DE1905681A1 - Stabilisiertes Enzympräparat und Verfahren zur Herstellung desselben - Google Patents
Stabilisiertes Enzympräparat und Verfahren zur Herstellung desselbenInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
5J) Int. Cl.:
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND C 12 k
DEUTSCHES
PATENTAMT Deutsche Kl.: 6 a, 22/10
Aktenzeichen: P 19 05 681.6
Anmeldetag: 5. Februar 1969
Anmeldetag: 5. Februar 1969
Offenlegungstag: 21. Mai 1970
Ausstellungspriorität: —
Unionspriorität Datum: Land:
Aktenzeichen:
Aktenzeichen:
5. Februar 1968 V. St. v. Amerika 702829
Bezeichnung: Stabilisiertes Enzympräparat und Verfahren zur Herstellung desselben
Zusatz zu: Ausscheidung aus: Anmelder: Corning Glass Works, Corning, N. Y. (V. St. A.)
Vertreter: Sturm, Dipl.-Chem. Dr. phil. Ernst, Patentanwalt, 8000 München
Als Erfinder benannt: Messing, Ralph Allan, Horseheads, N. Y. (V. St. A.)
Benachrichtigung gemäß Art. 7 § 1 Abs. 2 Nr. 1 d. Ges. v. 4.9.1967 (BGBl. IS. 960):
Prüfungsantrag gemäß § 28 b PatG ist gestellt
© 5.70 009 821,1655
ORIGINAL INSPECTED
PATENTANWALT
Dr. ERNST STURM
Deutsche Bank AG. München Kto. Nr. 21/34120 Postscheckkonto: München 91707
8 MÜNCHEN 23, den LEOPOLDSTR. 20/IV
(Concordiahaus) Telefon 396451 Telegrammanschrift: Isarpatent
21.1.1969
Anmelderin:
Corning Glass Works OOBNING
desselben
Die Erfindung betrifft die Stabilisierung von Enzymen durch Kuppelung der E.nzyme an eine anorganische Trägersubstanz,
die funktioneile Silanolgruppen enthält, durch Wasserstoff und Aminosilikatbindung, wobei das Enzym unlöslich
wird und über einen längeren Zeitraum verwendet und wieder verwendet werden kann·
Ein Enzym ist ein biologischer Katalysator, der fähig ist, eine chemische Reaktion in Gang zu setzen, zu fördern
und zu leiten, ohne dass es beim Prozess aufgebraucht oder zu einem Teil des gebildeten Produkts wird. Es ist
eine Proteinsubstanz, die durch Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen synthetisiert wird.
Alle isolierten Enzyme sind soweit Proteine, d. h. Peptidpolymere von Aminsoäuren, Bin Enzym kann pposthetische
009821/1655
ORIGINAL
Gruppen wie Flavin-adenin-dinucleotid, Porphyrin, DiphosphopyTidin-nucleotid
usw. enthalten. Verschiedene Enzyme ■brauchen Metallionen wie Mg++ oder Mn++ zur Wirksamkeit.
Enzyme sind im allgemeinen Makromoleküle, mit einem Molekulargewicht über 6000· Der isoelektrische Punkt der Enzyme
liegt "bei einem pH-Wert τοη etwas weniger als 1,0 "bis
11,0. Bei oder in der Nähe dieser Wasserstoffionenkonzentration
neigen die Enzym-Proteine gewöhnlich zum Koagulieren.
Die "besonderen Eigenschaften der Enzyme und ihre Fähigkeit,
Reaktionen von Substraten !sei niedrigen Konzentrationen zu katalysieren, ist in der chemischen Analyse von besonderem
Interesse. Durch Enzyme katalysierte Reaktionen sind seit einiger Zeit zur Bestimmung von Substraten, Beschleunigern,
Yerzögerern, und auch von Enzymen selbst verwendet worden. Bis in die jüngste Zeit ha"ben die "bei Verwendung van Enzymen
auftretenden Nachteile ihre Brauchbarkeit stark eingeschränkt. Einwände gegen die Verwendung von Enzymen sind
ihre !Instabilität, ihr Mangel an Verfügbarkeit, geringe Genauigkeit,
sowie der Arbeitsaufwand zur Durchführung der Analyse. Weiterhin sind die Kosten bei Verwendung grosser
Enzymmengen in der analytischen Chemie, besonders bei Routineanalysen, ein besonders schwieriges Problem.
Es simd Versuche unternommen worden., Enzyme in gebundener
(immobilized) ϊθγμ ohne Verlust ihrer Wirksamkeit herzustel-
0098217166$
len, 00 dass ein Master kontinuierlich, riele Stunden benutzt
werden kann. Das gebundene Enzym wird auf die gleiche Weise verwendet wie lösliche Enzyme, d. h. zur Bestimmung der Konzentration eines Substrates, eines Inhibitors, der das Enzym
inaktiriert, oder eines Aktivators, der eine Beschleunigung
der EnzymaktiTitBt bewirkt· Emzyme sind diazotiert an CeI-luloseteilchen und Polyaminostyrdperlen. Auoh sind Versuche
unternommen, die Enzyme durch Adsorption, Absorption oder durch Ionenaustausch physikalisch Λ einzuhüllen. Enzyme sind
auoh an Polystyrolpolypeptide gebunden worden, und in KoI-lodiummatrizen und in semipermeable Mikrokapseln aus synthetischen Polymerisaten eingeschlossen.
