DD274235A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die nach vollstaendiger bzw. partieller Schutzgruppenabspaltung als Enzymsubstrate oder Peptidwirkstoffe bzw. als Zwischenprodukte von Wirkstoffen dienen koennen. Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung sterisch einheitlicher Peptide in homogener Phase unter Bedingungen der Zurueckdraengung unerwuenschter proteasekatalysierter Bindungsspaltungen sowohl in den Edukten als auch im Produkt. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass N-Acylaminosaeureester mit hohem Kcat/KM-Werten im Ueberschuss eingesetzt werden, die die Sekundaerhydrolyse entscheidend zurueckdraengen und darueber hinaus den Einbau von Acyldonoraminosaeuren gestatten, die nicht der literaturbekannten Proteasespezifitaet entsprechen, wodurch eine entscheidende Verbreiterung des Einsatzes von Serinproteasen wie alpha-Chymotrypsin als Biokatalysatoren fuer enzymatische Peptidsynthesen resultiert.

Description

Anwendungsbereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die nach gegebenenfalls vollständiger bzw. partitieüer Abspaltung dor Schutzgruppen als Enzymsubstrate oder Wirkstoffe bzw. als Intermediate von Wirkstoffen dienen können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Herstellung von Peptiden können mehr als 140 verschiedene organisch-chemische Verfahren (vgl. Übersichten: Wünsch, E. [1974] Synthese von Peptiden, Houben-Weyl, Bd. 15,1/2, Methoden der organischen Chemie, Müller, E. (Hrsg.) Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Jakubke, H.-D., und Jeschkeit, H., Aminosäuren, Peptide, Proteine, 3. Aufl., Akademie-Verlag, Berl'n [1982)) eingesetzt werden. Bei chemischen Peptidsynthesen werden häufig unerwünschte Nebenreaktionen beobachtet, d\: ausbeuteverringernd wirken und langwierige Reinigungsprozesse erforderlich machen. Ein besonders schwerwiegender Nachteil der herkömmlichen chemischen Ver^fahren ist das ungelöste Problem der Racemisierung, die insbesondere bei der chemischen Verknüpfung von Peptidsegmenten in Erscheinung tritt (vgl. u.a. Meienhofer, J., [1981] Biopolymers 20,1761-1784). Da sirn Diastereomere kaum vollständig abtrennen lassen und diechirale Integrität für die biologische Wirkung eine notwendige Voraussetzung ist, besitzen die industriellen Verfahren zur Synthese von Peptiden mittels chemischer Kupplungsmethoden deutliche Nachteile. Weiterhin müssen bei allen themischen peptidsynthetischen Operationen die Drittfunktionen von A.ninosäurebausteinen wegen der Gefahr von Nebenreaktionen reversibel blockiert werden. Zur Umgehung der aufgezeigten Schwierigkeiten bietet sich der Einsatz von Biokatalysatoren für die Katalyse dar Knüpfung von Peptidbindungen an (vgl. Übersichten: Jakubke, H.-D., und Kühl, P., [1982] Pharmazie 37,89-106; Fruton, J. S., [1982] Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 53,2,39-306; Jakubke, H.-D., Kühl, P., und Könnecke, A., (1985) Angew. Chem. 97,79-87). Durch die StereG- und Regioselektivität der als Biokatalysatorsn eingesetzten Proteasen wird einerseits die optiscne Reinheit der Syntheseprodukte gewährleistet, und andererseits ermöglicht der hohe Grad der Reaktionskontrolle einen weitgehenden Verzicht auf den Schutz von Drittfunktionen.

Allgemein unterscheidet man zwischen gleichgewichtskontrollierten und kinetisch kontrollierten enzymkatalysierten Peptidsynthesen. Während es sich bei der ersten Variante um die direkte Umkehrung der Proteolyse handelt, werden bei kinetisch kontrollierten Synthesen als Carboxykomponenten in der Reg,el Alkylester eingesetzt, die die notwendige temporäre Acylierung der als Biokatalysatoren nur verwendbaren Serin- oder Cysteinproteasen begünstigen. Die kinetisch kontrollierte enzymatische Peptidsynthese besitzt wegen der Kürze der Reaktionsdauer und des geringeren Enzymbedarfs deutliche Vorteile gegenüber der gleichgewichtskontrollierten enzymatischen Peptidsynthese (vgl. Übersicht: Jakubke, H.-D., [1987] in: The Peptides [S. Udenfriend and J. Meienhofer, Hrsg.) Vol. 9, S. 103-165, Academic Press, New York). Bei Synthesen inhomogener Phase besteht jedoch die permanente Gefahr, daß die als Biokatalysatoren verwendeten Proteasen unerwünschte Bindungsspaltungen katalysieren.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung chiral einheitlicher Peptide auf kostengünstige Weise, in guter Ausbeute, bei einfacher Reaktionsführung.

