DE1949943A1 - Stabilisiertes Enzympraeparat und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Stabilisiertes Enzympraeparat und Verfahren zu seiner Herstellung

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DE1949943A1
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Messing Ralph Allan
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Corning Glass Works
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Corning Glass Works
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    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
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Description

Anmelderin: Corning Glass Works
Corning, New York, USA
Stabilisiertes Enzympräparat und Verfahren zu seiner
Herstellung
Die Erfindung betrifft die Stabilisierung von Enzymen durch chemische Kuppelung der Enzyme an eine anorganische Trägersubstanz vermittels eines Kupplungsmittels in Form eines Silaas, wobei das Enzym unlöslich wird und über einen längeren Zeitraum verwendet und wieder verwendet werden kann.
Ein Enzym ist ein biologischer Katalysator, der fähig ist, eine chemische Reaktion in Gang zu setzen, zu fördern und zu leiten, ohne dass es beim Prozess aufgebraucht oder zu einem Teil des gebildeten Produkts wird. Enzyme werden z, B0 durch Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen.synthetisiert*
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Alle bisher isolierten Enzyme sind Proteine, d. h. Peptidpolymere von Aminosäuren. Ein Enzym kann prosthetische Gruppen wie Flavin-adenin-dinucleotid, Porphyrin, Diphosphopyridin-nuclectid usw. enthalten. Enzyme sind im allgemeinen Makromoleküle,, mit einem Molekulargewicht über 6000. Der isoelektrische Punkt der Enzyme liegt bei einem pH-Wert von etwas weniger als 1,0 bis 11,0. Bei oder in der ITähe dieser Wasserstoffionenkonzentration neigen die Enzym-Proteine gewöhnlich zum Koagulieren.
Die besonderen "Eigenschaften der Enzyme und ihre Fähigkeit, Reaktionen von Substraten bei niedrigen Konsentrabionen zu katalysieren, ist in der chemischen Analyse von "besonderem Interesse. Durch Enzyme katalysierte He.aktionen sind seit einiger Zeit zur qualitativen und cjuantibativen Bestimmung von Substraten, Beschleunigern, Verzögerern, und auch von Enzymen selbst verwendet worden. Bis in die güngste Zeit haben die bei Vervrendung von Enzymen auftretenden ITachteile ihre Brauchbarkeit stark eingeschränkte Einwände gegen die Verwendung von Enzymen sind ihre !Instabilität, ihr Mangel an Verfügbarkeit, geringe Genauigkeit, sowie der Arbeitsaufwand zur Durchführung der Analyse. Weiterhin sind die Eogtren bei Verwendung grosser Ehzymmengen in der analytischen t Chemie, besonders bei Routineänalyseni ein besonders schwieriges Problem* Da die bekanntenEnzyme Proteine sind, werden
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sie wie diese unter "bestimmten Bedingungen, z. B. Temperaturen, pH-Werten, Konzentrationen, Hikrobenbefall, Autohydrolysc'uni dergleichen denaturiert.
Es sind Versuche unternommen worden, Enzyme in gebundener Form ohne Verlust ihrer Wirksamkeit herzustellen, so dass eine Probe kontimiierlich viele Stünden benutzt werden kann. Das gebundene Enzym wird in der gleichen Weise verwendet wie lösliche· Enzyme, d. h. zur Bestimmung der Konzentration eines Substrates, eines Inhibitors, der das Enzym inaktiviert, oder eines Aktivators, der eine Beschleunigung der Enzymaktivität bewirkt, wobei aber die Genauigkeit verbessert ist. Enzyme sind ddazotiert an Celluloseteilchen und Polyaminostyrο!perlen worden. Auch wurde versucht, die Enzyme durch Adsorption, Absorption oder durch Ionenaustausch physikalisch einzuhüllen. Enzyme sind auch an PoIystyrο!polypeptide gebunden, und in Kollodiummatrizen in Stärke- oder Polyacrylamidgelen, Agar, usw. und in semipermeable Mikrokapseln aus synthetischen Polymerisaten eingeschlossen worden.
Alle bisher zum Binden der Enzyme verwendeten Tragersubstanzen waren organische Substanzen, besonders organische Polymerisate. Der Hauptnachteil bei Verwendung von organischem Material beruht darauf, dass sie gegen Mikrobenbefall infolge der Anwesenheit von C-Atomen in der polymeren Kette anfällig
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sind, wobei der Träger aufgebrochen und das Enzym löslich gemacht wird. Weiterhin erfolgt die Kupplung mit Hilfe von Mazobindung durch eine Kupplungsgruppe, wobei die Enzymmoleküle an den Träger nur an verschiedenen Punkten entlang der Enzymkette gebunden sind. In wässriger Lösung können die Moleküle auseinanderfallen, wobei das Protein denaturiert und dementsprechend ein Verlust an Enzymwirksamkeit auftritt.