Alle bisher zum Binden der Enzyme verwendeten Träger subs tanzen waren organische Substanzen, besonders organische Polymerisate. Der Hauptnachteil bei Verwendung von organischem
Material beruht darauf, dass sie gegen Mikrobenbefall infolge der Anwesenheit von C-Atomen in der polymeren Kette anfällig
sind, wobei der Träger aufgebrochen und das Enzym löslich gemacht wird. Weiterhin erfolgt die Kupplung mit Hilfe von
Diazobindung durch eine Kupplungsgruppe, wobei die Enzjnamoleküle an den Träger nur an verschiedenen Punkten entlang
der Enzymkette gebunden sind. In wässriger Lösung können die Moleküle auseinan*erfallen, wobei das Protein denaturiert
und dementsprechend ein Verlust an Enzymwirksamkeit auftritt.
009821/1665
einen anorganischen Träger stabilisiert werden können· Es ist dann im wesentlichen immun gegen einen mikrobiellen Befall
und stark an die Trägersubstanz entlang der Kettenlänge gebunden. Durch Verwendung dieser Träger können hochstabile
Enzyme hergestellt werden, die über eine lange Zeitdauer ohne Verlart; der Wirksamkeit gebraucht und wiedergebraucht werden
können· Es ist so möglich, die Enzymwirksamkeit zu eichen und sicherzustellen, dass die Höhe der Wirksamkeit nach Wiederverwendung
im wesentlichen konstant bleibt« Diese stabilisierten Enzyme finden eine beträchtliche Verwendung für
analytische Zwecke und können ebenfalls bei der Herstellung von chemischen Stoffen, pharmazeutischen Präparaten und
Nahrungsmitteln gebraucht werden.
Das erfindungsgemässe unlösliche stabilisierte Enzympräparat
besteht aus einem Enzym und einem anorganischem Träger mit einer grossen Oberfläche und funktioneilen Silanolgruppen,
wobei das Enzym an den Träger sowohl durch Wasserstoffbindung als auch durch Amin-silikatbindung gekuppelt ist. Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Kuppeln des Enzyms an den Träger.
Die erfindungsgemäss efcabilisierbaren Enzyme sind ausserordent-Iich
zahlreich und lassen sich in drei Hauptgruppen einteilen: Hydrolasen, Redoxenzyme und Transferase-Enzym· Zu den Hydrolasen
gehören proteolytisohe Enzyme wie Papain, Pioin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; öarbo-
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hydrasen wie Cellulase, Amylase, Maltese, Pectinase, Chitinase;
Esterasen wie lipase, Cholinesterase, Leoithinase,
Phosphat as β; Nucleasen wie Ribenuelease, Desoxyribonuolease;
und Amidasen wie Arginase, Asparaginase, Glutaminase und Urease. Die zweite Gruppe "besteht aus Redoxenzymen, die Oxydations-
oder Reduktionsreaktionen katalysieren. Zu ihnen gehören Glucoseoxydase, Katalase, Peroiydase, Idpoxydase und
Cytoohrome. Die dritte Gruppe, die Transferasen, übertragen Gruppen von einem Molekül zum anderen. Beispiele hierfür
sind Glutamin-pyruvin-trans-aminase, Glutamin-oxälsäuretransaminase,
Transmethylase, Phosphopyruvin-trans-phosphorylase.
Kennzeichnendes Hauptmerkmal der Erfindung ist, dass die Träger aus anorganischen Stoffen mit reaktiven Silanolgruppen
"bestehen. Diese Stoffe müssen eine grosse Oberfläche haben und wasserunlöslich sein. Beispielsweise ist "bei keramischen
Trägern die Menge des an der Oberfläche des Trägers stabilisierten Enzyms eine funktion des Molekulargewichts
des Enzyms und eine funktion des Porendurchmessers und der Grösse *er Oberfläche des Trägers. Grobgereehnet soll der
Porendurchmesser wenigstens gleich oder grosser sein als di·
Quadratwurzel des Molekulargewichts des Enzyms und allgemein soll die Oberfläche grosser sein als etwa 0,1 m2/«· Der keramische
Träger muss reaktive Silanolgruppen enthalten zur Bildung von Ionenbindungen mit den Aminogruppen des Enzymmoleküls.
Bevorzugter Träger ist poröses Glas entweder in form von
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Feststoffpartikeln oder eines selbsttragenden Stückes wie
einer Scheibe oder eines Zylinders. Glas hat den Vorteil, dass es in seiner Abmessung stabil ist und beispielsweise
durch Sterilisieren gründlich gereinigt werden kann· Als Träger geeignetes poröses Glas ist schnell verfügbar und bei
Coming Glas Works unter dem Handelsnamen "7930-Poro»s Vycor
Glass" erhältlich. Derartiges poröses Glas kann mit verschiedenen Porendurohmessem nach US-Patent 2 106 774
und französischem Patent 1 534 990 hergestellt werden. Andere geeignete anorganische Träger mit grosser Oberfläche und
reaktiven Silanolgruppen sind kolloidale Kieselerde (SiO2)t
die unter den Handelsnamen wCab-0-Siln erhältlich ist, ferner
Wollastonit, ein in der Natur vorkommendes Ga-silikat,
sowie getrocknetes Silikagel und dgl«
Die Bindung des Enzyms an den Träger erfolgt in einer einfachen
Reaktionsstufe ohne ein Kupplungsmittel. Die Reaktion ist eine Wasserstoff- und Ionenbindung vermittels der Aminogruppe
des Enzyms- und der Silanolgruppe des keramischen Trägers. Die Wasserstoffbindung kann durch funktioneile
Gruppen am Enzym, z. B. Carbonyl-, Amid-, Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen zustande kommen, während ionische Bindung eine
Amino-Silikatbindung an endständigen oder restlichen Aminen
des Enzyms ist. Um einen Verlust an Enzymaktivität zu vermeiden,
sollte keine Bindung an den aktiven Punkten des Enzymmoleküls vorliegen.
