DE2615436C2 - Verfahren zur Entfernung von inaktiven Begleitproteinen und Begleitpolypeptiden aus Lösungen des Kallikrein- Trypsin-Inhibitors - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Entfernung von inaktiven Begleitproteinen und Begleitpolypeptlden aus Lösungen des Kallikrein-Trypsin-Inhibltors verschiedenen Reinheitsgrades durch Behandlung der Kallikrein-Trypsin-Inhibltor-haltigen Lösungen mit bestimmten an Träger gebundenen proteoly-

is tischen Enzymen und anschließende Abtrennung des Kalllkreln-Trypsln-Inhibitors aus dem durch Proteolyse entstandenen Peptid- und/oder Aminosäuregemisch.

Unter inaktiven Begleitproteinen und Begleitpolypeptiden versteht man Begleitproteine und Begleitpolypept!de, welche nicht die inhibitorische Wirkung des Kallikrein-Trypsin-Inhlbttors aufweisen und deren Anwesenheit in den zu applizierenden Lösungen des Kallikrein-Trypsin-Inhibltors unerwünscht ist,

Für hochkonzentrierte Infusionslösungen des Kallikreln-Trypsln-Inhibitors zur Behandlung der Pankxealltls und von Schockzuständen (W. Brendel und G. L. Haberland, »Neue Aspekte der Trasylol®-Therapie«, Schattauer Verlag, Stuttgart 1972) ist eine völlige Abwesenheit Inaktiver Proteine erstrebenswert. Besonders höher molekulare Begleltpolypeptlde können die Ursache für anaphylaktlsche Schockreaktionen bei Patienten sein.
Bekanntlich lassen sich aber diese inaktiven Proteine besonders aus weitgehend angereicherten Kallikrein-Trypsin-Inhibltor-Lösungen nur mit Schwierigkeiten entfernen. Besondere Schwierigkeiten können sich physikalisch und chemisch ähnlich wie der Inhibitor verhaltende Begleitproteine des Kalllkrein-Trypsln-Inhlbitors sowie Proteine, die mit dem Kallikrein-Trypsin-Inhibltor Komplexe bilden können [J. Pütter und G. Schmidt-Kastner, Blochemica Biophysica Acta 127 (1966), 538], bereiten.
Bislang wurden zur Entfernung von Begleitproteinen und Begleitpolypeptiden bereits verschiedene Methoden

•J" angewendet.

Die fraktionierte Fällung von Polypeptiden, z. B. mit sauren Proteinfällungsmitteln, ist mit einigen Nachteilen behaftet. So sind z. B. Trichloressigsäure (Deutsche Patentschrift 9 54 284) oder Sulfosallzylsäure einerseits giftig und müssen daher durch Absorption an Ionenaustauscher wieder vollständig entfernt werden, zum anderen treten bei der Ausfällung von Begleitproteinen des Kalllkrein-Trypsin-Inhlbitors Verluste an Inhibitor durch Ausfällung des Inhibitors selber oder durch Mitreißen beim Ausfällen inaktiver Begleitproteine auf.
b Es wurde gefunden, daß man inaktive Begleitproteine und Begleitpolypeptlde aus Lösungen des Kallikrein-

f Trypsln-Inhibitors verschiedenen Reinheitsgrades entfernen kann, indem man trägergebundene Proteasen aus

der Reihe Subtillsln, Pronase und Proteinase K auf Lösungen des Kalllkreln-Trypsln-Inhlbltors einwirken läßt und die entstehenden Peptide und Aminosäuren von den Kallikrein-Trypsin-Inhlbitor-Lösungen mit Hilfe an sich bekannter physikalischer Methoden abtrennt. Als solche physikalische Methoden selen beispielsweise genannt: Gelfiltration, Dialyse und Ultrafiltration.