In vielen Fällen wird die Substratdiffusion zum Grenzwert der Umsetzungsgeschwindigkeit und vermindert die scheinbare Enzymaktivität. Bei Verwendung in chromatographischen Säulen bewirken die pH-Werte und Lösungsverhältnisse eine Zu- oder Abnahme der Anschwellung, die den Substratdurchsatz in der Säule unkontrolliert und unerwünscht beeinflussen.
In dem Patent der früheren Anmeldung P 19 05 681.6-41 ist bereits ein im wesentlichen wasserunlösliches, stabilisiertes Enzympräparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben, in dem das freie Amin-ogruppen aufweisende Enzym an einen anorganischen,eine grosse Oberfläche und reaktive Silanolgruppen aufweisenden Träger durch Amino-Silikat- und Wasserstoffbindungen gekuppelt ist. Die Kupplung des Enzyms an den Träger ist eine unmittelbare. Dies hat den Nachteil, : dass bei eventueller Bindung an die aktiven Stellen des Enzymmoleküls die Aktivität gegebenenfalls beeinträchtigt werden kann. ·
'■■"■:■■ - .5 -
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Die Erfindung hat ein stabilisiertes, wasserunlösliches Enzympräparat sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung zur Aufgabe, das Aktivitätsverluste insbesondere durch unerwünschte Besetzung der aktiven Stellen des Enzymmoleküls weitgehend vermeidet.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass an wenigstens einen Träger mit freien Hydroxyl- oder Oxidgruppen wenigstens ein Enzym, und an dieses wenigstens ein Substrat gebunden ist.
Die Lösung beruht auf der überraschenden Feststellung, dass durch Bindung des Enzyms an den Träger in Gegenwart seines Substrats offenbar durch Blockierung der aktiven Enzymstellen eine Umsetzung an diesen Stellen mit dem Träger während der Bindung vermieden und Verluste an enzymatischer Aktivität vermieden oder ganz wesentlich verringert werden können. Die erhaltenen Enzympräparate sind in hohem Masse beständig" (stabilisiert), wasserunlöslich und zur Herstellung von chemischen und pharmazeutischen Produkten, insbesondere für die Herstellung von Detergentien, besonders geeignet.
Die Ausdrücke "stabilisiert"y "unlöslich" bzw. "wasserunlöslich" und "immobilisiert" haben hierbei folgende Bedeutung. "Stabilisiert" bedeutet eine Verringerung des Verlustes an
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enzymatiseher Aktivität in Abhängigkeit von Zeit und Temperatur. "Unlöslich" bedeutet im Wasser im wesentliehen unlöslich, als Folge der chemischen Kupplung des Enzyms an einen unlöslichen anorganischen Träger. "Immobilisiert" bezeichnet den Einschluss des Enzyms in einem polymeren Gitter oder einer semiperme.abl.en Membran. -
Die erfindungsgemäss stabilisierbaren Enzyme sind ausserpr- iL dent lieh zahlreich und lassen sich in drei Haupt gruppen einteilen: Hydrolasen, Hedoxenzyme und Transferase-Enzym. Zu den Hydrolasen gehören proteolytische Enzyme wie Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromalin, Eeratinasej Oarbohydrasen v/ie Cellulase, Amylase, Maltase, Pectinase, Chitinase; Ssterasen wie Lipase, Cho.line-sterase, Lecithinase, alkalische und saure Phosphatasen; Nucleasen wie Ribonuclease, Deso3q7TibOnucleasej und Ämidasen wie Arginase, Asparaginase, G-lutaminase und Urease. Die zweite Gruppe besteht aus Redoxenzymen, die Oxydations- oder Reduktionsreaktionen kataly-' sieren. Zu ihnen gehören-Glucoseoxydase, Eatalase, Perosqjr- ; dase, Lipoxydase und cytochrome Reduktase. Die dritte Gruppe, ! die. Transferasen, übertragen Gruppen von einem Molekühl zum
anderen. Beispiele hierfür sind G-lutamin-pyruvin-trans- : aminasej Glutamin-oxalsäureT-trana-aminasei Transmethylasej f \ Phosphopyruvin-trans-phosphorylase*
Als Träger dienen verfügbare Oxid- oder Hydroxidgruppen aufweisende anorganische Substanzen, .die im wesentlichen wasserunlöslich und schwache Säuren oder Basen sind. Sie können nach ihrer chemischen Zusammensetzung in siliziumhaltige Substanzen und nichtsiliziumhaltige Metalloxide eingeteilt werden. Als siliziumhaltiger Träger kommt vorzugsweise Glas in Betracht, entweder in Form von Feststoffpartikeln oder als selbsttragendes Stück, wie z. B. als Scheibe oder Zylinder. Glas hat. den Vorteil, dass es in seiner Abmessung stabil ist und beispielsweise durch Sterilisieren gründlich gereinigt werden kann. Als Träger geeignetes poröses Glas ist ohne weiteres verfügbar und bei Corning Glass Works unter der Codebezeichnung 7930 erhältlich. Derartiges poröses Glas kann mit verschiedenen Por endor climes sera, ζ. B. nach dem US-Patent 2 106 774- oder dem französischen Patent 1 534 990 hergestellt werden. Andere geeignete anorganische Träger sind kolloidale Kieselerde (SiOp), die unter dem Handelsnamen "Cab-O-Sil" erhältlich ist, ferner Wollastonit, ein in der Natur vorkommendes Ca-3ilikat, sowie getrocknetes Silikagel, Bentonit usf.
