DD260084A1

DD260084A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden

Info

Publication number: DD260084A1
Application number: DD30194987A
Authority: DD
Inventors: Volker Schellenberger; Ute Schellenberger; Andreas Koennecke; Hans-Dieter Jakubke
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1987-04-20
Filing date: 1987-04-20
Publication date: 1988-09-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung argininhaltiger Peptide. Ziel der Erfindung ist die Darstellung chiral einheitlicher Argininpeptide mit unblockierter Ganidofunktion mit Hilfe proteolytischer Enzyme. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass ein N-Acylaminosaeureester mit einem Argininester, dessen in Reaktion tretende Aminogruppe und Guanidofunktion unblockiert ist, in waessrigem Milieu unter Katalyse einer Cysteinproteinase umgesetzt werden, wobei in Abhaengigkeit von der Reaktionsfuehrung kontrolliert in einem Reaktionsschritt ein bis drei Argininbausteine in das Peptid eingefuegt werden koennen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von argininhaltigen Peptiden, die nach vollständiger bzw. partieller Abspaltung der Schutzgruppen als Wirkstoffe bzw. als Zwischenprodukte von Wirkstoffen dienen können.

Charakteristik der bekannten' technischen Lösungen

Zur Herstellung von Peptiden können verschiedene organisch-chemische Verfahren (vgl. Übersicht: WÜNSCH, E. [1974]Synthese von Peptiden, in HOUBEN-WEYL, Bd. 15,1/2, Methoden der organischen Chemie, MÜLLER, E. [Hrsg.] Georg Thieme Verlag, Stuttgart) eingesetzt werden. Im Verlauf chemischer Peptidsynthesen werden häufig unerwünschte Nebenreaktionen beobachtet, die die Ausbeute verringern und schwierige und langwierige Reinigungsprozesse erforderlich machen. Ein besonders schwerwiegender Nachteil der herkömmlichen Verfahren ist das ungelöste Problem der Racemisierung, die insbesondere bei Segmentkondensationen mittels chemischer Verknüpfungsmethoden in Erscheinung tritt. Da sich Stereoisomere kaum vollständig trennen lassen und die optische Reinheit der Syntheseprodukte für die biologische Aktivität eine notwendige Voraussetzung ist, besitzt die industrielle Synthese von Peptiden mittels organisch-chemischer Verfahren erhebliche Nachteile. Weiterhin müssen bei allen chemischen peptidsynthetischen Operationen die Drittfunktionen von Aminosäurebausteinen wegen der Gefahr von Nebenreaktionen reversibel maskiert werden, wobei es für die stark basische Guanidinofunktion des Arginine bis heute noch keine ideale Schutzgruppe gibt (vgl. H.-D. Jakubke u. H. Jeschkeit, Aminosäuren, Peptide, Proteine, 3. Aufl., Akademie-Verlag Berlin, 1982, S. 143-146). Zur Umgehung der geschilderten Schwierigkeiten bietet sich der Einsatz von Biokatalysatoren für die Katalyse des Peptidknüpfungsschritts an (vgl. Übersichten: Jakubke, H.-D. u. Kühl, P. [1982] Pharmazie 37,89; Fruton, J. S. [1982] in A. Meister: Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 53,239; Jakubke, H.-D. Kühl, P., u. Könnecke, A. [1985] Angew. Chem.97,79). Durch die Stereospezifität der als Biokatalysator eingesetzten Proteasen bleibt die chirale Integrität erhalten und der hohe Grad der Reaktionskontrolle ermöglicht einen weitgehenden Verzicht auf den Schutz von Drittfunktionen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung von chiral einheitlichen argininhaltigen Peptiden unter Einsatz von Biokatalysatoren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, N-Acylaminosäurealkylester in Gegenwart von Proteasen mit seitenkettenungeschützten Argininalkylestern als Nucleophil umzusetzen.

Erfindungsgemäß werden argininhaltige Peptide hergestellt aus einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid, dessen in Reaktion tretende Carboxylgruppe als Alkylester vorliegt, und einem Argininalkylester, bei dem die in Reaktion tretende Aminogruppe und die Guanidofunktion unblockiert sind, in Gegenwart löslicher oder immobilisierter Proteasen, wobei als Reaktionsmedium Wasser oder ein geeigneter Puffer, dem gegebenenfalls Anteile organischer Lösungsmittel zugesetzt sein können. In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen bilden sich kontrolliert argininhaftige Peptide, die mit geeigneten chromatographischen Techniken präparativ getrennt werden können. Nach beendeter Aufarbeitung können die Schutzgruppen erforderlichenfalls nach bekannten Methoden partiell oder vollständig entfernt werden. Im Gegensatz zu bekannten Synthesen argininhaltiger Peptide wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von Argininalkylestern als Aminokomponente in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen und der Art der Alkylestergruppierung der Aufbau von Peptiden ermöglicht, in denen ein, zwei oder drei Argininbausteine aufeinanderfolgend enthalten sein können, die im präparativen Maßstab getrennt werden können. Darüber hinaus sind argininenthaltende Peptide der allgemeinen Sequenz Y-Xxx-(Arg)_n-OR interessante Ausgangsprodukte für den Aufbau längerer Peptidsequenzen, wobei kinetisch kontrollierte trypsinkatalysierte Segmentverknüpfungen vorgenommen werden können.

