DD274235A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PEPTIDES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die nach vollstaendiger bzw. partieller Schutzgruppenabspaltung als Enzymsubstrate oder Peptidwirkstoffe bzw. als Zwischenprodukte von Wirkstoffen dienen koennen. Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung sterisch einheitlicher Peptide in homogener Phase unter Bedingungen der Zurueckdraengung unerwuenschter proteasekatalysierter Bindungsspaltungen sowohl in den Edukten als auch im Produkt. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass N-Acylaminosaeureester mit hohem Kcat/KM-Werten im Ueberschuss eingesetzt werden, die die Sekundaerhydrolyse entscheidend zurueckdraengen und darueber hinaus den Einbau von Acyldonoraminosaeuren gestatten, die nicht der literaturbekannten Proteasespezifitaet entsprechen, wodurch eine entscheidende Verbreiterung des Einsatzes von Serinproteasen wie alpha-Chymotrypsin als Biokatalysatoren fuer enzymatische Peptidsynthesen resultiert.The invention relates to a process for the preparation of peptides which, after complete or partial deprotection, can serve as enzyme substrates or peptide active agents or as intermediates of active compounds. The object of the invention is the preparation of sterically uniform peptides in the homogeneous phase under conditions of the backward penetration of undesired protease-catalyzed bond cleavages both in the educts and in the product. The object is achieved according to the invention that N-Acylaminosaeureester be used with high Kcat / KM values in excess, which decisively back Sekundaerhydrolyse and beyond allow the incorporation of Acyldonoraminosaeuren that do not correspond to the literature known Proteasepezifitaet, creating a significant broadening of the use of serine proteases such as alpha-chymotrypsin results as biocatalysts for enzymatic peptide syntheses.
Description
Anwendungsbereich der ErfindungScope of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die nach gegebenenfalls vollständiger bzw. partitieüer Abspaltung dor Schutzgruppen als Enzymsubstrate oder Wirkstoffe bzw. als Intermediate von Wirkstoffen dienen können.The invention relates to a process for the preparation of peptides which, after optionally complete or partial removal of the protective groups, can serve as enzyme substrates or active substances or as intermediates of active substances.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Zur Herstellung von Peptiden können mehr als 140 verschiedene organisch-chemische Verfahren (vgl. Übersichten: Wünsch, E. [1974] Synthese von Peptiden, Houben-Weyl, Bd. 15,1/2, Methoden der organischen Chemie, Müller, E. (Hrsg.) Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Jakubke, H.-D., und Jeschkeit, H., Aminosäuren, Peptide, Proteine, 3. Aufl., Akademie-Verlag, Berl'n [1982)) eingesetzt werden. Bei chemischen Peptidsynthesen werden häufig unerwünschte Nebenreaktionen beobachtet, d\: ausbeuteverringernd wirken und langwierige Reinigungsprozesse erforderlich machen. Ein besonders schwerwiegender Nachteil der herkömmlichen chemischen Verfahren ist das ungelöste Problem der Racemisierung, die insbesondere bei der chemischen Verknüpfung von Peptidsegmenten in Erscheinung tritt (vgl. u.a. Meienhofer, J., [1981] Biopolymers 20,1761-1784). Da sirn Diastereomere kaum vollständig abtrennen lassen und diechirale Integrität für die biologische Wirkung eine notwendige Voraussetzung ist, besitzen die industriellen Verfahren zur Synthese von Peptiden mittels chemischer Kupplungsmethoden deutliche Nachteile. Weiterhin müssen bei allen themischen peptidsynthetischen Operationen die Drittfunktionen von A.ninosäurebausteinen wegen der Gefahr von Nebenreaktionen reversibel blockiert werden. Zur Umgehung der aufgezeigten Schwierigkeiten bietet sich der Einsatz von Biokatalysatoren für die Katalyse dar Knüpfung von Peptidbindungen an (vgl. Übersichten: Jakubke, H.-D., und Kühl, P., [1982] Pharmazie 37,89-106; Fruton, J. S., [1982] Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 53,2,39-306; Jakubke, H.-D., Kühl, P., und Könnecke, A., (1985) Angew. Chem. 97,79-87). Durch die StereG- und Regioselektivität der als Biokatalysatorsn eingesetzten Proteasen wird einerseits die optiscne Reinheit der Syntheseprodukte gewährleistet, und andererseits ermöglicht der hohe Grad der Reaktionskontrolle einen weitgehenden Verzicht auf den Schutz von Drittfunktionen.For the production of peptides, more than 140 different organic-chemical processes can be used (for review, see: Wünsch, E. [1974] Synthesis of Peptides, Houben-Weyl, Vol. 15,1 / 2, Methods of Organic Chemistry, Müller, E. (Ed.) Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Jakubke, H.-D., and Jeschkeit, H., Amino Acids, Peptides, Proteins, 3rd ed., Akademie-Verlag, Berl'n [1982]). In chemical peptide syntheses, undesirable side reactions are often observed, which have the effect of reducing the yield and necessitating lengthy purification processes. A particularly serious disadvantage of the conventional chemical Ver Ahren f is the unsolved problem of racemization, which makes its appearance in particular in the chemical linkage of peptide segments (see., Inter alia, Meienhofer, J., [1981] Biopolymers 20.1761 to 1784). Since it is difficult to completely separate diastereomers and the chiral integrity is a necessary prerequisite for the biological action, the industrial processes for the synthesis of peptides by means of chemical coupling methods have distinct disadvantages. Furthermore, in all thematic peptide synthetic operations, the third functions of A.nino acid building blocks must be reversibly blocked because of the risk of side reactions. To circumvent the difficulties indicated, the use of biocatalysts for the catalysis of peptide bond formation is useful (for review, see: Jakubke, H.-D., and Kühl, P., [1982] Pharm. 37, 89-106; Fruton, JS, [1982] Adv. Enzymol., Rel. Areas Mol. Biol., 53, 23, 39-306, Jakubke, H.-D., Kühl, P., and Könnecke, A., (1985) Angew. Chem 97, 79-87). The stereochemistry and regioselectivity of the proteases used as biocatalysts ensures, on the one hand, the optic purity of the synthesis products and, on the other hand, the high degree of reaction control makes it possible to largely dispense with the protection of third-order functions.
Allgemein unterscheidet man zwischen gleichgewichtskontrollierten und kinetisch kontrollierten enzymkatalysierten Peptidsynthesen. Während es sich bei der ersten Variante um die direkte Umkehrung der Proteolyse handelt, werden bei kinetisch kontrollierten Synthesen als Carboxykomponenten in der Reg,el Alkylester eingesetzt, die die notwendige temporäre Acylierung der als Biokatalysatoren nur verwendbaren Serin- oder Cysteinproteasen begünstigen. Die kinetisch kontrollierte enzymatische Peptidsynthese besitzt wegen der Kürze der Reaktionsdauer und des geringeren Enzymbedarfs deutliche Vorteile gegenüber der gleichgewichtskontrollierten enzymatischen Peptidsynthese (vgl. Übersicht: Jakubke, H.-D., [1987] in: The Peptides [S. Udenfriend and J. Meienhofer, Hrsg.) Vol. 9, S. 103-165, Academic Press, New York). Bei Synthesen inhomogener Phase besteht jedoch die permanente Gefahr, daß die als Biokatalysatoren verwendeten Proteasen unerwünschte Bindungsspaltungen katalysieren.In general, a distinction is made between equilibrium-controlled and kinetically controlled enzyme-catalyzed peptide syntheses. While the first variant involves the direct reversal of proteolysis, in kinetically controlled syntheses, alkyl esters are used as the carboxy components in the reg, which favor the necessary temporary acylation of the serine or cysteine proteases which can only be used as biocatalysts. The kinetically controlled enzymatic peptide synthesis has clear advantages over equilibrium-controlled enzymatic peptide synthesis because of the short duration of the reaction and the lower enzyme requirement (see Overview: Jakubke, H.-D., [1987] in: The Peptides [S. Udenfriend and J. Meienhofer , Ed.) Vol. 9, pp. 103-165, Academic Press, New York). However, in syntheses of inhomogeneous phase there is a permanent risk that the proteases used as biocatalysts catalyze unwanted bond cleavage.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist die Herstellung chiral einheitlicher Peptide auf kostengünstige Weise, in guter Ausbeute, bei einfacher Reaktionsführung.The aim of the invention is the production of chirally uniform peptides in a cost effective manner, in good yield, with simple reaction.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von chiral einheitlichen Peptiden in homogener Phase unter Einsatz von Bioketalysatoren unter Bedingungen dot Zurückdrängung unerwünschter prcteasekatalysierter Bindungsspaltungen a !zugeben. Erfindungsgemsß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Peptide hergestellt werden aus einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid, dessen in Reaktion tretende Carboxylgruppe als Ester vorlisgt, und einer Am nokomponente, bei der die in die Reaktion tretende Aminogruppe unblockiert ist, in Gegenwart löslicher oder immobilisierter Serien- oder Cysteinproteasen, wobei als Reaktionsmedium Wasser dient oder ein geeigneter Puffor, dem gegebenenfalls Anteile: organischer Lösungsmittel zugesetzt sein