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Each dem erfindungsgemässen Verfahren wird Enzympulver in
einer Pufferlösung gelöst und geprüft. Das Enzym wird dann an einen vorbehandelten keramischen Träger mit reaktiver
Oberfläche im allgemeinen "bei unter Raumtemperatur gebunden. Überschüssiges Eneym wird entfernt und das gebundene Enzym
mit destilliertem Wasser und Pufferlösung berieselt. Anschliessend wird das Enzymträgerpräparat ausgelaugt und geprüft, bis ein konstanter Wert erhalten ist. Dann wird das
stabilisierte Enzym in Wasser oder einer Pufferlösung bei
Raumtemperatur oder darunter gelagert. Zur Bindung des Enzyms an den Träger wird die wässrige Enzymlösung mit dem
Träger bei einer Temperatur in Kontakt gebracht, die unter Raumtemperatur, vorzugsweise bei etwa 50C, liegt, da Enzyme
bei sehr niedrigen Temperaturen stabiler sind. Nach einer Kontaktzeit mit dem Träger von etwa 1-72 Stunden ist
das stabilisierte Enzym an die keramische Oberfläche gebunden, irgendwelches überschüssiges Enzym wird dann entfernt«
Die anfängliche Aufnahme von Protein durch Glas hängt vom isoelektrischen Punkt ab. Je höher der isoelektrisohe Punkt
des Moleküle liegt, d. h·, je basischer das Protein infolge
Anwesenheit, von Aminogruppen ist, umso grosser ist die
anfänglich gebundene Menge Protein bei der chemischen Bindung von basischen Aminogruppen an reaktive Silanolgruppen des
Glases. Es ist wichtig, dass der pH-Wert der Lösung während des Bindungsvorgangs so ist, dass das Enzym nicht denaturiert.
Vorzugsweise soll dies auf der sauren Seite des isoelektrischen Punktes sein. Es ist wichtig, nicht gebundenes Enzym
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auszuwaschen, "bevor ein stabilisierter Prüfwert erhalten ist.
Das Auslaugen kann Stunden und seihst mehrere Tage dauern. Die Länge dieser Zeit scheint eine Funktion der Porengrüsse
Poren
des keramischen Körpers zu sein. Körper mit kleinem/Durchmesser,
d.h. Poren mit den Molekulardimensionen des Enzyms, erfordern längere Auslaugezeiten von 6-16 Tagen. Grossporiges
Material wie gefrittetes Glas und Wollast.onit benötigen
geringe oder gar keine Auslaugezeiten. Hieraus ist zu entnehmen, dass die Auslaugung das Resultat einer Kombination
von lose gebundenen Enzymen in den Poren und verringerten Diffusionsgeschwindigkeiten (rates) entsprechend dem Verhältnis
der Porendimensionen und der Molekulargrösse des Enzyms ist. Eine induzierte negative Beladung über die erste
Schicht von gebundenem Enzym kann zweite und dritte Enzymschichten lose binden.
Bei der Herstellung des Trägers für die Enzymbindung ist es häufig notwendig, den Träger vorzubehandeln, um die Silanolgruppen
schneller verfügbar und reaktiv zu machen. Wenn z.B. das poröse Glas nicht vorbehandelt ist, kann es viele verschiedene Verunreinigungen enthalten, die die verfügbaren
Bindungsstellen besetzen. Dursh Reinigung der Glasoberfläche
werden im wesentlichen alle aktiven Stellen verfügbar. Eine typische Reinigung für poröses Glas ist folgende: Ein poröses
Glasmuster wird mit Ultraschall in einer verdünnten Salpetersäurelösung bei etwa 80° 0 1 1/2 Stunden gereinigt, mit dest.
Wasser abgespült und in einem Ofen gebracht. Die Temperatur
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wird auf etwa 625° C gesteigert und dabei 15-90 Minuten gehalten, während der Ofen mit Sauerstoff kontinuierlich
durchströmt wird. Des Muster wird sodann in einem Sauerstoffstrom gekühlt und unter verringertem Druck jjait'·■'- Wasserdampf
vorbehandelt (equilibrated). Im Falle von Wollastonit wird das Material mit Ultraschall in Wasser gereinigt, bis
der pH-Wert neutral ist, und dann einer ähnlichen Hitzebehandlung wie zuvor für poröses Glas unterworfen.
Das erfindungsgemäss erhaltene Produkt ist ein gefesseltes,
in Wasser unlösliches Enzym. Das Enzym ist so stabilisiert, dass es eine konstante Höhe an Wirksamkeit über einen langen
Zeitraum besitzt. Bei Lagerung bei Temperaturen von 5° 0 oder auch bei Raumtemperatur während mehrerer Monate liefert
das gebundene Enzym eine konstante Höhe an Wirksamkeit bei wiederholten Anwendungsbedingungen. Die Menge an stabilisiertem
Enzym ist eine Punktion des Molekulargewichts des Enzyms und des Porendurchmessers und der Oberfläohengrösse
des Trägers.
Ein typisches Huolease-Enzym (BMA-ase) mit folgenden Eigenschaften
wurde hergestellt: Mol.Gewicht 12 700, isoelektrischer Punkt pH 7,8, Aktivität des Präparates 1530 Einheiten/mg.