Ausführungsbeispiele

In den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Zusätzlich werden folgende Abkürzungen verwendet:

Z	Benzyloxycarbonyl
OMe	Methylester
OCAM	Carboxamidomethylester
OiPr	Isopropylester
OiBu	Isobutylester

Beispiel 1 Synthese von Z-Ala-Arg-OiPr

4ml Wasser/Methanol (4/1, v/v), enthaltend 0,03M Z-AIa-OCAM und 0,1 M Arg-OiPr sowie 1,3mM EDTA, wurden am pH-Stat auf pH8,0 gestellt und danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,5mg Papain gestartet. Nach 2 min wurden durch Zugabe von 6 N HCI auf pH 3 gestellt und damit die Reaktion gestoppt. Die Ausbeute wurde durch lonenaustausch-HPLCan einer TSK CM-3SW, 7,5 · 150mm, analytisch bestimmt und betrug 87% d.Th.

Beispiel 2

Wie Beispiel 1, aber mit 195mg feuchtem Enzacryl-AA-Papain. Nach 7 min 84% d.Th. Ausbeute.

Beispiel 3 Synthese von Z-Ala-Arg-Arg-OMe

Wie in Beispiel 1 wurden 0,03 M Z-AIa-OCAM mit 0,3 M Arg-OMe umgesetzt, wobei nach 30 min nochmals Enzym zugefügt wurde. Nach 45min wurde gestoppt, und es hatten sich 53% d.Th. Tripeptidester gebildet.

Beispiel 4 Synthese von Z-Ala-Arg-Arg-Arg-OMe

Wie Beispiel 3, jedoch mit 0,2 M Arg-OMe. Nach 45min 21 % d.Th. Tetrapeptidester.

Beispiel 5 Synthese von Z-Gly-Arg-OMe

0,03 M Z-GIy-OCAM und 0,2 M Arg-OMe wurden wie in Beispiel 1 mit 7,5 mg Papain zur Reaktion gebracht. Nach 1 min 83% d.Th. Produkt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von argininhaltigen Peptiden aus Aminosäuren oder entsprechenden Peptiden, die mit einer alpha-Aminoschutzgruppe blockiert sind und deren in Reaktion tretende Carboxylfunktion eine Estergruppierung trägt, dadurch gekennzeichnet, daß als Reaktionspartner ein Argininester eingesetzt wird, dessen in Reaktion tretende Aminogruppe und Guanidofunktion unblockiert sind, wobei in wäßriger Lösung, die gegebenenfalls organische Lösungsmittelanteile und/oder Puffersubstanzen enthält, in Anwesenheit eines Enzyms gearbeitet wird, wobei mit steigender Proteasezugabe und längerer Zeitdauer zunehmend mehr Argininbausteine angeführt werden, und nach beendeter Kupplung und Aufarbeitung Schutzgruppen partiell oder vollständig entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine pflanzliche Cysteinprotease wie Papain, Brommelain o. dgl. verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Z-AIa-OCAM mit Ar-OiPr in wäßrig-methanolischer Lösung in Anwesenheit von EDTA auf pH = 8,0 eingestellt wird, die Reaktion durch Zugabe von Papain gestartet wird, nach 2 min durch Ansäuern auf pH = 3 gestoppt wird und das Z-Ala-Arg-OiPr separiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Z-AIa-OCAM mit Arg-OMe in wäßrig-methanolischer Lösung in Anwesenheit von EDTA auf pH = 8,0 eingestellt wird, die Reaktion durch Zugabe von Papain gestartet wird, nach 30 min weiteres Enzym zugefügt wird, nach 45 min durch Ansäuern auf pH = 3 die Reaktion gestoppt wird und der Tripeptidester abgetrennt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Z-AIa-OCAM mit Arg-OMe in wäßrig-methanolischer Lösung in Anwesenheit von EDTA auf pH = 8,0 eingestellt wird, die Reaktion durch Zugabe von Papain gestartet wird, nach 45min durch Ansäuern auf pH = 3 gestoppt wird und der Tetrapeptidester separiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease kovalent an einen unlöslichen Träger gebunden ist.