DE4325746A1 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden und Verwendung - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Peptiden und VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur
biokatalytischen Herstellung von Peptiden und die
Verwendung von Biokatalysatoren.
Zur Herstellung von Peptiden können verschiedene
organisch-chemische Verfahren (vgl. Übersicht:
WÜNSCH. E. (1974) Synthese von Peptiden, in
HOUBEN-WEYL. Bd. 15. 1/2, Methoden der organischen
Chemie, Müller, E. (Hrsg.) Georg Thieme Verlag,
Stuttgart) eingesetzt werden. Im Verlauf chemischer
Peptidsynthesen werden häufig unerwünschte
Nebenreaktionen beobachtet, die die Ausbeute
verringern und schwierige und langwierige
Reinigungsprozesse erforderlich machen. Ein besonders
schwerwiegender Nachteil der herkömmlichen Verfahren
ist das ungelöste Problem der Racemisierung, die
insbesondere bei Segmentkondensation mittels
chemischer Verknüpfungsmethoden in Erscheinung tritt.
Da sich Stereoisomere kaum vollständig trennen lassen
und die optische Reinheit der Syntheseprodukte für die
biologische Aktivität eine notwendige Voraussetzung
ist, besitzt die industrielle Synthese von Peptiden
mittels organisch-chemischer Verfahren erhebliche
Nachteile. Weiterhin müssen bei allen chemischen
peptidsynthetischen Operationen die Drittfunktionen
von Aminosäurebausteinen wegen der Gefahr der
Nebenreaktionen reversibel maskiert werden. Zur
Umgehung der geschilderten Schwierigkeiten bietet sich
der Einsatz von Biokatalysatoren für die Katalyse des
Peptidknüpfungsschrittes an (vgl. Übersichten:
Jakubke. H.-D. (1987) in S. Udenfriend, J. Meienhofer
(Eds.): The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,
Vol. 9, Academic New York, pp. 103-165; Kullmann
(1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC, Boca Raton,
USA; Jakubke. H.-D. , Kuhl, P. u. Könnecke, A. (1985)
Angew. Chem. 97, 79). Durch die Stereospezifität der
als Biokatalysator eingesetzten Proteasen bleibt die
chirale Integrität erhalten und der hohe Grad der
Reaktionskontrolle ermöglicht einen weitgehenden
Verzicht auf den Schutz von Drittfunktionen. Im Rahmen
der enzymkatalysierten Peptidsynthese kommt der
kinetisch kontrollierten Reaktionsführung eine
Schlüsselrolle zu (Schellenberger, V., Jakubke. H.-D.
(1991) Angew. Chem. 103, 1440). Die bei dieser Methode
mit der Peptidproduktbildung einhergehende Hydrolyse
des Acylenzymintermediats und weitere mögliche
proteolytische Spaltungen stellen noch für viele
Synthesereaktionen ein Problem dar, indem die Ausbeute
an Peptidprodukt begrenzt bleibt und die Abtrennung
von Nebenprodukten die Herstellung erschwert.
Aufgabe der Erfindung ist die biokatalytische
Herstellung von Peptiden unter möglichst vollständigem
Ausschluß unerwünschter proteolytischer
Nebenreaktionen.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß
Anspruch 1.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die
biokatalytische Herstellung eines Peptids nicht wie
gewöhnlich mit einer Protease, sondern mit einem
Zymogen. Da Zymogene proteolytisch noch inaktive
Vorstufen (Proenzyme) von Proteasen sind und daher
eigentlich keine katalytische Effizienz haben sollten,
sind die erfindungsgemäßen Ergebnisse sehr
überraschend. Für hohe Ausbeuten ist es vorteilhaft,
vergleichsweise höhere Konzentrationen des gewählten
Zymogens einzusetzen. Die gesamte Verfahrensweise,
d. h. Wahl der Substrate, des Puffers, des Mediums,
der Temperatur, der Konzentrationen, der
Reaktionszeit, etc. , ist verhältnismäßig unkritisch
und kann vom Fachmann für biokatalytische
Peptidsynthesen einfach ermittelt werden.