Typische, nichtsiliziumhaltige Metalloxide sind z. B. Aluminiumoxid, Hydroxyapatit und Nickeloxid.Die in Frage kommenden anorganischen Träger lassen sich entsprechend der folgenden Tabelle zusammenfassent
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Siliziumhaitip; NichtsiliziufflhaltiKe Metalloxide
Übergangsmetalle MeO saures MeO basisches MeO
Amorph Kristallin
Glas Bentonit
Silikagel Wöllastonit
Kiesel-
säure-
kolMd'
NiO Al^O- ' Hydroxy
Apatit
Zur Bildung des in hohem Masse unlöslichen Enzyms und Vermeidung von Aktivitätsverlusten muss die Bindung des Enzyms in Gegenwart eines jeweiligen Substrats vorgenommen werden. Die Bedeutung dieses Merkmals mag am Beispiel, von Trysin erläutert werden. Durch Bildung eines Enzym-Substratkomplexes vor Bindung an den Träger werden die Aminogruppen der aktiven Stellen, d. h. Stickstoff im Histidinrest, durch das Substrat besetzt. Durch diese "Maskierung", (Besetzung), wird die umsetzung des Trägers mit den aktiven Enzymstellen vermieden und diese bleiben für spätere enzymatisch^ Umsetzungen frei. Das Substrat dient ausserdem als ein die Deformation des Enzymmoleküls verhindernder elastischer Puffer, sowie als ein die innere Bindung des Enzyms verstärkender Komplexbildner. Wesentlich dabei ist, das Substrat auf ein spezifisches Enzym zuzuschneiden. Die bei der Bildung anwe- · sende Substratmenge muss für den angestrebten Schutz des Enzyms ausreichen. Als grober Annäherungswert genügt in der
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Regel eine gleiche Gewichtsmenge von Substrat und Enzym. Die Substrate können einzeln oder bei gegebener Kompatibilität als Kombination eingesetzt werden. Bei Bindung von zwei oder mehreren Enzymtypen werden die besten Ergebnisse durch Verwendung jeweils eines Substrats für jeden Enzymtyp erzielt. Die folgende Tabelle zeigt eine Reihe von Substraten für spezifische Enzyme.
Enzyme Substrate
1. Proteolytisch:
Pap^Ln, Ficin, Pepsin, Kasein, Gelatin, Hämoglobin, Trypsin, Chymotrypsin Albumin, etc. Bromelin, Alkalin,
Protease
2. Carbohydrasen:
a Oellulase Cellulose, Carboxymethyl, Cellulose
Amylase Stärke
Maltase Maltose · . "
Pectinase Pectin
Chitinase Chitosan, Chitin, Chitinnitrat
3. Esterasen:
'a) Lipasen Fette, öle, Triglyceride
J) Cholinesterase Acetylcholin ,c) Lecithinase Lecithin
4. Nucleasen:
U) Ri
(b) De
Ribonuclease Ribonuclease-Säure Desoxyribonuclease Desoxyribonuclease-Säure
5. Amid as en:
Arginase Arginin
Asparaginase Asparagin
kc) Urease Urea
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- ίο -
6. Redoxenzyme:
(a) Glucose-Qxidase Glucose, Dextrose
(b) Peroxidase Peroxid
7. Transferasen: - ■ .
(a) Glutamic-Pyruvic-Transaminase Glutaminsäure
(b) Phosphopyruvic-Transphosphory-
lase Phosphopyruvin-Säure
Die Zeichnung zeigt ein Verfahrensschema als nicht beschränkendes Beispiel.
