DD260084A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PEPTIDES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung argininhaltiger Peptide. Ziel der Erfindung ist die Darstellung chiral einheitlicher Argininpeptide mit unblockierter Ganidofunktion mit Hilfe proteolytischer Enzyme. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass ein N-Acylaminosaeureester mit einem Argininester, dessen in Reaktion tretende Aminogruppe und Guanidofunktion unblockiert ist, in waessrigem Milieu unter Katalyse einer Cysteinproteinase umgesetzt werden, wobei in Abhaengigkeit von der Reaktionsfuehrung kontrolliert in einem Reaktionsschritt ein bis drei Argininbausteine in das Peptid eingefuegt werden koennen.The invention relates to a process for the preparation of arginine-containing peptides. The aim of the invention is the preparation of chirally uniform arginine peptides with unblocked ganido function by means of proteolytic enzymes. The object is achieved in accordance with the invention by reacting an N-acylamino acid ester with an arginine ester whose amino group and guanidofunction are unblocked in an aqueous medium with catalysis of a cysteine proteinase, with one to three arginine units being controlled in a reaction step as a function of the reaction can be inserted into the peptide.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von argininhaltigen Peptiden, die nach vollständiger bzw. partieller Abspaltung der Schutzgruppen als Wirkstoffe bzw. als Zwischenprodukte von Wirkstoffen dienen können.The invention relates to a process for the preparation of arginine-containing peptides, which can serve as active ingredients or as intermediates of active compounds after complete or partial removal of the protective groups.
Zur Herstellung von Peptiden können verschiedene organisch-chemische Verfahren (vgl. Übersicht: WÜNSCH, E. [1974]Synthese von Peptiden, in HOUBEN-WEYL, Bd. 15,1/2, Methoden der organischen Chemie, MÜLLER, E. [Hrsg.] Georg Thieme Verlag, Stuttgart) eingesetzt werden. Im Verlauf chemischer Peptidsynthesen werden häufig unerwünschte Nebenreaktionen beobachtet, die die Ausbeute verringern und schwierige und langwierige Reinigungsprozesse erforderlich machen. Ein besonders schwerwiegender Nachteil der herkömmlichen Verfahren ist das ungelöste Problem der Racemisierung, die insbesondere bei Segmentkondensationen mittels chemischer Verknüpfungsmethoden in Erscheinung tritt. Da sich Stereoisomere kaum vollständig trennen lassen und die optische Reinheit der Syntheseprodukte für die biologische Aktivität eine notwendige Voraussetzung ist, besitzt die industrielle Synthese von Peptiden mittels organisch-chemischer Verfahren erhebliche Nachteile. Weiterhin müssen bei allen chemischen peptidsynthetischen Operationen die Drittfunktionen von Aminosäurebausteinen wegen der Gefahr von Nebenreaktionen reversibel maskiert werden, wobei es für die stark basische Guanidinofunktion des Arginine bis heute noch keine ideale Schutzgruppe gibt (vgl. H.-D. Jakubke u. H. Jeschkeit, Aminosäuren, Peptide, Proteine, 3. Aufl., Akademie-Verlag Berlin, 1982, S. 143-146). Zur Umgehung der geschilderten Schwierigkeiten bietet sich der Einsatz von Biokatalysatoren für die Katalyse des Peptidknüpfungsschritts an (vgl. Übersichten: Jakubke, H.-D. u. Kühl, P. [1982] Pharmazie 37,89; Fruton, J. S. [1982] in A. Meister: Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 53,239; Jakubke, H.-D. Kühl, P., u. Könnecke, A. [1985] Angew. Chem.97,79). Durch die Stereospezifität der als Biokatalysator eingesetzten Proteasen bleibt die chirale Integrität erhalten und der hohe Grad der Reaktionskontrolle ermöglicht einen weitgehenden Verzicht auf den Schutz von Drittfunktionen.For the preparation of peptides, various organic-chemical methods (see Overview: WÜNSCH, E. [1974] Synthesis of peptides, in HOUBEN-WEYL, Vol 15.1 / 2, Methods of Organic Chemistry, MÜLLER, E. [Hrsg .] Georg Thieme Verlag, Stuttgart) are used. In the course of chemical peptide syntheses, undesirable side reactions are frequently observed which reduce the yield and necessitate difficult and lengthy purification processes. A particularly serious disadvantage of the conventional processes is the unresolved problem of racemization, which occurs in particular in segmental condensation by means of chemical linking methods. Since stereoisomers can hardly be completely separated and the optical purity of the synthesis products is a necessary prerequisite for the biological activity, the industrial synthesis of peptides by means of organic-chemical processes has considerable disadvantages. Furthermore, in all chemical peptide synthetic operations, the third functions of amino acid building blocks must be reversibly masked due to the risk of side reactions, although there is still no ideal protecting group for the strongly basic guanidino function of arginine (see H.