Vorzugsweise werden für die erfindungsgemäßen
biokatalytische Peptidsynthesen die bei
Peptidsynthesen mit Proteasen üblichen Substrate
eingesetzt. Geeignet sind insbesondere ggf.
N-geschützte Aminosäureester bzw. ggf. N-geschützte
Peptidester, die man mit einer C-terminal geschützten
Aminosäure umsetzt. Die NH₂-Gruppe der Acyldonorester
wird gewünschtenfalls durch in der Peptidchemie
übliche Aminoschutzgruppen, wie Boc-. Z-. etc. oder
durch Acylierung geschützt, geeignet sind z. B.
Maleinsäure, Essigsäure. Benzoesäure, etc. Als Ester
kommen insbesondere die niederen Ester in Frage,
besonders geeignet sind die Methyl- und Ethylester,
aber auch Cyanmethylester, p-Nitrobenzylester,
Carboxamidomethylester, etc.
Als C-terminale Komponente eignen sich vorteilhaft
C-terminal derivatisierte Aminosäuren oder
Peptidfragmente, insbesondere Aminosäureamide, wobei
auch Peptide, die ja ebenfalls Amide sind, eingesetzt
werden können. Beim Einsatz von Peptiden kann das
C-terminale Ende gewünschtenfalls geschützt sein,
z. B. durch eine NH₂-Gruppe.
Die Wahl eventueller Derivatisierungen und
Ausgangssubstrate richtet sich dabei grundsätzlich
nach dem gewünschten Endprodukt und dem eventuellen
Erfordernis. Nebenreaktionen zu verhindern. Diese Wahl
liegt daher im üblichen fachmännischen Handeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren offenbart gegenüber der
bisherigen Verwendung von Proteasen den besonderen
Vorteil der Unterdrückung von unerwünschten
proteolytischen Spaltreaktionen. Dies gelingt
erfindungsgemäß, da das Zymogen gegenüber der
entsprechenden Protease eine neue Spezifität zeigt.
Hierdurch wird es möglich, daß man für einen
gewünschten Peptidaufbau ein solches Zymogen wählt,
das einerseits geeignet ist, aus den Substraten in
annehmbarer Zeit und Ausbeute das Peptid aufzubauen,
und das andererseits mit einem solchen Enzym
korrespondiert, für das das erhaltene Peptid
vorzugsweise kein Substrat ist. d. h. , daß der
Peptidaufbau (Verknüpfungsgeschwindigkeit) durch das
Zymogen mindestens eine Größenordnung schneller sein
soll als der Peptidabbau durch das dem Zymogen
korrespondierende Enzym. Mit anderen Worten,
vorzugsweise wird das Zymogen so gewählt, daß die
Verknüpfungsgeschwindigkeit der gewählten Substrate
vorzugsweise zehnmal höher ist als die Geschwindigkeit
des Peptidabbaus durch das dem Zymogen
korrespondierende Enzym. So ist es beispielsweise
möglich, mit Trypsinogen "Chymotrypsin-spezifische"
Substrate oder mit Chymotrypsinogen "Trypsin-
spezifische" Substrate umzusetzen. Hierdurch wird
vermieden, daß das Zymogen zu einem geringen
Prozentsatz begleitende korrespondierende Enzym oder
sogar bei der Synthese durch limitierte Proteolyse aus
dem Zymogen entstehende Enzym zu einer Rückreaktion
führt. Diese Art der Sekundärhydrolyse kann durch
diese Verfahrensweise weitgehend oder vollständig
unterbunden werden.
Vorzugsweise werden als Zymogen Chymotrypsinogen,
Trypsinogen, Pepsinogen, Prorennin oder
Pro-Carboxypeptidase eingesetzt.
Erfindungsgemäß werden Peptide bevorzugt hergestellt
aus einer freien oder α-Aminogruppen-geschützten
Aminosäure oder einem freien oder α-Aminogruppen-
geschützten Peptid, dessen in Reaktion tretende
Carboxylgruppe als Ester vorliegt, und einer
Aminosäure, einem Aminosäurederivat oder einem Peptid,
bei dem die in Reaktion tretende Aminosäure am
NH₂-Ende unblockiert ist, in Gegenwart des Zymogens,
z. B. des Zymogens einer Serinprotease in Lösung oder
Suspension bei Raumtemperatur, die ggf. Anteile
organischer Lösungsmittel und/oder Puffersubstanzen
enthält, oder auch tieferen Temperaturen.