Nach dem Ausführungsbeispiel I wird der z. B. als Formkörper oder in Form von Materialteilchen vorliegende Träger in z. B, wässeriger Suspension oder Lösung zunächst mit dem Substrat verbunden. Die Temperatur ist an sich nicht kritisch, aber empfehlenswert ist Zimmertemperatur oder etwa s höher. Die erforderliche Behandlungsdauer, hängt vom Substrat und der eingesetzten Temperatur ab und ist im allgemeinen bei .Substraten mit niedrigem Molekulargewicht und höherer Temperatur kurzer, bei Substraten mit höherem Molekulargewicht und niedriger Temperatur langer. Unter "Verbindung" wird in diesem Zusammenhang im weitesten Sinne Sättigen, überziehen, Umsetzen, Komplexbildung, Mischen und Dispergieren verstanden. Nach der Verbindung von Träger und Substrat wird der Substratüberschuss entfernt. -
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AIs nächster Verfahrensschritt wird das Enzym in Gegenwart seines Substrats mit dem Träger umgesetzt, was als zweistufire Umsetzung aufgefasst werden kann, "bei der zunächst das En;vym mit dem Substrat reagiert und danach die mit dem Sub- -strat nicht zur Umsetzung gelangten verfügbaren Enzymreste mit dem Träger reagieren gelassen werden. In der Regel· wird das Enzym in wässeriger Lösung dem Träger-Substrat zugesetzt. Die Umsetzung sollte bei niedriger Temperatur, insbesondere. 5° oder darunter durchgeführt werden. Von Bedeutung ist auch der pH-Wert bei der Umsetzung. Er sollte vorzugsweise über oder unter dem optimalen pH der Enzym-Substratumsetzung liegen. Die Umsetzung soll lange gen\i£, in der Segel wenigstens 20 Minuten lang laufen, um das Enzym an den TrMger zu binden. Das als Produkt erhaltene gebundene Enzym in wässeriger Lösung kann gelagert und bei Bedarf verwendet wenden, !'.erstens wird ,jedoch zunüchnt las überschüssige Enzyn du"cv. Fil""ieren, Zentrifugieren und Waschen in d'est. Vi33er entfernt, und las gebundene Enzym in bekannter V/eise,
3. ". an ier Luft oder im Vakuum getrocknet, uni dann verwendet oder gelagert.
Nach eine:?, weiteren Aus führung sb ei spiel (Kethode II des Verfahre.nsschemas) wird der z. 3. als feinlcSrniges Material mit maximaler Korngrösse.von 1^0 /λ zunächst mit dem Substrat
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in wässeriger Suspension gemischt und der eine Oberflächen-' ladung aufweisende Träger dadurch in der Suspension dispergiert. Zeit und Temperatur entsprechen den Verfahrensbedingungen der Methode I. Anschliessend wird das Enzym bei niedriger Temperatur und sehr kurzer Dauer, in der Regel weniger als 5 Minuten, mit dem Träger-Substrat zur Umsetzung gebracht. Auch hier erfolgt zunächst die Umsetzung des Enzyms mit seinem Substrat, gefolgt von der Reaktion von En- ψ zym und Träger. Nunmehr wird das Enzym und der Träger durch Zusatz eines Fällungsmittels zusammen ausgefällt, z. B. durch Dehydrierung vermittels eines organischen Lösers wie z. Bi Aceton oder Alkohol oder Ladungsneutralisierung durch Beigabe einer Salzlösung, z. B. Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, wo durch die Ladung der Proteinmoleküle und Trägerpartikel neutralisiert wird. Die Ausfällungstemperatur soll in der Regel unter Zimmertemperatur liegen. Schliesslich wird das Fällungsmitfel in bekannter Weise, z. B. durch Filtrieren, Zentrifugieren, V/a sehen und Lufttrocknung entfernt.
Als Produkt wird das wasserunlösliche, stabilisierte, getrocknete Enzympräparat erhalten.
Die Erfindung sei an Hand der folgenden Ausführungsbeispiele ohne Beschränkung weiter erläutert.
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. BEISPIEL I
Eine Menge pulverförmiges, poröses Glas mit 96% Gehalt Kieselsäure (595 $■ Porengrösse, 80 - 140 mesh Korngrösse) wurde in HNO,, 0,2 N, unter ständiger Schallbehandlung . wenigstens 30 Minuten lang gewaschen. Das Glas wurde mehrere Male mit dest. Wasser gewaschen und in einem Op Strom bis auf 625° 30 Minuten in der Wärme behandelt und anschliessend unter Belassung in der Op Atmosphäre abgekühlt. Eine 0,2% Gelatinesubstratiösung (2?0 Bloom USP Granularskala) wurde durch Zugabe von 100 ml dest. Wasser und Lösen durch Wärme- und Schallbehandlung bereitet.
500 mg des porösen Glases wurden 5 ml der Gelatinelösung zugesetzt und die Mischung bei 37 1.1/2 Std. lang bewegt. Der verbleibende Rest an Gelatinelösung (3,6 ml) wurde von dem Glas abdekantiert.
Die mit Gelatine geschützte Glasprobe wurde im Wasserbad auf 5° gekühlt. Sodann wurden 5 ml einer 1,39 mg/ml alkalische Protease des B. Subtilis (im Handel als "Alcalase" erhältlich) enthaltenden wässerigen Lösung zugesetzt. Die Enzymlösung wurde abfiltriert und die Glaspartikel mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
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Eine ebenfalls "bereitete Vergleichsprobe erhielt zur An- " näherung an das in der durch Gelatine geschützten Probe nach dem Abdekantieren verbleibenden Flüssigkeitsvolumen einen Zusatz von 1,4 ml dest. V/asser.
