Trypsin, Chymotrypsin, V8 Protease, Glu-spezifische Endopeptidase aus Bacillus licheniformis, Subtilisin oder Mutanten dieser Enzyme oder Enzyme mit ähnlichen Spezifitätsdeterminanten eingesetzt werden.
- Verwendung von Peptidasen zum biokatalytischen Einführen von Funktionsgruppen in Peptide und Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß Peptidasen zum biokatalytischen Einführen von Marker- und Reportergruppen in Peptide und Proteine unter Vermeiden deren reversibler enzymatischer Abspaltung dergestalt eingesetzt werden, daß die einzuführende Marker- oder Reportergruppe ein Esterderivat als Abgangsgruppe trägt, welche die native Spezifität des eingesetzten Enzyms ausschaltet.
- Verwendung von Peptidasen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Peptidasen Trypsin, Chymotrypsin, V8 Protease, Glu-spezifische Endopeptidase aus Bacillus licheniformis, Subtilisin oder Mutanten dieser Enzyme oder Enzyme mit ähnlichen Spezifitätsdeterminanten eingesetzt werden.
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