Vorzugsweise wird die Reaktion in einem wäßrigen
Medium durchgeführt, das ggf. Anteile organischer
Lösungsmittel enthalten kann, wobei u. U. tiefe
Temperaturen vorteilhaft sind, bei denen auch das
wäßrige Medium zu Eis gefroren sein kann, da bei der
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei
tiefen Temperaturen zusätzlich die Sekundärhydrolyse
unterdrückt werden kann.
Die gebildeten Peptide können mit geeigneten
chromatographischen oder extraktiven Techniken
präparativ separiert werden. Nach beendeter
Aufarbeitung können ggf. noch vorhandene Schutzgruppen
nach bekannten Methoden entfernt werden.
Als Puffer können auch solche eingesetzt werden, die
proteolytische Reaktionen inhibieren. Auch hierdurch
können unerwünschte Sekundärhydrolysen reduziert
werden.
Im Gegensatz zu beschriebenen Verfahren zur Synthese
von Peptiden unter Nutzung von Proteasen wird durch
den erfindungsgemäßen Einsatz von proteolytisch
inaktiven Proenzymen die Gefahr unerwünschter
Spaltungen signifikant vermindert. Erstmalig wird für
die Stoffklasse der Peptide ihre biokatalytische
Synthese mit Zymogenen durchgeführt. Der Effekt der
Erfindung ist insofern überraschend als mit
proteolytisch inaktiven Proenzymen eine
Peptidbindungsknüpfung nicht erwartet werden konnte.
Bei Anwesenheit von geringen Anteilen aktiver
Proteasespecies in den eingesetzten Zymogenen wird
durch Temperaturerniedrigung bzw. Einfrieren der
Reaktionslösung in bekannter Weise eine mögliche
proteolytische Nebenreaktion praktisch ausgeschaltet:
D. h. , daß mit den oben beschriebenen Verfahrensvarianten insbesondere die kommerziell zur Verfügung stehenden Zymogene, die meist wenige Gew.-Prozente des korrespondierenden Enzyms enthalten, eingesetzt werden können.
D. h. , daß mit den oben beschriebenen Verfahrensvarianten insbesondere die kommerziell zur Verfügung stehenden Zymogene, die meist wenige Gew.-Prozente des korrespondierenden Enzyms enthalten, eingesetzt werden können.
Die vorliegende Erfindung zeigt neue
Verwendungsmöglichkeiten für Zymogene, mit zur
Erfindung gehört daher auch die Verwendung eines
Zymogens zur Peptidsynthese sowie die Verwendung eines
Zymogens als solches als Biokatalysator. Unter
"Zymogen als solches" ist dabei zu verstehen, daß das
Zymogen selbst, ggf. durch andere Komponenten
unterstützt, als Biokatalysator wirkt und nicht zuerst
aus dem Zymogen durch limitierte Proteolyse die
entsprechende Protease hergestellt wird, die dann ohne
Mitwirken des Zymogens die Reaktion biokatalysiert.
Die mit der vorliegenden Erfindung herstellbaren
Peptide oder -derivate eignen sich, ggf. nach
Abspaltung von Schutzgruppen, z. B. als Wirkstoffe
bzw. Zwischenprodukte von Wirkstoffen.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Beispielen näher ausgeführt.
In den Beispielen werden die Aminosäuren nach
international gültigen Regeln abgekürzt. Zusätzlich
werden folgende Abkürzungen verwendet:
Ac Acetyl
Bz Benzoyl
Boc tert.-Butyloxycarbonyl
Mal Maleyl
OCam Carboxamidomethylester
OEt Ethylester
OMe Methylester
NH₂ Amid
Bz Benzoyl
Boc tert.-Butyloxycarbonyl
Mal Maleyl
OCam Carboxamidomethylester
OEt Ethylester
OMe Methylester
NH₂ Amid
Wenn nicht anders vermerkt, besitzen Aminosäuren bzw.
Aminosäurereste mit chiralem Zentrum L-Konfiguration.