Die nachfolgende Behandlung entsprach der Behandlung der Hauptprobe mit der Bindung des Enzyms in Gegenwart seines Substrats.
Die Enzym- und Waschlösungen aller Proben wurden bei einer Wellenlänge von 280 ai/U auf nicht gebundenes Protein analysiert.
Die Analyse ergab für das umgesetzte -Glas und das gebundene Enzym das folgende Gewicht:
getrocknete proteingebunde- Enzym mg/g Probe Probe ' nes Enzym -
Substrat-geschützt 1,023 g 2,36mg 2,31
Vergleichs- · .
probe 1,020 g 2,78 mg 2,73
Das gebundene Enzym wurde dann wie folgt geprüft:
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A. Anson Hämoglobin (pH 9i72, 10 Kin., 37°)
Probe mg E Aktivität/p; Probe 'aktives Enzym$
Substratgeschütst
Vergleichsprobe
1,32 0,92
72% 30%
B. Azocoll (pH 10, 15 Hin., 37°) ProbG mn Z Akt'iyität/p; Pro^e
Substra-tgeschützb
Vergleichsp robe
1"7 ^ »3^
0,92
aktives Enzym
Lie Ergebnisse zeigen deutlich die weitaus grössere Aktivität des substratgesehützten Systems, das den Verlust an Enzymaktivität während der1 Enzyinbindung an den anorganischen Träger gan:: v;esentlich herabsetzt. '
BEISPIEL II
Nach lern gleichen Verfahren wie im Beispiel I warden 200 mg des alkalischen Proteaseeneyms ar. SOG m^ amorpher, kolloidaler Eieselsäureteilchen gebunden, und zwar einmal mit und einmal ohne 200 mg des schützenden GelatineSubstrats. Die gelmndenen Proben wurden mi1- einen: Hämoglobinsubstrat bei ?7° vaia rH ?,7 sit 10 1OSw-. ''; KIn. Inkubationszeit geprüft.
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Die Ergebnisse waren"wie folgt: -
Probe Inkubationszeit mg E Aktivität/g aktives Enzym
Probe
Substratge-
schützt ;		 10 Hin. 38,8 ■ 34,0% ■'
4-5 Hin. · - 73,3 64,3% .
Vergleichs-
probe		 10 Hin. 4,8. 1,1%
Hin. 9,2 2,290
Di·" ~.rn Vergleich zum dreien Enzym gr"3sere Ausbeute des ge-, bur.donen Enzyms bei der löage^en Inkubationszeit (45 Hin.) be~u!"- ?uf der allmi^hllchen Enzynabgabe an dio Lösung, währon'3-inc in Lösung befindliche freie Enzym durch. Denaturierung zerstört wird.
BEISPIEL III
ZToch "lein Verfahren des Beisiicls I wurden 0,C g Bentonit in Op 1.1/2 Std. auf 500° erhitzt ^ind 3?.wi 10 ml einer 2% OeIa.-t inc-1^ c-^T-C zugesetzt. IT ach gründlicher Durchmischung von Träger und Substrat vrarden bei Z-immertemperotur 10 ml einer 20A (2CG mg) alkalischen Proteaselösung zugesetzt. Die aus Träger, Substrat -;nd Enzym bestehende Hischung "vrordo auf 5° gebohlt und über !Tacht reagieren gelassen. Dos- Produkt .wurde mit einem Buchner-Trichter gefiltert, mit dest. Wasser gewaschen, und an der Luft getrocknet. Das an das Bentonit gebundene Enzymprotein wurde von dem übrigen Protein in der
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Waschlösung und dem Filtrat spektral-photometrisch bei 280 m/u ermittelt. Eine Vergleichsprobe wurde durch Zusatz von 10 ml der 2% (200 mg) alkalischen Proteaselösung zu 1 g Bentonit und Umsetzung über Nacht bereitet und dann in der gleichen V/eise wie die substratgeschützte Probe behandelt. Das Gewicht des umgesetzten Bentonit und des gebundenen Enzyms war wie folgt: ·
Probe Gewicht mg Enzym mg,. Enzym/g Probe prote inp;ebunden -
Substratge-
schübat 0,6870 g 86
Vergloichs-
probe 1,124-4- g 146
Das gebundene Enzym wurde sodann durch Anson-Hämoglobin (pH 9,75, 10 Min., 37°) geprüft. '
Probe mp; E Aktivität/p; Probe aktives Enzym
Substratgeschützt ΛΟ,Ο 32?6
Vergleichsprobe 1,2 0,9%
BEISPIEL IV '
Uach dom Verfahren des vorigen Beispiels wurden 0,6 g gemahlenes, aktiviertes Aluminiumoxid 10 ml einer 2% Gelatine-
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lösung zugesetzt. Nach, gründlicher Durchmischung von Träger und Substrat wurden bei Zimmertemperatur IO ml einer 2% alkalischen Proteaselösung zugesetzt. Die Mischung wurde auf .5° gekühlt und über Nacht reagieren gelassen. Eine Vergleichsprobe wurde durch Zusatz einer 2% Lösung alkalischer Protease zu 1 g des Aluminiumoxids bereitet.