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Versuchs "bedingungen: 4 Minuten Inkubation "bei 37° 0 in 0,1
Mol Acetatpuffer pH 5,0. Substrat: 1 $> Ribonucleinsäure in
Pufferlösung. Fällungsmittel: 0,75 # TJranylacetat in 25 fo
Perchlorsäure.
Definition der Aktivitätseinheit: Eine Einheit ist äquivalent der Menge an saurem löslichem Oligonucleotid, die einen Anstieg
der spektrophotometrischen Absorption bei 260 my. von 1,0 in 4 Minuten bei pH 5,0 bewirkt.
Der Träger war ein poröses Glasmuster von Kennzahl 7930, ein Zylinder mit äusseren Durchmesser 1,2 cm und innerem Durchmesser
1,0 om, länge 5 cm, Gewicht 2,0 g, Porendurchmesser 74 Α, Oberfläche 113 m /g. Das Muster wurde durch Eintauchen
in 1,2 Mol HCl 30 Minuten gereinigt, dann in einem Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 550° 0 gesteigert und
dabei 3 Stunden gehalten. Nach dem Abkühlen wurde das Glas
übernacht eingetaucht und ■ ·"' ~-mit-" '■ ;* . 0,1 Mol Acetatauf
puffer; pH 5,0.eingestellt.
puffer; pH 5,0.eingestellt.
Enzymbindung: Der Glaszylirifer wurde in ein Versuchsrohr eingesetzt·
Das Bohr.wurde in ein Wasserbad von 5° 0 eingetaucht, sodann 6 ml einer Lösung von 0,5 ag ENA-ase/ml in 0,1 Mol
Aoetatpuffer, pH 5,0, in das Rohr zugegeben« Das Enzym wurde
mit dem Zylinder 6 Stunden bei 5° 0 reagieren gelassen. Der Zylinder wurde aus der Enzymlösung herausgenommen und zweimal
mit der Pufferlösung extrahiert·
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Probe und Lagerung des MA-aseZylinders:
Der Zylinder -wurde in 20 ml einer 1 : 1 mit Ac et at puff er verdünnten Ribonucleinsäuren sung geprüft. Nach 4 Minuten
Inkubationszeit wurde eine aliquote Menge von 4- ml zur Analyse
entnommen. Zwischen den Analysen wurde der Zylinder zuerst kräftig mit der Pufferlösung gewaschen und dann in
der Pufferlösung "bei 5° C gelagert.
Die Resultate dieses Yersuchs ergaben eine Anfangsaktivität von 0,040 mg/g Glas. Nach einer Auslaugezeit von etwa
12 Tagen erreichte der Zylinder einen relativ konstanten Aktivitätswert, äquivalent 0,0075 mg RNA-ase pro Gramm Glas.
Die Aktivität "blieb auf dieser Höhe über 111 Tage lang erhalten.
Die Menge des an das Glas gebundenen Proteins wurde durch
Bestimmung der Beleuchtungsstärken (optical density) bei 280 mu der Original-Enzymlösung, der zum Binden gebrauchten
Lösung und der Extrakte festgestellt. Anfänglich waren 5 % des gebundenen Enzyms aktiv. Dieser Wert fiel auf 1,2 # nach
der Auslaugeperiode.
Ein typisches proteolytisch.es Enzym, Papain, wurde mit folgenden
Eigenschaften hergestellt: Mol-Gewicht 21 000, isoelektrischer Punkt: pH 8,75, Aktivität des Präparates: 0,01
Einheiten/mg.
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-- 12 -
Yersuchsbedingungen (modifizierter Kunitzprozess):
60 Minuten Inkubation "bei 40° C in 0,1 Mol Phosphatpuffer,
pH 5,8, der 0,005 Mol Cystein und 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) enthielt.
Substrat: 1 $ gekochtes Kasein in Pufferlösung. Fällungsmittel:
5 $> Trichloressigsäure. Definition der Aktivitätseinheit: Eine Einheit ist äquivalent der Menge an saurem
löslichem Peptid, die eine Änderung der Beleuchtungsstärke bei 280 mu von 0,001 pro Minute bewirkt.
Der Träger war ein poröses Glasmuster von Kennziffer 7930, Zylinder mit äusserem Durchmesser 1,2 cm und inneren Durchmesser
1,0 cm, Länge 2,5 cm, Gewicht 1,27 g, Porendurchmesser 68 ä , Oberfläche 118 m /g. Das Muster wurde mit
Ultraschall in 0,2 η-Salpetersäure bei 80° C gereinigt, in einem Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 100° C
gesteigert und bei 100° C eine Stunde gehalten. Das Glas wurde in einen Exsikkator eingesetzt, ^um all; - Wasserdampf
vorbehandelt zu werden. Das Glas wurde vor Gebrauch nicht -1-. Pufferlösung behandelt.
Enzymbindung: Der Glaszylinder wurde in ein Versuchsrohr eingesetzt, das Rohr in ein Bad von 5° C getaucht und
4- ml 0,1 Mol Phosphatpufferlösung pH 6,95, enthaltend 4- mg
Papain/1 ml zugegeben. Das Enzym wurde mit dem Zylinder 1 1/2 Stunden bei 5° C reagieren gelassen. Der Zylinder wurde
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aus der Enzymlösung herausgenommen und zweimal mit Wasser extrahiert.