2 ml 0,05 M Borat-Puffer, pH 9, enthaltend 0,2 M NaCl,
2 mM Mal-Phe-OMe, 50 mM H-Leu-NH₂ und 4 µM Trypsinogen
werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 24 h
wird die Reaktionslösung mit 0,5 proz.
Trifluoressigsäure in Methanol/Wasser (1 : 1; v/v) auf
pH 2 gebracht. Die Ausbeute wird HPLC analytisch
bestimmt und beträgt 73,5% d. Th.
Führt man die Synthese nicht bei Raumtemperatur,
sondern bei -15°C im gefrorenen wäßrigen System durch,
dann beträgt die Ausbeute nach 24 h bei einem
C/N-Verhältnis von 1 : 10 87% d. Th. bzw. bei einem
C/N von 1 : 5 77%. d. Th.
Wie in Beispiel 1a, jedoch mit 4 µM Chymotrypsinogen
als Biokatalysator. Ausbeute nach 24 h: 82% d. Th.
Ein Vergleichsansatz führte nach 48 h zu einer
Ausbeute von 80,3% d. Th.
Führt man die Synthese unter pH-Stat-Bedingungen (KOH;
pH 8,5) in Abwesenheit von Borat-Puffer und NaCl
durch, dann beträgt die Ausbeute nach 2 h 83% d. Th.
Ein Vergleichsansatz führte nach 72 h zu unveränderter
Ausbeute.
2 ml 0,05 M Borat-Puffer, pH 9, enthaltend 0,2 M NaCl,
2 mM Mal-Phe-OMe, 50 mM H-Leu-Leu-NH₂ und 12 µM
Trypsinogen werden bei 25°C unter pH-Kontrolle
gerührt. Die Reaktion wird wie unter 1a beschrieben
abgestoppt. Nach 24 h beträgt die HPLC analytisch
bestimmte Ausbeute 61% d. Th. Ein Parallelansatz
führte nach 48 h zu einer Ausbeute von 60,3% d. Th.
1 ml 0,1 M Veronal-Na/HCl-Puffer, pH 8,3/56% (v/v)
DMSO, erhaltend 40 mM Mal-Phe-Phe-OCam, 120 mM
H-Leu-NH₂ und 40 µM Trypsinogen werden bei
Raumtemperatur unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 85 min
wird die Reaktionslösung mit 2 proz. Essigsäure
abgestoppt. Die Ausbeute wird HPLC analytisch bestimmt
und beträgt 72% d. Th.
1 ml 0,1 M Veronal-Na/HCl-Puffer, pH 8,3/50% (v/v)
DMSO, enthaltend 100 mM Boc-Phe-OCam, 300 mM H-Leu-NH₂
und 100 µM Trypsinogen, werden bei Raumtemperatur
unter pH-Kontrolle gerührt. Nach 3 h wird die Reaktion
wie unter 3 beschrieben gestoppt. Die Ausbeute wird
HPLC analytisch bestimmt und beträgt 93% d. Th.
0,5 ml 0,05 M Borat-Puffer, enthaltend 0,2 M NaCl,
2 mM Ac-Tyr-OEt, 50 mM H-Leu-NH₂ und 4 µM
Chymotrypsinogen werden bei 25°C unter pH-Kontrolle
gerührt. Die Reaktion wird wie unter 1a beschrieben
gestoppt. Nach 30 min beträgt die HPLC analytisch
bestimmte Ausbeute 83,5%. Ein Parallelansatz führte
nach 1 h zur gleichen Ausbeute, während nach 68 h
Reaktionszeit nur 59% d. Th. betrug.
Führt man dagegen die Synthese unter gleichen
Bedingungen, jedoch bei -15°C im gefrorenen Zustand
durch, dann beträgt die Ausbeute nach 24 h 93% d. Th.
Wie im Beispiel 5a jedoch mit 12 µM Trypsinogen als
Biokatalysator. Ausbeute nach 10 min: 76% d. Th.
Während Parallelansätze nach 30 min bzw. 60 min zu
gleichen Ausbeuten führten, wurde nach 68 h nur 66%
d. Th. erhalten.