Das Gewicht des umgesetzten Aluminiumoxids und des gebundenen Enzyms war.wie folgt:
Probe Gewicht mg Enzym pro- rag Enzym/g Probe teingebunden
Substr.stge-
schützt 0,6026 g 54 90
Vergleichsprobe 1 ,.04-35 g - 88 / 84
Das gebunden Enzym wurde dann durch Anson-Hämoglobin (pH 9,75, 10 Min., 37°) geprüft.
Probe mg E Aktivität/g Probe aktives Enzym
Substrsige-
schützt 7,0 7,8%
Vergleichsprobe 1,2 1,4·%
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BEISPIEL V
Nach dem Verfahren des Beispiels .III und unter Verwendung der gleichen Menge Reagenzien wurde eine substrstgeschützte und eine Vergleichsprobe mit Hydroxyapatit (Ca-, Q(OH)pCPO^ )g Baker Reagenzqualität) als Träger hergestellt.
Das Gewicht des umgesetzten Hydroxyapatit und des gebundenen Enzyms war wie folgt:
Probe
Substratgeschützt
Vergleichsprobe
Gewicht mg Enzym prot eingebunden
0,6455
1,008
oo
mg Enzym/g Probe
Das gebundene Enzym wurde dann durch Änson-Eämoglobin CpH ?,75, IC Min., 37°) geprüft.
Probe '
Substrat-eschüfc^t
Vergleichsprobe
tag; E Aktivität/r; Probe aktives Enzym 24,0 26,7%
4,2 4,3%
- 20 -
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BA© OHIQtNAL
■ ν. - 20 - ■ . . :
■ BEISPIEL VI ' . ;'-■
!fach dem Verfahren des Beispiels I wurde eine ETenge pulver.^ förmiges,.poröses Glas mit; 96$ Kieselsäure gehalt: (790 £ $0 £ Porengrösse, KorngrÖsse 100 mesh) gereinigt und für die Verbindung: vorbereitet. Eine 3% Bextroselösting wurde durch. Leisen toe J g; IJextrasemonahydrat in 100 ml Wasser b©reibet imct 4 & des porösen Glases in einem Reagenzglas in einer Henge von 8 Eil zugesetzt. Das Reagenzglas wurd.e in ein Wasserrad w von 5° Temperatur gebracht. Haoh dem Abkühlen wurden 8 . einer vorgekühlten Glucoseoxidase (4^,5 Einheiten/mg, 5· zugesetzt und die Kischung 21.1/2 Stunden bei 5° reagieren Gelassen· Dap Glas wurde abfiltriert und mit Wasser gewasQhen und die Enzym- und Waschlösung spelcbralphotometrisch bei 280 m/U auf nichtgebundenes Protein analysiert. Entsprechend der Proteindifferenz betrug der Anteil des en das Glas gebun^ denen Enzymo 5,5 mg Enzym/g Probe,
In der gleichen Weise ".mrde eine Yercleichsprobe p-^doeh die Sei-rtrQselösunc durch S Eil dest. Wasser ersetzt, Pas or? das Glas gebundene Enzym b^truc 4,6 mg Enzym/g Probe,
Pie c-'^in&enen Glaspröben v;urien nun dur^h Inkubation bei
teniperGtur. in p?01 Hol Fho cpl.at-uf £ er, pH ψ, iriit 22?4 mg Eil Pvi-iep geprüf+:-, Z-ur. Bestimmung des er ©i^ aliquote Κβώ£ο yon 2,^ nl der
0098 ti/It 11
SiMAL
mischung abgezogen u-ßä· zunächst 0,025 nil 1% O-Dianisidin in Methanol und anschiiessend 0,5 ml Peroxideselösung (0,04 mg/ml) zugesetzt. Dabei ist eine Aktivitätseinheit der Dprstellung von 1 Mikromol HpOp pro .Std. hei Zimmertemperatur äquivalent. Der-Nachweis des anfallenden HpOp erfolgt durch seine Zersetzung in Gegenwart von Peroxidase und O-Dianisidin, wobei nach Oxidierung die optische Dichte bei 460 m /u ansteigt. Die Ergebnisse der Prüfung sind:
A. Anf ann s alct ivit ät: Probe rar, E Aktivität/^ Probe Aktives Enzym
Substratge-
schütjzt. 0,230 4,2%
Vergleichs- .