Bisher sind proteolytische Enzyme zur Extraktion bzw. Anreicherung von Substanzen verwendet worden, die nicht der Verbindungsklasse der Polypeptide zuzurechnen sind. Nach der gültigen Lehrmeinung sind Polypeptide grundsätzlich durch proteolytlsche Enzyme meistens unter Verlust einer eventuell vorhandenen enzymatisehen Aktivität abbaubar. Dieses Prinzip konnte zum Teil auch für den Kalllkrein-Trypsln-Inhlbltor bestätigt werden, der beispielsweise durch Thermolysln bei 60° C unter Verlust der Hemmaktivität hydrolytisch gespalten wird [T W. Wang und B. Kassell, Biophysical Research Communications 40 (1970), 1039].

Es lsi aber auch bekannt, daß die Aktivität des Kalllkreln-Trypsin-Inhibitors von zahlreichen proteolytischen Enzymen tierischen, mikrowellen oder pflanzlichen Ursprungs sowie aus Pilzen isolierten Proteasen, deren Aktien vltät nicht durch den Inhibitor gehemmt wird, nicht zerstört wird [B. Kassel, Methods In Enzymology 19 (1970), 848 und 850]. Diese Feststellung Ist jedoch nicht gleichbedeutend damit, daß auch die für die biologische Anwendung essentielle Struktur des Inhibitors nach Behandlung mit unspezlfischen proteolytlschen Enzymen unverändert bleibt. Bekanntlich können von Proteinen mit Hilfe proteolytischer Enzyme Peptldbereiche abgespalten werden, die ohne Bedeutung für die Katalyse sind.

Es konnte jedoch für den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Isolierten Kallikrein-Trypsin-Inhlbitor mittels Elektrophorese, Immunelektrophorese und Aminosäureanalyse gezeigt werden, daß überraschenderweise keine Modifikation der Struktur, d. h. Abspaltung von Aminosäuren oder Aufspaltung der Aminosäurekette, eingetreten war, d. h., daß überraschenderweise der native Wirkungszustand des Kalllkrein-Trypsln-Inhlbltors nach der Behandlung mit den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten proteolytischen Enzymen erhalten bleibt.

Das aus Chemical Abstracts 51999 w (1973) bekannte Verfahren benutzt eine Autolyse des Rohextraktes. Als problematisch ist hierbei anzusehen, daß eine Vielzahl von Proteasen, Peptidasen und unspezifische Esterasen lysosomalen Ursprungs freigesetzt werden. Das beinhaltet die Gefahr, daß ein enzymatischer Abbau des Inhibitors erfolgt. Außerdem erhält man, je nachdem, welches Organmaterial man einsetzt, Extrakte mit unterschiedlicher Zusammensetzung und Aktivität der genannten Enzyme, ja sogar diesbezügliche Schwankungen von einer Rohstoffcharge zur anderen beim gleichen Organmaterial sind möglich. Aus diesen Gründen ist dieses Verfahren nicht einwandfrei reproduzierbar und kann für die Produktion insbesondere von Arzneimitteln nicht verwendet werden.

In der DE-OS 25 09 482 wird ein Verfahren beschrieben, in dem proteolytische Enzyme zur Klärung von Organextrakten eingesetzt werden. Daran schließt sich eine weitere Reinigung an. Das erfindungsgemäße Verfahren kann nun sowohl für diese Vorreinigung aber auch für eine Feinreinigung bereits vorgereinigter Kallikrein-Trypsin-Inhibitor-Lösungen eingesetzt werden.

Der Einsatz der erfindungsgemäßen tiägergebundenen Proteasen stellt eine wesentliche Vereinfachung der technischen Durchführung dar. Darüber hinaus wird eine Kontamination des Kallikrein-Trypsin-lnhibitors mit den zugesetzten Proteasen vermieden. Das gleiche gilt für die ii. technischen Präparationen der Proteasen immer vorhandenen Begleitproteine und Peptide. Dies ist besonders bei hochreinen Lösungen des Inhibitors von großer Bedeutung. Weiterhin können die trägergebundenen Proteasen mehrfach eingesetzt werden, wodurch eine Kostenersparnis erzielt wird. Ebenso entfällt das Problem der Autolyse. m

