DE2509482A1 - Verfahren zur herstellung des kallikrein-trypsin-inhibitors aus rinderlunge - Google Patents

Verfahren zur herstellung des kallikrein-trypsin-inhibitors aus rinderlunge

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DE2509482A1 DE19752509482 DE2509482A DE2509482A1 DE 2509482 A1 DE2509482 A1 DE 2509482A1 DE 19752509482 DE19752509482 DE 19752509482 DE 2509482 A DE2509482 A DE 2509482A DE 2509482 A1 DE2509482 A1 DE 2509482A1
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Description

Bayer Aktiengesellschaft
Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen
509 Leverkusen, Bayerwerk Er/Bä
C2(PH)
i 4. MRZ. 1975
Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsln-Inhibitors aus Rinderlunge
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des bekannten biologisch wirksamen Kallikreln-Trypsin-Inbibitors durch Behandlung des biologischen Ausgangsmaterials mit proteolytischen Enzymen, Adsorption der lallikrein-Trypsin-Inhibitor-haltigen Lösung an trägergebundenem Trypsin und anschließende Desorption des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors.
Es ist bereits bekannt geworden, daß der Eallikrein-Irypsin-Inhibitor nach der deutschen Patentschrift 1 084 433 mit waseersischbaren organischen !lösungsmitteln« vornehmlich Methanol in Gegenwart τοη Salzen oder Hydroxiden der Erdalkalimetalle aus zerkleinerten tierischen Organen gewonnen werden kann. Biese selektive Extraktionsart liefert bereits relativ reinen Inhibitor,, da hochmolekulare Proteine denaturiert werden. Ein !fachten dieser Methode ist jedoch, daß die organischen Lösungsmittel in explosionssicheren Anlagen
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zurückgewonnen werden müssen. Außerdem ist bekannt, daß die Ausbeute abhängig vom Grad der Zerkleinerung der Organe ist· Die Ausbeute an Kallikrein-Trypsin-Inhibitor kann durch nochmalige Extraktion des Organs nach dem gleichen Prinzip erhöht werden.
Andererseits ist bekannt geworden, daß der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor mit starken Säuren wie Schwefelsäure (Französische Patentschrift 1 566 777), 3?riehloressigeäure (Deutsche Patentschrift 1 011 576), Oxalsäure (Deutsche Patentschrift 1 492 114) oder Perchlorsäure (Zeitschrift für Physiologische Chemie (1964) 22§, 228 -390) aus verschiedenen Organen extrahiert werden kann. Die mit Säuren erhaltenen Rohextrakte sind in der Ausbeute, nicht jedoch in der Reinheit (KIE/mg) (Kallikrein-Inhibitor-Einheiten^ als Literaturstelle: E. K. Frey, H. Kraut und E. Werle, das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, S. 11, Ferdinand Enke, Stuttgart 1968) mit einem mit Hilfe organischer Lösungsmittel erhaltenen Rohextrakt vergleichbar. Außerdem müssen die Säureanionen im Laufe der Aufarbeitung dLurch Adsorption an Ionenaustauscher wieder entfernt werden.
Die weitere Aufarbeitung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus diesen Rohlösungen erfolgt durch Fällung als schwerlösliches Derivat der Metaphosphorsäure bzw. Polyphosphorsäure gemäß den deutschen Patentschriften 1 193 200, 1 192 368 und 1 181 370. Die Komplexe werden nach bekannten Methoden in die Komponenten dissoziiert und die Lösung anschließend von Salzen befreit.
Fach dem gleichen Prinzip wird in der deutschen Patentschrift 1 251 911 vorgegangen, wo durch Zugabe von Elastin bei pH 7 ein schwerlöslicher Inhibitor-Elaetinkomplex abgetrennt werden kann, der bei pH 1 - 6 in die Komponenten dissoziiert wird.
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Die Abtrennung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors von Verunreinigungen mit Hilfe schwerlöslicher Derivate ist mit geringen Nachteilen behaftet, sie kann z.B. nur mit hochkonzentrierten und salzfreien Lösungen durchgeführt werden-r DieFällungsprodukte sind außerdem in überschüssigem Fällungsmittel wiedei löslich. Die Abtrennung des Inhibitors über den Elastinkomplex ist ökonomisch nicht optimal.