probe 0,190 2,4%
B. Nach 24 Std. Auslaugen?; bei Zimmertemperatur;
Probe mp; E Aktivität/p; Probe Aktives Enzym
Subcbratge-
schützt		 0,094 1,7
Vergleichs-,
probe		 0,026 0,57
BEISPIEL VII
200 3 Bentonit wurden unter Umrühren 2 1 Gelatinelösung' (70 ζ Gelatine gelöst in 2 1 IIpO) bei 80° zugesetzt. Es wurde weiter gerührt und die Temperatur auf 39° absinken ge-
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lassen. Denn wurde 1 1 alkalischer Proteaselösung bei 5 (60 g alkalischer Protease in 1 1 EJD) unter Umrühren zugesetzt und sofort 9 1 Aceton zugesetzt. Die Temperatur sank auf 19°. Nach Umrühren und Absetzen der Mischung wurde sie filtriert und mit Aceton gewaschen. Das getrocknete Filtrat ergab eine Ausbeute von 297>5 g·
^ Die Prüfung erfolgte nach den folgenden Methoden;
A. Anson Hämoglobin (pH 9,75, 37°, 10 Min.) Probe mg Enzym/p; Probe Aktives Enzym Substratgeschützt 182 91%
B. Azocoll in Detergentienlosung (55°, 10 ml., 50 mg Azocoll) Probe mg; Enzym/p; Probe ■ Aktives Enzym Substratgeschützt 250 125%
C. Azocoll in Detergentienlosung (37°, 25 mg Azocoll, 10 Min.) Probe mg Enzym/p; Probe Aktives Enzym Substrat geschützt /283 142%
Die Mitausfällung war besonders wirksam. Aktivitätswerte über 100% beruhen wahrscheinlich auf der Tatsache, dass die ge-
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bun&enen, substratgeschutzten Proben im Vergleich zum freien Enzym bei höheren Temperaturen grössere thermische Stabilität besitzen.
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Claims (8)

1S4IS43 'Patentansprüche
1. Stabilisiertes, wasserunlösliches Enzympräparat», da« . . durch gekennzeichnet, dass an wenigstens einen Träger mit freien Hydroxyl·*- oder Oxidgruppen wenigstens ein Enzym und an dieses wenigsteziß ein Substrat gebunden ist,
2, Enzympräparat gemäss Anspruch 1,. dadurch gekennzeichnet^ dass der Träger aus porösem Glas, Silieagßl, Kollidalem Siliciumoxid, Bentonite ¥ollastonit, Aluminiumoxid oder Hydroxyapatit besteht,_
5, Enzympräparat gemäss Anspruch 1 öder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das J^nzjm eine Protease, ζ* B, Bscillus tilis alkalische Protease oder ein Hedoxenzym, z, B. G coseoxidase ist,
4-, ITerfahreii zur Herstellung eines stabilisierten, wasser^· unlöslichen Enzympräparates gemäss dem Anspruch 1„ dadurch gekennzeichnet,, dass der anorganische Träger mit dem Enzym in Gegenwart von dessen Substrat umgesetzt wird*
5» Verfahren gemäss Anspruch M-, ds.dureh gekennzeichii«t, dass • die Umsetzung in wässerigem, tle&ium erfolgt.
6. Verfahren gemäss Anspruch. 5> dadurch gekennzeichnet, dass nach der Umsetzung das überschüssige Enzym entfernt und das anfallende Produkt getrocknet wird.
7. Verfahren gemäss Anspruch 55 dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym und der Träger durch Zugabe eines Fällungs mittels zusammen ausgefällt werden und anschliessend das Fällungsmittel abgezogen wird.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, dass das !Fällungsmittel aus einem organischen Dehydratisierungsmittel flüssiger Phase, z. B. Aceton, Alkohol und dergleichen oder einem ladungsneutralisierenden Salz, ζ. Bo Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und dergleichen besteht.
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H Leer sei t e
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2239254C2 (de) * 1970-12-30 1983-08-04 Organon Teknika Corp., Oklahoma City, Okla. "Säule zur Regenerierung einer zirkulierenden Dialysatlösung und Verwendung dieser Säule".