Führt man dagegen die Synthese bei -15°C im gefrorenen
Zustand durch, dann werden nach 1 h 45% und nach 24 h
sogar 93% d. Th. erhalten.
2 ml 0,05 M Borat-Puffer, pH 9, enthaltend 0,2 M NaCl,
2 mM Bz-Arg-OEt, 50 mM H-Leu-NH₂ und 4 µM Trypsinogen
werden bei 25°C unter pH-Kontrolle gerührt. Die
Reaktion wird wie beschrieben gestoppt. Nach 5 min
beträgt die HPLC analytisch bestimmte Ausbeute 72%.
d. Th. Parallelansätze führten nach 1 h bzw. nach 24 h
zu 62% bzw. 0%. Ausbeute.
Führt man die Synthese nicht bei 25°C, sondern bei
-15°C im gefrorenen Zustand durch, dann beträgt die
Ausbeute bereits nach 1 h 93% d. Th. Ein
Parallelansatz führte nach 24 h unter den gleichen
Bedingungen ebenfalls zu 93% Ausbeute.
Wie im Beispiel 6a, jedoch mit 25 µM Chymotrypsinogen
als Biokatalysator. Die HPLC analytisch bestimmte
Ausbeute beträgt nach 24 h bei Raumtemperatur 50%
d. Th. bzw. nach 72 h 66% d. Th.
2 ml 0,05 M Borat-Puffer, pH 9, enthaltend 0,2 M NaCl,
2 mM Mal-Phe-OMe, 50 mM H-Ala-Ile-OH und 4 µM
Trypsinogen werden bei 25°C unter pH-Kontrolle
gerührt. Die Reaktion wird wie beschrieben gestoppt.
Nach 10 min beträgt die Ausbeute 68% d. Th.
Parallelansätze führten nach 1 h bzw. nach 24 h zu 58
bzw. 0% Ausbeute.
Führt man die Synthese nicht bei 25°C, sondern bei
-15°C im gefrorenen Zustand durch, dann beträgt die
Ausbeute nach 1 h 76% d. Th. Ein Parallelansatz
führte nach 24 h zu einer übereinstimmenden Ausbeute.
Wie im Beispiel 7a, jedoch mit 4 µM Chymotrypsinogen
als Biokatalysator. Die Ausbeute beträgt nach 24 h
65% bzw. nach 72 h 68% d. Th.
1 ml 0,05 m Veronal-Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,
enthaltend 0,2 M NaCl, 2 mM Phe-OMe, 50 mM Arg-NH₂ und
10 µM Chymotrypsinogen werden bei Raumtemperatur
gerührt. Nach 4 h wird die Reaktion mit 2,5 proz.
Trifluoressigsäure gestoppt. Die Ausbeute wird HPLC
analytisch bestimmt und beträgt 77% d. Th. Ein
Parallelansatz führte nach 24 h zu unveränderter
Ausbeute.
Wie im Beispiel 8a, jedoch mit 10 µM Trypsinogen. Die
Ausbeute beträgt nach 4 h 61% d. Th.
Claims (8)
1. Verfahren zur biokatalytischen Herstellung eines
Peptids,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Biokatalysator ein Zymogen einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das Peptid aus einem Aminosäureester oder
einem Peptidester und einer C-terminal
derivatisierten Aminosäure oder einem
Peptidfragment aufbaut.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das Peptid aus Substraten mittels eines
Zymogens aufbaut, das so gewählt wird, daß die
Geschwindigkeit des Peptidabbaus durch das dem
Zymogen korrespondierende Enzym mindestens um eine
Größenordnung langsamer ist als die
Verknüpfungsgeschwindigkeit der gewählten
Substrate.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Reaktion in einem wäßrigen Medium,
das ggf. Anteile organischer Lösungsmittel
enthalten kann, durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Reaktion in einem gefrorenen wäßrigen
Medium durchführt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Zymogen Chymotrypsinogen, Trypsinogen,
Pepsinogen, Prorennin oder Pro-Carboxypeptidase
einsetzt.
7. Verwendung eines Zymogens zur Peptidsynthese.
8. Verwendung eines Zymogens als solches als
Biokatalysator.
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Title |
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