Die Bindung des proteolytischen Enzymes kann an einen unlöslichen oder löslichen hochmolekularen Träger erfolgen. Das Enzymharz kann leicht durch Filtration der Ultrafiltration aus dem Reaktionsansatz abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Entfernung von inaktiven Begleitproteinen und Begleitpolypeptlden aus Lösungen des Kallikrein-Trypsln-Inhlbitors verschiedenen Reinheitsgrades, durch Einwirkung von proteolytischen Enzymen und Abtrennung der damit entstandenen Peptide und Aminosäuren nach physikalischen Methoden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Lösungen des Kallikrein-Trypsin-Inhlbltors mit trägergebundenen Proteasen aus der Reihe Subtllisin, Pronase und Proteinase K bei 40 bis 60° C behandelt.

Vom Standpunkt der Wirtschaftlichkeit sind die Enzyme Subtllisin aus Bacillus subtllis (EC 3.4.21.14), Pronase aus Streptomyces griseus (EC 3.4.24.4) sowie Proteinase K (EC 3.4.21.14) aus Tritlrachium album limber geeignet. Die biochemischen Eigenschaften dieser Enzyme sind in den nachfolgenden Literaturstellen eingehend beschrieben:

G.E. Perlman und L. Lorand, Methods In Enzymology, Band 19, für Subtillsln Seite 199-215, und für Pronase Seite 651-664 sowie für Proteinase K. W. Ebellng, N. Hennrlch, M. Klockow, H. Metz, H. D. Orth und H. Lang, European Journal of Biochemistry 47 (1974), 91-97.

Die Fixierung der proteolytischen Enzyme an einen hochmolekularen Träger kann entweder kovalent über einen für die Katalyse nicht essentiellen Aminosäurerest des Enzyms oder durch Vernetzung des Enzyms mit Hilfe bifunktloneller Reagenzien, wie z. B. Glutardialdehyd, zu einem hochmolekularen Enzympolymer in den Poren des Trägers erfolgen [R. Goldman, L. Goldstein und E. Katchalskl in »Biochemical aspects of reaction cn solid supports«, Academic Press (1971), 1-72].

Die In dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten trägergebunaenen proteolytischen Enzyme werden nach an sich bekannten Methoden aus Trägerharzen und proteolytischen Enzymen hergestellt. Wegen des stark basischen Charakters des Kallikrein-Trypsln-Inhibitors können nur neutrale Polymere als Träger für die Proteasen verwendet werden.

Die kovalente Bindung der proteolytischen Enzyme an einen ungeladenen hydrophilen Träger kann über freie Carboxyl- oder Aminogruppen mittels wasserlöslicher Carbodiimide erfolgen [P. Cuatrecasas, J. Blol. Chem. 245 (1970), 3059-3065]. Eine weitere Möglichkeit ist die kovalente Bindung über die Aminogruppen der proteolytischen Enzyme an mit Halogencyaniden nach der Deutschen Offenlegungsschrlft 17 68 512 aktivierte Sepharose® oder Sephadex® sowie die Bindung an ein Oxirangruppen tragendes Acrylamid- oder Sepharose®-Harz.

Nach Inman und Dlntzls derivallslertes Polyacrylamidgel [J. K. Inman und H. M. Dintzis, Biochemistry 8 (1969), 4074] kann ebenfalls als Enzymträger fungieren.

Hydroxylgruppen tragende Polymere, wie z. B. Cellulose, Dextran oder Stärke, können mit Cyanurchlorid oder 2-Amino-4,6-Dlchlor-s-triazln [G. Kay und E. M. Crook, Nature 216 (1967), 514] umgesetzt und Enzyme über Amino- oder Hydroxylgruppen an das aktivierte Polymere gekuppelt werden.