US3850751A (en) * 1973-02-16 1974-11-26 Corning Glass Works Enzymes immobilized on porous inorganic support materials
US4043871A (en) * 1973-04-25 1977-08-23 Kommanditbolaget Kockums Chemical Ab & Co. Enzymatic substrate composition adsorbed on a carrier
US4001085A (en) * 1973-09-10 1977-01-04 Owens-Illinois, Inc. Immobilization of enzymes on an inorganic matrix
US3910823A (en) * 1974-03-25 1975-10-07 Corning Glass Works Immobilization of urease on porous titania
US3930950A (en) * 1974-04-09 1976-01-06 The Ohio State University Research Foundation Method of immobilizing an enzyme
US3930951A (en) * 1974-05-28 1976-01-06 Corning Glass Works Bonding enzymes to porous inorganic carriers
US4098645A (en) * 1976-02-24 1978-07-04 W. R. Grace & Co. Immobilization of proteins with polyurethane polymers
JPS52120190A (en) * 1976-04-02 1977-10-08 Cpc International Inc Fixing method of glucose isomerase and cotinuous isomerization of glucose
JPS5350389A (en) * 1976-10-19 1978-05-08 Agency Of Ind Science & Technol Immobilization and recovery of bacteris-originated alpha-1,6-glucosidase
US4202939A (en) * 1977-09-01 1980-05-13 Cpc International Inc. Glucoamylase immobilized on cationic colloidal silica
US4229536A (en) * 1978-12-28 1980-10-21 Uop Inc. Process for preparing immobilized enzymes
US4241185A (en) * 1979-02-23 1980-12-23 The Great Western Sugar Company Method of stabilizing α-galactosidase
EP0035883B1 (de) * 1980-03-08 1984-06-06 Fuji Oil Company, Limited Verfahren zur enzymatischen Zwischenveresterung von Fett und hierzu verwendetes Enzym
JPS56127087A (en) * 1980-03-08 1981-10-05 Fuji Oil Co Ltd Enzymatic agent and its preparation
EP0039104B1 (de) * 1980-04-25 1983-05-11 Etat belge représenté par l'Exécutif de la Région Wallonne Verfahren zur Immobilisierung der beta-Galaktosidase und die so erhaltenen Produkte
US4506015A (en) * 1980-05-08 1985-03-19 Borden Company Limited Multi-layer immobilized enzyme compositions
US4652524A (en) * 1980-10-02 1987-03-24 Ivan E. Modrovich Soluble stabilized enzymes
AU538170B2 (en) * 1982-09-15 1984-08-02 Owens-Illinois Glass Container Inc. Modified protein to mould an enzyme type molecule
AU538942B2 (en) * 1982-09-16 1984-09-06 Owens-Illinois Glass Container Inc. Protein moulding to make enzyme-type action and immobilization
US4679562A (en) * 1983-02-16 1987-07-14 Cardiac Pacemakers, Inc. Glucose sensor
DK8502857A (de) * 1984-06-25 1985-12-26
US4748121A (en) * 1984-11-30 1988-05-31 Ppg Industries, Inc. Porous glass fibers with immobilized biochemically active material
US4581338A (en) * 1985-05-31 1986-04-08 Manville Service Corporation Preparation of catalyst supports and materials produced thereby
FI85285C (fi) * 1988-05-13 1992-03-25 Stabra Ag Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.
US5288619A (en) * 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
WO1991016449A1 (en) 1990-04-16 1991-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
US6518051B1 (en) * 1991-04-11 2003-02-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
CH686518A5 (de) * 1993-10-05 1996-04-15 Asahi Optical Co Ltd Granulares Polymerkomposit, Herstellungsverfahren fur dieses und diagnostische Mittel.
JP2001509540A (ja) * 1997-07-09 2001-07-24 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー シトクロムを含むクリーニング組成物
US6492316B1 (en) 1997-07-09 2002-12-10 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising a cytochrome
US6107067A (en) * 1998-07-06 2000-08-22 W.R. Grace & Co.-Conn. Porous, non-macroporous, inorganic oxide carrier body for immobilizing microorganisms for bioremediation
CA2243230A1 (en) * 1998-07-15 2000-01-15 Aled Edwards A device and method for the determination of protein domain boundaries
US9133450B2 (en) 2012-01-31 2015-09-15 University Of Calcutta Thermostable enzymes and methods of making and using the same
RU2494725C1 (ru) * 2012-08-20 2013-10-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Сплат-Косметика" (Ооо "Сплат-Косметика") Минерально-ферментативный комплекс для укрепления и отбеливания эмали зубов, композиция для гигиены полости рта и зубная паста
EP3083699A1 (de) * 2013-12-16 2016-10-26 Basf Se Verfahren zur immobilisierung und trocknung von enzymen
EP3196315B1 (de) 2016-01-19 2020-02-05 ORITEST spol. s r.o. Kugelförmige pellets, herstellungsverfahren solcher pellets, verwendung und eine detektionsröhre mit solchen pellets
CN106833934B (zh) * 2017-01-16 2020-04-10 广州立白企业集团有限公司 含酶片状洗涤剂及其制备方法
CN113737509B (zh) * 2021-09-02 2023-09-05 珠海百康生物技术有限公司 一种固体酶制剂及其制备方法和应用

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Publication number Publication date
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FR2020661A1 (de) 1970-07-17
BE740229A (de) 1970-04-13
US3666627A (en) 1972-05-30
GB1259322A (de) 1972-01-05
CA947679A (en) 1974-05-21
US3802997A (en) 1974-04-09

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