Prüfung und lagerung des Papain-Zylinders: Der Zylinder wurde in 5 ml einer 1 : 1 mit Puffer verdünnter Substratlösung,
enthaltend 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure
geprobt. Nach 1 Stunde Inkubation wurde eine aliquote Menge von 4 ml zur Analyse entnommen. Zwischen den
Analysen wurde der Zylinder mit Wasser extrahiert und dann entweder in Wasser oder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung,
pH 5,8, enthalt end. 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Ä'thylendiamintetraessigsäure
bei 5° C gelagert. (Die zur lagerung verwendete lösung hatte keinen sichtbaren Einfluss auf die
Eesultate). Nach einer Auslaugezeit von etwa 16 Tagen erreichten die Zylinder einen relativ konstanten Aktivitätsgrad
äquivalent 0,07 mg Papin pro Gramm Glas. Die Aktivität blieb auf diesem Wert über einen Zeitraum von 122 Tagen· Anfänglich
waren 90 $> des gebundenen Enzyms aktiv. Dieser Wert fiel
auf 4 $> nach der Auslaügeperiode.
Zur Verwendung kam das Papainenzym von Beispiel 2. Poröses Glasmuster: Kennziffer 7930, Zylinder, äusserer
Durchmesser 1,2 cm, innerer Durchmesser 1,0 cm, länge 2,5 ob, Gewicht 1,26 g, Porendurchmeestr 68 X, Oberfläche 118 λ /g.
Das Muster wurde mit Ultraschall in einer 0,2 n-Salptt*reäure
009821/16SS
bei 8O0C 1 i/2 Stunden gereinigt, in einen Ofen gebracht,
die Temperatur langsam auf 1800C gesteigert und bei dieser
Temperatur über Nacht gehalten» Das Glas wurde gekühlt und mit Wasserdampf behandelt. Es wurde vor Gebrauch nicht
mit Pufferlösung behandelt.
EnzymMndung: Der Glaszylinder wurde in ein Versuchsrohr
eingesetzt, das Yersuchsrohr in ein Bad von 5°C eingetaucht und 4 ml eines 0,1 Mol Phosphatpuffers, pH 8,7, enthaltend
1 mg Papain/ml, zugegeben, Das Enzym reagierte mit dem 3-las
2 Stunden bei 50C. Der Zylinder wurde aus der Enzymlösung
entnommen und mit pH 8,7 - Puffer extrahiert»
Lagerung des Papainzylinders: Zwischen den Analysen wurde
der Zylinder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthyldendiamintetraessigsäure
bei Raumtemperatur gelagert.
Der Zylinder beMelt eine konstante Aktivitätshöhe, äquivalent
0,04 mg Papain pro Gramm Glas. Die Aktivität blieb auf dieser Höhe über einen Zeitraum von 86 Tagen erhalten.
Verwendung des Papainenzyms nach Beispiel 2. Poröses Glasmuster: Kennziffer 7930, Zylinder, äusserer Durchmesser
1,1 cm, innerer Durchmesser 1,0 cm« Länge 3»5 cm, Gewicht 0,8 g (Dieses Glasstück war die Innenwand sines
009821/1665
[Auslaugungs-J Zylinders, der an der leachYplane getrennt war). Porendurehmesser
92 Ä, Oberfläche 60 m /g. Das Muster wurde mit Ultraschall
in einer 0,2 n-Salpet er säure "bei 80° C gereinigt, in
einen Ofen gebracht und die Temperatur langsam auf 200° G gesteiegert. Das Muster wurde "bei dieser Temperatur über
Nacht gehalten. Das Glas wurde gekühlt und -mit - Wasserdampf behandelt" "-· D&s Muster wurde vor Gebrauch nicht mit' Pufferlösung".
Td ehandelt „
Enzymbindung: Das Papain wurde an das Glas aus einer 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Das Glas wurde
mit einer 5 ml Enzymlösung (4 mg PapAn/ml) 1 Stunde bei 5° C
zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 5 mal mit Wasser und einmal mit 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend
0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendiamintetraessigsäure,
extrahiert.
lagerung des PapainzylinÄersι Zwischen den Analysen wurde der
Zylinder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend
0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendiamintetraessigsäure, bei 5° C gelagert.
Der Zylinder wurde 40 mal über einen Zeitraum von 82 Tagen geprüft. Nach einer 12 Tage-Auslaugung wurde ein relativ konstanter
Aktivitätswert, äquivalent 0,08 mg Papain pro Gramm Glas erhalten, der über einen Zeitraum von 70 Tagen konstant
blieb.
009821/1665
Beispiel 5
Verwendung des Papainenzyms von Beispiel 2. Poröses G-lasmuster: Kennziffer 7930, Zylinder, äusserer Durchmesser
1,2 cm, innerer Durchmesser 1,0 cm, länge 2,5 cm, Gewicht
1,5 g» Porendurchmesser 68 Ä, Oberfläche 118 m /g·
Das Muster wurde mit Ultraschall in 0,2 η-Salpetersäure bei 80° 0 1 1/2 Stunden gereinigt, in einen Ofen gebracht, die
Temperatur langsam auf 180° G gesteigert und dabei über Nacht gehalten« Das Glas wurde gekühlt und mit Wasserdampf
behandelte Das Muster wurde vor Gebrauch nicht mit Pufferlösung behandelt.
Bindung und Vernetzung des Enzyms: Das I*apain wurde an das
Glas aus 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95 bei 50C
gebunden· Das Glas wurde mit 4 ml einer Lösung, enthaltend 2 mg Papain/ml, 4 Stunden zur Einwirkung gebracht· Das Glas
wurde 1 mal mit Wasser extrahiert. Das an das Glas gebundene Enzym wurde in einer 1$igen Formaldehydlösung über Nacht bei
5 C vernetzt. Der Zylinder wurde dann 3 mal mit Wasser extrahiert
und dann 1 mal mit 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendiamintetraessigsäure,
extrahiert.