Darlegung des Wesens e'er Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von chiral einheitlichen Peptiden in homogener Phase unter Einsatz von Bioketalysatoren unter Bedingungen dot Zurückdrängung unerwünschter prcteasekatalysierter Bindungsspaltungen a !zugeben. Erfindungsgemsß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Peptide hergestellt werden aus einer selektiv geschützten Aminosäure oder einem selektiv geschützten Peptid, dessen in Reaktion tretende Carboxylgruppe als Ester vorlisgt, und einer Am nokomponente, bei der die in die Reaktion tretende Aminogruppe unblockiert ist, in Gegenwart löslicher oder immobilisierter Serien- oder Cysteinproteasen, wobei als Reaktionsmedium Wasser dient oder ein geeigneter Puffor, dem gegebenenfalls Anteile: organischer Lösungsmittel zugesetzt sein können. Dazu werden N-Acylaminosäureesler in Gegenwart von Proteasen mit Aminokomponenten umgesetzt, die selbst proteolysesensitive Spaltstellen enthalten. Nach Abstoppen der Reaktion nach Erruichon des Produktmaximums bzw. vor vollst-' . ngem Esterverbrauch und nach üblicher Aufarbeitung können die Schutzgruppen erforderlichenfalls nach bekannten Methoden partitiell oder vollständig entfernt werden. Im Gegensatz zu bekannten kinetisch kontrollierten proteasokatalysierten Synthesen unter Einsatz von Serion- und Cysteinproteason und einfachen Alkylestern, /vie Methyl- und Ethylestem, wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von N-Acylaminosäureeste^rn mit hohem K_cs,/K_M-Wert3n in Abhängigkeit von der Art der Estergruppierung und den Real-tionsbedingungen der Autbau von Peptiden ermöglicht, in denen sich neben der neugeknüpften Bindung noch weitere proteasesensitive Spaltstellen befinden. Dai über hinaus muß dia C-terminale Acyldonoraminosäure nicht der literaturbekannten Proteasespezifität entsprechen, wodurch die Gefahr der Sekundärhydrolyso zusätzlich verringert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Peptiden besitzt gegenüber bisher bekannten Verfahren der proteasekatalysierten kinotisch kontrollierten Peptidsynthese den Vorteil, daß unter den neuen Synthesebedingungen ein lösliches Peptidprodukt trotz proteasesensitiver Peptidbindungen in der Sequenz in hoher Ausbeute erhalten werden kann. Es ist allgemein üblich und vorherrschende Meinung, daß ein in homogener Phase gebildetes Peptid mit proteasesensitiven Spaltstellen einer synchron zur Bildung verlaufenden Proteolyse unterliegt. Es wird erstmals gezeigt, daß möglich ist, Enzymsubstrate für diejenige Protease zu synthetisieren, die die Peptidknüpfungsreaktion in homogener Lösung katalysiert. Unerwartet führt die proteasekatalvsierte Kupplungsreaktion zu guten Ausbeuten an Peptid in sehr kurzen Reaktionszeiten bei Raumtemperatur. Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele

In den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Zusätzlich werden folgende Abkürzungen verwendet:

pNA	4-Nitroanilid
GIt	Glutalryl
Mal	Maleyl (3-Carboxyacryloyl)
OMe	Methylester
OBzI	Benzylester
ONb	4-Nitrobenzylester
DMSO	Dirnethylsulfoxid

Beispiel 1 Synthese von Glutaryl-L-leucyl-L-phenylalanln-4-nitroanilid

a) ausgehend von Glt-Leu-0Bz1

500μΙ Wasser/DMSO (9:1, v/v), enthaltend 2OmM Glt-Lou-OBz1 und 5mM Phe-pNA, wurden am pH-Stat auf pH 9 gestellt, und danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,15 mg Chymotrypsin bei 25°C gestartet. Nach 5 min wurde durch Zugabe von 6 N HCI auf pH 3 gestellt und damit die Rec k'.ion gestoppt. Die Ausbeute wurde durch HPLC analytisch bestimmt und betrug 34% d.Th.

b) ausgehend von Glt-Leu-ONb

Wie Beispiel 1 a, aber mit 2OmM Glt-Leu-ONb anstelle von Glt-Leu-OBz1. Nach 5 min 63% d.Th.

Beispiel 2

Synthese von Maleyl-L-leucyl-L-phenylalanin-4-nitroanilid a) ausgehend von Mal-Leu-OMe

Wie Beispiel 1a, aber mit 2OmM Mal-l.eu-OMe anstelle von Glt-i äu-OBz1. Nach 10min 3% d.Th. i ausgehend von Mal-Leu-OBz1 Wie Beispiel 1 a, aber mit 2OmM Mal-Leu-OBz 1 anstelle von Glt-Leu-OBz1. Nach 5min 65% d.Th.

c) ausgehend von Mal-Leu-ONb

Wie Beir;-iei 1 a, aber mit 2OmM Mal-Leu-ONb anstelle von GIt- Leu-OBz1. Nach 5min 80,5% d.Th.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden aus Aminosäuren oder entsprechenden Peptiden, die mit einer alpha-Aminoschutzgruppe blockiert sind und deren in Reaktion tretende Carboxylgruppe verestert vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß ein Acylaminosäureester eingesetzt wird, dessen Kcat/KM-Wert größer ist als der des gebildeten Peptids und als Reaktionspartner eine Aminokomponente verwendet wird, deren in Reaktion tretende Aminofunktion unblockiert ist und in deren Sequenz proteasesensitivePeptidbindungen enthalten sind, wobei in wäßriger Lösung, die gegebenenfalls organische Lösungsmittelanteile und/oder Puffersubstanzen enthält, in Anwesenheit eines Enzyms gearbeitet wird, wobei nach Erreichen des Produktmaximums bzw. bei noch nicht vollständigem Esterverbrauch die Kupplungsreaktion durch Säurezugabe bzw. Filtration des immobilisierten Enzyms gestoppt und nach üblicher Aufarbeitung Schutzgruppen erforderlichenfalls partitiell oder vollständig entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine Serinprotease wie Chymotrypsin, Elastase ο. dgl. bzw. eine Cysteinprotease wie Papain o. dgl. verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Acyldon^rester im Vergleich zur Aminokomponente im Überschuß eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease an einen unlöslichen Trägergebunden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die C-terminale Acyldonoi aminosäure nicht der literaturbekannten Proteasespezifität entspricht.