-D. Jakubke and H. Jeschkeit , Amino acids, peptides, proteins, 3rd ed., Akademie-Verlag Berlin, 1982, pp. 143-146). The use of biocatalysts for the catalysis of the peptide-linking step can be used to circumvent the difficulties described (for review, see: Jakubke, H.-D., and Kuhl, P. [1982] Pharmazy 37, 89; Fruton, JS [1982], in A. Meister: Adv. Enzymol., Relat. Areas Mol. Biol. 53, 239; Jakubke, H.-D. Kühl, P., and Könnecke, A. [1985] Angew Chem.97, 79). The stereospecificity of the proteases used as biocatalysts preserves the chiral integrity and the high degree of reaction control makes it possible to largely dispense with the protection of third-party functions.
Ziel der Erfindung ist die Herstellung von chiral einheitlichen argininhaltigen Peptiden unter Einsatz von Biokatalysatoren.The aim of the invention is the preparation of chirally uniform arginine-containing peptides using biocatalysts.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, N-Acylaminosäurealkylester in Gegenwart von Proteasen mit seitenkettenungeschützten Argininalkylestern als Nucleophil umzusetzen.The invention has for its object to implement N-Acylaminosäurealkylester in the presence of proteases with side chain protected Argininalkylestern as a nucleophile.
Erfindungsgemäß werden argininhaltige Peptide hergestellt aus einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid, dessen in Reaktion tretende Carboxylgruppe als Alkylester vorliegt, und einem Argininalkylester, bei dem die in Reaktion tretende Aminogruppe und die Guanidofunktion unblockiert sind, in Gegenwart löslicher oder immobilisierter Proteasen, wobei als Reaktionsmedium Wasser oder ein geeigneter Puffer, dem gegebenenfalls Anteile organischer Lösungsmittel zugesetzt sein können. In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen bilden sich kontrolliert argininhaftige Peptide, die mit geeigneten chromatographischen Techniken präparativ getrennt werden können. Nach beendeter Aufarbeitung können die Schutzgruppen erforderlichenfalls nach bekannten Methoden partiell oder vollständig entfernt werden. Im Gegensatz zu bekannten Synthesen argininhaltiger Peptide wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von Argininalkylestern als Aminokomponente in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen und der Art der Alkylestergruppierung der Aufbau von Peptiden ermöglicht, in denen ein, zwei oder drei Argininbausteine aufeinanderfolgend enthalten sein können, die im präparativen Maßstab getrennt werden können. Darüber hinaus sind argininenthaltende Peptide der allgemeinen Sequenz Y-Xxx-(Arg)n-OR interessante Ausgangsprodukte für den Aufbau längerer Peptidsequenzen, wobei kinetisch kontrollierte trypsinkatalysierte Segmentverknüpfungen vorgenommen werden können.According to the invention arginine-containing peptides are prepared from a selectively protected amino acid or a selectively protected peptide whose reacting carboxyl group is present as an alkyl ester, and a Argininalkylester in which the reacting amino group and the guanido are unblocked, in the presence of soluble or immobilized proteases as the reaction medium, water or a suitable buffer to which, if appropriate, proportions of organic solvents may be added. Depending on the reaction conditions, arginine-like peptides are formed in a controlled manner, which can be separated preparatively by suitable chromatographic techniques. After completion of the work-up, if necessary, the protective groups can be partially or completely removed by known methods. In contrast to known syntheses of arginine-containing peptides, the use according to the invention of arginine alkyl esters as amino component, depending on the reaction conditions and the type of alkyl ester grouping, makes it possible to build up peptides in which one, two or three arginine units can be sequentially added, which are separated on a preparative scale can be. In addition, arginine-containing peptides of the general sequence Y-Xxx- (Arg) n -OR are interesting starting materials for the construction of longer peptide sequences, whereby kinetically controlled trypsin-catalyzed segment linkages can be made.