Lagerung des Papainzylinders: Zwischen den Analysen wurde der
Zylinder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5 »8» enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendiamintetraessigsäure,
bei 5° C gelagert.
009821/165B
Nach einer Auslaugezeit von 9 Tagen zeigte das Glas eine konstante Aktivitätshöhe äquivalent 0,09 mg Papain/g Glas.
Dieser Wert wurde übereine Periode von 48 Tagen aufrechterhalten und schien etwa 1,3 mal grosser zu sein als der von
nicht veraetztem Papain.
Verwendung des Papainenzyms von Beispiel 2. lein gefrittetes Glasmuster: Kennziffer 7740 Borsilikatglas,
vier 20 mm Scheiten mit ebenen Kanten, Gesamtgewicht 4»63 g,
Porendurchmesser 50 000 Ä, Oberfläche 0,2 m /g. Das Muster
wurde mit Ultraschall in 0,2 η-Salpetersäure bei 80° ö 1 1/2 Stunden gereinigt, in einen Ofen gebracht, die Temperatur
langsam auf 200° gesteigert und dabei 2 Stunden gehalten. Das Glas wurde gekühlt. Es war nicht ,mit ■ Pufferlösua<
oder ,mi/fc Wasserdampf bejkiändtl'fe·. ;.
Enzymbindung: Das Papaein wurde an das Glas in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Die vier Glasscheiben
wurden mit 5 ml Enzymlösung (0,84 mg Papain/ml) 17 Stunden
bei 5° C zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 2 mal
mit Pufferlösung und 2 mal mit Wasser extrahiert. Lagerung der Papain-Scheiben: Zwischen den Analysen wurden die Scheiben
in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, tnthaltend
0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendiaaintetraessigsäurt,
bei 5° gelagert.
009821/1655
Nach einer Auslaugung während 1 Tag zeigte das Glas einen konstanten Wert der Aktivität, äquivalent 0,014 mg Papain/g
Glas. Dieser Wert wurde über einen Zeitraum von 83 Tagen aufre
oht erhalt en.
Verwendung des Papainenzyms nach Beispiel 2. Poröse Glasteilchen -60 bis +80 Maschen, Gewicht 1,0g,
Porendurchmesser 900 1, Oberfläche 20 m /g. Das Muster werde
durch Erhitzung auf 625° C in Anwesenheit von Sauerstoff während 15 Minuten gereinigt. Es wurde in einem Strom von O2
gekühlt und dann unter verringertem Druck gegen Wasserdampf gleichgestellt. Das Muster wurde vor Gebrauch nicht nit .
Puffer behandelt1· '■-
Enzymbindung: Das Papain wurde an das Glas aus 0,1 Mol Phosphatpufferlösung,
pH 6,95i gebunden. 1 g Glaspartikel wurde mit 4 ml einer Enzymlöeung (4 mg Papain/nO.) 70 Stunden bei
50C zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 2 mal mit Pufferlösung und dann mit Wasser extrahiert« Di® Enzymglaspartikel
wurden auf ein Stück filterpapier übertragen und das Papier mit einem Faden zusammengebunden. Die in Papier eingewiokelten
feilchen wurden wie ein "Teebeutel" für di® Enzymbestimmung
verwendet.
Prüfung und lagerung dtr Pape.inpartikel: Dtr Beutel wurde
in 15 ml einer 1 j 1 Hit Puffer verdünnten
0 0 9 8 21/16 5 5
(pH 5,8), enthaltend 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure,
geprüft. Nach, einstündiger Inkubation "bei 4-0° 0 wurden 4 ml aliquote Teile zur Analyse entnommen.
Zwischen den Analysen wurde der Beutel "bei 5° C in 0,1 Mol
Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cyztein
und 0,002 Mol Äthylendiamintetraessigsäure, gelagert.
Nach einer Auslaugung während 1 Tag zeigte das Glas einen konstanten Aktivitätswert, äquivalent 0,33 mg Papain/g Glas.
Dieser Wert blieb Über eine Zeitdauer von 43 Tagen erhalten.
Verwendung des Papainenzyms nach Beispiel 2. Poröse» Kieselerdeglas, gebildet durch Trocknung eines
Kieselsäuregelglasstücks von ungleichmässiger Gestalt, Gewicht 0,793 g,Porendurchmesser 75 Ä, Oberfläche 398 m2/g·
Das Muster wurde durch langsame Erhitzung auf 625° C in einem Op-Strom gereinigt, "bei dieser Temperatur 45 Minuten
gehalten und dann durch Aufblasen eines Og-Stromes gekühlt.
Das Glas wurde unter vermindertem Druck :nit Wasserdampf
"behandelt '■. Es wurde vor Gebrauch nicht intt Pufferlösung
behandelte
Enzymbindung: Das Papain wurde an das Glasstück in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Das Glas wurde mit
6 ml Enzymlttsung (2 mg Papain/ml) 17 Stunden bei 5° C zur
Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 1 mal mit Pufferlösung
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und 10 mal mit Wasser extrahiert.
Prüfung und lagerung des Papain-Kieselsäuregelstücks: Das Glasstück wurde in 6 ml eines 1 : 1 pH 5,8 Puffer verdünnten
Substrates, enthaltend 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthyl^endiamintetraessigsäure, geprüft. Nach einstündiger
Inkubation bei 40° 0 wurden 4 ml aliquote Teile zur Analyse entnommen· Zwischen den Analysen wurde das Glasstück bei
5° C in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Athylendiamintetraessigsäure,
gelagert.