Es wurde nun gefunden, daß der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor technisch einfach in hoher Ausbeute und Reinheit durch Einwirkung bestimmter proteolytischer Enzyme auf das zerkleinerte Organ bei erhöhter Reaktionstemperatur unter optimalen pH-Bedingungen extrahiert werden kann, sowie daß zur Weiterreinigung die Extraktionslösung an trägergebundenem Trypsin chromatographiert und anschließend wieder desorbiert werden kann.
Es ist als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, daß ein Protein wie der Zallikrein-Trypsin-Inhibitor derartig extreme Bedingungen für eine Proteinhydrolyne ohne Modifikation der Struktur übersteht. Zwar ist bereits in der Literatur die Stabilität des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors gegenüber proteolytischen Enzymen beschrieben werden (B. Kassell,Methods in Enzymology, 19 (1970) 848 and 850), jedoch wurde der Inhibitor unter vergleichsweise milden Bedingungen mit den Proteasen behandelt. Die aus der Lunge extrahierten Proteine werden bein erfindungsgemäßen Verfahren mit Ausnahme des Kallikrein-Trypein-Inhibitors in wäßriger Lösung bei erhöhter Reaktionstemperatur zu Peptiden und Aminosäuren hydrolysiert.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderlunge stellt eine Bereicherung der Pharmazie dar.
Der Ablauf des erfindungsgemäßen biochemischen Verfahrens kann durch das folgende Schema verdeutlicht werden:
Rinderlunge
I Proteasenaufschluß von Lunge Extrakt
Reinigung über trägergebundenes Trypsin und anschließende Desorption
Kallikrein-TryρsinInhibitor
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im allgemeinen zerkleinertes tierisches Organmaterial vorzugsweise Lunge, Parotis, Leber oder Pankreas im ersten Verfahrensschritt mit proteolytischen Enzymen umgesetzt, welche unspezifisch wirksam sind.
Verwendet werden können mit Ausnahme von Thermolysin und einer Protease aus Schimmelpilzen zahlreiche proteolytische Enzyme, unter anderem die Proteinase K aus Tritirachium album limber, Collagenase aus Clostridium histolyticum oder Bromelain. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren proteolytischen Enzyme werden aus Mikroorganismen, Pilzen oder Pflanzen isoliert. Sie werden im Gegensatz zu Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikrein nicht durch den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor gehemmt.
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Besonders geeignet vom Standpunkt der Wirtschaftlichkeit sind proteolytische Enzyme vom Typ Subtilisin (EC 3.4.4.16), Papain (EC 3.4.4.10) sowie Proteasen aus Pilzen der Gattung Aspergillus. Diese Enzyme können als käufliche technische Enzyme ohne vorherige Reinigung eingesetzt werden.
Die Eigenschaften von proteolytischen Enzymen, insbesondere die Beschreibung ihrer biochemischen Wirkungen sind in folgenden Literaturstellen beschrieben: G.E. Perlman und L. Lorand, Methods in Enzymology, 19 (1970) 199 - 215 für Subtilisin, 226 - 244 für Papain und 581 - 591 für Proteasen aus Aspergillus.
Die Enzyme werden bei ihrem jeweiligen pH-Optimum mit dem Lungenprotein in Kontakt gebracht. Der pH-Wert kann in einem weiten Bereich von pH 5 - 10 variiert werden, ohne daß Ausbeute und Reinheit des Inhibitors sich ändern.
Denaturierte Proteine sind bessere Substrate für Proteasen als die nativen Proteine. Außerdem steigt die Aktivität der Proteasen bei Erhöhung der Reaktionstemperatur von 250C auf 60°C auf ca. das Fünffache an.
Während bei 25°C bei einem Aufschluß von Lunge mit Proteasen nur trübe Rohextraktlösungen erhalten werden können, die auch nach Zusatz von Filtrierhilfsstoffen nicht einwandfrei zu klären sind, sind die bei 600C erhaltenen Rohlösungen klar. Die Reaktionstemperatur beträgt daher in allen Fällen 600C, die Reaktionszeit 90 - 120 Minuten. Als vorzugsweiser Temperaturbereich kann 40 - 700C angegeben werden.