Von besonderer Bedeutung für das erfindungsgemäße Verfahren 1st die chemische und physikalische Struktur der Enzymträger. Dieser muß nicht nur ungeladen und aktivierbar sein, sondern auch eine hohe Hydrophille und Quellbarkeit aufweisen. Die neben dem Kallikrein-Trypsin-Inhibltor in Lösung befindlichen abzubauenden Proteine untetschiedlicher Struktur müssen durch Diffusion in die Poren der Träger eindringen können. Daher bauen trägergebundene lösliche Proteasen inaktive Begleitproteine bis auf sehr ähnlich wie der Kalllkreln-Trypsin-Inhlbltor gebaute Isoinhibitoren vollständig ab. Hochmolekulare Proteine aus der Lunge können von löslichen trägergebundenen Enzymen schneller und vollständiger abgebaut werden als von unlöslichen Enzymharzen.

Von den trägergebundenen unlöslichen proteolytischen Enzymen sind z. B. Enzymharze aus Oxlranacrylharz (Präparat 2878, Röhm GmbH. Darmstadt/Deutschland) trotz hoher proteolytlscher Aktivität von 750-1000 ATEE-Einheiten/g Enzymharz (Definition s. Beispiel 1) verglichen mit Subtillsln-Sepharose® 4 B mit wesentlich geringerer Geschwindigkeit wirksam. Mit Subtllisin-Sephadex® G 75 1st aufgrund enger Trägerporen bereits kein Proteinabbau mehr durchführbar.

Es 1st ferner möglich, außer einem Enzymharz mit einem Enzym auch ein Enzymharz mit mehreren, vorzugsweise 2 Enzymen unterschiedlicher Spaltungsspezlfltät oder mehrere, vorzugsweise 2 Enzymharze mit Enzymen unterschiedlicher Spezlfität gemischt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Besonders geeignet für das beschriebene Verfahren 1st eine Kombination der beiden Endoproteasen Subtilisin und Pronase.

Denaturierte Proteine sind bessere Substrate für proteolytische Enzyme als die entsprechenden nativen Proteine und zum anderen nimmt die Aktivität der Enzyme mit der Temperatur zu. Zur Verkürzung der Reaktionszelt und aus Gründen einer möglichst vollständigen Protelnhydrolyse 1st es naheliegend, bei erhöhter Temperatur zu arbeiten. Durch die Bindung an einen hochmolekularen Träger werden proteolytische Enzyme beträchtlich gegen Autolyse stabilisiert. [H. D. Orth und W. Brummer, Angewandte Chemie 84 (1972), 319-330].

Bei Temperaturen von 40° C sind nur sehr kurze Kontaktzelten zwischen einer Kalllkreln-Trypsln-Inhibltorhaltigen Lösung und dem Enzymträger von ungefähr 10 bis 20 Minuten, beispielsweise 15 Minuten zum vollständigen Proteinabbau nötig. Das Enzymharz kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren im Rührkessel (Batch) oder in Form einer Säule eingesetzt werden. Die Kalllkreln-Trypsln-Inhlbitor-Lösung wird auf das pH- < Optimum des jeweiligen proteolytlschen Enzyms eingestellt und eventuell die Aktivität des proteolytlschen Enzyms stabilisierende Cofaktoren wie z. B. Ca²⁺-Ionen Im Falle des Subtlllsins oder der Pronase zum Reaktionsansatz zugefügt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren kann als Temperaturbereich 40-60° C, als vorzugsweiser pH-Bereich 5-10 angegeben werden.

i" Um eine Kontamination der Kalllkreln-Trypsln-Inhlbltor-Lösung mit Bakterien zu vermeiden, für die das entstehende Aminosäuregemisch besonders bei höheren Temperaturen Wachstumsbedingungen bietet, 1st es vorteilhaft wenn dem Reaktionsansatz Äthylmercurithlosalicylsäure (1 :20 000 g/l) oder 0,02 Gew.-96 Natriumazid zugesetzt werden.