können. Dazu werden N-Acylaminosäureesler in Gegenwart von Proteasen mit Aminokomponenten umgesetzt, die selbst proteolysesensitive Spaltstellen enthalten. Nach Abstoppen der Reaktion nach Erruichon des Produktmaximums bzw. vor vollst-' . ngem Esterverbrauch und nach üblicher Aufarbeitung können die Schutzgruppen erforderlichenfalls nach bekannten Methoden partitiell oder vollständig entfernt werden. Im Gegensatz zu bekannten kinetisch kontrollierten proteasokatalysierten Synthesen unter Einsatz von Serion- und Cysteinproteason und einfachen Alkylestern, /vie Methyl- und Ethylestem, wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von N-Acylaminosäureestern mit hohem Kcs,/KM-Wert3n in Abhängigkeit von der Art der Estergruppierung und den Real-tionsbedingungen der Autbau von Peptiden ermöglicht, in denen sich neben der neugeknüpften Bindung noch weitere proteasesensitive Spaltstellen befinden. Dai über hinaus muß dia C-terminale Acyldonoraminosäure nicht der literaturbekannten Proteasespezifität entsprechen, wodurch die Gefahr der Sekundärhydrolyso zusätzlich verringert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Peptiden besitzt gegenüber bisher bekannten Verfahren der proteasekatalysierten kinotisch kontrollierten Peptidsynthese den Vorteil, daß unter den neuen Synthesebedingungen ein lösliches Peptidprodukt trotz proteasesensitiver Peptidbindungen in der Sequenz in hoher Ausbeute erhalten werden kann. Es ist allgemein üblich und vorherrschende Meinung, daß ein in homogener Phase gebildetes Peptid mit proteasesensitiven Spaltstellen einer synchron zur Bildung verlaufenden Proteolyse unterliegt. Es wird erstmals gezeigt, daß möglich ist, Enzymsubstrate für diejenige Protease zu synthetisieren, die die Peptidknüpfungsreaktion in homogener Lösung katalysiert. Unerwartet führt die proteasekatalvsierte Kupplungsreaktion zu guten Ausbeuten an Peptid in sehr kurzen Reaktionszeiten bei Raumtemperatur. Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The object of the invention is to provide a process for the preparation of chirally uniform peptides in a homogeneous phase using biocatalysts under conditions of repulsion of undesired prctease-catalyzed bond cleavages. According to the invention, the object is achieved by preparing peptides from a selectively protected amino acid or a selectively protected peptide whose esterifying carboxyl group is present as an ester, and an amino component in which the amino group entering the reaction is unblocked, more soluble in the presence or immobilized series or cysteine proteases, wherein the reaction medium used is water or a suitable Puffor, to which may optionally be added proportions: organic solvents. For this purpose, N-acyl amino acid esters are reacted in the presence of proteases with amino components which themselves contain proteolysis-sensitive cleavage sites. After stopping the reaction after erruichone of the product maximum or before complete. If the ester is consumed and after customary workup, the protective groups can be removed, if necessary, partially or completely by known methods. In contrast to known kinetically controlled protease-catalyzed syntheses using serion and cysteine proteases and simple alkyl esters, including methyl and ethyl esters, the use of N-acylamino acid residues r n according to the invention gives high K cs , / K M value 3n as a function of the nature of the ester grouping and the conditions of realization of the construction of peptides in which, in addition to the newly knotted bond, further protease-sensitive cleavage sites are located. In addition, the C-terminal acyl donor amino acid does not have to correspond to the protease specificity known from the literature, which additionally reduces the risk of secondary hydrolysis. The method according to the invention for the production of peptides has the advantage over previously known methods of protease-catalyzed kinotically controlled peptide synthesis that a soluble peptide product can be obtained in high yield despite protease-sensitive peptide bonds in the sequence under the new synthesis conditions. It is a common and prevalent opinion that a homogeneous-phase peptide with protease-sensitive cleavage sites is subject to proteolysis that is in sync formation. It is shown for the first time that it is possible to synthesize enzyme substrates for the protease which catalyzes the peptide-linking reaction in homogeneous solution. Unexpectedly, the protease-catalyzed coupling reaction leads to good yields of peptide in very short reaction times at room temperature. The invention will be explained in more detail below by exemplary embodiments.