Soll zusätzlich zu dem Kallikrein-Trypsin-Inhibitor noch ein Proteinhydrolysat in Form eines Peptons aus Rinderlunge gewonnen werden, so kann man auch 2 proteolytische Enzymen sequentiell, bevorzugt Subtilisin zuerst und dann Protease P auf Rinderlunge einwirken lassen.
Subtilisin, Papain und Proteinase N können quantitativ durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert
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NA
von 1-2 zerstört werden. Bei der Protease P wird noch eine Restaktivität von 45 % des Ausgangswertes gefunden.
Der Extraktionsechritt, mit dem eine hohe Ausbeute relativ reinen Inhibitore erhalten wird, ist kombiniert mit einer selektiven Adsorptiin des Inhibitors an trägergebundeneβ Trypsin, welche hier als zweiter Verfahrensschritt bezeichnet werden soll.
Diese erfolgt nach dem Prinzip der Affinitätschromatographie gemäß der Deutschen Auslegeschrift 1 517 753. Alle Bestandteile der Lunge ohne Affinität für Trypsin, z.B. das mit dem Aufschluß erhaltene Proteinhydrolysat, enthaltend Trypsin-Kallikrein-Inhibitor und Peptide wird von der Trypsinsäule nicht zurückgehalten. Der Trypsin-Inhibitor-Komplex wird danach bei einem niedrigen pH-Wert in seine Bestandteile Trypsin und Kallikrein-Inhibitor dissoziiert.
Beim zweiten Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrene wird der im ersten Reaktionsschritt gewonnene hydrolysierte Organextrakt auf eine Säule, enthaltend trägergebundenes Trypsin, aufgetragen und zunächst mit Acetatpuffer pH 4 das Proteinhydrolysat eluiert und schließlich der Trypsin-Inhibitorkomplex mit verdünnter Mineralsäure dissoziert.
Das Trypsin kann an praktisch alle Trägermaterialien gebunden sein, mit denen Trypsin eine kovalente Bindung eingeht. Als mögliche Trägermaterialien selen beispielsweise genannt:
Sepharose; Copolymerisat aus Acrylamid, H,H'-Methylenbi8-acrylamid und Maleinsäure; Carboxymetbyl-CellulAse; vernetzteβ Maleinsäureanhydrid.
Diese Aufzählung soll keineswegs llmltiv wirken, neben den vorgenannten Trägermaterialien sind noch eine ganze Seihe anderer Trägermaterialien geeignet..
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Der erfindungsgemäß erhaltene Kallikrein-Trypsin-Inhibitor gleicht in seinen elektrophoretisehen und immunologischen Eigenschaften sowie in seiner Aminosäurezusammensetzung vSllig einem Inhibitor, der nach anderen Extraktionsverfahren oder anderen Aufarbeitungsmethoden aus demselben Organ erhalten werden kann.
Der Kallikrein-TrypBin-Inhibitir ist ein basisches Protein mit einem Molekulargewicht von 6513, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist. (Anderer P.A. und Hörnle, S., Z. Naturforsch., 20 b, 457 (1965); Anderer P.A., Z. Uaturforsch. 20 b, 4-62 (1965); Anderer, Έ.A. und Hörnle, S., J. Biol. Chem. 241, 1568 (1965).) Der Inhibitor hemmt die Enzyme Trypsin (EC 3.4.4.4), Chymotrypsin (EC 3.4.4.5), Plasmin (EC 3.4.4.14) und Kallikrein (EC 3.4.4.21). Er wird in besonders hoher Konzentration in Organen von Wiederkäuern gefunden und bevorzugt aus Lunge, Parotis, Leber oder Pankreas gewonnen.
Der erfindungsgemäß erhaltene Kallikrein-ffrypsin-Inhibitor kann in gleicher Weise wie aus der Literatur bekannt medizinisch z.B. bei der Therapie der Pankreatitis sowie bei postoperativen Blutungen Verwendung finden.