Der Verlauf der Proteinhydrolyse kann durch Entnahme von Proben aus dem Reaktionsansatz und anschlie-

is ßende Biuretreaktion [G. Beisenherz, H. J. Boltze, Th. Bücher, E. Czok, K. H. Carbade, E. Meyer-Arendt und G. Pfleiderer, Z. Naturforsch. 8b (1953), 555-577] der mit Trlchloresslgsäure ausgefällten Proteine verfolgt werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können aus Organen von Wiederkäuern speziell aus Lunge, Parotis oder Pankreas des Rindes gewonnene den Kallikreln-Trypsln-Inhlbitor enthaltende Extrakte weiter angereichert

2« werden. Dies gilt z.B. für, nach dem Französischen Patent 15 66 777 oder der Deutschen Offenlegungsschrlft

10 84 433, hergestellte Rohextrakte bzw. nach der Deutschen Offenlegungsschrift 21 16 377 über ein unsubstitu-

iertes poröses Polystyrolharz mit einer Oberfläche von 15OmVg (Lewapol® Ca 9255) weiter aufgereinigte Kallikreln-Trypsln-Inhibltor-Lösung.

Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahren kann die Zeichnung der Cellogelelektrophorese nach

Fig. 1 dienen. Ein über ein unsubstituiertes poröses Polystyrolharz mit einer Oberfläche von 15OmVg (Lewapol® Ca 9255) gemäß DE-PS 21 16 377 vorgereinigter Organextrakt enthält neben dem Kalllkreln-Trypsln-Inhlbltor eine Reihe von mit Amidoschwarz 10 B anfärbbaren Proteinbanden, von denen die Hauptzone mit dem Kalilkreln-Trypsln-Inhibitor identisch 1st (Fig. 1 A). Nach Behandlung mit an Sepharose kovalent gebundenem Subtilisin kann, wie Fig. 1 B zeigt, eine fast vollständige Entfernung aller inaktiven Proteine erzielt werden mit

M Ausnahme der ebenfalls hemmaktiven Kallikrein-Trypsin-Isolnhibitoren.

Auf die Cellogelstreifen (4Ox 170 mm) wurden 2 μΐ einer 8%igen Kalllkrein-Trypsln-Inhlbltor-haltlgen Lösung nach DE-PS 21 16 377 bzw. nach Subtilisln-Sepharose ® 4 B-Einwirkung aufgetragen und die Elektrophorese 2 Stunden bei 20 Volt/cm in Pyrldin-Essigsäurepuffer pH 6,5 durchgeführt. Danach wurden die Proteinbanden mit Amidoschwarz 10 B angefärbt und densitometrisch vermessen.

'? Der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor ist ein basisches Protein mit einem Molekulargewicht von 6513, dessen Aminosäuresequenz bekannt 1st. [Anderer F. A. und Hörnle, S., Z. Naturforsch., 20 b, 457 (1965); Anderer F. A., Z. Naturforsch. 20 b, 462 (1965); Anderer F. A. und Hörnle, S., J. Biol. Chem. 241, 1568 (1965)]. Der Inhibitor hemmt die Enzyme Trypsin (EC 3.4.4.4), Chymotrypsin (EC 3.4.4.5), Plasmin (EC 3.4.4.14) und Kallikreln (EC 3.4.4.21). Er wird in besonders hoher Konzentration in Organen von Wiederkäuern gefunden und

«ι bevorzugt aus Lunge, Parotis, Leber oder Pankreas gewonnen.

Bei dem im vorliegenden Text durch Angabe des Warenzeichens charakterisierten Trägerharzen handelt es sich im einzelnen um folgende Substanzen:

Lewapol® Ca 9255 = ein unsubstituiertes poröses Polystyrolharz mit einer Oberfläche von 150 m /g

** Sepharose® = Agarose = lineares Polysaccharid aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose

Sephadex® = quervernetztes Dextran

Herstellung der Enzymharze (trägergebundene Proteasen)
so B e 1 s ρ i e 1 1

20 g Sepharose® 4 B, werden auf einer Nutsche portionsweise mit 500 ml Wasser gewaschen, in 550 ml Wasser suspendiert und der pH-Wert mit 2N NaOH auf 11,0 eingestellt. Man fügt bei Zimmertemperatur unter Rühren 100mg Bromcyan pro g Sepharose® 4 B zu und hält den pH-Wert der Lösung mit 2N NaOH bei 11,0.