Nach einer über 6 Tage dauernden Auslaugung zeigte das Glas einen Aktivitätswert, äquivalent etwa 0,055 mg Papain/g Glas.
Verwendung des Papainenzyms nach Beispiel 2. Wollastonitmuster: Ein Zylinder, äusserer Durchmesser 0,9 cm,
innerer Durchmesser 0,8 cm, Länge 2,5 cm, Gewicht 0,925 g, Porendurchmesser <150 A bis 4500 Ä, Oberfläche 0,1 m /g.
Das Muster wurde durch langsames Erwärmen auf 6250C in einem
Op-Strom gereinigt, 45 Minuten bei dieser Temperatur gehalten
und durch Anblasen eines 02-Stroms gekühlt. Der WoIlastonit
wurde unter vermindertem Druck mit Wasserdampf behandelt. Das Muster wurde nicht mit Pufferlösung vor dem Gebrauch
behandelt.
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Enzymbindung: Das Fäpain wurde an den Wollastonit in 0,1 Mol
Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Es wurde mit 4 ml
Enzymlsjbung (2 mg Papain/ml) 17 Stunden "bei 5° C zur Einwirkung
gebracht. Der Wollastonit wurde 1 mal mit Pufferlösung und 10 mal mit Wasser extrahiert.
Prüfung und Lagerung des Papain-WollastonitZylinders:
Der Zylinder wurde in 5 ml einer 1 : 1 pH 5,8 Puffer verdünnten Substratlösung, enthalten 0,005 Mol Cystein und
0,001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure geprüft. Nach einstündiger Inkubation bei 40° C wurde ein 4 ml Muster zur
Analyse entnommen. Zwischen den Analysen wurde der Zylinder bei 5° 0 in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend
0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Ithylendiamintetraessigsäure
gelagert. Obwohl bei dieser Prüfung die Aktivitätswerte sehr gestreut liegen, ist keine Auslaugezeit ersichtlich. Der
Gesamtaktivitätswert übereinen Zeitraum von 35 Tagen lag bei 0,11 mg Papain/g Wollastonit.
Ein typisches Redox-Enzym, Grlukoseoxydase, wurde mit folgenden
Eigenschaften hergestellt: Mol-Gewioht 150 000, isoelektrischer Punkt 4,3, Aktivität des Präparates 45,5 u/mg.
Versuchsbedingungen: Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur
in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung, pH 7,0, Substrat:
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22,4 mg ß-D-Glucose/ml Puffer (Endkonzentration 18 mg/ml).
Zur Bestimmung des gebildeten HpOp wurden 2,5 ml aliquote
Teile der Reaktionsmischung abgenommen und 0,025 ml einer 1$igen O-Dianisidinlösung in Methanol zugegeben, dann 0,5 ml
Peroxydaselösung (0,04 mg/ml).
Bestimmung der Aktivitätseinheit: Eine Einheit ist äquivalent
der Produktionsrate von 1 Mikromol H2Op pro Stunde "bei Raumtemperatur.
Die gebildete HpO2-Menge wird durch Zersetzung
in Gegenwart von Peroxydase und 0-Dianisidin bestimmt. Die Oxydation von 0-Dianisidin wird durch Steigerung der Beleuchtungsstärke
bei 460 mu bestimmt.
Poröses Glasmuster: Kennziffer 7930, Zylinder, äusserer Durchmesser 1,2 cm, innerer Durchmesser 1,0 cm, Länge 2,5 cm,
Gewicht 1,3 g> Porendurchmesser 68 A, Oberfläche 118 m /g.
Das Muster wurde mit Ultraschall in 0,2 η-Salpetersäure bei 80° C 1 1/2 Stunden lang gereinigt. Das Muster wurde in einen
Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 180° gesteigert und bei dieser Temperatur über Uacht gehalten. Das Glas wurde
gekühlt und ; mit- 0,01 Mol Phosphatpufferlösunf^pH 7,0 eine
Stunde
Enzymbindung: Das Enzym wurde an das Glas in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung,
pH 7,0, gebunden. Der Zylinder wurde mit 4 ml einer GlucoseoxydaselÖsung (2 mg/ml) 1 Stunde bei 5° C
zur Einwirkung gebracht. Der Zylinder wurd© mit Wasser extrahiert.
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Lagerung des Glucoseoxydase-Zylinders: Der Zylinder wurde
in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung, pH 7|0 "bei Raumtemperatur zwischen den Analysen gelagert·
Nach einer Auslaugezeit von 3 Tagen hatte der Zylinder einen
Aktivitätswert, äquivalent 0,0001 mg Gluooseoxydase.
Verwendung des G-lucoseoxydaseenzyms nach Beispiel 10.
Poröses Glasmuster: Teilchen -60 +80 Maschen, Gewicht 1 g, Porendurchmesser 900 A, Oberfläche 20 m /g. Das Muster wurde
bei 625° C in Gegenwart von Sauerstoff 15 Minuten gereinigt. Es wurde in einem Sauerstoffstrom gekühlt, dann unter verringertem Druck mit" Wasserdampf !"behandelt. ■. Das Glas
wurde vor Gebrauch nicht „nit- Pufferlösung-"behandelt.
Enzymbindung: Die Glucoseoxydase wurde an das Glas in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden, 1 g Glaspartikel
wurden mit 4 ml Enzymlösung (5 mg Glucoseoxydase/ml) 70 Stunden
bei 5° C zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 2 aal mit Pufferlösung und dann mit Wasser extrahiert. Die Enzymglaspartikel
wurden auf ein Stück Filterpapier übertragen und dann das Filterpapier mit einem Faden zusammengebunden. In
Form eines "Teebeutels" wurden die Teilohen zur Enzymbestimmung
verwendet.