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Beispiel 1
1 kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 2 1 0.1 M Phosphat- oder Boratpuffer pH 8.0 angerührt und die Suspension auf 600C aufgeheizt. Es werden 13.2 Anson-Einheiten (Anson, J. Gen. Physiol., 22_ (1939) 79) technische Protease aus Bacillus (Alcalase der Fa. Novo Industri A3; Kopenhagen, Dänemark) oder Maxatase der Fa. Gist Brocades N.V., Delft, Niederlande zugesetzt und die Protein-· hydrolyse 90 Minuten lang bei 600C unter intensivem Rühren durchgeführt. Der pH-Wert wird dann mit konzentrierter Schwefelsäure auf 1-2 eingestellt und der Rückstand hochtourig abzentrifugiert. Der Überstand wird über ein Faltenfilter filtriert und anschließend mit Natronlauge auf pH 6 eingestellt. Nach Filtration über eine Seitz-AS-Filterschicht wird eine klare gelbe Lösung erhalten. Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1.6 χ 106 KIE/kg Lunge mit einer Hemmaktivität von 150 KIE/mg Protein.
138.000 KIE eines solchen Drganextraktee werden bei 4 - 250C auf eine Trypsin-Sepharose 4 B (RTM) Säule aufgetragen, die Begleitproteine mit 0,1 M Acetatpuffer pH 4 (+0.3 H NaCl +0.01 M CaCl2) eluiert und der Trypsin-Inhibitorkomplex mit 0.1 HCl (+ 0.5 M NaCl + 0.01 M CaCl«) pH 1.2 dissoziiert. Es werden im Eluat 128.000 ZIE entsprechend 92,7 # der Theorie gefunden. Nach Einstellen des pH-Wertes mit Kalilauge auf 5-6 wird die Inhibitorlösung am Rotationsdämpfer eingeengt und über Sephadex B 25 (RTM) mit 0,1 M Essigsäure oder 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat als Elutionsmittel entsalzt und anschließend lyophilisiert.
Die Entsalzung des Kallikrein-Trypsin-Inhibltore kann mit guter Ausbeute auch mit einer Uitrafiltrationsmembran erfolgen.
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Ausbeute: 22.4 mg (121.500 KIE entsprechen 88,1 $> d.Th.) Hemmaktivität: 5450 KIE/mg Einwaage oder 5600 KIE/mg Protein.
Beispiel 2
1 kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 2 1 0,1 M Phosphatpuffer pH 7.0 angerührt und die Suspension auf 600C aufgeheizt. Es werden 19.5 Anson-Einheiten Bakterienproteinase N (Röhm GmbH, Darmstadt, BRD) zugesetzt und die Proteinhydrolyse bei 600C für 90 Minuten unter intensivem Rühren durchgeführt. Die weitere Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1,6 χ 10 KIE/kg Lunge mit einer Hemmaktivität von 150 KIE/mg Protein.
150.000 KIE eines solchen Drganextraktes werden auf eine Trypsin-Sepharose 4 B (RTM) Säule gepumpt und der Kallikrein-Trypsin-InhibitDr wie im Beispiel 1 isoliert. Im Eluat werden 137.000 KIE entsprechend 91,3 $> der (Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25 (RTM) werden 26,0 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 4600 KIE/mg erhalten, insgesamt 119.500 KIE. d.h. 79,7 $> der Theorie.
Beispiel 3
1 kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 2 1 0.1 M Phosphatpuffer pH 7,0 angerührt und die Suspension auf 600C aufgeheizt. Es werden 15.4 Anson-Einheiten Bilzproteinase P aus Aspergillus (Röhm GmbH, Darmstadt, BRD) zugesetzt und die Proteinhydrolyse bei 600C für 90 Minuten unter intensivem Rühren durchgeführt. Die weitere Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1,7 χ 106 KIE/kg lunge mit einer Hemmaktivität von 150 - 350 KIE/mg Protein.
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NACHeERElCKTj
151.000 KIE eines solchen Organextraktes werden auf eine Trypsin-Sepharose 4 B (RTM) gepunpt und der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor wie im Beispiel 1 isoliert. Im Eluat werden 160.000 KIE entsprechend 106 $> der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25 (RTM) werden 23.3 reg Inhibitor einer Hemmaktivität von 5074 KIE/mg erhalten, insgesamt 118.000 KIE, d.h. 78,2 $ der Theorie.
Beispiel 4
1kg zerkleinerte Rinderlunge wird mit 2 1 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0 angerührt und die Suspension auf 600C aufgeheizt. Es werden 14,3 Anson-Einheiten Papain (Corolase S 50, Röhm GmbH, Darmstadt, BRD) zugesetzt und die Proteinhydrolyse bei 600C für 90 Minuten unter intensivem Rühren durchgeführt. Die weitere Aufarbeitung geschieht wie im Beispiel 1. Die Ausbeute beträgt im Durchschnitt 1,5 x 10 KIE/kg Lunge mit einer Hemmaktivität von 150 - 250 KIE/mg Protein.