^ 10 Minuten nach der Zugabe des Bromcyans wird die Lösung mit 2N HCl auf pH 8,5 eingestellt und mit 600 ml Wasser, die 1 g proteolytlsches Enzym enthalten, vermischt. Als Enzyme werden Subtilisin (Subtilisin Novo Industr! AS, Kopenhagen, Dänemark oder Maxatase®, Gist Brocades N. V., Delft/Niederlande) sowie Pronase (Pronase P Serva GmbH, Heidelberg/Deutschland) und Proteinase K (Merck AG, Darmstadt/Deutschland) zur Kupplung eingesetzt. Die proteolytische Aktivität beträgt für Subtilisin 153 000 ATEE-Elnheiten/g, für Pronase

6000 ATEE-Einheiten/g und für Proteinase K189 000 ATEE-Elnheiten/g.

Der Reaktionsansatz wird 16 Stunden bei 4° C gerührt. Die Suspension wird auf einer Fritte abgesaugt, portionsweise mit 11 0,1 M Acetatpuffer pH 4,0 und anschließend mit 11 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,0 sowie 21 Wasser gewaschen. Die Enzymharze werden zum Aktivitätstest lyophilisiert.
Die am Träger befindliche proteolytische Aktivität wird mit Hilfe eines pH-Stat-Gerätes bestimmt. Im Testan-

« satz befinden sich 10 ml 0,02 M N Acetyl-L-tyroslnäthylester (ATEE), gelöst in 0,05 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0 für Subtilisin (pH 9,0 für Pronase und Proteinase K), die auf 30° C gehalten werden. Es werden 0,1-1 ml einer Lösung von 5-20 mg gefriergetrocknetes Enzymharz/5 ml Wasser (20 Minuten vorgequollen) unter starkem Rühren zugegeben. Für 10-20 Minuten werden die freigesetzten Carboxylgruppen mit 0,05 N NaOH titriert und

die proteolytlsche Aktivität als N-Acetyl-L-tyroslnäthylester-Elnheiten (ATEE-Klnhelten) pro g Enzymharz berechnet. 1 ATEE-Einhelt entspricht der Enzymmenge, die 1 μ Mol N-Acetyl-L-tyroslnäthylester/Mlnute hydrolysiert. Für Subtllisln-Sepharose® 4 B werden 1730 ATEE-Einhelten/g Enzymharz, für Pronase-Sepharose® 4 B 138 ATEE-Einhelten/g Enzymharz und für Protelnase K-Sepharose® 140 ATEE-Elnheiten/g Enzymharz bestimmt.

In analoger Weise können an Stelle von Sepharose® 4 B auch andere Polysaccharide wie z. B. mit 2,3-pibrompropanol quervernetzte Sepharose® 4 B oder Sephadex ® Π 200 als Trägerharze eingesetzt werden.

Beispiel 2

50 g Stärke nach Zulkowsky werden In 750 ml Wasser gelöst, der pH-Wert mit 1096Iger NaOH auf 11,0 eingestellt, 8,4 g Bromcyan zugefügt und die Lösung unter Rühren 20 Minuten durch Zugabe von lO^lger NaOH bei pH 11,0 gehalten. Durch Zugabe von 2N HCl wird der pH-Wert auf 8,5 abgesenkt, 5 g Subtlllsln In 250 ml dest. Wasser zugefügt, durch Zugabe von 2N HCl der pH-Wert auf 7,0 eingestellt und die Lösung bei 4° C über Nacht gerührt. Das lösliche trägergebundene Enzymharz wird durch Ultrafiltration über eine Amlcon UM 10 Membran durch mehrfaches Konzentrieren mit Wasser von freiem Subtlllsln und niedermolekularen Stärkeanieilen befreit. Nach Gefriertrocknung werden 28,2 g an Stärke gebundenes Subtiüsin erhalten. Die proteolytische Aktivität beträgt 9530 ATEE-Einhelten/g für Subtillsln-Stärke.