Prüfung und Lagerung der Gluooseoxydaseteilchen: Der Beutel
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wurde in 125 ml einer 0,01 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95»
enthaltend 18 mg Gluoose/ml, "bei Raumtemperatur geprüft.
2,5 ml aliquote Teile vrarden in Abständen von 3 Minuten zur
Analyse entnommen. Zwischen den Analysen wurde der Beutel "bei
5° C in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gelagert.
Während der Anfangslagerzeit von 17 Tagen wurde keine sichtbare
Auslaugeperiode beobachtet und das Glas lieferte einen konstanten Aktivitätswert äquivalent 0,123 mg Glucoseoxydase/g
Glas. Am 21. Tag war ein Atf all auf etwa 40 # des Aktivitätswertes
festzustellen. Dieser Abfall der Aktivität war der Einwirkung von CS_ und C2H,-0H-Dämpfen auf das Enzym
zuzuschreiben. Bei wiederholten Analysen während der nächsten 24 Stunden war ein Wiederaufstieg auf 78 # des Originalaktivitätswertes
festzustellen. Aktivitätsverluste waren nach weiteren 20 Tagen und 41 Tagen zu beobachten. Nach einer
Lagerzeit von 64 Tagen war der Aktivitätswert äquivalent 0,04 mg Glucoseoxydase/g Glas. Bei diesem Punkt zeigte sich
ein starker mikrobieller Befall an der Oberfläche des Beutels. Die Aktivitätsverluste sind daher vermutlich auf die
Bildung eines Verzögerers oder auf einen Abbau des Enzyms durch einen Mikroorganismus zurückzuführen.
Einige Resultate der Beispiele sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Die Werte sind verglichen mit einem nichtporösen Glasrohr.
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Träger
Porendurch- Enzym messer M. (Mol.Gew.)
Oberfläche 2
mg Enzym gebunden an g Keramik
Borsilikat- nicht
glasrohr porös
glasrohr porös
Papain (21 000)
sehr niedrig
Beispiel 6 50 000
0,2
0,014
900
20
0,33
92
60
0,08
68
118
0,07
11
900
Gluooseoxydase (150 000)
20
0,12
10
68
118
0,0001
Aus den Werten der Tabelle ist folgendes zu ersehen:
1) Entsprechend einer Zunahme der Oberflächengrösse des
Trägers steigt auch die Menge des gebundenen Enzyms (Papain), bis sich die Porendurchmesser den Molekulargrössen des Enzyms
nähern· Bei diesem Punkt ist weniger Oberflächenbereich des Trägers zur Bindung verfügbar mit einem resultierenden
Abfall der Menge des gebundenen Enzyms«
2) Bei einem gegebenen porösen Träger fällt die Menge des gebundenen Enzyms, wenn das Mol-Gewicht des Enzyms steigt.
Jedoch gibt es einen optimalen Porendurohmesser für ein be-
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stimmtes Enzym, und dieser Punkt ist erreicht, wenn der Porendurchmesser
äquivalent angenähert der Quadratwurzel des Enzyms ist.
Selbstverständlich ist der Gegenstand der Erfindung nicht auf die im obigen gegebenen Beispiele beschränkt, vielmehr sind
Abwandlungen unter Zugrundelegung der Ansprüche möglich, ohne über den Rahmen der Erfindung hinauszugehen.
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Claims (10)
1. Stabilisiertes Enzympräparat, das im wesentlichen wasserunlöslich
und fähig ist, Reaktionen wiederholt ohne Verlust seiner Aktivität zu katalysieren, dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym verfügbare Aminogruppen hat, die an einen anorganischen Träger mit einer grossen Oberfläche
und reaktiven Silanolgruppen gekuppelt sind, und
dass das Enzym an den Träger mit Hilfe von Amino-Silikat-"bindungen
und WasserstoffWindungen gekuppelt ist.
2. Stabilisiertes Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym zu der Gruppe der Hydrolasei
Redoxenzyme und Transferasen gehört.
3. Stabilisiertes Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Oberfläche grosser
als 0,1 m /g hat und aus einem porösen keramischen Körper, kolloidaler Kieselerde, Wollastonit und porösem getrocknetem
Kieselsäuregel besteht.
4. Stabilisiertes Enzympräparat nach Anspruch 3t dadurch
gekennzeichnet, dass der Träger aus porösem Glas besteht.
5. Stabilisiertes Enzympräparat nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym aus Papain besteht
und der Träger ein hochporöses Kieselerdeglas mit einem Porendurchmesser von 68 - 900 Ä ist.
6. Stabilisiertes Enzympräparat nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, dass der Träger kolloidale Kieselerde ist,
7. Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Enzympräparates
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Lösung eines Enzyms mit verfügbaren Aminogruppen
mit einem anorganischen Träger mit grosser Oberfläche und reaktiven Silanolgruppen bei "bis zu Raumtemperatur
und eine ausreichende Zeitdauer in Berührung gebracht wird, um das Enzym fest an den Träger zu binden,
und dass dann überschüssiges ungebundenes Enzym entfernt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym aus der Gruppe der Hydrolasen, Redoxenzyme
und Transferasen ausgewählt ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das pH der Lösung so eingestellt ist, dass eine Denaturierung
des Enzyms vermieden wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Träger ein poröses Glas verwendet wird, das so vorbehandelt
ist, dass die Silanolgruppen deTrägers leicht verfügbar und reaktiv werden.
009821 /1655
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