150.000 KIE eines solchen Organextraktes werden auf eine Trypsin-Sepharose 4 B (RTM) Säule gepumpt und der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor wie im Beispiel 1 isoliert. Im Eluat werden 127.000 KIE entsprechend 84.6 $> der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25 (RTM) werden 24.1 mg Inhibitor einer Hemmaktivität vom 4980 KIE/mg erhalten, insgesamt 120.000 KIE, d.h. 80,0 # der Theorie.
Beispiel 5
25 kg zerkleinerte Rinderlunge werden mit 45 1 0.1 M Phosphatpuffer pH 8,0 angerührt und die Suspension_auf 60°C aufgeheizt. Es werden 240 Anson-Einheiten Alcalase zugesetzt und die Proteinhydrolyse 90 Minuten lang bei 60°C unter intensivem Rühren durchgeführt. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 1 - 2 eingestellt und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird filtriert und anschließend mit Natronlauge auf
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achqereicht \
pH 6 eingestellt. Nach Filtration über eine Seitz-A*-Y±Tter-^ schicht wird eine klare gelbe bis bräunliche Lösung erhalten. Die Ausbeute beträgt 42,5 x 106 KIE mit einer Hemmaktivität von 240 KIE/mg Protein.
90.200 KIE dieses Organextraktes werden auf eine Säule gepumpt, die Trypsin kovalent gebunden an ein Copolymerisat aus Acrylamid, N^'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäure (Enzygel (RTK) der Fa. Boehringer, Mannheim) enthielt. Wie im Beispiel 1 wirde der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor isoliert. Im Eluat werden 83.300 KIE entsprechend 92,4 $> der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex Q 25 (RTM) werden 14.5 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 5440 KIE/mg erhalten, insgesamt 78.900 KIE, d.h. 87,3 $ der Theorie.
Beispiel 6
142.000 KIE eines Organextraktes aus Beispiel 5 werden auf eine Säule gepumpt, die Trypsin polymer gebunden an Carboxymethyl-Cellulose enthielt. Wie im Beispiel 1 wird der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor isoliert. Im Eluat werden 132.000 KIE entsprechend 93.0 # der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex 6 25 (RTM) werden 24.1 mg Inhibitor einer Hemmaktivität von 5310 KIE/mg erhalten insgesamt 127.000 KIE, d.h. 89,4 $> der Theorie.
Beispiel 7
75.500 KIE eines Organextraktes aus Beispiel 5 werden auf eine Säule gepumpt, die Trypsin polymer gebunden an vernetzten) Maleinsäureanhydrid enthielt· Vie im Beispiel 1 wird der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor isoliert. Im Eluat werden 62.250 KIE entsprechend 82.7 # der Theorie gefunden. Nach Entsalzung über Sephadex G 25 (RTM) werden 27.1 mg Inhibitor einer Hemmaktivität vom 2000 KIE/mg Einwaage bzw. 4320 KIE/mg Protein erhalten, insgesamt 54.200 KIE, d.h. 59,3 56 der Theorie.
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Claims (3)

- -,;■■■»;-:r'tKiCHT Patentansprüche:
1) Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus organischem Material, dadurch gekennzeichnet, daß man Rinderlunge mit proteolytischen Enzymen bei 4-0 - 700C und pH 5 bis pH 10 umsetzt und extrahiert und anschließend den Extrakt an trägergebunc'enem Trypsin adsorbiert und den entstehenden Trypsin-Inhibitor-Komplex in seine Bestandteile Trypsin und Kallikrein-Trypsin-Inhibitor dissoziiert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem proteolytischen Enzym um ein Enzym aus der Reihe Bacillus Alcalase; Maxatase; Papain (Corolase); Pilzproteinase aus Aspergillus oder Bakterienproteinase N handelt.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem trägergebundenen Trypsin um Trypsin handelt, welches an einen Träger aus der Reihe Sepharose; Copolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäure; Carboxymethylcellulose; vernetztes Maleinsäureanhydrid kovalent gebunden ist.
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