An Stelle von Stärke nach Zulkowsky können In analoger Weise 50 g Dextran 500 (Molekulargewicht ca. 500 000) eingesetzt werden. Die proteolytlsche Aktivität für das erhaltene Subtllisin-Dextran 500 beträgt 7280 ATEE-Einheiten.

Beispiel 3

2 g Oxiranacrylamidperlen mit einer Porenweite von 0,5 bis 2,5 μ (5000 bis 25 000 Ä) (Röhm GmbH, Darmstadt/Deutschland) bzw. Epoxy-aktivlerte Sepharose® 6 B werden in 6 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 9 suspendiert, je 250 g Subtlllsln, Pronase und Protelnase K werden zugefügt und die Suspension für 10 Minuten sehr heftig geschüttelt. Die Suspension wird 64 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und nicht gebundenes Enzym mit je 2 χ 100 ml 0,5 M NaCl-Lösung und anschließend mit 2 χ 100 ml Wasser auf einer Nutsche ausgewaschen. Die Enzymharze v/erden bei 4° C In 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 + 0,02% Natrlumazid aufbewahrt.

Für Subtlllsln-Oxlranacrylharz werden nach Gefriertrocknung eine proteolytlsche Aktivität von 1000 ATEE-Einhelten/g Enzymharz, für Pronase-Oxlranacrylharz 32 ATEE-Elnheiten/g Enzymharz und für Protelnase K-Oxiranacrylharz 268 ATEE-Elnhelten/g Enzymharz bestimmt.

Vorreinigung von unreinen Lösungen des Kalükrein-Trypsln-Inhibitors
Beispiele 4 bis 9

2 kg zerkleinerte Rinderlunge werden mit 3,96 1 Wasser unter Zusatz von 40 ml konzentrierter Schwefelsäure bei 40° C unter Rühren aufgeschlossen. Der Rückstand wird abzentrifugiert. Der Überstand wird mit NaOH auf pH 8,0 eingestellt, am Rotationsverdampfer auf die Hälfte konzentriert und über ein Seitz-EK-Filter klarfiltriert. Es werden 1,65 χ 10⁶ KIE (Kallikreln-Inhibitor-Einheiten, als Literaturstelle: E. K. Frey, H. Kraut und E. Werle »Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren«, S. 11, Ferdinand Enke, Stuttgart 1968) pro kg Lunge erhalten. Der Extrakt enthält neben dem Kallikrein-Trypsln-Inhibitor eine große Anzahl höhermolekularer Proteine.

Je 250 ml dieses Extraktes werden in einem geschlossenen Rührgefäß auf 40-60° C erwärmt und unter starkem Rühren die in der nachfolgenden Tabelle angeführten Enzymharze zugesetzt. Es werden 0,25 g gefriergetrocknete Subtllisin-Stärke hergestellt gemäß Beispiel 2, 5 g feuchtes Subtillsln oder Pronase - Sepharose ® 4 B-Harz hergestellt gemäß Beispiel 1, 2,5 g feuchtes Protelnase K-Oxiranacrylamid-Harz hergestellt gemäß Beispiel 3 zugegeben.

Die Hydrolyse der Inaktiven Lungenproteine ist nach 15 Minuten bereits nahezu vollständig beendet. Die Ausbeute an Kalllkreln-Trypsin-Inhlbitor beträgt bezogen auf den Anfangswert vor Zugabe des Enzymharzes 95 ± 596. Mit löslichen trägergebundenen proteolytischen Enzymen können Organextrakte, die neben dem Kallikrein-Trypsin-Inhibiior eine große Anzahl von inaktiven, höhermc'.ekularen Protein enthalten, am weiigehensten angereichert werden.

Ein wie beschrieben proteolytlsch modifizierter Organextrakt kann mit hoher Kapazität an ein poröses Polystyrolharz mit einer Oberfläche von 150m²/g (Lewapol® Ca 9255) absorbiert und nach der Deutschen Offeniegungsschrift 2116 377 welter aufgereinigt werden.