In den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Zusätzlich werden folgende Abkürzungen verwendet:In the examples, the amino acids are abbreviated according to the internationally valid rules. In addition, the following abbreviations are used:
4ml Wasser/Methanol (4/1, v/v), enthaltend 0,03M Z-AIa-OCAM und 0,1 M Arg-OiPr sowie 1,3mM EDTA, wurden am pH-Stat auf pH8,0 gestellt und danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,5mg Papain gestartet. Nach 2 min wurden durch Zugabe von 6 N HCI auf pH 3 gestellt und damit die Reaktion gestoppt. Die Ausbeute wurde durch lonenaustausch-HPLCan einer TSK CM-3SW, 7,5 · 150mm, analytisch bestimmt und betrug 87% d.Th.4 ml of water / methanol (4/1, v / v) containing 0.03M Z-Ala-OCAM and 0.1M Arg-OiPr and 1.3mM EDTA were adjusted to pH8.0 on pH-Stat and thereafter the reaction started by adding 1.5mg papain. After 2 minutes, the pH was adjusted to 3 by the addition of 6N HCl and the reaction was stopped. The yield was determined analytically by ion exchange HPLC on a TSK CM-3SW, 7.5 x 150 mm, and found to be 87% of theory.
Wie Beispiel 1, aber mit 195mg feuchtem Enzacryl-AA-Papain. Nach 7 min 84% d.Th. Ausbeute.As Example 1, but with 195mg wet Enzacryl-AA-Papain. After 7 min 84% of theory Yield.
Wie in Beispiel 1 wurden 0,03 M Z-AIa-OCAM mit 0,3 M Arg-OMe umgesetzt, wobei nach 30 min nochmals Enzym zugefügt wurde. Nach 45min wurde gestoppt, und es hatten sich 53% d.Th. Tripeptidester gebildet.As in Example 1, 0.03 M Z-Ala-OCAM were reacted with 0.3 M Arg-OMe, enzyme being added again after 30 min. After 45 min was stopped, and it had 53% of theory. Tripeptide ester formed.
Wie Beispiel 3, jedoch mit 0,2 M Arg-OMe. Nach 45min 21 % d.Th. Tetrapeptidester.As Example 3, but with 0.2 M Arg-OMe. After 45 minutes 21% of theory Tetrapeptidester.
0,03 M Z-GIy-OCAM und 0,2 M Arg-OMe wurden wie in Beispiel 1 mit 7,5 mg Papain zur Reaktion gebracht. Nach 1 min 83% d.Th. Produkt.0.03 M Z-Gly-OCAM and 0.2 M Arg-OMe were reacted as in Example 1 with 7.5 mg papain. After 1 min 83% of theory Product.
Claims (6)
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DD30194987A DD260084A1 (en) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PEPTIDES |
Applications Claiming Priority (1)
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DD30194987A DD260084A1 (en) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PEPTIDES |
Publications (1)
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DD260084A1 true DD260084A1 (en) | 1988-09-14 |
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Family Applications (1)
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DD30194987A DD260084A1 (en) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PEPTIDES |
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DD (1) | DD260084A1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003051918A1 (en) * | 2001-12-19 | 2003-06-26 | Astrazeneca Ab | Solution-phase process for the manufacture of decapeptide |
-
1987
- 1987-04-20 DD DD30194987A patent/DD260084A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2003051918A1 (en) * | 2001-12-19 | 2003-06-26 | Astrazeneca Ab | Solution-phase process for the manufacture of decapeptide |
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