Ausführungsbeispieleembodiments
In den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Zusätzlich werden folgende Abkürzungen verwendet:In the examples, the amino acids are abbreviated according to the internationally valid rules. In addition, the following abbreviations are used:
a) ausgehend von Glt-Leu-0Bz1a) starting from Glt-Leu-0Bz1
500μΙ Wasser/DMSO (9:1, v/v), enthaltend 2OmM Glt-Lou-OBz1 und 5mM Phe-pNA, wurden am pH-Stat auf pH 9 gestellt, und danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,15 mg Chymotrypsin bei 25°C gestartet. Nach 5 min wurde durch Zugabe von 6 N HCI auf pH 3 gestellt und damit die Rec k'.ion gestoppt. Die Ausbeute wurde durch HPLC analytisch bestimmt und betrug 34% d.Th.500μl water / DMSO (9: 1, v / v) containing 20mM Glt-Lou-OBz1 and 5mM Phe-pNA were adjusted to pH 9 on pH-stat, and thereafter the reaction was stopped by adding 0.15mg chymotrypsin started at 25 ° C. After 5 minutes, the pH was adjusted to 3 by the addition of 6N HCl and the Rec k'.ion stopped. The yield was determined analytically by HPLC and was 34% of theory.
b) ausgehend von Glt-Leu-ONbb) starting from Glt-Leu-ONb
Wie Beispiel 1 a, aber mit 2OmM Glt-Leu-ONb anstelle von Glt-Leu-OBz1. Nach 5 min 63% d.Th.As Example 1 a, but with 2OmM Glt-Leu-ONb instead of Glt-Leu-OBz1. After 5 min 63% of theory
Synthese von Maleyl-L-leucyl-L-phenylalanin-4-nitroanilid a) ausgehend von Mal-Leu-OMeSynthesis of maleyl-L-leucyl-L-phenylalanine-4-nitroanilide a) starting from Mal-Leu-OMe
Wie Beispiel 1a, aber mit 2OmM Mal-l.eu-OMe anstelle von Glt-i äu-OBz1. Nach 10min 3% d.Th. i ausgehend von Mal-Leu-OBz1 Wie Beispiel 1 a, aber mit 2OmM Mal-Leu-OBz 1 anstelle von Glt-Leu-OBz1. Nach 5min 65% d.Th.As Example 1a, but with 2OmM Mal-l.eu-OMe instead of Glt-i äu-OBz1. After 10min 3% of theory i from Mal-Leu-OBz1 As Example 1 a but with 2OmM Mal-Leu-OBz 1 instead of Glt-Leu-OBz1. After 5 min 65% of theory
c) ausgehend von Mal-Leu-ONbc) starting from Mal-Leu-ONb
Wie Beir;-iei 1 a, aber mit 2OmM Mal-Leu-ONb anstelle von GIt- Leu-OBz1. Nach 5min 80,5% d.Th.Like Beir; -iei 1 a, but with 2OmM Mal-Leu-ONb instead of GIt-Leu-OBz1. After 5 minutes 80.5% of theory
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