Beispiel	Temperatur	Enzym	Enzymträger	Ausgangsakt.	Endakt.	Anreiche
				(KIE/mg Protein)	(KIE/mg Protein)	rungsfaktor
4	40° C	Proteinase K	Oxlranacrylamid	193,3	201,3	1,04
5	40° C	Subtilisln	Stärke	151,3	487,7	3,2
6	60° C	Subtilisin	Stärke	180,4	456,8	4,2
7	4O0C	Subtilisin	Sepharose 4 B®	187,9	279,0	1,5
8	40° C	Pronase	Sepharose 4 B®	180,4	282,8	1,6
9	40°C	Pronase +	Sepharose 4 B®	180,4	523,4	2,9
		Subtilisin

Felnreinlgung vorgereinigter Lösungen des Kalllkreln-Trypsin-Inhlbltors
Beispiel 11 bis 14

Je 300 mg nach der Deutschen Offenlegungsschrift 2116 377 angereicherter, gefriergetrockneter Kallikrein-Trypsln-Inhlbitor (3830 KIE/mg Festsubstanz) werden In 250 ml dest. Wasser oder Oj M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und In einem geschlossenen Rührkolben auf 40° C temperiert. Unter starkem Rohren werden je 5 g feuchtes Enzymharz hergestellt gemäß Beispiel 1, bzw. 0,25 g gefriergetrocknete SubtHisin-Stärke hergestellt gemäß Beispiel 2 zugesetzt. Vor Zugabe des Enzymharzes, 15 Minuten und 120 Minuten nach Zugabe des

ι» Enzymharzes werden Proben von 40 ml aus dem Reaktionsansatz entnommen und gefriergetrocknet

Unlösliche Enzymharze werden über eine Nutsche abfiltriert und wiedergewonnen, lösliche trägergebundene Enzymharze werden über eine Amicon XM 100 Membran aus der Lösung abgetrennt.

■ Wie die Elektrophorese und der Blurettest zeigen 1st der Abbau der Inaktiven Proteine bereits nach 15 Minuten nahezu vollständig beendet. Die Ausbeute Kallikreln-Trypsln-Inhlbltor beträgt bezogen auf den Ausgangswert 95 ± 5%.

Beispiel Protease Enzymträger Äusgangsaktlvltäl tndaklivität
(KIE/mg Protein) (KIE/mg Protein)

2» 11 Subtillsin Sepharose® 4 B 4950 6680

12 Subtilisin + Pronase Sepharose® 4 B 5170 7370

13 ProteinaseK Sepharose® 4 B 5190 6030

14 Subtillsin Stärke 5280 6760

^ Die entstandenen niedermolekularen Peptide und Aminosäuren können durch Ultrafiltration über eine Amicon UM 2 Membran oder nach Ansäuern des Reaktionsgemisches mit 0,1 M Essigsäure auf pH 4 über eine mit Sephadex ® G 25 gefällte Säule mit 0,1 M Essigsäure als Elutlonsmlttel von dem Kalllkreln-Tiypsln-Inhihitor abgetrennt werden.

Nach Angaben von F. Schulz, H. Kraut, N. Barghava, Naturwissenschaften 10 (1963), 375, beträgt die spezlflsehe Aktivität des aus ammonlakälischer Lösung kristallisierten Kallikreln-Trypsln-Inhibltors 0,14 γ/KlE entsprechend 7142 KIE/mg. Bezogen auf diesen Wert betragt die Reinheit des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kalllkreln-Trypsin-Inhlbltors 84,4-100%.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Entfernung von Inaktiven Begleitproteinen und Begleitpolypeptlden aus Lösungen des Kalükreln-Trypsin-Inblbltors verschiedenen Reinheitsgrades, durch Einwirkung von proteolytlschen Enzymen und Abtrennung der damit entstandenen Peptide und Aminosäuren nach physikalischen Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösungen des Kallikreln-Trypsin-Inhlbltors mit trägergeöundenen Proteasen aus der Reihe Subtillsln, Pronase und Protelnase K bei 40 bis 60° C behandelt.